Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления herpesvirus saimiri в клеточных культурах методом пцр в реальном времени

Авторы патента:

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

C12Q1/6806 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12N15/38 - Herpetoviridae, например вирусы герпеса, ветряной оспы, Epstein-Barr, цитомегалии, псевдобешенства

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

C07K14/03 - Herpetoviridae, например вирус ложного бешенства

C07H21/02 - с рибозилом в качестве сахаридного радикала

Владельцы патента RU 2753767:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров для количественной детекции генетического материала Herpesvirus Saimiri штамма С488 или его модифицированных производных в клеточных культурах методом количественной полимеразной цепной реакции. Заявленное изобретение позволяет быстро, чувствительно и специфично определять инфекцию клеточных культур вирусом Herpesvirus Saimiri, в том числе при получении культур иммортализованных Т-лимфоцитов человека, и может быть использовано в лабораторной и клинической практике для детектирования присутствия указанного вируса в клеточных культурах или ином исследуемом биоматериале. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в исследовательских целях для детекции в клеточных культурах или ином биоматериале латентной инфекции герпесвирусом Herpesvirus Saimiri.

Создание персонализированных генетически модифицированных лимфоидных линий для терапии онкологических заболеваний сопряжено с трудностями достижения эффективной трансдукции первичных культур Т-лимфоцитов и поддержания их стабильного роста. Решением проблемы может быть использование Гамма-2 герпесвируса Herpesvirus saimiri (HVS), способного инфицировать Т-лимфоциты человека и вызывать их иммортализацию с сохранением клеточного фенотипа и нормальной функциональной активности. Природным резервуаром вируса H. saimiri являются беличьи обезьяны (Saimiri sciureus), в которых вирус не вызывает каких-либо заболеваний. Заражение герпесвирусом обезьян других видов приводит к скорой гибели животных в результате развития лимфом.

Секвенирование генома вируса выявило схожесть H. saimiri с человеческим герпесвирусом Эпштейна-Барр. Генетический материал H. saimiri содержит единственный протяжённый кодирующий участок ДНК, включающий 76 открытых рамок считывания. Терминальная часть кодирующего региона ДНК является ключевой в реализации патогенности вируса и трансформации Т-лимфоцитов. На основании вариабельности данного участка выделяют три различных штамма H. saimiri A, B и С, где штамм С является наиболее онкогенным. Герпесвирус штамма С488 способен инфицировать и иммортализовать Т-лимфоциты человека. HVS персистирует в иммортализованных Т-лимфоцитах в латентной форме в виде внехромосомных ядерных кольцевых эписом с сохранением транскрипции несколько вирусных генов, в том числе гена Tip. Наработки вирулентных вирусных частиц клетками не происходит.

На данный момент для Т-лимфоцитов неизвестны случаи перехода инфекции из латентной в литическую, что делает этот метод сравнительно безопасным и удобным в использовании, например, при кокультивации трансдуцированных лимфоцитов с другими клетками или при реинфузии в организм. В лабораторной практике для наработки вирусных частиц и получения рекомбинантных производных герпесвируса целесообразно использовать другие человеческие клеточные линии, в том числе опухолевые, например, А549, и клеточные линии обезьян (ОМК, Vero), пермиссивные к инфекции HVS. Инфекция клеточной линии А549, как правило, протекает в латентной форме с периодическим переходом в литическую с образованием вирулентных вирусных частиц. Инфекция клеточных линий обезьян всегда литическая. Клетки типа А549 удобно использовать при получении рекомбинантных вирусных частиц с заданными генетическими конструкциями для последующей доставки и экспрессии в Т-лимфоцитах. Для этого линию А549 инфицируют HSV и трансфицируют плазмидой, кодирующей целевую генетическую конструкцию, фланкированную последовательностями, гомологичными участкам генома герпесвируса. Латентно-заражённые рекомбинатным герпесвирусом клетки затем культивируют совместно с клеточными линиями обезьян, например, ОМК, что приводит к образованию высоких титров рекомбинатных вирусных частиц, пригодных для трансдукции Т-лимфоцитов. Необходимость контроля эффективности распространения в культуре латентной инфекции как на стадии получения латентно-инфицированных А549, так и при получении иммортализованных Т-лимфоцитов обусловило поиск способов и разработку материалов для осуществления диагностики герпесвирусной инфекции.

В лабораторной и клинической практике наиболее оптимальными способами определения инфекции являются иммуноферментный анализ и метод количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Иммуноферментный анализ направлен на определение уровней белкового продукта экспрессии специфического для инфекционного агента гена, тогда как кПЦР позволяет определить количества присутствующей в пробе биоматериала мРНК, транскрибированной со специфического гена. Иммуноферментный анализ более трудоемок в исполнении и чаще используется для детекции секретируемых из клеток белков, нежели для внутриклеточных. Метод количественной ПЦР позволяет эффективно и быстро выявить наличие в пробе чужеродной мРНК и идеально подходит для диагностики латентной вирусной инфекции.

В качестве ближайшего аналога можно рассматривать праймеры для амплификации нуклеотидных последовательностей вируса ORF71, ORF72 и ORF73 методом ПЦР /заявка EP1151122A1, C12N 15/86, опубл. 24.08.2000 г. Заявка описывает регуляторный участок нуклеотидной последовательности H. saimiri, ассоциированный с сохранением латентного состояния герпесвируса в клетке, но при этом не упоминаются какие-либо олигонуклеотидные последовательности к гену Tip (ORF1), а также их использование в целях диагностики герпесвирусом.

Технической проблемой, на решение которой было направлено заявленное изобретение, является эффективная и специфичная диагностика латентной инфекции H. saimiri штамма С488 в клеточных культурах.

Техническим результатом изобретения является разработанный набор олигонуклеотидов для детекции и количественной оценки присутствия генетического материала Herpesvirus Saimiri штамма С488, либо его модифицированных производных (латентной инфекции) в клеточных культурах, включающий праймеры и флуоресцентномеченные зонды следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6. Количественное определение уровней заражения HVS достигается за счёт использования флуоресцентномеченного зонда, позволяющего проводить контроль динамики накопления флуоресцентного продукта реакции в режиме реального времени. Зондом (проба, probe) в методике ПЦР в реальном времени называют олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора (карбоксифлуоресцеин (FAM)) и молекула гасителя флуоресценции (Black Hole Quenchers (BHQ)). В качестве мишени, к которой подобраны праймеры и зонды, использован вирусный ген Tip, транскрипция с которого сохраняется при латентном инфицировании клеток H. saimiri.

Проведенные исследования патентной литературы позволили заключить, что заявленный технический результат не имеет полных аналогов и обладает конкурентными преимуществами.

Разработанный набор олигонуклеотидов применяют следующим образом. Собирают образцы клеточных культур, инфицированных вирусом, выделяют и очищают РНК из образцов. Получение чистого препарата РНК включает стадии лизиса клеток, фенол-хлороформной экстракции РНК и ее очистки от солей и белков. Использование специальных коммерчески доступных колонок является альтернативным, удобным и эффективным вариантом получения чистого препарата РНК. Далее РНК переводят в форму кДНК путём постановки реакции обратной транскрипции с использованием праймера олиго-(дТ)18. Полученную кДНК используют для проведения количественной ПЦР. Для этого часть кДНК (нг) смешивают с набором олигонуклеотидов SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, либо с набором олигонуклеотидов SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6. Для получения более достоверного результата следует проводить обе реакции параллельно. Помимо набора праймеров (конечная концентрация 500 нМ) в реакционную смесь добавляют реакционный буфер (5 мкл, 10х), Taq-полимеразу (до 5 мкл), дезоксирибонуклеотидтрифосфаты четырёх типов (20 мМ) и бидистиллированную воду (до конечного объема 50 мкл). Пробирки помещают в амплификатор ПЦР-РВ и запускают следующий протокол:

1. первичная денатурация 95 градусов - 2 минуты

2. денатурация 95 градусов - 30 сек

3. отжиг праймеров 55 градусов - 30 сек

4. элонгация 72 градуса - 40 сек.

Стадии 2-4 повторяются 40 раз (40 циклов). Детекцию флуоресценции прибором выставляют на стадии отжига праймеров. После снятия кривых накопления продукта реакции производят анализ результатов ПЦР с использованием порогового метода. Для сравнения в качестве контрольного значений используют данные, получаемые с кДНК неинфицированных нативных клеток.

Последовательности

Последовательность 1: "1"

Длина	Тип молекулы	Организм	Содержит фрагменты ДНК и РНК	Пропущенная последовательность
20	DNA	synthetic construct	Нет	Нет

Характеристики

Ключ характеристики	Местоположение характеристики	Квалификаторы
source	1..20	mol_type = other DNA organism = synthetic construct

Последовательность

--->

gttgctgaca agtcacgttt 20

<---

Последовательность 2: "2"

Длина	Тип молекулы	Организм	Содержит фрагменты ДНК и РНК	Пропущенная последовательность
22	DNA	synthetic construct	Нет	Нет

Характеристики

Ключ характеристики	Местоположение характеристики	Квалификаторы
source	1..22	mol_type = other DNA organism = synthetic construct

Последовательность

--->

tcctccgact tgtgtcgcac ca 22

<---

Последовательность 3: "3"

Длина	Тип молекулы	Организм	Содержит фрагменты ДНК и РНК	Пропущенная последовательность
20	DNA	synthetic construct	Нет	Нет

Характеристики

Ключ характеристики	Местоположение характеристики	Квалификаторы
source	1..20	mol_type = other DNA organism = synthetic construct

Последовательность

--->

aacttttgaa gacgcaaggg 20

<---

Последовательность 4: "4"

Длина	Тип молекулы	Организм	Содержит фрагменты ДНК и РНК	Пропущенная последовательность
20	DNA	synthetic construct	Нет	Нет

Характеристики

Ключ характеристики	Местоположение характеристики	Квалификаторы
source	1..20	mol_type = other DNA organism = synthetic construct

Последовательность

--->

cgcaccattc cttttccttg 20

<---

Последовательность 5: "5"

Длина	Тип молекулы	Организм	Содержит фрагменты ДНК и РНК	Пропущенная последовательность
24	DNA	synthetic construct	Нет	Нет

Характеристики

Ключ характеристики	Местоположение характеристики	Квалификаторы
source	1..24	mol_type = other DNA organism = synthetic construct

Последовательность

--->

gcacgttctg aggcctgtat gtgc 24

<---

Последовательность 6: "6"

Длина	Тип молекулы	Организм	Содержит фрагменты ДНК и РНК	Пропущенная последовательность
20	DNA	synthetic construct	Нет	Нет

Характеристики

Ключ характеристики	Местоположение характеристики	Квалификаторы
source	1..20	mol_type = other DNA organism = synthetic construct

Последовательность

--->

cccgtcaagc agttatagca 20

<---

Набор олигонуклеотидов для детекции и количественной оценки присутствия генетического материала Herpesvirus Saimiri штамма С488 в вирусных препаратах и клеточных культурах, включающий праймеры и флуоресцентномеченные зонды следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, либо SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в терапии. Способ оценки эффективности лечения пневмонии заключается в исследовании до и после лечения общего анализа крови.

Способ прогнозирования течения пневмонии с альвеолярным типом инфильтрации легочной ткани // 2753745

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии. Способ прогнозирования течения пневмонии заключается в исследовании до и после лечения общего анализа крови.

Способ оценки эффективности лечения пневмонии // 2753744

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в терапии. Способ оценки эффективности лечения пневмонии путем исследования до и после лечения общего анализа крови заключается в том, что дополнительно определяют в сыворотке крови количество C-реактивного протеина, активность каталазы, супероксиддисмутазы, эластазо- и трипсиноподобных протеиназ, уровень ТБК-активных соединений и концентрацию битирозина и рассчитывают дискриминантные функции Y1 и Y2, и при Y1 больше Y2 и снижении количества лейкоцитов на 30% и более, активности трипсиноподобных протеиназ на 20% и более, количества эозинофилов на 50% и более, а также СОЭ на 50% и более, количества C-реактивного протеина на 50% и более, активности СОД на 50% и более, уровня ТБК-активных соединений на 50% и более, концентрации битирозина на 50% и более по сравнению с уровнем до лечения лечение пневмонии с альвеолярным типом инфильтрации в легочной ткани оценивают как эффективное.

Гематоэнцефалический барьер, содержащий сконструированные эндотелиальные клетки // 2753441

Настоящее изобретение отчасти относится к биотехнологии и раскрывает систему гематоэнцефалического барьера (ВВВ) in vitro для оценки способности агента-кандидата проникать сквозь гематоэнцефалический барьер, а также способы и применения такой системы. ВВВ включает конфлюэнтный монослой эндотелиальных клеток, экспрессирующих E4ORF1 полипептид, и астроциты, находящиеся в прямом контакте с монослоем эндотелиальных клеток.

Гематоэнцефалический барьер, содержащий сконструированные эндотелиальные клетки // 2753441

Способ прогнозирования восстановления сенсомоторных функций у пациентов с острым ишемическим инсультом после ранней реабилитации // 2753140

Изобретение относится к области медицины, а в частности к неврологии. Способ прогнозирования восстановления сенсомоторных функций у пациентов с острым ишемическим инсультом после ранней реабилитации заключается в определении в венозной крови сывороточной концентрации основного белка миелина MBP на 2-е сутки ишемического инсульта и оценки степени постинсультных нарушений по шкале Фугл-Майера (FMA).

Способ прогнозирования летальных исходов у больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей после эндоваскулярных реконструкций // 2752823

Изобретение относится к медицине, в частности сердечно-сосудистой хирургии и ангиологии, и может быть использовано при лечении больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, также известном, как заболевания периферических артерий (ЗПА) атеросклеротической этиологии. Способ прогнозирования летальных исходов у больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей IIБ - IV стадий после эндоваскулярных реконструкций заключается в определении в периферической венозной крови за сутки до выполнения эндоваскулярных вмешательств маркеров эндотелиальной дисфункции - активности фактора фон Виллебранда, уровня метаболитов оксида азота II и оценки наличия либо отсутствия гипертонической болезни, с последующим расчетом вероятности развития летального исхода в течение года после оперативного вмешательства по формуле Р = 1 / (1 + е-Z), где Р - вероятность развития летального исхода в %, е - основание натурального логарифма (число Эйлера), а Z - показатель, рассчитываемый следующим образом: Z = -46.16 + 0.021 * X1 + 0.209 * X2 + 8.471 * X3, где Х1 - значение активности vWF, %; Х2 - значение метаболитов NO, мкм/мл; Х3 - значение, отражающее наличие или отсутствие гипертонической болезни у пациента - бинарная переменная 0 - нет гипертонической болезни или 1 - есть гипертоническая болезнь.

Способ определения уровня работоспособности спортсменов // 2752621

Изобретение относится к области медицины, а именно к общественному здравоохранению и спортивной медицине, и предназначено для определения уровня работоспособности спортсмена. Для осуществления способа исследуют слюну с помощью биолюминесцентного анализа.

Способ прогнозирования высокого риска развития раннего атеросклероза // 2752363

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования высокого риска развития раннего атеросклероза. У пациента определяют аллельные варианты, выбранные из группы, включающей Gly482Ser PPARGC1A, Leu28Pro АРОЕ, Lys198Asn EDN, G-250A LIPC и Ser447Ter LPL.

Измерения барьерной функции // 2752085

Изобретение относится к способу in vitro для определения модулирующего влияния исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия, который включает стадии а) обеспечения микрофлюидной системы, содержащей множество полых микрофлюидных каналов, при этом указанная система содержит по меньшей мере один канал, который по меньшей мере частично заполнен гидрогелем; b) введения эпителиальных клеток в указанный микрофлюидный канал и обеспечения приведения указанных эпителиальных клеток в контакт с указанным гидрогелем; c) культивирования указанных эпителиальных клеток, которые были введены в указанный микрофлюидный канал, тем самым позволяя указанным клеткам образовывать на гидрогеле слой клеток с апикальной и базолатеральной стороной; d) обеспечения указанных эпителиальных клеток в указанном микрофлюидном канале зондом и указанным исследуемым соединением, при этом указанный зонд и указанное исследуемое соединение независимо обеспечивают с апикальной стороны, с базолатеральной стороны или как с апикальной, так и базолатеральной стороны; e) определения в различные моменты времени сигнала, обеспечиваемого указанным зондом в указанном микрофлюидном канале или в указанном гидрогеле или как в указанном микрофлюидном канале, так и в указанном гидрогеле, и, тем самым, определения модулирующего влияния исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия.

Способ прогнозирования риска развития хронической истинной экземы у женщин с учетом генетических факторов // 2753274

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития хронической истинной экземы (ХИЭ) у неродственных русских пациенток, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ. Из периферической венозной крови выделяют ДНК.