Способ иммунологического мониторинга животных

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и предназначено для диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма по биологическому тесту. В качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов и готовят реагирующие смеси. Далее берут кровь из ушной вены опытных и контрольных животных для приготовления мазка и приготовляют мазок на предметном стекле. Мазок фиксируют 30 мин в ацетон-трилоне В и затем промывают проточной водой. Производят учет активности ферментов в течение 4 ч для сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и 24 ч для а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) после приготовления мазка. Под световым микроскопом подсчитывают гранулы энзимов в 50 лимфоцитах на двух мазках - для а-ГФДГ и для СДГ. При активности а-ГФДГ и СДГ до 3 гранул в лимфоците животных относят в группу со сниженной иммунологической реактивностью. Изобретение обеспечивает повышение достоверности лабораторного исследования путем проведения биологического теста и позволяет сформировать группу животных с высоким риском снижения иммунологической реактивности. 2 ил., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма, в частности к способу иммунологического мониторинга животных и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний при помощи иммунологического мониторинга на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов иммунологического мониторинга животных путем оценки иммунологической реактивности организма.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С - определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, МПК² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, МПК² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, Μ и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят о иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, МПК² G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент СССР №1813213, МПК² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

В известных способах иммунологического мониторинга животных проводится без выявления и определения значений титра антител и не позволяет достоверно установить наличие и степень тяжести иммунного эффекта. Эффективных методов иммунологического мониторинга животных в настоящее время не существует. Наш способ будет выявлять уже доступные изменения с первых часов жизни у полученного потомства и материнского организма.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа иммунологического мониторинга животных направленного на более релевантный иммунологический мониторинг реактивности материнского организма и полученного потомства, позволяющего в относительно короткие сроки определить уровень иммунологического статуса животных.

Цель изобретения - повышение точности и упрощения процедуры определения нарушения иммунологического статуса у животных.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования путем проведения биологического теста, в качестве которого используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов определяя среднюю активность гликолитических ферментов а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы). Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском снижения иммунологической реактивности.

Технический результат достигается при помощи способ аиммунологического мониторинга животных путем определения иммунологической реактивности по биологическому тесту, при этом, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов определяя среднюю активность гликолитических ферментов а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы) по следующей формуле:

A=S/N

где А - активность фермента, S - число гранул, а N - число просмотренных лимфоцитов,

при активности а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы) до 3 гранул в лимфоците животных относят в группу со сниженной иммунологической реактивностью.

Краткое описание чертежей и иных материалов

На фиг. 1, приведена средняя активность гликолитических ферментов лимфоцитов а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы) в лимфоцитах.

На фиг. 2, указана корреляционная зависимость между активацией а-ГФДГ (СДГ) и периодом беременности.

Осуществление изобретения

Выбирая энзиматический тест в иммунологическом мониторинге, мы исходили из предположения, что изменение функциональной активности лимфоцитов периферической крови, индуцированной главным образом различием между донором и реципиентом в HLA-совместимости и имеющей следствием манифестацию криза отторжения, должно сопровождаться изменением внутриклеточного метаболизма, а значит, опосредоваться через системы внутриклеточных ферментов.

Определение активности ферментов производили микроскопически на мазке перефереической крови после осуществления энзиматической проводки. Тест состоит из четырех этапов, хронометраж которых для одного исполнителя приведен ниже:

- приготовление реагирующих смесей - 10 мин на каждую;

- постановка реакции - 1 ч 15 мин;

- микроскопический анализ - 20-30 мин;

- вычисление активности для одного фермента - 3 мин.

Пример 1

Приготовление реагирующих смесей

Смесь №1. В 300 мл 1/1,5 Μ фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) добавляют 78 мг трилона-В (ЕДТА Na₂, «Reaml») и 78 мг нитротетразолия фиолетового («Reanal»); смесь фильтруют и хранят при 4°С; перед употреблением нагревают до 37°С.

Смесь №2а (готовят ex tempore): 40 мл смеси №1 + 630 мг «глицерофосфата (глицерин-1-фосфатдинатриевая соль).

Смесь №2б (готовят ex tempore): 40 мл смеси №1 + 540 мг динатрий сукцината.

В опыте для определения иммунологической реактивности использовали 15 свиноматок крупной белой породы и полученное потомство (новорожденные поросята 165 гол.). Кровь у опытных и контрольных животных для приготовления мазка берут ушной вены и приготовляют мазок на предметном стекле. Мазок фиксируют 30 мин в ацетон-трилоне В (60% раствор ацетона + 250 мг ЕДТА Na2) и затем промывают проточной водой. У

Затем для оценки энзимной активности ферментов лимфоцитов подготовленные мазки помещают в смесь 2а (для а-ГФДГ) на 4 часа и 2б (для СДГ) на 24 ч при 37°С, после чего промывают в проточной воде. Затем окрашивают 0,25% раствором Janus grun (Merck) в течение 10-15 с; промывают и высушивают при 22°С, после чего он готов для подсчета.

Учет активности ферментов. Производится в течение 4 ч для СДГ и 24 ч для а-ГФДГ после приготовления мазка. Под световым микроскопом (10×90) подсчитывают гранулы энзимов, образовавшиеся в результате цитохимических реакций и видные как фиолетовые включения, расположенные по всей поверхности клетки. Подсчитывают число гранул в 50 лимфоцитах (на двух разных мазках, для а-ГФДГ и для СДГ).

Активность фермента А в числе гранул рассчитывается по формуле

A=S/N,

где S - число гранул, a N - число просмотренных лимфоцитов.

Нами обнаружены различия в функциональной активности лимфоцитов (внутриклеточный метаболизм лимфоцитов). Установили, что активность внутриклеточного фермента отражает напряженность клеточного метаболизма, этот фермент служит маркером иммунологической реактивности.

У животных с признаками пониженной иммунологической реактивности имелись различия по данным показателям. Так у опытных животных составило 2 гранулы, а у контрольных 10 гранул на лимфоцит. Уровень активности ферментов показан в таблице 1.

Пример 2

По второму примеру во вторую половину беременности определяют активность ферментов, которая соответствует в среднем 6,83±0,50 (а-ГФДГ) и 10,55±0,63 (СДГ). Нарушение условий плацентации в первую половину снижало уровень а-ГФДГ и активность СДГ.

Начиная с 1-го месяца после беременности, т.е. в период стабильной функции фетоплацентарного комплекса, активность обоих ферментов близка к активности у интактных животных. Из полученных данных следует, что при снижении иммунологической реактивности активность фермента а-ГФДГ была высокой в подавляющем большинстве случаев, а при отсутствии данного эффекта, наоборот, около 60% определений активности фермента давали низкие результаты. Высокий коэффициент корреляции и однозначная направленность процесса свидетельствуют о том, что активация а-ГФДГ связана с последующей манифестацией иммуносупрессивного состояния у данных особей.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами.

1. Предлагаемый способ предназначен для проведения более достоверного иммунологического мониторинга животных.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

Способ диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма по биологическому тесту, отличающийся тем, что в качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов и готовят реагирующие смеси:

cмесь 1 включает 300 мл 1/1,5 Μ фосфатного буфера с рН 7,2-7,4, в который добавляют 78 мг трилона-В и 78 мг нитротетразолия фиолетового; смесь фильтруют и хранят при 4°С; перед употреблением нагревают до 37°С;

смесь 2а готовят ex tempore: 40 мл смеси 1 + 630 мг глицерин-1-фосфатдинатриевой соли;

смесь 2б готовят ex tempore: 40 мл смеси 1 + 540 мг динатрий сукцината;

далее кровь берут из ушной вены опытных и контрольных животных для приготовления мазка и приготовляют мазок на предметном стекле; мазок фиксируют 30 мин в ацетон-трилоне В и затем промывают проточной водой;

для оценки энзимной активности ферментов лимфоцитов подготовленные мазки помещают в смесь 2а для а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) на 4 часа и 2б для сукцинатдегидрогеназы (СДГ) на 24 ч при 37°С, после чего промывают в проточной воде, затем окрашивают в течение 10-15 с; промывают и высушивают при 22°С, после чего производят учет активности ферментов в течение 4 ч для СДГ и 24 ч для а-ГФДГ после приготовления мазка;

под световым микроскопом подсчитывают гранулы энзимов, образовавшиеся в результате цитохимических реакций и видные как фиолетовые включения, расположенные по всей поверхности клетки; подсчитывают число гранул в 50 лимфоцитах на двух мазках - для а-ГФДГ и для СДГ;

определяют среднюю активность гликолитических ферментов а-ГФДГ и СДГ по следующей формуле:

A=S/N

где А - активность фермента, S - число гранул, а N - число просмотренных лимфоцитов,

при активности а-ГФДГ и СДГ до 3 гранул в лимфоците животных относят в группу со сниженной иммунологической реактивностью.