Молекула субстрата

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к композициям и способам тестирования активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции, включающей использование субстрата в виде молекулы нуклеиновой кислоты, который детектирует активность никующей эндонуклеазы и полимеразы путем высвобождения детектируемого репортера (например, флуорофора). 4 н. и 35 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 4 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/110,237, поданной 30 января 2015 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Реакции амплификации нуклеиновых кислот могут не происходить по причине отсутствия целевой нуклеиновой кислоты (истинный отрицательный результат) или по причине того, что специфическая амплификация ингибирована (ложный отрицательный результат). Таким образом, понимание причины того, почему реакция не происходит, может влиять на интерпретацию отрицательного результата. Использование положительного контроля может повысить уверенность в том, что отрицательный результат является истинным отрицательным, а не обусловлен компонентами реакции. Если реакции амплификации нуклеиновых кислот используются в качестве средства детекции инфекционного агента, то положительный контроль особенно полезен для индикации того, что отрицательные результаты амплификации соответствуют истинно отрицательным образцам.

В соответствии с этим срочно необходимы усовершенствованные способы точной детекции молекул нуклеиновых кислот.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам тестирования активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции, включающей использование субстратной молекулы нуклеиновых кислот, которая детектирует активность никующей эндонуклеазы и полимеразы путем высвобождения детектируемого репортера (например, флуорофора).

В одном из аспектов изобретение относится к субстрату для никирования и реакции достройки, включающему дуплекс нуклеиновой кислоты, у которого первая нуклеиновая цепь имеет сайт узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу, а вторая нуклеиновая цепь имеет последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу, или дуплекс нуклеиновой кислоты, у которого первая нуклеиновая цепь имеет сайт узнавания никующей эндонуклеазы и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; а вторая нуклеиновая цепь имеет последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу.

В другом аспекте изобретение относится к способу детекции активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции, включающей: контакт дуплекса нуклеиновой кислоты с никирующей эндонуклеазой, причем дуплекс включает: первую нуклеиновую цепь с сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентной детектируемой меткой, ковалентно пришитой к 3'-концу; и вторую нуклеиновую цепь с последовательностью, способной образовывать дуплекс с первой цепью, и компонентом-тушителем, ковалентно пришитым к 5'-концу; или дуплекс включает: первую нуклеиновую цепь с сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и компонентом-тушителем, ковалентно пришитым к 3'-концу; и вторую нуклеиновую цепь с последовательностью, способной образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентной детектируемой меткой, ковалентно пришитой к 5'-концу; связывание никированного дуплекса с полимеразой в присутствии дНТФ; полимеразную достройку, в результате которой замещается фрагмент первой нуклеотидной цепи от сайта никирования до 3'-конца, ковалентно связанного с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, отделенной от тушителя, детектирующую тем самым активность никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу амплификации специфического продукта в реакции никующей амплификации, включающей: контакт целевой молекулы нуклеиновой кислоты в существенно изотермических условиях с двумя или более праймерами, каждый из которых специфически связывается с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, в присутствии дНТФ, никующей эндонуклеазы, и дуплекса, включающего: первую нуклеиновую цепь с сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентной детектируемой меткой, ковалентно пришитой к 3'-концу; и вторую нуклеиновую цепь с последовательностью, способной образовывать дуплекс с первой цепью, и компонентом-тушителем, ковалентно пришитым к 5'-концу; или дуплекса, включающего: первую нуклеиновую цепь с сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и компонентом-тушителем, ковалентно пришитым к 3'-концу; и вторую нуклеиновую цепь с последовательностью, способной образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентной детектируемой меткой, ковалентно пришитой к 5'-концу; генерацию ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; никирование дуплекса и полимеразную достройку, в результате которой замещается фрагмент первой нуклеотидной цепи от сайта никирования до 3'-конца, ковалентно связанного с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, отделенной от тушителя, детектирующую тем самым активность никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции.

В другом аспекте изобретение относится к способу детекции специфического продукта в реакции никующей амплификации, включающей: контакт целевой молекулы нуклеиновой кислоты в существенно изотермических условиях с двумя или более праймерами, каждый из которых специфически связывается с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, в присутствии дНТФ, никующей эндонуклеазы, и дуплекса, включающего: первую нуклеиновую цепь с сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентной детектируемой меткой, ковалентно пришитой к 3'-концу; и вторую нуклеиновую цепь с последовательностью, способной образовывать дуплекс с первой цепью, и компонентом-тушителем, ковалентно пришитым к 5'-концу; или дуплекса, включающего: первую нуклеиновую цепь с сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и компонентом-тушителем, ковалентно пришитым к 3'-концу; и вторую нуклеиновую цепь с последовательностью, способной образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентной детектируемой меткой, ковалентно пришитой к 5'-концу; генерацию ампликонов, содержащих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; никирование дуплекса и полимеразную достройку, в результате которой замещается фрагмент первой нуклеотидной цепи от сайта никирования до 3'-конца, ковалентно связанного с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, отделенной от тушителя, детектирующую тем самым активность никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции; и детекцию сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновых кислот или ее ампликоном, причем сигнал определяет количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.

В еще одном аспекте изобретение относится к набору для детекции активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции, причем набор содержит субстрат никирования и реакции достройки, включающий дуплекс нуклеиновой кислоты, у которого первая нуклеиновая цепь имеет сайт узнавания никующей эндонуклеазы и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; а вторая нуклеиновая цепь имеет последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу, или дуплекс нуклеиновой кислоты, у которого первая нуклеиновая цепь имеет сайт узнавания никующей эндонуклеазы и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; а вторая нуклеиновая цепь имеет последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу.

В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе субстрат, или дуплекс, имеет длину от примерно 30 п.н. до примерно 2 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 1 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 500 п.н., от примерно 30 п.н. до примерно 200 п.н., от примерно 30 п.н. до примерно 60 п.н., от примерно 35 п.н. до примерно 50 п.н. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе цепи нуклеиновой кислоты субстрата, или дуплекса, имеют длину от примерно 30 н. до примерно 2000 н., от примерно 100 н. до примерно 1000 н., от примерно 100 н. до примерно 500 н., от примерно 30 н. до примерно 200 н., от примерно 30 н. до примерно 60 н., от примерно 35 н. до примерно 50 н. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе длина нуклеиновой цепи от сайта никирования до 3'-конца составляет около 25 н., около 35 н., около 40 н. или более. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., около 15 н., около 20 н. или более. В некоторых вариантах осуществления длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет примерно 10 н., примерно 5 н., примерно 3 н. или менее. В конкретных вариантах осуществления длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта узнавания никующей эндонуклеазы составляет 4, 3, 2 или 1 н. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе первые и вторые нуклеотидные цепи ковалентно связаны.

В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе субстрат включает модифицированный нуклеотид. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе 3'-конец второй нуклеиновой кислоты модифицирован с помощью C3-спейсера, дидезоксинуклеотида, фосфорилирования, красителя, флуорофора, тушителя, спейсера или линкера. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе первая нуклеотидная цепь субстрата, или дуплекса, имеет один или более модифицированных нуклеотидов в положении 1 в направлении 5'-конца от сайта никирования (то есть nick-1), в положении 2 в направлении 5'-конца от сайта никирования (то есть nick-2), и в положении 1 в направлении 3'-конца от сайта никирования (то есть nick+1). В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе первая нуклеотидная цепь субстрата, или дуплекса, имеет один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5) модифицированных нуклеотидов между сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и сайтом никирования. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе субстрат модифицирован в одном или более положениях в пределах сайта узнавания никующей эндонуклеазы. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе модифицированный нуклеотид представляет собой модифицированный нуклеотид, включающий 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH₂-O-2'-мостик, 4'-(CH₂)₂-O-2'-мостик, 2'-O-(N-метилкарбамат), метилирование, биотинилирование, нуклеотидный аддукт или аналог основания.

В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе субстрат или дуплекс содержит флуоресцентную детектируемую метку, сопряженную с компонентом-тушителем. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе флуоресцентные детектируемые метки представляют собой FAM, TET, HEX, TAMRA, JOE, или ROX. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе компонент-тушитель представляет собой 5' Iowa Black® RQ (5IabRQ), dabcyl, dabsyl, или краситель Black Hole Quencher. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе субстрат, или дуплекс, содержит одну или более пар "флуоресцентная детектируемая метка/компонент-тушитель", ковалентно пришитых (например, посредством биотинилирования) к противоположным нуклеотидным цепям и внутри дуплекса.

В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе реакция проводится в существенно изотермических условиях. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе реакция дополнительно включает праймеры, зонды и/или целевые молекулы нуклеиновой кислоты. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе нуклеотидные цепи субстрата, или дуплекса, имеют последовательности, которые не связываются с другими молекулами нуклеиновых кислот, присутствующими в реакции. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе флуоресцентная детектируемая метка дуплекса нуклеиновой кислоты и флуоресцентная детектируемая метка зонда различаются (например, FAM и CalRed). В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе детекция сигнала от дуплекса используется в качестве положительного контроля. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе момент времени, в который сигнал от дуплекса достигает заданной относительной флуоресценции (ОФЕ), указывает конечную точку наблюдения за реакцией никующей амплификации. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе этот способ предусматривает использование одного или более дуплексов нуклеиновых кислот, или субстратов, отличающихся своими модификациями.

В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе первая нуклеотидная цепь субстрата, или дуплекса, никируется никующей эндонуклеазой. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе никующая эндонуклеаза представляет собой Nt.BstNBI, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI, Nb.Bpu10I, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.Bpu10I, Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI, или Nt.CviPII. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе первая нуклеотидная цепь субстрата, или дуплекса, находится в контакте с полимеразой. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе полимераза представляет собой ДНК-полимеразу I Bst, ДНК-полимеразу Bsu, ДНК-полимеразу I Gst, или ДНК-полимеразу I Gka. В других вариантах осуществления примеры полимераз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, BST (большой фрагмент), ДНК-полимеразу I (E. coli), ДНК-полимеразу I, большой (Klenow-) фрагмент, Klenow-фрагмент (3'-5' exo-), ДНК-полимеразу T4, ДНК-полимеразу T7, ДНК-полимеразу Deep VentR(exo-), ДНК-полимеразу Deep VentR, DyNAzyme, High-Fidelity ДНК-полимеразу, ДНК-полимеразу Therminator, Therminator II, ДНК-полимеразу AmpliTherm, ДНК-полимеразу Taq, ДНК-полимеразу Tth, ДНК-полимеразу Tfl, ДНК-полимеразу Tgo, ДНК-полимеразу SP6, ДНК-полимеразу Tbr или их активные фрагменты.

Другие характеристики и преимущества изобретения будут очевидны из подробного описания и из формулы изобретения.

Определения

Под "ампликоном" подразумевается полинуклеотид, генерируемый при амплификации интересующего полинуклеотида. В одном примере ампликон генерируется во время реакции никующей амплификации.

Под "модификатором коэффициента амплификации" подразумевается агент, способный влиять на скорость полимеразной достройки.

Под "заменой основания" подразумевается замена азотистого основания в полимере, которая не приводит к значительному нарушению гибридизации между комплементарными нуклеотидными цепями.

В данном документе термины "включает", "включающий", "содержащий" и "имеющий" и т.п. могут иметь смысл, приписанный им патентным правом США, и могут означать "включает", "включающий" и т.п.; термин "состоящий по существу из" или "состоящий по существу" также имеет смысл, приписываемый ему патентным правом США, и этот термин является неограничивающим и охватывает не перечисленные здесь изменения, при условии, что такие изменения не меняют перечисленных здесь основных и отличительных признаков, но исключает варианты осуществления на существующем уровне техники.

Под "комплементарным" или "комплементарностью" подразумевается, что нуклеиновая кислота может образовывать водородную(ые) связь(и) и с другой последовательностью нуклеиновых кислот посредством традиционного спаривания оснований по Уотсону-Крику или по Хугстину. Комплементарное спаривание оснований включает не только пары «G-C» и «A-T», но также включает пары оснований, задействующие универсальные основания, такие как инозин. Процентная комплементарность указывает на процент смежных остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику) со второй нуклеотидной последовательностью (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из общего числа 10 нуклеотидов в первом олигонуклеотиде, чьи основания образуют пару со второй нуклеотидной последовательностью, состоящей из 10 нуклеотидов, составляют 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарности, соответственно). Для определения того, что процентная комплементарность имеет по меньшей мере определенную величину, доля смежных остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которая может образовывать водородные связи (например, пары оснований по Уотсону-Крику) со второй нуклеотидной последовательностью вычисляется и округляется до ближайшего целого числа (например, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов из общего числа 23 нуклеотидов в первом олигонуклеотиде, образующих пары оснований со второй нуклеотидной последовательностью длиной 23 нуклеотида, соответствует 52%, 57%, 61%, 65%, 70% и 74%, соответственно; и имеет не менее 50%, 50%, 60%, 60%, 70% и 70% комплементарности, соответственно). В настоящем документе термин "существенно комплементарный" подразумевает комплементарность между цепями, такую, что они способны гибридизоваться в биологических условиях. Существенно комплементарные последовательности имеют 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100% комплементарности. Кроме того, способы определения того, способны ли две цепи гибридизоваться в биологических условиях путем изучения их нуклеотидных последовательностей, хорошо известны на существующем уровне техники.

В настоящем документе термин "дуплекс" подразумевает двойную спираль, сформированную взаимодействием двух одноцепочечных нуклеиновых кислот. Дуплекс обычно образуется путем попарного образования водородных связей между основаниями, т.е. образования "пар оснований", между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, которые ориентированы антипараллельно друг другу. Пары оснований в дуплексах обычно возникают путем спаривания оснований по Уотсону-Крику, при котором гуанин (G) образует пару оснований с цитозином (C) в ДНК и РНК, аденин (А) образует пару оснований с тимином (T) в ДНК, и аденин (А) формирует пару оснований с урацилом (U) в РНК. Условия, в которых пары оснований могут образоваться, включают физиологические или биологически релевантные условия (например, внутриклеточный pH 7.2, 140 мМ ионов калия; внеклеточный pH 7.4, 145 мМ ионов натрия). Кроме того, дуплексы стабилизируются стэкинг-взаимодействиями между соседними нуклеотидами. В настоящем документе подразумевается, что дуплекс может быть создан или поддерживаться с помощью спаривания оснований или стэкинг-взаимодействий. Дуплекс формируется двумя комплементарными цепями нуклеиновых кислот, которые могут быть существенно комплементарными или полностью комплементарными. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты, которые образуют пары оснований на протяжении нескольких оснований, считаются "гибридизованными".

"Детекция" означает идентификацию присутствия, отсутствия или количества аналита, который предполагается детектировать.

Под "детектируемым компонентом" подразумевается композиция, которая, будучи связана с интересующей молекулой, делает последнюю детектируемой с использованием спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств. Например, полезные метки включают радиоактивные изотопы, магнитные сферы, металлические сферы, коллоидные частицы, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, широко используемые в ИФА), биотин, дигоксигенин или гаптены.

Под "фрагментом" подразумевается часть молекулы нуклеиновой кислоты. Часть содержит, предпочтительно, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% полной длины референсной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов.

"Гибридизоваться" означает образовать двухцепочечную молекулу из комплементарных полинуклеотидных последовательностей (например, описанного в настоящем документе гена) или их частями с различной степенью строгости. (См., например, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507). Гибридизация происходит путем образования водородных связей, которое может являться образованием водородных связей по Уотсону-Крику, Хугстину или по обращенному механизму Хугстина, между комплементарными азотистыми основаниями. Например, аденин и тимин представляют собой комплементарные нуклеотидные основания, которые спариваются путем образования водородных связей.

Под "изолированным полинуклеотидом" подразумевается нуклеиновая кислота (например, ДНК, РНК), свободная от генов, которые в естественном геноме организма, из которого получена молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, фланкируют интересующий ген. Следовательно, этот термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которая вставлена в вектор; в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус; или в геномную ДНК прокариота или эукариота; или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или геномный или кДНК-фрагмент, полученный в результате ПЦР или обработки эндонуклеазами рестрикции), независимо от других последовательностей. Кроме того, этот термин включает молекулу РНК, транскрибированную с молекулы ДНК, а также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность.

Термины "изолированный", "очищенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, который в разной степени свободен от компонентов, которые обычно в нем присутствуют в его естественном состоянии. "Изолировать" означает степень отделения от исходного источника или окружающей среды. "Очистить" означает степень отделения выше, чем изоляция. "Очищенный" или "биологически чистый" белок в достаточной степени свободен от других материалов, так что любые примеси не оказывают существенного воздействия на биологические свойства белка и не вызывают иных неблагоприятных последствий. То есть, нуклеиновые кислоты или пептиды согласно данному изобретению очищены, если они в значительной степени свободны от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды, когда они получены с помощью способов с использованием рекомбинантной ДНК, или химических прекурсоров или других химических веществ в случае, если они химически синтезированы. Чистота и однородность обычно определяются с помощью способов аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Термин «очищенный» может обозначать, что нуклеиновая кислота или белок приводят к появлению по существу одной полосы в гель-электрофорезе. Для белка, который может быть подвергнут модификациям, например, фосфорилированию или гликозилированию, различные модификации могут порождать различные изолированные белки, которые могут быть отдельно очищены.

Под "температурой плавления (Тп)" подразумевается температура системы в равновесии, при которой 50% молекул пребывает в одном состоянии, и 50% молекул находится пребывает в другом состоянии. В отношении нуклеиновых кислот изобретения Тп представляет собой температуру, при которой 50% молекул является одноцепочечными, а 50% является двуцепочечными (например, внутримолекулярно или межмолекулярно).

"Наблюдение за реакцией" означает детектирование протекания реакции. В одном варианте осуществления наблюдение протекания реакции включает детекцию активности никующей эндонуклеазы, полимеразной достройки и/или детекцию завершения реакции амплификации.

В настоящем документе термин "получение", как, например, в обороте "получение агента", включает синтез, покупку или приобретение агента иным способом.

В настоящем документе термин "нуклеиновые кислоты", относится к дезоксирибонуклеотидам, рибонуклеотидам или модифицированным нуклеотидам и их полимерам в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Этот термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки остова или линкеры, которые являются синтетическими, встречающимися естественным образом и не встречающимися естественным образом, которые имеют свойства связывания, сходные с таковыми референсной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются таким же образом, что и референсные нуклеотиды. Примеры таких аналогов включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, 2'-модифицированные нуклеотиды (например, 2'-O-метилрибонуклеотиды, 2'-F-нуклеотиды).

В настоящем документе «модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду, имеющему одну или более модификаций нуклеозида, азотистого основания, пентозного кольца или фосфатной группы. Например, модифицированные нуклеотиды исключают рибонуклеотиды, содержащие аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, уридинмонофосфат и цитидинмонофосфаты и дезоксирибонуклеотиды, содержащие дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфаты, дезокситимидинмонофосфаты и дезоксицитидинмонофосфаты. Модификации включают те, которые естественным образом происходят в результате модификации ферментами, модифицирующими нуклеотиды, такими как метилтрансферазы. Модифицированные нуклеотиды также включают синтетические или не встречающиеся естественным образом нуклеотиды. Синтетические или не встречающиеся естественным образом модификации в нуклеотидах включают 2'-модификации, например 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH₂-O-2'-мостик, 4'-(CH₂)₂-O-2'-мостик, 2'-O-(N-метилкарбамат), или модификации, включающие аналоги оснований.

Под "нуклеотидным аддуктом" подразумевается компонент, ковалентно или иным образом связанный со стандартным азотистым основанием.

Под "никующим агентом" подразумевается химическое вещество, способное узнавать и связываться со специфической структурой на двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты и разрушать фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами одной цепи при связывании со своей распознанной специфической структурой, в результате чего создается свободная 3'-гидроксильная группа на терминальном нуклеотиде, предшествующем сайту никирования. В предпочтительном варианте осуществления, 3'-конец может быть достроен с помощью полимеразы, не содержащей экзонуклеазу. Примеры никующих агентов включают никующие эндонуклеазы, рибозимы, дезоксирибозимы и хелаторы переходных металлов.

Под "палиндромной" подразумевается нуклеотидная последовательность, идентичная или существенно идентичная при чтении от 5'- к 3'-концу на одной цепи или от 5'- к 3'-концу на комплементарной цепи. Термин "совершенный палиндром" относится к последовательности, имеющей две смежные подпоследовательности, такие, что при считывании одной подпоследовательности в направлении от 5'- к 3'-концу, она идентична другой подпоследовательности, считываемой в направлении от 3'- к 5'-концу.

Под "молекулой, останавливающей полимеразу" подразумевается компонент, ассоциированный с полинуклеотидной матрицей/праймером, предотвращающий или значительно замедляющий продвижение полимеразы по полинуклеотидной матрице. Предпочтительно, этот компонент включен в полинуклеотид. В одном из предпочтительных вариантов осуществления этот компонент предотвращает продвижение полимеразы по матрице.

Под "полимеразной достройкой" подразумевается продвижение полимеразы вперед по матрице, при котором подходящие мономеры ставятся в соответствие их партнерам по связыванию на полинуклеотидной матрице.

В настоящем документе термин "праймер-димер" обозначает димер двух мономерных олигонуклеотидных праймеров. В олигонуклеотидном праймере согласно изобретению, 5'-концевые участки мономерных праймеров димеризуются.

Под "полуколичественным" понимается предоставляющий оценку относительного количества на основе внутреннего контроля.

Под "специфическим продуктом" подразумевается полинуклеотидный продукт, возникающий в результате гибридизации олигонуклеотидных праймеров с комплементарной целевой последовательностью и последующей достройки целевой последовательности, опосредованной полимеразой.

Под "существенно изотермическим условием" подразумевается проведение реакции при одной температуре или в пределах узкого диапазона температур, которые существенно не варьируют. В одном из вариантов осуществления реакция, проводимая в существенно изотермических условиях, проводится при температуре, которая варьируется в пределах лишь примерно 1-5 °С (например, варьируется на 1, 2, 3, 4 или 5 градусов). В другом варианте осуществления реакция осуществляется при одной температуре в пределах эксплуатационных параметров используемого инструмента.

Под "способом количественного порога" подразумевается оценка количества на основе превышения или непревышения сравниваемого стандарта по количеству.

Под "референсным" понимается стандартное или контрольное условие. Как очевидно специалисту в данной области техники, соответствующий референт имеет один измененный элемент, что позволяет определить эффект этого элемента.

Под "субъектом" понимается млекопитающее, включая, не ограничиваясь нижеперечисленным, человека или млекопитающее, отличное от человека, такое как бык, лошадь, собака, баран или кошка.

Под "целевой молекулой нуклеиновой кислоты" понимается полинуклеотид, подлежащий анализу. Такие полинуклеотиды может представлять собой смысловую или антисмысловую цепь целевой последовательности. Термин "целевая молекулая нуклеиновой кислоты" также относится к ампликонам исходной целевой последовательности.

Диапазоны, упоминаемые в данном документе, следует понимать как сокращенные обозначения всех значений, входящих в диапазон. Например, диапазон от 1 до 50 следует понимать как включающий любое число, комбинацию чисел или поддиапазон в пределах группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.

Если не указано специально, или не очевидно из контекста, в настоящем документе, термин "или" понимается как включающий. Если не указано специально, или не очевидно из контекста, в настоящем документе термины "a", "a" и "the" понимаются как единственные или множественные.

Если не указано специально, или не очевидно из контекста, в настоящем документе, термин "примерно" подразумевает диапазон обычной толерантности, принятой в данной области техники, например, в рамках двух стандартных отклонений среднего. «Примерно» следует понимать как в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанного значения. Если из контекста не следует иного, все числовые значения, приведенные в данном документе, изменяются в присутствии термина "примерно".

Перечисление химических групп в любом определении переменной в настоящем документе включает определения этой переменной как представляющей собой любую отдельную группу или комбинацию перечисленных групп. Упоминание варианта осуществления для переменной или аспекта в настоящем документе включает этот вариант осуществления как любой отдельный вариант осуществления или в сочетании с любыми другими вариантами осуществления или их частями.

Любые композиции или способы, приведенные в настоящем документе, могут сочетаться с одним или более другими композициями и способами, приведенными в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1A-1F описывают структуру и механизм субстрата никирования и реакции достройки. На Фиг.1А изображена структура молекулы субстрата никирования и реакции достройки согласно изобретению. На Фиг.1B изображен олигонуклеотидный дуплекс, имеющий сайт никирования на одной цепи, находящийся ближе к 5'-концу от детектируемой репортерной молекулы, прикрепленной к 3'-концу цепи (например, ковалентно пришитой). В приведенном примере, детектируемый репортер представляет собой флуорофор, расположенный вблизи тушителя, находящегося на 5'-конце противоположной цепи. Когда две цепи гибридизуются, 3'-концевой флуорофор (например, FAM, HEX) и тушитель (например, 5IabRQ, BHQ-1) оказываются вблизи друг от друга, и флуоресцентный сигнал тушится. На Фиг.1C показано, что молекула субстрата согласно изобретению имеет сайт узнавания никующей эндонуклеазы, и никируется в присутствии никующей эндонуклеазы, которая связывается в этом сайте. На Фиг.1D показано, что никированная молекула субстрата согласно изобретению имеет свободный 3'-конец в сайте никирования, с которым может связаться полимераза. На Фиг.1E показана полимеразная достройка с использованием комплементарной цепи в качестве матрицы. Полимеразная достройка замещает участок цепи по направлению к 3'-концу от сайта никирования, который связан с детектируемым репортером. Детектируемый репортер флуоресцирует, когда он отделен от тушителя. Фиг.1F показывает, что продукт реакции достройки может быть никирован. Это может привести к дополнительному образованию «шортмеров», которые могут быть спроектированы так, что будут гибридизоваться сами с собой и «выключать» реакцию. Таким образом, молекула может быть спроектирована таким образом, чтобы предотвратить или свести к минимуму дальнейшие циклы никирования-достройки. Дополнительно, последовательность на участке между 5'-концом и сайтом никирования может быть спроектирована таким образом, чтобы она была нестабильной при температуре реакции, так что она отделяется, не допуская достройки со свободного З'-конца.

Фиг.2A и 2B показывают, что никирование и достройка молекулы субстрата согласно изобретению приводит к линейному возрастанию сигнала. Фиг.2A представляет собой схему, показывающую линейное возрастание сигнала от молекулы субстрата согласно изобретению в присутствии никующей эндонуклеазы и полимеразы по мере прохождения реакции. Линейное возрастание предполагается, когда молекула субстрата и/или ее нити не взаимодействуют с какими-либо другими компонентами реакции. Например, 3'-конец любой нити может быть заблокирован флуорофором или C3-спейсером. Фиг.2B представляет собой схему, показывающую использование молекулы субстрата согласно изобретению как молекулы внешнего контроля в реакции никующей амплификации. Молекула субстрата может использоваться в качестве контроля, чтобы показать, что никующая эндонуклеаза и полимераза обладают активностью в реакции никующей амплификации. Конечные точки реакции никующей амплификации могут быть установлены как моменты времени, когда молекула внешнего контроля достигает установленного значения ОФЕ (относительные флуоресцентные единицы). Например, это может использоваться для характеристики сигнала амплификации как положительного или отрицательного на основе момента его обнаружения.

На Фиг.3A и 3B изображен «лонгмер» субстрата согласно изобретению, который в одном из примеров может использоваться для изучения процессивности полимеразы. На Фиг.3А изображена структура никирования и «лонгмера» молекулы согласно изобретению, называемая «обобщенный «лонгмер» для тестирования активности двух ферментов». Множественные репортеры (например, разные цвета) могут использоваться для индикации процессивности полимеразы. Используется один тушитель на каждый репортер. Двухцепочечная молекула ДНК имеет длину до 2000 п.н. Субстрат из нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать модификации в основаниях, аддукты и т.п. для исследования влияния этих модификаций на процессивность фермента. На Фиг.3B изображены изменения и факторы, которые могут использоваться для изучения их воздействия на процессивность полимеразы. Использование «лонгмер»-версии включает, но не ограничивается, исследованиями: процессивности полимеразы, метилирования ДНК, ДНК-аддуктов/продуктов повреждения или ДНК-связывающих белков. Что касается исследований метилирования ДНК, сайты метилирования ДНК обычно расположены по цитозинам в CpG-сайтах в положении С5 (5-метилцитозин). Что касается ДНК-аддуктов/продуктов повреждения, примеры включают в себя ацетальдегид, цисплатин, 7,12-диметилбензантрацен, малондиальдегид, продукты эксцизионной репарации оснований, продукты окислительного повреждения, бензопирен, афлатоксин, другие реактивные компоненты ДНК.

На Фиг.4 представлены последовательности, используемые для проверки влияния модифицированных нуклеотидов на свойства молекулы субстрата согласно изобретению. Олигонуклеотидная цепь ExogContBOT, у которой имеется 5'-концевой тушитель 5IabRQ (5' Iowa Black RQ), была гибридизована с каждой из олигонуклеотидных цепей, имеющих 3'-концевой флуорофор 36-FAM: vanilla (без модифицированных нуклеотидов), nick-2 (2'OMe в положении 2 по направлению к 5'-концу от сайта никирования), nick+1 (2'OMe в положении 1 по направлению к 3'-концу от сайта никирования) и nick-1 (2'OMe в положении 1 по направлению к 5'-концу от сайта никирования).

Фиг.5A-5Е иллюстрируют активность молекул субстрата, имеющих олигонуклеотидные цепи, показанные на рисунке 4, в присутствии никующей эндонуклеазы в различных концентрациях, и полимеразы. Результаты показывают, что реакция молекулы субстрата может быть настроена в зависимости от использованных модифицированных нуклеотидов, концентрации молекулы субстрата относительно количества никующей эндонуклеазы и/или смесей различно модифицированных молекул субстрата. Фиг.5А представляет собой диаграмму, описывающую активность молекул субстрата, имеющих олигонуклеотидные цепи, показанные на рисунке 4, в присутствии 0.3 Ед/мкл никующей эндонуклеазы. Фиг.5B представляет собой диаграмму, описывающую активность молекул субстрата, имеющих олигонуклеотидные цепи, показанные на рисунке 4, в присутствии 0.015 Ед/мкл никующей эндонуклеазы. Фиг.5C представляет собой диаграмму, описывающую активность молекул субстрата, имеющих олигонуклеотидные цепи, показанные на рисунке 4, в присутствии 0.075 Ед/мкл никующей эндонуклеазы. Фиг.5D представляет собой диаграмму, описывающую активность молекул субстрата, имеющих олигонуклеотидные цепи, показанные на рисунке 4, в присутствии 0.00375 Ед/мкл никующей эндонуклеазы. Фиг.5B представляет собой диаграмму, описывающую активность молекул субстрата, имеющих олигонуклеотидные цепи, показанные на фиг. 4, в присутствии 0.0188 Ед/мкл никующей эндонуклеазы.

На Фиг.6A-6D изображены диаграммы, приведенные на Фиг.4A-4E, полученные с помощью немодифицированных и модифицированных олигонуклеотидных цепей, имеющих 3'-концевой флуорофор 36-FAM. На Фиг.6А изображены реакционные кривые для молекулы субстрата, включающей олигонуклеотидную цепь ExogContBOT, у которой имеется 5'-концевой тушитель 5IabRQ и олигонуклеотидную цепь vanilla, имеющую 3'-концевой флуорофор 3-FAM и не содержащую модифицированных нуклеотидов. На Фиг.6B изображены реакционные кривые для молекулы субстрата, включающей олигонуклеотидную цепь ExogContBOT, у которой имеется 5'-концевой тушитель 5IabRQ, и олигонуклеотидную цепь nick-2, имеющую 3'-концевой флуорофор 36-FAM и 2'OMe в положении 2 по направлению к 5'-концу от сайта никирования. На Фиг.6С изображены реакционные кривые для молекулы субстрата, включающей олигонуклеотидную цепь ExogContBOT, у которой имеется 5'-концевой тушитель 5IabRQ, и олигонуклеотидную цепь nick-1, имеющую 3'-концевой флуорофор 36-FAM и 2'OMe в положении 1 по направлению к 5'-концу от сайта никирования. На Фиг.6D изображены реакционные кривые для молекулы субстрата, включающей олигонуклеотидную цепь ExogContBOT, у которой имеется 5'-концевой тушитель 5IabRQ и олигонуклеотидную цепь nick+1, имеющую 3'-концевой флуорофор 36-FAM и 2'OMe в положении 1 по направлению к 3'-концу от сайта никирования.

На Фиг.7 изображены результаты исследования, в котором определялось влияние длины олигонуклеотида между 5'-концом и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы на молекуле субстрата. Диаграмма реакционных кривых показана для молекул субстрата, имеющих указанные олигонуклеотидные пары. Последовательности олигонуклеотидных цепей молекул субстрата показаны под диаграммой.

На Фиг.8 изображены результаты исследования, в котором определялось влияние использования различных соотношений молекул субстрата, включающих немодифицированные и модифицированные нуклеотиды. Диаграмма реакционных кривых показана для реакций, имеющих указанное соотношение молекул субстрата. Последовательности олигонуклеотидных цепей немодифицированных и 2'OMe-модифицированных молекул субстрата показаны под диаграммой. Это показывает, что реакция может быть настроена для достижения желаемого порогового значения за заданное время с использованием различных соотношений различных молекул субстрата.

Фиг.9А и 9B иллюстрируют результаты исследования, в котором определялось влияние позиционирования модифицированных нуклеотидов в различных положениях в молекуле субстрата. Фиг.9А представляет собой диаграмму реакционных кривых для реакции, в которой использовались молекулы субстрата, имеющие последовательности, показанные под диаграммой (А-F). Фиг.9B представляет собой диаграмму реакционных кривых для реакции, в которой использовались молекулы субстрата, имеющие последовательности, показанные под диаграммой (А-F).

На Фиг.10 изображены результаты исследования, показывающего, что молекула субстрата может использоваться для тестирования никующей эндонуклеазы и/или полимеразы.

На Фиг.11 изображены окончательные последовательности молекулы внешнего/внутреннего контроля для использования в анализе на Salmonalla, основанном на реакции никующей амплификации.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты для реакций никирования и достройки, имеющих флуорофор с подавленной флуоресценцией, который высвобождается и может флуоресцировать в результате воздействия никующей эндонуклеазы и полимеразы на субстрат. Молекула субстрата согласно изобретению может быть добавлена к известным реакциям никующей амплификации, и, таким образом, использоваться в качестве молекулы внешнего контроля в реакции никующей амплификации. В этой связи молекула внешнего контроля обеспечивает контроль как для активности никующей эндонуклеазы, так и для активности полимеразы, которые присутствуют в реакции никующей амплификации. Даже проводимая параллельно, реакция внешнего контроля не интерферирует в заметной степени с первичной реакцией амплификации. Например, внешний контроль не потребляет больших количеств компонентов реакции, таких как дНТФ. Внешний контроль может быть спроектирован таким образом, чтобы свести к минимуму формирование 3'-концов, которое может привести к неспецифической полимеразной достройке и фоновым шумам. Как показано в настоящем документе, молекула внешнего контроля также может быть "настроена" на запуск в определенное время. Сама по себе молекула субстрата изобретения может использоваться в тесте активности ферментов или для проверки качества фермента.

Молекула субстрата для реакций никирования и достройки

Изобретение относится к молекуле субстрата для реакций никирования и достройки, которая может использоваться для тестирования или подтверждения активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции. Как показано на Фиг.1А-1Е, молекула субстрата включает олигонуклеотидный дуплекс, связанный на одном конце с детектируемым репортером (например, парой флуорофор-тушитель; донор-акцепторной парой для флуоресцентной передачи энергии (FRET)). В некоторых вариантах осуществления эти две олигонуклеотидные цепи ковалентно связаны. Олигонуклеотидный дуплекс содержит сайт узнавания никующей эндонуклеазы, такой, что при никировании молекулы 3'-конец, образованный разрывом, может запускать полимеразную достройку, приводящую к активации детектируемого репортера. В некоторых вариантах осуществления детектируемый репортер представляет собой флуоресцентный репортер (например, FAM), сопряженный с молекулой-тушителем (например, любая взаимодействующая пара флуорофора и тушителя или донор-акцепторная FRET-пара, известная на существующем уровне техники). Флуоресцентный репортер активируется заместительной активностью полимеразы и отделением флуорофора от тушителя. Флуоресцентный репортер ковалентно связан с 3'- или 5'-концом олигонуклеотидного дуплекса, а тушитель ковалентно связан с 5'- или 3'-концом противоположной цепи, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, имеется один или более флуорофоров, представляющих собой FAM, TET, HEX, TAMRA, JOE или ROX. В различных вариантах осуществления имеется один или более тушителей, представляющих собой дабцил, дабсил, Black Hole Quencher dye, в том числе 5' Iowa Black® RQ (5IabRQ). Как правило, тушащий краситель представляет собой тушащий краситель, соответствующий флуорофору по возбуждению. Пары флуорофор-тушитель и их выбор описаны, например, в Marras, Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes in Methods in Molecular Biology: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols. Edited by: V.V. Didenko © Humana Press Inc., Totowa, NJ. Если в качестве внешнего контроля используется субстрат никирования и достройки, детектируемая флуоресцентная метка выбирается так, чтобы обеспечить детектируемый флуоресцентный сигнал, отличный от того, который используется в зонде для детекции апмлификации целевой нуклеиновой кислоты (например, FAM и CalRed). В предпочтительном варианте осуществления свободный 3'-конец (т.е. не имеющий флуоресцентного репортера или тушителя) блокируется для предотвращения его использования в реакциях полимеразной достройки. Свободный 3'-конец может блокироваться с помощью 3-углеродного спейсера (C3-спейсера) или дидезоксинуклеотида. В ходе синтеза на свободный 3'-конец могут быть добавлены различные модификаци, предотвращающие его достройку, включая фосфорилирование, пришивку красителя, флуорофора, тушителя, спейсера или линкера.

Субстрат никирования и достройки может содержать сайт узнавания любой никующей эндонуклеазы. Сайт узнавания никующей эндонуклезы ферментов располагается таким образом, что удлинение 3'-конца, открываемого одноцепочечным разрывом, приводит к полимеразной достройке и активации детектируемого репортера. При использовании в качестве молекулы внешнего контроля, сайт узнавания никующей эндонуклеазы соответствует никующей эндонуклеазе, используемой в реакции никующей амплификации. Примеры никующих эндонуклеаз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI(NEB), Nb.Bpu10I(Fermantas), Nb.BsmI(NEB), Nb.BsrDI(NEB), Nb.BtsI(NEB), Nt.AlwI(NEB), Nt.BbvCI(NEB), Nt.Bpu10I(Fermentas), Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI(NEB), Nt.BstNBI(NEB), и Nt.CviPII(NEB). В таблице 1 приводятся последовательности сайтов узнавания никующей эндонуклеазы.

Таблица 1. Последовательности узнавания никующих эндонуклеаз

N.Bst9I	5'-GAGTCNNNNN↓NN-3' |||||||||| || 3'-CTCAGNNNNN•NN-5'
N.BstSEI	5'-GAGTNCNNNN↓NN-3' |||||||||| || 3'-CTCAGNNNNN•NN-5'
Nb.BbvCI(NEB)	5'-CCTCA•GC-3' ||||| || 3'-GGAGT↑CG-5'
Nb.Bpu10I(Fermantas)	5'-CCTNA•GC-3' ||||| || 3'-GGANT↑CG-5'
Nb.BsmI(NEB)	5'-GAATG•CN-3' ||||| || 3'-CTTAC↑GN-5'
Nb.BsrDI(NEB)	5'-GCAATG•NN-3' |||||| || 3'-CGTTAC↑NN-5'
Nb.BtsI(NEB)	5'-GCAGTG•NN-3' |||||| || 3'-CGTCAC↑NN-5'
Nt.AlwI(NEB)	5'-GGATCNNNN↓N-3' ||||||||| | 3'-CCTAGNNNN•N-5'
Nt.BbvCI(NEB)	5'-CC↓TCAGC-3' || ||||| 3'-GG•AGTCG-5'
Nt.Bpu10I(Fermentas)	5'-CC↓TNAGC-3' || ||||| 3'-GG•ANTCG-5'
Nt.BsmAI	5'-GTCTCN↓N-3' |||||| | 3'-CAGAGN•N-5'
Nt.BspD6I	5'-GAGTCNNNN↓N-3' ||||||||| | 3'-CTCAGNNNN•N-5'
Nt.BspQI(NEB)	5'-GCTCTTCN↓-3' |||||||| 3'-CGAGAAGN -5'
Nt.BstNBI(NEB)	5'-GAGTCNNNN↓N-3' ||||||||| | 3'-CTCAGNNNN•N-5'
Nt.CviPII(NEB)	5'-↓CCD-3' ||| 3'- GGH-5'

В некоторых вариантах осуществления, сайт узнавания никующей эндонуклеазы представляет собой Nt.BstNBI для использования с никующей эндонуклеазой Nt.BstNBI, широко используемой в реакциях никующей амплификации.

Длина и нуклеотидная последовательность молекулы субстрата никирования и достройки могут зависеть от различных факторов, в том числе от их предполагаемого использования. Длина молекулы субстрата ограничена только длиной полинуклеотидов, которые позволяют синтезировать современные технологии. Однако для некоторых приложений, таких как использование в качестве внешнего контроля реакции, длина субстрата может быть сведена к минимуму, чтобы сделать доступными свободные дНТФ или другие компоненты реакции амплификации нуклеиновых кислот. В других приложениях, таких как использование в исследовании процессивности, может использоваться более длинный субстрат. В различных вариантах осуществления дуплекс имеет длину от примерно 30 п.н. до примерно 2 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 1 т.п.н., от примерно 100 п.н. до примерно 500 п.н. В других вариантах осуществления олигонуклеотиды дуплекса имеют длину от примерно 30 н. до примерно 2000 н., от примерно 100 н. до примерно 1000 н., от примерно 100 н. до примерно 500 н. В различных вариантах осуществления длина олигонуклеотидного дуплекса составляет от примерно 30 до примерно 100 п.н., от примерно 30 до примерно 60 п.н., от примерно 35 до примерно 50 п.н. В других вариантах осуществления длина олигонуклеотидов дуплекса составляет от примерно 30 до примерно 100 н., от примерно 30 до примерно 60 н., от примерно 35 до примерно 50 н. Аналогично, последовательности молекулы субстрата выбираются так, чтобы минимизировать взаимодействие с последовательностями других молекул нуклеиновой кислоты, которые могут присутствовать в реакции, включая последовательности целевых нуклеиновых кислот, последовательности праймеров, последовательности зондов и/или неспецифичные фоновые последовательности (например, геномные последовательности в биологическом образце).

Положение сайта узнавания никующей эндонуклеазы и/или сайта никирования на молекуле субстрата зависит от целого ряда факторов, в том числе от самой никующей эндонуклеазы. Например, при использовании никующей эндонуклеазы Nt.BstNBI, вносящей разрыв в направлении 3' от ее сайта узнавания, часть олигонуклеотидной цепи между 3'-концом и сайтом никирования дуплекс имеет температуру плавления, превышающую самую высокую температуру в реакции. Длина участка олигонуклеотидной цепи между 3'-концом и сайтом никирования составляет примерно 25 н., примерно 35 н., примерно 40 н. или более. Таким образом, генерация сигнала сопряжена с замещением цепи полимеразой.

Длина участка олигонуклеотидной цепи между 5'-концом и сайтом никирования составляет примерно 10 н., примерно 15 н., примерно 20 н. или более. Если участок олигонуклеотидной цепи между 5'-концом и сайтом никирования имеет температуру плавления дуплекса ниже температуры реакции, то полимеразная достройка со свободного 3'-конца минимизируется. Например, последовательность на участке между 5'-концом и сайтом никирования может быть спроектирована таким образом, чтобы она была нестабильной при температуре реакции, так что она отделяется, не допуская достройки со свободного 3'-конца. Альтернативно, подобные "шортмеры" могут быть спроектированы так, что будут гибридизоваться сами с собой и "выключать" реакцию. Кроме того, было обнаружено, что молекула субстрата обладает активностью, когда один или более нуклеотидов присутствуют между 5'-концом и сайтом узнавания Nt.BstNBI. Между 5'-концом и сайтом узнавания Nt.BstNBI может присутствовать от одного до примерно 10 нуклеотидов, от двух до примерно 5 нуклеотидов. Укорочение олигонуклеотидной цепи между 5' и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы изменяет скорость реакции и обеспечивает возможность настройки реакции.

Вставка 2'OMe-модифицированных нуклеотидов в молекуле субстрата между сайтом распознавания никующей эндонуклеазы и сайтом никирования изменяет скорость субстратной реакции. В некоторых вариантах осуществления модифицирован один или более нуклеотидов первой нуклеотидной цепи в положениях 1 или 2 по направлению к 5'-концу от сайта никирования, и в положении 1 по направлению к 3'-концу от сайта никирования. В дуплексе, включающем сайты узнавания и никирования Nt.BstNB1, описание положений соответствует нумерации (положение 1, 2, 3, 4 и т.д.) и направлению (5' или 3'), как показано ниже:

положения по направлению к 5'-концу положения по направлению к 3'-концу

от сайта никирования от сайта никирования

Размещение 2'OMe модифицированных нуклеотидов в молекуле субстрата может использоваться для "настройки" реакции (т.е. скорости реакции). Один или более нуклеотидов между сайтом узнавания никующей эндонуклеазы и сайтом никирования Nt.BstNBI могут представлять собой 2'OMe-модифицированный нуклеотид. В конкретных вариантах осуществления, один или более 2'OMe-модифицированных нуклеотидов находятся в положениях 1 и 2 по направлению к 5'-концу от сайта никирования и/или в положении 1 по направлению к 3'-концу от сайта никирования.

Возможность настройки реакции может также быть достигнута с использованием модифицированных нуклеотидов, разветвленных нуклеотидов (например, T-fam) или любых нуклеотидов, влияющих на кинетику реакции, в том числе путем размещения модифицированных нуклеотидов на цепи, содержащей последовательность никирования; размещение модифицированных нуклеотидов на цепи, противоположной цепи, содержащей последовательность никирования. Возможность настройки реакции может также быть достигнута путем смешивания одной или более немодифицированных или модифицированных молекул субстрата (например, настройка путем смешивания олигонуклеотидов в прямом или обратном соотношении) и/или изменением молярности никующей эндонуклеазы относительно концентрации молекулы субстрата.

Способы использования молекулы субстрата

Молекула-субстрат для никующей эндонуклеазы и полимеразы может использоваться для определения активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в реакции. Молекула субстрата сама по себе может быть использована для оценки комбинаций никующих эндонуклеаз и полимераз, для определения оптимальных условий работы никующих эндонуклеаз и полимераз, или проверки качества никующих эндонуклеаз и полимераз. Полимеразы для использования в описанных в настоящем документе способах могут катализировать включение нуклеотидов для достройки 3'-гидроксильного конца олигонуклеотида (например, праймера), связанного с целевой молекулой нуклеиновой кислоты и/или 3'-гидроксильного конца в сайте никирования в двухцепочечной молекуле ДНК в сочетании с замещением цепи. Примеры полимераз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, производные и варианты ДНК полимеразы I, выделенной из Bacillus stearothermophilus, также классифицируемой как Geobacillus stearothermophilus, и из близкородственных бактериальных штаммов, изолятов и видов, включающих род Geobacillus, у которых отсутствует или значительно снижена 5'-3'-экзонуклеазная активность и имеется цепь-замещающая активность, а также большие фрагменты ДНК-полимеразы I Bst, ДНК-полимеразы I Bsu, ДНК-полимеразы I Gst, и ДНК-полимеразы I phi29. У таких полимераз также отсутствует или значительно снижена 5'-3'-экзонуклеазная активность, и они могут включать также термофильные полимеразы (например, Taq, Vent). В этой связи изобретение также относится к средству количественной оценки удельной активности комбинации никующей эндонуклеазы и полимеразы. Кроме того, молекула субстрата согласно изобретению может использоваться для исследования процессивности полимеразы в различных условиях, включая, например, метилирование ДНК или в присутствии ДНК-аддуктов/продуктов повреждения ДНК (например, ацетальдегида, цисплатина, 7,12-диметилбензантрацена, малондиальдегида, продуктов репарации, продуктов окислительного повреждения, бензопирена, афлатоксина, других реактивных соединений ДНК) и/или ДНК-связывающих белков (Фиг.3A и 3B). Кроме того, для изучения процессивности одна или более пар флуорофор-тушитель, включая различные, множественные флуорофоры, могут быть ковалентно пришиты (например, биотинилированы) внутри дуплекса (Фиг. 3А). Например, могут использоваться флуорофоры 1-5, по одному на канал, будучи биотинилированы или пришиты напрямую (например, с помощью сукцинимидил-эфиров). Один или более перекрывающихся тушителей могут быть сопряжены с ними на противоположной цепи. В некоторых случаях перекрывающиеся тушители охватывают широкую область спектра и могут быть сопряжены со множественными различными флуорофорами. Таким образом, молекула субстрата согласно изобретению может быть модифицирована, и влияние модификаций на полимеразную достройку и/или процессивность полимеразы может быть исследовано.

Молекула субстрата согласно изобретению также может быть добавлена к известным реакциям никующей амплификации и, таким образом, будет использоваться в качестве молекулы внешнего контроля в реакции никующей амплификации, например, для проверки истинности отрицательной реакции. Соответственно, молекула внешнего контроля используется при тех же температурах реакции, при которых проводится реакция никующей амплификации. Простое присутствие или отсутствие сигнала могут использоваться в качестве контроля на реакцию. Дополнительно, момент времени, в который реакция внешнего контроля достигает установленного значения ОФЕ, может показывать конечную точку реакции. Молекула внешнего контроля также может быть "настроена" на конкретную скорость реакции, таким образом, изменяя время достижения заданного значения ОФЕ. Даже если реакция внешнего контроля проводится в той же реакционной среде, что и реакция никующей амплификации, она не может существенно влиять на первичную реакцию амплификацию. Внешний контроль не потребляет значительных количеств компонентов реакции, таких как дНТФ или других реагентов. Дополнительно, внешний контроль может быть спроектирован таким образом, чтобы свести к минимуму формирование 3'-концов, которое может привести к неспецифической полимеразной достройке и фоновым шумам.

Способы амплификации нуклеиновых кислот

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой широко используемую технологию амплификации нуклеиновых кислот, основанную на температурных циклах, применяемую для амплификации ДНК, состоящую из многократных циклов нагрева-охлаждения реакционной среды для плавления ДНК и энзиматической репликации ДНК с использованием ДНК-полимеразы. Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР) представляет собой способ, используемый для количественной оценки количества копий заданной нуклеотидной последовательности в биологическом образце. В настоящее время кПЦР использует детекцию продуктов реакции в реальном времени в ходе реакции и сравнивает профиль амплификации с амплификацией в контроле, содержащем известное количество нуклеиновых кислот в начале каждой реакции (или известное соотношение нуклеиновых кислот к неизвестной определяемой нуклеиновой кислоте). Результаты контрольных реакций используются для построения стандартных кривых, обычно основанных на логарифмическом участке стандартных кривых реакции амплификации. Эти значения используются для интерполяции количества определяемых псоледовательностей, основанной на том, как их кривые амплификации соотносятся со стандартными контрольными количествами.

Помимо ПЦР, существуют технологии амплификации нуклеиновых кислот, не использующие температурные циклы или являющиеся изотермическими, включая, не ограничиваясь нижеперечисленным, реакцию никующей амплификации, амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), хеликаза-зависимую амплификацию (HDA), петлевую изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с замещением цепи (SDA), транскрипционно-опосредованную амплификацию (ТМА), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR), амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), однопраймерную изотермическую амплификацию (SPIA), Q-β-репликазную систему и рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA).

Изотермическые реакции никующей амплификации имеют сходство с температурными циклами ПЦР. Подобно ПЦР, реакции никующей амплификации используют олигонуклеотидные последовательности, комплементарные целевым последовательностям, называемые праймерами. Кроме того, реакция никующей амплификации целевых последовательностей приводит к логарифмическому накоплению целевой последовательности, точно так же, как и в стандартной ПЦР. В отличие от стандартной ПЦР, реакции никующей амплификации проводятся в изотермических условиях. В стандартной ПЦР температура повышается для того, чтобы две цепи ДНК могли разойтись. В реакции никующей амплификации в целевые нуклеотидные последовательности вносится одноцепочечный разрыв в специфических сайтах никирования, присутствующие в тестируемом образце. Полимераза обнаруживает сайт никирования и начинает синтез комплементарной цепи никированной целевой нуклеотидной последовательности нуклеотидов (добавленной экзогенной ДНК) наряду с замещением имеющейся дополнительной комплементарной цепи ДНК. Процесс репликации-замещения цепи устраняет необходимость в повышении температуры. В этот момент молекула праймера гибридизуются с замещенной комплементарной последовательностью добавленной экзогенной ДНК. После этого полимераза достраивает 3'-конец шаблона, создавая комплементарную цепь к ранее замещенной цепи. Второй олигонуклеотидный праймер затем гибридизуется с вновь синтезированной комплементарной цепью и достраивается, образуя дуплекс ДНК, который включает последовательность узнавания никующей эндонуклеазы. Затем эта цепь подвергается никированию с последующей полимеразной достройкой-замещением, ведущей к образованию дуплекса ДНК, имеющего сайты никирования с обеих сторон исходной целевой ДНК. Сразу после первичного синтеза эта молекула продолжает амплифицироваться экспоненциально посредством репликации смещенных цепей с новыми молекулами шаблона. Кроме того, усиление также происходит линейно с каждой молекулы продукта посредством многократных циклов разрыва-трансляционного синтеза на сайтах никирования, внесенных шаблоном. В результате очень быстро увеличивается число целевых сигналов; гораздо более быстро, чем в температурных циклах ПЦР, при этом амплификация достигается менее чем за десять минут.

Способы проведения никующей амплификации

Изобретение относится к молекуле субстрата для использования при детекции молекул нуклеиновой кислоты, амплифицируемых способом изотермической никующей амплификации. Подобные способы известны на существующем уровне техники и описаны в настоящем документе. См., например, опубликованную патентную заявку США 2009/0081670, Заявку на договор о патентной кооперации 2009/012246 и патенты США 7,112,423 и 7,282,328, каждый из которых включен во всей полноте в настоящий документ.

Полимеразы для использования в описанных в настоящем документе способах могут катализировать включение нуклеотидов для достройки 3'-гидроксильного конца олигонуклеотида (например, праймера), связанного с целевой молекулой нуклеиновой кислоты и/или 3'-гидроксильного конца в сайте никирования в двухцепочечной молекуле ДНК в сочетании с замещением цепи. У таких полимераз также отсуствует или значительно снижена 5'-3'-экзонуклеазная активность, и они могут включать также термофильные полимеразы (например, Taq, Vent). ДНК-полимеразы, применяемые в способах, подразумевающих использование 2'-модифицированных нуклеотидов на участке праймера, содержащем шесть 3'-концевых нуклеотидов, включают производные и варианты ДНК-полимеразы I, выделенной из Bacillus stearothermophilus, также классифицируемой как Geobacillus stearothermophilus, и из близкородственных бактериальных штаммов, изолятов и видов, включающих род Geobacillus, у которых отсутствует или значительно снижена 5'-3'-экзонуклеазная активность и имеется цепь-замещающая активность. В различных вариантах осуществления любого аспекта из описанных в настоящем документе полимераза представляет собой ДНК-полимеразу I Bst, ДНК-полимеразу Bsu, ДНК-полимеразу I Gst, или ДНК-полимеразу I Gka. В других вариантах осуществления примеры полимераз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, BST (большой фрагмент), ДНК-полимеразу I (E. coli), ДНК-полимеразу I, большой (Klenow-) фрагмент, Klenow-фрагмент (3'-5' exo-), ДНК-полимеразу T4, ДНК-полимеразу T7, ДНК-полимеразу Deep VentR(exo-), ДНК-полимеразу Deep VentR, DyNAzyme, High-Fidelity ДНК-полимеразу, ДНК-полимеразу Therminator, Therminator II, ДНК-полимеразу AmpliTherm, ДНК-полимеразу Taq, ДНК-полимеразу Tth, ДНК-полимеразу Tfl, ДНК-полимеразу Tgo, ДНК-полимеразу SP6, ДНК-полимеразу Tbr или их активные фрагменты.

Никующий агент, используемый в способах, описанных в настоящем документе, представляет собой химическое вещество, способное узнавать и связываться со специфической структурой на двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты и разрушать фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами на верхней цепи со значительно большей скоростью, чем оно разрушает фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами на нижней цепи при связывании со своей распознанной специфической структурой, в результате чего создается свободная 3'-гидроксильная группа на терминальном нуклеотиде, предшествующем сайту никирования, который может быть достроен цепь-замещающей полимеразой без 5'-3'-экзонуклеазной активности. В предпочтительном варианте осуществления описанных в настоящем документе способов скорость разрыва "никующим агентом" фосфодиэфирной связи на верхней цепи приближается к 100%, в то время как скорость разрыва фосфодиэфирной связи на верхней цепи приближается к 0%. Никующие агенты, применяемые в описанных здесь способах, могут быть ферментами, т.е. саморегенерирующимися катализаторами, работающими на множестве молекул субстрата, или нерегенерируемыми катализаторами, работающими только на одной молекуле субстрата в эквимолярном режиме.

Никующая эндонуклеаза связывает двойную ДНК и вносит разрыв в одну из цепей двухцепочечного дуплекса. В способах согласно изобретению, никующий фермент вносит разрыв в верхнюю цепь (цепь, включающую 5'-3'-последовательность узнавания никующего агента). В конкретном варианте осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, никующая эндонуклеаза вносит разрыв только в верхнюю цепь, причем по направлению к 3'-концу от сайта узнавания. В примере варианта осуществления реакция включает использование никующей эндонуклеазы, вносящей разрыв, или никующей, после сайта связывания, так что последовательность продукта не содержит сайта никирования. Использование фермента, вносящего разрыв после сайта связывания, облегчает полимеразную достройку, не требуя удаления никующей эндонуклеазы. В идеальном случае, никующая эндонуклеаза функционирует в тех же условиях реакции, что и полимераза. Примеры никующих эндонуклеаз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI(NEB), Nb.Bpu10I(Fermantas), Nb.BsmI(NEB), Nb.BsrDI(NEB), Nb.BtsI(NEB), Nt.AlwI(NEB), Nt.BbvCI(NEB), Nt.Bpu10I(Fermentas), Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI(NEB), Nt.BstNBI(NEB), и Nt.CviPII(NEB). В таблице 1 приводятся последовательности сайтов узнавания никующей эндонуклеазы.

Никующие эндонуклеазы также включают рекомбинантные никующие эндонуклеазы, созданные путем модификации нуклеазной активности эндонуклеаз рестрикции (NEB expressions July 2006, vol 1.2). Когда эндонуклеазы рестрикции связываются с их последовательностями узнавания в ДНК, два каталитических сайта каждого фермента, гидролизующих каждую из цепей, параллельно выполняют две независимые реакции гидролиза. Модифицированные ферменты рестрикции могут быть сконструированы таким образом, чтобы они гидролизовали лишь одну цепь дуплекса, образуя "никированные" молекулы ДНК, (3'-гидроксил, 5'-фосфат), а не расщепленные. Никующие эндонуклеазы также могут включать модифицированные CRISPR/Cas-белки, такие нуклеазы, подобные активатору транскрипци (TALEN) и цинковопальцевые нуклеазы, обладающие никазной активностью.

Реакция никующей амплификации, как правило, включает нуклеотиды, например, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ). Реакция может также осуществляться в присутствии дНТФ, которые включают детектируемые компоненты, включая, но не ограничиваясь нижеперечисленным, радиоактивные метки (например, ³²P, ³³P, ¹²⁵I, ³⁵S), фермент (например, щелочную фосфатазу), флуоресцентую метку (например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC)), биотин, авидин, дигоксигенин, антигены, гаптены или флуорохромы. Реакция дополнительно включает некоторые соли и буферы, которые обеспечивают активность никующих эндонуклеаз и полимераз.

Преимуществом является то, что реакция никующей амплификации проводится в существенно изотермических условиях, при которых температура реакции более или менее постоянна в течение всей реакции амплификации. Поскольку необходимость в циклическом переключении между более высокой и более низкой температурой отсутствует, реакция никующей амплификации может осуществляться в условиях, при которых провести обычную ПЦР было бы затруднительно. Как правило, реакция осуществляется при температуре примерно между 35 С и 90 C (например, примерно 35, 37, 42, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85 °С). Преимуществом является то, что нет необходимости поддерживать температуру с высокой степенью точности. Некоторые колебания температуры являются приемлемыми.

Наборы праймеров для реакции амплификации выбираются, чтобы они имели ΔΔG≤-15, -16, -17, -18, -19, -20, -25, -30 ккал/моль или более. Характеристики эффективности реакции амплификации могут быть модифицированы путем увеличения концентрации одного или более олигонуклеотидов (например, одного или более праймеров и/или зондов) и/или их соотношения. Высокая концентрация праймеров также способствует образованию димеров праймеров. В различных вариантах осуществления концентрация праймеров составляет 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 нМ или более. Для снижения температуры плавления олигонуклеотидов можно также использовать модификаторы температуры плавления (Tп) и скорости реакции, например, этиленгликоль и глицерин, но не ограничиваясь ими. Кроме того, для изменения скорости реакции с целью повышения точности количественной оценки могут использоваться модификаторы скорости ДНК-полимеразной реакции (такие как концентрации дНТФ и магния). В конкретных вариантах осуществления 5'-концевые участки прямых и обратных праймеров имеют одинаковые нуклеотидные последовательности.

Настоящее изобретение относится к способам наблюдения за ходом реакции амплификации в реальном времени. В одном из вариантов осуществления, количественная амплификация нуклеиновых кислот использует целевые нуклеиновые кислоты наряду с контрольной амплификацией известного количества. Количество целевой нуклеиновой кислоты можно рассчитать в виде абсолютной количественной оценки или относительной количественной оценки (полуколичественной оценки), основанной на контрольных данных (внешнего или внутреннего контроля).

Количественная оценка неизвестной последовательности нуклеотидов может быть достигнута либо путем сопоставления логарифмической пороговой амплификации неизвестной последовательности и нескольких известных целевых последовательностей в отдельном наборе реакций или в той же самой реакции; или с помощью внутреннего эндогенного или экзогенного продукта коамплификации, достигающего пороговой величины, указывающей на положительный результат (если неизвестная последовательность превышает порог) или отрицательный результат (если неизвестная последовательность не превышает порога).

Изобретение также относится к способу конструирования никующий агент-зависимой изотермической реакции амплификации со смещением цепи без экспериментального скрининга множества комбинаций потенциальных прямых праймеров или потенциальных обратных праймеров. В пределах целевой последовательности определяется участок от 35 до 70 п.н. длиной, имеющий в центральной части последовательность от 12 до 20 п.н. длиной с Tп ≥ температуры проведения реакции (например, примерно 55 °С). В соответствии с вышеуказанными критериями определяются смежные последовательности длиной от 12 п.н. до 20 п.н. непосредственно до и после центрального участка длиной от 15 до 20 п.н. Tп выбранных двуцепочечных смежных даунстрим- и апстрим-последовательностей различается менее чем на±3 °С. Цель-специфическая пара прямых и обратных праймеров создается путем присоединения 5'-концевого участка, обеспечивающего стабильную димеризацию праймера, к 5'-концу смежной апстрим-последовательности, и к 5'-концу комплементарной цепи смежной даунстрим-последовательности длиной 12-20 п.н. При объединении прямого праймера, обратного праймера, а также зонда, праймер, запускающий синтез цепи, комплементарной зонду, находится в избытке по отношению к другому праймеру, причем молярное соотношение составляет примерно от 1.1:1 до 10:1. Суммарная концентрация праймера в реакции не превышает 1000 нМ. Такая постановка реакции может также использоваться для преобразования предвалидированной ПЦР для ампликона ≤ 70 п.н. в реакцию никующей изотермической амплификации со смещением цепи.

Конструирование праймеров

Обычные способы конструирования праймеров в основном ориентированы на температуру плавления, температуру гибридизации праймеров, содержание GC (гуанинина и цитозина), длину праймера, и минимизацию взаимодействия праймера со всеми нуклеиновыми кислотами, кроме целевой (см., например, www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html). В противоположность этим способам, было установлено, что праймеры, которые образуют праймер-димеры, стабильные в смысле свободной энергии образования (ΔG), функционируют предсказуемым образом в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Хотя и свободная энергия (ΔG), и температура плавления (Tп) зависят от первичных компонентов энтальпии (ΔH) и энтропии (ΔS), значения ΔG и Tп выводятся по-разному и не коррелируют друг с другом, и единственный способ связать заданное ΔG с заданным значением Tп состоит в том, чтобы в явном виде знать значение ΔH и ΔS, из которых они выводятся (Manthey, ʺmFold, Delta G, and Melting Temperatureʺ ©2005 and 2011 Integrated DNA Technologies). Фиг. 1-11 относятся к конструированию оптимальных праймеров.

Свободная энергия образования (ΔG) для межмолекулярных структур праймеров может быть рассчитана с использованием уравнений, известных на существующем уровне техники. Имеется ряд программ для определения формирования различных внутримолекулярных и межмолекулярных структур праймеров и расчета их ΔG, включая, например, алгоритмы прогнозирования mfold и UNAfold (см., например, Markham and Zuker. UNAFold: Software for Nucleic Acid Folding and Hybridization. Bioinformatics: Volume 2, Chapter 1, pp 3-31, Humana Press Inc., 2008; Zuker et al. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide In RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, 1999; M. Zuker. Prediction of RNA Secondary Structure by Energy Minimization. Methods in Molecular Biology, 267-294, 1994; Jaeger et al. Predicting Optimal and Suboptimal Secondary Structure for RNA. In Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Methods in Enzymology 183, 281-306, 1990; Zuker. On Finding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule. Science 244, 48-52, 1989). OligoAnalyzer 3.1 является одной из таких реализаций mfold для конструирования праймеров (www.idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoAnalyzer/). Например, в программе OligoAnalyzer расчеты ΔG могут выполняться с использованием следующих параметров: Целевая молекула: ДНК; Концентрация олигонуклеотидов 0,25 мкМ; Концентрация Na⁺: 60 мМ; Концентрация Mg⁺⁺: 15 мМ; и концентрация дНТФ: 0,3 мМ.

3'-концевая область узнавания

Изобретение относится к праймеру, имеющему 3'-концевую последовательность узнавания, формирующую устойчивый комплекс с целевой молекулой (ΔG≤примерно -20 ккал/мол или более), и способную повысить эффективность реакции амплификации нуклеиновых кислот. 3'-концевой участок узнавания специфически связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, например, с комплементарной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления 3'-концевой участок узнавания содержит последовательность, комплементарную 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или более, основаниям нуклеотидной последовательности. В конкретных вариантах осуществления, 3'-концевой участок узнавания содержит одно или более инозиновых оснований. В конкретных вариантах осуществления, 3'-концевой участок узнавания содержит не более 1/12 инозинов. В различных вариантах осуществления температура плавления комплекса праймера с целевой молекулой равна или превышает значение, составляющее на 8° или 6°С ниже температуры реакции или достройки в ходе анализа (Tп≥при температуре -8°). В конкретных вариантах осуществления 3'-концевая последовательность узнавания содержит от 12 до 20, от 12 до 17 или от 12 до 14 оснований. В конкретных вариантах осуществления комплекс праймера с целевой молекулой является более стабильным, чем гомодимер праймера (ΔΔG, например, составляет примерно -15, -16, -17, -18, -19, -20 ккал/моль или более). Предпочтительно, чтобы 3'-концевая последовательность узнавания не содержала самокомплементарных последовательностей, коротких инвертированных повторов (например, более 4 оснований на повтор) или последовательностей, которые иным образом способствуют внутримолекулярному взаимодействию, потенциально мешающему гибридизации праймера с целевой молекулой.

В одном из вариантов осуществления сконструирован праймер, имеющий Тп 56 °С с 4 последовательность-специфичными основаниями на конце праймера, которые могут не участвовать в гибридизации. В одном из вариантов осуществления праймер представляет собой 16-, 17-, 18-, 19-, 20- или 21-мер.

В частности, праймер согласно изобретению, имеющий 3'-концевую последовательность узнавания, может применяться в реакции никующей амплификации. Кроме того, 3'-концевой участок узнавания включает один или более 2'-модифицированных нуклеотидов (например 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-o-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH₂-O-2'-мостик, 4'-(CH₂)₂-O-2'-мостик, и 2'-O-(N-метилкарбамат)). Без привязки к теории, предполагается, что включение одного или более двух модифицированных нуклеотидов в участки узнавания уменьшает или устраняет межмолекулярные и/или внутримолекулярные взаимодействия в отношении праймеров/шаблонов (например, гомодимеров праймеров), и, таким образом, уменьшает или устраняет фоновый сигнал в изотермической амплификации. Модифицированные по 2' нуклеотиды, предпочтительно, имеют основания, образующие пары с основаниями целевой последовательности. В конкретных вариантах осуществления, два или более 2'-модифицированных нуклеотида (например, 2, 3, 4, 5 или более 2' модифицированных нуклеотида) на участке узнавания целевой последовательности являются смежными (например, формируют блок модифицированных нуклеотидов). В некоторых вариантах осуществления блок из 2'-модифицированных нуклеотидов располагается на 3'-конце участка узнавания целевой последовательности. В других вариантах осуществления блок из 2'-модифицированных нуклеотидов располагается на 5'-конце участка узнавания целевой последовательности. Когда блок из 2'-модифицированных нуклеотидов располагается на 5'-конце участка узнавания целевой последовательности, 2'-модифицированные нуклеотиды могут быть отделены от сайта никирования одним или более немодифицированными нуклеотидами (например, 2, 3, 4, 5 или более 2'-немодифицированными нуклеотидами). Заявители обнаружили, что размещение одного или более 2'-модифицированных нуклеотидов или блока из 2'-модифицированных нуклеотидов изменяет кинетику амплификации. Когда один или более 2'-модифицированных нуклеотидов или блок из 2'-модифицированных нуклеотидов располагаются на 5'-конце участка узнавания или поблизости от сайта никирования, амплификация в реальном времени показала сокращение времени, прошедшего до детекции сигнала. Кроме того, сигнальная кривая сжимается, а ее наклон изменяется.

В соответствующем варианте осуществления различные соотношения праймеров, имеющих один или более 2'-модифицированных нуклеотидов, могут использоваться для изменения времени, требующегося для детекции и/или эффективности реакции, чтобы "настроить" реакцию, что приводит к предсказуемому контролю за кинетикой реакции. Увеличение соотношения концентрации праймера, имеющего один или более 2'-модифицированных нуклеотидов на 3'-конце последовательности узнавания, к концентрации праймера, имеющего один или более 2'-модифицированных нуклеотидов на 5'-конце последовательности узнавания, сокращало сигнальную кривую и изменяло ее наклон. Полезно иметь возможность "настраивать" реакцию, предоставляя средства для манипулирования как временем детекции, так и эффективностью реакции. Относительная количественная оценка с использованием внутреннего контроля требует соблюдения двух важных условий. Во-первых, полезно иметь возможность изменять время детекции, создавая условия реакции, не допускающие конкурирующих процессов. Таким образом, из-за влияния на контрольную реакцию так, чтобы в ней детекция происходила в более поздний момент времени (по отношению к целевой реакции), она не конкурирует со специфической целевой реакцией даже в тех случаях, когда целевая молекула изначально присутствует лишь в небольшом избытке. Во-вторых, для обеспечения корректного расчета относительного избытка необходимо, чтобы контроль и специфические целевые реакции имели одинаковые эффективности. Контроль эффективности каждой реакции с помощью условия "настройки" позволяет приводить реакции к одинаковой эффективности, обеспечивая удовлетворительные относительные количественные расчеты. Настройка реакции может быть использована для приведения эффективности амплификации целевой нуклеиновой кислоты и амплификации референсной нуклеиновой кислоты (например, внутреннего стандарта) к одной и той же эффективности в количественной ПЦР (кПЦР). Кроме того, кривые амплификации целевой нуклеиновой кислоты и внутреннего стандарта могут быть изменены таким образом, что моменты детекции их продуктов амплификации будут разнесены во времени, обеспечивая при этом одинаковую эффективность амплификации целевой нуклеиновой кислоты и амплификации внутреннего стандарта. Путем использования конкретных сочетаний и соотношений олигонуклеотидных структур в рамках реакции можно создать условия, позволяющие настроить эффективность реакции.

5'-концевая область димеризации

Изобретение относится к праймеру, содержащему 5-концевой участок, способный к образованию гомодимеров, повышающему эффективность реакции амплификации нуклеиновых кислот. Без привязки к теории, в реакции амплификации нуклеиновых кислот праймер гибридизуется с целевой нуклеиновой кислотой в виде праймер-димера. Например, праймеры для никующей амплификации имеют сайт узнавания никующего агента на 5'-конце, который не влияет на специфичность связывания праймера в отношении последовательности узнавания целевой молекулы. Неспецифические фоновые продукты, являющиеся результатом неспецифических взаимодействий праймеров потенциально могут привести к подавлению активности компонентов реакции, которые в противном случае были бы использованы для амплификации специфического продукта. В различных вариантах осуществления гомодимер является стабильным (например, ΔG составляет примерно -30, -35, -40, -45, -50, -55, -60 ккал/моль или более). В различных вариантах осуществления температура плавления гомодимера выше температуры реакции достройки. В конкретном варианте осуществления 5'-концевой участок содержит палиндромную последовательность. В дополнительных вариантах осуществления 5'-концевой участок имеет длину не менее 20 оснований (например, 20, 21, 22, 23, 24 основания). В дополнительных вариантах осуществления на 5'-концевом содержание GC составляет 80-90%. В некоторых вариантах осуществления гомодимер более стабилен, чем другие менее стабильные конформации димеров праймеров (ΔΔG составляет, например, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -25, -30, -35, -40 ккал/моль или более).

В частности, праймер согласно изобретению, имеющий 5'-концевую последовательность, меожт применяться в реакциях никующей амплификации. Для использования в реакции никующей амплификации 5'-концевой участок содержит один или более сайтов узнавания никующего агента, а также 5'-концевой участок имеет симметрично инвертированную последовательность. В конкретных вариантах осуществления, 5'-концевой участок содержит четное число нуклеотидов (например, 22, 24 нуклеотида). Сайт никирования сконструирован таким образом, чтобы он был расположен между нуклеотидами на 3'-конце 5'-концевого участка и нуклеотидами на 5'-конце 3'-концевого участка узнавания. Без привязки к теории, никующая эндонуклеаза не вносит разрыва в сайте никирования, если узнавание 3'-концевой участок узнавания является одноцепочечным. Тем не менее, разрыв в сайте никирования происходит, когда 3'-концевой участок узнавания является двуцепочечным (например, когда праймер вводится в двуцепочечную целевую молекулу нуклеиновой кислоты в ходе реакции амплификации нуклеиновых кислот). Например, 5'-концевые последовательности длиной 24 нуклеотида, содержащие последовательность узнавания Nt.BstNBI могут быть сгенерированы на основе следующего шаблона: 5 '-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3 '. На основе этого шаблона возможны 537824 5'-концевые последовательности, имеющие следующие свойства: ΔG=от -48 ккал/моль до -62 ккал/моль; ΔΔG < -40 ккал/моль; и содержание GC составляет от 68% до 84%. Из них было выбрано 1050 последовательностей, представляющих 0,2% всего пространства последовательностей (537824). Примеры 5'-концевых последовательностей длиной 22 нуклеотида, содержащих последовательность узнавания Nt.BstNBI и основанных на следующем шаблоне: 5'-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3'. На основе этого шаблона возможны 248832 5'-концевые последовательности, имеющие следующие свойства: ΔG составляет от -47 ккал/моль от -55 ккал/моль; ΔΔG < -40 ккал/моль; и содержание GC составляет от 72% до 82%. Из них было выбрано 200 последовательностей, представляющих 0,08% всего последовательного пространства (248832).

Молекулы целевой нуклеиновой кислоты

Способы и композиции согласно изобретения могут применяться для амплификации и/или идентификации молекулы нуклеиновой кислоты в пробном образце. Целевые последовательности амплифицируются практически из любых образцов, содержащих молекулу нуклеиновых кислот.

Образцы включают телесные жидкости (например, слюна, пот, слезы, жидкости, накапливаемые в полостях тела, моча, эякулят, вагинальный секрет, спинномозговая жидкость, лимфа, фекалии, мокрота, жидкость, образующаяся при разложении, рвотная масса, пот, грудное молоко, кровь, сыворотка и плазма), тканевые экстракты, культуральные среды (например, жидкость, в которой выращивались клетки, например, патогенные клетки), экологические образцы, сельскохозяйственные продукты или другие пищевые продукты, их экстракты и идентификационные ДНК-тэги. При необходимости образец очищается перед внесением в реакцию никующей амплификации с использованием любого стандартного способа, который обычно используется для выделения молекул нуклеиновых кислот из биологических образцов.

В одном из вариантов осуществления используется амплификация праймерами целевой нуклеиновой кислоты патогена для детекции присутствия патогена в образце. Для экологических приложений пробные образцы могут включать воду, жидкие экстракты строительных материалов (например, гипсокартона, потолочных плиток, стеновых плит, тканей, обоев и напольных покрытий), которые могли быть подвергнуты воздействию субъекта, зараженного патогеном, экологические мазки или любой другой образец.

Приложения

Амплификация целевой нуклеиновой кислоты с использованием праймеров согласно изобретению имеет характеристики, позволяющие применять ее для быстрой детекции молекул целевой нуклеиновой кислоты. Композиции и способы согласно изобретению могут применяться в диагностике заболеваний человека, в случае, когда требуется быстрый диагностический ответ (например, детектируемая амплификация достигается в течение менее 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 минут или менее). В конкретных вариантах осуществления, изобретение предусматривает использование протокола реакции никующей амплификации в человеческой или ветеринарной диагностике в клинических или полевых условиях. В других вариантах осуществления изобретение предусматривает использование протоколов реакции никующей амплификации в диагностичекой работе в полевых условиях, где доступ к термоциклерам недоступен или является недопустимо дорогостоящим. В дополнительных других вариантах осуществления изобретение предусматривает использование протоколов реакции никующей амплификации в клинической обстановке, требующей быстрых количественных ответов.

Детектируемые олигонуклеотидные зонды

Настоящее изобретение предусматривает количественное определение целевых молекул нуклеиновой кислоты или их ампликонов в реакции никующей амплификации реакции с использованием неамплифицируемых детектируемых олигонуклеотидных зондов, включающих по крайней мере одну молекулу, останавливающую полимеразу, (например, модификацию нуклеотида или другой компонент, который делает олигонуклеотид способным к связыванию целевой молекулы нуклеиновой кислоты, но не способным поддерживать достройку шаблона с использованием детектируемого олигонуклеотидного зонда в качестве целевой молекулы). Без привязки к теории, присутствие одного или более компонент, которые не допускают продвижение полимеразы, скорее всего, влечет за собой остановку полимеразы на не-нуклеиновокислотных дополнениях к остову олигонуклеотида или путем образования препятствий на пути репликативной полимеразы (например, C3-спейсер, поврежденные основания ДНК, другие спейсерные компоненты, 2'-OMe-основания). Таким образом, эти конструкции предотвращают или уменьшают нежелательную амплификацию зонда в ходе реакции никующей амплификации. Это отличает их от обычных зондов детекции, которые должны быть добавлены в конце реакции никующей амплификации, чтобы предотвратить их усиление.

Традиционные зонды детекции оказались непрактичными для для численной оценки реакции никующей амплификации в реальном времени. Если обычные зонды детекции вносятся в реакцию никующей амплификации, эти обычные зонды детекции амплифицируются одновременно с целевым объектом. Амплификация этих молекул детекции скрывает интересующие целевые ампликоны из-за ненулевого количества начальных молекул зонда детекции в начале реакции.

Изобретение относится к не-амплифицируемому детектируемому полинуклеотидному зонду, содержащему, по меньшей мере, одну молекулу, останавливающую полимеразу. Согласно изобретению, молекула, останавливающая полимеразу, может представлять собой, не ограничиваясь нижеперечисленным, модифицированный нуклеотид или другой компонент, который блокирует достройку шаблона репликативными ДНК-полимеразами, предотвращая тем самым амплификацию молекул детекции; но может допустить надлежащую гибридизацию или спейсинг нуклеотидов к целевой молекуле или к амплифицированным копиям целевой молекулы. В одном из вариантов осуществления детектируемый олигонуклеотидный зонд согласно изобретению включает 3-углеродный спейсер (C3-спейсер), который предотвращает или уменьшает нежелательную амплификацию молекулы детекции.

В одном варианте осуществления детектируемый олигонуклеотидный зонд включает одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, имеющих повышенную аффинность к комплементарным нуклеотидам. Примерами модифицированных оснований являются, не ограничиваясь нижеперечисленным, 2'-концевые флуоресцентные амидиты, и 2'OMe-РНК-амидиты (также функционирующие как молекулы, останавливающие полимеразу). Детектируемые олигонуклеотидные зонды согласно изобретению могут быть синтезированы с флуорофорами различных цветов и могут быть сконструированы для гибридизации практически с любой целевой последовательностью. С учетом их исключительной специфичности, не-амплифицируемый детектируемый полинуклеотидный зонд согласно изобретению используется для детекции одиночной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в образце или используется в сочетании с детектируемыми олигонуклеотидными зондами, каждый из которых связывается с различными целевыми молекулами нуклеиновых кислот. В соответствии с этим, не-амплифицируемые полинуклеотидные зонды согласно изобретению могут использоваться для детекции одной или более целевых молекул нуклеиновой кислоты в той же реакции, что позволяет квантифицировать эти целевые молекулы одновременно. Настоящее изобретение охватывает использование таких флуорофоров в сочетании с описанными в настоящем документе детектируемыми олигонуклеотидными зондами.

Реализация в аппаратном и/или программном обеспечении

Описанные в настоящем документе способы могут быть реализованы на универсальном или специально запрограммированном оборудовании или программном обеспечении. Например, эти способы могут быть реализованы на носителе, считываемом компьютером. Соответственно, настоящее изобретение также относится к программному обеспечению и/или компьютерной программе, настроенной для выполнения алгоритмов и/или способов в соответствии с любым вариантом осуществления настоящего изобретения. Квалифицированный специалист в данной области техники может без творческих усилий настроить программное обеспечение, которое может выполнять алгоритмы и/или способы, предусмотренные в настоящем изобретении. Носитель, считываемый компьютером, может быть долговременным и/или материальным. Например, носитель, считываемый компьютером, может быть представлять собой энергозависимую память (например, оперативную память и т.п.) или энергонезависимую память (например, память, доступная только для чтения, жесткие диски, дискеты, магнитная лента, оптические диски, бумажные таблицы, перфокарты и т.п.) Исполняемые инструкции компьютера могут быть написаны на соответствующем языке программирования или на комбинации нескольких языков. Основные способы вычислительной биологии описаны, например, в Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) и Ouelette и Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2^nd ed., 2001).

Настоящее изобретение может также использовать различные компьютерные программные продукты и программное обеспечение для различных целей, таких, как конструирование зондов, управление данными, анализ и эксплуатация приборов. (см. Патенты США №№ 5,593,839, 5,795,716, 5,733,729, 5,974,164, 6,066,454, 6,090,555, 6,185,561, 6,188,783, 6,223,127, 6,229,911 и 6,308,170.) Кроме того, настоящее изобретение может иметь предпочтительные варианты осуществления, включающие способы предоставления генетической информации по сетям, таким, как Интернет, как показано в US Ser №№ 10/197,621, 10/063,559 (US Pub No 20020183936), 10/065,856, 10/065,868, 10/ 328,818, 10/328,872, 10/423,403 и 60/482,389.

Наборы

Изобретение предусматривает наборы для анализа активности никующей эндонуклеазы и полимеразы. В различных вариантах осуществления наборы включают молекулу субстрата согласно изобретению. Изобретение также предусматривает наборы для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, включая молекулу субстрата согласно изобретению для использования в качестве внешнего контроля. Такие наборы полезны для детекции или квантификации нуклеиновой кислоты в биологической пробе, полученной от субъекта. Наборы согласно настоящему изобретению могут включать, например, ДНК-полимеразы, прямые и обратные праймеры, а также один или более никующих эндонуклеаз, как описано в настоящем документе, и детектируемый зонд. Если необходимо амплифицировать несколько последовательностей патогенов, а шаблоны, сконструированные для этих целевых последовательностей, содержат сайты узнавания одного и того же никующего фермента, то может быть включена одна или две никующие эндонуклеазы. В тех случаях, когда шаблоны узнаются разными никующими эндонуклеазами, в комплект могут быть включены дополнительные никующие эндонуклеазы, например, 3 или более.

В одном из аспектов изобретение относится к набору для амплификации нуклеиновых кислот, включающему ДНК-полимеразу; первичный праймер, вторичный праймер, никующую эндонуклеазу со специфичностью к сайтам узнавания никующих эндонуклеаз на праймерах, и дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ) (например, в буферном растворе, содержащем компоненты, достаточные для амплификации). В различных вариантах осуществления как первичный праймер, так и вторичный праймер имеют 3'-концевую последовательность специфического узнавания, комплементарную или существенно комплементарную целевой последовательности, причем концевой участок специфического узнавания узнавания включает один или более 2'-модифицированных нуклеотидов; 5'-концевой участок, содержащий сайт связывания никующей эндонуклеазы перед 3'-концевыми последовательностями специфического узнавания, которые могут димеризоваться сами с собой (например, являются самокомплементарными). В конкретных вариантах осуществления, один или более праймеров находятся в конфигурации праймер-димеров (например, получаемых при нагреве примерно до Тп и медленном охлаждении).

Наборы настоящего изобретения могут также включать один или более компонентов в любом количестве отдельных контейнеров, пакетов, пробирок (например, <0.2 мл, 0.2 мл, 0.6 мл, 1.5 мл, 5.0 мл, >5.0 мл), флаконов, микротитрационных планшетов (например, с <96 лунок, с 96 лунками, с 384 лунками, с 1536 лунками, с >1536 лунок), ArrayTape и т.п., или компоненты могут быть комбинированы в различные комбинации в таких контейнерах. В различных вариантах осуществления в набор дополнительно входит пара праймеров, способных связываться с референсной последовательностью и амплифицировать ее. В конкретных вариантах осуществления, в набор дополнительно входит один или более праймеров в конфигурации праймер-димеров (например, получаемых при нагреве примерно до Тп и медленном охлаждении). В других воплощениях этот набор включает стерильный контейнер, содержащий эти праймеры; такие контейнеры могут представлять собой ящики, ампулы, бутылки, флаконы, пробирки, мешки, пакеты или другие подходящие контейнеры, известные на существующем уровне техники. Такие контейнеры могут быть сделаны из пластмассы, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, пригодных для хранения нуклеиновых кислот. Компоненты набора могут, например, присутствовать в одном или более контейнерах, например, все компоненты могут находиться в одном контейнере, или, например, ферменты и праймеры могут находиться в отдельных контейнерах. Эти компоненты, например, могут быть сухими (например, в виде порошка) или в стабильном буфере (например, химически стабилизированном, термически стабилизированном). Сухие компоненты могут, например, быть приготовлены путем лиофилизации, сушки с использованием вакуума и центрифугирования и/или сушки в нормальных условиях. В различных вариантах осуществления, полимераза и никующая эндонуклеаза находятся в лиофилизированной форме в одном контейнере, а праймеры лиофилизированы, высушены при низкой температуре или находятся в буфере, и содержатся в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления, полимераза, никующая эндонуклеаза и праймеры находятся в лиофилизированной форме в одном и том же контейнере. В других вариантах осуществления в полимераза и никующая эндонуклеаза могут находиться в разных контейнерах. Наборы могут дополнительно включать, например, дНТФ, используемые в реакции, или модифицированные нуклеотиды, кюветы или другие контейнеры, используемые для реакции, или флакон с водой или буфером для регидратации лиофилизированных компонентов. Используемый буфер может, например, подходить как для исследования активности полимеразы, так и для активности никующей эндонуклеазы.

Наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать инструкции по выполнению одного или более описанных в данном документе способов и/или описание одной или более описанных в данном документе композиций или реагентов. Инструкции и/или описания могут находиться в напечатанной форме и могут быть включены в набор поставки. В набор также может входить письменное описание сайта в Интернете, предоставляющего такие инструкции или описания.

Использование настоящего изобретения подразумевает, если не указано иное, обычные способы молекулярной биологии (включая способы рекомбинации), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которыми хорошо владеет специалист в данной области техники. Такие способы в полной мере разъясняются в литературе, см., например, ʺMolecular Cloning: A Laboratory Manualʺ, second edition (Sambrook, 1989); ʺOligonucleotide Synthesisʺ (Gait, 1984); ʺAnimal Cell Cultureʺ (Freshney, 1987); ʺMethods in Enzymologyʺ ʺHandbook of Experimental Immunologyʺ (Weir, 1996); ʺGene Transfer Vectors for Mammalian Cellsʺ (Miller and Calos, 1987); ʺCurrent Protocols in Molecular Biologyʺ (Ausubel, 1987); ʺPCR: The Polymerase Chain Reactionʺ, (Mullis, 1994); ʺCurrent Protocols in Immunologyʺ (Coligan, 1991). Эти способы применимы к производству нуклеотидов и полипептидов согласно изобретению и, как таковые, могут быть рассмотрены в процессе изготовления и применения изобретения. В последующих разделах будут рассмотрены способы, особенно полезные для конкретных вариантов осуществления.

Следующие примеры приводятся с тем, чтобы дать специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как следует подготавливать и использовать протоколы, скрининг и терапевтические способы согласно изобретению, и не имеют целью ограничение сферы охвата в том, что изобретатели считают своим изобретением.

Примеры

Пример 1. Субстрат реакции никирования и достройки с детектируемым репортером, который может использоваться в качестве молекулы внешнего или внутреннего контроля.

Настоящее изобретение относится к субстрату никирования и достройки, который представляет собой олигонуклеотидный дуплекс, имеющий сайт никирования на одной цепи, расположенный ближе к 5'-концу от молекулы детектируемого флуоресцентного репортера, которая ковалентно пришита к 3'-концу цепи (Фиг. 1А и 1B). Тушитель на 5'-конце противоположной цепи предотвращает флуоресценцию молекулы репортера (Фиг. 1А и 1B). Когда молекула субстрата никируется, возникающий внутренний 3'-конец может быть достроен полимеразой, использующей противоположную цепь в качестве шаблона (Фиг.1C-1E). Полимеразная достройка приводит к замещению части цепи, связанной с флуоресцентным репортером (Фиг. 1E). Когда флуоресцентный репортер отделяется от тушителя, он генерирует флуоресцентный сигнал (Фиг. 1E). В молекулу субстрата могут быть внесены дополнительные усовершенствования, чтобы предотвратить или свести к минимуму дополнительные циклы никирования-удлинения (Фиг. 1F).

Реакция молекулы субстрата в присутствии никующей эндонуклеазы и полимеразы генерирует линейный сигнал, особенно в тех случаях, когда 3'-концы олигонуклеотидов блокируются от дальнейших взаимодействий (Фиг. 2А). Молекула субстрата может быть добавлена к реакции никующей амплификации в качестве внешнего/внутреннего контроля, чтобы показать, что никующая эндонуклеаза и полимераза активны в этой реакции. Как контрольная реакция, так и реакция никующей амплификации начинаются тогда, когда никующая эндонуклеаза и полимераза активны и действуют параллельно. Контрольная реакция построена таким образом, чтобы свести к минимуму использование компонентов реакции и таким образом минимизировать любое воздействие на реакцию амплификации. Предпочтительно, чтобы конечные точки реакции никующей амплификации были установлены на момент, когда молекула внешнего контроля достигает заданного значения ОФЕ (Фиг. 2B). Например, это может использоваться для характеристики сигнала амплификации как положительного или отрицательного на основе момента его детекции.

Были проведены исследования c несколькими молекулами субстрата с модифицированными нуклеотидами на различных позициях, прилегающих к сайту никирования (Фиг. 4). В этих исследованиях 3'-конец олигонуклеотида, на котором находился тушитель, не был блокирован. Молекула субстрата показала ожидаемый профиль реакции. Быстрый линейный отклик наблюдался при относительно высокой концентрации никующей эндонуклеазы, причем в большинстве случаев максимальное значение ОФЕ быстро достигалось в течение 5 минут (Фиг. 5A-5Е и 6A-6D). В частности, молекула субстрата "nick-1", у которой на 1-й позиции по направлению к 5'-концу от сайта никирования находится 2'ОMe, показала задержку ответа по сравнению с другими молекулами субстрата (Фиг. 6C). При сравнительно низких концентрациях никующей эндонуклеазы время до достижения максимального значения ОФЕ можно увеличить (Фиг. 5D и 5E).

Были введены изменения в длину участка олигонуклеотида между 5'-концом и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы GAGTC (Фиг. 7). Верхние цепи A, B, C имели эквивалентные активности, оцененные по наклону кривой. Реакционная кривая для верхней цепи D, имеющей два нуклеотида между 5'-концом и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы, имела набольшие изменения. Дальнейшее уменьшение реакционного отклика наблюдалось для верхней цепи E, у которой имелся один нуклеотид между 5'-концом и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы. Не было замечено никакой реакции для верхней цепи F, не имеющей нуклеотидов между 5'-концом и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что полная активность никующей эндонуклеазы достигается в случае, если между 5'-концом и сайтом узнавания никующей эндонуклеазы GAGCT имеется три или более нуклеотида. Различие в активности делает возможным выбор скорости реакции, с тем чтобы внешний контроль был совместим с различными анализами.

Пример 2. Настраиваемость реакции внешнего контроля.

В одном из аспектов изобретения реакция внешнего контроля может быть настроена, что позволяет подобрать параметры реакции внешнего контроля для заданного набора условий реакции никующей амплификации. Используя различные соотношения молекул субстрата, содержащих немодифицированные и модифицированные нуклеотиды, скорость реакции можно контролировать (Фиг. 8). Немодифицированная верхняя цепь (A) была титрована с двойным метокси-модифицированным олигонуклеотидом (G). Добавка некоторого количества модифицированного олигонуклеотида позволяет контролировать скорость реакции (наклон кривой) и настраивать ее для достижения желаемого порога за заданное время. Эти результаты показывают, что смеси молекул внешнего контроля можно использовать в качестве "таймера реакции", а также в качестве реакции положительного контроля.

В другом аспекте реакция внешнего контроля может быть настроена путем введения 2'-модифицированных нуклеотидов в различных положениях в пределах молекулы субстрата вблизи сайта никирования и сайта узнавания никующей эндонуклеазы (Фиг. 9А и 9B). Модифицированные верхние цепи (A-K и D-E) использовались в комбинации с нижней цепью, заблокированной C3-спейсером. Относительно эквивалентные результаты наблюдались для всех верхних цепей, кроме D, у которой модифицированный нуклеотид находится в положении "nick-1" (соответствующем последнему в направлении 5'-конца основанию перед сайтом никирования Nt.BstNBI). Предыдущие результаты также показали небольшой эффект от верхней цепи B в случае использования меньшей концентрации никующей эндонуклеазы. Относительно эквивалентные результаты наблюдались со всеми 2'OMe-модифицированными нуклеотидами, помещенными на участке узнавания никующей эндонуклеазы (GAGTC). Наиболее заметный эффект наблюдался, когда 2'OMe-модифицированные нуклеотиды были размещены по обе стороны от сайта никирования.

Пример 3. Использование молекулы субстрата никирования и достройки для анализа активности никующей эндонуклеазы и полимеразы.

В одном из аспектов изобретения молекула субстрата может использоваться для проверки условий реакции, чтобы определить активность комбинаций никующей эндонуклеазы и полимеразы, и характеризации их комбинированной деятельности. Из-за различий в свойствах (например, тепловых свойствах) никующей эндонуклеазы и полимеразы существует возможность оптимизации условий реакции для максимизации общей активности реакции никирования и достройки. До настоящего изобретения такой анализ был недоступен. Модифицированная верхняя цепь используется в комбинации с незаблокированной нижней цепью (незаблокированным 3'-концом). Никующая эндонуклеаза и/или полимераза могут быть испытаны на активность с использованием этих олигонуклеотидов, чтобы обеспечить высоко контролируемую реакцию с высокой воспроизводимостью, имитируя при этом реальную реакцию амплификации с точки зрения функции ферментов. В зависимости от требуемого считывания можно использовать заблокированные или незаблокированные 3'-концы. Было проведено исследование, показывающее влияние концентрации никующей эндонуклеазы на реакцию молекулы субстрата (Фиг. 10).

Пример 4. Тестовый набор для качественной детекции ДНК из Salmonella, включающий внешний/внутренний контроль

Быстрая детекция Salmonella на месте требуется для осуществления мер, направленных на предотвращение ее распространения. Для качественной детекции ДНК из Salmonella был создан тестовый набор. Протокол детекции основан на способе изотермической амплификации нуклеиновых кислот. В набор также входит внешний/внутренний контроль для подтверждения активности никующей эндонуклеазы и полимеразы в каждой реакции. Для оптимизации протокола в первую очередь был протестирован список праймеров и последовательности молекулярных маяков. Для усиления целевой молекулы нуклеиновой кислоты использовались следующие праймеры:

Прямые праймеры

5'-TGACTCCATATGGAGTCACATCACmCGAAATACmCmGmCmCmA-3'

5'-GACTCGATATCGAGTCTTTCCACmCGAAATACmCmGmCmCmA-3'*

5'-GAAAGACTCGCGAGTCTTTCCACmCGAAATACmCmGmCmCmA-3'

Обратные праймеры

5'-TGACTCCATATGGAGTCACATCGGmCATCATTATTATCTTTGmUmGmAmAmC-3'

5'-GACTCGATATCGAGTCTTTCCGGmCATCATTATTATCTTTGmUmGmAmAmC-3' *

5'-GAAAGACTCGCGAGTCTTTCCGGmCATCATTATTATCTTTGmUmGmAmAmC-3'

Основания, обозначенные префиксом "m", обозначают положение 2'-O-метиловых рибонуклеотидов.

Для детекции целевой молекулы нуклеиновой кислоты использовался следующий зонд:

Зонд детекции "молекулярный маяк"

5'-CalRed_610nm-CGCCTGTGAACTTTATTGGCG-BHQ2-3'

В качестве внешнего и внутреннего контроля использовались дуплексы следующих олигонуклеотидов (Фиг. 11):

Внешний контроль, нижняя цепь (BOT) с 3-углеродным спейсером (C3-спейсером):

5' Black Hole Quencher (BHQ)-1 GGCCCGCGCGATGCACTCCGTGGCAGTGACTCTG

TAAT-С3-спейсер 3'

Очищен на ВЭЖХ

Внешний контроль, верхняя цепь (Topn):

5' CAGAGTCACTGCCACGGAGTGCATCGCGCGGGCC/36-FAM/ 3'

Очищен на ВЭЖХ

Вышеуказанные праймеры и зонды были испытаны в реакции изотермической амплификации нуклеиновых кислот. Пробные образцы были подготовлены из смоделированной пищи для животных или обогащенной культуры. Реакции амплификации и детекции показали высокое соотношение сигнал/шум, раннее начало экспоненциальной амплификации, резкий наклон кривой амплификации, короткое время детекции и низкую вариабельность сигнала при повторных анализах. Все целевые контрольные образцы давали надежный сигнал. Внешний/внутренний контроль предоставил средства детекции активности никующей эндонуклеазы и полимеразы, оказывая при этом минимальное воздействие на реакцию изотермической амплификации нуклеиновых кислот. Протокол был подвергнут дальнейшим испытаниям, в ходе которых детектировал более 100 серотипов Salmonella. Эти результаты свидетельствуют о том, что вышеуказанная реакция и реагенты могут использоваться для быстрого и точного обнаружения Salmonella.

Другие варианты осуществления

Из вышеизложенного описания следует, что изменения и модификации могут быть внесены в изобретение, описанное в настоящем документе, с целью его адаптации к различным случаям использования и условиям. Такие варианты осуществления также входят в сферу охвата формулы изобретения, приведенной ниже.

Упоминание элементов в любом определении переменной в настоящем документе включает определения этой переменной как любого отдельного элемента или комбинации (или субкомбинации) перечисленных элементов. Упоминание варианта осуществления в настоящем документе включает этот вариант осуществления как любой отдельный вариант осуществления или в сочетании с любыми другими вариантами осуществления или их частями.

Все патенты и публикации, упомянутые в настоящей спецификации, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы о каждом независимом патенте и публикации имелось указание, что они конкретно и индивидуально включены посредством ссылки.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> EnviroLogix Inc.

<120> МОЛЕКУЛА СУБСТРАТА

<130> 049224-1058WO1

<140> PCT/US16/14753

<141> 2016-01-25

<150> 62/110,237

<151> 2015-01-30

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С FAM на 3'-конце

<400> 1

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 2

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С тушителем на 5'-конце

<400> 2

ggcccgcgcg atgcactccg tggcagtgac tctgtaat 38

<210> 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С FAM на 3'-конце

<400> 3

ccacggagtg catcgcgcgg gcc 23

<210> 4

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 4

attacagagt cactgccacg ga 22

<210> 5

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 5

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 6

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 5IAbRQ на 5'-конце

<400> 6

ggcccgcgcg atgcactccg tggcagtgac tctgtaat 38

<210> 7

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 7

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 8

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (14)..(14)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 8

attacagagt cacugccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 9

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (16)..(16)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 9

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 10

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (15)..(15)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 10

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 11

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 11

tacagagtca ctgccacgga gtgcatcgcg cgggcc 36

<210> 12

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 12

acagagtcac tgccacggag tgcatcgcgc gggcc 35

<210> 13

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 13

cagagtcact gccacggagt gcatcgcgcg ggcc 34

<210> 14

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 14

agagtcactg ccacggagtg catcgcgcgg gcc 33

<210> 15

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 15

gagtcactgc cacggagtgc atcgcgcggg cc 32

<210> 16

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (15)..(15)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (16)..(16)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 16

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 17

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> с IAbRQ на 5'-конце

<220>

<223> с С3-спейсером на 3'-конце

<400> 17

ggcccgcgcg atgcactccg tggcagtgac tctgtaat 38

<210> 18

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (7)..(7)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 18

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 19

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(8)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 19

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 20

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (9)..(9)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 20

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 21

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (10)..(10)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 21

attacagagu cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 22

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (11)..(11)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 22

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 23

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (7)..(7)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (12)..(12)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 23

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 24

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (7)..(7)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(13)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<223> С 36-FAM на 3'-конце

<400> 24

attacagagt cactgccacg gagtgcatcg cgcgggcc 38

<210> 25

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> с BHQ-1 на 5'-конце

<220>

<223> с С3-спейсером на 3'-конце

<400> 25

ggcccgcgcg atgcactccg tggcagtgac tctgtaat 38

<210> 26

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (6)..(12)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 26

gagtcnnnnn nn 12

<210> 27

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(7)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 27

nnnnnnngac tc 12

<210> 28

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (5)..(5)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<220>

<221> доп_элемент

<222> (7)..(12)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 28

gagtncnnnn nn 12

<210> 29

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(7)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 29

nnnnnnngac tc 12

<210> 30

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (6)..(10)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 30

ggatcnnnnn 10

<210> 31

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(5)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 31

nnnnngatcc 10

<210> 32

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (6)..(10)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 32

gagtcnnnnn 10

<210> 33

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(5)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 33

nnnnngactc 10

<210> 34

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность узнавания фермента

<220>

<221> доп_элемент

<222> (6)..(10)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 34

gagtcnnnnn 10

<210> 35

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(5)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 35

nnnnngactc 10

<210> 36

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (6)..(14)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 36

gagtcnnnnn nnnn 14

<210> 37

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(9)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 37

nnnnnnnnng actc 14

<210> 38

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<220>

<221> доп_элемент

<222> (10)..(15)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<220>

<221> доп_элемент

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 38

nnnngactcn nnnnngagtc nnnn 24

<210> 39

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<221> доп_элемент

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<220>

<221> доп_элемент

<222> (10)..(13)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<220>

<221> доп_элемент

<222> (19)..(22)

<223> n представляет собой a, c, g, или t, неизвестное или иное

<400> 39

nnnngactcn nnngagtcnn nn 22

<210> 40

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (25)..(25)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (33)..(33)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (34)..(34)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (35)..(35)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (36)..(36)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (37)..(37)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<400> 40

tgactccata tggagtcaca tcaccgaaat accgcca 37

<210> 41

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (32)..(32)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (33)..(33)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (34)..(34)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (35)..(35)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (36)..(36)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<400> 41

gactcgatat cgagtctttc caccgaaata ccgcca 36

<210> 42

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (32)..(32)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (33)..(33)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (34)..(34)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (35)..(35)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (36)..(36)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<400> 42

gaaagactcg cgagtctttc caccgaaata ccgcca 36

<210> 43

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (25)..(25)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (42)..(42)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (43)..(43)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (44)..(44)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (45)..(45)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (46)..(46)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<400> 43

tgactccata tggagtcaca tcggcatcat tattatcttt gugaac 46

<210> 44

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (41)..(41)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (42)..(42)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (43)..(43)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (44)..(44)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (45)..(45)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<400> 44

gactcgatat cgagtctttc cggcatcatt attatctttg ugaac 45

<210> 45

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (41)..(41)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (42)..(42)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (43)..(43)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (44)..(44)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (45)..(45)

<223> 2'-О-метилированный нуклеотид

<400> 45

gaaagactcg cgagtctttc cggcatcatt attatctttg ugaac 45

<210> 46

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<220>

<223> с CalRed на 5'-конце

<220>

<223> с BHQ2 на 3'-конце

<400> 46

cgcctgtgaa ctttattggc g 21

<---

1. Субстрат для никирования и достройки, включающий дуплекс нуклеиновой кислоты, содержащий:

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу;

или

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу;

где первая цепь нуклеиновой кислоты модифицирована по одному или более нуклеотидам между сайтом узнавания никующего фермента и сайтом никирования, в сайте узнавания никующего фермента, в 2, 3, 4 или 5 нуклеотидах от сайта никирования (с 5’- или 3’-стороны) и/или в положении 1 с каждой из сторон от сайта никирования (5’- и 3’-стороны).

2. Субстрат по п. 1, где первая цепь нуклеиновой кислоты никируется никующим ферментом.

3. Субстрат по п. 1 или 2, где флуоресцентная детектируемая метка представляет собой FAM, TET, HEX, TAMRA, JOE или ROX.

4. Субстрат по любому из пп. 1-3, где компонент-тушитель представляет собой Iowa Black® RQ (5IabRQ), дабцил, дабсил или краситель Black Hole Quencher.

5. Субстрат по любому из пп. 1-4, где 3'-конец второй нуклеиновой кислоты модифицирован с помощью C3-спейсера, дидезоксинуклеотида, фосфорилирования, красителя, флуорофора, тушителя, спейсера или линкера.

6. Субстрат по любому из пп. 1-5, где один или более модифицированных нуклеотидов содержат 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH₂-O-2'-мостик, 4'-(CH₂)₂-O-2'-мостик, 2'-O-(N-метилкарбамат), метилирование, биотинилирование, нуклеотидный аддукт или аналог основания.

7. Субстрат по любому из пп. 1-6, где никующий фермент представляет собой Nt.BstNBI, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI, Nb.Bpu10I, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.Bpu10I, Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI или Nt.CviPII.

8. Субстрат по любому из пп. 1-7, который имеет длину от 30 п.н. до 2 т.п.н., от 100 п.н. до 1 т.п.н., от 100 п.н. до 500 п.н., от 30 п.н. до 200 п.н., от 30 п.н. до 60 п.н., от 35 п.н. до 50 п.н.

9. Субстрат по любому из пп. 1-8, где цепи нуклеиновой кислоты имеют длину от 30 н. до 2000 н., от 100 н. до 1000 н., от 100 н. до 500 н., от 30 н. до 200 н., от 30 н. до 60 н., от 35 н. до 50 н.

10. Субстрат по любому из пп. 1-9, где длина нуклеиновой цепи от сайта никирования до 3'-конца составляет 25 н., 35 н., 40 н. или более.

11. Субстрат по любому из пп. 1-10, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., 15 н., 20 н. или более.

12. Субстрат по любому из пп. 1-11, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., 5 н., 3 н. или менее.

13. Субстрат по п. 12, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта узнавания никующего фермента составляет 4, 3, 2 или 1 н.

14. Субстрат по любому из пп. 1-13, содержащий одну или более пар "флуоресцентная детектируемая метка-компонент-тушитель", ковалентно пришитых к противоположным нуклеотидным цепям и внутри дуплекса.

15. Субстрат по любому из пп. 1-13, где первые и вторые нуклеотидные цепи ковалентно связаны.

16. Способ детекции активности никующего фермента и полимеразы в реакции, включающей: а) контакт дуплекса нуклеиновой кислоты с никующим ферментом, где указанный дуплекс нуклеиновой кислоты никируется указанным никующим ферментом, причем дуплекс включает:

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу;

или

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу;

где первая цепь нуклеиновой кислоты модифицирована по одному или более нуклеотидам между сайтом узнавания никующего фермента и сайтом никирования, в сайте узнавания никующего фермента, в 2, 3, 4 или 5 нуклеотидах от сайта никирования (с 5’- или 3’-стороны) и/или в положении 1 с каждой из сторон от сайта никирования (5’- и 3’-стороны);

b) контакт никированного дуплекса с полимеразой в присутствии дНТФ;

c) полимеразную достройку никированного дуплекса, замещающую участок цепи по направлению к 3'-концу от сайта никирования, который связан с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и

d) детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, которая отделяется от тушителя, выявляющую активность никующего фермента и полимеразы в реакции.

17. Способ амплификации специфического продукта в реакции никующей амплификации, включающий:

a) контакт с целевой молекулой нуклеиновой кислоты в изотермических условиях с двумя или более праймерами, каждый из которых специфически связывается с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, в присутствии дНТФ, никующего фермента и дуплекса, включающего:

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 5'-концу;

или

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, включающую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу;

где первая цепь нуклеиновой кислоты модифицирована по одному или более нуклеотидам между сайтом узнавания никующего фермента и сайтом никирования, в сайте узнавания никующего фермента, в 2, 3, 4 или 5 нуклеотидах от сайта никирования (с 5’- или 3’-стороны) и/или в положении 1 с каждой из сторон от сайта никирования (5’- и 3’-стороны);

b) генерацию ампликонов, включающих по меньшей мере часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты;

c) никирование дуплекса и полимеразную достройку указанного дуплекса, замещающую участок цепи по направлению к 3'-концу от сайта никирования, который связан с флуоресцентной детектируемой меткой или компонентом-тушителем; и

d) детекцию сигнала от флуоресцентной детектируемой метки, которая отделяется от тушителя, выявляющую активность никующего фермента и полимеразы в реакции.

18. Способ по п. 17, дополнительно включающий контакт молекулы нуклеиновой кислоты с двумя или более праймерами в присутствии детектируемого полинуклеотидного зонда; и

e) детекцию сигнала, специфического для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликону, причем сигнал указывает количество целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.

19. Способ по п. 17 или 18, где детекция сигнала от дуплекса используется в качестве положительного контроля.

20. Способ по любому из пп. 17-19, где момент, в который сигнал от дуплекса достигает заданной относительной флуоресценции (ОФЕ), указывает конечную точку наблюдения за реакцией никующей амплификации.

21. Способ по любому из пп. 16-20, где реакция осуществляется в изотермических условиях.

22. Способ по любому из пп. 16-20, где реакция дополнительно включает праймеры, зонд, и/или целевые молекулы нуклеиновой кислоты.

23. Способ по любому из пп. 16-22, где цепи нуклеиновой кислоты имеют последовательности, не связывающиеся с другими молекулами нуклеиновой кислоты, присутствующими в реакции.

24. Способ по любому одному или более из пп. 16-23, где флуоресцентная детектируемая метка на дуплексе нуклеиновой кислоты и флуоресцентная детектируемая метка на зонде различаются.

25. Способ по любому из пп. 16-24, где флуоресцентная детектируемая метка, ковалентно пришитая к первой цепи нуклеиновой кислоты, представляет собой FAM, TET, HEX, TAMRA, JOE или ROX.

26. Способ по любому из пп. 16-25, где компонент-тушитель, ковалентно связанный со второй цепью нуклеиновой кислоты, представляет собой Iowa Black® RQ (5IabRQ), дабцил, дабсил или краситель Black Hole Quencher.

27. Способ по любому из пп. 16-26, где 3'-конец второй нуклеиновой кислоты модифицирован с помощью C3-спейсера, дидезоксинуклеотида, фосфорилирования, красителя, флуорофора, тушителя, спейсера или линкера.

28. Способ по любому из пп. 16-27, где один или более модифицированных нуклеотидов содержат 2'-O-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-флуорогруппу, 2'-гидроксил (РНК), 2'-аллил, 2'-О-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тиогруппу, 4'-CH₂-O-2'-мостик, 4'-(CH₂)₂-O-2'-мостик, 2'-O-(N-метилкарбамат), метилирование, биотинилирование, нуклеотидный аддукт или аналог основания.

29. Способ по любому из пп. 16-28, где никующий фермент представляет собой Nt.BstNBI, N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI, Nb.Bpu10I, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.Bpu10I, Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI или Nt.CviPII.

30. Способ по любому из пп. 16-29, где полимераза представляет собой ДНК-полимеразу I Bst, ДНК-полимеразу Bsu, ДНК-полимеразу I Gst или ДНК-полимеразу I Gka. В других вариантах осуществления примеры полимераз включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, BST (большой фрагмент), ДНК-полимеразу I (E. coli), ДНК-полимеразу I, большой (Klenow-) фрагмент, Klenow-фрагмент (3'-5' exo-), ДНК-полимеразу T4, ДНК-полимеразу T7, ДНК-полимеразу Deep VentR(exo-), ДНК-полимеразу Deep VentR, DyNAzyme, High-Fidelity ДНК-полимеразу, ДНК-полимеразу Therminator, Therminator II, ДНК-полимеразу AmpliTherm, ДНК-полимеразу Taq, ДНК-полимеразу Tth, ДНК-полимеразу Tfl, ДНК-полимеразу Tgo, ДНК-полимеразу SP6, ДНК-полимеразу Tbr или их активные фрагменты.

31. Способ по любому из пп. 16-30, где дуплекс нуклеиновой кислоты имеет длину от 30 п.н. до 2 т.п.н., от 100 п.н. до 1 т.п.н., от 100 п.н. до 500 п.н., от 30 п.н. до 200 п.н., от 30 п.н. до 60 п.н., от 35 п.н. до 50 п.н.

32. Способ по любому из пп. 16-31, где цепи нуклеиновой кислоты субстрата или дуплекса, имеют длину от 30 н. до 2000 н., от 100 н. до 1000 н., от 100 н. до 500 н., от 30 н. до 200 н., от 30 н. до 60 н., от 35 н. до 50 н.

33. Способ по любому из пп. 16-32, где длина нуклеиновой цепи от сайта никирования до 3'-конца составляет 25 н., 35 н., 40 н. или более.

34. Способ по любому из пп. 16-33, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., 15 н., 20 н. или более.

35. Способ по любому из пп. 16-34, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта никирования составляет 10 н., 5 н., 3 н. или менее.

36. Способ по п. 35, где длина нуклеиновой цепи от 5'-конца до сайта узнавания никующего фермента составляет 4, 3, 2 или 1 н.

37. Способ по любому из пп. 16-36, где первые и вторые нуклеотидные цепи ковалентно связаны.

38. Способ по любому из пп. 16-37, включающий использование одного или более дуплексов нуклеиновой кислоты, различающихся по своим модификациям.

39. Набор для детекции активности никующего фермента и полимеразы в реакции, содержащий субстрат реакций никирования и достройки, включающий дуплекс нуклеиновой кислоты, включающий:

a) первую цепь нуклеиновой кислоты, содержащую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 3'-концу; и

b) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и компонент-тушитель на 5'-конце;

или

i) первую цепь нуклеиновой кислоты, содержащую сайт узнавания никующего фермента, сайт никирования и компонент-тушитель, ковалентно пришитый к 3'-концу; и

ii) вторую цепь нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, способную образовывать дуплекс с первой цепью, и флуоресцентную детектируемую метку, ковалентно пришитую к 5'-концу;

где первая цепь нуклеиновой кислоты модифицирована по одному или более нуклеотидам между сайтом узнавания никующего фермента и сайтом никирования, в сайте узнавания никующего фермента, в 2, 3, 4 или 5 нуклеотидах от сайта никирования (с 5’- или 3’-стороны) и/или в положении 1 с каждой из сторон от сайта никирования (5’- и 3’-стороны).