Соединения и способы трансмембранной доставки молекул

Изобретение относится к конъюгату общей формулы (I), который применяется для доставки лекарственного вещества через биологическую мембрану. 20 пр., 57 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Изобретение относится к новой системе доставки и способам доставки молекул и макромолекул через биологические мембраны в клетки, возможно, с последующим удержанием их внутри клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Для этиологии и патогенеза многих заболеваний характерно патологическое изменение функции белков: от дисфункции мутантных белков до патологического усиления функции определенных белков, которые приобрели новое свойство и стали токсичными. Теоретически, ингибирование синтеза таких белков методами генной терапии может быть перспективным для пациентов с подобными заболеваниями.

[0003] Одним из важнейших научных достижений последних лет стала разработка концепции подавления экспрессии заданного гена методом РНК-интерференции с использованием коротких интерферирующих РНК (киРНК). В основе РНК-интерференции лежит действие коротких (около 19-27 пар оснований) двухцепочечных последовательностей РНК (обозначаемых «киРНК»), способных, при участии других клеточных систем [в частности, белкового комплекса Dicer, расщепляющего более длинные двухцепочечные РНК до киРНК, а также индуцируемого РНК сайленсинг-комплекса (RNA-induced silencing complex, RISC)] ингибировать трансляцию и «помечать» определенные последовательности мРНК для инициации их деградации, что приводит к подавлению экспрессии гена на стадии трансляции. Также, ингибирование экспрессии и блокирование продукции заданного целевого белка проводилось с использованием антисмыслового олигонуклеотида (АОН), представляющего собой короткую последовательность немодифицированной или химически модифицированной молекулы ДНК (обычно длиной 13-25 нуклеотидов), комплементарной матричной РНК. И все же, несмотря на то, что применение этих методов в здравоохранении потенциально должно принести огромную пользу, доставка подобных макромолекул в клетки остается достаточно сложной задачей, поскольку олигонуклеотиды имеют относительно большую и сильно заряженную структуру (например, средняя молекулярная масса киРНК составляет 13 кДа, при этом молекула несет примерно 40 отрицательно заряженных фосфатных групп). Действительно, трансмембранная доставка олигонуклеотидов требует преодоления очень высокого энергетического барьера.

[0004] Дипольным потенциалом мембраны называется электрический потенциал, возникающий во всех фосфолипидных мембранах между границей раздела мембрана-вода и центральной зоной мембраны (положительной внутри). Считается, что этот потенциал создается за счет в высокой степени упорядоченно расположенных карбонильных групп в сложноэфирных связях с глицерином в молекулах фосфолипидов, и имеет амплитуду примерно 220-280 мВ. Поскольку дипольный потенциал мембраны возникает в условиях сильно гидрофобной окружающей среды с диэлектрической проницаемостью 2-4, он генерирует очень сильное электрическое поле, напряженностью 10⁸-10⁹ В/м, называемое «электрическим полем внутри мембраны» (ЭПВМ). По всей видимости, дипольный потенциал мембраны и создаваемое им внутримембранное электрическое поле имеют важные физиологические функции: они могут влиять на функционирование мембранных белков, определяя их конформацию и активность. Вместе с тем, насколько нам известно, на сегодняшний день дипольный потенциал в промышленных, биологических или медицинских целях еще не использовали.

[0005] Известны разные способы доставки макромолекул, таких как олигонуклеотиды или белки, через биологические мембраны. К ним относится использование векторов на основе вирусов, а также применение невирусных систем доставки, например, катионных липидов или липосом. Тем не менее, на данный момент эти способы, в основном, применяются in vitro либо для введения в очаг поражения in vivo, например, для инъекции непосредственно в глаз или прямого введения в легкие. Также, был разработан эффективный способ доставки в печень. Серьезным ограничивающим фактором использования некоторых из таких способов, например, связанных с использованием катионных липидов, является токсичность. Относительно невирусных систем доставки: известным эффективным и широко используемым способом доставки макромолекул in vitro является электропорация. Данный способ предполагает наложение электрического поля на суспензию клеток, в результате чего заряженные целевые молекулы ударяются о клеточные мембраны, после чего происходит временная дестабилизация мембран в этом месте, в результате чего макромолекулы проходят в клетки. Однако, как упомянуто выше, электропорацию используют, в основном, in vitro. Попытки распространить ее применение для решения задач in vivo были не слишком успешными, и на практике применение электропорации ограничивается отдельными органами, в которые можно ввести электроды (например, мышцами и легкими).

[0006] В заключение следует отметить, что существует большая неудовлетворенная потребность в способах доставки макромолекул, таких как олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны или другие биологические барьеры, например, гематоэнцефалический, гематоофтальмический и плацентарный барьер, так что системная доставка макромолекул лекарств все еще остаётся огромной нерешенной проблемой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение относится к новому инновационному применению недавно открытого электрического поля внутри мембраны (ЭПВМ), создаваемого дипольным потенциалом мембраны, в разных областях, таких как медицина, биология и сельское хозяйство.

[0008] Согласно одному аспекту, изобретение относится к ЭПВМ-субстрату, представляющему собой представляет собой химическую группировку, которую можно связать с лекарственным веществом для обеспечения лучшей доставки этого лекарственного вещества через биологические фосфолипидные мембраны в клетки, и доставка зависит от ЭПВМ/дипольного потенциала мембраны.

[0009] Согласно еще одному аспекту, изобретение относится к способу доставки лекарственного вещества через биологические мембраны, при котором получают лекарственное вещество, связанное с ЭПВМ-субстратом, и приводят это лекарственное вещество, связанное с ЭПВМ-субстратом, в контакт с биологическими мембранами.

[0010] В одном воплощении изобретения, в указанном способе лекарственное вещество связывают с ЭПВМ-субстратом.

[0011] Согласно еще одному аспекту изобретения, предложен способ доставки лекарственного вещества через биологическую мембрану, при котором лекарственное вещество связывают с одной или более чем одной группировкой, у каждой их которых: коэффициент распределения октанол/вода больше 1; имеется по меньшей мере один отрицательный полюс, выбранный из следующих группировок: карбонильная группа, простая эфирная группа или атом(ы) фтора; и положительный полюс включает в себя по меньшей мере одну линейную или разветвленную алифатическую углеводородную цепь, содержащую два атома углерода; и этот конъюгат лекарственного вещества приводят в контакт с биологической мембраной. В одном воплощении изобретения, указанные группировки могут иметь описанную здесь структуру E, E' или E''.

[0012] Еще в одном аспекте, изобретение относится к конъюгату для применения в доставке лекарственного вещества через биологическую мембрану, содержащему лекарственное вещество, связанное с одной или более чем одной группировкой, каждая из которых имеет: коэффициент распределения октанол/вода больше 1; по меньшей мере один отрицательный полюс, выбранный из следующих фрагментов: карбонильная группа, эфирная группа или атом(ы) фтора; и положительный полюс, включающий в себя по меньшей мере одну линейную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую два атома углерода; и этот конъюгат лекарственного вещества приводят в контакт с биологической мембраной. Еще в одном воплощении изобретения, указанные группировки могут иметь описанную здесь структуру E, E' или E''.

[0013] Флоретин является химическим веществом, уменьшающим ЭПВМ, и поэтому может использоваться для оценки зависимости движения конкретного соединения от дипольного потенциала мембраны/ЭПВМ. Следовательно, при реализации настоящего изобретения на практике, ЭПВМ-субстратом является химическое соединение, возможно, присоединенное к лекарственному веществу, доставка которого через клеточные мембраны в присутствии флоретина снижена более чем на 50%.

[0014] Еще в одном воплощении изобретения ЭПВМ-субстрат представляет собой новый рационально сконструированный «молекулярный нанодвигатель» (МНД), который способен использовать ЭПВМ для доставки лекарственных веществ через биологические мембраны. С этой целью МНД могут конвертировать электростатическую энергию ЭПВМ в кинетическую энергию, позволяющую преодолевать зачастую очень высокий энергетический барьер, имеющий место при доставке химических соединений, таких как макромолекулы лекарственных веществ, через биологические барьеры, к которым относятся фосфолипидные мембраны.

[0015] Согласно еще одному аспекту, изобретение основано на сделанном авторами изобретения открытии: проникновение конъюгатов, содержащих группировку формулы (I)-(XId), через биологические мембраны можно существенно ингибировать или увеличивать путем фармакологического «выключения» (например, с помощью флоретина (100-1000 мкМ)) или «включения» (например, с помощью 6-кетохолестанола (10-100 мкМ)), соответственно, электрического поля внутри мембраны. Это свидетельствует о прямой зависимости проникновения конъюгатов формулы (I)-(XId) по изобретению через мембраны от электрического поля внутри мембраны, которое создается дипольным потенциалом мембраны. Таким образом, все эти соединения формулы (I)-(XId) могут считаться ЭПВМ-субстратами.

[0016] МНД по изобретению содержат структуру, представляющую собой группировку E, E' или E'', как она определена в формуле (II) ниже. Доставляемые с использованием МНД лекарственные вещества могут быть как низкомолекулярными веществами, так и макромолекулами, например, пептидами, белками или олигонуклеотидами (в частности, природными или модифицированными, одноцепочечными или двухцепочечными, РНК или ДНК). Еще в одном воплощении изобретения, доставляемые макромолекулы включают в себя цепи РНК, предназначенные для сайленсинга генов, например, киРНК (короткие интерферирующие РНК), либо последовательности ДНК, используемые в качестве антисмысловых олигонуклеотидов (АСО).

[0017] Конъюгаты лекарственных веществ (например, низкомолекулярных лекарственных веществ или макромолекул) с МНД по изобретению могут быть использованы в фундаментальных научных исследованиях, сельском хозяйстве, химии и неклинической либо клинической медицинской практике. В частности, эти конъюгаты можно применять для лечения заболеваний, в патогенез которых вовлечены аберрантные белки, либо при которых имеет место дисфункция белков, и при этом подавление экспрессии генов, кодирующих упомянутые белки, может быть полезным. Применение в медицине может представлять собой, например, использование конъгатов в качестве средств лечения дегенеративных заболеваний, рака, нарушений, вызванных токсинами, ишемического инсульта, инфекций или иммуно-опосредованных заболеваний.

[0018] В качестве одного из воплощений изобретения предложен способ доставки лекарственного вещества через биологические мембраны, при котором используют конъюгат формулы (I):

или фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (I), и сольваты и гидраты указанных солей, где

D представляет собой лекарственное вещество, которое требуется доставить через биологические мембраны, выбранное из группы, состоящей из низкомолекулярного лекарственного вещества, пептида, белка, природной либо модифицированной, одноцепочечной или двухцепочечной ДНК либо РНК, киРНК и АСО; символы y, z и w - каждый - обозначает целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6, при этом, если указанное целое число представляет собой 0, это означает, что соответствующая группировка E отсутствует; и где по меньшей мере один из y, z и w отличается от 0;

группировки E, E'и E'' могут быть одинаковыми или разными, при этом каждая имеет структуру формулы (II):

(A)_a-B-L₁-Q₁-L₂-Q₂-L₃

формула (II)

где каждая группировка А независимо выбрана из структур формулы (III), (IV), (V) и (VI):

М отсутствует либо выбрано из -O- и -CH₂-; и символы g, h и k, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16; * обозначает -H или место связи с В или другой группой А; а представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; Q представляет собой кислород или аминогруппу;

где B выбрано из одной или более групп, состоящих из следующего:

линейный, циклический или разветвлённый C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄ алкил или гетероалкил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

линейный, циклический или разветвлённый C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄ алкилен или гетероалкилен, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄ арил или гетероарил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

одна или более чем одна стероидная группировка, выбранная из группы, состоящей из холестерина, желчной кислоты, эстрогена, эстрадиола, эстриола, литохолевой кислоты и любого их аналога, где каждая группировка возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связана с простой эфирной группой, сложноэфирной группой, аминогруппой или амидной группой;

и любые их комбинации;

Q₁ и Q₂, каждая, представляет собой расщепляемую группу, которая, независимо, либо отсутствует, либо выбрана из сложноэфирной группы, тиоэфирной группы, амидной группы [например, -C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-], карбаматной группы [например, -O-C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-O-], мочевины [-NH-C(=O)-NH-], дисульфидной группы [-(S-S)-], простой эфирной группы [-O-], аминогруппы, имидазола, триазола и дилактона, лиганда металлохелата, выбранного из BAPTA (1,2-бис(o-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота) и EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), включающего ион этого металла, а также любых их комбинаций;

L₁, L₂ и L₃, каждая независимо, либо отсутствует, либо выбрана из группы, состоящей из следующего:

линейный, циклический или разветвленный C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкил или гетероалкил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

линейный, циклический или разветвленный C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкилен или гетероалкилен, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ арил или гетероарил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

-(O-CH₂-CH₂)_u-, где каждая такая группировка возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой; нуклеозид, нуклеотид, имидазол, азид, ацетилен и любые их комбинации, где каждый возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой; и где u представляет собой целое число: 1, 2, 3, 4 или 5; и любые их комбинации;

где по меньшей мере одна из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не является отсутствующей, и каждая из Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ может включать в себя группировку T, представляющую собой группу-инициатор, выбранную из C₄-, C₅- или C₆-1,2-дитиоциклоалкила (1,2-дитиоциклобутана; 1,2-дитиоциклопентана; 1,2-дитиоциклогексана и 1,2-дитиоциклогептана); γ-лактама (внутренний амид, содержащий 5 атомов в цикле), δ-лактама (внутренний амид, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-лактама (внутренний амид, содержащий 7 атомов в цикле), γ-бутиролактона (внутренний эфир, содержащий 5 атомов в цикле), δ-валеролактона (внутренний эфир, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-капролактона (внутренний эфир, содержащий 7 атомов в цикле), каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой;

причем по меньшей мере одна из группировок B, Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ связана с лекарственном веществом в соответствии с формулой (I).

[0019] В некоторых воплощениях изобретения y = 1, z = o, и w = 0; или y = 1, z = 1 и w = 0.

[0020] Конъюгаты по изобретению имеют структуру общей формулы (I) и могут быть доставлены через биологические мембраны в клетки:

включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (I), а также сольваты и гидраты указанных солей, где

D является лекарственным веществом, которое требуется доставить через биологические мембраны; D может представлять собой низкомолекулярное лекарственное вещество, пептид, белок, природную либо модифицированную, одноцепочечную или двухцепочечную ДНК либо РНК, киРНК или АСО;

символы y, z и w, каждый независимо, обозначает целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6, при этом, если указанное целое число представляет собой 0, это означает, что соответствующая группировка E отсутствует; и где по меньшей мере один из y, z и w отличается от 0. В одном из воплощений изобретения y = 1, z = o, и w = 0; еще в одном воплощении изобретения y = 1, z = 1, и w = 0.

группировки E, E' и E'' могут быть одинаковыми или разными, при этом каждая имеет структуру формулы (II):

(A)_a-B-L₁-Q₁-L₂-Q₂-L₃

формула (II)

где каждая группировка А независимо выбрана из структур формулы (III), (IV), (V) и (VI):

М выбрано из -O- и -CH₂-; и символы g, h и k, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16; * обозначает -H или место связи с В или другой группой А; а представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; Q представляет собой кислород или аминогруппу.

B выбрано из одной или более групп, состоящих из следующего:

линейный, циклический или разветвлённый C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкил или гетероалкил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

линейный, циклический или разветвлённый C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкилен или гетероалкилен, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ арил или гетероарил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

одна или более чем одна стероидная группировка (такая как холестерин, желчная кислота, эстрадиол и эстриол), эстроген, нуклеозид, нуклеотид и любая их комбинация, где каждая группировка возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо каждая возможно связана с простой эфирной группой, сложноэфирной группой, аминогруппой или амидной группой;

и любые их комбинации;

Q₁ и Q₂, каждая, представляет собой расщепляемую группу, которая, независимо, либо отсутствует, либо выбрана из сложноэфирной группы, тиоэфирной группы, амидной группы [например, -C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-], карбаматной группы [например, -O-C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-O-], мочевины [-NH-C(=O)-NH-], дисульфидной группы [-(S-S)-], простой эфирной группы [-O-], аминогруппы, имидазола, триазола, дилактона, рН-чувствительной группировки, редокс-чувствительной группировки, лиганда металлохелата, включающего ион этого металла, а также любых их комбинаций;

L₁, L₂ и L₃, каждая независимо, либо отсутствует, либо выбрана из группы, состоящей из следующего:

линейный, циклический или разветвленный C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкил или гетероалкил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

линейный, циклический или разветвленный C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкилен или гетероалкилен, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ арил или гетероарил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

-(O-CH₂-CH₂)_u-, где каждая такая группировка возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой;

нуклеозид, нуклеотид, имидазол, азид, ацетилен и любые их комбинации, где каждый возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой; и где u представляет собой целое число: 1, 2, 3, 4 или 5; и любые их комбинации;

где по меньшей мере одна из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не является отсутствующей, и каждая из Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ возможно замещена группировкой T, где T представляет собой группу-инициатор, выбранную из C₄-, C₅- или C₆-1,2-дитиоциклоалкила (1,2-дитиоциклопентана; 1,2-дитиоциклогексана и 1,2-дитиоциклогептана); γ-лактама (внутренний амид, содержащий 5 атомов в цикле), δ-лактама (внутренний амид, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-лактама (внутренний амид, содержащий 7 атомов в цикле), γ-бутиролактона (внутренний эфир, содержащий 5 атомов в цикле), δ-валеролактона (внутренний эфир, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-капролактона (внутренний эфир, содержащий 7 атомов в цикле), причем каждая группа-инициатор возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой;

и где по меньшей мере одна из группировок B, Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ связана с лекарственным веществом в соответствии с формулой (I).

[0021] Еще в одном воплощении изобретения, по меньшей мере, две из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не являются отсутствующими.

[0022] Еще в одном воплощении изобретения, по меньшей мере, три из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не являются отсутствующими.

[0023] Еще в одном воплощении, изобретение относится к конъюгату общей формулы (I), где, по меньшей мере, одна из E, E' и E'' имеет структуру как определено в формуле (VIIIg) или формуле (IXc):

формула (VIIIg)

формула (XIc),

где L₃ и D, каждая, имеет то же значение, что и в формуле (I);

формула (IXc); когда a = 1, и k =1; группировка обозначается: «Apo-Si-G»

включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (VIIIg) или формулы (XIc), и формулы IXc, а также сольваты и гидраты указанных солей; при этом D представляет собой лекарственное вещество как определено в формуле (I); и L₃ отсутствует либо выбрана из C₁, C₂, C₃, C₄, C₅ и C₆ алкилена.

[0024] Еще в одном воплощении, изобретение относится к способу доставки лекарственного вещества через биологическую мембрану в клетки, либо in vitro, либо in vivo, при котором клетки приводят в контакт с описанным здесь конъюгатом.

[0025] Еще в одном воплощении, изобретение относится к способу лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента, при котором пациенту вводят терапевтически эффективные количества фармацевтической композиции, содержащей описанный здесь конъюгат.

[0026] Еще в одном воплощении, изобретение представляет собой описанный здесь конъюгат для применения в медицине, например, у людей, или в ветеринарии.

[0027] Еще в одном воплощении, изобретение относится к применению МНД, например, представляющего собой группировку E, E' или E'', как она определена в формуле (II) и описана здесь, и лекарственного вещества для получения описанного здесь конъюгата, предназначенного для лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента. Еще в одном воплощении, изобретение относится к применению описанного здесь конъюгата в приготовлении лекарственного препарата для лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента.

[0028] В некоторых воплощениях изобретения упомянутое заболевание представляет собой рак.

[0029] Способ выбора ЭПВМ-субстрата из библиотеки соединений, при котором:

(i) клетки или липосомы инкубируют с представляющим интерес соединением из библиотеки соединений, которое, предположительно, может быть ЭПВМ-субстратом, в присутствии флоретина (100-1000 мкМ) и/или 6-КХ (10-100 мкМ);

(ii) измеряют уровни проникновения представляющего интерес соединения через мембраны в клетки или липосомы в присутствии флоретина и/или 6-КХ;

(iii) клетки или липосомы инкубируют с указанным представляющим интерес соединением в отсутствие флоретина и/или 6-КХ (10-100 мкМ);

(iv) измеряют уровни проникновения указанного представляющего интерес соединения через мембраны в клетки или липосомы в отсутствие флоретина и/или 6-КХ; и

(v) сравнивают уровни проникновения представляющего интерес соединения в присутствии и в отсутствие флоретина и/или 6-КХ; при этом уменьшение проникновения более чем на 50% в присутствии флоретина или увеличение проникновения более чем в два раза в присутствии 6-КХ указывает на то, что представляющее интерес соединение является ЭПВМ-субстратом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0030] Файл с патентом или заявкой на патент содержит по меньшей мере одну цветную фигуру. Экземпляры патента или заявки на патент с цветными фигурами предоставляются патентным ведомством по запросу после уплаты соответствующей пошлины.

[0031] Ниже изобретение раскрыто путем приведения ряда примеров и раскрытия воплощений, которыми оно не ограничивается, с привязкой к упомянутым далее поясняющим фигурам. Это позволит лучше понять изобретение. На фигурах представлено следующее:

[0032] На Фиг. 1А схематически показан принцип ассиметричной полярности, лежащий в основе предполагаемого механизма действия (МД) соединений по изобретению. Молекула имеет отрицательный полюс, содержащий атом(-ы), несущий(-е) отрицательный заряд, например, атом(-ы) фтора, и положительный полюс, в состав которого входят углеводородные цепи, вступающие в гидрофобное взаимодействие с ближайшими к ним цепями молекул фосфолипидов. Таким образом, будучи в целом гидрофобной и незаряженной, молекула несет сконцентрированный дискретный частичный отрицательный заряд, в то время как частичный положительный заряд, наоборот, рассредоточен и не проявляется. Это заставляет молекулу перемещаться от поверхности мембраны к ее центральной зоне.

[0033] На Фиг. 1В схематически показаны структурные мотивы молекулы по изобретению на примере соединения формулы (IXb), где Q₁ представляет собой -S-S-, Q₂ отсутствует, a = 6, b = 8, а стероидная группировка представляет собой остаток литохолевой кислоты.

[0034] На Фиг. 2 схематически изображен предполагаемый механизм действия конъюгата по изобретению. На Фиг. 2 показан «молекулярный нанодвигатель» (МНД), «работающий» на энергии электрического поля внутри мембраны, создаваемого дипольным потенциальным мембраны. На Фиг. 2В изображено приближение макромолекулы, которую тянет МНД, к поверхности мембраны, при этом нарушается стабильность гидратных оболочек фосфолипидов, и головки фосфолипидов сдвигаются в латеральном направлении. На Фиг. 2С изображена индукция последующего попадания конъюгата в слои мембраны и эндоцитоз, при котором конъюгат поступает в эндосомы; в конце концов, конъюгат оказывается между слоями мембраны эндосомы в силу тенденции к поддержанию равновесия концентраций в слоях; затем из эндосомальной мембраны конъюгат перемещается в цитоплазму под действием градиента концентраций и компонентов, улучшающих результат (performance enhancing moieties, PEM), описанных здесь.

[0035] На Фиг. 3 схематически показан механизм удержания киРНК в цитоплазме с участием фермента Dicer, когда отщепляется и удаляется МНД. На Фиг. 3А показана «стыковка» киРНК, связанной с двумя молекулярными нанодвигателями Apo-Si, с ферментом Dicer. На Фиг. 3В изображено удаление одного двигателя в результате ферментативного расщепления РНК. Затем, под действием геликазы семейства Argonaut, происходит расплетание цепей РНК с высвобождением ведущей/смысловой цепи, которая, далее, вступает во взаимодействие с индуцируемым РНК сайленсинг-комплексом (RISC), результатом чего является сайленсинг генов, а цепь-«спутник» с оставшимся присоединенным к ней МНД, подвергается расщеплению.

[0036] На Фиг. 4 приведен пример структуры конъюгата по изобретению, включающей белок (в качестве примера указан Cas9, которым изобретение не ограничивается) и группировки E, E' и E” как они определены в формуле (I).

[0037] На Фиг. 5А-F, 6A-C и 7-9 приведены данные, полученные при разных вариантах реализации изобретения в биологической среде in vitro с использованием ряда конъюгатов по изобретению, включающих в себя МНД по изобретению, имеющих структуру, как определено в формуле (VII) или (VIIa), т.е. Apo-Si-11 и Apo-Si-C4, соответственно.

[0038] Фиг 5A-F: клетки 3T3

на Фиг. 5А представлено полученное под флуоресцентным микроскопом изображение доставки конъюгата, включающего в себя 29-мерную одноцепочечную ДНК (оцДНК) через биологическую мембрану клеток 3Т3, в которых происходит экспрессия белка EGFP (enhanced green fluorescent protein, усиленный зеленый флуоресцентный белок) («клетки 3T3-EGFP») in vitro;

на Фиг. 5В представлены результаты количественной оценки доставки конъюгата, показанной на Фиг. 5А, с помощью проточной цитометрии (метод FACS (Fluorescence-activated cell sorting, сортировка флуоресцентно-активированных клеток). Результаты представлены в виде точечной диаграммы;

на Фиг. 5С представлены результаты количественной оценки доставки конъюгата, показанной на Фиг. 5А, после инкубации в течение 24 часов, полученные с использованием ридера для ELISA (enzyme-linked immune-sorbent analysis, твердофазный иммуноферментный анализ);

на Фиг. 5D представлено полученное под флуоресцентным микроскопом изображение доставки конъюгата, включающего в себя 58-мерную двухцепочечную ДНК (дцДНК) через биологические мембраны клеток 3Т3, в которых происходит экспрессия белка EGFP («клетки 3T3-EGFP») in vitro;

на Фиг. 5E представлены результаты количественной оценки доставки конъюгата, показанной на Фиг. 5D, с помощью проточной цитометрии (FACS): (i) на точечной диаграмме показано количество перенесенных молекул, в процентах; и (ii) на гистограмме показана зависимость «доза - ответ»;

на Фиг. 5F представлено полученное под конфокальным микроскопом изображение доставки конъюгата, данные о которой приведены на Фиг. 5D, по механизму, лежащему в основе изобретения, в эндосомальный компартмент.

[0039] Фиг. 6A-C: клетки мышиной меланомы B16

на Фиг. 6А представлено полученное под флуоресцентным микроскопом изображение доставки конъюгата по изобретению, включающего в себя 58-мерную двухцепочечную ДНК, меченную флуорофором Cy3 («красный») через биологические мембраны клеток меланомы В16 in vitro: (I), (II) - светлое поле, виден контур клеток; (III) - флуоресцентный сигнал от ДНК без МНД; (IV) - флуоресцентный сигнал от конъюгата, содержащего МНД;

на Фиг. 6В представлены результаты количественной оценки доставки конъюгата, показанной на Фиг. 6А, методом проточной цитометрии (зависимость «доза - ответ»);

на Фиг. 6С представлено полученное под конфокальным микроскопом изображение показанной на Фиг. 6А доставки конъюгата, включающего в себя 58-мерную двухцепочечную ДНК, в эндосомальный компартмент клеток В16.

[0040] Фиг. 7: клетки мышиной карциномы кишечника C26

Исследование доставки конъюгата по изобретению, включающего в себя 58-мерную двухцепочечную ДНК, через биологические мембраны клеток С26 in vitro, выполненное методом проточной цитометрии.

[0041] Фиг. 8: клетки HeLa

Исследование доставки конъюгата по изобретению, включающего в себя 58-мерную двухцепочечную ДНК, через биологические мембраны клеток HeLa in vitro, выполненное методом проточной цитометрии. Показана зависимость «доза - ответ»

[0042] На Фиг. 9 представлены результаты сайленсинга гена (ген EGFP), выполненного in vitro в клетках HeLa с использованием конъюгата по изобретению, представляющего собой соответствующую киРНК, сконструированную специально для сайленсинга гена EGFP, связанную с двумя МНД, каждый из которых имеет структуру как определено в формуле (VIIIb); т.е. Apo-Si-W (среднее ± стандартная ошибка среднего (СОС)).

[0043] На Фиг. 10А-Н показан механизм действия (МД) соединения формулы (XVI): на Фиг. 10А представлен интактный конъюгат, находящийся во внеклеточном пространстве; на Фиг. 10В показано расщепление дисульфидной связи в восстановительных условиях цитоплазматической среды; на Фиг. 10С показано депротонирование тиольной группы до тиолатной группы, где протекание процесса зависит от рКа; на Фиг. 10D показана нуклеофильная атака тиолатной группы по карбонильной группе в составе амидной группы; на Фиг. 10Е показано образование тетраэдрического промежуточного соединения; на Фиг. 10F показано последующее расщепление конъюгата с образованием тиоэфира; на Фиг. 10G показан последующий гидролиз; на Фиг. 10Н показано закрытие цикла с образованием дисульфидной группы в окислительных условиях среды внеклеточного пространства в процессе экскреции из организма.

[0044] На Фиг. 11А-Н показан механизм действия (МД) соединения формулы XVI: на Фиг. 11А представлен интактный конъюгат, находящийся во внеклеточном пространстве; на Фиг. 11В показано расщепление дисульфидной связи в восстановительных условиях цитоплазматической среды; на Фиг. 11С показано депротонирование тиольной группы до тиолатной группы, где протекание процесса зависит от рКа; на Фиг. 11D показана нуклеофильная атака тиолатной группы по карбонильной группе, находящейся в составе амидной группы; на Фиг. 11Е показано образование тетраэдрического промежуточного соединения; на Фиг. 11F показано последующее расщепление конъюгата с образованием тиоэфира; на Фиг. 11G показан последующий гидролиз; на Фиг. 11Н показано закрытие цикла с образованием дисульфидной группы в окислительных условиях среды внеклеточного пространства в процессе экскреции из организма.

[0045] На Фиг. 12 приведены результаты сайленсинга генов, выполненного в первичной культуре гепатоцитов трансгенной мыши, экспрессирующих ген EGFP, с применением конъюгата по изобретению, который представляет собой соответствующую киРНК, сконструированную специально для сайленсинга гена EGFP, связанную с двумя МНД Apo-Si-C4 и образующую комплекс с гистоном Н2А за счет нековалентных связей (среднее ± СОС).

[0046] На Фиг. 13А-Н показан механизм действия (МД) соединения формулы (VII), обозначенного как «Apo-Si-X-1»: на Фиг. 13А показан интактный конъюгат, находящийся во внеклеточном пространстве; на Фиг. 13В показано расщепление дисульфидной связи в восстановительных условиях цитоплазматической среды; на Фиг. 13С показано депротонирование тиольной группы до тиолатной группы, где процесс зависит от рКа; на Фиг.13D показана нуклеофильная атака тиолатной группы по карбонильной группе в составе амидной группы; на Фиг. 13Е показано образование тетраэдрического промежуточного соединения; на Фиг. 13F показано последующее расщепление конъюгата с образованием тиоэфира; на Фиг. 13G показан последующий гидролиз, при котором, также, выделяется CO₂; и на Фиг. 13Н показано закрытие цикла с образованием дисульфидной группы в окислительных условиях среды внеклеточного пространства в процессе экскреции МНД из организма.

[0047] На Фиг. 14А-С показано взаимодействие группировок Е по изобретению с фосфолипидными мембранами в исследовании молекулярной динамики (Molecular Dynamics, MD). Фиг. 14А - соединение формулы (VII), обозначенное как «Apo-Si-X-1»; Фиг. 14В - соединение формулы (VII), обозначенное как «Apo-Si-X-2»; и Фиг. 14С - соединение формулы IXb, обозначенное как «Apo-Si-S-S»).

[0048] На Фиг. 15 с помощью компьютерного молекулярного моделирования проиллюстрирован принцип динамического протонирования. Третичная аминогруппа в МНД может быть протонированной и не протонированной, поэтому показана водорастворимая форма молекулы, в которой третичная аминогруппа протонирована (несет положительный заряд) и, следовательно, способна перемещаться в плазме крови или цитоплазме, и нерастворимая в воде форма, в которой атом азота находится в незаряженном состоянии, обеспечивая возможность молекулы перемещаться в толще клеточной мембраны. Скоординированное распределение этих двух форм in vivo может обеспечить, в совокупности, большой объем распределения конъюгата в организме. На Фиг. 15А показана протонированная, положительно заряженная форма молекулы по изобретению, не проникающая в мембрану. На Фиг. 15В показана гидрофобная, не протонированная форма молекулы, которая раздвигает фосфолипидную мембрану и движется вглубь нее.

[0049] На Фиг. 16 показан результат гель-электрофореза, подтверждающий расщепление конъюгата по изобретению формулы (VIIIb) (Apo-Si-W) при взаимодействии с ферментом Dicer, с удалением одного из МНД in vitro.

На Фиг. 17 приведены результаты сайленсинга гена PMP22 в клетках S16 с использованием конъюгата по изобретению, включающего в себя двойную спираль киРНК, 5'-конец каждой цепи которой связан с группировкой E, E' или E'' по изобретению, где каждая из группировок имеет структуру как определено в формуле (IXb), где a = 3, b = 0, и k = 1. Группировка обозначается: «Apo-Si-S-S». В качестве контролей используются необработанные клетки, а также клетки, обработанные киРНК против гена EGFP (но не против PMP22). Как видно, конъюгаты с МНД Apo-Si-S-S эффективно «выключают» экспрессию (осуществляют сайленсинг) гена PMP22 дозозависимым образом: в сравнении с необработанными клетками, при использовании конъюгата в количестве 400 нМ наблюдается 57%-ный сайленсинг, который увеличивается до 66% при применении конъюгата в количестве 600 нМ.

На Фиг. 18 продемонстрирована прямая связь между трансмембранной доставкой конъюгата по изобретению формулы (VIIa) (где a = 2, и k=1; обозначен как «Apo-Si-C4») и дипольным потенциалом мембраны/электрическим полем внутри мембраны (ЭПВМ). (A) Флоретин; исследование методом проточной цитометрии. Предварительное инкубирование клеток с флоретином, который уменьшает дипольный потенциал мембраны, приводит к заметному уменьшению проникновения конъюгата Apo-Si-C4 в клетки. (B) 6-кетохолестанол (6-KX); флуоресцентная микроскопия. Предварительное инкубирование клеток с 6-КХ, который увеличивает дипольный потенциал мембраны, приводит к заметному увеличению проникновения конъюгата Apo-Si-C4 в клетки (определено по флуоресценции Cy3). Вероятность того, что наблюдаемые эффекты обусловлены разницей в соответствующем числе клеток, была исключена после подсчета числа клеток в поле зрения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0050] Данное изобретение относится, среди прочего, к новому инновационному использованию открытого в последнее время электрического поля внутри мембраны (ЭПВМ), создаваемого дипольным потенциалом мембраны, в разных областях, таких как медицина, биология и сельское хозяйство.

[0051] В одном важном аспекте, изобретение относится к ЭПВМ-субстрату, представляющему собой химическую группировку, которая, будучи связанной с лекарственным веществом, улучшает доставку этого лекарственного вещества через биологические фосфолипидные мембраны в клетки, причем эффект зависит от ЭПВМ/дипольного потенциала мембраны.

[0052] Флоретин является химическим соединением, уменьшающим ЭПВМ, поэтому его можно использовать для оценки зависимости движения конкретного вещества от дипольного потенциала мембраны/ЭПВМ. Следовательно, при реализации настоящего изобретения на практике, ЭПВМ-субстратом является химическое соединение, доставка которого через клеточные мембраны в присутствии флоретина снижена более чем на 50, 60, 70, 80 или 90% по сравнению с его доставкой в отсутствие флоретина.

[0053] Еще в одном воплощении изобретения, ЭПВМ-субстрат представляет собой новый рационально сконструированный «молекулярный нанодвигатель» (МНД), который способен использовать ЭПВМ для доставки лекарственных веществ через биологические мембраны. С этой целью МНД могут конвертировать электростатическую энергию ЭПВМ в кинетическую энергию, позволяющую преодолевать зачастую очень высокий энергетический барьер, имеющий место при доставке химических соединений, таких как макромолекулы лекарственных веществ, через биологические барьеры, представляющие собой фосфолипидные мембраны.

[0054] Согласно еще одному аспекту, изобретение основано на сделанном авторами изобретения открытии: проникновение конъюгатов, содержащих группировку как определено в формулах (I)-(XId), через биологические мембраны можно существенно ингибировать или увеличивать путем фармакологического «выключения» (например, с помощью флоретина (100-1000 мкМ)) или «включения» (например, с помощью 6-кетохолестанола (10-100 мкМ)), соответственно, электрического поля внутри мембраны. Это свидетельствует о прямой зависимости проникновения конъюгатов формулы (I)-(XId) по изобретению через мембраны от электрического поля внутри мембраны, создаваемого дипольным потенциалом мембраны. Соответственно, все соединения формулы (I)-(XId) могут считаться ЭПВМ-субстратами.

[0055] Доставляемые с использованием МНД лекарственные вещества могут быть как низкомолекулярными веществами, так и макромолекулами, например, пептидами, белками или олигонуклеотидами (например, одноцепочечными или двухцепочечными, РНК или ДНК). Еще в одном воплощении изобретения доставляемые макромолекулы включают цепи РНК, предназначенные для сайленсинга генов, например, киРНК (короткие интерферирующие РНК), либо последовательности ДНК, предназначенные для использования в качестве антисмысловых олигонуклеотидов (АСО).

[0056] Другие воплощения изобретения представляют собой новые конъюгаты, включающие в себя систему доставки лекарственных веществ через биологические мембраны в цитоплазму либо через биологические барьеры, например, гематоэнцефалический (ГЭБ), гематоофтальмический барьер (ГОБ) и плацентарный барьер (гемато-плацентарный барьер).

[0057] В других воплощениях, соединения по изобретению содержат новые «молекулярные нанодвигатели» (МНД), рационально сконструированные так, чтобы конвертировать электростатическую энергию дипольного потенциала мембраны в кинетическую энергию и использовать ее для преодоления зачастую очень высокого энергетического барьера, имеющего место при доставке химических соединений, таких как макромолекулы лекарственных веществ, через биологические барьеры, например через фосфолипидные мембраны. Ткаое применение может подразумевать, среди прочего, движение МНД, связанного с транспортируемым лекарственным веществом, внутри фосфолипидных мембран, от поверхности раздела мембрана-вода в центральную зону мембраны, за счет электрического поля внутри мембраны (ЭПВМ), создаваемого дипольным потенциалом мембраны. Присоединенная к лекарственному веществу, такая система доставки перемещает его в центральную зону мембраны, способствуя прохождению лекарственного вещества сквозь мембрану. Эта система доставки, среди прочего, предназначена для доставки макромолекул лекарств: белков или олигонуклеотидов, причем последние могут представлять собой одноцепочечные либо двухцепочечные ДНК либо РНК. В частности, такая система доставки предназначена для доставки антисмысловых олигуонуклеотидов (АСО), киРНК или лекарственных белков, например, но без ограниения им, белка Cas9, а также антител.

[0058] Одним из основных принципов, лежащих в основе создания структур МНД по изобретению, является описываемый далее, но без ограничения им, принцип «ассиметричной полярности». Авторы изобретения разработали этот принцип в качестве инструмента, обеспечивающего перемещение больших и заряженных молекул, которые потенциально могут быть использованы, в толще фосфолипидных мембран, от поверхности мембраны в ее центральную зону, что происходит за счет энергии внутримембранного электрического поля и позволяет преодолеть соответствующий энергетический барьер. В настоящем изобретении принцип «ассиметричной полярности» воплощен в определенных молекулярных структурах. Т.е. эти молекулярные структуры предназначены для трансформации электростатической потенциальной энергии дипольного потенциала мембраны в кинетическую энергию молекул, перемещающихся в толще мембраны. Относительно структуры: упомянутые молекулы рационально сконструированы авторами изобретения таким образом, что являются гидрофобными и незаряженными, и это позволяет им, в соответствии с logP, проникать в биологические мембраны [например, значение logP молекул - больше 1 (без ограничения этим) (см. Фиг. 1А)]. Вместе с тем, важным аспектом принципа «ассиметричной полярности» является то, что упомянутые молекулы полярны, при этом частичные заряды распределены в них по-разному: частичный отрицательный заряд сильно сконцентрирован и локализован, а частичный положительный заряд распределен по углеводородным цепям в пределах молекулы. Эти частичные положительные заряды не проявляются и при взаимодействии молекулы с фосфолипидной мембраной, ввиду гидрофобных взаимодействий лондоновского типа, имеющих место между углеводородными цепями молекулы и ближайшими углеводородными цепями фосфолипидной среды (лондоновские дисперсионные силы). Эти факторы «ассиметричной полярности», когда молекула является гидрофобной, но полярной, имея сконцентрированный частичный отрицательный заряд, в то время как частичный положительный заряд рассеян и не проявляется, обеспечивают перемещение молекулы в гидрофобной среде внутри мембраны так, как будто молекула формально является отрицательно заряженной (см. Фиг. 1А). Электрическое поле внутри мембраны имеет отрицательный полюс, находящийся на поверхности раздела мембрана-вода, и положительный полюс - в центральной зоне мембраны, поэтому молекулы по изобретению перемещаются к центральной зоне мембраны. И если они связаны с транспортируемым лекарственным веществом (например, киРНК, АСО, лекарственным белком, антителом или другим лекарственным средством), они тянут его в этом направлении - в толщу мембраны. Описанное перемещение может способствовать передвижению транспортируемого белка через мембрану за счет нескольких факторов. В частности, заряженная молекула может быть принудительно приближена к головкам фосфолипидов (phoslholipid head-groups, PLHG), это нарушит стабильность гидратных оболочек вокруг PLHG и, таким образом, заставит PLHG сдвигаться в латеральном направлении. Очаг нестабильности мембраны может запустить эндоцитоз и проникновение лекарственного вещества в слои мембранных фосфолипидов. Оба этих процесса обеспечивают поступление лекарственного вещества внутрь клетки (Фиг.2).

[0059] Конъюгаты по изобретению, также, могут включать в себя компоненты, улучшающие результат (performance enhancing moieties, PEM). Эти компоненты представляют собой химические группы или механизмы, способствующие увеличению концентрации лекарственного вещества или его активной(-ых) группировки(-ок) в нужном месте внутри клеток.

[0060] Один из методов, улучшающих результат (РЕМ), предполагает включение в структуру конъюгатов по изобретению расщепляемых групп [группировки Q₁ и Q₂, как они определены в формуле (I)]. В контексте настоящего изобретения термин «расщепляемая группа» обозначает химическую группировку, которая может расщепляться, спонтанно или с участием ферментов, в определенных физиологических условиях, например, при изменении рН либо окислительно-восстановительных или других условий внутри клетки. Примерами расщепляемой группы являются дисульфидная группа, дилактон, сложноэфирная группа, тиоэфирная группа, амидная группа, карбаматная группа, рН-чувствительная группировка и редокс-чувствительная группировка. В результате расщепления конъюгата по изобретению в этих местах, транспортируемое лекарственное средство (например, несущая большой отрицательный заряд киРНК или АСО либо другое лекарственное средство) может остаться в цитоплазме клетки-мишени. Кроме того, продолжающееся поглощение конъюгата и его расщепление может также обеспечить градиент концентрации, способствующий передвижению конъюгата через плазматические или эндосомальные мембраны. В настоящем изобретении к РЕМ, основанным на использовании расщепляемых групп, относятся, без ограничения ими, дисульфиды, карбаматы и дилактоны.

[0061] В качестве другого воплощения компонента, улучшающего результат (РЕМ), предложено введение конъюгата, в котором D представляет собой двухцепочечную РНК, являющуюся субстратом для белка Dicer. Обычно такие конъюгаты содержат 23-30-мерную двухцепочечную РНК, выбранную в соответствии с генетическим кодом и подходящую для сайленсинга конкретного целевого гена. Dicer является уникальной нуклеазой, способной расщеплять двухцепочечные РНК по определенным сайтам, в результате чего образуются 21-23-мерные двухцепочечные сегменты РНК, готовые к взаимодействию с комплексом RISC для осуществления сайленсинга гена. Этот подход предполагает, что с 3'-концом и/или 5'-концом смысловой цепи (цепи-«спутника») и/или 5'-концом антисмысловой цепи («ведущей») этого лекарственного вещества-олигонуклеотида может быть соединен один или несколько МНД. После введения конъюгата МНД смогут осуществить трансмембранную доставку упомянутой макромолекулы лекарственного вещества. При последующем расщеплении двухцепочечной РНК с участием фермента Dicer в цитоплазме, МНД будут удалены с 5'-конца ведущей цепи, и киРНК таким образом высвободится из системы доставки. Поскольку киРНК несет многочисленные отрицательные заряды, она неизбежно останется в цитоплазме, где вступит во взаимодействие с комплексом RISC, результатом чего станет сайленсинг гена. Механизм удержания молекулы внутри клетки, опосредуемый Dicer, схематически показан на Фиг. 3.

[0062] Важно отметить, что, согласно изобретению, предложен еще один, инновационный метод, улучшающий результат, - основанный на концепции «динамического протонирования». Эта концепция предполагает включение в структуру молекулы основной группы (например, аминогруппы) с рКа 7,0-8,5. Метод основан на том, что у основной молекулы, как известно, рН на поверхности примерно на 1 единицу рН меньше чем внутри. С учетом уравнения Гендерсона-Гассельбаха, это означает наличие двух популяций молекул: молекулы одной популяции протонированы и, следовательно, гидрофобны и растворимы в водных средах, таких как плазма или цитоплазма, а молекулы второй популяции являются гидрофобными, непротонированными и взаимодействуют с мембранами клеток и эндосом. Таким образом, испльзование принципа динамического протонирования в конъюгатах по изобретению делает их «амфибиями», способными перемещаться как в гидрофильных, так и в гидрофобных средах, обеспечивая, в итоге, большой объем распределения конъюгата в организме, при этом конъюгат проникает через клеточные мембраны в цитоплазму и выходит из эндосомального компартмента в цитоплазму, как требуется от эффективной системы, предназначенной для системной генной доставки (пример 17, Фиг. 15). Соответственно, изобретение включает в себя группировку E, E' или E'', содержащую «группировку динамического протонирования», в состав которой входят: (i) аминогруппа, расположенная между отрицательным и положительным полюсом МНД; и (ii) группы, оттягивающие на себя электроны, расположенные по бокам от этой аминогруппы, в результате чего ее рКа составляет 7,0-8,5 единиц рН. Примерами групп, оттягивающих на себя электроны, являются карбонильная группа, простая эфирная группа, сложноэфирная группа и фторзамещенные углеводородные группы.

[0063] Термин «группа-инициатор» в контексте настоящего изобретения относится к химической группе, которая, вступая в химические реакции, спонтанные или катализируемые ферментом, инициирует расщепление соседней химической связи. В более конкретных воплощениях изобретения, группа инициатор выбрана из C₄-, C₅- или C₆-1,2-дитиоциклоалкила (1,2-дитиоциклобутана; 1,2-дитиоциклопентана; 1,2-дитиоциклогексана и 1,2-дитиоциклогептана); γ-лактама (внутренний амид, содержащий 5 атомов в цикле), δ-лактама (внутренний амид, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-лактама (внутренний амид, содержащий 7 атомов в цикле), γ-бутиролактона (внутренний эфир, содержащий 5 атомов в цикле), δ-валеролактона (внутренний эфир, содержащий 6 атомов в цикле) и ε-капролактона (внутренний эфир, содержащий 7 атомов в цикле).

[0064] Термин «активированный эфир» в контексте данного изобретения относится к производному карбоновой кислоты, имеющему хорошую уходящую группу, способному за счет этого к взаимодействию с аминами с образованием амидов. Примером активирующего агента, применительно к карбоновой кислоте, является N-гидроксисукцинимид (N-hydroxysuccinimide, NHS).

[0065] Термин «лиганд металлохелата» в контексте настоящего изобретения относится к химической группировке, образующей комплекс с ионом металла посредством координационных связей, при этом со стороны лиганда в координационных связях могут участвовать атомы азота, серы и кислорода. В предпочтительном воплощении, ион(-ы), включенный(-е) в металлохелат, представляет(-ют) собой кальций (Ca⁺²), соединенный координационными связями с атомами азота и кислорода в лиганде. В другом воплощении изобретения, лиганд металлохелата представляет собой BAPTA (1,2-бис(o-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота), EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота) или их аналог, поскольку обладает выгодной селективностью в отношении Ca⁺² по сравнению с другими ионами, например Mg⁺². Такие лиганды позволяют задействовать значительный градиент концентрации ионов Ca⁺², существующий между внеклеточным пространством и цитозолем, для потенциального отделения МНД от транспортируемого лекарственного вещества с удержанием и накоплением целевого лекарственного вещества в цитоплазме.

[0066] В контексте изобретения «гетероалкил», «гетероалкилен» и «гетероарил» относятся к соответствующим углеводородным структурам, в которых по меньшей мере один атом заменен на атом(ы) азота, кислорода или серы, или любые их комбинации.

[0067] В одном из воплощений изобретения «транспортируемый груз», или «транспортируемое лекарственное вещество», представляет собой киРНК, АСО, лекарственный белок или любое другое лекарственное средство, доставляемое через клеточные мембраны и в клетки. Упомянутые клетки могут находиться либо в культуре клеток, либо в организме живого животного или человека, и целью этой доставки является оказание полезного терапевтического эффекта.

[0068] Термин «предшественник» в контексте данного изобретения относится к химической группировке, используемой в синтезе конъюгатов по изобретению. Молекула предшественника содержит химические группы, которые должны удаляться на разных стадиях синтеза конъюгата, например, но не ограничиваясь этим, при присоединении макромолекулы, например олигонуклеотида, к МНД по изобретению.

[0069] Область белковых лекарственных средств внутриклеточного назначения (Protein Drugs for Intracellular Targets, PDIT) - относительно новая. Она получила развитие, в частности, после завершения проекта по определению последовательности генома человека, и позволяет определить множество новых внутриклеточных целей, которые могут быть объектом потенциального медицинского вмешательства путем введения белковых лекарственных средств, сайленсинга генов, редактирования РНК или ДНК или заместительной белковой терапии. Теоретически, такие терапевтические стратегии могут применяться для лечения практически любого заболевания. К конкретным белкам, которые представляют большой интерес в области PDIT, относятся белки на основе CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (короткие палиндромные повторы, расположенные группами на одинаковом расстоянии друг от друга)), и, в частности, белок Cas9. На практике, к Cas9 можно присоединить любую последовательность РНК, способствующую его направленной доставке к конкретному локусу в геноме и рационально выбранную в соответствии с потенциальным действием этого белка в отношении мутантного, дефектного гена. После этого Cas9 индуцирует аккуратное разрезание двойной цепи ДНК. Затем могут начать действовать естественные механизмы репарации ДНК, приводящие к репарации указанного локуса ДНК в этом гене с нарушенным функционированием. Таким образом, Cas9 и аналогичные белки могут очень эффективно выполнять редактирование генов (путем наращивания, нарушения или изменения последовательности конкретных генов), а также регуляцию и репарацию генов, приемлемую для живых организмов на протяжении жизни. Соответственно, доставка Cas9 и подходящей ведущей РНК в клетку может обеспечить разрезание генома организма в любом интересующем месте с последующей его коррекцией и репарацией.

[0070] Как проиллюстрировано ниже (см. пример 4), в одном из воплощений изобретение включает в себя один или более чем один «молекулярный нанодвигатель» (МНД), соединенный с белком Cas9, потенциально участвующим в коррекции ДНК или РНК. В другом воплощении, изобретение относится к лекарственному белку, вводимому в качестве средства заместительной терапии. Такая заместительная терапия может требоваться при лечении заболевания, при котором имеет место снижение уровней физиологически важного белка в связи с дефицитом или мутацией последнего. Поскольку белки представляют собой заряженные макромолекулы, их трансмембранная доставка часто невозможна без конъюгации их с системой доставки, такой как МНД по изобретению.

[0071] МНД по изобретению обычно представляют собой гидрофобные химические группировки [например, имеющие коэффициент распределения октанол/вода (logP) больше1], которые являются биполярными и незаряженными, сконструированными в соответствии с принципом ассиметричной полярности (изложен выше). Как обсуждается выше, этот уникальный набор свойств МНД (т.е. гидрофобность, нейтральный заряд группировки в целом, но при этом сконцентрированные частичные отрицательные заряды и рассеянные частичные положительные заряды) создает уникальную векторную систему, которая, при помещении ее в электрическое поле внутри мембраны, способна перемещаться в фосфолипидной среде от поверхности раздела мембрана-вода в центральную зону мембраны. Если такая молекула связана с лекарственным веществом, она, соответственно, тянет его вглубь мембраны.

[0072] Как схематически показано на Фиг. 1B, конъюгаты по изобретению обычно содержат описанный выше «молекулярный(-е) нанодвигатель(-и)» (МНД), представляющий собой группировку E, E' или E'' [например, группировку, как определено в любой из формул VII-Xia]. «Молекулярный нанодвигатель» (МНД) является гидрофобной группировкой (коэффициент распределения октанол/вода - больше 1), включающую в себя следующие структурные мотивы:

(i) отрицательный полюс (группа А в группировке E, E' или E''), обычно содержащий по меньшей мере один электроотрицательный атом, выбранный из галогена [например, атом(-ы) фтора] и кислорода, который может быть сконцентрирован в пространстве в форме сферы (или почти сферы). Благодаря способности указанных атомов оттягивать на себя электроны, отрицательный полюс конъюгата имеет большую концентрацию электронов. В предпочтительном воплощении, А представляет собой остаток нонафтор-трет-бутанола.

(ii) положительный полюс (группа В в группировке E, E' или E''), содержащий относительно электроположительные атомы, выбранные из атомов углерода, кремния, бора, фосфора и серы и расположенные таким образом, чтобы, после попадания молекулы в фосфолипидную мембрану, было обеспечено максимальное взаимодействие этих атомов с находящимися рядом углеводородными цепями, предпочтительно, за счет их размещения в алифатической или ароматической структуре, состоящей из линейных, разветвлённых или циклических цепей либо их комбинаций. В предпочтительном воплощении изобретения, положительный полюс включает в себя линейную(-ые), насыщенную(-ые) углеводородную(-ые) цепь(-и) или стероидную группировку, например, холестерин, желчные кислоты, эстрадиол, эстриол либо их производные или комбинации. Конъюгат по изобретению может иметь несколько структурных мотивов, представляющих собой отрицательные и/или положительные полюса, например, последовательно расположенные перфтор-группы и атомы кислорода, разделенные углеводородными цепями, как проиллюстрировано любой из формул I-XId.

[0073] Помимо «молекулярного(-ых) нанодвигателя(-ей)» (МНД) и лекарственного вещества D, конъюгат по изобретению может также включать в себя одну или более чем одну связывающую группу (L) и расщепляемую группу (Q), как описано в соответствующих структурных формулах, характеризующих данное изобретение. Лекарственное вещество D может быть связано с молекулярным(-и) нанодвигателем(-ями) (МНД) E, E' или E'' непосредственно либо через группировку L или Q, ковалентными либо нековалентными связями, например, основанными на электростатических или координационных взаимодействиях.

[0074] К вышесказанному следует добавить, что МНД по изобретению может быть входить в состав фармацевтической композиции, в дополнение к действующему веществу. Поскольку МНД увеличивает взаимодействие с мембранами, включение его в композицию может повысить эффективность и безопасность применения действующего вещества.

[0075] Другие воплощения изобретения относятся к применению конъюгатов по изобретению, содержащих лекарственные вещества, например белки или олигонуклеотиды (в частности, киРНК или АСО), для лечения заболеваний у нуждающегося в этом индивида. Указанные заболевания могут представлять собой (не ограничиваясь этими примерами) дегенеративные заболевания, рак, травму, нарушение, вызванное токсинами, ишемический инсульт, инфекции или иммуноопосредованные заболевания, в этиологию или патогенез которых вовлечен(-ы) определенный(-е) белок(-ки), и при которых модуляция экспрессии соответствующих генов с помощью киРНК или с применением антисмысловых механизмов либо модуляция активности соответствующего белка с помощью лекарственного белка или антитела или путем заместительной белковой терапии может оказать положительный эффект, заключающийся в торможении патологических процессов или лечении основного заболевания.

[0076] Например, конъюгаты по изобретению можно использовать для антисмысловой терапии - лечения, при котором вводят молекулы одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК или химического аналога), связывающейся с последовательностью ДНК, кодирующей конкретный белок, либо с соответствующей матричной РНК (мРНК), при трансляции которой образуется белок. Результатом такого лечения может быть угнетение экспрессии соответствующего гена и, как следствие, предотвращение продукции указанного белка. Или же конъюгаты по изобретению могут включать в себя лекарственные белки, например, белок Cas9.

[0077] Термины «лекарственное вещество» и «лекарственное средство» в контексте данного изобретения относятся к химическому соединению, которое, после введения его пациенту, имеющему заболевание, способно дать у этого пациента полезный эффект. Полезный эффект может выражаться в уменьшении симптомов или в противодействии эффекту агента или вещества, вовлеченного в патогенез этого заболевания. Лекарственное вещество может включать в себя небольшую молекулу или макромолекулу, такую как белок или одно- или двухцепочечная РНК либо ДНК, которую вводят для ингибирования экспрессии гена. В частности, лекарственное вещество может включать в себя киРНК или АСО. В некоторых воплощениях изобретения, лекарственное вещество предназначено для лечения дегенеративных заболеваний, рака, ишемического инсульта, инфекции, нарушения, вызванного токсинами, или иммуноопосредованных расстройств.

[0078] Применительно к данному изобретению, под «биологической мембраной» понимается любая фосфолипидная мембрана, относящаяся к биологической системе. Примерами фосфолипидных мембран являются плазматическая мембрана клеток, межклеточная мембрана и биологические барьеры, например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), гематоофтальмический барьер (ГОБ) и плацентарный барьер.

Также, согласно изобретению, предложены конъюгаты, содержащие МНД по изобретению и лекарственное вещество. Далее, согласно изобретению, предложены фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты по изобретению, описанные здесь, и фармацевтически приемлемый(-ые) носитель(-и) или соль(-и).

В других воплощениях, изобретение представляет собой конъюгаты по изобретению или фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты по изобретению, для применения в лечении заболеваний у пациента, нуждающегося в таком лечении. В других воплощениях, изобретение относится к применению конъюгатов по изобретению для приготовления фармацевтических композиций, предназначенных для лечения заболеваний у нуждающегося в этом пациента. В еще одном воплощении, заболевание представляет собой рак.

[0079] Еще в одном воплощении, конъюгаты и фармацевтические композиции по изобретению могут применяться для обеспечения эффективной доставки и достижения полезного результата заместительной белковой терапии или генотерапии [например (не ограничиваясь этим) при использовании киРНК или антисмысловой терапии (АСО)] in vivo в условиях клиники.

[0080] Конъгат по изобретению может быть полезен для улучшения доставки киРНК, АСО, лекарственного белка или антитела через клеточные мембраны или биологические барьеры, например гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), с целью улучшения результата применения макромолекулярного лекарственного средства в одном или более чем одном аспекте, например, в аспекте эффективности, токсичности или фармакокинетики.

[0081] Еще в одном воплощении изобретения, лекарственное вещество представляет собой макромолекулу, выбранную из группы, состоящей из киРНК, АСО и лекарственного белка.

[0082] Согласно еще одному воплощению изобретения, предложен конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемая соль или носитель.

[0083] Согласно еще одному воплощению изобретения, предложен способ доставки лекарственного вещества в биологические клетки, находящиеся либо в культуре клеток, либо в организме живого животного или человека, при котором эти клетки приводят в контакт с конъюгатом по изобретению.

[0084] Согласно еще одному воплощению изобретения, в предложенном способе биологическая мембрана выбрана из группы, состоящей из клеточных мембран и биологических барьеров, где биологические барьеры выбраны из гематоэнцефалического барьера, гематоофтальмического барьера и плацентарного барьера.

[0085] Как упомянуто выше при описании потенциального механизма действия (МД), которым изобретение не ограничивается, в результате взаимодействия конъюгатов по изобретению, содержащих лекарственное вещество, например киРНК или лекарственный белок, которое связано с МНД, с фосфолипидной мембраной обеспечивается их трансмембранная доставка. Упомянутый механизм действия схематично изображен на Фиг. 2. Ввиду асимметричной полярности, МНД сначала движется от поверхности мембраны вглубь ее за счет энергии электрического поля внутри мембраны (Фиг. 2A). На втором этапе (Фиг. 2В) макромолекула, которую тянет связанный с ней МНД, приближается к поверхности мембраны, в результате чего нарушается стабильность гидратных оболочек как у этой транспортируемой макромолекулы лекарственного вещества, так и у фосфолипидных головок. В результате, головки фосфолипидов сдвигаются в латеральном направлении с образованием в мембране временных пор, через которые макромолекула лекарственно вещества проходит внутрь клетки. После этого временные поры закрываются, и целостность мембранной оболочки восстанавливается, что является энергетически выгодным (Фиг. 2С).

[0086] Конъюгаты по изобретению имеют структуру общей формулы (I):

включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (I), а также сольваты и гидраты указанных солей, где D представляет собой лекарственное вещество, которое требуется доставить через биологические мембраны. D может представлять собой низкомолекулярное лекарственное вещество, пептид, белок, природную либо модифицированную, одноцепочечную или двухцепочечную ДНК или РНК, например киРНК или АСО; символы y, z и w - каждый - обозначает целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6, при этом, если а представляет собой 0, это означает, что соответствующая группировка E отсутствует; и где по меньшей мере один из y, z и w отличается от 0. Еще в одном воплощении изобретения y = 1, z = o, и w = 0; в другом воплощении изобретения y = 1, z = 1, и w = 0.

[0087] Группировки E, E' и E'' могут быть одинаковыми или разными, при этом каждая имеет структуру формулы (II):

(A)_a-B-L₁-Q₁-L₂-Q₂-L₃

формула (II)

где каждая группировка А независимо выбрана из структур формулы (III), (IV), (V) и (VI):

М отсутствует либо выбрано из -O- и -CH₂-; и символы g, h и k, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16; * обозначает -H или место связи с В или другой группой А; а обозначает целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; Q представляет собой кислород или аминогруппу.

где B (положительный полюс как описано выше) выбрано из одной или более групп, состоящих из следующего: линейный, циклический или разветвлённый C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкил или гетероалкил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

линейный, циклический или разветвлённый C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкилен или гетероалкилен, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ арил или гетероарил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связан с простой эфирной группой, сложноэфирной группой или амидной группой;

одна или более чем одна стероидная группировка (например, холестерин, желчная кислота, эстроген, эстрадиол, эстриол, литохолевая кислота и любые их аналоги), каждая из которых возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо возможно связана с простой эфирной группой, сложноэфирной группой, аминогруппой или амидной группой; и любые их комбинации;

Q₁ и Q₂, каждая, представляет собой возможную расщепляемую группу, которая, независимо, либо отсутствует, либо выбрана из сложноэфирной группы, тиоэфирной группы, амидной группы [например, -C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-], карбаматной группы [например, -O-C(=O)-NH- или -NH-C(=O)-O-], мочевины [-NH-C(=O)-NH-], дисульфидной группы [-(S-S)-], простой эфирной группы [-O-], аминогруппы, имидазола, триазола, дилактона, рН-чувствительной группировки, редокс-чувствительной группировки, лиганда металлохелата, включающего ион этого металла, а также любых их комбинаций;

L₁, L₂ и L₃, каждая независимо, либо отсутствует, либо выбрана из группы, состоящей из следующего:

линейный, циклический или разветвленный C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкил или гетероалкил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

линейный, циклический или разветвленный C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ алкилен или гетероалкилен, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁, C₁₂, C₁₃ или C₁₄ арил или гетероарил, каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой;

-(O-CH₂-CH₂)_u-, где каждая группировка возможно замещена одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой;

нуклеозид, нуклеотид, имидазол, азид, ацетилен и любые их комбинации, где каждый возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой, либо связан с простой эфирной группой; и где u обозначает целое число: 1, 2, 3, 4 или 5.

где по меньшей мере одна из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не является отсутствующей, и каждая из Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ может включать в себя группировку T, представляющую собой группу-инициатор, выбранную из C₄-, C₅- или C₆-1,2-дитиоциклоалкила (1,2-дитиоциклобутана; 1,2-дитиоциклопентана; 1,2-дитиоциклогексана и 1,2-дитиоциклогептана); γ-лактама (внутренний амид, содержащий 5 атомов в цикле), δ-лактама (внутренний амид, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-лактама (внутренний амид, содержащий 7 атомов в цикле), γ-бутиролактона (внутренний эфир, содержащий 5 атомов в цикле), δ-валеролактона (внутренний эфир, содержащий 6 атомов в цикле) или ε-капролактона (внутренний эфир, содержащий 7 атомов в цикле), каждый из которых возможно замещен одним или более чем одним галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой либо связан с простой эфирной группой;

где по меньшей мере одна из группировок B, Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ связана с лекарственным веществом (D) в соответствии с формулой (I).

[0088] Еще в одном воплощении изобретения, по меньшей мере, две из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не являются отсутствующими.

[0089] Еще в одном воплощении изобретения, по меньшей, три из группировок Q₁, Q₂, L₁, L₂ и L₃ не являются отсутствующими.

[0090] D может быть связано с другими группировками в молекуле посредством ковалентных связей, электростатических взаимодействий или координационных связей. D может быть связано ковалентной связью через группировку Q₁ или Q₂, каждая из которых выбрана из группы, состоящей из простой эфирной группы, сложноэфирной группы, амидной группы, простой тиоэфирной группы, сложной тиоэфирной группы и карбаматной группы. Координационная связь предполагает наличие группировки Q₁ или Q₂, представляющей собой лиганд металлохелата, и координационные взаимодействия, преимущественно, с ионом(-ами) кальция. Примером электростатического взаимодействия может быть солевой «мостик» между аминогруппами группировки L₁, L₂ или L₃ в составе E, E' или E” и отрицательно заряженными фосфатными группами в молекуле D. Если D представляет собой нуклеотид, он может быть связан по основанию нуклеотида, по остатку рибозы (например, по положению 2', 3' или 5' рибозы) или по фосфатной группе нуклеотида; связь может быть образована по терминальному или не терминальному нуклеотиду олигонуклеотидной цепи; также, связь может быть образована по природному или модифицированному нуклеотиду. Если D является белком, он может быть связан с другими группировками молекулы через боковые цепи остатков аминокислот в этом белке, например, через лизин, цистеин, глутамат или аспартат.

[0091] Термин «олигонуклеотид» в контексте настоящего изобретения может относиться к молекулам ДНК или РНК, каждая из которых может быть одноцепочечной или двухцепочечной последовательностью, состоящей из одного или более чем одного нуклеотида. В состав каждого нуклеотида входит азотистое основание (основание нуклеотида), остаток сахара, содержащий пять атомов углерода (рибоза или дезоксирибоза) и фосфатная группа. Основания нуклеотидов выбраны из пуринов (аденин и гуанин) и пиримидинов (тимин, цитозин и урацил). Упомянутый термин может также относиться к модифицированным нуклеотидам, где модифицированным может быть либо скелет молекулы (например, он будет представлять собой тиофосфат или пептидную нуклеиновую кислоту) или основание нуклеотида (например, посредством метилирования по положению 2' рибозы в РНК или за счет присоединения атомов фтора по этому положению). Данные модификации могут придать олигонуклеотиду определенные свойства, например, увеличить его стабильность или улучшить фармакокинетику в жидких средах организма. Соответственно, применение указанных модифицированных олигонуклеотидов также входит в объем изобретения.

[0092] Еще в одном воплощении, изобретение относится к способу специфичного подавления экспрессии гена in vitro либо in vivo. В данном способе используют конъюгат по изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую такой конъюгат, где D представляет собой киРНК или АСО, предназначенный для подавления экспрессии определенного гена, кодирующего патогенный белок, вовлеченный в этиологию или патогенез заболевания.

[0093] Соответственно, конъюгаты по изобретению могут применяться для лечения заболевания. Таким образом, согласно изобретению, предложен также способ лечения, при котором пациенту, нуждающемуся в этом, вводят терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции по изобретению. Еще в одном воплощении изобретения, вводимая фармацевтическая композиция может содержать киРНК или антисмысловой олигонуклетид, способный подавлять экспрессию определенного гена, кодирующего белок, вовлеченный в механизм заболевания.

[0094] В качестве еще одного воплощении изобретения, предложены конъюгаты общей формулы (I), где группировка E, E' или E'' имеет структуру как определено в общей формуле (VII), и родственные структуры:

формула (VII)

U отсутствует или выбрано из группы, состоящей из -O-, сложноэфирной группы, амидной группы и аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); L₁, L₂, L_3, Q₁, Q₂ имеют те же значения, что и в формуле (I); R и R', каждый независимо, выбран из водорода, галогена, гидроксильной группы, метоксигруппы и фторзамещенной углеводородной группы; W и G, каждая независимо, либо отсутствует, либо выбрана из кислорода, сложноэфирной группы, амидной группы и аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); символы k и d, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из нуля, 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и группировка E, E' и E'' связана с D, где D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I); включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (VII) или соответствующих аналогов, а также сольваты и гидраты солей.

[0095] Еще в одном воплощении изобретения R или R', каждый независимо, выбран из водорода и атома фтора.

[0096] Еще в одном воплощении изобретения, группировка эстрадиола замещена другим стероидным остатком. Указанный стероидный остаток может представлять собой остаток холестерина, литохолевой кислоты или их аналога.

[0097] Еще в одном воплощении изобретения, L₁, L₂ и L₃, каждая независимо, отсутствует либо выбрана из линейной, циклической или разветвленной C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇ или C₈ углеводородной цепи, возможно связанной с простой эфирной группой или аминогруппой; при этом L₁, L₂ и L₃ могут быть одинаковыми или разными.

[0098] Еще в одном воплощении изобретения, Q₁ или Q₂ представляет собой группировку, выбранную из амидной группы, сложноэфирной группы, простой эфирной группы, карбаматной группы или дисульфидной группы.

[0099] Еще в одном воплощении изобретения, L₁, L₂ или L₃ содержит группировку Т, которая представляет собой 1,2-дитиоциклобутан, возможно замещенный галогеном, гидроксильной группой, метоксигруппой, фторзамещенным углеводородом, аминогруппой или тиольной группой.

[00100] В соответствии с еще одним, более конкретным воплощением изобретения, предложен конъюгат общей формулы (I) или формулы (VII), где E, E' или E'' имеет структуру как определено в формуле (VIIa):

формула (VIIa)

где символы a и k, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (VIIa) или его аналогов, а также сольваты и гидраты указанных солей.

[00101] В соответствии с другими воплощениями изобретения, предложены конъюгаты, описанные ниже.

[00102] Класс А: конъюгаты формулы (I) и (VII), где E, E' или E'' включает в себя «группировки динамического протонирования»

Согласно изобретению, предложены конъюгаты общей формулы (I) или (VII), содержащие МНД, где группировка E, E' или E'' может включать в себя «группировку динамического протонирования», упомянутую выше, которая состоит из: (i) аминогруппы, расположенной между отрицательным и положительным полюсом МНД; и (ii) групп, оттягивающих на себя электроны, расположенных по бокам от этой аминогруппы и обеспечивающих значение рКа этой аминогруппы в диапазоне 7,0-8,5 единиц рН. Примерами таких расположенных по бокам групп, оттягивающих на себя электроны, являются: карбонильная группа, простая эфирная группа, сложноэфирная группа и фторзамещенная углеводородная группа. Каждая из группировок E, E' и E'' может иметь структуру как определено в формуле (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg) или (IXh), включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, и металлохелаты, а также сольваты и гидраты указанных солей; при этом D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I); L₃ имеет те же значения, что и в формуле (I); символы a, k и d, при наличии и каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и R''' выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

формула (VIIIa)

формула (VIIIb); когда a = 2, и L₃ отсутствует, обозначается: «Apo-Si-W»

формула (VIIIc)

формула (VIIId)

формула (VIIIe)

формула (VIIIf)

формула (VIIIg)

формула (VIIIh)

[00103] Класс В: конъюгаты формулы (I) и (VII), где E, E' или E'' включает в себя расщепляемую дисульфидную группу

Согласно изобретению, предложены конъюгаты общей формулы (I) или (VII), где E, E' или E'' может включать в себя расщепляемую группу, представляющую собой дисульфидную группу. Каждая из группировок E, E' и E'' может иметь структуру как определено в формуле (IX) или соответствующих ей формулах (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (Xe), (IXf), (IXg) и (IXh):

формула (IX)

где U отсутствует либо выбрана из -О-, сложноэфирной группы, амидной группы и аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); L₁, L₂ и L₃ имеют значения, упомянутые выше; R и R', каждый независимо, выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, гидроксильной группы, метоксигруппы и фторзамещенной углеводородной группы; W и G, каждая независимо, отсутствует либо выбрана из кислорода, сложноэфирной группы, амидной группы или аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); символы a, b, k и d, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из нуля, 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и группировка E, E' или E'' связана с D, где D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I); включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (IX) и соответствующих аналогов формулы (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (Xe), (IXf), (IXg) и (IXh), а также сольваты и гидраты указанных солей:

формула (IXa)

формула (IXb): когда a = 3, b = 0 и k = 1, группировка обозначается: «Apo-Si-S-S»

формула (IXc): когда a = 1, k = 1; группировка обозначается: «Apo-Si-G»

[00104] Класс С: структуры формул (I), (VII) и (IX), содержащие одновременно расщепляемую дисульфидную группу и группировку динамического протонирования:

где L₃ имеет значение, установленное выше; символы b и d, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из нуля, 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и R''' выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила; причем группировка E, E' или E'' связана с D, где D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I);

формула (IXd)

формула (IXe)

формула (IXf)

формула (IXg)

формула (IXh)

[00105] Класс D: конъюгаты формул (I), (VII) и (X), где E, E' или E'' включает в себя циклическую группировку с дисульфидной группой и карбаматную группу

Согласно изобретению, предложены конъюгаты общей формулы (X), где E, E' или E'' может содержать карбаматную группу, а расщепляемая дисульфидная группа входит в состав циклической структуры, как определено в формулах (X), (Xa), (Xb) и (Xc); а также соответствующие структуры, где дисульфидная группа может быть либо в окисленной, либо в восстановленной (открытое кольцо) форме:

формула (X)

где символы a, d, k и d, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; h обозначает целое число 1, 2, 3 или 4; Z выбрано из водорода, фтора, гидроксильной группы и аминогруппы; R и R', каждый независимо, выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, гидроксильной группы, метоксигруппы и фторзамещенной углеводородной группы; L₃ - такая как определено в формуле (I); G выбрана из группы, состоящей из водорода, галогена, гидроксильной группы, метоксигруппы и фторзамещенной углеводородной группы; W выбрана из кислорода, амидной группы, сложноэфирной группы и аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I); включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (X), а также соответствующих аналогов, имеющих структуру формулы (IXa), (IXb), (Xa), (Xb) или (Xc), и сольваты и гидраты указанных солей.

[00106] Еще в одном воплощении изобретения k = 1, и h = 1. Еще в одном воплощении изобретения, по меньшей мере, один из R и R' представляет собой атом фтора, а второй из них является атомом водорода.

[00107] Структуры по изобретению, включающие в себя циклическую группировку с дисульфидной группой и, таким образом, соответствующие формуле (X), следующие:

формула (Xa)

формула (Xb)

формула (Xc),

включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (X) или соответствующих аналогов, имеющих структуру формулы (Xa), (Xb) или (Xc), а также сольваты и гидраты указанных солей.

[00108] Класс Е: конъюгаты формулы (I), (VII) и (XI), где E, E' или E'' содержит и расщепляемую карбаматную группу, и группировку динамического протонирования

формула (XI)

где каждая из группировок L₃ и L₂ - такая, как определено в формуле (I); U отсутствует либо выбрано из группы, состоящей из -О-, сложноэфирной группы, амидной группы и аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); символы b и d, каждый, обозначают целое число 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; R', R'' и R''', каждый независимо, обозначает водород, метил или этил; D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I); включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения формулы (XI) или его аналогов, имеющих структуру формулы (IXa), (IXb), (IXc) или (IXd), и сольваты и гидраты указанных солей:

формула (XIa)

где L₃ имеет значение, установленное в формуле (I); символы a, b и d, каждый, обозначают целое число 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; R'', R''' и R^IV, каждый независимо, представляет собой водород, метил или этил; и D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I);

формула (XIb)

где L₃ имеет значение, установленное в формуле (I); символы a, b и d, каждый, обозначают целое число 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; R'', R''' и R^IV, каждый независимо, представляет собой водород, метил или этил; и D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I);

формула (XIc)

где каждая из группировок L₃ и D - такая, как определено в формуле (I);

формула (XId)

где каждая из группировок L₃ и D - такая, как определено в формуле (I).

[00109] В качестве еще одного воплощения изобретения предложен конъюгат, в котором каждая из группировок E, E' и E'', независимо, имеет структуру, как определено в формуле (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), и связана с лекарственным веществом.

[00110] В объем изобретения также входят молекулы, называемые «предшественниками». В контексте настоящего изобретения термин «предшественник» относится к химической группировке, используемой в синтезе конъюгатов по изобретению. Предшественник часто содержит химические группы, удаляемые или модифицируемые в процессе синтеза конъюгата, например, на стадии присоединения лекарственного белка, олигонуклеотида иди другой макромолекулы к МНД по изобретению. Примерами таких химических групп являются амидофосфит, азид, ацетилен и N-гидроксисукцинимид (N-hydroxysuccinimide, NHS). Соответственно, изобретение также относится к предшественнику, который представляет собой соединение, имеющее структуру, как определено в любой из формул (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), содержащую или связанную с химической группой, удаляемой или модифицируемой в процессе синтеза конъюгата.

[00111] Еще в одном воплощении, изобретение относится к предшественнику, в котором удаляемая или модифицируемая химическая группа выбрана из амидофосфита, активированного сложного эфира, азида и ацетилена.

[00112] Еще в одном воплощении изобретения предшественник имеет структуру формулы (XII):

формула (XII)

где W представляет собой группировку, выбранную из E, E' и E'', как они определены в формуле (I), формуле (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId). Этот предшественник может быть использован, в частности, для присоединения к 5'-концу олигонуклеотида.

[00113] Другой предшественник по изобретению имеет структуру формулы (XIII):

формула (XIII)

где G представляет собой группировку, выбранную из E, E' и E'', как они определены в формуле (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId). Этот предшественник может быть использован, в частности, для присоединения к 3'-концу олигонуклеотида. «DMT» означает: диметокситритил-бис-(4-метоксифенил)фенилметил (Dimethoxytrityl bis-(4-methoxyphenyl) phenylmethyl); «CPG» = стекло с заданным размером пор (Controlled Pore Glass).

[00114] Еще один предшественник используется для присоединения к D, являющемуся олигонуклеотидом, по положению внутри олигонуклеотидной последовательности. Такой предшественник имеет структуру формулы (XIV):

формула (XIV)

где W представляет собой группировку, выбранную из E, E' и E'', как они определены в формуле (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), и «PRG» означает любую защитную группу, подходящую для защиты гидроксильной группы; примерами таких групп являются: диметокситритил-бис-(4-метоксифенил)фенилметил (DMT), ацетил и метоксиметиловый эфир (MOM);

Y выбран из 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-атомной углеводородной связывающей группы, возможно замещенной атомом(-ами) кислорода или азота и, возможно, связанной с любым природным или модифицированным основанием РНК или ДНК. В предпочтительном воплощении, указанное основание представляет собой тимин или урацил.

[00115] Еще один предшественник используется для присоединения E, E' или E'' к группировке D, представляющей собой белок. Такой предшественник имеет структуру, выбранную из структур А и В:

[00116] Упомянутый предшественник предназначен для связывания с аминогруппами в группировке D, где W выбрана из E, E' и E'', имеющих структуру как определено в формуле (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId). В других воплощениях изобретения, предшественник имеет структуру как определено в формуле (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), где в положении, по которому будет образована связь с D, присоединена группа, выбранная из амидофосфита, активированного сложного эфира, азида и ацетилена. В процессе присоединения предшественника к D две последние из упомянутых групп могут участвовать в реакции по механизму «клик-химии», например, но не ограничиваясь этим, в реакции азид-алкинового циклоприсоединения (реакции Хьюсгена).

[00117] Согласно другим воплощениям изобретения, предложены фармацевтические композиции, содержащие конъюгат формулы (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), и фармацевтически приемлемую соль или носитель.

[00118] Также, согласно изобретению, предложены способы подавления экспрессии конкретного гена in vitro или in vivo. В одном воплощении изобретения, в предложенном способе используют конъюгат формулы (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId) либо соответствующую фармацевтическую композицию, при этом D представляет собой киРНК или АСО, предназначенный для подавления экспрессии конкретного гена. В некоторых воплощениях изобретения указанный ген кодирует патогенный белок, вовлеченный в этиологию или патогенез заболевания. В некоторых воплощениях изобретения D представляет собой лекарственный белок.

[00119] Конъюгаты по изобретению могут применяться для лечения заболевания. Согласно изобретению, предложены способы лечения, при которых пациенту, нуждающемуся в этом, вводят терапевтически эффективные количества фармацевтической композиции, содержащей конъюгат формулы (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), где D представляет собой лекарственное вещество, полезное для лечения соответствующего заболевания.

[00120] Еще в одном воплощении, изобретение относится к способу к генной терапии с использованием киРНК или АСО, при котором пациенту, нуждающемуся в этом, вводят терапевтически эффективные количества фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по изобретению формулы (I), (II), (VII), (VIIa), (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), (X), (Xa), (Xb), (Xc), (XI), (XIa), (XIb), (XIc) или (XId), где D представляет собой киРНК, АСО или лекарственный белок, полезный для подавления экспрессии гена, вовлеченного в механизм заболевания у конкретного пациента.

[00121] В других воплощениях изобретение относится к способу лечения заболевания с использованием лекарственного белка, где D представляет собой белок, доставляемый через биологические фосфолипидные мембраны в клетки либо доставляемый через биологические барьеры, например, гемато-энцефалический барьер. Указанные клетки либо находятся в культуре клеток in vitro, либо в организме живого животного или человека in vivo. В некоторых воплощениях изобретения клетка представляет собой неопластическую клетку. В некоторых воплощениях изобретения неопластическая клетка представляет собой клетку опухоли. В некоторых воплощениях изобретения неопластическая клетка является клеткой метастаза. Упомянутая клетка может представлять собой эукариотическую клетку, эукариотическую клетку, трансфицированную онкогенным агентом, клетку человека, предраковую клетку или любую их комбинацию. Клетка может находиться в культуре клеток либо в организме живого животного или человека.

[00122] Еще в одном воплощении изобретения, D представляет собой белок, вводимый в качестве средства заместительной терапии, например, для замещения мутантного белка с нарушенным функционированием, с целью решения физиологической проблемы. В другом воплощении, D представляет собой белок, вовлеченный в регуляцию генов, в частности, белок, вовлеченный в редактирование ДНК или РНК (наращивание, разрыв или изменение последовательности определенных генов). Еще в одном воплощении, указанный белок относится к белкам на основе CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats; короткие палиндромные повторы, расположенные группами на одинаковом расстоянии друг от друга). В частности, указанный белок может представлять собой или включать в себя белок Cas9 (CRISPR associated protein 9; белок 9, ассоциированный с CRISPR), управляемый РНК фермент ДНК-азу или их аналог.

[00123] В других воплощениях изобретение относится к способу генной терапии заболевания, при котором пациенту, нуждающемуся в этом, вводят терапевтически эффективные количества фармацевтической композиции, содержащей конъюгат формулы (I), где D представляет собой белок CRISPR, например, Cas9, вводимый вместе с подходящим ведущим олигонуклеотидом в целях доставки этого белка, связанного с этим ведущим олигонуклеотидом, в клетки, в которых белок CRISPR может проявлять свою активность в редактировании генома. В этом контексте, ведущий олигонуклеотид представляет собой последовательность РНК или ДНК, которая направляет белок Cas9 к определенному локусу (месту) молекулы ДНК, в результате чего в этом месте индуцируется разрезание двухцепочечной ДНК и репарация локального дефекта генетического материала. В случае белка Cas9, ведущий олигонуклеотид представляет собой короткий сегмент РНК, последовательность которого комплементарна последовательности целевого локуса ДНК.

[00124] Таким образом, конъюгаты по изобретению и соответствующие фармацевтические композиции и способы могут применяться, в частности, для лечения заболеваний, выбранных, среди прочего, из рака, нарушений, вызванных токсинами, ишемической болезни, инфекционного заболевания, заболевания, связанного с патологическим накоплением белка, травмы, иммуноопосредованного заболевания и дегенеративного заболевания.

[00125] В некоторых воплощениях изобретения заболевание представляет собой рак. Термин «рак» в контексте изобретения относится к наличию клеток, обладающих типичными характеристиками раковых клеток, такими как неконтролируемая пролиферация, потеря специальных функций, бессмертность, значительный метастатический потенциал, существенное увеличение анти-апоптозной активности, высокая скорость роста и пролиферации и присутствие определенных характерных морфологических и клеточных маркеров. Обычно в животных организмах раковые клетки образуют локально расположенные опухоли или циркулируют в кровотоке (например, лейкозные клетки).

[00126] В области лечения расстройств нервной системы конъюгаты по изобретению могут использоваться, в частности, для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, заболевание двигательных нейронов, болезнь Паркинсона, болезнь, Хантингтона, рассеянный склероз и болезнь Крейтцфельдта-Якоба.

[00127] В других воплощениях изобретение относится к применению соединений по изобретению для повышения эффективности доставки химического соединения через фосфолипидную мембрану в клетки. Доставку можно осуществлять в разных целях, в зависимости от присоединенного химического соединения и имеющейся потребности. Например, в растениеводстве посредством такой доставки можно повысить качество и увеличить количество урожая, в частности, за счет улучшения генетических характеристик растений или за счет уничтожения разнообразных насекомых, бактерий и грибов.

Еще в одном воплощении, изобретение относится к способу А способу выбора ЭПВМ-субстрата из библиотеки соединений, при котором:

(i) клетки или липосомы инкубируют с представляющим интерес соединением из библиотеки соединений, которое, предположительно, может быть ЭПВМ-субстратом, в присутствии флоретина (100-1000 мкМ) и/или 6-КХ (10-100 мкМ);

(ii) измеряют уровни проникновения представляющего интерес соединения через мембраны в клетки или липосомы в присутствии флоретина и/или 6-КХ;

(iii) клетки или липосомы инкубируют с указанным представляющим интерес соединением в отсутствие флоретина (100-1000 мкМ) и/или 6-КХ (10-100 мкМ);

(iv) измеряют уровни проникновения указанного представляющего интерес соединения через мембраны в клетки или липосомы в отсутствие флоретина и/или 6-КХ; и

[00128] (v) сравнивают уровни проникновения представляющего интерес соединения в присутствии и в отсутствие флоретина и/или 6-КХ; при этом уменьшение проникновения более чем на 50% в присутствии флоретина или увеличение проникновения более чем в два раза в присутствии 6-КХ указывает на то, что представляющее интерес соединение является ЭПВМ-субстратом.

ПРИМЕРЫ

[00129] Ниже приведен ряд примеров, дополнительно иллюстрирующих изобретение. В примерах продемонстрировано, как изобретение может быть реализовано на практике.

[00130] В нижеприведенных примерах описаны конъюгаты, содержащие МНД по изобретению, связанные с одноцепочечным или двухцепочечным олигонуклеотидом. В примерах показана возможность реализации полного спектра воплощений изобретения с использованием разных конъюгатов по изобретению, а именно, подтверждено, что: (i) синтез МНД по изобретению успешно осуществляется; (ii) успешно выполняется их связывание с макромолекулой лекарственного вещества (например, одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК); (iii) успешно осуществляется доставка сильно заряженных макромолекул (через гидрофобные фосфолипидные мембраны в клетки); и (iv) эти макромолекулы, находясь внутри клетки, способны достигать своего места действия и проявлять полезную биологическую активность (например, осуществлять сайленсинг генов в цитоплазме).

[00131] Пример 1. Общий способ синтеза конъюгатов по изобретению, содержащих олигонуклеотиды

Сначала, с учетом этиологии и патогенеза заболевания, выбирают, сайленсинг какого гена требуется проводить. Затем, в соответствии с известными в данной области биоинформационными методиками, определяют последовательности нуклеотидов (обычно это двухцепочечная РНК длиной 19-21 пар оснований - в качестве субстрата RISC, или двухцепочечная РНК длиной 25-29 пар оснований - в качестве субстрата Dicer).

[00132] Синтез осуществляют в направлении 3'-5'. Синтез проводится на твердофазном носителе с использованием амидофосфитных строительных блоков, полученных из защищенных 2-дезоксинуклеозидов (dA (deoxyadenosine, дезоксиаденозин), dC (deoxycytidine, дезоксицитидин), dG (deoxyguanosine, дезоксигуанозин) и T), рибонуклеозидов (A (adenosine, аденозин), C (cytidine, цитидин), G (guanosine, гуанозин), and U (uracyl, урацил)) или химически модифицированных нуклеозидов, например, LNA (locked nucleic acids, закрытые нуклеиновые кислоты) или BNA (bridged nucleic acids, мостиковые нуклеиновые кислоты). Олигонуклеотидную цепь наращивают путем присоединения строительных блоков один за другим, в соответствии с последовательностью желаемой киРНК,

[00133] После завершения синтеза олигонуклеотида в качестве строительного блока этого олигонуклеотида присоединяют группировку Е по изобретению. Группировка Е добавляется в форме ее предшественника, как описано выше. Для связывания с 5'-концом олигонуклеотида используется предшественник, соответствующий формуле (XII), несущий амидофосфитную группу. Для связывания с 3'-концом олигонуклеотида используется предшественник, соответствующий формуле (XIII). Для связывания с олигонуклеотидом по положению внутри олигонуклеотидной цепи используется предшественник, соответствующий формуле (XIV). Среди прочего, предшественник может иметь ацетиленовую или азидную группу, участвующую в реакции связывания группировки Е с олигонуклеотидной цепью. Такой процесс полностью автоматизирован. После завершения сборки цепи продукт отделяется от твердофазного носителя и переходит в раствор, с него удаляют защитные группы и целевой продукт собирают. Затем целевой конъюгат выделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), получая конъюгат олигонуклеотида высокой чистоты. В случае киРНК, каждую из комплементарных цепей РНК синтезируют отдельно, после чего осуществляют их отжиг в стандартных условиях, известных специалистам в данной области, с получением желаемой двухцепочечной киРНК.

[00134] Пример 2. Химический синтез группировок Е по изобретению (E, E' и E'')

Используемый в качестве исходного материала перфтор-трет-бутанол имеется в продаже. В данном примере синтезируют группировки Е, предназначенные для связывания с 5'-концом олигонуклеотида. Соответственно, на последней стадии синтеза перед конъюгацией с олигонуклеотидной цепью добавляется амидофосфитная группа.

[00135] Пример 2a. Способ синтеза группировки Е, как она определена в формуле (VII):

В качестве примера приведен способ синтеза предшественника группировки Е по изобретению, как она определена в формуле (VIIa) (обозначается: «Apo-Si-C4»). Предшественник предназначен для присоединения к 5'-концу олигонуклеотида и имеет следующую структуру:

[00136] Синтез начинают с эстрадиола.

Схема 1

[00137] Синтез проводят по схеме 1. Так, к эстрадиолу присоединяют защитную группу с получением соединения 11. К спирту 11 (25,6 г) присоединяют аллил в оптимизированных условиях реакции (аллилбромид, NaH, кат. тетра-н-бутиламмонний бромид (tetra-n-butylammonium bromide, TBAI), тетрагидрофуран (ТГФ), кипячение с дефлегмацией в течение 16 часов) с получением аллилового эфира 24 (21,85 г, 77%) в виде белого твердого вещества (очищенного путем растирания, поочередно, в гептане и MeOH). После региоселективного гидроборирования терминального алкена 24 (21,8 г) 9-борбицикло[3.3.1]нонаном (9-Borabicyclo[3.3.1]nonane, 9-BBN) и выделения в стандартных окислительных условиях (NaOH/H2O₂) получают спирт 22. В реакции Мицунобу с участием спирта 22 (13,6 г) и избытка перфтор-трет-бутанола в оптимизированных условиях [диизопропилазодикарбоксилат (Diisopropyl azodicarboxylate, DIAD), молекулярное сито (molecular sieve, MS) 4А, тетрагидрофуран (ТГФ), комнатная температура (КТ), 16 часов] получили желаемый эфир 21. Осуществляют каталитическое гидрирование соединения 21 (10% Pd/C, КТ) с использованием смеси (1:1) ТГФ и 2,2,2-трифторэтанола в качестве растворителя (5 бар; реактор Parr) с получением (примерно через 18 часов) фенола 26 в виде грязно-белого твердого вещества. Затем проводят дебензилирование, после чего - алкилирование с использованием бромбутанола с тетрагидробромпалматиновой защитной группой (Tetrahydropalmatine, THP). Защитную группу удаляют, после чего, на последней стадии перед получением желаемого соединения, присоединяют амидофосфитную группу. Затем осуществляют присоединение полученного продукта, по месту связи с амидофосфитной группой, к 5'-концу олигонуклеотидной цепи, где упомянутый продукт используется как последний строительный блок в синтезе этой олигонуклеотидной цепи.

[00138] Пример 2b. Способ синтеза группировки Е, как она определена в формуле (VII)

В качестве примера приведен синтез предшественника группировки Е по изобретению, как она определена в формуле (VII), где эстрогеновый скелет заменен на остаток литохолевой кислоты, каждый из R и R' представляет собой атом водорода, L₁, L₂, Q₁ и Q₂ отсутствуют, и L₃ является углеводородной связывающей группой, имеющей 14 атомов углерода. Данное соединение обозначено как «Apo-Si-11» и изображено ниже в виде предшественника, несущего амидофосфитную группу и, таким образом, предназначенного для присоединения к 5'-концу олигонуклеотида:

Apo-Si-11

[00139] Синтез начинается с литохолевой кислоты, относящейся к желчным кислотам. Она имеется в продаже. Синтез осуществляют согласно Схеме 2:

Схема 2

[00140] Так, осуществляют превращение 25 г соединения 1 в соответствующий метиловый эфир с количественным выходом. Осуществляют взаимодействие 25 г соединения 2 с 29 г трет-бутилдиметилсилилхлорида (tert-Butyldimethylsilyl chloride, TBDMSCl) (87%, ЯМР). Получают чистое соединение 3. Соединение 3 восстанавливают до 4 с помощью NaBH₄ (ТГФ/MeOH), получая, после выделения и очистки, соединение 4 (85%, ЯМР), все еще содержащее следовые количества соединения 3. Реакция Мицунобу с участием соединения 4 и перфтор-трет-бутанола дает, после выделения с помощью колоночной хроматографии и растирания с МеОН, 33,5 г (92%) соединения 5, с которого затем удаляют защитные группы с получением стероида 6. Проводят реакцию сочетания стероида 6 (2,5 г) с бромтетрадеканолом, несущим защитную группу THP. Реакция сочетания проводится в течение 3 дней, при этом для обеспечения полного превращения требуется 4 эквивалента бромтетрадеканола, несущего защитную группу THP. Полученный продукт очищают колоночной хроматографией. После удаления защитной группы (ТНР) с использованием МеОН/1,4-диоксана (4 н HCl)/ТГФ полученный продукт 7 очищают колоночной хроматографией для удаления примесей. Получают продукт 7 в виде белого твёрдого вещества (1,5 г, c.y. (выход соединения) 48%). Осуществляют превращение продукта 7 в желаемое соединение 8 путем присоединения амидофосфитной группы. Это соединение в качестве последнего строительного блока присоединяют к 5'-концу олигонуклеотидной цепи.

[00141] Пример 2c. Способ синтеза группировки Е, как она определена в формуле (Xc)

В качестве примера приведен синтез предшественника группировки Е по изобретению, как она определена в формуле (Xc), имеющего приведенную ниже структуру. Данный предшественник предназначен для присоединения к 5'-концу олигонуклеотида и имеет следующую структуру:

Синтез промежуточного соединения 4 осуществляют по схеме 3.

Схема 3

[00142] При взаимодействии дитиолбутиламина (0,5 г) с йодом в щелочной среде получают 1,2-дитиан 10 в виде белого кристаллического вещества (3,13 г; 90%). Спирт, соответствующий промежуточному соединению 11, имеется в продаже; в него вводят диметокситрилильную защитую группу (dimethoxytrityl, DMT). При восстановительном аминировании амином 10 (258 г) в присутствии NaBH(OAc)₃ получают желаемый вторичный амин 4 в качестве основного продукта (330 г; 91%). Затем промежуточное соединение 26, описанное в примере 2а, присоединяют к промежуточному соединению 4 в реакции карбамоилирования, известной специалистам в данной области. DMT затем удаляют и присоединяют амидофосфитную группу с получением соединения-предшественника. Проводят присоединение предшественника в качестве последнего строительного блока к 5'-концу олигонуклеотидной цепи. Эти две группировки связаны через атом кислорода. В результате связывания получают желаемый конъюгат, включающий в себя группировку Е, как она определена в формуле (Xc).

[00143] Пример 2d. Способ синтеза ключевого строительного блока соединений по изобретению (стероид 1)

Стероид 1 является важным строительным блоком во многих структурах, относящихся к изобретению. В качестве исходного материала для синтеза стероида 1 используется эстрадиол. Метод синтеза, разработанный для соединений по изобретению, предполагает присоединение перфтор-трет-бутанола в реакции Мицунобу после защиты гидроксильной группы на ароматическом кольце. Синтез осуществляют в соответствии с приведенной ниже схемой, где «Bn» означает бензильную защитную группу, BnBr = бензилбромид, TBAI = тетрабутиламмония йодид (Tetrabutylammonium iodide), ТГФ = тетрагидрофуран, 9-BBN = 9-борбицикло[3.3.1]нонан, и DIAD = диизопропилазодикарбоксилат.

[00144] Пример 2e. Способ синтеза группировки Е, как она определена в формуле (IXb)

В этом примере описан синтез предшественника группировки Е, как она определена в формуле (IXb), где a = 3, b = 0, и k = 1, что соответствует приведенной ниже структуре. Соединение является предшественником конкретно для Apo-Si-S-S.

формула (IXb): Apo-Si-S-S

[00145] Синтез осуществляют согласно приведенной ниже схеме, начиная с основного промежуточного соединения 1, как описано в примере 2d:

[00146] Проводят алкилирование соединения 1 (5 г) с получением соединения 53 (4,95 г выделенного вещества), которое восстанавливают с помощью LiAlH₄, после чего вводят защитную группу - мезилхлорид (MsCl) (4,56 г мезилата). Успешно превращают полученное соединение в ацетат 32 с использованием тиоацетата калия (KSAc) и после очистки выделяют 4,35 г этого соединения. Используя пирролидин, удаляют защитные группы с получением соединения 33, которое затем превращают в соединение 35 (9,88 г неочищенного вещества) и подвергают его очистке. Неочищенное вещество APO-Si-SS, содержащее, в основном, избыток имидатного реагента, очищают с использованием пентана и МеОН, которые образуют двухфазную систему. Супернатант декантируют, и с поверхности растворителей сливают белое масло, получая чистый предшественник для APO-Si-SS (1,33 г).

[00147] Пример 2h. Способ синтеза группировки Е, соответствующей формуле (VIIIb)

Группировка E, соответствующая формуле (VIIIb), имеет приведенную ниже структуру и обозначается: «Apo-Si-W». В данном примере описан синтез предшественника, содержащего амидофосфитную группу и предназначенного для присоединения к лекарственному веществу, являющемуся олигонуклеотидом, по его 5'-концу:

формула (VIIIb); Apo-Si-W

[00148] Синтез проводят в соответствии с приведенной ниже схемой, начиная с эстрадиола.

где Bn = бензил

[00149] Проводят присоединение аллила, используя все количество вещества W-2. После тщательно проведенного процесса выделения получают соединение W-3 высокой степени чистоты (66,4 г). Параллельно проводят синтез соединения W-6 по приведенной ниже схеме:

Alloc = алкоксикарбонил (реагент, используемый для твердофазного синтеза); в реакции Мицунобу спиртовая группа заменяется на множество других функциональных групп.

[00150] Затем проводят восстановительное аминирование с получением W-7. С соединением W-7 проводят описанные ниже реакции, получая желаемое соединение, содержащее амидофосфитную группу, которая является местом связывания с D.

[00151] Пример 2i. Способ синтеза группировки Е, как она определена в формуле (VIIIh)

В этом Примере описан синтез предшественника группировки Е, как она определена в формуле (VIIIh), имеющего следующую структуру:

формула (VIIIh)

[00152] Синтез осуществляют в соответствии с приведенными ниже схемами. Сначала синтезируют соединение B3-1, описанное на схеме ниже. Путем алкилирования исходных веществ, имеющихся в широком доступе, получают соединение B3-2 хорошей степени чистоты и в хорошем количестве. Затем проводят реакцию Мицунобу с получением 8,5 г выделенного B3-3.

[00153] Затем проводят синтез по приведенной ниже схеме, начиная с эстрона, с получением желаемого соединения:

где Bz-Cl = бензилхлорид; Bn = бензил; TsOH = п-толуолсульфокислота; TBS = трет-бутилдиметилсилиловый эфир; TBAF= тетра-н-бутиламмония фторид

[00154] Пример 2j. Способ синтеза группировки Е, как она определена в формуле (IXh)

В этом примере описан синтез предшественника группировки Е, как она определена в формуле (IXh), где предшественник имеет следующую структуру:

формула (IXh)

[00155] Синтез начинают с используемого в качестве строительного блока производного гидроксипролина как показано ниже.

[00156] При восстановлении метилового эфира пролина [номер CAS: 40216-83-9] с помощью NaBH₄ получают соответствующий диол. Последующая обработка этилтрифторацетатом дает ацетамид 3. Селективная реакция первичного спирта с мезилхлоридом дает соединение 4. Затем в реакции с тиоацетатом получают соединение 5, с которого удаляют ацетатную группу. Далее описаны последующие стадии синтеза, в котором получают конечную молекулу предшественника - соединения формулы (IXh).

[00157] Пример 3. Примеры связывания МНД с олигонуклеотидными цепями

Ниже приведены примеры структур предшественников и соответствующих соединений, полученных при связывании с олигонуклеотидной цепью.

a. Присоединение к 5'-концу олигонуклеотида

Предшественник:

Соединение с олигонуклеотидом:

b. Присоединение к 3 ' -концу олигонуклеотида

Предшественник:

где DMT = диметокситритил; и CPG = стекло с заданным размером пор, используемое в качестве твердой подложки для синтеза олигонуклеотида.

Соединение с олигонуклеотидом:

c. Присоединение по положению внутри олигонуклеотидной цепи

В этом случае к Е присоединяется нуклеотид (например, тимин), играющий роль «якоря» в реакции с олигонуклеотидной цепью. Подобная модификация может использоваться для присоединения группировки Е по положению внутри олигонуклеотидной цепи, но не к концу цепи. Ниже приведён пример с Е, имеющей структуру как определено в формуле (VIIa):

Предшественник:

Соединение с олигонуклеотидом:

[00158] Пример 4. Пример структуры конъюгата по изобретению, включающего в себя белок (например, Cas9), связанный с группировкой Е по изобретению

Как проиллюстрировано на схеме ниже, МНД E, E' и E'' по изобретению соединяются с белком через связывающую группу. Связывание осуществляется путем образования карбаматных или амидных связей с боковой цепью лизина на поверхности белка. Для присоединения используются активные сложные эфиры. С этой целью спиртовую группу переводят в активную сложноэфирную группу (например, N-гидроксисукцинимидную группу (NHS)). Эта группировка, вступает во взаимодействие преимущественно с азотом боковых цепей лизина в белке, а не с кислородом (в воде). Реакцию проводят по следующей схеме:

[00159] Возможные реагенты для получения производных:

a) фосген: присоединение через сложный эфир хорформиата;

b) дисукцинимидилкарбонат (X = N-гидроксисукцинимид): присоединение через сукцинимидилкарбонат;

c) карбонилдиимадазол (Carbonyldiimidazole (CDI), X = имидазол): присоединение через имидазолилкарбамат.

[00160] Присоединение к белку любой из этих групп проводится в слегка щелочном буферном растворе, не содержащем аминов (рН = 8-9). Место присоединения является гидрофобным, поэтому для того, чтобы реакция произошла, требуется использовать сорастворитель (обычно используют диметилформамид (ДМФ) или диметилсульфоксид (ДМСО)). Из трех вышеперечисленных вариантов карбонилдиимидазол предпочтителен, поскольку он обладает наибольшей селективностью в отношении азота (в сравнении с кислородом), и процесс синтеза, как следствие - проще. Число группировок E, E' и E”, приходящихся на молекулу белка, оптимизируется и определяется предварительно заданным желаемым соотношением молекул.

[00161] Пример 5. Проникновение конъюгатов, содержащих ДНК-олигонуклеотиды, связанные с одним или более чем одним молекулярным нанодвигателем по изобретению, в клетки

На Фиг. 5-9 приведены примеры осуществления доставки конъюгатов по изобретению, содержащих МНД по изобретению, в клетки разных типов in vitro. Эти конъюгаты включают в себя МНД, как он определен в формуле (VIIa), где a = 2, и k = 1 (обозначается: «Apo-Si-C4»), или Apo-Si-11, описанный в примере 2b выше. Упомянутые МНД соединены с Су3-меченной одноцепочечной 29-мерной последовательностью ДНК (несущей 29 отрицательных зарядов) либо с двухцепочечной 58-мерной последовательностью ДНК (несущей 58 отрицательных зарядов), в которой каждая последовательность мечена «красным» флуорофором Су3. Последовательности ДНК-олигонуклеотидов следующие: 5'-МНД-TT-iCy3-CGGTGGTGCA GATGAACTTCAGGGTCA (SEQ ID. No. 1) и 5'-МНД-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC GAA. iCy3 (SEQ ID. No. 2); видно, что флуорофор Су3 присоединен по положению внутри последовательности. Указанные последовательности (например, синтезированные в компании IDT (Айова, США), но без ограничения этим) выбраны произвольно, поскольку задача состояла в том, чтобы привести пример трансмембранной доставки в клетки. Флуорофор применяется в качестве инструмента для определения местонахождения исследуемого конъюгата. Воплощение изобретения продемонстрировано с использованием разных линий клеток для подтверждения того, что трансмембранная доставка макромолекул с применением МНД Apo-Si - универсальна и не ограничена одним типом клеток. Отметим, что, как правило, все описанные ниже конъюгаты по изобретению - Apo-Si-C4, Apo-Si-11 Apo-Si-S-S, Apo-Si-G и Apo-Si-W - имеют сходные показатели функционирования.

[00162] Пример 5a. Клетки 3T3

Чтобы оценить способность МНД по изобретению доставлять 29-мерный одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид (оцДНК) в клетки, было проведено исследование in vitro. За день до эксперимента клетки NIH-3T3, стабильно трансфицированные белком EGFP (клетки 3T3-EGFP) и находящиеся в экспоненциальной фазе роста, поместили в 24-луночные планшеты с плотностью 4,5×10⁴ клеток/лунка, в среду DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium; среда Игла, модифицированная по методу Дульбеко) с добавкой питательной среды (500 мкл/лунка) без антибиотиков. Сначала проводили изучение меченного Су3 29-мерного оцДНК-олигонуклеотида, имеющего последовательность: 5'-Apo-si-11-TT-iCy3-CGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCA (SEQ ID. No. 3). Проникновение этого конъюгата в клетки сравнивали с проникновением контрольного соединения, состоящего из той же цепи ДНК, меченой Су3, но без МНД Apo-Si-11. Каждый конъюгат разводят в Opti-Mem (номер по каталогу Life technologies: 31985062; США) (100 мкл/лунка), инкубируют 10 минут при комнатной температуре и добавляют к клеткам в конечной концентрации 100 нМ. Проникновение конъюгата в клетки в сравнении с контролем оценивали после 8 часов инкубации, когда клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (Hank's Buffered Salt Solution (буфер HBSS); Biological Industries, Израиль) и проводили анализ. Клетки визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus (BX51TF; Olympus Optical, Великобритания), в УФ-свете, создаваемом ртутной лампой (увеличение: 20х). Флуорофор Су3 визуализировали при длине волны возбуждения 470-495 нм и эмиссии при 590 нм, а флуорофор EGFP визуализировали при длине волны возбуждения 530-550 нм и эмиссии при 510-550 нм. На изображениях, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии (Фиг. 5А), видно, что Apo-Si-11, включающий в себя Apo-si-11, соединенный с 29-мерной цепью ДНК, эффективно осуществляет трансмембранную доставку в клетки 3T3-EGFP, в отличие от не содержащего МНД контрольного олигонуклеотида, эффективного проникновения которого в клетку не наблюдается.

[00163] Количественную оценку способности МНД Apo-Si доставлять 29-мерный оцДНК-олигонуклеотид в клетки 3T3-EGFP выполняли также с использованием ридера для ELISA (Фиг. 5С). Для этого клетки в экспоненциальной фазе роста за день до эксперимента помещали в 24-луночные планшеты (плотность: 4,5×10⁴ клеток/лунка, в среде DMEM с добавкой питательной среды (500 мкл/лунка) без антибиотиков). Каждый олигонуклеотид, меченный Су3, разводили в Opti-Mem (100 мкл/лунка) и добавляли к клеткам в конечной концентрации 40-100 нМ. После ингибирования в течение 24 часов оценивали накопление в клетках конъюгата с МНД Apo-Si в сравнении с контрольным соединением, не содержащим МНД. С этой целью клетки промывали буфером HBSS и проводили их анализ. Для детекции и количественного определения Су3-положительной популяции использовали многорежимный ридер Tecan Infinite® 200 PRO (длина волны возбуждения - 548±4,5 нм, эмиссии - 580±10 нм). Проникновение в клетки конъюгата с МНД Apo-Si сравнивали с проникновением контрольного ДНК-олигонуклеотида при одних и тех же значениях концентрации, и результаты выражали в процентах от контроля. Как видно на Фиг. 5С, наблюдалось значительное, по сравнению с контролем, проникновение конъюгата в клетки.

[00164] Оценку проникновения МНД Apo-Si, соединенного с 29-мерным ДНК-олигонуклеотидом, выполняли также с помощью проточной цитометрии (FACS). Как описано выше, за день до эксперимента клетки 3T3-EGFP, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, помещали в 6-луночные планшеты (плотность 1,5×10⁵ клеток/лунка, в полной среде DMEM без антибиотиков). Каждый из олигонуклеотидов, меченных Су3, разводили в Opti-Mem (500 мкл/лунка) и добавляли к клеткам в конечной концентрации 1-40 нМ. Доставку конъюгата оценивали через 24-72 часа после трансфекции. После инкубации клетки обрабатывали трипсином с добавкой сбалансированного солевого раствора Хенкса (буфер HBSS) (Biological Industries, Израиль) и центрифугировали при 1100 об./мин. в течение 5 мин. Клетки ресуспендировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса и анализировали с использованием клеточного сортера FACSAria III (BD Biosciences; Сан-Хосе, Калифорния, США) и программного обеспечения Cell Diva. Для каждого образца сортировали, в целом, 10⁴ событий. Детекцию и количественную оценку Cy3-положительной популяции проводили, измеряя интенсивность флуоресценции и сравнивая результаты в клетках, инкубированных с конъюгатом Apo-Si-11, и в клетках, инкубированных с контрольным олигонуклеотидом, имеющим ту же последовательность, но не связанным с МНД.

[00165] Результаты анализа, проведенного методом FACS, подтверждают, что МНД Apo-Si способен эффективно доставлять 29-мерный оцДНК-олигонуклеотид в клетки 3T3-EGFP. На Фиг. 5В представлены точечные диаграммы, показывающие, что в популяции клеток, инкубированных с конъюгатом Apo-Si-11, наблюдалось проникновение конъюгата практически во все клетки, в противоположность контрольным клеткам, проникновения в которые не наблюдалось.

[00166] Далее, оценивали способность Apo-Si-11 доставлять двухцепочечный олигонуклеотид (дцДНК) через клеточные мембраны. С этой целью два МНД Apo-Si-11 присоединяли (по одному - к каждому 5'-концу) к олигонуклеотиду, представляющему собой дцДНК из 29 пар оснований, меченному флуорофором Су3 и прошедшему отжиг с образованием двухцепочечного олигонуклеотида. Последовательность дцДНК - такая, как описано выше: 5'-Apo-si-11-TT-iCy3-CGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCA (SEQ ID. No. 3); и 5'-Apo-si-11-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGAA (SEQ ID. No. 4).

[00167] МНД присоединяли к олигонуклеотиду как описано в примере 3 выше. Клетки 3T3-EGFP инкубировали с 40 нМ конъюгата. После инкубации в течение 24 часов с помощь флуоресцентной микроскопии оценивали проникновение в клетки и сравнивали с проникновением в клетки контрольного олигонуклеотида, имеющего ту же последовательность, но не связанного с МНД. Как показано на Фиг. 5D, два МНД Apo-Si-11 способны доставлять 58-мерный дцДНК-олигонуклеотид в клетки 3T3- EGFP.

[00168] Затем доставку продемонстрировали с помощью FACS. Для этого клетки 3T3-EGFP помещали в 6-луночные планшеты и обрабатывали как описано на Фиг. 5С. Каждый меченный Су3 олигонуклеотид (содержащий либо не содержащий МНД) разводили в Opti-Mem (500 мкл/лунка) и добавляли к клеткам в конечной концентрации 40 нМ, 10 нМ и 1 нМ. После инкубации в течение 24 часов доставку олигонуклеотидов оценивали с помощью клеточного сортера FACS-Aria III (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и анализировали с использованием программного обеспечения Cell Diva. Для каждого образца сортировали, в целом, 10⁴ событий. Детекцию и количественную оценку Cy3-положительной популяции проводили, измеряя интенсивность флуоресценции и сравнивая результаты в клетках, инкубированных с конъюгатом, содержащим МНД Apo-Si-11, и в клетках, инкубированных с контрольным олигонуклеотидом, не связанным с МНД. Как показано на Фиг. 5Е и Фиг. 5F, исследование методом FACS подтвердило, что два МНД Apo-Si способны эффективно доставлять 58-мерный дцДНК-олигонуклеотид в клетки 3T3- EGFP: на Фиг. 5Е представлены точечные диаграммы (левая и правая), на которых видно, что проникновение ДНК наблюдалось только в клетках, инкубированных с конъюгатом, содержащим Apo-Si-11, с накоплением конъюгата практически во всех клетках; на Фиг. 5F на гистограмме представлены результаты анализа геометрических средних, показывающие заметный сигнал в клетках, обработанных конъюгатом, содержащим МНД Apo-Si, в противоположность низким, фоновым уровням в клетках, обработанных контрольным олигонуклеотидом, не связанным с Apo-Si-11. В исследуемых концентрациях (40 нМ, 10 нМ и 1 нМ) ясно наблюдается зависимость «доза-ответ».

[00169] С целью дополнительно подтвердить проникновение конъюгата, содержащего два МНД Apo-Si-11, применяли конфокальную микроскопию. Клетки подготавливали как описано выше. При этом проводили окрашивание ядер красителем Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, США; 1:1000 в буфере HBSS в течение часа). Как видно на Фиг. 5G, конъюгат, включающий в себя Apo-Si, эффективно проникает через клеточные мембраны и накапливается в клетке.

[00170] Пример 5b. Клетки мышиной меланомы B16

В задачу представляемого ряда экспериментов входило изучение способности конъюгата, содержащего два МНД Apo-Si-11 (каждый присоединен к 5'-концу цепи), проникать в культивируемые клетки мышиной меланомы кожи В16. С этой целью клетки В16 выращивали и поддерживали как описано в примере 5А. Кратко: клетки выращивали в среде DMEM (Sigma Aldrich, США) с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки (fetal bovine serum, FBS), 2 мМ L-глутамина и 1% препарата «ПенСтреп» (Pen-Strep) во влажной камере с 5% СО₂ при 37°C. За день до трансфекции 2×10⁴ клеток B16 поместили в стандартные 24-луночные планшеты. 40 нМ 58-мерного дцДНК-олигонуклеотида, меченного Су3 и связанного с двумя МНД Apo-si-11, инкубировали с клетками в течение 24 часов в полной питательной среде. В качестве контроля использовали идентичный олигонуклеотид, меченный Су3, но не связанный с МНД Apo-si-11, который тоже инкубировали с клетками в течение того же периода времени. Каждую лунку дважды промывали HBSS, после чего измеряли флуоресценцию. Изображения на микроскопе Olympus BX51 получали как описано выше.

[00171] Клетки В16 изучали также методом FACS. Для этого за день до трансфекции клетки В16 в количестве 16×10⁴ засевали в стандартные 6-луночные планшеты. Меченные Су3 58-мерные дцДНК-олигонуклеотиды, связанные с двумя МНД Apo-si-11, в концентрации 10 нМ и 40 нМ инкубировали в полной питательной среде в течение 24 часов. В качестве контроля использовали меченную Су3 58-мерную ДНК, не связанную с МНД. Клетки промывали буфером HBSS и измеряли флуоресценцию с использованием BD FACSAria™ III как описано выше.

[00172] Кроме того, для дополнительного подтверждения проникновения и нахождения внутри клеток конъюгата с МНД Apo-Si, содержащего два МНД, использовали конфокальную микроскопию. Клетки подготавливали как описано выше. При этом проводили окрашивание ядер красителем Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, США; 1:1000 в буфере HBSS в течение часа).

[00173] Заметное проникновение наблюдалось в клетках, обработанных конъюгатом с Apo-Si-11, содержащим 58-мерную двухцепочечную ДНК, и не наблюдалось в клетках, обработанных идентичным меченным Су3 олигонуклеотидом, не связанным с МНД. Это подтверждено как с помощью флуоресцентной микроскопии (Фиг. 6А), так и с помощью метода FACS (Фиг. 6В). При использовании 40 нМ конъюгата, содержащего МНД Apo-Si, наблюдалось проникновение в 98% клеток. При сравнении интенсивностей сигнала для 40 нМ и 10 нМ четко видна зависимость «доза-ответ». Эффективное проникновение конъюгата с Apo-Si через клеточные мембраны в клетки дополнительно продемонстрировано с помощью конфокальной микроскопии (Фиг. 6С).

[00174] Таким образом, МНД Apo-Si эффективно доставляет 58-мерный дцДНК-олигонуклеотид в клетки меланомы В16 дозо-зависимым образом.

[00175] Пример 5c. Клетки мышиной аденокарциномы толстой кишки C26

Чтобы продемонстрировать способность МНД Apo-Si эффективно доставлять сильно заряженные 58-мерные дцДНК в клетки мышиной аденокарциномы толстой кишки C26, клетки выращивали и поддерживали как описано выше. Кратко: клетки выращивали в среде DMEM с добавкой 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 1% препарата «ПенСтреп» во влажной камере с 5% СО₂ при 37°C.

[00176] Клетки изучали методом FACS. Для этого за день до трансфекции клетки С26 в количестве 16×10⁴ засевали в стандартные 6-луночные планшеты. 58-мерные двухцепочечные ДНК, связанные с двумя МНД Apo-Si-11 (каждый присоединен к 5'-концу олигонуклеотида) и меченные Су3, в концентрации 40 нМ инкубировали в полной питательной среде в течение 24 часов. В качестве контроля использовали ту же конструкцию, но без МНД Apo-Si. Клетки промывали буфером HBSS и измеряли интенсивность флуоресценции с использованием BD FACSAria™ III как описано выше.

[00177] Как видно на Фиг. 7, в 98% клеток, обработанных конъюгатом с Apo-Si-11, наблюдалась заметная флуоресценция. Такого проникновения в клетки, обработанные контрольным олигонуклеотидом, не наблюдалось. Следовательно, МНД Apo-Si-11 эффективно доставляет олигонуклеотид через клеточные мембраны.

[00178] Пример 5d. Человеческие клетки линии HeLa

Задача состояла в том, чтобы продемонстрировать способность МНД Apo-Si-11 эффективно доставлять сильно заряженные 58-мерные дцДНК в клетки человеческой эпителиальной карциномы шейки матки линии HeLa. Для этого клетки выращивали и поддерживали как описано выше. Кратко: клетки выращивали в среде DMEM с добавкой 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 1% препарата «ПенСтреп» во влажной камере с 5% СО₂ при 37°C.

[00179] Для анализа методом FACS за день до трансфекции клетки HeLa в количестве 16×10⁴ засевали в стандартные 6-луночные планшеты. Меченные Су3 58-мерные двухцепочечные ДНК, связанные с двумя МНД Apo-si-11, в концентрации 40 нМ инкубировали в полной питательной среде в течение 24 часов. В качестве контроля использовали меченную Су3 58-мерную ДНК. Клетки промывали буфером HBSS и измеряли интенсивность флуоресценции с помощью BD FACSAria™ III как описано выше. Наблюдалось заметное проникновение 58-мерной двухцепочечной ДНК, связанной с МНД Apo-Si, почти во все клетки культуры, которую обрабатывали этими клетками (Фиг. 8). В противоположность этому, такого проникновения контрольного олигонуклеотида в клетки не наблюдалось. Соответственно, сделан вывод, что меченная Су3 58-мерная двухцепочечная ДНК, несущая 58 отрицательных зарядов и связанная с двумя МНД Apo-Si-11, эффективно проникает в человеческие клетки линии HeLa in vitro.

[00180] Совокупность представленных в примере 5 результатов, полученных с использованием четырех разных типов клеток - мышиных фибробластов 3Т3, клеток мышиной меланомы В16, клеток мышиной карциномы толстой кишки С26 и клеток человеческой карциномы шейки матки линии HeLa - является свидетельством эффективной трансмембранной доставки и проникновения в клетки сильно заряженных макромолекул, если они соединены с одним либо двумя МНД Apo-Si-11. Подобного проникновения в клетки контрольных олигонуклеотидов, не связанных с МНД, не наблюдалось. Полученные данные подтверждают точку зрения, что применение МНД по изобретению для осуществления трансмембранной доставки олигонуклеотидов является универсальным и не ограничено отдельными типами клеток.

[00181] Пример 6. Демонстрация компонентов, улучшающих результат (PEM), включающих в себя субстрат для Dicer

В одном из воплощений изобретения предложен способ удаления МНД для обеспечения эффективного сайленсинга генов, основанный на активности белка Dicer. Этот белок представляет собой эндонуклеазу, которая участвует в процессинге двухцепочечной РНК, нарезая ее на фрагменты длиной 19-21 пар оснований, подходящих для вступления во взаимодействие с RISC (индуцируемый РНК сайленсинг-комплекс), результатом которого является сайленсинг гена. Данный способ включает: (i) введение конъюгата по изобретению, где олигонуклеотид представляет собой субстрат для Dicer, состоящий из двухцепочечной РНК длиной 25-30 нуклеотидов, где последовательность РНК выбрана соответственно целевому гену, сайленсинг которого планируется осуществить, и связанный с одним-двумя МНД по изобретению, соединенными с 3'-концом или 5'-концом смысловой цепи (цепи-«спутника») и/или с 5'-концом антисмысловой («ведущей») цепи; (ii) трансмембранную доставку указанной киРНК, осуществляемую МНД; (iii) расщепление киРНК ферментом Dicer с удалением при этом одного МНД из дуплекса; и (iv) последующее физиологическое разделение двойной спирали (например, ферментом геликазой семейства Argonaut) с высвобождением интактной антисмысловой цепи, вступающей во взаимодействие с RISC для сайленсинга конкретного целевого гена (Фиг. 3).

[00182] Для демонстрации этого механизма in vitro, дуплекс киРНК длиной 25-27 нуклеотидов, каждая цепь которого связана по 5'-концу с одним МНД Apo-Si-W как определено в формуле (VIIIb) (100 пмоль), и контрольную дцРНК, которая является идентичной, но не связана с МНД, инкубируют в 20 мл 20 мМ буферного раствора Tris (рН 8,0), 200 мМ NaCl и 2,5 мМ MgCl₂ вместе с 1 единицей рекомбинантного человеческого Dicer (Stratagene) в течение 24 часов. Из каждой реакционной смеси отбирают аликвоты объемом 3 мл (15 пмоль РНК) и проводят разделение в 15% неденатурирующем полиакриламидном геле, окрашивают красителем GelStar (Ambrex) и визуализируют в УФ-свете. Как показано на Фиг. 16, конъюгаты, содержащие два МНД, эффективно расщепляются белком Dicer на более короткие фрагменты дцРНК с удалением одного из МНД. Важно отметить, что присоединенные МНД не оказывают существенного влияния на эффективность расщепления белком Dicer (что было установлено при сравнении с расщеплением дцРНК длиной 25-27 нуклеотидов, не модифицированной присоединением Apo-Si-W). На Фиг. 16: дорожка №1: двухцепочечная РНК длиной 21 нуклеотид, подходящая по размеру для взаимодействия с RISC; дорожка №2: расщепление конъюгата, включающего в себя МНД Apo-Si-W, ферментом Dicer с удалением в результате одного МНД. Второй МНД остается присоединенным, что немного замедляет передвижение конъюгата в геле; дорожка №3: дуплекс киРНК длиной 25-27 нуклеотидов, некоторые нуклеотиды которого метилированы, являющийся субстратом для Dicer; дорожка №4: конъюгат дуплекса киРНК, включающий в себя два МНД Apo-Si-W; дорожка №5: дуплекс киРНК длиной 25-27 нуклеотидов без Dicer.

[00183] Результаты описанных исследований, выполненных в изолированной ферментной системе, дополнительно подтверждены данными экспериментов, проведенных in vitro в системах с живыми клетками, где конъюгаты киРНК с Apo-Si-W эффективно обеспечивали сайленсинг гена EFGP (примеры 7a и 7b).

[00184] Пример 7a. Сайленсинг гена EGFP конъюгатами, содержащими Apo-Si-W, в клетках линии HeLa in vitro

Для демонстрации упомянутого результата в качестве биологической системы использовали линию человеческих клеток HeLa со стабильной экспрессией усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) (клетки NIH-HeLa EGFP). Вводимый конъюгат по изобретению включал в себя киРНК, созданную для подавления экспрессии гена EGFP. В естественном состоянии, т.е. в отсутствие реагента, обеспечивающего трансфекцию, такой конструкт РНК не может проникнуть сквозь клеточную мембрану в цитоплазму, где он мог бы проявить активность в сайленсинге гена. После связывания этой киРНК с МНД по изобретению [в частности, представляющим собой группировку Е, как она определена в формуле (VIIIb) (где a = 2, и L₃ отсутствует; обозначается: «Apo-Si-W»)] наблюдалась активность в сайленсинге гена, при этом не потребовалось применять реагент для трансфекции.

формула (VIIIb): когда a = 2, и L₃ отсутствует, группировка обозначается: «Apo-Si-W»

[00185] С этой целью клетки инкубировали с конъюгатом по изобретению, содержащем киРНК, созданную для сайленсинга гена белка EGFP (IDT; Айова, США), связанную с двумя МНД, как они определены в формуле (VIIIb). Последовательность двухцепочечной РНК следующая: смысловая цепь в направлении 5' - 3': ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCG (SEQ ID. No. 5); антисмысловая цепь в направлении 5' - 3': CGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCA (SEQ ID. No. 6). В качестве контроля служила соответствующая двухцепочечная последовательность ДНК, связанная с группировкой МНД, поскольку такой конструкт ДНК не может осуществлять сайленсинг гена. Так, за день до эксперимента клетки NIH-HeLa EGFP в экспоненциальной фазе роста поместили в 24-луночные планшеты (4,5×10⁴ клеток/лунка) в среду DMEM с добавкой питательной среды (500 мкл/лунка) без антибиотиков. Конъюгат киРНК с МНД Apo-Si разводили в Opti-Mem (Life technologies) (100 мкл/лунка) и в конечной концентрации 40 нМ добавляли к клеткам.

формула (VIIIb); когда a = 2, и L₃ отсутствует,

обозначается: «Apo-Si-W»

[00186] Сайленсинг гена оценивали после инкубации в течение 72 часов. Клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (буфер HBSS) (Biological Industries, Израиль) и проводили анализ. Для детекции и количественного определения флуоресцентного сигнала EGFP использовали многорежимный ридер Tecan Infinite® 200 PRO (длина волны возбуждения - 488±4,5 нм, эмиссии - 535±10 нм). Как видно на Фиг. 9А, при использовании конъюгата киРНК с МНД Apo-Si-W наблюдался эффективный заметный сайленсинг гена. Эффект является дозозависимым: среднее значение показателя сайленсинга составляет 22% - при использовании 40 нМ конъюгата, и показатель увеличивается до 51% и 68% при концентрациях конъюгата 300 нМ и 600 нМ, соответственно (p < 0,001).

[00187] Пример 7b. Сайленсинг гена EGFP с использованием Apo-Si-W в клетках 3T3-EGFP in vitro

Методы: Для оценки способности Apo-Si-W эффективно осуществлять доставку и обеспечивать подавление экспрессии гена EGFP, два МНД Apo-Si-W связывали с соответствующей киРНК (по 5'-концу каждой цепи) и полученный конъюгат инкубировали с клетками 3T3-EGFP. Клетки засевали в 24-луночные планшеты (25000 клеток/лунка) в полной среде без антибиотиков. В указанных условиях клетки инкубировали с конъюгатом Apo-Si-W-дуплекс киРНК в течение 72 часов, при этом первые 24 часа использовали среду без сыворотки. Через 72 часа после трансфекции проводили аспирацию питательной среды и, затем, лизис клеток в буферном растворе для лизиса [50 мМ Tris (pH 8), 0,75% Тритон X-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерин и ингибитор протеаз Complete (Roche)]). Измерение интенсивности флуоресценции EGFP поводили с использованием многорежимного ридера Infinite М200 Pro (Tecan) при длине волны возбуждения 488 нм, и длине волны эмиссии 535 нм. В качестве контроля использовали такие же последовательности киРНК, но не связанные с МНД Apo-Si-W.

[00188] Результаты: как показано на Фиг. 9В, конъюгаты Apo-Si-W с киРНК заметно уменьшали экспрессию гена дозозависимым образом, где ингибирование на 65% наблюдалось при использовании конъюгата в концентрации 600 мМ (p<0,001).

[00189] Вывод: конъюгат, содержащий Apo-Si-W, эффективно опосредует доставку киРНК, соответствующей гену EGFP, в цитоплазму и, как следствие, сайленсинг гена в клетках EGFP-3T3 in vitro.

[00190] Пример 7c. Сайленсинг гена EGFP в клетках HeLa с помощью конъюгата, содержащего МНД Apo-Si-S-S (формула IXb) in vitro

Используемый конъюгат содержит два МНД Apo-Si-S-S как определено в формуле (IXb):

формула (IXb); когда a = 3, b = 0, и k = 1, обозначается: «Apo-Si-S-S»

Таким образом, структура конъюгата следующая:

[00191] Методы: для оценки способности конъюгатов по изобретению обеспечивать сайленсинг гена EGFP клетки HeLa-GFP засевали в 24-луночные планшеты, предназначенные для анализа на основе измерения флуоресценции (40000 клеток/лунка) и инкубировали с конъюгатами, содержащими киРНК, способной осуществлять сайленсинг гена EGFP и имеющей следующие последовательности цепей:

Антисмысловая последовательность : 5'-Apo-Si-S-S-CGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCA-3'(SEQ ID. No. 7); Смысловая последовательность: 5'-Apo-Si-S-S-ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCG-3'(SEQ ID. No. 8).

[00192] На следующий день клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) и среду заменяли на Opti-MEM, не содержащую сыворотки (Thermo Fisher Scientific), в которой их выдерживали 24 часа, после чего инкубировали в течение 48 часов в полной питательной среде. Через 72 часа после трансфекции проводили аспирацию среды и промывание клетки буфером HBSS. Измеряли интенсивность флуоресценции EGFP с использованием многорежимного ридера Infinite 200 Pro (Tecan) при длине волны возбуждения 488 нм, и длине волны эмиссии 535 нм.

[00193] Результаты: данные сайленсинга гена EGFP с помощью конъюгатов, содержащих МНД Apo-Si-S-S, представлены на Фиг. 9С. Как видно, наблюдался эффективный дозо-зависимый сайленсинг гена EGFP. В среднем, при использовании 10 нМ конъюгата киРНК с двумя МНД Apo-S-S обеспечивался сайленсинг гена на 62%, по сравнению с контрольными необработанными клетками. При применени конъюгата в концентрации 40 нМ сайленсинг гена был больше и составлял 80% (p<0,001) (Фиг. 9С).

[00194] Вывод: конъюгаты, содержащие киРНК, связанную с двумя МНД Apo-Si-S-S, надежно обеспечивают сайленсинг репортерного гена EGFP в клетках HeLa.

[00195] Пример 7d. Сайленсинг в клетках 3T3, в которых экспрессируется ген EGFP, с помощью конъюгата по изобретению, как он определен в формуле (IXb) (Apo-Si-S-S) in vitro

Методы: эксперимент, в целом, проводили как описано в примере 7с выше, но со следующими отличиями: линии мышиных фибробластов NIH-3T3, в которых экспрессируется белок EGFP, выращивали и поддерживали в среде DMEM с добавкой 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 1% препарата «ПенСтреп» во влажной камере с 5% СО₂ при 37°C. Затем в течение 72 часов клетки инкубировали с конъюгатом в концентрации 40, 150 и 300 нМ. Затем измеряли интенсивность флуоресценции белка EGFP с использованием ридера для ELISA. Параллельно проводились эксперименты с контролем, в качестве которого использовали клетки, не подвергнутые никакой обработке («необработанные»).

[00196] Результаты: в клетках, обработанных конъюгатом, содержащим Apo-Si-S-S, подавление экспрессии гена было очень значительным. Наблюдаемый уровень сайленсинга гена EGFP в клетках, обработанных конъюгатом в концентрации 40, 150 и 300 нМ, составил, соответственно, 90,0%, 91,5% и 92,0% (+0,1%).

[00197] Выводы: приведенные примеры подтверждают, что «молекулярные нанодвигатели» (МНД) способны: (i) осуществлять трансмембранную доставку киРНК, которая без них не может проникать через мембрану; (ii) направлять конъюгат E-РНК-E' в цитоплазму; и (iii) обеспечивать желаемое функционирование белковых сайленсинг-комплексов с конъюгатами по изобретению. Следует отметить, что данный конъюгат содержит МНД, присоединенный через расщепляемую группу (дисульфидную группу). Таким образом, подтверждена эффективность включения в конъюгат расщепляемой группы, что также входит в объем изобретения.

[00198] Пример 7e. Сайленсинг репортерного гена EGFP с помощью конъюгатов, содержащих МНД Apo-Si-G, in vitro

формула (IXc); когда a = 1, k = 1, а L₃ отсутствует;

группировка обозначается: «Apo-Si-G»

[00199] Методы: для оценки способности конъюгатов, содержащих МНД Apo-Si-G, нокаутировать ген EGFP в клетках 3T3-GFP, клетки засевали в 24-луночные планшеты, предназначенные для анализа на основе измерения флуоресценции (40000 клеток/лунка) и инкубировали с конъюгатами, содержащими Apo-Si-S-S. На следующий день клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS), заменяли среду на Opti-MEM, не содержащую сыворотки (Thermo Fisher Scientific), на 24 часа, после чего инкубировали в полной питательной среде в течение 48 часов. Через 72 часа после трансфекции проводили аспирацию среды и промывание клеток буферным раствором HBSS. Измеряли интенсивность флуоресценции EGFP с использованием многорежимного ридера Infinite 200 Pro (Tecan) при длине волны возбуждения 488 нм, и эмиссии - 535 нм.

[00200] Результаты: данные по сайленсингу гена EGFP с помощью конъюгатов, содержащих МНД Apo-Si-G, представлены на Фиг. 9D. Как видно, при использовании конъюгата в концентрации 10 нМ сайленсинг гена составлял, в среднем, 66%, а при использовании конъюгата в концентрации 40 нМ сайленсинг был больше и составлял 84% (p<0,001).

[00201] Вывод: конъюгаты, содержащие киРНК, связанную с двумя МНД Apo-Si-G, обеспечивают эффективный сайленсинг репортерного гена EGFP в клетках HeLa. Сходные результаты были получены с использованием клеточных линий 3T3-EGFP и 293T-EGFP.

[00202] В итоге, в примере 7 продемонстрировано применение нескольких разных конъюгатов по изобретению, имеющих разные структуры, но основные структурные элементы которых - одни и те же и соответствуют формуле (I) и формуле (VII), при этом все конъюгаты показали очень эффективную доставку киРНК в клетки и сайленсинг соответствующих генов.

[00203] Пример 8. Доставка конъюгата по изобретению, в котором Е имеет структуру как определено в формуле (VIIa), в клетки

Фиг. (VIIa); когда a = 2 и k = 1, обозначается: «Apo-Si-C4»

[00204] Клетки 3T3 и C26 выращивали и подготавливали как описано в примере 5 выше. Клетки инкубировали в течение 1, 2 и 24 часов с конъюгатом, содержащим 58-мерную двухцепочечную (дц) ДНК, связанную с флуорофором Су3 и двумя группировками Apo-Si-C4. Конъюгаты исследовали в двух концентрациях: 40 и 100 нМ. Анализ проводили методом флуоресцентной микроскопии и измеряли сигнал на ридере для ELISA как описано в примере 5 выше. В качестве контроля использовалась идентичная 58-мерная дцДНК, не связанная с группировками Е.

[00205] Уже через один час обнаруживали флуоресценцию конъюгата внутри клеток. Сигнал был зарегистрирован в цитоплазме, как и требуется. По истечении 2 часов интенсивность сигнала заметно увеличилась, а по прошествии 24 часов была еще больше. Проникновение конъюгата было точно измерено на ридере для ELISA: отношение интенсивности сигнала конъюгата и контрольной дцДНК, не связанной с МНД, для концентраций 40 и 100 нМ, было, соответственно, 80- и 72-кратным - для клеток C26, и 104- и 101-кратным - для клеток 3T3. Таким образом, конъюгат по изобретению чрезвычайно эффективно обеспечивал доставку сильно заряженной 58-мерной дцДНК в клетки обоих типов (в сравнении с результатами контрольных молекул, не содержащих МНД).

[00206] Пример 9a. Механизм редокс-чувствительного расщепления конъюгата по изобретению, где E, E' или E'' включает в себя циклическую группировку с дисульфидной группой и амидную группу

[00207] Описанным далее механизмом изобретение не ограничивается. В шестичленном кольце в молекуле конъюгата имеется дисульфидная группа. Поскольку в межклеточном пространстве превалируют окислительные условия, упомянутое кольцо в плазме крови и во внеклеточном пространстве остается стабильным. Внутри клеток конъюгат, наоборот, подвергается воздействию восстановительных условий среды, обеспечиваемых высоким уровнем глутатиона в цитоплазме. Соответственно, здесь происходит расщепление указанной дисульфидной группы с образованием свободных тиольных групп. По аналогии с другими циклическими молекулами с дисульфидной группой, считается, что значения рКа свободных тиольных групп - около 8 и 9. Ввиду того, что физиологическое значение рН внутри клетки составляет около 7, большинство тиольных групп, образовавшихся в результате расщепления дисульфидной группы, в любой момент времени являются свободными тиольными группами (-SH), а не соответствующими тиолатными группами (-S^-), которые считаются более нуклеофильными. Карбонильная группа в амидной группе специально расположена через пять или шесть атомов от тиольных групп. Аналогично катализу протеолиза, осуществляемого цистеиновыми протеиназами, происходит нуклеофильная атака по атому углерода карбонильной группы в амидной группе и отщепление эстрадиола. Таким образом, в цитоплазме происходит избирательное высвобождение именно транспортируемого лекарственного вещества (D). Если D представляет собой, например, киРНК, в цитоплазме удерживается олигонуклеотид с сильным отрицательным зарядом, готовый взаимодействовать in situ с индуцируемым РНК сайленсинг-комплексом (RISC) с осуществлением сайленсинга гена.

[00208] Данный механизм изображен на Фиг. 10: А) интактная молекула конъюгата во внеклеточном пространстве; В) расщепление дисульфидной связи в восстановительных условиях среды цитоплазмы; С) депротонирование тиольной группы с образованием тиолатной группы, где процесс является рКа-зависимым; D) нуклеофильная атака тиолатной группы по карбонильной группе в составе амидной группы; Е) образование тетраэдрического производного; F) последующее расщепление конъюгата с образованием тиоэфира; G) последующий гидролиз; и H) закрытие кольца с образованием дисульфидной группы, которое происходит в окислительных условиях среды внеклеточного пространства в процессе экскреции МНД из организма.

[00209] Пример 9b. Механизм редокс-чувствительного расщепления конъюгата по изобретению, где E имеет структуру как определено в формуле (Xc), и его использование для направленной доставки транспортируемого лекарственного вещества (D) в цитоплазму:

формула (Xc)

[00210] Описанный выше механизм расщепления соединения формулы (IX), имеющего амидную связь, реализуется и при расщеплении соединения формулы (Xc), имеющего карбаматную группу. На Фиг. 11: А) интактная молекула конъюгата во внеклеточном пространстве; В) расщепление дисульфидной связи в восстановительных условиях среды цитоплазмы; С) депротонирование тиольной группы с образованием тиолатной группы, где процесс является рКа-зависимым; D) нуклеофильная атака тиолатной группы по карбонильной группе в составе амидной группы; Е) образование тетраэдрического производного; F) последующее расщепление конъюгата с образованием тиоэфира; G) последующий гидролиз, с образованием CO₂; и H) закрытие кольца с образованием дисульфидной группы, которое происходит в окислительных условиях среды внеклеточного пространства в процессе экскреции МНД из организма.

[00211] Пример 10. Стабильность структуры формулы (XIa)

Синтез конъюгатов по изобретению, как правило, предполагает присоединение защитных групп к азотистым основаниям в синтезируемых олигонуклеотидах. Например, к аденину в качестве защитной группы часто присоединяют бензоил, к гуанидину - изобутирил, а к цитозину - ацетил. В конце процесса синтеза, для получения функционально-способного олигонуклеотида, эти защитные группы должны быть удалены. Обычно удаление защитных групп проводят в сильно щелочных условиях. Например, согласно стандартному протоколу компании IDT (Айова, США), для удаления защитных группа в ходе синтеза олигонуклеотидов проводят нагревание с гидроксидом аммония при 65°C в течение 2 часов. Чтобы оценить, выдержат ли соединения по изобретению удаление защитных групп в таких агрессивных условиях, сконструировали модельную систему на основе модельного соединения А, имеющего следующую структуру:

Модельное соединение А

[00212] 2 мг этого соединения нагревают в вышеописанных стандартных условиях удаления защитных групп. Образцы вынимают через 15 минут, 1 час и 2 часа после начала нагревания и анализируют методом ВЭЖХ-МС (высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией), изучая и оценивая их на предмет образования новых пиков. Важно отметить, что признаков разложения соединения А в условиях, установленных упомянутым протоколом, не выявлено. Таким образом, данный аналог соединения по изобретению остается стабильным в этих достаточно агрессивных щелочных условиях. Полученные данные относятся не только к удалению защитных групп с олигонуклеотидов в процессе синтеза конъюгатов по изобретению: выявленная высокая стабильность указывает на стабильность этих конъюгатов и при хранении.

[00213] Пример 11. Сайленсинг гена в первичной культуре гепатоцитов трансгенной мыши, в которой происходит экспрессия гена EGFP, с применением конъюгата по изобретению формулы (VIIa), где a = 2, и k = 1 (обозначается: «Apo-Si-C4»)

Двухцепочечную последовательность РНК, описанную в примере 7, соединили с двумя МНД, как они определены в формуле (VIIa), где a = 2, и k = 1 (обозначение: «Apo-Si-C4»). Конъюгат (40 нМ) затем инкубируют с белком-гистоном 2А (гистон Н2А; молекулярная масса - 14 кДа; New England Biolabs, Inc.) в течение 30 минут (соотношение гистон/РНК 2:1) для получения комплекса РНК+МНД+белок. Полученный комплекс инкубируют с клетками первичной культуры гепатоцитов трансгенной мыши, в которых экспрессируется ген EGFP. Через 72 часа измеряют сигнал флуоресценции от EGFP с использованием ридера для ELISA как описано в примере 7. На Фиг. 12 показано, что наблюдалось заметное уменьшение сигнала от EGFP - на 76%, в сравнении с флуоресцентным сигналом у клеток, инкубируемых с контрольных комплексом, содержащим ту же РНК+Н2А, но без МНД по изобретению. Полученные результаты подтверждают устойчивую эффективность МНД по изобретению в трансмембранной доставке макромолекулярных структур: комплекс дцРНК+Н2А+два МНД Apo-Si имеет молекулярную массу около 30 кДа и несет множество электрических зарядов. Результаты с очевидностью свидетельствуют о том, что данный комплекс способен эффективно проникать через клеточные мембраны и, более того, давать полезный биологический эффект, выражающийся в сайленсинге генов. При сравнении с данными контрольного комплекса, не содержащего МНД, становится понятно, что полученные результаты обусловлены исключительно МНД по изобретению.

[00214] Пример 12. Механизм редокс-чувствительного расщепления конъюгата по изобретению, где E, E' или E'' имеет структуру согласно приведенной ниже формуле, и его использование для направленной доставки транспортируемого лекарственного вещества (D) в цитоплазму

формула (VII); «Apo-Si-X-1»

Для этого варианта соединения формулы (VII) (Apo-Si-X-1) на Фиг. 13 показано следующее: А) интактная молекула конъюгата во внеклеточном пространстве; В) расщепление дисульфидной связи в восстановительных условиях среды цитоплазмы; С) депротонирование тиольной группы с образованием тиолатной группы, где процесс является рКа-зависимым; D) нуклеофиьная атака тиолатной группы по карбонильной группе в составе амидной группы; Е) образование тетраэдрического производного; F) последующее расщепление конъюгата с образованием тиоэфира; G) последующий гидролиз, с образованием, среди прочего, CO₂; и H) закрытие кольца с образованием дисульфидной группы, которое происходит в окислительных условиях среды внеклеточного пространства в процессе экскреции МНД из организма.

[00215] Пример 13. Исследование с моделированием молекулярной динамики (molecular dynamis, MD), в котором демонстрируется взаимодействие группировок Е по изобретению с фосфолипидными мембранами

Для упомянутой демонстрации были выбраны три соединения, структуры которых приведены ниже: a. соединение как определено в формуле (VII), обозначаемое: «Apo-Si-X-1»; b. соединение как определено в формуле (VII), обозначаемое: «Apo-Si-X-2»; и c. соединение как определено в формуле (IXb), обозначаемое: «Apo-Si-S-S».

Apo-Si-X-1 Apo-Si-X-2

Apo-Si-S-S

[00216] Методы: двуслойная мембрана из POPC (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), состоящая из 128 липидов POPC и водного слоя модели TIP3P 20Å, предварительно уравновешенная (400 наносекунд (нс) при 303 K), была загружена с сайта Stockholm Lipids (http://mmkluster.fos.su.se/slipids/Downloads.html). Была проведена параметризация соединений, представляющих собой Apo-Si, а именно: Apo-Si-X-1, Apo-Si-X-2 и Apo-Si-S-S, с использованием программного обеспечения AnteChamber. Моделирование проводили с использованием силового поля AMBER12sb в программном пакете Gromacs (версия 4.5). Изначально все соединения помещали в водный слой в ориентации: параллельно мембране. Чтобы сделать систему электрически нейтральной, в раствор добавляли ионы до концентрации 0,15 М NaCl. Сначала систему минимизировали с ограничением положений соединений до начальных, затем ограничения были сняты, при этом использовались 50000 шагов скорейшего спуска. Затем систему уравновешивали: сначала в ансамбле NVT (постоянные: количество частиц (number), объем (volume) и температура (temperature)) (500 пикосекунд (пс)), а затем - в ансамбле NPT (постоянные: количество частиц (number), давление (pressure) и температура (temperature)) (2 нс). В процессе уравновешивания NPT температура постепенно увеличивалась до 303 К (что выше температуры фазового перехода липидов). Были наложены ограничения на положение групп липидных головок (до вертикального (z) направления), а также самих соединений. Для уравновешивания в ансамбле NVT использовали термостат Нозе-Хувера с полуизотропным термостатированием, при этом было ограничено только положение соединений. Моделирование молекулярной динамики в аспекте производительности осуществляли в ансамбле NPT в течение 100 нс. Во всех вариантах моделирования применялось обрезание Ван-дер-Ваальсовского взаимодействия 12 Å. Электростатические взаимодействия дальнего радиуса действия рассчитывались суммированием по методу «частица-сетка» Эвальда. Периодически применялись пограничные условия. Для ограничения длины связей использовался алгоритм LINCS.

[00217] Результаты: как показано на Фиг. 14, изначально каждая молекула была помещена в водный слой около мембраны. Важно отметить, что за 30 нс (Apo-Si-X-1 и Apo-Si-X-2) и за 100 нс (Apo-Si-S-S) молекула сдвигалась с места и перемещалась вертикально в углеводородном слое мембраны, от поверхности раздела вода-липиды в центральную зону мембраны, где в итоге и оставалась по прошествии упомянутого времени (Фиг. 14А, 14В и 14С, соответственно). Было установлено, что в центральную зону мембраны каждое соединение тянут перфтор-группы, т.е. отрицательные полюса МНД (см. белые стрелки). У всех трех исследуемых соединений наблюдался один и тот же характер движения.

[00218] Вывод: это тщательно проведенное объективное моделирование, выполненное с целью изучения энергетики молекул в силовом поле фосфолипидной мембраны, дополнительно подтверждает описанный механизм действия (МД) МНД по изобретению. Сходные результаты наблюдений за тремя молекулами свидетельствуют о том, что в основе их эффекта лежит общий механизм действия. Продемонстрировано, что МНД по своим структурным/функциональным характеристикам, определяющим перемещение молекулы от поверхности раздела вода-углеводородная среда в центральную зону мембраны, чувствительны к дипольному потенциалу мембраны.

[00219] Пример 14. Включение в группировку Е «группировки динамического протонирования» для увеличения системного распределения конъюгатов по изобретению после их системного введения

Для обеспечения эффективной трансмембранной доставки конъюгатов по изобретению, содержащих макромолекулу транспортируемого лекарственного вещества, группировка Е имеет гидрофобную структуру. Для подобных группировок характерно максимальное связывание с белками плазмы крови, главным образом, с альбумином. Такое существенное связывание с белками плазмы крови может серьезно ограничить объем распределения конъюгатов, поскольку ограничивается распределение их во внутрисосудистом компартменте. Это противоположно желаемому для конъюгатов профилю, ввиду того, что требуется их широкое системное распределение с достижением разных тканей организма. Для решения этой потенциальной проблемы, согласно изобретению, в структуру Е предложено ввести аминогруппу. Ниже приведен пример такой группы в структуре, определенной в формуле (VIIIb) (Apo-Si-W):

формула (VIIIb); когда a = 2, и L₃ отсутствует, обозначается: «Apo-Si-W»

Форма A (незаряженный амин)

Форма B (протонированный, положительно заряженный аммоний)

Введение в структуру аминогруппы дает две формы группировки Е.

[00220] Форма A, гидрофобная. Амин в данной форме не несет электрического заряда. Эта структура является эффективным вариантом молекулярного нанодвигателя, обеспечивающим связь соединенных с ним макромолекул лекарственного вещества с клеточными мембранами и дальнейшее продвижение сквозь мембрану под действием электрического поля внутри мембраны, создаваемого ее дипольным потенциалом.

[00221] Форма B, относительно гидрофобная. В данной форме аминогруппа - протонированная. У такой протонированной формы молекулы коэффициент распределения липиды-вода (Log D) при физиологическом значении рН=7,4 снижен примерно на три порядка. Кроме того, положительный заряд в центре группировки Е ограничивает ее чувствительность к дипольному потенциалу мембраны, центральная зона которой тоже заряжена положительно. Это не позволяет группировке Е проникать и передвигаться внутри мембраны. Соответственно, конъюгат в такой форме в меньшей степени связывается с клеточными мембранами или белками плазмы крови во время своего свободного перемещения в жидких компартментах организма: плазме крови, внутриклеточной и внеклеточной жидкостях. Также, нахождение группировки Е в данной форме способствует ее экскреции из организма (с мочой или желчью) после отщепления от транспортируемого лекарственного вещества, что желательно.

[00222] Основным фактором, определяющим соотношение форм А и В группировки Е, является рКа аминогруппы. Обычно значение рКа вторичных аминов, подобных этому - около 11. Однако, группировка Е по изобретению сконструирована таким образом, что рКа аминогруппы в ней составляет 8,5, как показано на примере Apo-Si-W. Соответственно, в любой момент времени в любом компартменте организма и форма А, и форма В присутствует в значительном количестве, при этом молекула может переходить из одной формы в другую. Таким образом, вместе со способностью молекулярных нанодвигателей эффективно осуществлять трансмембранную доставку конъюгатов через клеточные мембраны, это обеспечивает широкое системное распределение конъюгата в организме. Кроме того, систему легко регулировать для оптимизации результата, изменяя длину углеводородной связывающей группы и соответствующего перфтор-мотива.

[00223] Пример 15. Подавление экспрессии гена PCSK9 в клетках мышиной печени Hepa 1-6 с помощью конъюгата по изобретению формулы (IXb)

формула (IXb); когда a = 3, b = 0 и k = 1, группировка обозначается: «Apo-Si-S-S»

[00224] PCSK9 участвует в снижении уровней холестерина в крови: когда он связывается с рецептором к ЛПНП (липопротеины низкой плотности), рецептор разрушается и больше не может принимать участие в удалении холестерина ЛНП из крови. Соответственно, если PCSK9 блокирован, больше рецепторов присутствует и функционирует на поверхности клеток печени, способствуя удалению холестерина ЛПНП из крови и, как следствие, снижению в ней уровней холестерина. Этот пример приводится для демонстрации способности конъюгатов по изобретению осуществлять сайленсинг генов, вовлеченных в патогенез заболевания (в данном случае - гиперхолистеринемии), и сайленсинг этого гена может входить в стратегию лечения. Также, в примере продемонстрирован сайленсинг гена в релевантных клетках, т.е., в данном случае, в линии клеток печени. Таким образом, продемонстрировано, что конъюгаты по изобретению активны не только в отношении репортерных генов, таких как EGFP, но могут применяться и для сайленсинга генов, вовлеченных в патогенез заболеваний.

[00225] Исследуемый конъюгат содержит две группировки Е, каждая из которых имеет структуру как определено в формуле (IXb), обозначенной: «Apo-Si-S-S». Эти группировки входят в состав конъюгата общей формулы (I), структура которого показана ниже и обозначается: «конъюгат Е-РНК-E'». Группировки Е произведены компанией Syncom, Ltd. (Нидерланды). Связывание с РНК осуществлено компанией IDT (Айова, США). Структура конъюгата следующая:

[00226] В конъюгате дцРНК представляет собой двухцепочечную РНК длиной 25-27 нуклеотидов, являющуюся субстратом для Dicer и специально сконструированную для сайленсинга гена PCSK9, которая связана. Было обнаружено, что конъюгат по изобретению в дозе 400 нМ индуцирует сайленсинг гена PCSK9 на 75,5%, при сравнении с контрольной РНК, имеющей ту же последовательность, но не связанную с молекулярными нанодвигателями Apo-Si (p<0,001).

[00227] Таким образом, в данном примере продемонстрировано, что молекулярные нанодвигатели (МНД) обеспечивают: (i) трансмембранную доставку киРНК, не способных проникать через мембрану другим образом; (ii) продвижение конъюгата E-РНК-E' в цитоплазму; и (iii) достижение желаемого результата в сайленсинге гена, вовлеченного в патогенез заболевания.

[00228] Пример 16. Сайленсинг в клетках 3T3, в которых экспрессируется ген EGFP, с помощью конъюгата по изобретению формулы (Xb) (Apo-Si-X-2)

В конъюгате, рассматриваемом в данном примере, каждая из групп E и E' имеет структуру как определено в формуле (Xb), где R = F, R' = H, a = 2, W = O, и k = 1. Структура конъюгата приведена ниже и обозначена как «Apo-Si-X-2».

формула (Xb)

[00229] Используются клетки 3T3, стабильно экспрессирующие ген EGFP. Линию клеток выращивают в среде Игла, модифицированной по методу Дульбеко (DMEM), с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки (fetal calf serum, FCS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина в количестве 10 мкг/мл и поддерживают в инкубаторе во влажном воздухе с 5% CO₂ при 37°C. За день до трансфекции 25000 клеток 3T3-EGFP помещают в 24-луночный планшет. На следующий день проводят трансфекцию клеток Apo-Si-X-2 (0,6 мкМ), связанным с последовательностью РНК, сконструированной для нокаутирования гена EGFP (последовательность приведена в примере 12). Через 72 часа после трансфекции проводят аспирацию среды, осуществляют лизис клеток и измеряют флуоресценцию с использованием многорежимного ридера Infinite® 200 PRO (Tecan). Содержание белка определяют при длине волны возбуждения 488±5 нм, и длине волны эмиссии 535±10 нм. В сравнении с контрольными клетками, обработанными киРНК, не связанными с молекулярными нанодвигателями Apo-Si, в клетках, обработанных конъюгатом по изобретению выявлено нокаутирование гена на 75%, что подтверждает эффективность конъюгатов.

[00230] Пример 17. Исследование с молекулярным моделированием, проведенное для демонстрации используемого в настоящем изобретении принципа динамического протонирования в качестве компонента, улучшающего результат. Этот принцип обеспечивает - в зависимости от степени протонирования МНД - водорастворимую форму молекулы, способную перемещаться в плазме или цитоплазме, и не растворимую в воде форму, способную перемещаться в среде клеточной мембраны, и вместе эти формы обеспечивают большой объем распределения конъюгата.

[00231] Методы: исследование с молекулярным моделированием взаимодействий непротонированной и протонированной форм Apo-Si-W проводилось как описано в примере 13. Структура используемого МНД представляла собой Apo-Si-W как определено в формуле (VIIIb), присоединенный к фосфатной группе, имитирующей фосфатные группы РНК. Используемый четвертичный амин Apo-Si-W находился в двух состояниях, описанных в примере 14: непротонированном и протонированном (был положительно заряженным). Работа над структурой в каждом состоянии протонирования проводилась независимо в компьютерной системе молекулярного моделирования фосфолипидных мембран в течение нескольких дней, пока не была получена модель с пробегом 100 нс. Начальное положение каждой структуры: параллельно поверхности мембраны.

Apo-Si-W

[00232] Результаты: на Фиг. 15 показано положение каждой молекулы в конце пробега продолжительностью 100 наносекунд. Был установлено, что протонированная, положительно заряженная форма (Фиг. 15А) не проникла в мембрану в течение всего модельного периода. Гидрофобная, непротонированная форма молекулы, наоборот, превосходно входила в фосфолипидную мембрану (Фиг. 15В). Интересно и важно отметить, что проникновение незаряженной формы молекулы вглубь мембраны происходило в соответствии с полярностью электрического поля внутри мембраны, а именно: отрицательный полюс МНД достигал центральной зоны мембраны, т.е. положительного полюса электрического поля.

[00233] Вывод: как установлено в этой молекулярной модели, состояние протонирования единственного динамически протонируемого атома азота способно управлять взаимодействием всего мотива Е с мембраной.

[00234] Пример 18. Сайленсинг гена PMP22 в клетках S16 с использованием конъюгата по изобретению

Болезнь Шарко-Мари-Тута является основным неврологическим заболеванием, затрагивающим шванновские клетки, которые формируют миелиновую оболочку периферических нервов, необходимую для электроизоляции нервных волокон. У больных этим заболеванием в три раза больше сегмента гена, кодирующего белок PMP22, являющийся важным структурным белком шванновских клеток. Это приводит к переизбытку PMP22, создающему разрушительные метаболические механизмы в этих клетках и, в итоге, их дегенерацию. Таким образом, киРНК, предназначенные для сайленсинга гена PMP22, могут быть полезны для снижения белковой нагрузки в шванновских клетках и, соответственно, для остановки прогрессирования заболевания и адекватной регенерации ткани.

Методы : для демонстрации способности конъюгата по изобретению подавлять экспрессию гена PMP22, мы использовали соответствующую последовательность киРНК, соответствующий дуплекс киРНК, связанный по 5'-концу каждой цепи с группировкой E, E' или E'' по изобретению, где каждая группировка имеет структуру как определено в формуле (IXb), где a = 3, b = 0, и k = 1. Такая группировка обозначается: «Apo-Si-S-S»:

Apo-Si-S-S

В качестве клеточной системы использовались клетки S16, являющиеся крысиными шванновскими клетками. Клетки засевали в 6-луночные планшеты (800000 клеток/лунка). На следующий день клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) и меняли среду на Opti-MEM, не содержащую сыворотки (Thermo Fisher Scientific). Клетки обрабатывали 400 нМ и 600 нМ Apo-Si-S-S-дуплекскиРНК (субстрат для Dicer) в течение 24 часов, и полной питательной средой - в течение следующих 24 часов. Через 48 часов после трансфекции проводили аспирацию среды, лизис клеток реагентом «Тризол» (Thermo Fisher Scientific) и экстрагировали РНК с использованием мини-набора для экстракции РНК PureLink (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкции производителя. Проводили обратную транскрипцию РНК и количественную полимеразную цепную реакцию с полученной кДНК в реальном времени (ПЦР-РВ), используя системы для проведения ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific).

Результаты : способность конъюгатов Apo-Si-S-S-МНД подавлять экспрессию PMP22 проиллюстрирована на Фиг. 17 (среднее ± стандартное отклонение (СО)). В качестве контроля служили необработанные клетки и клетки, обработанные киРНК против EGFP (и против PMP22). Было показано, что конъюгаты, содержащие МНД Apo-Si-S-S, эффективно снижают уровень экспрессии (осуществляют сайленсинг) гена PMP22 дозозависимым образом. В сравнении с необработанными клетками, при использовании дозы 400 нМ сайленсинг составляет 57%, а при использовании дозы 600 нМ достигает 66%.

Вывод : подтверждена потенциальная польза конъюгата по изобретению, содержащего киРНК против PMP22, связанную с двумя МНД по изобретению [Apo-Si-S-S-дуплекскиРНК (субстрат для Dicer)] в качестве эффективного средства для лечения болезни Шарко-Мари-Тута, поскольку конъюгат обладает способностью подавлять экспрессию вовлеченного в патогенез заболевания гена, кодирующего экспрессируемый в избытке белок PMP22.

Пример 19. Демонстрация прямой связи между трансмембранной доставкой конъюгата по изобретению формулы (VIIa) (где a = 2, и k = 1; обозначение: «Apo-Si-C4») и дипольным потенциалом мембраны/электрическим полем внутри мембраны (ЭПВМ).

Флоретин является ингибитором дипольного потенциала мембраны и создаваемого этим потенциалом ЭПВМ, а 6-кетохолестанол (6-КХ) существенно усиливает ЭПВМ. В этой связи, проводилось изучение возможной связи между эффектами модуляторов дипольного потенциала флоретином и 6-КХ и уровнем проникновения конъюгатов по изобретению (содержащих МНД Apo-Si-C4, связанные с дцДНК, включающей в себя приведенные далее последовательности: смысловая:/5'-МНД/TT/iCy3/CGGTGGCAGATGAACTTCAGGGTCA (SEQ ID. No. 9);

антисмысловая:/5 ' -МНД/TGACCCTGAAGTTCATCTGCCACCGAA (SEQ ID. No. 10); где Cy3 представляет собой красный флуорофор).

Методы

За один день до эксперимента клетки 3T3-EGFP в экспоненциальной фазе роста помещали в 6-луночные планшеты, при плотности 5×10⁵ клеток/лунка, заполненные полной средой DMEM без антибиотиков. Клетки инкубировали в течение 1 часа с флоретином (750 мкМ) при 37°C или с 6-КХ (100 мкМ) при 37°C. Проводили промывку от 6-КХ, а флоретин оставляли в среде. Вышеупомянутый конъюгат разводили Opti-Mem до концентрации 500 мкл/лунка и на 2 часа добавляли к клеткам в конечной концентрации 40 нМ. Через 2 часа после трансфекции оценивали доставку конъюгата. Для этого проводили трипсинизацию с добавкой сбалансированного солевого раствора Хенкса (буфер HBSS) (Biological Industries, Израиль) и центрифугирование при 1200 об./мин. в течение 5 мин, ресуспендирование клеток в сбалансированном солевом растворе Хенкса и анализ с использованием клеточного сортера FACSAria III (BD Biosciences; Сан-Хосе, Калифорния, США) и программного обеспечения Cell Diva. Для каждого образца сортировали, в целом, 10⁴ событий.

Результаты

Результаты анализа методом FACS подтверждают, что конъюгат по изобретению способен эффективно осуществлять доставку в клетки: уже после 2 часов инкубации 68% клеток были меченными. Для сравнения: только 1,5% клеток, обработанных флоретином, были связаны с конъюгатом, содержащим Apo-Si-C4 (Фиг. 18А). 6-Кетохолестанол индуцировал увеличение проникновения конъюгата, содержащего Apo-Si-C4, в клетки (Фиг. 18В): хотя число клеток на изображениях в светлом поле было таким же, флуоресценция Су3 в клетках, обработанных 6-КХ, была гораздо более интенсивной, что свидетельствует о большем числе проникших в клетки молекул.

Вывод : как показано в этом эксперименте, «выключение» и «включение» дипольного потенциала мембраны и, соответственно, электрического поля внутри мембраны, определяет и напрямую связано с проникновением в клетки конструкции, содержащей МНД Apo-Si.

Пример 20. Структурный/функциональный анализ полярности молекул по изобретению

Задача: продемонстрировать важность ассиметричной полярности, характерной для всех МНД, как они определены в формулах (VII)-(XId):

Методы

С этой целью сконструировали и провели оценку двух конъюгатов-аналогов:

(i) конъюгата дцДНК, связанной с E и E', каждая из которых имеет структуру как определено в формуле (VIIa); обозначается: «Apo-Si-C4»:

Apo-Si-C4

и

(ii) «мутантного», сходного по структуре аналога, обозначенного как «контроль А», в котором каждая из E и E' имеет структуру Apo-Si-C4, но без атомов фтора, играющих важную роль в генерации ассиметричной полярности молекулы:

Контроль A

Обе эти группировки МНД были связаны с 58-мерным ДНК-олигонуклеотидом, меченным флуорофором Су3, и подвергнуты анализу методом FACS.

За один день до эксперимента клетки 3T3-EGFP в экспоненциальной фазе роста помещали в 6-луночные планшеты, при плотности 0,2-0,5×10⁵ клеток/лунка, заполненные полной средой DMEM без антибиотиков. Каждый из меченных Су3 олигонуклеотидов (связанный и не связанный с МНД) разводили Opti-Mem до концентрации 500 мкл/лунка и добавляли к клеткам в конечной концентрации 40 нМ. Доставку конъюгата оценивали после инкубации в течение 2-24 часов. После завершения периода инкубации клетки трипсинизировали с добавкой сбалансированного солевого раствора Хенкса (буфер HBSS) (Biological Industries, Израиль) и центрифугировали при 1200 об./мин. в течение 5 мин, ресуспендировали клетки в сбалансированном солевом растворе Хенкса и проводили их анализ с использованием клеточного сортера FACSAria III (BD Biosciences; Сан-Хосе, Калифорния, США) и программного обеспечения Cell Diva. Для каждого образца сортировали, в целом, 10⁴ событий. Детекцию и количественную оценку Cy3-положительной популяции проводили, измеряя интенсивность флуоресценции и сравнивая результаты в клетках, инкубированных с конъюгатом Apo-Si-4С, и в клетках, инкубированных с контрольным конъюгатом А.

Результаты

Большинство клеток, инкубированных с конъюгатом Apo-Si-4C, давали сильный флуоресцентный сигнал Су3 уже через 2 часа инкубации. Интенсивность сигнала нарастала к истечению 24 часов инкубации. Для сравнения: клетки, инкубируемые с контрольным конъюгатом А, не давали сигнала Су3 ни через 2 часа, ни через 24 часа инкубации.

Вывод

В данном примере продемонстрировано значение ассиметричной полярности для функционирования МНД по изобретению. Все соединения формул (VII)-(XId) «работают» по этому принципу, т.е. в примере показана общая закономерность, объединяющая все аспекты изобретения и лежащая в основе способности конъюгатов осуществлять трансмембранную доставку.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Aposense LTD.

ZIV, Ilan

<120> COMPOUNDS AND METHODS FOR TRANS-MEMBRANE DELIVERY

OF MOLECULES

<130> P-79037-PC1

<150> 15/164,344

<151> 2016-05-25

<150> 15/057,813

<151> 2016-03-01

<150> 14/985,526

<151> 2015-12-31

<150> 14/872,179

<151> 2015-10-15

<150> 14/870,406

<151> 2015-09-30

<150> 14/830,799

<151> 2015-08-20

<150> PCT/IL2015/000019

<151> 2015-03-29

<150> 61/971,548

<151> 2014-03-28

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> C is attached to MNM-TT-iCy3

<400> 1

cggtggtgca gatgaacttc agggtca 27

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> T is attached to MNM

<400> 2

tgaccctgaa gttcatctgc accaccgaa 29

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> C is attached to Apo-si-11-TT-iCy3

<400> 3

cggtggtgca gatgaacttc agggtca 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> T is attached to Apo-si-11

<400> 4

tgaccctgaa gttcatctgc accaccgaa 29

<210> 5

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial short sequence

<400> 5

acccugaagu ucaucugcac caccg 25

<210> 6

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial short sequence

<400> 6

cgguggugca gaugaacuuc aggguca 27

<210> 7

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial short sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> C is attached to Apo-Si-S-S

<400> 7

cgguggugca gaugaacuuc aggguca 27

<210> 8

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial short sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> A is attached to Apo-Si-S-S

<400> 8

acccugaagu ucaucugcac caccg 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> C is attached to MNM/TT/iCy3

<400> 9

cggtggcaga tgaacttcag ggtca 25

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> T is attached to MNM

<400> 10

tgaccctgaa gttcatctgc caccgaa 27

<---

Конъюгат общей формулы (I)

или фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты соединения, представленного структурой, как определено в формуле (I), а также сольваты и гидраты указанных солей,

где D представляет собой лекарственное вещество, которое требуется доставить через биологические мембраны, выбранное из группы, состоящей из низкомолекулярного лекарственного вещества, пептида, белка, природной либо модифицированной, одноцепочечной или двухцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) либо рибонуклеиновой кислоты (РНК), короткой интерферирующей РНК (киРНК) и антисмыслового олигонуклеотида (АСО); символы y, z и w, каждый, обозначают целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, при этом, если указанное целое число представляет собой 0, это означает, что соответствующая группировка E отсутствует; и где по меньшей мере один из y, z и w отличается от 0;

где E, E'или E'' имеет структуру, как определено в формуле (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh) или (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh), включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты, а также сольваты и гидраты указанных солей; при этом D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I); L₃ отсутствует либо выбрана из линейной, циклической или разветвленной C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇ или C₈ углеводородной цепи, возможно связанной с простой эфирной группой или аминогруппой; символы a, b, k и d, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и R''' выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила:

формула (VIIIa),

формула (VIIIb),

формула (VIIIc),

формула (VIIId),

формула (VIIIe),

формула (VIIIf),

формула (VIIIg),

формула (VIIIh),

или

где E, E' или E'', независимо, имеет структуру, как определено в формуле (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg) или (IXh), включая фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты и металлохелаты, а также сольваты и гидраты указанных солей:

формула (IXa),

формула (IXb); когда a = 3, b = 0 и k = 1, группировка обозначается: «Apo-Si-S-S»,

формула (IXc); когда a = 1 и k = 1, группировка обозначается: «Apo-Si-G»,

формула (IXd),

формула (IXe),

формула (IXf),

формула (IXg),

формула (IXh),

или

где одна или более чем одна из группировок E, E' и E'' включает в себя карбаматную группу, а расщепляемая дисульфидная группа входит в состав циклической структуры, как определено в формуле (X), (Xa), (Xb) или (Xc); при этом дисульфидная группа может быть либо в окисленной, либо в восстановленной (открытое кольцо) форме:

формула (X),

формула (Xa),

формула (Xb),

формула (Xc),

где символы a, b и k, каждый независимо, обозначают целое число, выбранное из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6; h обозначает целое число 1, 2, 3 или 4; Z выбрано из группы, состоящей из водорода, фтора, гидроксильной группы и аминогруппы; R и R', каждый независимо, выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, гидроксильной группы, метоксигруппы и фторзамещенной углеводородной группы; L₃ отсутствует либо выбрана из линейной, циклической или разветвленной C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇ или C₈ углеводородной цепи, возможно связанной с простой эфирной группой или аминогруппой; G выбрана из группы, состоящей из водорода, галогена, гидроксильной группы, метоксигруппы и фторзамещенной углеводородной группы; W выбрана из кислорода, амидной группы, сложноэфирной группы и аминогруппы (вторичной и третичной аминогруппы); D представляет собой лекарственное вещество, как оно определено в формуле (I).