Антитела, связывающие ctla-4, и их применение

Авторы патента:

ГАНЬ, Синь (CN)

ХЕ, Юн (CN)

ШЭНЬ, Юйцян (CN)

ЧЖАО, Цзюцяо (US)

ЖУН, Ипин (CN)

ГРОСВЕЛД, Франк (NL)

ДРАБЕК, Дюбравка (NL)

ВАН ХАПЕРЕН, Маринус Рин (NL)

ЯНСЕНС, Рик (NL)

C12N15/63 - введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

C12N15/13 - иммуноглобулины

C07K2317/24 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

C07K16/2818 - Иммуноглобулины, например моноклональные или поликлональные антитела

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

A61P37/00 - Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K39/3955 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

A61K2039/505 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2756100:

ХАРБОР БАЙОМЕД (ШАНХАЙ) КО., ЛТД (CN)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено специфически связывающее CD152 антитело, включающее только тяжелые цепи. Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, экспрессирующему вектору и клетке-хозяину для получения антитела и к применению антитела для лечения рака и аутоиммунного заболевания. Изобретение обеспечивает эффективное ингибирование сигнальной активности CD152 с минимальными неблагоприятными побочными эффектами. 7 н. и 20 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 16 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к моноклональным анти-CTLA-4-антителам, нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела, экспрессирующим векторам и рекомбинантным клеткам, включающим нуклеиновые кислоты, и фармацевтическим композициям, включающим антитела. Также предложены способы получения антител и способы применения антител для лечения заболеваний, включая рак и аутоиммунные заболевания.

Предшествующий уровень техники

Иммунотерапия рака, недавний прорыв в лечении онкологических заболеваний, использует собственную иммунную систему пациента для атаки на опухолевые клетки. Содействие устойчивому CD8 Т-клеточно-зависимому цитотоксическому ответу в микроокружении опухоли важно для генерации эффективного противоопухолевого иммунного ответа. Тем не менее, опухоль имеет тенденцию избегать иммунного надзора, используя механизм подавления Т-клеток. Истощение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) приводит к анергии цитотоксических Т-клеток и выходу опухолевых клеток из-под надзора (Wherry and Kurachi, 2015, Nat Rev Immunol., 2015, 15: 486-499; Dyck and Mills, 2017, Eur., J. Immunol., 47(5): 765-779).

Ингибиторы иммунных белков контрольной точки обладают потенциалом для лечения различных опухолей, таких как метастатическая меланома, рак легкого, рак молочной железы и почечно-клеточный рак. CTLA-4 (CD152) представляет собой такую ингибирующую молекулу контрольной точки на поверхности Т-клеток. Первоначально она был идентифицирована путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК мышиных цитолитических Т-клеток (Brunet et al., 1987, Nature, 328: 267-270). Предполагается, что CTLA-4 может функционировать в качестве отрицательного регулятора активации Т-клеток (Walunas et al., 1994, Immunity, 1: 405-413). CTLA-4 экспрессируется конститутивно на поверхности регуляторных Т-клеток, но его количество относительно низкое. Она активируется при активации Т-клеток. После активации CTLA-4 взаимодействует с CD80 (B7.1) и CD86 (B7.2), которые также являются лигандами для CD28, с гораздо более высокой аффинностью связывания, чем CD28 (van der Merwe et al.,1997, J Exp Med. 185:393-403; Alegre et al., 2001, Nat Rev Immunol, 1: 220-228). Передача сигналов CD28 способствует активации Т-клеток, в то время как взаимодействие CTLA-4 с его лигандами B7.1 и B7.2 предотвращает дальнейшую активацию Т-клеток.

Антагонисты CTLA-4 привлекательны, поскольку блокада CTLA-4 с помощью антагонистов была показана как эффективная противоопухолевая терапия (пат. США № 6984720). Ингибирование этого поверхностного рецептора с использованием антагониста, такого как mAb против CTLA-4, усиливало эффекторные ответы CD4 и CD8 Т-клеток и снижало супрессирующую функцию клеток Treg. В последние годы лечение на основе антагонистов CTLA-4 быстро прогрессировало. Ипилимумаб (VERYOR®) является гуманизированным антителом и блокирует эффекты CTLA-4, которые усиливают ответы Т-клеток на опухолевые клетки. Ипилимумаб был первым лекарственным средством, продемонстрировавшим улучшение общей выживаемости пациентов с метастатической меланомой в рандомизированном контролируемом исследовании фазы 3. Он имеет управляемый профиль безопасности в дозе 3 мг/кг в качестве монотерапии у пациентов, ранее получавших другие виды терапии, и в дозе 10 мг/кг в сочетании с дакарбазином у пациентов, не получавших лечение. Помимо злокачественной меланомы, ипилимумаб также находится в стадии исследования для лечения рака предстательной железы и немелкоклеточного рака легкого.

Однако, несмотря на прогресс, упомянутый выше, желательны антагонисты CTLA-4 с улучшенной аффинностью, специфичностью и способностью к совершенствованию. Кроме того, также необходимы более эффективные терапевтические средства, включающие анти-CTLA-4 антитела, которые эффективно ингибируют сигнальную активность CTLA-4, в то же время вызывая минимальные неблагоприятные побочные эффекты у людей.

Сущность изобретения

Раскрыто выделенное моноклональное антитело, содержащее CD152-связывающий домен, где CD152-связывающий домен включает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, где CDR1, CDR2 и CDR3 содержат аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с (1) SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно; (2) SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно; (3) SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно; (4) SEQ ID NO: 22, 23 и 24, соответственно; (5) SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; (6) SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно; (7) SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответственно; (8) SEQ ID NO: 46, 47 и 48, соответственно; (9) SEQ ID NO: 52, 53 и 54, соответственно; (10) SEQ ID NO: 58, 59 и 60, соответственно; (11) SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно; (12) SEQ ID NO: 70, 71 и 72, соответственно; (13) SEQ ID NO: 76, 77 и 78, соответственно; (14) SEQ ID NO: 82, 83 и 84, соответственно; (15) SEQ ID NO: 88, 89 и 90, соответственно; (16) SEQ ID NO: 94, 95 и 96, соответственно; (17) SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно; (18) SEQ ID NO: 106, 107 и 108, соответственно; (19) SEQ ID NO: 112, 113 и 114, соответственно; (20) SEQ ID NO: 118, 119 и 120, соответственно; (21) SEQ ID NO: 124, 125 и 126, соответственно; (22) SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно; (23) SEQ ID NO: 136, 137 и 138, соответственно; (24) SEQ ID NO: 142, 143 и 144, соответственно; (25) SEQ ID NO: 148, 149 и 150, соответственно; (26) SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно; (27) SEQ ID NO: 160, 161 и 162, соответственно; (28) SEQ ID NO: 166, 167 и 168, соответственно; (29) SEQ ID NO: 172, 173 и 174, соответственно; (30) SEQ ID NO: 178, 179 и 180, соответственно; (31) SEQ ID NO: 184, 185 и 186, соответственно; или (32) SEQ ID NO: 190, 191 и 192, соответственно.

В некоторых случаях антитело представляет собой антитело, содержащее только тяжелые цепи. В некоторых случаях антитело не содержит легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело содержит одну тяжелую цепь иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело содержит две тяжелые цепи иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело состоит из двух тяжелых цепей иммуноглобулина. В некоторых случаях, по меньшей мере, одна из двух тяжелых цепей иммуноглобулина включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 или 188.

В некоторых случаях вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183 или 189.

В некоторых случаях антитело специфически связывается с CD152 человека. В некоторых случаях антитело связывается с CD152 человека с высокой аффинностью. В некоторых случаях антитело связывается с CD152 человека с аффинностью выше, чем у аналога ипилимумаба. В некоторых случаях антитело связывается с CD152 человека с аффинностью, которая, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 20 раз, по меньшей мере, в 30 раз, по меньшей мере, в 50 раз или, по меньшей мере, в 100 раз выше, чем у аналога ипилимумаба.

В некоторых случаях антитело диссоциирует от человеческого CD152 с Kd 1,0*10^-7 М или менее. В некоторых случаях антитело диссоциирует от человеческого CD152 с Kd 1,0*10^-8 М или менее. В некоторых случаях антитело диссоциирует от человеческого CD152 с Kd 1,0*10^-9 М или менее. В некоторых случаях антитело диссоциирует от человеческого CD152 с Kd 1,0*10^-10 М или менее. В некоторых случаях антитело диссоциирует от человеческого CD152 с Kd 1,0*10^-11 М или менее. В некоторых случаях Kd составляет 6,0*10^-11 М или менее. В некоторых случаях антитело диссоциирует от человеческого CD152 с Kd, который ниже, чем у аналога ипилимумаба. В некоторых случаях антитело диссоциирует от CD152 человека с Kd, который, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 20 раз, по меньшей мере, в 30 раз, по меньшей мере, в 50 раз или, по меньшей мере, в 100 раз ниже, чем у аналога ипилимумаба. В некоторых случаях Kd определяется поверхностным плазмонным резонансом.

В некоторых случаях антитело специфически связывается с CD152 обезьяны. В некоторых случаях антитело специфически не связывается с CD152 обезьяны. В некоторых случаях антитело блокирует связывание CD152 с CD80, CD86 или с обеими. В некоторых случаях антитело способствует секреции IL-2 иммунными клетками. В некоторых случаях антитело индуцирует активацию Т-клеток. В некоторых случаях антитело стимулирует противоопухолевый иммунный ответ иммунных клеток. В некоторых случаях антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

В другом аспекте в данном документе раскрыто выделенное моноклональное антитело, содержащее только тяжелые цепи, включающее CD152-связывающий домен, где антитело специфически связывается с CD152 человека. В некоторых случаях антитело не содержит легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело содержит одну тяжелую цепь иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело содержит две тяжелые цепи иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело состоит из двух тяжелых цепей иммуноглобулина.

В некоторых случаях антитело связывается с CD152 человека с высокой аффинностью. В некоторых случаях антитело связывается с CD152 человека с аффинностью выше, чем у аналога ипилимумаба. В некоторых случаях антитело связывается с CD152 человека с аффинностью, которая, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 20 раз, по меньшей мере, в 30 раз, по меньшей мере, в 50 раз или, по меньшей мере, в 100 раз выше, чем у аналога ипилимумаба.

В некоторых случаях антитело специфически связывается с CD152 обезьяны. В некоторых случаях антитело специфически не связывается с CD152 обезьяны. В некоторых случаях CD152-связывающий домен включает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, где CDR1, CDR2 и CDR3 содержат аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 90% 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с (1) SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно; (2) SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно; (3) SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно; (4) SEQ ID NO: 22, 23 и 24, соответственно; (5) SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; (6) SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно; (7) SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответственно; (8) SEQ ID NO: 46, 47 и 48, соответственно; (9) SEQ ID NO: 52, 53 и 54, соответственно; (10) SEQ ID NO: 58, 59 и 60, соответственно; (11) SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно; (12) SEQ ID NO: 70, 71 и 72, соответственно; (13) SEQ ID NO: 76, 77 и 78, соответственно; (14) SEQ ID NO: 82, 83 и 84, соответственно; (15) SEQ ID NO: 88, 89 и 90, соответственно; (16) SEQ ID NO: 94, 95 и 96, соответственно; (17) SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно; (18) SEQ ID NO: 106, 107 и 108, соответственно; (19) SEQ ID NO: 112, 113 и 114, соответственно; (20) SEQ ID NO: 118, 119 и 120, соответственно; (21) SEQ ID NO: 124, 125 и 126, соответственно; (22) SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно; (23) SEQ ID NO: 136, 137 и 138, соответственно; (24) SEQ ID NO: 142, 143 и 144, соответственно; (25) SEQ ID NO: 148, 149 и 150, соответственно; (26) SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно; (27) SEQ ID NO: 160, 161 и 162, соответственно; (28) SEQ ID NO: 166, 167 и 168, соответственно; (29) SEQ ID NO: 172, 173 и 174, соответственно; (30) SEQ ID NO: 178, 179 и 180, соответственно; (31) SEQ ID NO: 184, 185 и 186, соответственно; или (32) SEQ ID NO: 190, 191 и 192, соответственно.

В некоторых случаях CD152-связывающий домен включает, по меньшей мере, одну тяжелую цепь иммуноглобулина, где тяжелая цепь иммуноглобулина включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 или 188. В некоторых случаях вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183 или 189.

В некоторых случаях антитело блокирует связывание CD152 с CD80, CD86 или с обеими. В некоторых случаях антитело способствует секреции IL-2 иммунными клетками. В некоторых случаях антитело индуцирует активацию Т-клеток. В некоторых случаях антитело стимулирует противоопухолевый иммунный ответ иммунных клеток. В некоторых случаях антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

В другом аспекте в данном документе раскрыта фармацевтическая композиция, включающая любое антитело, раскрытое в данном документе, и его фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых случаях фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество выбирают из группы, состоящей из носителей, поверхностно-активных агентов, загустителей или эмульгаторов, твердых связующих, дисперсионных или суспендирующих добавок, солюбилизаторов, красителей, ароматизаторов, покрытий, агентов для улучшения распадаемости, смазывающих веществ, подсластителей, консервантов, изотонических агентов и их комбинаций. В некоторых случаях фармацевтическая композиция дополнительно содержит второе антитело, где второе антитело представляет собой иммуностимулирующее антитело или костимулирующее антитело. В некоторых случаях иммуностимулирующее антитело выбирают из группы, состоящей из анти-PD-1 антитела, анти-PD-L1 антитела, анти-LAG-3 антитела, анти-TIM 3 антитела, анти-STAT3 антитела и анти-ROR1 антитела. В некоторых случаях костимулирующее антитело представляет собой анти-CD137 антитело или анти-GITR антитело.

В другом аспекте в данном документе раскрыта выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая любое антитело, раскрытое в данном документе. В некоторых случаях молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 92%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO.: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 или 187. В некоторых случаях молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 или 187.

В другом аспекте в данном документе раскрыт экспрессирующий вектор, содержащий сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий любое антитело, раскрытое в данном документе, где сегмент нуклеиновой кислоты функционально связан с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В некоторых случаях сегмент нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 88%, 92%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO : 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 или 187. В некоторых случаях сегмент нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 или 187.

В другом аспекте в данном документе раскрыта клетка-хозяин, содержащая любой экспрессирующий вектор, раскрытый в данном документе.

В другом аспекте в данном документе раскрыт способ получения CD152-связывающего моноклонального антитела, причем способ включает: культивирование клетки-хозяина, содержащей любой экспрессирующий вектор, в условиях, в которых экспрессируется сегмент нуклеиновой кислоты, с получением, таким образом, CD152-связывающего моноклонального антитела. В некоторых случаях клетка-хозяин представляет собой линию клеток-хозяев CHO, HEK293 или COS. В некоторых случаях клеточная линия-хозяин CHO представляет собой клеточную линию CHO-K1. В некоторых случаях способ дополнительно включает извлечение CD152-связывающего моноклонального антитела.

В другом аспекте в данном документе раскрыт способ индукции антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) против клетки, экспрессирующей антиген, ассоциированный с опухолью, причем способ включает: контакт Т-клетки с любым антителом, раскрытым в данном документе, где указанный контакт происходит в условиях, при которых индуцируется ADCC против клетки, экспрессирующей ассоциированный с опухолью антиген.

В другом аспекте в данном документе раскрыт способ лечения расстройства у объекта, включающий введение объекту терапевтически эффективного количества любого антитела, раскрытого в данном документе, или любой фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе. В некоторых случаях расстройство является раком. В некоторых случаях рак выбирают из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, CLL, малой лимфоцитарной лимфомы, B-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы Беркетта, почечно-клеточного рака, рака толстой кишки, колоректального рака, рака молочной железы, эпителиального плоскоклеточного рака, меланомы, миеломы, рака желудка, рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака яичка, рака щитовидной железы и рака головы и шеи. В некоторых случаях способ дополнительно включает терапевтический агент. В некоторых случаях терапевтическое средство представляет собой противораковое лекарственное средство. В некоторых случаях терапевтическое средство представляет собой ипилимумаб или его биоподобный продукт. В некоторых случаях расстройство является аутоиммунным заболеванием.

В другом аспекте в данном документе раскрыто применение любой фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, для приготовления лекарственного средства для лечения расстройства. В некоторых случаях расстройство является раком. В некоторых случаях рак выбирают из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, CLL, малой лимфоцитарной лимфомы, B-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы Беркетта, почечно-клеточного рака, рака толстой кишки, колоректального рака, рака молочной железы, эпителиального плоскоклеточного рака, меланомы, миеломы, рака желудка, рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака яичка, рака щитовидной железы и рака головы и шеи. В некоторых случаях расстройство является аутоиммунным заболеванием.

В другом аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, имеющему вариабельную область тяжелой цепи, которая включает область CDR1, область CDR2 и область CDR3, где область CDR1, область CDR2 и область CDR3 содержит аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности с (1) SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно; (2) SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно; (3) SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно; (4) SEQ ID NO: 22, 23 и 24, соответственно; (5) SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; (6) SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно; (7) SEQ ID NO: 40, 41 и 42, соответственно; (8) SEQ ID NO: 46, 47 и 48, соответственно; (9) SEQ ID NO: 52, 53 и 54, соответственно; (10) SEQ ID NO: 58, 59 и 60, соответственно; (11) SEQ ID NO: 64, 65 и 66, соответственно; (12) SEQ ID NO: 70, 71 и 72, соответственно; (13) SEQ ID NO: 76, 77 и 78, соответственно; (14) SEQ ID NO: 82, 83 и 84, соответственно; (15) SEQ ID NO: 88, 89 и 90, соответственно; (16) SEQ ID NO: 94, 95 и 96, соответственно; (17) SEQ ID NO: 100, 101 и 102, соответственно; (18) SEQ ID NO: 106, 107 и 108, соответственно; (19) SEQ ID NO: 112, 113 и 114, соответственно; (20) SEQ ID NO: 118, 119 и 120, соответственно; (21) SEQ ID NO: 124, 125 и 126, соответственно; (22) SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно; (23) SEQ ID NO: 136, 137 и 138, соответственно; (24) SEQ ID NO: 142, 143 и 144, соответственно; (25) SEQ ID NO: 148, 149 и 150, соответственно; (26) SEQ ID NO: 154, 155 и 156, соответственно; (27) SEQ ID NO: 160, 161 и 162, соответственно; (28) SEQ ID NO: 166, 167 и 168, соответственно; (29) SEQ ID NO: 172, 173 и 174, соответственно; (30) SEQ ID NO: 178, 179 и 180, соответственно; (31) SEQ ID NO: 184, 185 и 186, соответственно; или (32) SEQ ID NO: 190, 191 и 192, соответственно; где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают CTLA-4.

В другом аспекте выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183 или 189.

В одном воплощении антитело по настоящему изобретению включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182 или 188, которые могут кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID No: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 157, 163, 169, 175, 181 или 187.

В некоторых воплощениях антитело по настоящему изобретению состоит по существу или состоит из двух тяжелых цепей, описанных выше.

В другом аспекте изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть является частью иммуноконъюгата, который содержит терапевтический агент, например цитотоксин или радиоактивный изотоп, связанный с антителом. В другом аспекте антитело является частью биспецифической молекулы, которая содержит второй функциональный фрагмент (например, второе антитело), обладающий специфичностью связывания, отличной от указанного антитела или его антигенсвязывающей части. В другом аспекте антитело или его антигенсвязывающие части по настоящему изобретению могут быть превращены в часть химерного антигенного рецептора (CAR) или сконструированного Т-клеточного рецептора. Антитело или его антигенсвязывающие части по настоящему изобретению также могут кодироваться или применяться в сочетании с онколитическим вирусом.

Также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть, иммуноконъюгат, биспецифическую молекулу, химерный антигенный рецептор, сконструированный Т-клеточный рецептор или онколитический вирус по изобретению, необязательно составленный в фармацевтически приемлемом носителе.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать другие противораков агенты. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать, по меньшей мере, одно дополнительное иммуностимулирующее антитело, выбранное из группы, состоящей из анти-PD-1 антитела, анти-PD-L1 антитела, анти-LAG-3 антитела, анти-TIM 3 антитела, анти-STAT3-антитела и анти-ROR1-антитела и/или костимулирующего антитела, которое может быть анти-CD137-антителом или анти-GITR-антителом.

Также предлагается молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающую часть (например, вариабельные области и/или CDR) по изобретению, а также экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту и клетку-хозяина, содержащую экспрессирующий вектор. Также предлагается способ получения анти-CTLA-4 антитела с использованием клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, и включающий стадии (i) экспрессии антитела в клетке-хозяине и (ii) выделения антитела из клетки-хозяина.

В еще одном воплощении изобретение относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у объекта, включающему введение объекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению. Опухоль может представлять собой солидную или несолидную опухоль, выбранную из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, CLL, малой лимфоцитарной лимфомы, В-клеточной лимфомы маргинальных клеток, лимфомы Беркетта, почечно-клеточного рака, рака толстой кишки, колоректального рака, рака молочной железы, эпителиального плоскоклеточного рака, меланомы, миеломы, рака желудка, рака головного мозга, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака яичка, рака щитовидной железы и рака головы и шеи. Предпочтительно, опухоль представляет собой меланому, рак предстательной железы или немелкоклеточный рак легкого. В еще одном воплощении изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания у объекта, включающему введение объекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению. В еще одном воплощении изобретение относится к способу лечения вирусной инфекции у объекта, включающему введение объекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению. В другом воплощении способ включает введение фармацевтической композиции, биспецифического агента или иммуноконъюгата по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к анти-CTLA-4 антителу и композиции по изобретению для применения в вышеупомянутых способах или для получения лекарственного средства для применения в вышеупомянутых способах (например, для лечения).

Другие особенности и преимущества настоящего раскрытия будут очевидны из следующего подробного описания и примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержание всех источников, записей Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных по всей данной заявке, прямо включено в данный документ ссылкой.

Краткое описание чертежей

Вышеизложенное краткое изложение, а также последующее подробное описание изобретения будет лучше поняты при рассмотрении вместе с чертежами. Следует понимать, что изобретение не ограничено воплощениями, представленными на чертежах.

На чертежах:

На фиг. 1 показана активность связывания анти-CTLA-4 антител по настоящему изобретению с CTLA-4 человека, экспрессированной на клетках 293.

На фиг. 2 показана активность связывания анти-CTLA-4-антител по настоящему изобретению с CTLA-4 яванского макака, экспрессированной на клетках 293.

На фиг. 3 показана способность анти-CTLA-4 антител по настоящему изобретению блокировать взаимодействие между CTLA-4 и B7.1.

На фиг. 4А и 4В показано влияние анти-CTLA-4 антител CL3, CL5, CL11 и CL22 (A) и CL24, CL25 и CL30 (B) на секрецию IL-2 в анализе стимуляции SEB-зависимых Т-лимфоцитов с использованием PBMC от донора 1.

На фиг. 5А и 5В показана способность к связыванию анти-CTLA-4 антител экспрессированный CL5, CL11, CL22, CL24 и CL25 (A) и CL5 (B) с CTLA-4 человека или CTLA-4 мыши.

На фиг. 6А и 6В показано влияние анти-CTLA-4 антител CL5, CL11 и их мутантов (A) и CL22, CL25 и их мутантов (B) на секрецию IL-2 в анализе стимуляции SEB-зависимых Т-лимфоцитов с использованием PBMC от донора 2.

На фиг. 7 показана активность связывания мутантов анти-CTLA-4-антитела с CTLA-4 человека.

На фиг. 8 показана активность мутантов анти-CTLA-4-антител в отношении блокирующего взаимодействия между CTAL-4 и меченным биотином B7.1.

На фиг. 9 показано влияние мутантов анти-CTLA-4-антител на секрецию IL-2 в анализе стимуляции SEB-зависимых Т-лимфоцитов с использованием PBMC от донора 3.

На фиг. 10 показана активность связывания анти-CTLA-4 антитела CL5 и его мутантов с CTLA-4 человека или яванского макака, измеренная с помощью BiaCore.

На фиг. 11 показана активность ADCC in vitro анти-CTLA-4-антитела CL5 и его мутанта на клетках CHO K1-CTLA-4.

На фиг. 12 показан профиль зависимости сывороточной концентрации от времени анти-CTLA-4-антитела CL5 у мышей-самцов C57BL/6.

На фиг. 13 показано соотношение опухоли к сыворотке концентрации анти-CTLA4 HCAb.

На фиг. 14А, 14В и 14С показана противоопухолевая активность анти-CTLA-4 антител у мышей с опухолями МС38. (А) Кривые роста опухоли в разных группах. (B) Кривая выживания времени до конечной точки Каплана-Мейера. (C) Массы тела мышей оставались относительно постоянными вместе с обработкой человеческим анти-CTLA-4 антителом. Данные были выражены как Среднее + SEM, N = 9.

На фиг. 15А и 15В показано ингибирование роста опухоли человеческими анти-CTLA-4 антителами у мышей, несущих МС38. (А) Кривая роста опухоли. (B) Масса тела мышей оставалась относительно постоянной на фоне обработки человеческим анти-CTLA-4 антителом. Данные были выражены как Среднее + SEM, N = 6.

Подробное описание изобретения

Общий обзор

В раскрытии предлагаются антитела, которые специфически связываются с CD152. Эти связывающие молекулы могут специфически связываться с CD152 и с другой мишенью. Введение терапевтически эффективного количества CD152-связывающего антитела нуждающемуся в этом пациенту полезно при лечении определенных расстройств, включая определенные виды рака. Связывание антитела с Т-клеткой, экспрессирующей CD152, индуцирует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность в отношении клетки, экспрессирующей антиген, ассоциированный с опухолью. Терапевтические средства, связывающиеся с CD152, по настоящему изобретению, предлагают различные преимущества при лечении пациентов, например, эффективное связывание с CD152, эффективную индукцию антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности и/или более низкий риск неблагоприятных событий (например, токсичности). В определенных аспектах CD152-связывающие антитела связываются с CD152 более эффективно в определенных форматах (например, антитело, содержащее только тяжелые цепи, по сравнению с типичным полноразмерным антителом), что приводит к более высокой эффективности и улучшенной применимости при лечении расстройств, связанных с CD152.

Определения

Используемые в данном документе заголовки разделов предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описанный объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемых в данном документе, включая, без ограничения указанным, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, настоящим прямо включены ссылкой в полном объеме для любых целей. В случае, если один или несколько из включенных документов или частей документов определяют термин, который противоречит определению этого термина в заявке, определение, которое появляется в этой заявке, имеет преимущественную силу. Однако упоминание любых источника, статьи, публикации, патента, публикации патента и заявки на патент, цитируемых в данном документе, не является и не должно восприниматься как подтверждение или какая-либо форма предположения о том, что они представляют собой действующий предшествующий уровень техники или являются частью широко распространёнными общими знаниями в любой стране мира.

В настоящем описании любой диапазон концентрации, процентный диапазон, диапазон отношения или целочисленный диапазон следует понимать как включающий значение любого целого числа в указанном диапазоне и, при необходимости, его доли (например, одну десятую и одну сотую целого числа), если не указано иное. Следует понимать, что термины, приведенные в единственном числе, относятся к «одному или нескольким» из перечисленных компонентов, если не указано иное. Использование альтернативы (например, «или») следует понимать как означающее либо одну, обе или любую комбинацию альтернатив. Используемые в данном документе термины «включать» и «содержать» используются как синонимы. Кроме того, следует понимать, что полипептиды, содержащие различные комбинации компонентов (например, доменов или областей) и заместителей, описанных в данном документе, раскрыты в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждый полипептид был изложен индивидуально. Таким образом, выбор конкретных компонентов отдельных полипептидов находится в пределах объема настоящего раскрытия.

Термин «около» и его грамматические эквиваленты по отношению к референсному числовому значению и его грамматические эквиваленты, используемые в данном документе, могут включать диапазон значений плюс или минус 10% от этого значения, такой как диапазон значений плюс или минус 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от этого значения. Например, сумма «около 10» включает суммы от 9 до 11.

При использовании в данном документе «полипептид» или «полипептидная цепь» представляет собой единое, линейное и непрерывное расположение ковалентно связанных аминокислот. Он не включает две полипептидные цепи, которые связаны друг с другом нелинейным образом, например, через дисульфидную связь между цепями (например, половинная молекула иммуноглобулина, в которой легкая цепь связана с тяжелой цепью через дисульфидную связь). Полипептиды могут иметь или образовывать одну или несколько внутрицепочечных дисульфидных связей. Что касается полипептидов, как описано в данном документе, ссылка на аминокислотные остатки, соответствующие остаткам, указанным в SEQ ID NO, включает посттрансляционные модификации таких остатков.

«Белок» представляет собой макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой производится белок, и будут варьировать в зависимости от типа клетки. Белки определены в данном документе с точки зрения их структуры аминокислотной цепи; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но, тем не менее, могут присутствовать.

Термины «антитело», «иммуноглобулин» или «Ig» могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо и означают молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеуказанных через, по меньшей мере, один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. При использовании в данном документе термин «антитело» охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как фрагменты Fab, Fab′, F(ab′)2 и Fμ), одноцепочечные мутанты Fμ (scFv), мультиспецифичные антитела, такие как биспецифичные антитела (включая антитела с двойным связыванием), химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, гибридные белки, содержащие часть определения антигена из антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, при условии, что антитела демонстрируют искомую биологическую активность. Термин «антитело» может также относиться к Y-образному гликопротеину с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, который состоит из четырех полипептидных цепей: двух легких (L) цепей и двух тяжелых (H) цепей. Существует пять типов изотипов тяжелых цепей млекопитающих Ig, обозначаемых греческими буквами альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ). Тип тяжелой цепи определяет класс антител, то есть IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. Классы γ и α дополнительно подразделяются на подклассы на основе различий в последовательности и функции константного домена, например, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. У млекопитающих есть два типа легких цепей иммуноглобулина, λ и κ.

При использовании в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций и/или модификаций после трансляции (например, изомеризации, амидиации), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела имеют то преимущество, что они синтезируются культурой гибридомы, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, получаемого по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными способами, включая, например, гибридомный способ (например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способы рекомбинантной ДНК (см., например, Пат. США 4816567), технологии фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) и технологии получения антител человека или антител, подобных антителам человека в животных, которые имеют части или все локусы иммуноглобулина человека или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулина человека (см. например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Пат. США No. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

При использовании в данном документе термин «антитело, содержащее только тяжелые цепи» (HCAb) относится к антителу, которое состоит только из двух тяжелых цепей и не содержит двух легких цепей, обычно присутствующих в полноразмерных антителах.

Термин «выделенное антитело», при использовании для описания различных антител, раскрытых в данном документе, означает антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из клетки или клеточной культуры, из которой оно было экспрессировано. Загрязняющие компоненты его естественной среды представляют собой материалы, которые обычно мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых воплощениях антитело очищают до чистоты более 95% или 99%, что определяется, например, электрофоретическим способом (например, SDS-PAGE, изоэлектрическое фокусирование (IEF), капиллярный электрофорез) или хроматографическим способом (например, ионно-обменная или обратно-фазная ВЭЖХ). Для обзора способов оценки чистоты антител см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007). В предпочтительных воплощениях антитело будет очищено (1) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до гомогенности с помощью SDS-PAGE при невосстанавливающих или восстанавливающих условия с использованием кумасси синего или, предпочтительно, серебряного красителя. Выделенное антитело включает антитела in situ в рекомбинантных клетках, поскольку, по меньшей мере, один компонент полипептидной природной среды не будет присутствовать. Обычно, однако, выделенный полипептид будет получен, по меньшей мере, на одной стадии очистки.

Термин «выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественной среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в локации в хромосоме расположении, которая отличается от ее естественного расположения в хромосоме.

Термины «вариабельная область легкой цепи» (также называемая «вариабельный домен легкой цепи» или «VL» или V_L) и «вариабельная область тяжелой цепи» (также называемая «вариабельный домен тяжелой цепи» или «VH» или V_H) относятся к вариабельной области связывания антитела легкой и тяжелой цепи, соответственно. Вариабельные области связывания состоят из дискретных, четко определенных субобластей, известных как «области, определяющие комплементарность» (CDR) и «каркасные области» (FR), обычно включающие FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3 -FR4 от аминоконца до карбоксильного конца. В одном воплощении FR являются гуманизированными. Термин «CL» относится к «константной области легкой цепи иммуноглобулина» или «константной области легкой цепи», то есть константной области легкой цепи антитела. Термин «СН» относится к «константной области тяжелой цепи иммуноглобулина» или «константной области тяжелой цепи», которая дополнительно делится в зависимости от изотипа антитела на СН1, СН2 и СН3 (IgA, IgD, IgG) или домены CH1, CH2, CH3 и CH4 (IgE, IgM). «Fab» (фрагмент, связывающий антиген) представляет собой часть антитела, которая связывается с антигенами и включает вариабельную область и домен CH1 тяжелой цепи, связанный с легкой цепью через межцепную дисульфидную связь.

При использовании в данном документе термин «связывающий домен» или «связывающая область» относится к домену, области, части или сайту белка, полипептида, олигопептида или пептида или антитела или связывающего домена, полученного из антитела, которые обладают способностью специфически распознавать и связывать молекулу-мишень, такую как антиген, лиганд, рецептор, субстрат или ингибитор (например, CD152). Типичные связывающие домены включают вариабельные области одноцепочечных антител (например, доменные антитела, sFv, scFv, scFab), рецепторные эктодомены и лиганды (например, цитокины, хемокины). В некоторых воплощениях связывающий домен включает или состоит из антигенсвязывающего сайта (например, содержащего вариабельную последовательность тяжелой цепи и вариабельную последовательность легкой цепи или три области, определяющие комплементарность из легкой цепи (CDR) и три CDR из тяжелой цепи антитела, помещенных в альтернативный вариант каркасной области (FR) (например, FR человека, необязательно содержащей одну или несколько аминокислотных замен). Известно множество анализов для идентификации доменов связывания по настоящему изобретению, которые специфически связывают конкретную мишень, включая вестерн-блот, ELISA, скрининг библиотеки фагового дисплея и анализ взаимодействия BIACORE®. При использовании в данном документе, «CD152-связывающий домен» может иметь вариабельные области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащие три CDR тяжелой цепи: CDR1, CDR2 и CDR3.

Антитело или связывающий домен «специфически связывает» мишень, если оно связывает мишень с аффинностью или Ka (то есть константой равновесной ассоциации конкретного связывающего взаимодействия с единицами 1/М), равной или превышающей 105 М^-1 и при этом незначительно связывает другие компоненты, присутствующие в тестовом образце. Антитела или связывающие домены могут быть классифицированы как «высокоаффинные» антитела или связывающие домены и «низкоаффинные» антитела или связывающие домены. «Высокоаффинные» антитела или связывающие домены относятся к тем антителам или связывающим доменам с Ka, по меньшей мере, 10⁷ М^-1, по меньшей мере, 10⁸ М^-1, по меньшей мере, 10⁹ М^-1, по меньшей мере, 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере, 10¹¹ М^-1, по меньшей мере, 10¹² М^-1 или, по меньшей мере, 10¹³ М^-1. «Низкоаффинные» антитела или связывающие домены относятся к тем антителам или связывающим доменам с Ka до 10⁷ М^-1, до 10⁶ М^-1, до 10⁵ М^-1. В ином случае, аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (Kd) конкретного связывающего взаимодействия с единицами М (например, 10^-5 M - 10^-13 M). В случае связывания антитела с антигеном Ka = 1/Kd. Аффинность антител или связывающих доменов в соответствии с настоящим изобретением может быть легко определена с использованием обычных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс (см., например, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; и Пат. США № 5283173, 5468614 или эквивалент).

При использовании в данном документе «CD152» относится к кластеру дифференцировки 152, который также известен как белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4). Термины «CD152», «CTLA-4» и «CTLA4» используются в данном документе взаимозаменяемо. Аналогично, «анти-CD152», «анти-CTLA-4», «анти-CTLA4» также используются в данном документе взаимозаменяемо.

При использовании в данном документе «CD80» относится к кластеру дифференцировки 80, который представляет собой белок, обнаруженный в дендритных клетках, активированных В-клетках и моноцитах, который обеспечивает костимулирующий сигнал, необходимый для активации и выживания Т-клеток. Термины «CD80», «B7-1» и «B7.1» используются в данном документе взаимозаменяемо.

При использовании в данном документе «CD86» относится к кластеру дифференцировки 86, который представляет собой белок, экспрессируемый на антигенпрезентирующих клетках, который обеспечивает костимулирующие сигналы, необходимые для активации и выживания Т-клеток. Термины «CD86», «B7-2» и «B7.2» используются в данном документе взаимозаменяемо.

При использовании в данном документе «консервативная замена» в данной области техники известна как замена одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет сходные свойства. Типичные консервативные замены хорошо известны в данной области (см., например, WO 97/09433, стр. 10, опубликовано 13 марта 1997 г.; Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). В некоторых воплощениях консервативная замена включает замену лейцина на серин.

При использовании в данном документе «аналог ипилимумаба» относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с CTLA-4, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.: 199 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 200.

При использовании в данном документе, если не указано иное, любое непатентованное или общее название биологического продукта включает биологический продукт и любой его биоподобный продукт. Например, непатентованное название, ипилимумаб, относится к биологическому продукту, продаваемому под торговой маркой YERVOY; это также включает любой биоподобный продукт биологического продукта.

При использовании в данном документе, если не указано иное, термин «биоподобный продукт» относится к 1) биологическому продукту, имеющему аминокислотную последовательность, которая идентична референсному продукту; 2) биологический продукт, имеющий аминокислотную последовательность, отличную (например, укорочения на N- или C-конце) от референсного продукта; или 3) биологический продукт, имеющий посттрансляционную модификацию, отличающуюся от (например, гликозилированием или фосфорилированием) от референсного продукта, где биоподобный продукт и референсный продукт используют один и тот же механизм или механизмы действия для профилактики, обработки или лечения заболевания или состояния.

При использовании в данном документе термин «производное» относится к модификации одного или нескольких аминокислотных остатков пептида химическими или биологическими средствами, либо с ферментом, либо без него, например, путем гликозилирования, алкилирования, ацилирования, образования сложного эфира или амида. образование.

При использовании в данном документе указание того, что полипептид или аминокислотная последовательность, «получены из» указанного полипептида или белка, относится к происхождению полипептида. В некоторых воплощениях полипептидная или аминокислотная последовательность, которая получена из конкретной последовательности (иногда называемой «исходной» или «родителем» или «родительской» последовательностью), имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична исходной последовательности или ее части, причем часть состоит, по меньшей мере, из 10-20 аминокислот, по меньшей мере, 20-30 аминокислот, или, по меньшей мере, 30-50 аминокислот, или, по меньшей мере, 50-150 аминокислот, или которые иным образом идентифицируемы обычным специалистом в данной области техники, как происходящие из исходной последовательности. Например, связывающий домен может быть получен из антитела, например, Fab, F(ab’)2, Fab’, scFv, однодоменного антитела (sdAb) и т.д.

Полипептиды, полученные из другого полипептида, могут иметь одну или несколько мутаций относительно исходного полипептида, например, один или несколько аминокислотных остатков, которые были замещены другим аминокислотным остатком или которые имеют одну или несколько вставок или делеций аминокислотных остатков. Полипептид может содержать аминокислотную последовательность, которая не встречается в природе. Такие вариации обязательно имеют менее чем 100% идентичности или сходства последовательности с исходным полипептидом. В одном воплощении вариант будет иметь аминокислотную последовательность от около 60% до менее чем 100% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью исходного полипептида. В другом воплощении вариант будет иметь аминокислотную последовательность от около 75% до менее чем 100%, от около 80% до менее чем 100%, от около 85% до менее чем 100%, от около 90% до менее чем 100 %, от около 95% до менее чем 100% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью исходного полипептида.

При использовании в данном документе, если не указано иное, положение аминокислотного остатка в вариабельной области молекулы иммуноглобулина нумеруется в соответствии с системой нумерации IMGT (Brochet, X, et al., Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508), а положение аминокислотного остатка в константной области молекулы иммуноглобулина пронумеровано в соответствии с номенклатурой EU (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94). В данной области известны другие системы нумерации (например, система нумерации по Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)).

При использовании в данном документе термин «человеческое» антитело относится к антителу человеческого происхождения или гуманизированному антителу.

При использовании в данном документе термин «гуманизированный» относится к процессу создания с помощью методов генной инженерии антител или иммуноглобулиновых связывающих белков и полипептидов, полученных от не являющегося человеком вида (например, мыши или крысы), менее иммуногенными для человека, с сохранением при этом антигенсвязывающих свойств оригинального антитела. В некоторых воплощениях связывающий домен(домены) антитела или иммуноглобулиновых связывающих белков и полипептидов (например, вариабельные области легкой и тяжелой цепи, Fab, scFv) являются гуманизированными. Нечеловеческие связывающие домены могут быть гуманизированы с использованием методов, известных как прививка CDR (Jones et al., Nature 321: 522 (1986)) и их вариантов, включая «решейпинг» (Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), «гиперхимеризация» (Queen et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: 10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88: 2869-2873; Co, et al., 1992 J. Immunol. 148: 1149-1154) и «венирование» (Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.” In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312). Если они получены из не являющегося человеком источника, другие области антитела или иммуноглобулиновые связывающие белки и полипептиды, такие как шарнирная область и домены константной области, также могут быть гуманизированы.

При использовании в данном документе термин «нуждающийся пациент» или «нуждающийся объект» относится к пациенту или объекту, подверженному риску заболевания или расстройства или состояния, которое поддается лечению или улучшению с помощью CD152-связывающего антитела или его композиции, представленных в данном документе.

При использовании в данном документе термин «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным веществам и композициям, которые обычно не вызывают аллергических или других серьезных побочных реакций при введении с использованием путей, хорошо известных в данной области. Молекулярные объекты и композиции, одобренные регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленные в Фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях для применения на животных, и, более конкретно, на людях, считаются «фармацевтически приемлемыми».

При использовании в данном документе термин «лечение», «лечить» или «улучшать состояние» относится либо к терапевтическому лечению, либо к профилактическому/превентивному лечению. Лечение является терапевтическим, если, по меньшей мере, один симптом заболевания у индивидуума, получающего лечение, улучшается или лечение может отсрочить ухудшение прогрессирующего заболевания у индивидуума или предотвратить возникновение дополнительных сопутствующих заболеваний.

При использовании в данном документе термин «терапевтически эффективное количество (или доза)» или «эффективное количество (или доза)» конкретной связывающей молекулы или соединения относится к такому количеству соединения, которое достаточно, чтобы привести к ослаблению одного или нескольких симптомов заболевания, подвергаемого лечению, статистически значимым образом или статистически значимому улучшению функции органов. При ссылке на отдельный активный ингредиент, вводимый отдельно, терапевтически эффективная доза относится только к этому ингредиенту. Применительно к комбинации терапевтически эффективная доза относится к объединенным количествам активных ингредиентов, которые приводят к терапевтическому эффекту, вне зависимости вводятся ли они последовательно или одновременно (в одной и той же композиции или одновременно в отдельных композициях).

При использовании в данном документе термины «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и «ADCC» относятся к клеточно-опосредованному процессу, в котором неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcγR (например, моноцитарные клетки, такие как клетки-натуральные киллеры (NK) и макрофаги) распознают связанное антитело (или другой белок, способный связывать FcγR) на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. В принципе, любая эффекторная клетка с активирующим FcγR может быть иницирована для опосредования ADCC. Первичными клетками для опосредования ADCC являются NK-клетки, которые экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты, в зависимости от их состояния активации, локализации или дифференцировки, могут экспрессировать FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Обзор экспрессии FcγR на гемопоэтических клетках см., например, Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92.

При использовании в данном документе термин «промотор» относится к области ДНК, вовлеченной в связывание РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

При использовании в данном документе термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» относятся к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме. За исключением случаев конкретного ограничения, термины охватывают нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги природных нуклеотидов, которые обладают свойствами связывания, сходными с эталонной нуклеиновой кислотой, и метаболизируются способом, подобным встречающимся в природе нуклеотидам. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно включает ее консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные замены кодонов) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, вырожденные замены кодонов могут быть достигнуты путем получения последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещено остатками смешанного основания и/или дезоксиинозина (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с геном, кДНК и мРНК, кодируемой геном. При использовании в данном документе термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» предназначены для включения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекул РНК (например, мРНК), аналогов ДНК или РНК, полученных с использованием нуклеотидных аналогов и их производных, фрагментов и гомологов.

Термин «экспрессия» относится к биосинтезу продукта, кодируемого нуклеиновой кислотой. Например, в случае сегмента нуклеиновой кислоты, кодирующего представляющий интерес полипептид, экспрессия включает транскрипцию сегмента нуклеиновой кислоты в мРНК и трансляцию мРНК в один или несколько полипептидов.

Термины «единица экспрессии» и «кассета экспрессии» используются в данном документе взаимозаменяемо и обозначают сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий представляющий интерес полипептид и способный обеспечивать экспрессию сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Единица экспрессии обычно включает промотор транскрипции, открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес полипептид, и терминатор транскрипции, все в функциональной конфигурации. В дополнение к транскрипционному промотору и терминатору, единица экспрессии может дополнительно включать другие сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, энхансер или сигнал полиаденилирования.

При использовании в данном документе термин «экспрессирующий вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или кольцевой, содержащей одну или несколько единиц экспрессии. В дополнение к одной или нескольким единицам экспрессии экспрессирующий вектор может также включать дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, одну или несколько точек начала репликации или один или несколько селектируемых маркеров. Экспрессирующие векторы обычно происходят из плазмидной или вирусной ДНК или могут включать элементы обоих.

При использовании в данном документе термин «идентичность последовательности» относится к взаимосвязи между двумя или более полинуклеотидными последовательностями или между двумя или более полипептидными последовательностями. Когда положение в одной последовательности занято одним и тем же основанием нуклеиновой кислоты или аминокислотным остатком в соответствующем положении сопоставленной последовательности, говорят, что последовательности «идентичны» в этом положении. Процент «идентичности последовательности» рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, чтобы получить количество «идентичных» положений. Количество «идентичных» положений затем делится на общее количество положений в окне сравнения и умножается на 100, чтобы получить процент «идентичности последовательности». Процент «идентичности последовательности» определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения. Окно сравнения для последовательностей нуклеиновых кислот может составлять, например, по меньшей мере, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более нуклеиновых кислот в длину. Окно сравнения для полипептидных последовательностей может быть, например, по меньшей мере, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 или более аминокислот в длину. Чтобы оптимально выровнять последовательности для сравнения, часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции, называемые пробелами, в то время как референсная последовательность поддерживается постоянной. Оптимальное выравнивание - это такое выравнивание, которое, даже с пропусками, создает максимально возможное количество «идентичных» положений между референсной последовательностью и последовательностью сравнения. Процент «идентичности последовательностей» между двумя последовательностями можно определить с помощью версии программы «BLAST 2 Sequences», которая была доступна в Национальном центре биотехнологической информации по состоянию на 1 сентября 2004 года, и эта программа включает программы BLASTN (для сравнения нуклеотидных последовательностей) и BLASTP (для сравнения полипептидных последовательностей), программы которых основаны на алгоритме Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (12): 5873-5877, 1993). При использовании «BLAST 2 Sequences» параметры, которые были параметрами по умолчанию на 1 сентября 2004 года, могут использоваться для размера «слова» (3), штрафа за открытый разрыв (11), штрафа за продолжение разрыва (1), прекращение разрыва (50), ожидаемое значение (10) и любой другой обязательный параметр, включая, без ограничения, опцию матрицы. Считается, что две нуклеотидные или аминокислотные последовательности имеют «по существу сходную идентичность последовательности» или «существенную идентичность последовательности», если две последовательности имеют, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96 %, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательностей относительно друг друга.

Антитела

В данном документе раскрыты человеческие моноклональные антитела, содержащие CD152-связывающий домен. Антитела могут быть антителами только на основе тяжелых цепей. Антитела могут состоять только из двух тяжелых цепей. Антитела могут не содержать легких цепей. Антитела могут специфически связываться с CD152. Антитела могут быть выделенными моноклональными антителами, которые специфически связываются с CD152 с высокой аффинностью.

Описанные в данном документе анти-CD152-антитела могут специфически связываться с CD152 человека. В некоторых случаях анти-CD152 антитела могут связываться с CD152 человека с высокой аффинностью (например, KD <6,0*10^-11M). Анти-CD152 антитела могут иметь сравнимую или более высокую аффинность к CTLA-4 по сравнению с аналогом ипилимумабом. Анти-CD152 антитела также могут блокировать связывание CD152 с его лигандами B7.1. Анти-CD152 антитела могут иметь повышенное соотношение опухоль/периферическая сыворотка, чем аналог ипилимумаб. Анти-CD152 антитела могут индуцировать более высокую ADCC, например, антитела могут индуцировать, по меньшей мере, около 2-кратное, по меньшей мере, около 3-кратное, по меньшей мере, около 4-кратное, по меньшей мере, около 5-кратное, по меньшей мере, около 6-кратное, по меньшей мере, около 7-кратное, по меньшей мере, около 8-кратное, по меньшей мере, около 9-кратное, по меньшей мере, около 10-кратное, по меньшей мере, около 15 -кратное или, по меньшей мере, около 20-кратное, увеличение лизисной активности NK-клеток.

Анти-CD152 антитела могут содержать CD152-связывающий домен, который включает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3. Анти-CD152 антитела также могут содержать CDR1, CDR2 и CDR3, которые отличаются от этих областей из анти-CD152 антител, раскрытых в данном документе, одной или несколькими консервативными модификациями. В данной области понятно, что могут быть выполнены определенные модификации консервативных последовательностей, которые не удаляют связывание антигена. См., например, Brummell et al., 1993, Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al., 1997, Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al., 1992, J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell, 1993, Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., 1998, Int. Immunol.10:341-6 и Beers et al., 2000, Clin. Can. Res. 6:2835-43.

Фармацевтические композиции и составы

Фармацевтическая композиция может содержать одно или несколько анти-CD152 антител, описанных в данном документе, в составе вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. Говорят, что эксципиент является «фармацевтически приемлемым эксципиентом», если его пациент может переносить его прием. Эксципиенты, которые могут быть использованы, включают носители, поверхностно-активные вещества, загущающие или эмульгирующие агенты, твердые связующие, дисперсионные или суспендирующие добавки, солюбилизаторы, красители, ароматизаторы, покрытия, разрыхлители, смазывающие вещества, подсластители, консерванты, изотонические агенты и их комбинации. Выбор и применение подходящих эксципиентов изучается в Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003), и в Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995). Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор является одним из примеров фармацевтически приемлемого эксципиента. Композиции могут дополнительно включать один или несколько носителей, разбавителей, консервантов, солюбилизаторов, буферных агентов, альбумина для предотвращения потери белка на поверхностях сосудов и т.д.

Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения единичной дозированной формы, может варьировать в зависимости от объекта, которого лечат, и конкретного способа введения, и, как правило, может быть таким количеством фармацевтической композиции, которое оказывает терапевтический эффект. Как правило, количество активного ингредиента может составлять от около 0,01% до около 99% (масс./масс.) композиции, например, может составлять около 0,1% -1%, около 0,1% -5%, около 0,1-10%. около 0,1% -20%, около 0,5% -1%, около 0,5% -5%, около 0,5% -10%, около 0,5% -20%, около 1% -5%, около 1% -10%, около 1% -20%, около 5% -10%, около 5% -20%, около 10% -20%, около 10% -30%, около 20% -30%, около 20% -40%, около 30% -40%, около 30% -50%, около 40% -50%, около 40% -60%, около 50% -60%, около 50% -70%, около 60% -70%, около 60 % -80%, около 70% -80%, около 70% -90%, около 80% -90%, около 80% -95% или 95% -99% фармацевтической композиции. Предпочтительно количество активного ингредиента может составлять от около 0,1% до около 70% и наиболее предпочтительно от около 1% до около 30% фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция может быть подходящей для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активный ингредиент может быть покрыт материалом, защищающим его от действия кислот и других природных условий, которые могут его инактивировать. Словосочетание «парентеральное введение» используемое в данном документе, означает режимы введения отличные от энтерального или местного введения, обычно инъекцией, и включает, без ограничений указанным, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутритрахеальную, внутрикапсулярную, внутриорбитальную, внутрикардиальную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, внутрипозвоночную, эпидуральную и надчревную инъекцию или инфузию. В ином случае, антитело по изобретению можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или слизистый путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно. Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильных водных растворов или дисперсий. Фармацевтическая композиция также может быть составлена в виде микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в дозированной форме, выбранной из группы, состоящей из: пероральной дозированной лекарственной формы, внутривенной дозированной лекарственной формы, интраназальной дозированной лекарственной формы, дозированной лекарственной формы для суппозиториев, внутрикожной дозированной лекарственной формы, внутримышечной дозированной лекарственной формы, внутрибрюшинной дозированной лекарственной формы, подкожной дозированной лекарственной формы, эпидуральная дозированной лекарственной формы, сублингвальной дозированной лекарственной формы и внутримозговой дозированной лекарственной формы. Дозированная лекарственная форма для перорального применения может быть выбрана из группы, состоящей из таблеток, пилюль, пеллет, капсул, порошков, пастилок, гранул, растворов, суспензий, эмульсий, сиропов, эликсиров, составов с замедленным высвобождением, аэрозолей и спреев.

Фармацевтическая композиция может представлять собой композицию с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Описанные в данном документе моноклональные антитела могут быть составлены для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, чтобы гарантировать, что терапевтические антитела по изобретению проникают через гематоэнцефалический барьер, они могут быть включены в липосомы, которые могут дополнительно содержать нацеливающие фрагменты для усиления селективного транспорта к конкретным клеткам или органам. См., например, пат. США No. 4522811; 5374548; 5416016; и 5399331; V. V. Ranade, 1989, J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., 1988, Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., 1995, FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., 1995, Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123; и Killion and Fidler, 1994, Immunomethods 4:273.

Фармацевтическая композиция может необязательно включать один или несколько дополнительных фармацевтически активных ингредиентов, таких как другое антитело или лекарственное средство. Фармацевтические композиции по изобретению также можно вводить в комбинированной терапии, например, с другим противоопухолевым средством, другим противовоспалительным средством или вакциной.

Фармацевтические композиции могут поставляться в виде набора, включающего контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, как описано в данном документе. Фармацевтическая композиция может быть предоставлена, например, в форме раствора для инъекций для однократной или многократных доз или в виде стерильного порошка, который будет восстановлен перед инъекцией. В ином случае, такой набор может включать устройство, диспергирующее сухой порошок, генератор жидкого аэрозоля или распылитель для введения фармацевтической композиции. Такой набор может дополнительно включать письменную информацию о показаниях и применении фармацевтической композиции.

Способы лечения

Кроме того, в настоящем описании раскрыт способ лечения расстройства путем введения объекту терапевтически эффективного количества антитела или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе. Анти-CD152 антитела, описанные в данном документе, могут быть использованы в способе лечения объекта (например, человека или примата, не являющегося человеком) или для изготовления лекарственного средства для лечения объекта. Обычно такие способы включают введение объекту, нуждающемуся в таком лечении, анти-CD152-антител, описанных в данном документе.

Анти-CD152 антитела, описанные в данном документе, могут быть использованы в способе лечения объекта (например, человека или примата, не являющегося человеком) или для изготовления лекарственного средства для лечения объекта. Как правило, такие способы включают введение объекту, нуждающемуся в таком лечении, анти-CD152 антитела, описанного в данном документе. В некоторых воплощениях анти-CD152 антитело включает, по меньшей мере, одну эффекторную функцию, выбранную из антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), так что анти-CD152 антитело индуцирует ADCC и/или CDC против CD152-экспрессирующих клеток у объекта.

Также в данном документе раскрыт способ лечения расстройства, характеризующегося сверхэкспрессией опухолевого антигена, такого как рак. Примеры опухолевых антигенов, которые могут распознаваться биспецифическим анти-CD152-антителом, могут включать PSMA, CD19, CD20, CD37, CD38, CD123, Her2, ROR1, RON, антиген гликопротеина A33 (gpA33) и CEA. Обычно такие способы включают введение объекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества анти-CD152 антитела, содержащего второй связывающий домен, который связывает опухолевый антиген, как описано в данном документе. Анти-CD152 антитело может индуцировать перенаправленную T-клеточную цитотоксичность (RTCC) против опухолевых антиген-экспрессирующих клеток у объекта.

Способ может быть использован для лечения рака, такого как рак предстательной железы, колоректальный рак, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак слюнной железы, рак поджелудочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, меланома, рак молочной железы (например, тройной негативный рак молочной железы), рак надпочечника, лимфома мантийных клеток, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, неходжкинская лимфома, острый миелоидный лейкоз (AML), В-лимфолейкоз, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль (BPDCN), волосатоклеточный лейкоз.

Также в данном документе раскрыт способ лечения аутоиммунного расстройства, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтических композиций или анти-CD152 антитела, описанного в данном документе, пациенту, нуждающемуся в этом.

Объекты для введения анти-CD152-антител, как описано в данном документе, включают пациентов с высоким риском развития конкретного расстройства, а также пациентов с имеющимся таким расстройством. Как правило, у объекта диагностируют расстройство, для которого требуется лечение. Кроме того, объекты могут в течение курса лечения наблюдаться на предмет любого изменения расстройства (например, увеличения или уменьшения клинических симптомов расстройства). Кроме того, в некоторых вариантах объект не страдает от другого расстройства, требующего лечения, которое включает нацеливание на клетки, экспрессирующие CD152.

В профилактических целях фармацевтические композиции можно вводить пациенту, подверженному или иным образом подверженному риску конкретного расстройства, в количестве, достаточном для устранения или уменьшения риска или задержки возникновения расстройства. В терапевтических применениях композиции можно вводить пациенту, подозреваемому или уже страдающему таким расстройством, в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, частичной остановки симптомов расстройства и его осложнений. Количество, достаточное для достижения этого, называется терапевтически эффективной дозой или количеством. Как в профилактических, так и в терапевтических режимах агенты можно вводить в нескольких дозировках, пока не будет достигнут достаточный ответ. Как правило, ответ контролируется, и повторные дозы назначаются, если искомый ответ начинает исчезать.

Для идентификации пациентов, подлежащих лечению, в соответствии со способами раскрытия, могут быть использованы принятые способы скрининга для определения факторов риска, связанных с конкретными расстройствами, или для определения состояния существующего расстройства, выявленного у объекта. Такие способы могут включать, например, определение того, есть ли у человека родственники, которым был поставлен диагноз определенного заболевания. Способы скрининга могут также включать, например, обычные обследования для определения семейного статуса для конкретного заболевания, которое, как известно, имеет наследственный компонент. Например, известно, что различные виды раков имеют определенные наследуемые компоненты. Наследуемые компоненты рака включают, например, мутации во множественных генах, которые являются трансформирующими (например, Ras, Raf, EGFR, cMet и др.), наличие или отсутствие определенных молекул HLA и рецептора подавления цитотоксичности (KIR) или механизмы, с помощью которых раковые клетки способны модулировать иммуносупрессию таких клеток, как NK-клетки и Т-клетки, прямо или косвенно (см., например, Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). С этой целью нуклеотидные зонды могут обычно использоваться для идентификации лиц, несущих генетические маркеры, связанные с конкретным представляющим интерес расстройством. Кроме того, в данной области техники известно множество разнообразных иммунологических способов, которые полезны для идентификации маркеров специфического расстройства. Например, в данной области техники доступны и хорошо известны различные способы иммуноферментного анализа ELISA, в которых используются зонды моноклональных антител для выявления антигенов, связанных со специфическими опухолями. Скрининг может быть осуществлен в соответствии с известными симптомами пациента, возрастными факторами, связанными факторами риска и т.д. Эти способы позволяют врачу регулярно отбирать пациентов, нуждающихся в способах, описанных в данном документе, для лечения. В соответствии с этими способами нацеливание на патологические опухолевые антиген-экспрессирующие клетки может быть реализовано в виде независимой программы лечения или в качестве последующей, вспомогательной или координирующей схемы лечения по сравнению с другими видами лечения.

Определение эффективных дозировок в этом контексте обычно основывается на модельных исследованиях на животных, за которыми следуют клинические испытания на людях, и руководствуется определением эффективных дозировок и протоколов введения, которые значительно уменьшают возникновение или серьезность расстройства у модельных объектов. Эффективные дозы композиций по настоящему изобретению варьируют в зависимости от многих различных факторов, включая способы введения, целевой участок, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, вводятся другие лекарственные средства, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, а также конкретная активность самой композиции и ее способность вызывать искомый ответ у индивидуума. Обычно пациент является человеком, но при некоторых заболеваниях пациент может быть млекопитающим, не являющимся человеком. Как правило, режимы дозирования корректируются для обеспечения оптимального терапевтического ответа, то есть для оптимизации безопасности и эффективности. Соответственно, терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, в котором любые нежелательные побочные эффекты перевешиваются полезными эффектами введения анти-CD152 антитела, как описано в данном документе. Для введения анти-CD152 антитела дозировка может варьировать от около 0,1 мкг до 100 мг/кг или от 1 мкг/кг до около 50 мг/кг, а чаще от 10 мкг до 5 мг/кг массы тела объекта. В более конкретных воплощениях эффективное количество агента составляет от около 1 мкг/кг до около 20 мг/кг, от около 10 мкг/кг до около 10 мг/кг или от около 0,1 мг/кг до около 5 мг/кг. Дозировки в этом диапазоне могут быть достигнуты путем однократного или многократного введения, включая, например, многократное введение в день или ежедневное, еженедельное, двухнедельное или ежемесячное введение. Например, в определенных вариациях режим состоит из первоначального введения, за которым следуют множественные последующие введения с еженедельными или двухнедельными интервалами. Другой режим состоит из начального введения с последующим многократным, последующим введением с месячными или двухмесячными интервалами. В качестве альтернативы, введение может осуществляться нерегулярно, на основании мониторинга клинических симптомов расстройства.

Дозировка фармацевтической композиции может быть изменена лечащим врачом для поддержания искомой концентрации в целевом участке. Например, если выбран внутривенный способ доставки, локальная концентрация агента в кровотоке в ткани-мишени может составлять около от 0,01-50 наномолей композиции на литр, иногда от около 1,0 наномоля на литр до 10, 15 или 25 наномолей на литр в зависимости от состояния объекта и прогнозируемого измеренного ответа. Более высокие или более низкие концентрации могут быть выбраны на основе способа доставки, например, трансэпидермальной доставки по сравнению с доставкой на поверхность слизистой оболочки. Дозировка также должна регулироваться на основе скорости высвобождения введенной композиции, например, назального спрея в сравнении с порошком, пероральных или инъецированных частиц с замедленным высвобождением, трансдермальных композиций и т.д. Для достижения того же уровня концентрации в сыворотке, например, частицы с медленным высвобождением со скоростью высвобождения 5 нМ (в стандартных условиях) должны вводиться в дозе, примерно вдвое превышающей дозу частиц со скоростью высвобождения 10 нМ.

Анти-CD152 терапевтическое средство (например, анти-CD152 антитело) также можно вводить в суточной дозе от около 0,001 до около 10 миллиграммов (мг) на килограмм (mpk) массы тела, предпочтительно, в виде однократной суточной дозы или в разделенных дозах от около двух до шести раз в день. Для введения взрослому пациенту-человеку терапевтически эффективное количество можно вводить в дозах в диапазоне от 0,2 до 800 мг на дозу, включая, без ограничения указанным, 0,2 мг на дозу, 0,5 мг на дозу, 1 мг на дозу, 5 мг на дозу, 10 мг на дозу, 25 мг на дозу, 100 мг на дозу, 200 мг на дозу и 400 мг на дозу, и в ходе лечения можно вводить многократные, обычно последовательные ежедневные дозы. Анти-CD152 терапевтическое средство можно вводить в разное время суток. В одном воплощении оптимальная терапевтическая доза может быть введена вечером. В другом воплощении оптимальная терапевтическая доза может быть введена утром. Общая суточная доза анти-CD152 терапевтического средства, таким образом, в одном воплощении может составлять от около 1 мг до около 2 г, и часто варьирует от около 100 мг до около 1,5 г, и наиболее часто варьирует от около 200 мг до около 1200 мг. В случае типичного взрослого человека массой 70 кг общая суточная доза анти-CD152 терапевтического средства может составлять от около 2 мг до около 1200 мг и часто будет варьировать, как отмечено выше, от около 0,2 мг до около 800 мг.

Режимы дозирования также можно регулировать для обеспечения оптимального искомого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут вводиться с течением времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указано в зависимости от терапевтической ситуации. Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в дозированной форме для простоты введения и однородности дозировки. Используемая в данном документе дозированная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для объектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного ингредиента, рассчитанное для получения искомого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. В ином случае, антитело может быть введено в виде состава с замедленным высвобождением, в случае которого требуется менее частое введение.

Для введения антитела дозировка может составлять от около 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела в пределах диапазона 1-10 мг/кг. Примерный режим лечения включает введение раз в неделю, раз каждые две недели, раз каждые три недели, раз каждые четыре недели, раз в месяц, раз каждые три месяца или раз каждые три-шесть месяцев. Предпочтительные режимы дозирования для анти-CD152 антитела по изобретению включают 1мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела посредством внутривенного введения, с антителом, которое дается одним из следующих режимов дозирования: (i) каждые четыре недели для шести доз, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела однократно с последующим 1 мг/кг массы тела каждые три недели. В некоторых способах дозу корректируют до достижения концентрации антител в плазме около 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах около 25-300 мкг/мл.

«Терапевтически эффективная дозировка» анти-CD152 антитела по изобретению предпочтительно приводит к уменьшению выраженности симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов без симптомов заболевания или предотвращению нарушения или нетрудоспособности вследствие поражения заболеванием. Например, для лечения объектов, имеющих опухоль, «терапевтически эффективная доза» предпочтительно ингибирует рост опухоли, по меньшей мере, на около 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, на около 40%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на около 60%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, около на 80% по сравнению с необработанными объектами. Терапевтически эффективное количество терапевтического антитела может уменьшить размер опухоли или иным образом ослабить симптомы у объекта, который обычно является человеком или может быть другим млекопитающим.

Что касается лечения солидных опухолей, протоколы для оценки конечных точек и противоопухолевой активности хорошо известны в данной области. Хотя каждый протокол может определять оценки ответа опухоли по-разному, критерии RECIST (Критерии оценки ответа при солидных опухолях) в настоящее время считаются рекомендованными руководящими принципами для оценки ответа опухоли Национального института онкологии США (см. Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 205-216, 2000). В соответствии с критериями RECIST опухолевый ответ означает уменьшение или устранение всех измеримых повреждений или метастазов. Заболевание, как правило, считается измеримым, если оно включает поражения, которые можно точно измерить, по меньшей мере, в одном измерении, например,> 20 мм с помощью традиционных методов или> 10 мм с помощью спиральной компьютерной томографии с четко определенными полями с помощью медицинской фотографии или рентгеновской компьютерной осевой томографии (КТ), магнитно-резонансной визуализации (МРТ) или клинического обследования (если поражения поверхностные). Неизмеримое заболевание означает, что заболевание включает поражения <20 мм, измеренные с помощью традиционных методов или <10 мм с помощью спиральной компьютерной томографии, и действительно неизмеримые поражения (слишком маленькие, чтобы их можно было точно измерить). К неизмеримым заболеваниям относятся плевральные выпоты, асциты и заболевание, подтвержденное косвенными данными.

Критерии объективного статуса необходимы для протоколов, чтобы оценить реакцию солидной опухоли. Типичные критерии включают следующее: (1) полный ответ (CR), определяемый как полное исчезновение всех измеримых заболеваний; нет новых поражений; нет связанных с болезнью симптомов; нет доказательств неизмеримых заболеваний; (2) Частичный ответ (PR), определяемый как уменьшение суммы самого длинного диаметра целевых поражений на 30% (3) Прогрессирующее заболевание (PD), определяемое как увеличение суммы наибольшего диаметра целевых поражений на 20% или появление любого нового поражения; (4) Стабильное состояние или отсутствие ответа, определяемое как не отвечающее критериям CR, PR или прогрессирующего заболевания (См. Therasse et al., выше.).

Дополнительные конечные точки, которые принимаются в области онкологии, включают общую выживаемость (OS), выживаемость без заболеваний (DFS), частоту объективных ответов (ORR), время до прогрессирования (TTP) и выживаемость без прогрессирования (PFS) (см. Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD.)

Анти-CD152 антитела могут быть использованы для подавления опосредованных CTLA-4 сигнальных путей, которые отрицательно регулируют иммунные ответы, и, следовательно, для усиления опухолеспецифических иммунных ответов, либо в виде монотерапии, либо в сочетании с моноклональными антителами против PD-L1 или другими противоопухолевыми средствами.

Способы приготовления антител

Антитела, раскрытые в данном документе, могут представлять собой антитело, состоящее только из тяжелых цепей человека (HCAb), полученное от гуманизированных мышей Harbour (пат. США No. 9353179, 9346877 и 8921522 и европейские патенты No. 1776383 и 1864998). Молекулы, продуцируемые мышами HCAb, могут быть растворимыми и могут иметь аффинность, разнообразие и/или физико-химические свойства, сравнимые с традиционными человеческими антителами IgG.

Получение HCAb в HCAb-мышах может способствовать образованию растворимых доменов VH человека, минимальной иммуноглобулиновой единицы распознавания и, таким образом, конструированию новых многофункциональных молекул, содержащих либо несколько доменов VH, либо домен(домены) VH, связанные с другими молекулами, например, биспецифическими, конъюгаты антитело-лекарственное средство или диагностические или терапевтические молекулы, полученные из домена VH.

Анти-CD152 антитела также могут быть получены с использованием антитела, имеющего одну или несколько последовательностей VH анти-CD152 антитела, раскрытого в данном документе, в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или нескольких остатков в вариабельных областях (то есть VH и/или VL), например, в пределах одной или нескольких областей CDR и/или в одной или нескольких каркасных областях. Дополнительно или альтернативно, антитело может быть сконструировано путем модификации остатков в константной области (областях), например, для изменения эффекторной функции (функций) антитела.

Полинуклеотидные молекулы, содержащие искомую полинуклеотидную последовательность, могут размножаться путем помещения молекулы в вектор. Могут использоваться вирусные и невирусные векторы, включая плазмиды. Выбор плазмиды будет зависеть от типа клетки, в которой желательно размножение, и цели размножения. Определенные векторы полезны для амплификации и получения больших количеств искомой последовательности ДНК. Другие векторы пригодны для экспрессии в клетках в культуре. Еще другие векторы пригодны для переноса и экспрессии в клетках у целого животного или индивидуума. Выбор подходящего вектора находится в пределах квалификации в данной области. Многие такие векторы доступны на рынке. Частичный или полноразмерный полинуклеотид встраивается в вектор обычно посредством присоединения ДНК-лигазы к расщепленному сайту рестриктазы в векторе. В ином случае, искомая нуклеотидная последовательность может быть вставлена путем гомологичной рекомбинации in vivo. Обычно это достигается путем присоединения областей гомологии к вектору на боковых сторонах искомой нуклеотидной последовательности. Области гомологии добавляют путем лигирования олигонуклеотидов или с помощью полимеразной цепной реакции с использованием, например, праймеров, включающих как область гомологии, так и часть искомой нуклеотидной последовательности.

Для экспрессии можно использовать кассету или систему экспрессии. Для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, раскрытый в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, функционально связанную с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипционную экспрессию в экспрессирующем векторе, вводят в клетку-хозяина. В дополнение к транскрипционным регуляторным последовательностям, таким как промоторы и энхансеры, экспрессирующие векторы могут включать последовательности регуляции трансляции и маркерный ген, который подходит для отбора клеток, несущих экспрессирующий вектор. Генный продукт, кодируемый полинуклеотидом по изобретению, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, системы на основе бактерий, дрожжей, насекомых, амфибий и млекопитающих. В экспрессирующем векторе полипептид-кодирующий полинуклеотид связан с регуляторной последовательностью, если это необходимо, для получения искомых свойств экспрессии. Они могут включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Промоторы могут регулируемыми (например, промотор из вектора pIND, индуцируемый стероидами (Invitrogen)) или конститутивными (например, промоторы из последовательностей CMV, SV40, фактора элонгации или LTR). Они связаны с искомой нуклеотидной последовательностью, с помощью способов, описанных выше для связывания с векторами. Могут быть использованы любые методы, известные в данной области техники. Соответственно, экспрессирующий вектор обычно обеспечивает область инициации транскрипции и трансляции, которая может быть индуцибельной или конститутивной, где кодирующая область функционально связана под транскрипционным контролем области инициации транскрипции и области терминации транскрипции и трансляции.

Экспрессирующая кассета может быть введена в различные векторы, например, плазмиду, ВАС, YAC, бактериофаг, такой как лямбда, Р1, М13 и т.д., вирусные векторы растений или животных (например, векторы на основе ретровирусов, аденовирусные векторы) и т.п., где векторы обычно характеризуются способностью обеспечивать отбор клеток, содержащих экспрессирующие векторы. Векторы могут обеспечивать внехромосомное поддержание, особенно в виде плазмид или вирусов, или интеграцию в хромосому хозяина. Если требуется внехромосомное поддержание, для репликации плазмиды предоставляется последовательность точки начала репликации, которая может обеспечивать низкое или высокое число копий. Для выбора доступно большое разнообразие маркеров, особенно тех, которые защищают от токсинов, более конкретно от антибиотиков. Конкретный маркер, который выбран, выбирается в соответствии с природой хозяина, где в некоторых случаях может использоваться комплементация ауксотрофных хозяев. Для введения конструкции ДНК можно использовать любой удобный способ, включая, например, конъюгацию, бактериальную трансформацию, осажденную кальцием ДНК, электропорацию, слияние, трансфекцию, заражение вирусными векторами, биолистику и тому подобное. Раскрытие относится к экспрессирующему вектору, включающему сегмент нуклеиновой кислоты, где указанный сегмент нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 139, 145, 151, 163, 169, 175, 181 или 187.

Соответственно, белки для применения в настоящем раскрытии могут быть получены в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с традиционными методами. Подходящими клетками-хозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре и включают бактерии, грибные клетки и культивируемые клетки высших эукариот (включая культивируемые клетки многоклеточных организмов), в частности культивируемые клетки млекопитающих. Методы обработки клонированных молекул ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяева раскрыты в Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), и Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons, 1999).

Для направления рекомбинантного белка в секреторный путь клетки-хозяина, в экспрессирующем векторе предоставляется секреторная сигнальная последовательность (также известная как лидерная последовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть последовательностью нативной формы рекомбинантного белка или может быть получена из другого секретируемого белка или синтезирована de novo. Секреторная сигнальная последовательность функционально связана с кодирующей полипептид ДНК-последовательностью, то есть две последовательности соединены в правильной рамке считывания и расположены так, чтобы направлять вновь синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' относительно последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, Welch et al., Пат. США № 5037743; Holland et al., Пат. США № 5143830).

Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами для продуцирования рекомбинантных белков для применения в настоящем описании. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают трансфекцию, опосредованную фосфатом кальция (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro и Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном (Ausubel et al., выше), и трансфекцию, опосредованную липосомами (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, Levinson et al., пат. США No. 4713339; Hagen et al., пат. США № 4784950; Palmiter et al., пат. США № 4579821; и Ringold, пат. США № 4656134. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero; ATCC CRL 1587), клетки почки эмбриона человека (293-HEK; ATCC CRL 1573), клетки почки детеныша хомяка (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544)., ATCC CRL 10314), клетки почки собаки (MDCK; ATCC CCL 34), клетки яичника китайского хомяка (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11 (Hyclone, Logan, UT); см. также, например, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986)), клетки гипофиза крысы (GH1; ATCC CCL82), клетки HeLa S3 (ATCC CCL2.2), клетки гепатомы крысы (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-трансформированные клетки почки обезьяны (COS-1; ATCC CRL 1650) и мышиные эмбриональные клетки (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны в общественных депозиториях, таких как Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния. Могут быть использованы сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловирус. См., например, пат. США № 4956288. Другие подходящие промоторы включают промоторы из генов металлотионеина (пат. США No. 4579821 и 4601978) и основной поздний промотор аденовируса.

Отбор лекарственными средствами обычно используется для отбора культивируемых клеток млекопитающих, в которые была вставлена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют «трансфектантами». Клетки, которые были культивированы в присутствии селективного агента и способны передавать представляющий интерес ген своему потомству, называются «стабильными трансфектантами». Типичные селектируемые маркеры включают ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину, который позволяет проводить селекцию в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как G-418 или тому подобного; ген gpt для ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы, который обеспечивает рост клеток-хозяев в присутствии микофенольной кислоты/ксантина; и маркеры, которые обеспечивают устойчивость к зеоцину, блеомицину, бластоцидину и гигромицину (см., например, Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207: 342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18: 4009, 1990). Системы отбора могут также использоваться для повышения уровня экспрессии представляющего интерес гена, в процессе, называемом «амплификацией». Амплификацию проводят путем культивирования трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и последующего увеличения количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов. Типичным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая придает устойчивость к метотрексату. Также могут быть использованы другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивость к гигромицину, устойчивость к нескольким лекарственным средствам, пуромицин-ацетилтрансфераза).

Другие высшие эукариотические клетки также могут быть использованы в качестве хозяев, включая клетки насекомых, клетки растений и клетки птиц. Использование Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений было рассмотрено Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Трансформация клеток насекомых и продуцирование в них чужеродных полипептидов раскрыта в Guarino et al., US 5162222 и WO 94/06463.

Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно полученным из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). См. King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O’Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994); и Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995). Рекомбинантный бакуловирус также может быть получен путем использования системы на основе транспозона, описанной Luckow et al. (J. Virol. 67: 4566-4579, 1993). Эта система, которая использует трансферные векторы, коммерчески доступна в форме набора (набор BAC-TO-BAC; Life Technologies, Гейтерсберг, Мэриленд). Трансферный вектор (например, PFASTBAC1; Life Technologies) содержит транспозон Tn7 для перемещения ДНК, кодирующей представляющий интерес белок, в геном бакуловируса, который содержится в E.coli, в виде большой плазмиды, называемой «бакмидой». См. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; и Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-1549, 1995. Кроме того, трансферные векторы могут включать слияние в рамке с ДНК, кодирующей удлинение полипептида или аффинную метку, как описано выше. С использованием методов, известных в данной области, трансферный вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую белок, трансформируют в клетки-хозяева E.coli, и клетки подвергают скринингу на наличие бактерий, которые содержат прерванный ген lacZ, указывающий на рекомбинантный бакуловирус. Бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный бакуловирусный геном, выделяют, используя обычные методы, и используют для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda, таких как клетки Sf9. Затем получают рекомбинантный вирус, который экспрессирует представляющий интерес белок. Рекомбинантные вирусные стоки получают способами, обычно используемыми в данной области.

Для продуцирования белка рекомбинантный вирус используется для инфицирования клеток-хозяев, как правило, клеточной линии, происходящей от совки кукурузной листовой, Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf9 или Sf21) или Trichoplusia ni (например, клетки HIGH FIVE; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). См. в общем плане Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994). См. также пат. США № 5300435. Бессывороточные среды используются для роста и поддержания клеток. Подходящие составы сред известны в данной области и могут быть получены от коммерческих поставщиков. Клетки выращивают до плотности инокуляции приблизительно от 2-5 × 10⁵ клеток до 1-2 × 10⁶ клеток, и в этот момент добавляют рекомбинантный вирусный сток при множественности инфекции (MOI) от 0,1 до 10, более типично около 3. Используемые процедуры обычно описаны в доступных лабораторных руководствах (см., например, King and Possee, выше; O’Reilly et al., Выше; Richardson, выше).

Грибные клетки, включая дрожжевые клетки, также могут быть использованы в настоящем описании. В этом отношении виды дрожжей включают, например, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S. cerevisiae экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, в Kawasaki, пат. США № 4599311; Kawasaki et al., пат. США № 4931373; Brake, пат. США № 4870008; Welch et al., пат. США № 5,037,743; и Murray et al., пат. США № 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно лекарственной устойчивостью или способностью расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Примерной векторной системой для применения в Saccharomyces cerevisiae является векторная система POT1, раскрытая Kawasaki et al. (пат. США № 4931373), которая позволяет выбирать трансформированные клетки путем роста в среде, содержащей глюкозу. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают промоторы из генов гликолитического фермента (см., например, Kawasaki, пат. США № 4599311; Kingsman et al., пат. США № 4615974; и Bitter, пат. США № 4979092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также пат. США No. 4990446; 5063154; 5139936; и 4661454. В данной области известны системы трансформации для других дрожжей, включая Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii и Candida maltosa. См., например, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, пат. США № 4882279; и Raymond et al., Yeast 14: 11-23, 1998. Клетки Aspergillus могут быть использованы в соответствии со способами McKnight et al., пат. США № 4935349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum раскрыты в Sumino et al., пат. США № 5162228. Способы трансформации Neurospora раскрыты Lambowitz, пат. США № 4486533. Продуцирование рекомбинантных белков в Pichia methanolica описано в пат. США No. 5716808; 5736383; 5854039; и 5888768.

Прокариотические клетки-хозяева, включая штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и других родов, также являются полезными клетками-хозяевами в рамках настоящего изобретения. Способы трансформации этих хозяев и экспрессии клонированных в них чужеродных последовательностей ДНК хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook and Russell, выше). При экспрессии рекомбинантного белка в бактериях, таких как E.coli, белок может удерживаться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может направляться в периплазматическое пространство с помощью последовательности бактериальной секреции. В первом случае клетки лизируют, а гранулы извлекают и денатурируют, используя, например, изотиоцианат гуанидина или мочевину. Затем денатурированный белок может быть повторно свернут и димеризован путем разбавления денатуранта, например, диализом против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против буферного солевого раствора. В ином случае, белок может быть извлечен из цитоплазмы в растворимой форме и выделен без использования денатурирующих агентов. Белок извлекается из клетки в виде водного экстракта, например, в фосфатно-солевом буферном растворе. Для захвата представляющего интерес белка экстракт наносят непосредственно на хроматографическую среду, такую как иммобилизованное антитело или гепарин-сефарозная колонка. Секретируемые белки могут быть извлечены из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (например, путем обработки ультразвуком или осмотическим шоком), чтобы высвободить содержимое периплазматического пространства и восстановления белка, тем самым устраняя необходимость в денатурации и рефолдинге. Антитела, включая одноцепочечные антитела, можно продуцировать в бактериальных клетках-хозяевах в соответствии с известными способами. См., например, Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. США 85: 5879-5883, 1988; и Pantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991.

Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с традиционными процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, включая определенные среды и сложные среды, известны в данной области и обычно включают источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. Среды по необходимости могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка. Среда для роста, как правило, отбирает клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, например, путем отбора на лекарственном средстве или с помощью дефицита в существенном питательном веществе, которое дополняется селектируемым маркером, который переносится на экспрессирующем векторе или совместно трансфицируется в клетку-хозяина.

Анти-CD152 антитела могут быть очищены обычными способами очистки белка, обычно с помощью комбинации хроматографических методов. См. в общем плане Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994). Белки, содержащие Fc-область иммуноглобулина, могут быть очищены аффинной хроматографией на иммобилизованном протеине А или протеине G. Дополнительные стадии очистки, такие как гель-фильтрация, могут быть использованы для получения искомого уровня чистоты или для обессоливания, замены буфера и т.п.

Следующие примеры изобретения служат для дополнительной иллюстрации сущности изобретения. Следует понимать, что следующие примеры не ограничивают изобретение и что объем изобретения должен определяться прилагаемой формулой изобретения.

Примеры

Пример 1 Получение анти-CTLA-4 антител

Человеческий белок CTLA-4-ECD (Acro Bio) использовали в качестве иммуногена для получения анти-CTLA-4 антител. Использование технологии трансгенных по человеческому иммуноглобулину мышей для разработки и получения человеческих антител было впервые описано Abgenix (ксеномышь и Medarex (HuMab «мышь»); Lonberg et al., 1994, Nature, 368: 856-859; Lonberg and Huszar, 1995, Internal Rev. Immunol., 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci., 764: 536-546).

Мышей HCAb иммунизировали белком CTLA-4-ECD человека в дозе 20 мг/мышь каждые две недели три раза, и шесть из них иммунизировали еще пять раз по 44 мг/мышь. За исключением первой инъекции, где в качестве адъюванта использовался Stimune (Prionics), все бустерные введения проводили с адъювантом Ribi (адъювант Sigma S6322-1VL). После иммунизации суспензии отдельных клеток выделяли из костного мозга, селезенки и лимфатических узлов мыши. Затем плазматические клетки мыши выделяли с использованием набора для выделения плазматических клеток (Miltenyi, Cat.No.130-092-530). Вкратце, была получена суммарная РНК из плазматических клеток мыши и обратно транскрибирована в кДНК в большом пуле. VH-области человека амплифицировали из кДНК с использованием праймеров следующим образом.

Прямой праймер:

lib-3-23/53-S: 5’-GTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG (SEQ ID NO: 193) и

lib-3-11-S: 5’-GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG (SEQ ID NO: 194)

Обратный праймер:

mG1hrv: 5’-ggcttacaaccacaatccctgggc (SEQ ID NO: 195)

Все амплифицированные фрагменты ПЦР, содержащие домен VH, клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих pTT5. Полученные плазмиды трансформировали в бактерии (DH5α) путем электропорации. Плазмиды дублировали и очищали, а затем трансфицировали в клетки НЕК 293 для получения антител.

Клетки 293 инкубировали в среде 293 FreeStyle (12338018, Thermo) в течение 10 дней, и надосадочные жидкости подвергали скринингу с помощью анализа ELISA. Рекомбинантные человеческие белки CTLA4-his (Acro Bio) разводили в PBS с концентрацией 2 мкг/мл, и 100 мкл разведенных белков CTLA-4-his добавляли на лунку к микропланшетам ELISA, которые инкубировали в течение ночи при 4°С для покрытия планшетов рекомбинантными белками. Затем планшеты блокировали блокирующим раствором для ELISA (включающим 2% BSA, 0,05% (об./об.) Tween-20, буфер PBS pH 7,4, масс./об.) при 37°C в течение двух часов и затем инкубировали с надосадочными жидкостями в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали и инкубировали с козьим антителом против человеческого IgG (H + L), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (A18805, Life technologies), при 37°C в течение одного часа. Добавляли 100 мкл тетраметилбензидина (TMB) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Для прекращения реакции добавляли 50 мкл 1 Н HCl. Тридцать пять положительных клонов со значительным окрашиванием отбирали для дальнейших испытаний.

35 клонов секвенировали, и 9 клонов из 35 отобрали с уникальными последовательностями CDR3. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот этих 9 анти-CTLA-4 антител суммированы в таблице 1. Антитела HCAb содержали только две тяжелые цепи.

Таблица 1. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности антител против CTLA-4 человека

ID клона	SEQ ID No
нк- тяжелая цепь	ак-тяжелая цепь	ак-вариабельная область тяжелой цепи	ак-CDR1 тяжелой цепи	ак-CDR2 тяжелой цепи	ак-CDR3 тяжелой цепи
CL3	1	2	3	4	5	6
CL5	7	8	9	10	11	12
CL11	13	14	15	16	17	18
CL20	19	20	21	22	23	24
CL22	25	26	27	28	29	30
CL24	31	32	33	34	35	36
CL25	37	38	39	40	41	42
CL30	43	44	45	46	47	48
CL34	49	50	51	52	53	54

нк: нуклеиновая кислота; ак: аминокислота

Пример 2. Получение и очистка анти-CTLA-4 антител

Стадия 1. Получение клеток HEK 293F со сверхэкспрессией hCTLA-4

Нуклеотидная последовательность, кодирующая CTLA-4 человека (SEQ ID NO: 196, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197), была субклонирована в вектор pcDNA3.1 (Clontech) для получения плазмиды. Клетки HEK293 и CHO-K1 (Invitrogen) транзиторно трансфицировали плазмидами с использованием PEI, и трансформанты культивировали в культуральной среде DMEM, содержащей 0,5 г/мл пенициллина/стрептомицина и 10% (масс./масс.) фетальной бычьей сыворотки (FBS) в течение 2 недель. Осуществляли лимитирующее разведение в 96-луночном культуральном планшете, и планшет инкубировали при 37°С с 5% (об./об.) СО₂ в течение приблизительно 2 недель. Моноклоны наращивали в 6-луночных планшетах, и нарощенные клоны подвергали скринингу с помощью проточной цитометрии с использованием коммерчески доступных анти-hCTLA-4 антител (R & D Systems). Клоны, демонстрирующие более высокие скорости роста и более высокую интенсивность флуоресценции, как измерено с помощью FACS, дополнительно наращивали и подвергали криоконсервации в жидком азоте.

Стадия 2. Определение активности связывания анти-CTLA-4 антител в клеточной среде HEK 293F с помощью ELISA и анализа связывания FACS на клеточной основе

Рекомбинантные человеческие белки CTLA4-his (Acro Bio) разводили в PBS с концентрацией 2 мкг/мл, и 100 мкл разведенных белков CTLA-4-his добавляли на лунку к микропланшетам для ELISA, которые инкубировали в течение ночи при 4°С для покрытия планшетов рекомбинантными белками. Затем планшеты блокировали блокирующим раствором для ELISA (содержащим 2% BSA, 0,05% (об./об.) Tween-20, буфер PBS pH 7,4, об./об.) при 37°C в течение двух часов и затем инкубировали с клеточной средой 293F, содержащей анти-CTLA-4 антитела (см. Пример 1) в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали и инкубировали с козьим антителом против человеческого IgG (H + L), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (A18805, Life technologies), при 37°C в течение одного часа. Добавляли 100 мкл тетраметилбензидина (TMB) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. 50 мкл 1 Н HCl добавляли для прекращения реакции, и OD 450 нм определяли с помощью ридера для ELISA-планшетов.

При этом клетки 293-hCTLA-4, полученные на стадии 1, культивировали и использовали для измерения активности связывания антител. Клетки обрабатывали бесферментным раствором для диссоциации клеток (раствор Versene, Invitrogen) и затем собирали. BSA добавляли к суспензии клеток до конечной концентрации 1%, и клетки блокировали в течение 30 минут на льду и затем дважды промывали HBSS. Клетки собирали после центрифугирования и ресуспендировали в буфере FACS (HBSS + 1% BSA, об./об.) при 2 × 10⁶ клеток/мл. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл клеточной суспензии. 100 мкл клеточной среды 293F, содержащей анти- CTLA-4 антитела (см. Пример 1), добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубировали в течение 1 часа на льду. Клетки дважды промывали буфером FACS, и добавляли 100 мкл Alexa 488-меченного антитела против белка человека (H + L) (Invitrogen) в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 1 часа на льду. Образцы трижды промывали буфером FACS, и в каждую лунку добавляли 100 мкл буфера для фиксации (4% параформальдегидного об./об.) и инкубировали в течение 10 минут. Затем клетки дважды промывали буфером FACS и ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяли с использованием FACS Calibur (BD).

Стадия 3. Продуцирование и очистка ведущих антител-кандидатов

Концентрация антител из клеток HEK293 составляла около 1-10 мкг/мл и широко варьировала. Кроме того, FBS и компоненты культуральной среды могут мешать анализу. Следовательно, необходимо было осуществить препаративное получение (1-5 мг) и очистку антитела.

Конструкции, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие анти- CTLA-4 антитела (как указано в таблице 1), вводили в клетки 293. Надосадочную жидкость, содержащую антитела-мишени, собирали через 6-7 дней после трансфекции центрифугированием и фильтрацией. Моноклональные антитела очищали, пропуская их через 2 мл колонки с Протеином G (GE Healthcare). Колонки с Протеином G сначала уравновешивали буфером PBS (рН 7,2), а затем надосадочные жидкости гибридомной культуры наносили на уравновешенные колонки с Протеином G с постоянной скоростью потока 3 мл/мин. Затем каждую колонку промывали PBS-буфером, объем которого в 3 раза превышал объем колонки. Анти- CTLA-4 антитела затем элюировали элюирующим буфером (0,1 М ацетатный буфер, pH 2,5), и УФ-поглощение элюатов контролировали с использованием УФ-детектора (пик поглощения УФ-излучения A280). 10% 1 М трис-HCL-буфера добавляли к элюатам для нейтрализации рН, и образцы подвергали стерильной фильтрации, пропуская их через фильтры 0,22 мкм. Были получены очищенные в стерильных условиях анти- CTLA-4 антитела.

Концентрации очищенных анти-CTLA-4 антител определяли по УФ-поглощению (A280/1.4) и измеряли чистоту и уровень эндотоксина (набор Lonza). Очищенные анти-CTLA-4 антитела имели концентрацию эндотоксина менее чем 1 EU/мг.

Пример 3. Характеризация ведущих антител-кандидатов

Клетки 293 стабильно трансфицировали плазмидами pTT5, содержащими последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CTLA-4 человека (SEQ ID NO: 196), для получения клеток 293F, стабильно экспрессирующих человеческие CTLA-4 (в настоящем документе называемые клетками 293-hCTLA-4). Дополнительные клетки 293 были стабильно трансфицированы плазмидами pIRES, включающими последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полноразмерный CTLA-4 яванского макака (SEQ ID NO: 198), для генерации клеток 293, стабильно экспрессирующих CTLA-4 яванского макака (в настоящем документе называемых клетками 293-cynoCTLA-4). Клетки 293-hCTLA-4 и 293-cynoCTLA-4 культивировали и наращивали в колбах для культивирования T-75 до конфлуентности 90%. Культуральную среду аспирировали и клетки дважды промывали HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, Invitrogen). Клетки обрабатывали бесферментным раствором для диссоциации клеток (раствор Versene, Invitrogen) и собирали. Затем клетки дважды промывали HBSS, определяли количество клеток и ресуспендировали клетки с использованием HBSS при 2 × 10⁶ клеток/мл. BSA добавляли к суспензии клеток до конечной концентрации 1%, и клетки блокировали в течение 30 минут на льду и затем дважды промывали HBSS. Клетки собирали после центрифугирования и ресуспендировали в буфере FACS (HBSS + 1% BSA, об./об.) при 2 × 10⁶ клеток/мл. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл клеточной суспензии. 100 мкл очищенных анти-CTLA-4 антител из Примера 2 или контрольных антител добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубировали в течение 1 часа на льду, где тяжелая цепь и легкая цепь аналога ипилимумаба имели аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 200, соответственно. Клетки дважды промывали буфером FACS, и добавляли 100 мкл Alexa 488-меченного антитела против белка человека (H + L) (Invitrogen) в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 1 часа на льду. Образцы трижды промывали буфером FACS и в каждую лунку добавляли 100 мкл буфера для фиксации (содержащего 4% параформальдегида, об./об.) и инкубировали в течение 10 минут. Затем клетки дважды промывали буфером FACS и ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS.

Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяли с использованием FACS Calibur (BD), и результаты представлены на фиг. 1 и фиг. 2. Антитела из Примера 2 обладали активностью связывания с CTLA человека или яванского макака на клетках 293F, сравнимой с аналогом ипилимумабом.

Пример 4. Определение способности антител против CTLA-4 блокировать связывание CTLA-4 с B7.1.

Анализ связывания рецептор-лиганд на основе клеток проводили для определения способности антител против CTLA-4 блокировать связывание CTLA-4 с его лигандами B7.1. Рекомбинантный белок B7.1ECD-Fc (B71-H5259, Acro Bio) биотинилировали с использованием EZ-LINK NHS-PEG12-Biotin (Thermo Scientific # 21312) в соответствии с инструкцией производителя. Биотинилированный белок B7.1ECD-Fc концентрировали и удаляли свободную метку с использованием центрифужного фильтра Amicon (отсечка 10 кДа). Внеклеточный домен B7.1 соответствовал аминокислотам Val35-Asn242 белка базы данных Uniprot P33681.

Клетки 293-hCTLA-4, полученные в Примере 3, культивировали и наращивали в колбах для культивирования Т-75 до конфлуентности 60-80%. Культуральную среду аспирировали и клетки дважды промывали PBS. Клетки обрабатывали бесферментным раствором для диссоциации клеток (раствор Versene, Invitrogen) и собирали. Раствор диссоциации нейтрализовали добавлением 8 мл культуральной среды и определяли количество клеток. Клетки центрифугировали при 300 g в течение 5 минут и ресуспендировали в блокирующем буфере (содержащем 2% BSA, буфер PBS pH 7,4, масс./об.) при 1 × 10⁶ клеток/мл. Клетки блокировали в течение 15 минут при 37°С. Тем временем лунки 96-луночных круглодонных планшетов блокировали 200 мкл блокирующего буфера в течение 1 часа при 37°С. Блокирующий буфер отбрасывали, и 200 мкл клеток распределяли в каждую лунку 96-луночного планшета (2 × 10⁵ клеток/лунку). Планшеты центрифугировали при 500 g в течение 5 минут и надосадочные жидкости отбрасывали. Клетки ресуспендировали в 100 мкл анти-CTLA-4 антител, приготовленных в блокирующем буфере с различными концентрациями. 100 мкл биотинилированного ECD-Fc B7.1 (60 мкг/мл в блокирующем буфере) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и осторожно перемешивали при встряхивании. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 90 минут и дважды промывали 200 мкл блокирующего буфера. Блокирующий буфер отбрасывали и клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора стрептавидина-Alexa 488 (Invitrogen, 1: 500 в блокирующем буфере) и инкубировали при 4°С в течение 1 часа. Планшеты трижды промывали блокирующим буфером и добавляли 200 мкл блокирующего буфера.

Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяли с использованием FACS Calibur (BD). Результаты, как показано на фиг. 3, продемонстрировали, что анти- CTLA-4 антитела могут блокировать связывание экспрессируемого клеткой CTLA-4 с его лигандом B7.1 на уровне, сопоставимом с аналогом ипилимумабом.

Пример 5. Антитела против CLTA-4 HCAb, способствующие высвобождению IL-20

стадия 1. Тест стимуляции РВМС

100 мкл PBMC (содержащих 1 × 10⁵ клеток) добавляли в лунки 96-луночного планшета, и затем добавляли 50 мкл каждого тестируемого антитела, имеющего различные концентрации, в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. 50 мкл 100 нг/мл SEB добавляли в каждую лунку и культивировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 72 часов. Надосадочные жидкости собирали и хранили при -20°С до анализа.

Стадия 2. Детекция секреции интерлейкина IL-2 методом ELISA

Количественное определение уровня IL-2 в культуральной надосадочной жидкости проводили с использованием набора ELISA для определения IL-2 человека Quantikine (DY202, R & D Systems), следуя инструкциям, предоставленным производителем. Вкратце, поликлональные антитела против IL-2 наносили на микропланшеты для ELISA, и 100 мкл культуральной надосадочной жидкости, а также стандарта добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Планшеты 4 раза промывали промывочным буфером с последующим добавлением конъюгированных с HRP антител против IL-2 человека и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывки добавляли хромогенный субстрат (5120-0077, SeraCare) и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, и реакцию останавливали добавлением стоп-раствора (E661006-0200, BBI Life Sciences).

Поглощение при 450 нм определяли с использованием ридера для ELISA-планшетов, и результаты, как показано на фиг. 4A и 4B, продемонстрировали, что некоторые из анти-CTLA-4 антител могут увеличивать секрецию IL-2 при низких концентрациях по сравнению с человеческим IgG (AB170090 (Crown Bio) или аналогом ипилимумабом.

Пример 6. Анти-CTLA-4 антитела HCAb, связанные с CTLA-4 человека, но не с CTLA-4 мыши в анализе ELISA

Рекомбинантный человеческий или мышиный белок CTLA4-his (CT4-H5229 для белка человека, CT4-M52H5 для белка мыши, Acro Bio) разводили в PBS до концентрации 2 мкг/мл и 100 мкл разведенного белка CTLA-4-his на лунку добавляли к микропланшетам для ELISA, которые инкубировали в течение ночи при 4°С для покрытия планшетов рекомбинантными белками. Затем планшеты блокировали раствором для ELISA (включающим 2% BSA, 0,05% (об./об.) Tween-20, буфер PBS pH 7,4, об./об.) при 37°C в течение двух часов и затем инкубировали с анти-CTLA-4 антителами при различных концентрациях в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали и инкубировали с козьим антителом против человеческого IgG (H + L), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (A18805, Life technologies), при 37°C в течение одного часа. Добавляли 100 мкл тетраметилбензидина (TMB) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. 50 мкл 1 Н HCl добавляли для прекращения реакции, и OD 450 нм определяли с помощью ридера для ELISA-планшетов.

Данные показаны на фиг. 5A и фиг. 5B, предполагая, что все клоны связываются с CTLA-4 человека, но почти не связываются с CTLA-4 мыши.

Пример 7. Мутанты анти-CTLA-4 антител, способствующие высвобождению IL-20

Был проведен анализ стимуляции Т-клеток для некоторых антител, упомянутых выше, и их мутантов для изучения влияния этих антител на стимуляцию Т-клеток путем блокирования связывания CTLA-4 с его лигандами B7.1 и B7.2.

Мутанты антител получали путем применения мутаций S239D и I332E в константном домене Fc клона 5 HCAb, клона 11, клона 22, клона 25 и клона 30 с помощью ПЦР. Мутированные антитела экспрессировали в клетках НЕК293 и очищали, как описано в Примере 2. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности мутантов антител, определенных с использованием стандартных методов молекулярной биологии, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности мутантов анти-CTLA-4 антител

ID клона	SEQ ID No
нк- тяжелая цепь	ак-тяжелая цепь	ак-вариабельная область тяжелой цепи	ак-CDR1 тяжелой цепи	ак-CDR2 тяжелой цепи	ак-CDR3 тяжелой цепи
CL5-eA	139	140	141	142	143	144
CL11-eA	115	116	117	118	119	120
CL22-eA	121	122	123	124	125	126
CL25-eA	127	128	129	130	131	132
CL30-eA	133	134	135	136	137	138

нк: нуклеиновая кислота; ак: аминокислота

Тест стимуляции PBMC и обнаружение секреции интерлейкина IL-2 с помощью ELISA выполняли, как в Примере 5.

Результаты на фиг. 6A и 6B продемонстрировали, что мутанты антител против CTLA-4 усиливали секрецию IL-2 по сравнению с изотипическим контрольным IgG1 человека и их родительскими клонами.

Пример 8. Варианты анти-CTLA-4 антител с удаленным PTM

Аминокислотные последовательности 7 клонов HCAb (CL22, CL25, CL5, CL3, CL11, CL30, CL24) выравнивали с геном IGHV3-53*01, и они представлены в таблице 3. Различия в гене зародышевой линии и участках PTM были выделены. Последовательности были пронумерованы согласно схеме нумерации Chothia.

Ген зародышевой линии IGHV3-53 изначально не имеет мотива N-гликозилирования, и эти мотивы N-гликозилирования, присутствующие в 7 клонах HCAb, были образованы соматическими мутациями. Следовательно, один из подходов к удалению этого мотива состоял в том, чтобы заменить его соответствующими аналогичными остатками в зародышевой линии, например, заменить мотив NVS в CDR1 CL11 на TVS зародышевой линии. Альтернативный подход был также изучен путем объединения удаления PTM с «зародышевой линией» на основе концепции CDR-трансплантации, используемой для гуманизации. Во втором подходе CDR каждого HCAb были трансплантированы к каркасам IGHV3-53 зародышевой линии, и ключевые остатки каркаса из родительского HCAb также были сохранены. Для некоторых антител были восстановлены аминокислотные мутации, расположенные в специальных остатках, которые могут влиять на активность связывания между CTLA-4 и антителами. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот вариантов человеческих анти-CTLA-4 антител HCAb с удалением PTM перечислены в таблице 4.

Таблица 3. Различия аминокислотной последовательности HCAb по сравнению с последовательностью зародышевой линии

	Зародышевая линия	Критические PTM
Клон #	IGHV	% Идент.	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
CL22	IGHV3-53*02	89,7%					NXS/T
CL25	IGHV3-53*02	96,9%					NXS/T
CL5	IGHV3-53*02	86,6%		NXS/T
CL3	IGHV3-53*02	88,7%		NXS/T			NXS/T
CL11	IGHV3-53*02	86,6%		NXS/T
CL30	IGHV3-53*02	87,6%		NXS/T
CL24	IGHV3-53*02	84,5%		NXS/T			NXS/T
CL20	IGHV3-74*03	98%				NxS/T,NS,DG
CL34	IGHV3-74*03	88,8%				NxS/T,NS,DG		DG

Таблица 4. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности вариантов антител против CTLA-4 с удалением PTM

ID клона	SEQ ID No
нк- тяжелая цепь	ак-тяжелая цепь	ак-вариабельная область тяжелой цепи	ак- CDR1 тяжелой цепи	ак-CDR2 тяжелой цепи	ак-CDR3 тяжелой цепи
CL5-dPTM	103	104	105	106	107	108
CL5-dPTM'	109	110	111	112	113	114
CL5-eA-dPTM	145	146	147	148	149	150
CL5-eA-dPTM'	151	152	153	154	155	156
CL5’-dPTM'	169	170	171	172	173	174
CL5’-eA-dPTM'	181	182	183	184	185	186
CL11-dPTM	55	56	57	58	59	60
CL11-dPTM'	61	62	63	64	65	66
CL11’-dPTM'	163	164	165	166	167	168
CL11’-eA-dPTM'	175	176	177	178	179	180
CL20’-eA	187	188	189	190	191	192
CL22-dPTM	67	68	69	70	71	72
CL22-dPTM'	73	74	75	76	77	78
CL25-dPTM	79	80	81	82	83	84
CL25-dPTM'	85	86	87	88	89	90
CL30-dPTM	91	92	93	94	95	96
CL30-dPTM'	97	98	99	100	101	102

нк: нуклеиновая кислота; ак: аминокислота

Пример 9. Связывающая активность на основе клеток вариантов анти-CTLA-4 антител с удалением PTM

Анализ связывания на основе клеток проводили для определения способности связывания вариантов антител против CTLA-4 с удалением PTM в отношении человеческого CTLA-4. Процедура анализа была аналогична описанной в Примере 3. Вкратце, клетки 293F-hCTLA-4 собирали с использованием бесферментного раствора для диссоциации клеток (раствор Versene, Invitrogen), а затем нейтрализовали культуральной средой и определяли количество клеток. Клетки центрифугировали и блокировали в блокирующем буфере (содержащем 2% BSA, буфер PBS pH 7,4, масс/объем) при 1 × 10⁶ клеток/мл в течение 15 минут при 37°С. 200 мкл клеток распределяли в каждую лунку 96-луночного планшета (2 × 10⁵ клеток/на лунку). Планшеты центрифугировали и надосадочные жидкости отбрасывали. Клетки ресуспендировали в 100 мкл анти-CTLA-4 антител, приготовленных в блокирующем буфере. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 90 минут и дважды промывали. После того как блокирующий буфер удаляли, клетки ресуспендировали в 100 мкл меченного Alexa 488 антитела против белка человека (H + L) (1: 500, Invitrogen) и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали и ресуспендировали в 200 мкл блокирующего буфера. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяли с использованием FACS Calibur (BD).

Результаты, как показано на фиг. 7, продемонстрировали, что варианты анти-CTLA-4 антител с удалением PTM связывались с человеческим CTLA-4, экспрессируемым клетками.

Пример 10. Блокирующая активность вариантов анти-CTLA-4 антител с удалением PTM при взаимодействии CTLA-4-B7.1 и B7.2

Анализ связывания лиганда с рецептора на основе клеток проводили, как описано в Примере 4, для определения способности вариантов анти-CTLA-4 антител с удалением PTM блокировать связывание CTLA-4 с его лигандами B7.1.

Результаты, как показано на фиг. 8, продемонстрировали, что варианты анти-CTLA-4 антител с удалением PTM блокировали связывание экспрессируемого клетками CTLA-4 с его лигандом B7.1 и B7.2 (данные не показаны) на уровне, сопоставимым с аналогом ипилимумабом.

Пример 11. Варианты анти-CTLA антител 4 с удалением PTM, способствующие высвобождению IL-20

Стимуляцию РВМС и количественную оценку уровня IL-20 проводили, как описано в Примере 5.

Результаты, как показано на фиг. 9, продемонстрировали, что варианты анти-CTLA-4 антител с удалением PTM все еще могут стимулировать секрецию IL-2. Анти-CTLA-4 антитела с мутациями S239D и I332E и удалением PTM индуцировали повышенную секрецию IL-2, по сравнению с антителами с мутациями S239D и I332E, но без удаления PTM.

Пример 12. Константа аффинности связывания и диссоциации вариантов анти-CTLA-4 антител с удалением PTM

Константы диссоциации определяли с помощью Biacore T200 (GE Healthcare) в соответствии со спецификациями прибора, предоставленными производителем. Вкратце, разведенные 1 мкг/мл анти-CTLA-4 антитела в 10 мМ NaOAc (pH 5, Sigma) иммобилизовали на проточной ячейке сенсорного чипа CM5 Series S. Оставшиеся активные эфирные группы блокировали 1 М этаноламином (рН 8,5). С HBS-EP + в качестве рабочего буфера, рекомбинантные белки CTLA-4-his человека (CT4-H5229, AcroBio) и CTLA-4-his яванского макака (CT4-C5227, AcroBio) с пятью последовательно разведенными концентрациями инъецировали в проточные клетки при 30 мкл/мин со временем ассоциации 180 с. Буферный поток поддерживали для диссоциации в течение 600 с. Значение KD для каждого взаимодействия между антителом и антигеном оценивали, используя оценочное программное обеспечение Biacore T200 1.0 и подходящую модель связывания 1:1.

Результаты показаны на фиг. 10 и в таблице 5. Аффинность связывания двух клонов была аналогична таковой у аналога ипилимумаба.

Таблица 5. Кинетика и аффинность связывания человеческих антител против CTLA-4 с белком CTLA-4ECD-his человека и белком cynoCTLA-4ECD-his яванского макака, как определено Biacore T200

ID клона	Белки	KD (M)	ка (1/мс)	кд (1/с)
CL5’-dPTM’	CTLA-4ECD-his человека	4,28E-11	5,35E + 06	2,29E-04
CL5’-dPTM’	CTLA-4ECD -his яванского макака	5,91E-11	5,21E + 06	3,08E-04
CL5’-eA-dPTM’	CTLA-4ECD-his человека	1,40E-11	5,40E + 06	7,58E-05
CL5’-eA-dPTM’	CTLA-4ECD-his яванского макака	2,43E-11	4,55E + 06	1,10E-04
Аналог ипилимумаб	CTLA-4ECD-his человека	7,32E-11	1,23E + 06	8,98E-05
Аналог ипилимумаб	CTLA-4ECD-his яванского макака	3,47E-10	3,73E + 06	1,29E-03

Пример 13. Анализ функции ADCC in vitro

Чтобы подтвердить предполагаемую NK-зависимую цитотоксическую активность человеческих антител против CTLA-4, был проведен анализ антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) как на CTLA-4-экспрессирующих клетках CHO-K1, так и на CTLA-4-экспрессирующих in vitro стимулированных клетках Treg.

Клетки CHO-K1, экспрессирующие CTLA-4, как описано в Примере 2, стадия 1, доводили до концентрации 2 × 10⁵ клеток/мл в среде ADCC (содержащей RPMI 1640 без фенолового красного, 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин). 50 мкл клеточных суспензий (1 × 10⁴ жизнеспособных клеток) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с v-образным дном. Тестируемые антитела последовательно разводили в среде ADCC (без фенолового красного) и 50 мкл каждого полученного раствора добавляли в лунки в трех экземплярах. Конечные концентрации антител составили: 0,087 мкМ, 0,44 мкМ, 2,2 мкМ, 10,9 мкМ, 54 мкМ, 272 мкМ, 1,36 нМ и 6,8 нМ. Планшет инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Клетки NK92, стабильно трансфицированные FcγR158V, доводили средой ADCC (без фенолового красного) так, чтобы путем добавления 100 мкл клеток NK92, стабильно трансфицированных FcγR158V, к клеткам-мишеням соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 5:1. Затем планшет инкубировали при 37°С в течение 6 часов. После 6 часов инкубации планшет центрифугировали и 50 мкл каждого супернатанта переносили в новый планшет. Надосадочную жидкость инкубировали с 50 мкл буфера для обнаружения LDH при комнатной температуре в течение 30 минут и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Для максимального контроля клеточного лизиса добавляли 50 мкл CTLA-4-экспрессирующих клеток CHO-K1, 50 мкл среды ADCC и 100 мкл 1% буфера тритон-X100 для обнаружения LDH. Для контроля минимального клеточного лизиса добавляли 50 мкл CTLA-4-экспрессирующих клеток CHO-K1 и 150 мкл среды ADCC для обнаружения LDH. Измеряли поглощение при 492/650 нм. Процент лизиса клеток рассчитывали как 100 * (поглощение образцов - поглощение фона)/(поглощение максимального высвобождения - поглощение минимального высвобождения). Все проценты значений клеточного лизиса рассчитывали с использованием GraphPad Prism 5.0.

Результаты, как показано на фиг. 11, показали, что антитело клона CL5-dPTM' индуцировало эффект ADCC на CTLA-4-экспрессирующих клетках CHO-K1, а клон CL5-eA-dTPM' с дополнительными мутациями S239D и I332E показал более высокую активность ADCC, чем аналог ипилимумаб.

CTLA-4-экспрессирующие in vitro стимулированные Treg-клетки получали in vitro из выделенных наивных CD4+ T-клеток. Сначала наивные CD4 + Т-клетки выделяли из первичных РВМС в соответствии с инструкцией производителя (Miltenyi, 130-094-131). Затем наивные CD4 + Т-клетки активировали путем инкубации с гранулами с активатором человеческих T-клеток CD3/CD28 (Dynabeads human T-activator CD3/CD28) (1:1) (Thermo, 11131D), 10 нг/мл IL-2 (PeproTech, 200-02-B) и 20 нг/мл TGF-β1 (PeproTech, 100-21) в течение трех дней. В день эксперимента по опосредованному ADCC уничтожению стимулированные Treg-клетки доводили до концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл в среде ADCC (содержащей RPMI 1640 без фенолового красного, 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин). Клетки 1 × 10⁶ окрашивали 5 мкл кальцеина AM (Therom, C34851, исходный материал, приготовленный как 50 мкг на 50 мкл ДМСО) в течение 1 ч при 37°С. Treg-клетки трижды промывали средой ADCC. 50 мкл клеточных суспензий Treg (5 × 10³ жизнеспособных клеток) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с v-образным дном. Тестируемые антитела последовательно разводили в среде ADCC (без фенолового красного) и 50 мкл каждого полученного раствора добавляли в лунки в трех экземплярах. Конечные концентрации антител составляли 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1 нМ, 10 нМ и 100 нМ. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Свежие PBMC (Miaotong) доводили до 5 × 10⁶ клеток/мл средой ADCC (без фенолового красного). При добавлении 50 мкл свежей РВМС к окрашенным клеткам Treg соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 50: 1. Затем планшет инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После 2 часов инкубации планшет центрифугировали и 100 мкл каждой надосадочной жидкости переносили в новый планшет. Надосадочную жидкость измеряли прибором Enspire. Для контроля максимального клеточного лизиса добавляли 50 мкл окрашенных кальцеином AM клеток Treg, 50 мкл среды ADCC и 100 мкл 1% буфера тритон-X100 для обнаружения высвобожденного кальцеина AM. Для контроля минимального клеточного лизиса добавляли 50 мкл клеток, окрашенных кальцеином AM, и 150 мкл среды ADCC для обнаружения высвобожденного кальцеина AM. Измеряли поглощение при 520/650 нм. Процент удельного уничтожения рассчитывается как 100 * (поглощение образцов - поглощение фона)/(поглощение максимального высвобождения - поглощение минимального высвобождения). Все проценты значений удельного уничтожения рассчитывали с использованием GraphPad Prism 5.0.

Результаты показали, что человеческие анти-CTLA-4 антитела индуцировали эффект ADCC в отношении CTLA-4-экспрессирующих клеток Treg, а антитело с мутациями S239D и I332E показало более высокую активность ADCC, чем антитело без мутаций.

Пример 14. Фармакокинетическое исследование анти-CTLA-4 антител

Стадия 1. Обработка однократной дозой анти- CTLA-4 антитела у мышей

Самцам мышей C57BL/6 вводили 3 мг/кг анти- CTLA-4 антитела через хвостовую вену для измерения сывороточной концентрации антител против CTLA-4. Животных сдерживали вручную и приблизительно 100 мкл крови/в момент времени собирали с помощью ретроорбитальной пункции, момент времени соответствовал моменту до введения дозы, 0,167, 1, 4, 8, 24 ч, 2, 4, 7, 14 дней после инъекции антитела. Терминальный забор осуществляли посредством пункцию сердца. Образцы крови оставляли при комнатной температуре и центрифугировали при 2000 × g в течение 5 минут при 4°С для получения образцов сыворотки.

Стадия 2. Концентрация анти-CTLA-4 антитела в сыворотке, измеренная методом ELISA

Все образцы сыворотки сначала разбавляли в 20 раз в аналитическом разбавителе. Дополнительное разведение было сделано в 5% мышиной сыворотке (PBS, об./об.). Рекомбинантный человеческий белок CTLA4-his (Acro Bio) разводили в PBS до концентрации 0,5 мкг/мл, и 50 мкл разведенного образца белка CTLA-4-his добавляли на лунку в микропланшеты для ELISA, которые инкубировали в течение ночи при 4°С для покрытия планшетов рекомбинантными белками. Затем планшеты блокировали блокирующим раствором для ELISA (включающим 2% BSA, 0,05% (об./об.) Tween-20, буфер PBS pH 7,4, об./об.) при 37°C в течение двух часов. Блокирующий буфер удаляли и планшеты инкубировали с разведенными образцами сыворотки в течение 1 часа при 37°С. Планшеты трижды промывали промывочным буфером (PBS + 0,01% (об./об.) Tween 20) и инкубировали с козьим антителом против человеческого IgG (Fc), конъюгированным с пероксидазой хрена (A0170, Sigma), при 37°С в течение одного часа. Добавляли 100 мкл тетраметилбензидина (TMB) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. 100 мкл 0,1 Н HCl добавляли в каждую лунку для остановки реакции. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью ридера для ELISA-планшетов (SpectraMax M2).

Соответствующая сывороточная концентрация анти-CTLA-4 антитела показана на фиг. 12, а подробные данные приведены в таблице 6.

Таблица 6. Средняя концентрация антител в сыворотке после внутривенного введения (в.в.) в дозе 3 мг/кг для мышей

Индивидуальные и средние данные сывороточной концентрации от времени аналога ипилимумаба после внутривенной дозы 3 мг/кг для самцов мышей C57BU6
Доза Доза	время отбора образцов	Концентрация	Среднее
(мг/кг) путь			(мкг/мл)		(мкг/мл)	SD	CV(%)
	(День)	Индивидуум (№ 1 - № 12)
3 в.в.	0	BQL	BСL	BСL	BQL	Не Доступно	Не Доступно
	0,00694	67,3	69,8	60,2	65,8	4,99	7,59
	0,0417	528	58,4	54,0	55,1	2,92	5,29
	0,167	42,1	55,6	52,7	50,2	7,09	14,14
	0,333	37,3	42,0	38,1	39,2	254	6,50
	1	21,7	26,0	24,0	23,9	2,163	9,04
	2	19,8	22,8	17,6	20,1	2,59	12,9
	4	17,7	17,5	17,0	17,4	0,389	2,24
	7	18,3	13,3	13,4	15,03	2,829	18,83
	14	10,8	9,8	10,3	10,30	0,531	5,15
ФК-параметры	Единица	Расчетное значение
CL	мл/день/кг мл/кг			7,12
Vss				127
V1	мл/кг			47,2
Альфа t1/2	день			0,271
Бета t1/2	день			12,8
AUC	день*мкг/мл			421
MRT	день			17,8
Индивидуальные и средние данные концентрации CL5 в сыворотке крови после в.в. дозы в дозе 3 мг/кг в
Доза доза	время отбора	Концентрация	Среднее
(мг/кг) путь	образцов		(мкг/мл)		(мкг/мл)	SD	CV(%)
(День)	Индивидуум
3 в.в.	0	BQL	BQL	BQL	BQL	Не Доступно	Не Доступно
	BCL	44,3	49,7	50,9	48,3	3,54	7,33
	0,0417	37,5	39,6	33,4	36,8	3,20	8,67
	0,167	26,0	26 0	22,5	24,8	2,00	8,07
	0,333	22,1	18,7	21,0	20,6	1,70	8,27
	1	128	14,1	14,0	13,6	0,697	5,12
	2	12,7	13,6	11,0	124	1,32	10,6
	4	11 0	10-5	9,62	10,4	0,690	6,66
	7	9,94	9,09	10,2	9,75	0,594	6,09
	14	4,99	5,42	5,89	5,43	0,449	8,26
ФК-параметры	Единица	Расчетные значения
CL	Мл/день/кг			139
Vss	мл/кг			194
V1	мл/кг			64,0
Альфа t1/2	день			0,113
Бета t1/2	день			9,92
AUC	день*мкг/мл			216
MRT	день			14,0

Кроме того, отношение опухоли к сыворотке концентрации антитела против CTLA4 HCAb измеряли у мышей C57BL/6 с опухолями MC38. Мышам вводили 3 мг/кг анти-CTLA-4 антитела через хвостовую вену для измерения концентрации анти-CTLA-4 антител в сыворотке и опухоли. Животных удерживали вручную и приблизительно 100 мкл крови/момент времени собирали с помощью ретроорбитальной пункции, момент времени составлял 8 и 24 часа после инъекции. Конечный сбор осуществляли посредством пункцию сердца. Образцы крови хранили при комнатной температуре и центрифугировали при 2000 × g в течение 5 минут при 4°С для получения образцов сыворотки. Концентрации анти-CTLA-4 антитела в сыворотке и опухоли также тестировали с помощью ELISA, как на стадии 2.

Отношение опухоли к сыворотке концентрации антитела против CTLA4 HCAb в группе CL5-eA-dPTM' составляло примерно в 1 раз выше, чем в группе аналогов Ipi, как показано на фиг. 13, что может быть связано с уникальным признаком антител HCAb, содержащих только тяжелую цепь. Более высокое распределение опухоли к сыворотке может привести к более высокому проникновению в опухолевую ткань антител HCAb.

Пример 15. Мыши, несущие опухоль MC38, лучше выживали с человеческими анти-CTLA-4 антителами

Криоконсервированная клеточная линия карциномы толстой кишки мыши MC-38 была выделена и культивирована в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина, стрептомицина при 37 °C, чтобы получить достаточно клеток для имплантации опухоли. Культивируемые клетки МС-38 собирали, ресуспендировали в PBS с плотностью 1 × 10⁷ клеток/мл с жизнеспособностью> 90% и подкожно имплантировали в правый бок 120 hCTLA-4-нокаутных мышей (GempharmaTech). Через пять дней после инокуляции опухоли отобрали 81 мышь с размером опухоли в диапазоне от 26 до 64 мм³ (средний размер опухоли составляла 40 мм³) и распределили на 9 групп с использованием стратифицированной рандомизации с 9 мышами на группу в зависимости от их объема опухоли. Обработку начинали со дня рандомизации (определяемого как D0). Группу 1 обрабатывали hlgG1 в.б. (внутрибрюшинно) при 10 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 2 обрабатывали CL20’-еА (последовательности в таблице 7) в.б. при 5,4 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 3 обрабатывали аналогом ипилимумаба, в.б. при 10 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 4 обрабатывали аналогом ипилимумаба в.б. при 1 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 5 обрабатывали CL5'-dPTM' в.б. при 5,4 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 6 обрабатывали CL5'-dPTM' в.б. при 0,54 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 7 обрабатывали CL5'-eA-dPTM' в.б. при 5,4 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16; группу 8 обрабатывали CL5'-eA-dPTM' в.б. при 1,5 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16 и группу 9 обрабатывали CL5'-eA-dPTM' в.б. при 0,54 мг/кг в D0, D3, D6, D10, D13, D16.

Таблица 7. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности клона CL20’-eA

ID клона	SEQ ID No
нк- тяжелая цепь	ак-тяжелая цепь	ак-вариабельная область тяжелой цепи	ак-CDR1 тяжелой цепи	ак-CDR2 тяжелой цепи	ак-CDR3 тяжелой цепи
CL20’-eA	157	158	159	160	161	162

нк: нуклеиновая кислота; ак: аминокислота

Размеры опухоли измеряли три раза в неделю во время обработки. Когда отдельное животное достигло конечной точки (TV> 2000 мм³), его умерщвляли. Время от начала обработки до прекращения считалось временем его выживания. Кривая выживания построена по методу Каплана-Мейера. Среднее время выживания (MST) рассчитывали для каждой группы. Увеличение продолжительности жизни (ILS) рассчитывалось по следующей формуле:

ILS (%) = (MSTобработка-MSTноситель)/MSTноситель x 100%).

ILS (%)> 25% будет считаться биологически значимым преимуществом выживания в соответствии с критериями Национального института рака.

Относительное изменение массы тела (RCBW) каждой мыши рассчитывали по следующей формуле: RCBW (%) = (BWi - BW0)/BW0 × 100%, где BWi относится к средней массе тела в день i, а BW0 относится к средней массе в день 0.

Объемы опухолей (TV) рассчитывали по следующей формуле: объем опухоли = (длина × ширина²)/2.

Степень ингибирования роста опухоли (TGI%) для каждой группы, получавшей дозу, рассчитывали по следующей формуле: TGI% = [1-TVi/TVvi] * 100%, где TVi относится к среднему объему опухоли в группе, получающей дозу, в день i, и TVvi относится к среднему объему опухоли в группе, получавшей носитель, в день i.

Среднее значение и стандартная ошибка среднего (SEM) массы тела мышей, RCBW и объема опухоли в каждой группе были рассчитаны с использованием Microsoft Excel 2007. Фигуры массы тела, относительного изменения массы тела, кривая роста опухоли и ингибирования роста опухоли были построены с использованием GraphPad Prism 5. Рост опухоли между различными группами анализировали с использованием двухстороннего РМ ANOVA. Кривые выживаемости Каплана-Мейера были проанализированы с использованием логрангового критерия. P-значения <0,05 рассматривали, как статистически значимые.

Все исследование было прекращено на D65. Индивидуальные кривые роста опухолей каждой группы показаны на фиг. 14А. Кривые выживаемости животных по времени до конечной точки Каплана-Мейера показаны на фиг. 14В. Все процедуры переносились без каких-либо побочных эффектов, как показано на фиг. 14C. В большинстве этих групп мышей умерщвляли, когда объем опухоли достигал 2000 мм³. В группе 7 3 из 9 мышей, получавших CL5’-eA-dPTM’ при 5,4 мг/кг, выжили без опухоли на D65. В группе 9 2 из 9 мышей, которым вводили CL5’-eA-dPTM’ в дозе 0,54 мг/кг, выжили без опухоли на D65.

MST рассчитывали для каждой группы, и они представлены в таблице 8. MST группы, получавшей носитель, hIgG1 при 5,4 мг/кг и CL20’-eA при 5,4 мг/кг составили 14 дней. MST групп обработки аналогом ипилимумаба при 10 мг/кг и 1 мг/кг, CL5'-dPTM' при 5,4 мг/кг и 0,54 мг/кг, CL5'-eA-dPTM' при 5,4 мг/кг, 1,5 мг/кг и 0,54 мг/кг составили 14, 23, 19, 21 14, 40, 21 и 28 дней, соответственно. Также можно видеть в таблице 8, ILS в группах обработки составляли 64,3%, 35,7%, 50%, 0%, 185,7%, 50% и 100% по сравнению с группой hIgG1, получавшей носитель. Аналог ипилимумаб при 10 мг/кг, CL5'-dPTM' при 5,4 мг/кг, CL5’-eA-dPTM' при 5,4 мг/кг, 1,5 мг/кг и 0,54 мг/кг значительно увеличил среднее время выживания. Мыши, получавшие CL5’-eA-dPTM при 5,4 мг/кг, продемонстрировали лучшее ILS, чем мыши с аналогом ипилимумабом при 10 мг/кг.

Таблица 8. Анализ выживания

группа		MST	ILS (%)	p-значение
Gl	HlgGl, LOmpk	14	-	-
G2	CL20'-eA, 5.4mpk	14	0,0	ns
G3	аналог ипилимумаб, lOmpk	23	64,3	<0,01
G4	аналог ипилимумаб, lmpk	19	35,7	ns
G5	CL5'-dPTM', 5.4mpk	21	50	O,05
G6	CL5'-dPTM', 0.54mpk	14	0,0	ns
G7	CL5'-eA-dPTM', 5.4mpk	40	185,7	<0,05
G8	CL5'-eA-dPTM', 1.5mpk	21	50	<0,05
G9	CL5'-eA-dPTM', 0.54mpk	28	100,0	<0,05

Примечание: ILS = (MST_Gn – MST_G1)/MST_G1 * 100%; P- значением являются все группы по сравнению с группой G1.

Пример 16. Ингибирование роста опухоли MC38 у hCTLA-4-нокаутных мышей с помощью анти- CTLA-4 антитела HCAb.

Криоконсервированная клеточная линия карциномы толстой кишки мыши MC-38 была выделена и культивирована в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина, стрептомицина при 37°C, чтобы получить достаточно клеток для имплантации опухоли. Культивируемые клетки МС-38 собирали, ресуспендировали в PBS с плотностью 5 × 10⁶ клеток/мл с жизнеспособностью> 90% и подкожно имплантировали в правый бок 60 hCTLA-4-нокаутных мышей. Через семь дней после инокуляции опухоли были отобраны 30 мышей с опухолями со средним размером 102 мм³, которые были рандомизированы на 5 групп (n = 6) в зависимости от размера опухоли. Обработку начинали в день рандомизации (определяемый как D0). Включенных в исследование мышей обрабатывали hIgG1 (0,5 мг/кг), аналогом ипилимумаба (0,5 и 0,2 мг/кг) и CL5'-eA-dPTM' (0,27 и 0,1 мг/кг), соответственно, внутрибрюшинно (ip) в D0, D6, D9, D13, D16 и D19. Мышей контролировали ежедневно, а массу тела регистрировали в рабочие дни. Размеры опухоли измеряли два раза в неделю во время обработки.

Относительное изменение массы тела (RCBW), объемов опухоли (TV) и степени ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывали, как в Примере 16. Среднее значение, стандартная ошибка среднего (SEM) массы тела мышей, RCBW и объема опухоли в каждой группе рассчитывали с использованием Microsoft Excel 2007. Фигуры массы тела, относительного изменения массы тела, кривая роста опухоли и ингибирования роста опухоли были построены с использованием GraphPad Prism 5. Рост опухоли между различными группами анализировали с использованием двухстороннего РМ ANOVA. Кривые выживаемости Каплана-Мейера были проанализированы с использованием логрангового критерия. P-значения <0,05 рассматривали, как статистически значимые.

Кривые роста опухоли показаны на фиг. 15А. Все виды обработок переносились без каких-либо побочных эффектов, как показано на фиг. 15B. Мыши в группах CL5’-eA-dPTM’ при 0,1 мг/кг и 0,27 мг/кг, аналог ипилимумаба при 0,5 мг/кг показали значительное ингибирование роста опухоли от D20 до D30 по сравнению с мышами в группе hIgG1 при 0,2 мг/кг. В то время как обработка аналогом ипилимумабом в дозе 0,2 мг/кг не показала значительного ингибирования роста опухоли по сравнению с hIgG1 при 0,2 мг/кг. CL5’-eA-dPTM ’способствует лучшему ингибированию роста опухоли, чем аналог ипилимумаб в той же дозе.

Хотя изобретение было описано подробно и со ссылкой на его конкретные воплощения, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за пределы сущности и объема изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd

<120> ANTIBODIES BINDING CTLA-4 AND USES THEREOF

<130> 55543 00001

<150> US62/607917

<151> 2017-12-20

<160> 200

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 1

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg atccaccggc 60

tctgaggtgc agctggtgga gattggagga ggcgagatcc agccgggggg gtccctgaga 120

ctctcgtgtg cagcctctgg gttcaacgtc agtaagaact acatgagttg ggtccgccag 180

gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gtaatctata gtggtggtgg tacagaatac 240

gcagcctccg tgaagggccg atttaacatc tccagagaca gttccaagaa tatgttgtat 300

cttcaaatga acaacctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtgc gagggccgtc 360

cccaggcccc atgggactga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagag 420

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 480

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 540

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 600

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 660

aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 720

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 780

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 840

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 900

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 960

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1020

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1080

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1113

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ile Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Glu Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Asn Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys

85 90 95

Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Val Pro Arg Pro His Gly Thr Asp Ile

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys

130 135 140

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

165 170 175

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

180 185 190

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

195 200 205

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

210 215 220

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

245 250 255

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

260 265 270

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

275 280 285

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

290 295 300

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

305 310 315 320

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

325 330 335

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

340 345 350

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

355 360 365

Pro Gly Lys

370

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ile Gly Gly Gly Glu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Val Ser Lys Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Asn Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Val Pro Arg Pro His Gly Thr Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 4

Gly Phe Asn Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 5

Val Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 6

Ala Val Pro Arg Pro His Gly Thr Asp Ile

1 5 10

<210> 7

<211> 1116

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 7

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg atccaccggc 60

tctgaggtgc agctggcgga gactggagga ggcttgatcc agcctggggg gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagtctctgg gttcaatgtc agtaagaatt acatgagctg ggtccgccag 180

gttccaggga aggggctgga gtgggtcgca gttgtttata gcggtggtag caaaacctac 240

gcagactccg tgaagggccg attcatcctc tccagagaca attccgacaa cacactgtat 300

cttcaaatga acaacctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagccgtt 360

cctcattccc ccagttcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 480

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 540

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 600

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 660

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 720

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 780

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 840

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 900

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 960

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1020

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1080

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1116

<210> 8

<211> 372

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Glu Thr Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Leu Ser Arg Asp Asn Ser Asp

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Val Pro His Ser Pro Ser Ser Phe Asp

115 120 125

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser

130 135 140

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

145 150 155 160

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

165 170 175

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

180 185 190

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

195 200 205

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

210 215 220

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

225 230 235 240

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

245 250 255

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

260 265 270

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

275 280 285

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

290 295 300

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

305 310 315 320

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

325 330 335

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

340 345 350

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

355 360 365

Ser Pro Gly Lys

370

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 9

Glu Val Gln Leu Ala Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asn Val Ser Lys Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ile Leu Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Val Pro His Ser Pro Ser Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 10

Gly Phe Asn Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo Sapiens)

<400> 11

Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 12

Ala Val Pro His Ser Pro Ser Ser Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 13

<211> 1116

<212> DNA

<213> Homo Sapiens)

<400> 13

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg atccaccggc 60

tctgaggtgc agctggagga gactggagga gacttgatcc agccgggggg gtccctgaga 120

ctctcctgta cagcctctgg gtttaacgtc agtagaatct acatgagctg ggtccgccag 180

gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gtgatttata gcggtggaag tatatattac 240

gcagattccg tgaggggccg atttaccatc tccagagaca gttccacgaa cacggtgttt 300

cttcaaatga acagcctgag agccgaggac tcggccgtgt attactgtgc gagagccgtc 360

ccaagtgccc ctagttcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 420