Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу умерщвления насекомого Phyllotreta spp., к способу задержки развития насекомого Phyllotreta spp., а также к способу борьбы с насекомым Phyllotreta spp. Также раскрыта инсектицидная композиция, обладающая инсектицидной активностью против Phyllotreta spp., а также способ, обеспечивающий растение, имеющее повышенную стойкость к насекомому Phyllotreta spp. Изобретение также относится к растению, имеющему повышенную устойчивость к насекомому Phyllotreta spp., клетке такого растения, а также к рекомбинантному ДНК конструкту для борьбы с насекомым Phyllotreta spp. Изобретение позволяет эффективно бороться с Phyllotreta spp. 10 н. и 18 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ И ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/030430, поданной 29 июля 2014 года, которая включена посредством ссылки в данный документ в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащихся в файле ʺ40-21_60779_0000_US_ST25.txtʺ (2098 Кб, созданный 26 июля 2014 года, поданный с предварительной заявкой на патент США № 62/030430 29 июля 2014 года), включен посредством ссылки в данный документ в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащихся в файле ʺ40-21_60779_0000_WO_ST25.txtʺ (2103 Кб, созданный 8 июля 2015 года), подан таким образом и включен посредством ссылки в данный документ в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] В данном документе описаны способы борьбы с заражениями беспозвоночными вредителями, особенно у растений, композиции и полинуклеотиды, полезные в таких способах, и растения, имеющие повышенную устойчивость к беспозвоночным вредителям. Более конкретно, раскрыты полинуклеотиды и способы их использования для модификации экспрессии генов у насекомых-вредителей, в частности с помощью РНК-интерференции. Виды вредителей включают блошек, таких как Phyllotreta spp. и Psylliodes spp.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Коммерческие сельскохозяйственные культуры часто являются объектами нападений со стороны беспозвоночных вредителей, таких как насекомые. Композиции для борьбы с заражениями насекомыми у растений, как правило, были в форме химических инсектицидов. Однако есть несколько недостатков при использовании химических инсектицидов. Например, химические инсектициды, как правило, не селективны, и применение химических инсектицидов, предназначенных для борьбы с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур, может оказывать свои воздействия на не целевых насекомых, а также других беспозвоночных. Химические инсектициды часто сохраняются в окружающей среде и могут медленно деградировать, таким образом, потенциально накапливаясь в пищевой цепи. Кроме того, использование стойких химических инсектицидов может привести к развитию резистентности у целевых видов насекомых. Таким образом, уже давно назрела необходимость более экологически чистых способов для борьбы или истребления заражения насекомыми на или в растениях, например, способы, которые являются видоспецифическими, экологически инертными, нестойкими и биодеградируемыми, и которые хорошо вписываются в схемы управления устойчивостью к вредителям.
[0004] РНК-интерференция (РНКи, РНК-опосредованное подавление гена) - это подход, который показывает перспективы для использования в экологически чистой борьбе с вредителями. У беспозвоночных, РНКи-основанное подавление гена было впервые продемонстрировано у нематод (Fire et al., (1998) Nature, 391:806-811; Timmons & Fire (1998) Nature, 395:854). Впоследствии, о РНКи-основанном подавлении генов беспозвоночных с использованием техник рекомбинантных нуклеиновых кислот сообщалось у ряда видов, включая сельскохозяйственно- или экономически значимых вредителей от различных таксонов насекомых и нематод, таких как: корневые нематоды (Meloidogyne spp.), см. Huang и др. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:14302-14306, doi:10.1073/pnas.0604698103); хлопковая совка (Helicoverpa armigera), см. Mao и др. (2007) Nature Biotechnol., 25:1307-1313, doi:10.1038/nbt1352; Западная блошка длинноуса (Diabrotica virgifera LeConte), см. Baum и др. (2007) Nature Biotechnol., 25:1322-1326, doi:10.1038/nbt1359; нематода сахарной свеклы (Heterodera schachtii), см. Sindhu и др. (2008) J. Exp. Botany, 60:315-324, doi:10.1093/jxb/ern289; комар (Aedes aegypti), см. Pridgeon и др. (2008) J. Med. Entomol., 45:414-420, doi: full/10.1603/0022-2585%282008%2945%5B414%3ATAADRK%5D2.0.CO%3B2; плодовые мошки (Drosophila melanogaster), мучные жуки (Tribolium castaneum), гороховые тли (Acyrthosiphon pisum), и табачная гусеница с рогом (Manduca sexta), см. Whyard и др. (2009) Insect Biochem. Mol. Biol., 39:824-832, doi:10.1016/j.ibmb.2009.09.00; капустная моль (Plutella xylostella), см. Gong и др. (2011) Pest Manag. Sci., 67: 514-520, doi:10.1002/ps.2086; зеленая персиковая тля (Myzus persicae), см. Pitino и др. (2011) PLoS ONE, 6:e25709, doi:10.1371/journal.pone.0025709; бурая рисовая цикадка (Nilaparvata lugens), см. Li и др. (2011) Pest Manag. Sci., 67:852-859, doi:10.1002/ps.2124; и белокрылка (Bemisia tabaci), см. Upadhyay и др. (2011) J. Biosci., 36:153-161, doi:10.1007/s12038-011-9009-1.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Данные варианты реализации изобретения относятся к контролю видов насекомых, особенно видов земляных блошек, которые являются экономически или сельскохозяйственно важными вредителями. Композиции и способы, описанные в данном документе, включают рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, такие как рекомбинантные ДНК конструкты для создания трансгенных растений, устойчивых к заражению видами насекомых, и полинуклеотидные агенты, такие как РНК ʺтриггерыʺ, которые полезны для борьбы с или предотвращения заражения этими видами насекомых. Несколько вариантов реализации изобретения, описанных в данном документе, относятся к полинуклеотид-содержащим композициям (например, композиция, содержащая дцРНК триггер для подавления гена-мишени) которые наружно применяются к видам насекомых или растению, части растения, или семенам для защиты от заражения видами насекомых. Другие варианты реализации изобретения относятся к способам отбора предпочтительных генов-мишеней насекомых, которые наиболее вероятно будут эффективными мишенями для РНКи-опосредованного контроля видов насекомых.
[0006] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения насекомыми, включая контактирование насекомого с дцРНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит цепь РНК с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит цепь РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724. В различных вариантах реализации изобретения, контактирование с насекомым осуществляется путем перорального введения, или непероральным контактом, например, путем проникновения через кутикулу, или путем комбинирования перорального и неперорального введения. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК триггер подавляет ген-мишень у насекомого и тормозит рост, развитие или размножение насекомого, или убивает насекомое.
[0007] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу умерщвления или приостановки роста насекомого, включая предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один подавленный элемент, отличающийся тем, что по меньшей мере один подавленный элемент является по существу идентичным или по существу комплементарным фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, и при этом проглатывание полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательность гена-мишени является выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, подавленный элемент содержит цепь РНК с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, подавленный элемент содержит цепь РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид предусмотрен в рационе насекомого в форме растительной или бактериальной клетки, содержащей полинуклеотид, или как синтетическая полинуклеотидная молекула, или как продукт ферментации (например, дцРНК шпилькообразной формы, произведенная в бактерии). В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой молекулу рекомбинантной РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу РНК.
[0008] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащей инсектицидно-эффективное количество полинуклеотида, отличающегося тем, что полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на от около 95% до около 100% комплементарных соответствующей части гена-мишени насекомого, которое заражает растение. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной соответствующей части гена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединица коатомеры) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на около 95% до около 100% комплементарных последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой рекомбинантную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой молекулу являющуюся дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция дополнительно содержит один или более агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых и регулятор роста насекомых. Варианты реализации инсектицидных композиций включают неполинуклеотидные инсектициды, например, бактериально-произведенный инсектицидный белок.
[0009] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего повышенную стойкость к насекомым, включая экспрессирование в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК полинуклеотид, имеющий последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, причем прием внутрь полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в структуре стебель-петля. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0010] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к рекомбинантному ДНК конструкту, содержащему гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарни с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к коммерческим единицам семян, таким как мешок, в котором все или практически все семена содержат рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в структуре стебель-петля. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт содержит РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт содержит РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0011] В связанных аспектах, предусмотренных в данном документе, присутствуют искусственные композиции, содержащие полинуклеотид или триггер, как описано в данном документе, такой как дцРНК составы, используемые для местного нанесения на растение, или вещество, нуждающееся в защите от заражения насекомыми; рекомбинантные конструкции и векторы, пригодные для получения трансгенных растительных клеток и трансгенных растений; составы и покрытия, используемые для обработки растений (включая семена растений или части, пригодные для размножения, такие как клубни); семена растений или части, пригодные для размножения, такие как клубни, обработанные с или содержащие полинуклеотид как описано в данном документе, а также товарную продукцию и продукты питания, произведенные из таких растений; семена или части, пригодные для размножения (особенно товарную продукцию и продукты питания, имеющие обнаруживаемое количество полинуклеотида, описанного в данном документе). Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам, которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам, которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их комплемента. Такие антитела производят с помощью рутинных способов известных среднему специалисту в данной области техники.
[0012] Другие аспекты и конкретные варианты реализации изобретения описаны в следующем подробном описании и работающих примерах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0013] Настоящие варианты реализации изобретения относятся к способам и композициям для борьбы с насекомыми-вредителями, в частности группой жесткокрылых насекомых, широко известных как ʺблошкиʺ, среди которых существует несколько родов. Описанные в данном документе, гены-мишени определены как полезные для проектирования полинуклеотидных агентов для предотвращения или лечения заражений блошкой, особенно у коммерчески важных растений. Способы и композиции являются особенно полезными для предотвращения или лечения заражений блошкой коммерчески важных видов Brassica, включая виды, используемые в промышленности в качестве масличного сырья, продуктов питания, или корма для скота (например, канола, рапс, репа, и горчица полевая или турнепс). Такие виды рода Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Также описаны последовательности для подавления одного или более генов-мишеней блошки. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидным агентам, например, в форме дцРНК ʺтриггеровʺ, которые подавляют гены-мишени блошек. В некоторых вариантах реализации изобретения предусмотрены полинуклеотиды и рекомбинантные молекулы ДНК и конструкты полезные для способов борьбы с насекомыми-вредителями, особенно блошками. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к инсектицидным композициям, а также к трансгенным растениям устойчивым к заражению насекомыми-вредителями. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам идентификации эффективных полинуклеотидных агентов, например, двухцепочечных молекул РНК, для борьбы с насекомыми-вредителями и способам идентификации генов-мишеней, которые, вероятно, выполняют важные функции, что делает эти гены предпочтительными целями для РНКи-опосредованного подавления и контроля насекомых-вредителей.
[0014] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам и композициям для ингибирования или контролирования заражения растения блошками с помощью ингибирования экспрессии одного или более гена-мишеней блошки, выбранных из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ингибирование экспрессии одного или более гена-мишени у блошки приводит к замедлению роста или гибели.
[0015] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидной молекуле, такой как дцРНК, которая содержит один или более сегментов, содержащих 18 или более смежных нуклеотидов, например, 21 или более смежных нуклеотидов, имеющих 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера ) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит несколько сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит 21 смежных нуклеотидов, имеющих 100% комплементарность фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Например, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит сегменты, соответствующие различным участкам гена-мишени, или может содержать множественные копии сегмента. В других вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит несколько сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарной фрагменту другого гена-мишени; таким образом несколько генов-мишеней, или несколько видов насекомых, могут быть подавлены.
[0016] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекуле дцРНК, иногда упоминаемой в данном документе как ʺтриггерʺ, который ингибирует экспрессию одного или более генов-мишеней насекомых, выбранных из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к дцРНК имеющей длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК (таких как эндогенно образующиеся миРНК и зрелые микроРНК), например, дцРНК состоит из по меньшей мере около 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК имеет длину от между около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК имеет по меньшей мере 50 пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК формируется из двух отдельных, по существу комплементарных цепочек (например, где каждая цепь представлена отдельно, или где каждая цепь кодируется на отдельной молекуле ДНК, или где две цепи кодируются на отдельных участках ДНК и отдельно транскрибируются или создаются отдельно, например, под действием рекомбиназы или нуклеазы), при этом по меньшей мере одна цепь РНК содержит последовательность, имеющая от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК является тупоконечной, например, две раздельные, равной длины цепи РНК, которые формируют дцРНК посредством межмолекулярной гибридизации. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК имеет "липкие" концы на одном или обоих концах (сайт терминации транскрипции), например, две раздельные, неравной длины цепи РНК, которые формируют дцРНК посредством межмолекулярной гибридизации; "липкий" конец может быть отдельным нуклеотидом или 2, 3, 4, 5, 6 или более нуклеотидами, и может быть расположен на 5ʹ конце или на 3ʹ конце цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один стебель-петлю, например, одна молекула РНК, которая формирует дцРНК с вторичной структурой ʺшпилькаʺ посредством внутримолекулярной гибридизации. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК формируется из одного самогибридизующегося транскрипта шпильки, где одна ʺрукаʺ шпильки содержит последовательность, имеющую от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, самогибридизующиеся транскрипты, которые формируют шпильки (или частичные шпильки), включают в себя молекулы дцРНК, которые включают ʺспейсерныеʺ нуклеотиды или одноцепочечный ʺучасток петлиʺ между дцРНК-формирующими комплементарными ʺрукамиʺ смысловой последовательности и анти-смысловой последовательности. В вариантах реализации изобретения, такие спейсеры или петли включают в себя нуклеотиды, имеющие последовательность несвязанного (не комплементарных или идентичных) гена-мишени, соответствующего двухцепочечному фрагменту шпильки. Примеры спейсеров или петель включают те, что кодируются с помощью SEQ ID NO: 1719-1721. В вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит несколько стеблей-петель с или без нуклеотидов спейсера между каждым стеблем-петлей. В вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит модифицированный стебель-петлю, такой как ʺстабилизированную анти-смысловуюʺ петлю или ʺстабилизированную смысловуюʺ петлю; см., например, патент США № 7855323 и 9006414, которые включены посредством ссылки в данный документ в полном объеме.
[0017] ДцРНК может быть химически синтезирована (например, с помощью in vitro транскрипции, такой как транскрипция с использованием T7 полимеразы или других полимераз), или может быть получена путем экспрессии в микроорганизме, путем экспрессии в растительной клетке, или путем микробной ферментации. ДцРНК может быть химически модифицирована, например, для улучшения стабильности, простоты препарата или эффективности. В некоторых вариантах реализации изобретения, молекула дцРНК представлена в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует дцРНК (такую как дцРНК триггер шпилькообразной формы), или в микробном продукте ферментации.
[0018] Различные способы конструирования и производства разнообразных форм дцРНК известны в данной области техники и являются полезными в композициях и способах, описанных в данном документе. См., например, следующие патенты, которые включены посредством ссылки в данный документ в полном объеме: (1) патент США № 8598332 Waterhouse и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая ДНК, кодирующую последовательность смысловой РНК и анти-смысловой РНК в одном транскрипте, который формирует искусственную ʺшпильковуюʺ РНК структуру с двухцепочечным стеблем РНК с помощью спаривания оснований между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; варианты реализации изобретения включают шпильки со спейсерными нуклеотидами между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; (2) патент США № 8158414 Rommens и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая конвергентно ориентированные первый и второй промоторы, которые производят, например, дуплекс-РНК, которая сформирована с помощью отжига двух отдельных РНК транскриптов; и (3) патент США № 7855323 и 9006414 Huang и др., которые раскрывают рекомбинантные ДНК конструкты, содержащие ДНК, кодирующую ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ транскрипты которые формируют петлю анти-смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней; рекомбинантные ДНК конструкты могут быть сконструированы для подобного кодирования ʺстабилизированных смысловыхʺ транскриптов, которые формируют петлю смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней.
[0019] Варианты реализации изобретения композиций, содержащих полинуклеотиды, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, дополнительно содержать один или более дополнительных компонентов или адъювантов, например, агент-переносчик, инкапсулирующий агент, эмульгирующий агент, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, расширяющий агент, фотозащитный агент, агент устойчивости к осадкам, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, неполинуклеотидный фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, феромоны насекомых, и регулятор роста насекомых. В вариантах реализации изобретения, эти дополнительные компоненты или адъюванты являются съедобными или усваиваются, если попадают в организм блошки.
[0020] В вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, используются в сочетании с ненуклеотидным пестицидным агентом, таким как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент, одновременно или последовательно. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататин, растительные лектины, фитоэкдистероиды, и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки от Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (ранее Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (ранее Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae), бактерию, которая продуцирует инсектицидный белок, и энтомицидные виды бактерий. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными пестицидами, такими как спиромезифен, спиродиклофен, спиротетрамат, пиридабен, тебуфенпирад, толфенпирад, фенпироксимат, флуфенерим, пиримидифен, феназахин, ротенон, циенопирафен, гидраметилнон, ацехиноцил, флуакрипирим, фосфид алюминия, фосфид кальция, фосфин, фосфид цинка, цианид, диафентиурон, азоциклотин, цигексатин, оксид фенбутатина, пропаргит, тетрадифон, бенсультап, тиоциклам, тиосултап-натрия, флоникамид, этоксазол, клофентезин, дифловидазин, гекситиазокс, хлорфлуазурон, бистрифлурон, дифлубензурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, новалурон, новифлумурон, тефлубензурон, трифлумурон, бупрофезин, циромазин, гидропрен, кинопрен, метопрен, феноксикарб, пирипроксифен, пиметрозин, пирифлукваиназон, хлорфенапир, тралопирил, B.t. (Bacillus thuringiensis) var. aizawai, B.t. var. israelensis, B.t. var. kurstaki, B.t. var. sphaericus, B.t. var. tenebrionensis, Bacillus thuringiensis белки сельскохозяйственных культур, включая Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Ab1, бромистый метил и другие алкилгалогениды, хлорпикрин, фторид серы, бенклотиаз, хинометионат, криолит, метилнеодеканамид, бензоксимат, цимиазол, флуенсульфон, азадирахтин, бифеназат, амидофлумет, дикофол, плифенат, цифлуметофен, пиридалил, Beauveria bassiana GHA, сульфоксафлор, спинеторам, спиносад, эмамектинбензоат, лепимектин, милбемектин, абамектин, метоксифенозид, хромафенозид, галофенозид, тебуфенозид, амитраз, хлорантранилипрол, циантранилипрол, флубендиамид, альфа-эндосульфан, хлордан, эндосульфан, фипронил, ацетопрол, этипрол, пирафлупрол, пирипрол, индоксакарб и метафлумизон, акринатрин, аллетрин, аллетрин-цис-транс, транс-аллетрина, бета-цифлутрин, бета-циперметрин, бифентрин, биоаллетрин, биоаллетрин S-циклопентенил, биоресметрин, циклопротрин, цифлутрин, цигалотрин, циперметрин, цифенотрин [(1R)-транс-изомеры], димефлутрин, эмпентрин [(EZ)-(1R)-изомеры], эсфенвалерат, этофенпрокс, фенпропатрин, фенвалерат, флюцитринат, флюметрин, гамма-цигалотрин, лямбда-Цигалотрин, меперфлутрин, метофлутрин, перметрин, фенотрин [(1R)-транс-изомер], праллетрин, профлутрин, протрифенбут, ресметрин, силафлуофен, тау-флувалинат, тефлутрин, тетраметрин, тетраметрин [(1R)-изомеры], тетраметилфлутрин, тета-циперметрин, тралометрин, трансфлутрин, дзета-циперметрин, альфа-циперметрин, дельтаметрин, DDT и метоксихлор, тиодикарб, аланикарб, алдикарб, бендиокарб, бенфуракарб, бутоксикарбоксим, карбарил, карбофуран, карбосульфан, этиофенкарб, фенобукарб, форметанат, фуратиокарб, изопрокарб, метиокарб, метомил, метолкарб, оксамил, пиримикарб, пропоксур, тиофанокс, триазамат, триметакарб, ХМС, ксилилкарб, хлорпирифос, малатион, ацефат, азаметифос, азинфос-этил, азинфос-метил, кадусафос, хлоретоксифос, хлорфенвинфос, хлормефос, хлорпирифосметил, кумафос, цианофос, метилмеркаптофос, диазинон, дихлорвос/ДДВФ, дикротофос, диметоат, диметилвинфос, дисульфотон, EPN, этион, этопрофос, фамфос, фенамифос, фенитротион, фентион, фонофос, фостиазат, имициафос, изофенфос-метил, мекарбам, метамидофос, метидатион, мевинфос, монокротофос, налед, ометоат, оксидеметон-метил, паратион, паратион-метил, фентоат, форат, фосалон, фосмет, фосфамидон, фоксим, пиримофоз-этил, профенофос, пропафос, пропетамфос, протиофос, пираклофос, пиридафентион, хиналфосом, сульфотеп, тебупиримфос, темефос, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиометон, триазофос, хлорофос, вамидотион имидаклоприд, тиаметоксам, ацетамиприд, клотиандин, динотефуран, нитенпирам, нитиозин, никотин, тиаклоприд, хлорантранилипрол и циантранилипрол. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов рода Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из дельтаметрина, циперметрина, лямбда-цигалотрина, перметрина, карбарила, карбофурана и малатиона, или обработкой семян, содержащей один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из тиаметоксама, имидаклоприда и клотианадина.
[0021] В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными фунгицидами, такими как бупиримат, диметиримол, этиримол, ципродинил, пириметанил, мепанипирим, фенпиклонил, флудиоксонил; фениламиды, беналаксил, фуралаксил, металаксил, R-металаксил, офурак, оксадиксил, беномил, карбендазим, дебакарб, фуберидазол, тиабендазол, хлозолинат, дихлозолин, ипродин, миклозолин, процимидон, винклозолин, карбоксин, фенфурам, флутоланил, мепронил, оксикарбоксин, тифлузамид, гуазатин, додин, иминоктадин, азоксистробин, крезоксим-метил, метоминостробин или трифлоксистробин, фербам, манкозеб, манеб, метирам, пропинеб, тирам, зинеб, зирам, каптафол, каптан, дихлофлуанид, флуоромид, фолпет, толуфлуанид, гидроксид меди, оксихлорид меди, сульфат меди, оксид меди, манкуппер, оксин-медь, динокап, нитротал-изопропил, эдифенфос, ипробенфос, изопротиолан, фосдифен, пиразофо, токлофос-метил, ацибензолар-S-метил, харпин, анилазин, бластицидин-S, хинометионат, хлоронеб, хлороталонил, цимоксанил, дихион, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, диметоморфу, дитианон, этридиазол, фамоксадон, фенамидон, фентин, фенпиразамине, феримзон, флуазинам, флусульфамид, фосетил-алюминий, гимексазол, касугамицин, метасульфокарб, пенцикурон, фталид, полиоксины, пробеназол, пропамокарб, пироквуилон, хиноксифен, квинтозин, сера, триазоксид, трициклазол, валидамицин, азаконазол, битертанол, пропиконазол, дифеноконазол, диниконазол, ципроконазол, эпоксиконазол, флухинконазол, флусилазол, флутриафол, гексаконазол, имазалил, имибенконазол, ипконазол, тебуконазол, тетраконазол, фенбуконазол, метконазол, миклобутанил, перфуразоат, пенконазол, бромуконазол, пирифенокс, прохлораз, триадимефон, триадименол, трифлумизол, тритиконазол, трифорин, анцимидол, фенаримол или нуаримол, додеморф, фенпропидин, фенпропиморф, спироксамин, тридеморф и фенгексамид. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов рода Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, штамма QST 2808 Bacillus subtilis, боскалида, флуксопироксада, пираклостробина, метконазола, протиоконазола, пентиопирада, пикоксистробина и тиофанат метила, или обработкой семян, содержащей один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, металаксила, трифлоксистробина, пираклостробина, седаксана, пенфлуфена, флудиоксонила и мефеноксама.
[0022] В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, могут дополнительно включать или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными гербицидами, такими как глифосат, ауксин-подобными гербицидами, такими как дикамба, фосфинотрицин, глюфосинат, 2,2-дихлоропропионовая кислота (далапон), ингибиторы ацетолактат синтазы, такие как сульфонилмочевины, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты, и фталид, бромоксинил, циклогександион (сетоксидим) и арилоксифеноксипропионат (галоксифоп), сульфонамид гербициды, триазиновые гербициды, 5-метилтриптофан, аминоэтил цистеин, пиридазиноновые гербициды, такие как норфлуразон, циклопропилизоксазол гербициды, такие как изоксафлютол, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы, гербициды, содержащие фрагмент арилоксиалканоата, фенокси ауксины, такие как 2,4-D и дихлорпроп, пиридилокси ауксины, такие как фтороксипира и триклопира, арилоксифеноксипропионаты (AOPP), ингибиторы ацетил-коэнзим A карбоксилазы (ACCase), такие как галоксифоп, хизалофоп и дислофоп, и 5-замещенные ингибиторы феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX, такие как пирафлуфен и флумиклорак. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов рода Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более послевсходовых гербицидов, выбранных из группы, состоящей из хизалофопа, сетоксидима, клетодима, и клопиралида. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у устойчивых к гербицидам видов рода Brassica, включая устойчивый к гербицидам рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более гербицидов, выбранных из группы, состоящей из имазамокас, глифосата и глюфосината.
[0023] Описанные композиции и способы являются полезными для ингибирования или борьбы с заражением блошкой растения, такого как виды рода Brassica. В вариантах реализации изобретения, композиции и способы используются для лечения растущего растения, такого как полевые растения рода Brassica. Варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие полинуклеотиды, описанные в данном документе, в композиции в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы или композиции для обработки семян. В вариантах реализации изобретения такие композиции наносятся на поверхность растения, нуждающегося в защите или лечении от заражения блошками, или наносятся прямо на блошек, или предусмотрены в пищевой для блошек форме. В вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотиды, описанные в данном документе, наносится прямо на непроросшие семена (такие как непроросшие семена видов рода Brassica), обеспечивая растению, проросшему из обработанных семян, повышенную устойчивость к заражению блошками; примеры способов обработки семян описаны в патентной заявке США 14/143836, которая включена посредством ссылки в данный документ в полном объеме. Варианты реализации изобретения включают семена рода Brassica, которые обрабатываются с помощью непосредственного контакта семян с полинуклеотидом (таким как дцРНК триггер), описанным в данном документе, после прорастания в растение рода Brassica, которое демонстрируют повышенную устойчивость к заражению блошкой.
[0024] Если не указано иное, используемые технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области техники. Термины ʺсодержатьʺ или ʺвключатьʺ подразумевают ʺвключает, но без ограниченияʺ. Как правило, используемая номенклатура и производственные или лабораторные методики, описанные ниже, являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники. Обычные способы используются для выполнения этих процедур, таких, как те, которые предусмотрены в данной области техники и различных общих ссылках. В случае, когда термин предусмотрен в единственном числе, авторы данного изобретения также рассматривают аспекты, описываемые множественным числом этого термина. Там, где есть расхождения в терминах и определениях, используемых в ссылках, которые включены посредством ссылки, термины, используемые в данной заявке, должны иметь приведенные определения. Другие технические термины имеют их обычное значение в области техники, в которой они используются, как проиллюстрировано с помощью различных технико-специфических словарей, например, ʺThe American Heritage® Science Dictionaryʺ (Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Хоутон Миффлин Харкорт, Бостон и Нью-Йорк), ʺMcGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Termsʺ (6th edition, 2002, МакГроу-Хилл, Нью-Йорк), или ʺOxford Dictionary of Biologyʺ (6th edition, 2008, Oxford University Press, Оксфорд и Нью-Йорк). Авторы данного изобретения не намерены ограничиваться механизмом или способом действия. Ссылка к ним предоставляется только для иллюстрации.
[0025] Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот в тексте данного описания изобретения приведены так, что читаются слева направо в направлении 5' к 3' концу. Специалисту в данной области техники будет известно, что данная последовательность ДНК понимается для определения соответствующей последовательности РНК, которая идентична последовательности ДНК за исключением замены нуклеотидов тимина (T) в ДНК на нуклеотиды урацила (U). Таким образом, предоставляемая конкретная последовательность ДНК понимается для определения точного РНК эквивалента. Данная первая полинуклеотидная последовательность, будь то ДНК или РНК, дополнительно определяет последовательность ее точного комплемента (который может быть ДНК или РНК), т.е., второй полинуклеотид, который гибридизируется идеально с первым полинуклеотидом путем формирования Уотсона-Криковских пар оснований. Под термином "по существу идентичны" или ʺпо существу комплементарны" гену-мишени или фрагменту гена-мишени, подразумевается, что полинуклеотидная цепь (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) сконструирована для гибридизации (как правило, при физиологических условиях, таких как те, что можно найти в клетке живых растений или животных) с геном-мишенью, или с фрагментом гена-мишени, или с транскриптом гена-мишени или фрагмента гена-мишени; специалисту в данной области техники будет понятно, что такая гибридизация не обязательно требует 100% идентичности или комплементарности последовательности. Первая последовательность нуклеиновой кислоты "функционально" соединена или "связана" со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательность промотора является ʺфункционально связаннойʺ с ДНК, если промотор обеспечивает транскрипцию или экспрессию ДНК. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными.
[0026] Термин ʺполинуклеотидʺ обычно относится к молекуле ДНК или РНК, содержащей несколько нуклеотидов и, в общем, относится к обоим ʺолигонуклеотидамʺ (полинуклеотидная молекула из 18-25 нуклеотидов в длину) и более длинным полинуклеотидам из 26 или более нуклеотидов. Полинуклеотиды также включают молекулы, содержащие несколько нуклеотидов, включая неканонические нуклеотиды или химически модифицированные нуклеотиды, как это обычно практикуется в данной области техники; см., например, химические модификации, раскрытые в техническом руководстве ʺRNA Interference (RNAi) and DsiRNAsʺ, 2011 (Integrated DNA Technologies Коралвилл, Айова). Как правило, полинуклеотид, как описано в данном документе, будь то ДНК или РНК, или оба, и будь то одно- или двухцепочечный, включает по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов (или в случае двухцепочечных полинуклеотидов по меньшей мере 18 смежных пар оснований), которые, по сути, идентичны или комплементарны фрагменту эквивалентного размера ДНК гена-мишени или РНК транскрипта гена-мишени. На протяжении этого описания, "по меньшей мере 18 смежных" означает "от около 18 до около 10000, включая каждый целый номер точки между ними". Таким образом, варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие олигонуклеотиды, имеющие длину от 18-25 нуклеотидов (18-членные, 19-членные, 20-членные, 21-членные, 22-членные, 23-членные, 24-членные, или 25-членные), или средней длины полинуклеотиды, имеющие длину от 26 или более нуклеотидов (полинуклеотиды из 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, или около 300 нуклеотидов), или длинные полинуклеотиды, имеющие длину, более чем около 300 нуклеотидов (например, полинуклеотиды от между около 300 до около 400 нуклеотидов, между около 400 до около 500 нуклеотидов, между около 500 до около 600 нуклеотидов, между около 600 до около 700 нуклеотидов, между около 700 до около 800 нуклеотидов, между около 800 до около 900 нуклеотидов, между около 900 до около 1000 нуклеотидов, между около 300 до около 500 нуклеотидов, между около 300 до около 600 нуклеотидов, между около 300 до около 700 нуклеотидов, между около 300 до около 800 нуклеотидов, между около 300 до около 900 нуклеотидов, или около 1000 нуклеотидов в длину, или даже более чем около 1000 нуклеотидов в длину, например, по всей длине гена-мишени, содержащего кодирующие или некодирующие или оба кодирующие или некодирующие участки гена-мишени). Там, где полинуклеотид представляет собой двухцепочечный, такой как дцРНК триггеры, описанные в рабочих примерах, его длина может быть аналогичным образом описана в терминах пар оснований. Двухцепочечные полинуклеотиды, такие как дцРНК триггеры, описанные в рабочих примерах, могут быть дополнительно описаны в терминах одного или нескольких одноцепочечных компонентов.
[0027] Полинуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть одноцепочечными (оц) или двухцепочечными (дц). «Двухцепочечный» относится к спариванию оснований, которое происходит между полностью комплементарными, анти-параллельными цепями нуклеиновой кислоты с образованием структуры двухцепочечной нуклеиновой кислоты, как правило, при физиологически подходящих условиях. Варианты реализации изобретения включают те, где полинуклеотид является выбранным из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной ДНК (оцДНК), смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), двухцепочечной ДНК (дцДНК), двухцепочечного ДНК/РНК гибрида, анти-смысловой оцДНК или смысловой оцРНК; смесь полинуклеотидов любого из этих типов может быть использована. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК длиной более чем, та, которая характерна для естественных регуляторных малых РНК (таких как, эндогенно полученные миРНК и зрелые микроРНК). В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК из по меньшей мере около 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК с длиной между около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеоти может содержать компоненты отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, вариант реализации изобретения представляет собой РНК, которая содержит терминальные дезоксирибонуклеотиды.
[0028] Эффективные полинуклеотиды любого размера могут быть использованы по отдельности или в сочетании, в различных способах и композициях, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, один полинуклеотидный триггер используется для создания композиции (например, композиции для местного применения, или рекомбинантного конструкта ДНК пригодного для создания трансгенного растения). В других вариантах реализации изобретения, используется смесь или совокупность разных полинуклеотидных триггеров; в таких случаях полинуклеотидные триггеры могут быть для одного гена-мишени или нескольких генов-мишеней.
[0029] В различных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как те, которые присутствуют в ДНК и РНК. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетические полинуклеотиды, состоящие в основном из рибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дезоксирибонуклеотидов или одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов, или синтетических полинуклеотидов, состоящих в основном из дезоксирибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит химически модифицированные нуклеотиды. Примеры химически модифицированных олигонуклеотидов или полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники; см., например, публикацию патента США 2011/0171287, публикацию патента США 2011/0171176, публикацию патента США 2011/0152353, публикацию патента США 2011/0152346, и публикацию патента США 2011/0160082, которые включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные примеры включают, но без ограничения, встречающиеся в природе фосфодиэфирный остов олигонуклеотида или полинуклеотид, который может быть частично или полностью модифицирован с фосфоротиоатом, фосфородитиоатом, или метилфосфонатными межнуклеотидными модификациями связи, модифицированные основания нуклеозидов или модифицированные сахара могут быть использованы в синтезе олигонуклеотида или полинуклеотида, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут быть помечены флуоресцентными фрагментами (например, флуоресцеином или родамином) или другой меткой (например, биотином).
[0030] Термин ʺрекомбинантныйʺ, используемый для обозначения полинуклеотида (такого как молекулы рекомбинантной РНК или конструкты рекомбинантной ДНК, описанные в данном документе), означает, что полинуклеотид не является встречающейся в природе молекулой, т.e., что требуется вмешательство человека для существования полинуклеотида. Рекомбинантный полинуклеотид получают с использованием методики рекомбинантной нуклеиновой кислоты или путем химического синтеза, и он может включать комбинации последовательностей, которые не встречаются в природе (например, комбинации гетерологичного промотора и ДНК, кодирующей экспрессируемую РНК, или молекулу РНК, содержащую связанные сегменты гена-мишени которые в природе не встречаются рядом друг с другом). Рекомбинантный полинуклеотид может быть биологически произведен в клетке (такой как бактериальная, или растительная или животная клетка), например, когда эту клетку трансфицируют или трансформируют с вектором, кодирующим рекомбинантный полинуклеотид (например, вектор, кодирующий дцРНК шпилькообразной формы, произведенный в бактерии). Рекомбинантный полинуклеотид может включать последовательность нуклеотидов, сконструированную in silico с использованием соответствующих алгоритмов.
[0031] Полинуклеотиды или триггеры, описанные в данном документе, как правило, сконструированы для подавления или сайленсинга одного или более генов (ʺгенов-мишенейʺ). Термин ʺгенʺ относится к любому участку нуклеиновой кислоты, который обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт, или который является наследуемой последовательностью нуклеиновой кислоты. ʺГенʺ может включать, но без ограничения, участок промотора, 5ʹ нетранслируемый участок, кодирующий транскрипт участок, который может включать интронный участок, 3ʹ нетранслируемый участок, или комбинации этих регионов. В вариантах реализации изобретения, гены-мишени могут включать кодирующую или некодирующую последовательность или обе. В других вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность идентичную или комплементарную матричной РНК, например, в вариантах реализации изобретения ген-мишень представляет собой кДНК.
[0032] Как используется в данном документе, термин ʺизолированныйʺ относится к отделению молекулы от других молекул обычно связанных с ней в своем нативном или естественном состоянии. Термин ʺизолированныйʺ таким образом, может относиться к молекуле ДНК, которая была отделена от других молекул(ы) ДНК, которые обычно связаны с ней в своем нативном или естественном состоянии. Такая молекула ДНК может присутствовать в рекомбинированном состоянии, таком как рекомбинантная молекула ДНК. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями с которыми они обычно не связаны, например посредством рекомбинантных технологий, рассматриваются изолированно, даже при интегрировании в качестве трансгена в хромосому клетки или в присутствии с другими молекулами ДНК.
[0033] Под "инсектицидно-эффективным" подразумевается эффективный в индукции физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослой блошки или личинок), которое заражает растение, таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала или снижение плодовитости, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах реализации изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, к растению повышает устойчивость растений к заражению насекомым. В некоторых вариантах реализации изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, к культурному растению повышает урожайность (например, увеличивает биомассу, повышает семенную или плодовую продукцию, или увеличивает содержание масла, крахмала, сахара или белка) культурного растения, в сравнении с культурным растением не обработанным полинуклеотидом. В то время как не существует верхнего предела концентраций и доз полинуклеотида, как описано в данном документе, которые могут быть полезны в способах и композициях, представленных в данном документе, более низкие эффективные концентрации и дозировки, как правило, будут искать для эффективности и экономии. Неограничивающие варианты реализации изобретения эффективных количеств полинуклеотида включают диапазон от около 10 нанограмм на миллилитр до около 100 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в жидкой форме распыляемого на растение, или от около 10 микрограмм на акр до около 100 грамм на акр полинуклеотида применяемого к полевым растениям, или от около 0,001 до около 0,1 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в искусственном питании для кормления насекомых. В то время как композиции, описанные в данном документе, наружно применяют к растению, концентрация может быть скорректирована с учетом объема спрея или обработки, применяемой к листьям растений или другим частям поверхности растения, таким как лепестки цветка, стебли, клубни, плоды, пыльники, пыльца, листья, корни или семена. В одном варианте реализации изобретения, пригодная обработка травянистых растений с использованием 25-членного полинуклеотида, как описано в данном документе, составляет около 1 наномоля (нмоль) полинуклеотида на растение, например, от около 0,05 дo 1 нмоль полинуклеотида на растение. Другие варианты реализации изобретения для травянистых растений включают полезные диапазоны от около 0,05 до около 100 нмоль, или около 0,1 до около 20 нмоль, или около 1 нмоль до около 10 нмоль полинуклеотида на растение. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется от около 40 до около 50 нмоль одноцепочечного полинуклеотида, как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется от около 0,5 нмоль до около 2 нмоль дцРНК, как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется композиция, содержащая около 0,5 до около 2,0 миллиграмм на миллилитр, или около 0,14 миллиграмм на миллилитр дцРНК (или одноцепочечного 21-членного), как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется композиция от около 0,5 до около 1,5 миллиграмм на миллилитр полинуклеотида дцРНК, описанного в данном документе, содержащего от около 50 до около 200 или более нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется к растению от около 1 нмоль до около 5 нмоль дцРНК, как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотидная композиция, как наружно применяемая к растению, содержит по меньшей мере один полинуклеотид, как описано в данном документе, в концентрации от около 0,01 дo около 10 миллиграмм на миллилитр, или около 0,05 дo около 2 миллиграмм на миллилитр, или около 0,1 дo около 2 миллиграмм на миллилитр. Очень большие растения, деревья или лианы, требуют соответственно больших количеств полинуклеотидов. При использовании длинных молекул дцРНК, которые могут быть переработанны в несколько олигонуклеотидов (например, несколько триггеров, кодируемых с помощью одной молекулы рекомбинантной ДНК, как описано в данном документе), могут быть использованы более низкие концентрации. Неограничивающие примеры эффективных режимов обработки полинуклеотидом включают обработку от между около 0,1 дo около 1 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 1 нмоль дo около 10 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 10 нмоль дo около 100 нмоль молекул полинуклеотида на растение.
СПОСОБЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ ГИБЕЛЬ НАСЕКОМЫХ, И СПОСОБЫ БОРЬБЫ С ЗАРАЖЕНИЯМИ НАСЕКОМЫМИ
[0034] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу умерщвления или приостановки роста насекомого, включая предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одной рекомбинантной РНК, содержащей по меньшей мере один подавленный элемент по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, причем последовательность гена мишени выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859, при этом проглатывание рекомбинантной РНК насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. Эти способы могут быть использованы для борьбы с заражением насекомыми растения, например, для предотвращения или лечения заражения блошкой сельскохозяйственного растения, особенно коммерчески важных видов рода Brassica.
[0035] В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого, отличающийся тем, что ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей их SEQ ID NO: 1-859. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит дцРНК, содержащую по меньшей мере одну цепь РНК, содержащую последовательность, имеющую от около 95% дo около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0036] В вариантах реализации изобретения, рекомбинантная РНК представлена в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует рекомбинантную РНК, или в микробном продукте ферментации, или является химически синтезированной. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит дцРНК. В вариантах реализации изобретения, дцРНК является тупоконечной, или имеет "липкий" конец на по меньшей мере одном конце, или содержит по меньшей мере один стебель-петлю. ДцРНК обеспечивается удобными, обычно используемыми методами. В вариантах реализации изобретения, дцРНК является химически синтезированной, полученной путем экспрессии в микроорганизме, полученной путем экспрессии в растительной клетке, или полученной путем микробной ферментации. В вариантах реализации изобретения, дцРНК изготавливается из встречающихся в природе рибонуклеотидов; в других вариантах реализации изобретения, дцРНК является химически модифицированной.
[0037] В вариантах реализации изобретения, способ применяется для умерщвления или приостановки роста насекомых, которые являются вредителями коммерчески важных сельскохозяйственных растений, таких как насекомые-вредители видов рода Brassica. В вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой блошку. В вариантах реализации изобретения, насекомое является представителем рода выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).
[0038] Варианты реализации способа включают те, в которых рекомбинантная РНК сконструирована для подавления гена-мишени родо- или видоспецифическим способом, например, где (a) насекомое представляет собой вид рода Phyllotreta и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-551; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошку репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551; (e) насекомое представляет собой виды рода Psylliodes и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859. Варианты реализации изобретения способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой вид рода Phyllotreta и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1410 или их фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391 или их фрагмента; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410 или их фрагмента; (e) насекомое представляет собой виды рода Psylliodes и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента.
[0039] Варианты реализации способа включают те, в которых по меньшей мере одна рекомбинантная РНК представлена в композиции, содержащей по меньшей мере одну рекомбинантную РНК, при этом композицию наносят на поверхность насекомого, либо на поверхность семян или растений, нуждающихся в защите от заражения насекомыми. Варианты реализации таких композиций, включают те, в которых композиция включает твердое вещество, жидкость, порошок, суспензию, эмульсию, спрей, инкапсуляцию, микрогранулы, частицы носителей, пленки, матрицы, орошения почвы или обработку семян. Во многих вариантах реализации изобретения, композицию составляют в форме, которая проглатывается насекомым. В вариантах реализации изобретения, композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, удобрения, микроэлемента, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. В вариантах реализации изобретения, композиция дополнительно содержит по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.
[0040] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения насекомыми, включая контактирование растения и/или насекомого, которое заражает растение, с двухцепочечной РНК (дцРНК), при этом дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% ( например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарной фрагменту гену-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на около 95% до около 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В этом контексте ʺборьба сʺ включает стимулирование физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки, или нимфы) таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента, или их комплемента.
[0041] В различных вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой блошку, например, вида рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки) и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).
[0042] Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться полинуклеотидами, описанными в данном документе. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты реализации способа включают те, в которых растение представляет собой растение из семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. В других вариантах реализации изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.
[0043] Способы включают те, которые разработаны для конкретных блошек-вредителей данного растения, например, в которых растение представляет собой растение картофеля и насекомое представляет собой Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах реализации изобретения, конкретные гены-мишени были идентифицированы в качестве мишеней для РНКи-опосредованного контроля данного вида насекомого. Различные варианты реализации способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859.
[0044] В некоторых вариантах реализации изобретения, определенные дцРНК ʺтриггерыʺ разработаны для конкретных генов-мишеней данного вида насекомых. Варианты реализации изобретения способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391 или их фрагмента; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410 или их фрагмента; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента.
[0045] Способ включает стадию, в которой насекомое, такое как блошка, приводят в контакт с двухцепочечной РНК (дцРНК). Варианты реализации изобретения включают стадию приведения в контакт через пероральное введение насекомому, или непероральное введение насекомому, или комбинацию перорального и неперорального введения насекомому. Варианты реализации изобретения включают приведение в контакт насекомых во взрослой стадии, или в личиночной стадии, или в стадии яйца. В некоторых вариантах реализации изобретения, приведение в контакт насекомого приводит к гибели (смерти) или задержки роста (отставание в росте, или снижение или прекращение стадии развития метаморфоза) насекомого, тем самым предотвращая или вылечивая заражение растения насекомым. В некоторых вариантах реализации изобретения, приведение в контакт приводит к стимулированию физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки, или нимфы), что приводит к уменьшенной способности насекомого заражать или повреждать растение, например, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения.
[0046] В некоторых вариантах реализации способа, приведение в контакт включает применение композиции, содержащей дцРНК, на поверхности насекомых или на поверхности растений, зараженных насекомыми. Композиция может содержать или быть в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы или обработки семян. В вариантах реализации изобретения, приведение в контакт включает предоставление дцРНК в композиции, которая дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения, приведение в контакт включает предоставление дцРНК в композиции, которая дополнительно содержит один или более пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.
[0047] В некоторых вариантах реализации способа, стадия контакта включает предоставление дцРНК в композиции, которая проглатывается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Такие композиции могут дополнительно содержат один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. Такие композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В вариантах реализации изобретения, сочетание дцРНК и пестицидного агента обеспечивает уровень борьбы с насекомыми, который больше, чем сумма эффектов дцРНК и компонентов пестицидного агента, если они тестированы отдельно.
Инсектицидные Композиции
[0048] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащей инсектицидно-эффективное количество полинуклеотида, такого как молекула дцДНК, причем полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих около 95% до около 100% комплементарности с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов, имеющих 100% комплементарности с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0049] В различных вариантах реализации инсектицидной композиции, насекомое представляет собой, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки) и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).
[0050] Инсектицидная композиция используется для обработки растения или участка в непосредственной близости от растения для обеспечения защиты или лечения от насекомых, особенно блошек. Связанный аспект представляет собой растение, обработанное инсектицидной композицией, как описано в данном документе, или семена обработанных растений, причем растение проявляет повышенную устойчивость к насекомым (например, повышенную стойкость к блошкам). В некоторых вариантах реализации изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением, не обработанным инсектицидной композицией. В вариантах реализации изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается с помощью использования инсектицидно-эффективного количества полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, нацеливающегося на один или более генов, идентифицированных у Phyllotreta cruciferae (блошки канолы); в отдельных вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей их SEQ ID NO: 297-532. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться с помощью инсектицидной композиции. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены в рубрике ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты реализации способа включают те, в которых растение представляет собой растение из семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. В других вариантах реализации изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.
[0051] В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция, разработана для конкретной блошки-вредителя для данного растения, например, где растение представляет собой растение картофеля и насекомое представляет собой Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция, разработана для конкретного гена-мишени у данного вида насекомого. Конкретные варианты реализации инсектицидной композиции включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859.
[0052] В некоторых вариантах реализации изобретения, молекула дцРНК, используемая в данном способе, представлена как изолированная молекула дцРНК (не часть экспрессионного конструкта, например, отсутствуют дополнительные элементы, такие как промотор или последовательности терминатора). Такие молекулы дцРНК могут быть относительно короткими, такими как одно- или двухцепочечные молекулы РНК от между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую сегмент, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0053] В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, пищи насекомых или приманки насекомых и обработки семян. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция представлена в форме, которая проглатывается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В некоторых вариантах реализации изобретения, сочетание молекулы рекомбинантной РНК и пестицидного агента обеспечивает уровень борьбы с насекомыми, который больше, чем сумма эффектов молекулы рекомбинантной РНК и компонентов пестицидного агента, если они тестированы отдельно.
[0054] Варианты реализации композиций дополнительно содержат соответствующие наклейки и смачиватели, необходимые для эффективного лиственного покрытия, а также УФ-протекторы для защиты полинуклеотидов, такие как дцРНК от УФ-повреждений. Такие добавки обычно используются в биоинсектицидной промышленности и известны специалистам в данной области техники. Композиции для нанесения на грунт могут включать гранулированные составы, которые служат приманкой для личинок насекомых. Варианты реализации изобретения включают агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганику, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых и регулятор роста насекомых.
[0055] Варианты реализации композиций могут содержать ʺагент переносаʺ: агент, который в сочетании с композицией, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе, который наружно применяют на поверхность организма, дает возможность полинуклеотиду проникать в клетки этого организма. Такой агент переноса может быть включен как часть композиции, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе, или может быть нанесен до, одновременно с или после нанесения композиции, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса представляет собой агент, который улучшает поглощение полинуклеотида насекомым. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса представляет собой агент, который находится на поверхности растительной ткани, например, семян, листьев, стеблей, корней, цветов, или плодов, для проникновения полинуклеотида в клетки растений. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса обеспечивает путь для полинуклеотида через кутикуло-восковые барьеры, устьица, и/или клеточную стенку или мембранные барьеры в клетки растений.
[0056] Подходящие агенты переноса включают в себя агенты, которые повышают проницаемость внешней части организма, или которые увеличивают проницаемость клеток организма к полинуклеотидам. Подходящие агенты переноса включают в себя химический агент, или физический агент, или их сочетания. Химические агенты для создания необходимых условий или переноса включают (a) поверхностно-активные вещества, (b) органический растворитель, или водный раствор или водную смесь органических растворителей, (c) окисляющие агенты, (d) кислоты, (e) основания, (f) масла, (g) ферменты, или их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения, использование полинуклеотида и агента переноса дополнительно включает стадию инкубации, стадию нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания, или окисляющего агента, или инактивации фермента), стадию отмывания, или их комбинацию. Подходящий агент переноса может быть в форме эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции, или может вызывать переход полинуклеотидной композиции в форму эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции. Варианты реализации агентов переноса включают противоионы или другие молекулы, которые, как известно, ассоциируются с молекулами нуклеиновых кислот, например, катионные липиды, неорганические ионы аммония, ионы алкил аммония, ионы лития, полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин, и другие катионы. Варианты реализации агентов переноса включают органические растворители, такие как ДМСО, ДМФ, пиридин, N-пирролидин, гексаметилфосфорамид, ацетонитрил, диоксан, полипропилен гликоль или другие растворители, смешиваемые с водой или растворяющие фосфонуклеотиды в неводных системах (такие, как используются в синтетических реакциях). Варианты реализации изобретения агентов переноса включают масла природного происхождения или синтетические с добавлением или без поверхностно-активных веществ или эмульгаторов, например, масла из растительных источников, растительных масел (таких как те, которые перечислены в 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, в открытом доступе в режиме онлайн на herbicide.adjuvants.com), парафиновых масел, эфиров жирной кислоты и многоатомного спирта, или масел с короткими цепочками молекул, модифицированных амидами или полиаминами, такими как полиэтиленимин или N-пирролидин.
[0057] Варианты реализации агентов переноса включают кремнийорганические препараты. Например, подходящий агент переноса представляет собой кремнийорганический препарат - ПАВ, который коммерчески доступен под торговой маркой SILWET L-77®, имеющий CAS № 27306-78-1 и EPA №: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, и в настоящее время доступен в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В вариантах реализации изобретения, кремнийорганический препарат - ПАВ, который коммерчески доступен под торговой маркой SILWET L-77® используется в качестве агента переноса в форме обработки спреем (применяется до, одновременно с или после нанесения композиции, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе) листьев растения или других поверхностей растения, свежеприготовленные концентрации в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент) ( например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента) эффективны при подготовке листа или другой поверхности растения для переноса полинуклеотида, как описано в данном документе, в растительные клетки через местное нанесение на поверхность. Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, содержащий кремнийорганический препарат, такой как Silwet L-77 в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента). Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, содержащий ПАВ, коммерчески доступный под торговой маркой SILWET L-77®, в диапазоне от около 0,3 до около 1 процента по массе (массовый процент) или около 0,5 до около 1% по массе (массовый процент).
[0058] Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, соединения, которые содержат: (a) головную группу трисилоксана, которая ковалентно связана с, (b) алкильным линкером, включая, но без ограничения, n-пропил линкер, который ковалентно связан с, (c) цепью полигликоля, которая ковалентно связана с, (d) терминальной группой. Головные группы трисилоксана таких кремнийорганических соединений включают, но без ограничения, гептаметилтрисилоксан. Алкильные линкеры могут включать, но без ограничения, n-пропил линкер. Полигликолевые цепи включают, но без ограничения, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. Полигликолевые цепи могут включать смесь, которая обеспечивает среднюю длину цепи ʺnʺ около ʺ7,5ʺ. В конкретных вариантах реализации изобретения, средняя длина цепи ʺnʺ может варьировать от около 5 дo около 14. Терминальные группы могут включать, но без ограничения, алкильные группы, такие как метильная группа. Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, трисилоксан этоксилатные поверхностно-активные вещества или полиалкиленоксид модифицированный гептаметил трисилоксан. Пример агента переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, представляет собой Соединение I:
(Соединение I: полиалкиленоксид гептаметилтрисилоксан, среднее n=7,5).
[0059] Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, используются, например, как свежеприготовленные концентрации в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента).
[0060] Варианты реализации агентов переноса включают одну или более соль, такую как хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид и сульфат аммония, представленные в или используемые в композиции, содержащей полинуклеотид, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид и/или сульфат аммония используют в концентрации от около 0,5% до около 5% (м./об.), или около 1% до около 3% (м./об.), или около 2% (м./об.). В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит соли аммония в концентрации большей или равной 300 миллимолям. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит кремнийорганический агент переноса в концентрации около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент), а также сульфат аммония в концентрации от около 80 до около 1200 миллимолей или около 150 миллимолей до около 600 миллимолей.
[0061] Варианты реализации агентов переноса включают фосфатные соли. Фосфатные соли, используемые в композиции, содержащей полинуклеотид, включают, но без ограничения, кальциевые, магниевые, калиевые или фосфат-натриевые соли. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации от около 5 миллимолей, около 10 миллимолей, или около 20 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль натрия в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль натрия в диапазоне от около 10 миллимолей до около 160 миллимолей или в диапазоне от около 20 миллимолей до около 40 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит натрий-фосфатный буфер при рН около 6,8.
[0062] Варианты реализации агентов переноса включают поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них. Поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них, включают, но без ограничения, натриевые или литиевые соли жирных кислот (таких как талловый жир или амины или фосфолипиды таллового жира) и кремнийорганические поверхностно-активные вещества. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, составлена из противоионов или других молекул, которые, как известно, связываются с молекулами нуклеиновых кислот. Не ограничивающие примеры включают, ионы тетраалкил аммония, ионы триалкил аммония, ионы сульфония, ионы лития, и полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, составлена из неполинуклеотидного гербицида, например, глифосата, ауксин-подобных гербицидов бензойной кислоты, включающих дикамбу, хлорамбен и ТВА, глуфосинат, ауксин-подобных гербицидов, включающих гербицид фенокси карбоксильной кислоты, гербицид пиридин карбоксильной кислоты, гербицид хинолин карбоксильной кислоты, гербицид пиримидин карбоксильной кислоты, и беназолин-этиловый гербицид, сульфонилмочевину, имидазолиноны, бромоксинил, делапон, циклохезанедион, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы и 4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназо ингибирующих гербицидов. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, составлена из неполинуклеотидного пестицида, например, пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.
Способы обеспечения растений с улучшенной устойчивостью к насекомым
[0063] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего повышенную устойчивость к насекомым, включающему экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую РНК, имеющую последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК, содержащую последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Несколько вариантов реализации изобретения относятся к растению, полученному с помощью такого способа. В некоторых вариантах реализации изобретения, ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК, имеющую от около 95% до около 100% ( например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичности или комплементарности последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0064] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт дополнительно содержит гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК, причем гетерологичный промотор является функционирующим в растительной клетке. ʺГетерологичныйʺ относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые обычно функционально не связаны в нативном или встречающемся в природе геноме; с помощью ʺгетерологичного промотораʺ означает, что промотор изначально функционально не связан с ДНК, кодирующей РНК. Промоторы, функционирующие в растительной клетке, содержат те, которые перечислены под заголовком ʺПромоторыʺ.
[0065] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт экспрессируется в растении путем трансгенной экспрессии или транзиторной экспрессии. В некоторых вариантах реализации изобретения, способ дополнительно включает экспрессию в растении по меньшей мере одного пестицидного агента, выбранного из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Пестицидный агент может быть экспрессирован из того же рекомбинантного ДНК конструкта, который содержит ДНК, кодирующую РНК, или из другого рекомбинантного ДНК конструкта.
[0066] Связанный аспект представляет собой растение, имеющее повышенную устойчивость к насекомым (например, повышенную стойкость к блошкам), или семена такого растения, причем растение предусматривается способом, включающим экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую РНК, имеющую последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, причем ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК, содержащую последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением не экспрессирующим рекомбинантный ДНК конструкт. В вариантах реализации изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается с помощью экспрессирования в растениях канолы или масличного рапса полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, нацеливающегося на один или более генов Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), например, в котором ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. Несколько вариантов реализации изобретения относятся к плоду, семенам, или частям, пригодными для размножения растения, предусмотренным этим способом, и проявляющих повышенную устойчивость к насекомым. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которое может контролироваться с помощью экспрессии у растения рекомбинантного ДНК конструкта соответственно этому способу. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены в рубрике ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для обеспечения декоративного растения или сельскохозяйственного растения с повышенной устойчивостью к блошкам. Различные варианты реализации способа включают те, в которых растение представляет собой растение из семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. В других вариантах реализации изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum. В варианте осуществления способ предусматривает растение картофеля с повышенной устойчивостью к Epitrix cucumeris (картофельной блошке).
[0067] Варианты реализации способов предусматривают растение, имеющее повышенную стойкость к одному или более видов блошек, например, виду рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах реализации изобретения, способ предусматривает растение, имеющее улучшенную устойчивость к насекомым, выбранным из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).
[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения, способ разработан для конкретных генов-мишеней у данного вида насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (блошки полосатой), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта цепь дцРНК, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта дцРНК, содержащую цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (блошке полосатой), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта дцРНК, содержащую цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта дцРНК, содержащую цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента.
Рекомбинантный ДНК конструкт, кодирующий РНК для борьбы с насекомым
[0069] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к рекомбинантному ДНК конструкту, содержащему гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0070] В некоторых вариантах реализации рекомбинантного ДНК конструкта, РНК транскрипт содержит по меньшей мере одну РНК цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт формирует дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь, содержащую по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую по меньшей мере одну РНК цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь, содержащую последовательность, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.
[0071] В некоторых вариантах реализации рекомбинантного ДНК конструкта, гетерологичный промотор является функционирующим для экспрессирования РНК транскрипта в бактерии. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых рекомбинантный ДНК конструкт должен экспрессироваться в бактерии, бактерию выбирают из группы, состоящей из Escherichia coli, видов Bacillus, видов Pseudomonas, видов Xenorhabdus или видов Photorhabdus. В других вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит гетерологичный промотор, который является функционирующим в растительной клетке.
[0072] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержится в рекомбинантном векторе, таком как вектор рекомбинантного растительного вируса или рекомбинантный вектор бакуловируса. В вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт интегрирован в растительную хромосому или пластиду, например, путем стабильной трансформации.
[0073] Связанные аспекты включают трансгенную растительную клетку, содержащую в своем геноме рекомбинантный ДНК конструкт, и трансгенное растение, содержащее такую трансгенную растительную клетку. Трансгенные растительные клетки и растения созданы с помощью способов, известных в данной области техники, таких как описанные под заголовком ʺСоздание и использование трансгенных растительных клеток и трансгенных растенийʺ. Дополнительные аспекты включают товарный продукт, полученный из такого трансгенного растения, и семян трансгенного потомства или частей трансгенного растения, пригодных для размножения.
Дополнительная информация и методы
Растения
[0074] Способы и композиции, описанные в данном документе, для лечения и защиты растений от насекомых-вредителей могут быть использованы у широкого спектра растений. Подходящие растения, у которых способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы, включают, но без ограничения, зерновые и кормовые травы (рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, овес, сорго, просо, пальчатое просо, кормовые травы холодного сезона и гречку заметную), масличные культуры (сою, масличные рода капусты, включая канолу и масличный рапс, подсолнечник, арахис, лен, кунжут и сафлор), бобовые, зерновые и кормовые растения (обыкновенную фасоль, китайскую вигну, горох, стручковую фасоль, чечевицу, фасоль остролистную, азиатскую фасоль, голубиный горох, вику, нут, люпин, люцерну и клеверы), фрукты и орехи умеренного пояса (яблоко, грушу, персик, сливы, ягодные культуры, вишни, виноград, оливы, миндаль и грецкий орех), тропические и субтропические фрукты и орехи (цитрусовые, включая лимоны, апельсины и грейпфруты; банан и банан райский, ананас, папайю, манго, авокадо, киви, маракуйю и хурму), овощные культуры (растения семейства пасленовых, включая помидоры, баклажаны и перцы; овощи рода капуста; редис, морковь, тыквы, луки, спаржи и листовые овощи), сахарные, клубневые и лубяные культуры (сахарный тростник, сахарную свеклу, стевию, картофель, сладкий картофель, маниоку и хлопок), плантационные культуры, декоративные растения и газонные травы (табак, кофе, какао, чай, каучуковое дерево, лекарственные растения, декоративные растения и газонные травы) и виды лесных деревьев. Конкретные виды растений представляющих интерес, являются растениями семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. Дополнительными видами растений, представляющих интерес, являются Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.
Дополнительные элементы конструкта
[0075] Варианты реализации изобретения полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, могут содержать дополнительные элементы, такие как промоторы, сайты распознавания малых РНК, аптамеры и рибозимы и дополнительные кассеты экспрессии для экспрессирования кодирующих последовательностей (например, для экспрессирования трансгенов, таких как инсектицидный белок или выбираемый маркер) или некодирующих последовательностей (для экспрессирования дополнительных элементов подавления). Например, аспект обеспечивает рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В другом варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей: (a) РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента, и (b) аптамер, стабильно интегрированный в растительный геном, из которого РНК транскрипт, содержащий РНК аптамер и подавленный элемент РНК, экспрессируются в клетках растения; аптамер служит для направления подавленного элемента РНК в нужное место в клетке. В другом варианте реализации изобретения, включение одного или более сайтов распознавания для связывания и расщепления с помощью малых РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которые экспрессируются только в определенной клетке или ткани) позволяет более точно экспрессировать паттерны в растении, в котором экспрессия рекомбинантного ДНК конструкта подавляется, где экспрессируются малые РНК. Такие дополнительные элементы описаны ниже.
Промоторы
[0076] Промоторы, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, являются функциональными в клетке, в которой данная конструкция предназначена для транскрипции. Как правило, эти промоторы являются гетерологичными промоторами, как используется в рекомбинантных конструктах, т. e., они не обнаружены в природе функционально связанными с другими нуклеиновыми элементами, используемыми в конструктах. В различных вариантах реализации изобретения, промотор является выбранным из группы, состоящей из конститутивного промотора, пространственно специфического промотора, специфического во времени промотора, связанного с развитием специфического промотора и индуцибельного промотора. Во многих вариантах реализации изобретения, промотор представляет собой промотор функциональный в растении, например, pol II промотор, pol III промотор, pol IV промотор, или pol V промотор.
[0077] Неконститутивные промоторы, пригодные для применения с конструктами рекомбинантной ДНК, описанными в данном документе, включают пространственно специфические промоторы, специфические во времени промоторы и индуцибельные промоторы. Пространственно специфические промоторы могут включать органелло-, клеточно-, ткане- или органоспецифические промоторы ( например, пластидспецифический, корнеспецифический, пыльцаспецифический или семяспецифический промотор для экспрессии в пластидах, корнях, пыльце или семенах соответственно). Во многих случаях особенно полезен семяспецифический, эмбрионоспецифический, алейроноспецифический или эндоспермоспецифический промотор. Специфические во времени промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию промотировать экспрессию во время конкретных стадий развития в цикле роста растения или в течение различного времени дня или ночи, или в различные времена года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами или условиями окружающей среды, таким как, но без ограничения, биотический или абиотический стресс (например, недостаток воды или засуха, жара, холод, высокие или низкие количества питательных веществ или соли, высокие или низкие уровни света, или вредитель, или патогенная инфекция). Промоторы микроРНК могут быть использованы, особенно те, которые имеют паттерн временной специфичности, пространственной специфичности или индуцибельной специфичности; примеры миРНК промоторов, а также способов для идентификации миРНК промоторов, имеющих специфические паттерны экспрессии, представлены в публикации заявки на патент США 2006/0200878, 2007/0199095 и 2007/0300329, которые специально включены в данный документ посредством ссылки. Промотор со специфической экспрессией может также включать промоторы, которые обычно конститутивно экспрессируются, но с разной степенью или "силой" экспрессии, включая промоторы, обычно рассматриваемые как "сильные промоторы" или как "слабые промоторы.
[0078] Промоторы, представляющие особый интерес, включают следующие примеры: промотор опалинсинтазы, выделенный из Т-ДНК Agrobacterium; промотор вируса мозаики цветной капусты 35S; усовершенствованные промоторные элементы или химерные промоторные элементы, такие как усовершенствованный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, связанный с энхансерным элементом (интрон белка теплового шока 70 Zea mays); корнеспецифические промоторы, такие как те, что описаны в патентах США 5837848; 6437217 и 6426446; промотор L13 олеозина кукурузы, описанный в патенте США 6433252; промотор для гена ядра растения, кодирующий локализованную в пластиде альдолазу, описанный в публикации заявки на патент США 2004/0216189; холодо-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6084089; солеиндуцибельные промоторы, описанные в патенте США № 6140078; светоиндуцибельные промоторы, описанные в патенте США 6294714; патоген-индуцибельные промоторы, описанные в патенте США 6252138; и водного дефицита индуцибельные промоторы, описанные в публикации заявки на патент США 2004/0123347 A1. Все описанные выше патенты и патентные публикации, описывающие промоторы и их использование, особенно в рекомбинантных ДНК конструктах, функциональных в растениях, включены в данный документ посредством ссылки.
[0079] Интересующие растительные сосудо- или флоэмоспецифические промоторы включают rolC или rolA промотор Agrobacterium rhizogenes, промотор Т-ДНК гена 5 Agrobacterium tumefaciens, промотор гена RSs1 сахарозосинтазы риса, промотор баднавируса желтой крапчатости Commelina, промотор вируса лиственного распада кокоса, промотор палочковидного вируса риса тунгро, промотор гена GS3A глутамин синтетазы гороха, промоторы генов invCD111 и invCD141 инвертазы картофеля, промотор, изолированный из Arabidopsis, который имеет флоэмоспецифическую экспрессию у табака, что показано Kertbundit и др. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 88:5212-5216, промотор VAHOX1 участка, промотор гена инвертазы клеточной стенки гороха, промотор гена кислой инвертазы из моркови, промотор гена сульфат транспортера Sultr1;3, промотор гена синтазы сахарозы растения и промотор гена переносчика сахарозы растений.
[0080] Промоторы, пригодные для применения с конструктом рекомбинантной ДНК или полинуклеотидом, описанными в данном документе, включают промоторы полимеразы II (ʺpol IIʺ) и промоторы полимеразы III (ʺpol IIIʺ). РНК полимераза II транскрибирует структурные и каталитические РНК, которые обычно короче, чем 400 нуклеотидов в длину, и распознает простой запуск Т-остатков в качестве сигнала терминации; она была использована для транскрибирования миРНК дуплексов (см., например, Lu et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32:e171). Промоторы рol II являются предпочтительными в некоторых вариантах реализации изобретения, где короткий РНК-транскрипт должен быть получен из рекомбинантного ДНК конструкта. В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит промотор pol II для экспрессирования РНК транскрипта, фланкированного с помощью саморасщепляющихся последовательностей рибозима (например, саморасщепляющихся рибозимов типа «hammerhead»), в результате чего обработанная РНК, такая как одноцепочечная РНК, которая связывается с транскриптом гена-мишени блошки, с определенными 5ʹ и 3ʹ концами, свободна от потенциально интерферирующих фланкирующих последовательностей. В альтернативном подходе используются промоторы pol III для создания транскриптов с относительно определенными 5ʹ и 3ʹ концами, т. e., для транскрибирования РНК с минимальными 5ʹ и 3ʹ фланкирующими последовательностями. В некоторых вариантах реализации изобретения, промоторы pol III (например, промоторы U6 или H1) являются предпочтительными для добавления короткого AT-насыщенного сайта терминации транскрипции, что приводит к образованию 2 пар оснований липких концов (UU) в транскрибируемой РНК; это полезно, например, для экспрессии конструктов миРНК-типа. Сообщалось об использование промоторов pol III для запуска экспрессии конструктов миРНК; см. van de Wetering и др. (2003) EMBO Rep., 4: 609-615, и Tuschl (2002) Nature Biotechnol., 20: 446-448. Промоторы бакуловируса, такие как полиэдрин бакуловируса и промоторы p10, известны в данной области техники и коммерчески доступны; см., например, Invitrogenʹs ʺGuide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniquesʺ, 2002 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и F. J. Haines и др. ʺBaculovirus Expression Vectorsʺ, без указания даты (Oxford Expression Technologies, Оксфорд, Великобритания).
[0081] Элемент промотора может содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые не являются природными промоторами, или промоторными элементами или их гомологами, но которые могут регулировать экспрессию гена. Примеры таких "ген независимых" регуляторных последовательностей включают природные или искусственно созданные последовательности РНК, которые содержат лиганд-связывающий участок, или аптамер (см. ʺАптамерыʺ, ниже) и регуляторный участок (который может быть цис-активным). См., например, Isaacs и др. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841-847, Bayer и Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, Mandal и Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463, Davidson and Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23:109-112, Winkler и др. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan и др. (2003) RNA, 9:644-647, и Mandal и Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35. Такие "риборегуляторы" можно выбирать или конструировать для конкретной пространственной или временной специфичности, например, для регуляции трансляции ДНК, которая кодирует подавленный элемент гена-мишени только в присутствии (или в отсутствие) данной концентрации подходящего лиганда. Одним из примеров является риборегулятор, который является чувствительным к эндогенному лиганду (например, жасмоновой кислоте или салициловой кислоте), вырабатываемому растением в условиях стресса (например, абиотического стресса, такого как вода, температура, или стресса питательных веществ, или биотического стресса, такого как прикрепление вредителей или патогенов); при стрессе, уровень эндогенного лиганда увеличивается до уровня, достаточного риборегулятору для начала транскрипции ДНК, которая кодирует подавленный элемент для подавления гена-мишени.
Сайты рекомбиназы
[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержит ДНК, кодирующую один или более сайтов узнавания сайт-специфической рекомбиназы. В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит по меньшей мере пару сайтов loxP, причем сайт-специфическая рекомбинация ДНК между сайтами loxP опосредуется Cre-рекомбиназой. Положения и относительная ориентация сайтов loxP выбранны для достижения желаемой рекомбинации; например, когда сайты loxP находятся в той же ориентации, ДНК между сайтами loxP вырезают в круговой форме. В другом варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую один сайт loxP; в присутствии Cre-рекомбиназы и другой ДНК с сайтом loxP, две ДНК рекомбинируются.
Аптамеры
[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, которая обрабатывается в РНК аптамер, то есть РНК, которая связывается с лигандом по механизму связывания, который, прежде всего, не основан на спаривании оснований по Уотсон-Крику (в противоположность, например, спариванию оснований, происходящему между комплементарными, антипараллельными цепями нуклеиновой кислоты с образованием структуры двухцепочечной нуклеиновой кислоты). См., например, Ellington и Szostak (1990) Nature, 346:818-822. Примеры аптамеров могут быть найдены, например, в общедоступной базе данных аптамеров на сайте aptamer.icmb.utexas.edu (Lee et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32(1):D95-100). Аптамеры могут, однако, быть моновалентными (связывающими один лиганд) или поливалентными (связывающими более чем один отдельный лиганд, например, связывающими одну единицу из двух или более различных лигандов).
[0084] Лиганды содержат любую молекулу (или часть молекулы), которая может быть распознана и будет связана с помощью нуклеиновой кислоты вторичной структуры с помощью механизма, прежде всего, не основанного на спаривании оснований по Уотсон-Крику. Таким образом, распознавание и связывание лиганда и аптамера аналогично антигену и антителу, или биологическому эффектору и рецептору. Лиганды могут содержать единичные молекулы (или часть молекулы), или сочетание двух или более молекул (или частей молекул), и могут содержать один или более макромолекулярных комплексов (например, полимеров, липидных бислоев, липосом, клеточных мембран или других клеточных структур, или клеточных поверхностей). Примеры специфических лигандов включают витамины, такие как коэнзим B12 и тиаминпирофосфат, флавинмононуклеотид, гуанин, аденозин, S-аденозилметионин, S-аденозилгомоцистеин, коэнзим A, лизин, тирозин, дофамин, глюкозамин-6-фосфат, кофеин, теофиллин, антибиотики, такие как хлорамфеникол и неомицин, гербициды, такие как глифосат и дикамба, белки, включая вирусные или фаговые белки оболочки и эпидермальные или поверхностные белки пищеварительного тракта беспозвоночного, и РНК, включая вирусную РНК, транспортную РНК (т-РНК), рибосомную РНК (рРНК) и РНК полимеразы, такие как РНК-зависимые РНК полимеразы (РзРп). Одним классом РНК аптамеров являются "термовыключатели", которые не связывают лиганд, но являются термочувствительными, то есть, конформация аптамера определяется температурой; см., например, вставку 3 в Mandal и Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463.
Трансгенные транскрипционные единицы
[0085] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид, описанные в данном документе, содержат трансгенную транскрипционную единицу. Трансгенная транскрипционная единица содержит последовательность ДНК, кодирующую интересующий ген, например, природный белок или гетерологичный белок. Представляющий интерес ген может быть кодирующей или некодирующей последовательностью любых видов (включая, но без ограничения, не эукариотов, таких как бактерии и вирусы; грибы, протисты, растения, беспозвоночные и позвоночные животные). Конкретные гены, представляющие интерес, являются генами, кодирующими один или более белков, придающих устойчивость к гербициду, и генами, кодирующими по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus и инсектицидного белка, производимого с помощью Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Трансгенная транскрипционная единица может дополнительно содержать 5ʹ или 3ʹ последовательность или обе, как требуется для транскрипции трансгена.
Интроны
[0086] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую сшивающий интрон. ʺИнтронʺ обычно означает сегмент ДНК (или РНК, транскрибированную из такого сегмента), который расположен между экзонами (белок-кодирующими сегментами ДНК или соответствующей транскрибированной РНК), причем, в ходе созревания матричной РНК, интрон является ферментативно "сращенным из" или удаленным из цепи РНК с помощью процесса расщепления/лигирования, который происходит в ядре эукариот. Термин ʺинтронʺ также применяется для некодирующих последовательностей ДНК, которые транскрибируются в сегменты РНК, которые могут быть сращены из созревающего РНК-транскрипта, но интроны не обнаружены между белок-кодирующих экзонами. Одим из примеров таких являются сшивающие последовательности, которые обладают способностью усиливать экспрессию расположенной ниже кодирующей последовательности в растениях (в некоторых случаях, особенно, у однодольных); эти сшивающие последовательности в норме расположены в 5ʹ нетранслируемом участке некоторых генов растений, а также в некоторых вирусных генах (например, 5ʹ лидерная последовательность вируса табачной мозаики или ʺомегаʺ лидер, описанные как усиливающие экспрессию генов растений в Gallie и Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20:4631-4638). Эти сшивающие последовательности или ʺусиливающие экспрессию интроныʺ могут быть искусственно вставлены в 5ʹ нетранслируемый участок гена растения между промотором, но до любого из белок-кодирующих экзонов. Примеры таких усиливающих экспрессию интронов включают, но без ограничения, алкогольдегидрогеназу кукурузы (Zm-Adh1), Bronze-1 усиливающий экспрессию интрон кукурузы, интрон актина 1 (Os-Act1) риса, Shrunken-1 (Sh-1) интрон, интрон синтетазы сахарозы кукурузы, интрон белка теплового шока 18 (hsp18) и интрон белка теплового шока 82 килодальтон (hsp82). Патенты США 5593874 и 5859347, специально включенные в данный документ посредством ссылки, описывают способы улучшения рекомбинантных ДНК конструктов для применения у растений с помощью включения усиливающего экспрессию интрона, полученного из белка теплового шока 70 килодальтон (hsp70) в нетранслируемом лидере, расположенном в 3' от промотора гена и 5' от первого белок-кодирующего экзона.
Рибозимы
[0087] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую один или более рибозимов. Рибозимы, представляющие особый интерес, включают саморасщепляющийся рибозим, рибозим со структурой "hammerhead" или рибозим со структурой "шпильки". В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую один или более рибозим, которые служат для расщепления транскрибируемой РНК для получения определенных сегментов РНК, таких как отдельные смысловые или анти-смысловые одноцепочечные сегменты РНК (которые в вариантах реализации изобретения гибридизируются с образованием дцРНК), или сегмент РНК, имеющий самокомплементарные нуклеотидные последовательности, которые формируют по меньшей мере частично дцРНК (например, в стебель-петля структуру) для подавления гена-мишени блошки.
Элементы супрессии генов
[0088] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую дополнительный элемент супрессии гена для подавления гена-мишени, отличного от гена-мишени блошки. Ген-мишень, который должен быть подавлен может содержать кодирующую или не кодирующую последовательность или обе.
[0089] Подходящие элементы супрессии гена подробно описаны в публикации заявки на патент США 2006/0200878, описание которых специально включено в данный документ посредством ссылки, и содержат один или более из:
(a) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмент анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;
(b) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;
(c) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмент смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;
(d) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;
(e) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит по меньшей мере один сегмент анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и по меньшей мере один сегмент смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;
(f) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит многочисленные серии сегментов анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми к меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленным сериям сегментов смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;
(g) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен, с помощью формирования многочисленных двойных цепочек РНК и содержит многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми по меньшей мере к одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленными сегментами смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен, и при этом многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК и многочисленные сегменты смысловой ДНК расположены в серии инвертированных повторов;
(h) ДНК, которая содержит нуклеотиды, полученные из растительной микроРНК;
(i) ДНК, которая содержит нуклеотиды миРНК;
(j) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом; и
(k) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную к регулированию экспрессии гена, который должен быть подавлен, причем регулирование зависит от конформации регуляторных РНК и конформация регуляторной РНК аллостерически влияет на состояния связывания РНК аптамеров.
[0090] В некоторых вариантах реализации изобретений, интрон используется для доставки элемента супрессии гена в отсутствии любого белок-кодирующего экзона (кодирующей последовательности). В одном примере, интрон, такой как усиливающий экспрессию интрон (предпочтительный в конкретных вариантах реализации изобретения), прерывается путем встраивания в интрон элемента супресси гена, причем, при транскрипции элемент супресси гена вырезается из интрона. Таким образом, белок-кодирующие экзоны не требуются для обеспечения функции супрессии гена конструктов рекомбинантной ДНК, описанных в данном документе.
Транскрипционные регуляторные элементы
[0091] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую транскрипционный регуляторный элемент. Транскрипционные регуляторные элементы содержат элементы, которые регулируют уровень экспрессии рекомбинантного ДНК конструкта (относительно их экспрессии в отсутствии таких регуляторных элементов). Примеры подходящих транскрипционных регуляторных элементов включают рибопереключатель (цис- или транс-действующие), стабилизирующие транскрипт последовательности и сайты узнавания микроРНК, как подробно описано в публикации заявки на патент США 2006/0200878, специально включенной в данный документ посредством ссылки.
Трансгенные растительные клетки и трансгенные растения
[0092] Рекомбинантные ДНК конструкты, описанные в данном документе, могут быть cложены с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей, (например, в случае трансформированных растений, особенности включают устойчивость к гербицидам, устойчивость к вредителям, устойчивость к холодному проращиванию, устойчивость к водному дефициту и так далее) например, с помощью экспрессирования или подавления других генов. Конструкты для скоординированного уменьшения и увеличения экспрессии генов представлены в публикации заявки на патент США 2004/0126845 A1, специально включенной в качестве ссылки.
[0093] В конкретных трансгенных растительных клетках и трансгенных растениях, иногда желательно, чтобы одновременно экспрессировался интересующий ген, в то время как также модулируется экспрессия гена-мишени блошки. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретений, трансгенное растение содержит рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую элемент экспрессии гена для экспрессирования по меньшей мере одного интересующего гена, и транскрипция рекомбинантного ДНК конструкта для борьбы с блошкой предпочтительно осуществляется с одновременной транскрипцией элемента экспрессии гена. В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК транскрипт, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую не-нуклеотидный пестицидный агент, такой как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент; такие ДНК могут быть сложены в один рекомбинантный конструкт или экспрессионную кассету, или, альтернативно, могут быть экспрессированы из дискретных рекомбинантных конструкций или кассет экспрессии. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататин, растительные лектины, фитоэкдистероиды, и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки из Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae). В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК транскрипт, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую один или более белков, отвечающих за толерантность к гербицидам. Примеры белков, отвечающих за толерантность к гербицидам включают 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS; см., например, патенты США № 5627061, 5633435 RE39247, 6040497 и 5094945, и PCT международную публикацию заявки на патент WO04074443 и WO04009761), глифосат оксидоредуктазу (GOX; патент США № 5463175), глифосата декарбоксилазу (PCT международная публикация заявки на патент WO05003362, патент США № 7405347 и публикация заявки на патента США 2004/0177399), глифосат-N-ацетил трансферазу (GAT; патент США № 7714188) отвечающую за толерантность к глифосату; дикамбу монооксигеназу, отвечающую за толерантность к ауксин-подобным гербицидам, таким как дикамба (патент США № 7105724); фосфинотрицин ацетилтрансферазу (pat или bar), отвечающую за толерантность к фосфинотрицину или глюфосинату (патент США № 5646024); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты, отвечающую за толерантность к 2,2-дихлорпропионовой кислоте (Далапон) (PCT международная публикация заявки на патент WO9927116); ацетогидроксиацид синтазу или ацетолактатсинтазу, отвечающие за толерантность к ингибиторам ацетолактатсинтазы, таким как сульфонилмочевина, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты и фталид (патент США № 6225105); галоарилнитрилазу (Bxn) для придания устойчивости к бромоксинилу (патент США № 4810648); модифицированную ацетил-коэнзим A карбоксилазу для придания устойчивости к циклогексанэдиону (сетоксидим) и арилоксифеноксипропионату (галоксифоп) (патент США № 6414222); дигидроптероат синтазу (sul I) для придания устойчивости к сульфонамидным гербицидам (патент США № 5719046); полипептид 32 кДa фотосистемы II (psbA) для придания устойчивости к триазиновым гербицидам (Hirschberg et al., 1983, Science, 222:1346-1349); антранилат синтазу для придания устойчивости к 5-метилтриптофану (патент США № 4581847); синтазу дигидродипиколиновой кислоты (dap A) для придания устойчивости к аминоэтил цистеину (PCT международная публикация заявки на патент WO8911789); фитоен десатуразу (crtI) для придания устойчивости к пиридазиноновым гербицидам, таким как норфлуразон (патент Японии JP06343473); гидроксифенилпируват диоксигеназу, оксидазу 4-гидроксифенилуксусной кислоты и 4-гидроксифенилуксусную 1-гидролазу (патент США 7304209) для придания устойчивости к циклопропилизоксазоловым гербицидам, таким как изоксафлютол (патент США № 6268549); модифицированную протопорфириноген оксидазу I (protox) для придания устойчивости к ингибиторам протопорфириногеноксидазы (патент США № 5939602); арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD-1) для придания устойчивости к гербициду, содержащему компонент арилоксиалканоата (WO05107437); серин гидроксиметилтрансферазу (в публикации заявки на патента США 2008/0155716), глюфосинат-толерантную глютамин синтетазу (в публикации заявки на патента США 2009/0018016). Примеры таких гербицидов включают фенокси ауксины (такие как 2,4- D и дихлорпроп), пиридоксин ауксины (такие как флуроксипир и трихлопир), ингибиторы арилоксифеноксипропионат (AOPP) ацетилкоэнзим A карбоксилазы (ACCase) (такие как галоксифоп, хизалофоп и диклофоп), и ингибиторы 5-замещенной феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Нуклеотидные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки гербицид-толерантности и последовательности белков гербицид-толерантности, как описано в патенте США и публикациях заявки на патент, цитируемые в этом параграфе, включены в данный документ посредством ссылки.
[0094] В некоторых вариантах реализации изобретения, конструкты рекомбинантный ДНК, описанные в данном документе, могут быть транскрибированы в любой растительной клетке или ткани или в целом растении на любой стадии развития. Трансгенные растения могут быть получены из любого однодольного или двудольного растения, такого как, но без ограничения, растения коммерческого или сельскохозяйственного интереса, такие как культурные растения (особенно сельскохозяйственные растения, используемые для продуктов питания человека или корма для животных), дерево- или целлюлозо-продуцирующие деревья, овощные растения, плодовые растения и декоративные растения. Примеры растений, представляющих интерес, включают растения зерновых злаков (таких как пшеница, овес, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, квиноа, амарант и гречку); растения кормовых культур (например, кормовые травы и кормовые двудольные включая люцерну, вику, клевер и т.п.); растения масличных культур (таких как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канолу, рапс, лен, арахис и масличную пальму); древесные орехи (такие как грецкий орех, кешью, фундук, пекан, миндаль, и т.п.); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, оливу, сахарную свеклу, чай, кофе; дерево- или целлюлозно-продуцирующие деревья; растения овощных культур, таких как бобовые (например, фасоли, горохи, чечевицы, люцерна, арахис), салат-латук, спаржа, артишоки, сельдерей, морковь, редис, крестоцветные (например, капусты, кормовые капусты, горчицы и другие листовые крестоцветные, брокколи, цветная капусту, брюссельскую капусту, репу, кольраби), пищевые тыквенные (например, огурцы, дыни, летние тыквы, зимние тыквы), пищевые луковые (например, луки, чеснок, луки-порей, луки-шалот, лук-резанец), съедобные представители семейства Solanaceae (например, помидоры, баклажаны, картофель, перец, физалис), и съедобные представители семейства Chenopodiaceae (например, свекла, мангольд, шпинат, квиноа, амарант); растения плодовых культур, таких как яблоки, груши, цитрусовые (например, апельсин, лайм, лимон, грейпфрут и другие), косточковые плоды (например, абрикос, персик, слива, нектарин), банан, ананас, виноград, киви, папайя, авокадо, и ягоды; растения, выращенные для биомассы или биотоплива (например, травы Miscanthus, просо, ятрофа, масличная пальма, эукариотические микроводоросли, такие как Botryococcus braunii, Chlorella spp. и Dunaliella spp., и эукариотические макроводоросли, такие как Gracilaria spp. и Sargassum spp.); и декоративные растения, включая декоративные цветущие растения, декоративные деревья и кустарники, декоративные почвопокровные растения и декоративные травы. Конкретные виды растений, представляющих интерес, в которых транскрибируется рекомбинантный ДНК конструкт для обеспечения устойчивости к блошкам, являются растениями из семейства Brassicaceae, включающие виды рода Brassica B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Дополнительными видами растений, представляющих интерес, в которых транскрибируется рекомбинантный ДНК конструкт для обеспечения устойчивости к блошкам, являются Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.
[0095] Кроме того, в данном документе описаны товарные продукты, полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян, экспрессирующих рекомбинантный ДНК конструкт, придающий повышенную устойчивость к блошкам, описанным в данном документе, включающие, но без ограничения, собранные листья, корни, побеги, клубни, стебли, плоды, семена или другие части растения, муку, масла, экстракты, продукты ферментации или расщепления, дробленные или цельные зерна или семена растения, или любой пищевой или непищевой продукт, включая такие товарные продукты, полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян как описано в данном документе. Обнаружение одной или более последовательностей нуклеиновой кислоты конструктов рекомбинантной ДНК для борьбы с блошками, как описано в данном документе, в одном или более товаров или товарных продуктах, рассмотренных в данном документе, является de facto доказательством того, что товар или товарный продукт содержит или получен из трансгенной клетки растения, растения или семян, экспрессирующих такой рекомбинантный ДНК конструкт.
[0096] Как правило, трансгенное растение, имеющее в своем геноме рекомбинантный ДНК конструкт, как описано в данном документе, проявляет повышенную стойкость к заражению насекомым, в частности, повышенную устойчивость к заражению блошкой. В различных вариантах реализации изобретения, например, где трансгенное растение экспрессирует рекомбинантный ДНК конструкт для борьбы с блошкой, который сложен с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей, трансгенное растение имеет по меньшей мере один дополнительный измененный признак по отношению к растению с отсутствующим рекомбинантным ДНК конструктом, выбранный из группы признаков, состоящей из:
(a) повышенной толерантности к абиотическому стрессу;
(b) повышенной толерантности к биотическому стрессу;
(c) модифицированного состава первичных метаболитов;
(d) модифицированного состава вторичных метаболитов;
(e) модифицированного состава микроэлементов, каротиноидов или витаминов;
(f) повышенного урожая;
(g) повышенной способности усваивать азот, фосфат или другие питательные вещества;
(h) модифицированных агротехнических характеристик;
(i) модифицированных характеристик роста и репродукции
(j) улучшенного качества сбора урожая, хранения и обработки.
[0097] В некоторых вариантах реализации изобретения, трансгенное растение характеризуется повышенной толерантностью к абиотическому стрессу (например, толерантностью к недостатку воды или засухе, тепловому, холодовому стрессу, неоптимальным уровням питательных веществ или соли, неоптимальным уровням освещенности) или к биотическому стрессу (например, перенаселению, аллелопатии или скарификации); модифицированным составом первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода); модифицированным составом вторичных метаболитов (например, алкалоидов, терпеноидов, поликетидов, нерибосомных пептидов и вторичных метаболитов смешанного биосинтетического происхождения); модифицированным составом микроэлементов (например, железа, цинка), каротиноидов (например, β-каротина, ликопена, лютеина, зеаксантина или других каротиноидов и ксантофиллов) или витаминов (например, токоферолов); повышенным урожаем (например, повышенным урожаем в условиях отсутствия стресса или повышенным урожаем в условиях биотического или абиотического стресса); повышенной способностью усваивать азот, фосфат или другие питательные вещества; модифицированными агротехническими характеристиками (например, замедленным созреванием; замедленным старением; более ранней или более поздней спелостью; повышенной толерантностью к тени; повышенной устойчивостью к полеганию корней и стеблей; повышенной устойчивостью к "разрыву" стеблей; модифицированным ответом на фотопериод); модифицированными характеристиками роста и репродукции (например, преднамеренной карликовостью; преднамеренной мужской стерильностью, пригодной, например, в методиках улучшения гибридизации; повышенной скоростью вегетативного роста; улучшенным прорастанием; повышенной мужской или женской фертильностью); улучшенными свойствами для сбора урожая, хранения и качества обработки (например, повышенной устойчивостью к вредителям при хранении, повышенной устойчивостью к повреждениям, большей привлекательностью для потребителя) или любой комбинацией этих признаков.
[0098] В другом варианте реализации изобретения, трансгенные семена или семена, образуемые трансгенным растением, имеют модифицированный состав первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода), модифицированный состав вторичных метаболитов, модифицированный состав микроэлементов, каротиноидов или витаминов, улучшенные свойства для сбора урожая, хранения и качества обработки или их комбинацию. В другом варианте реализации изобретения, может быть желательно изменить уровни нативных компонентов трансгенного растения или семян трансгенного растения, например, уменьшить уровни аллергенного белка или гликопротеина или токсичного метаболита.
Примеры
Пример 1
[0099] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации кодирующих ДНК последовательностей, используемых в качестве генов-мишеней для борьбы с видами насекомых и для изготовления композиций для борьбы с насекомыми и устойчивых к насекомым трансгенных растений, и определяет последовательности дцРНК триггера, полезного для борьбы с видами насекомых. Более конкретно, варианты реализации генов-мишеней, идентифицированных по имени (аннотации) и идентификатору последовательности (SEQ ID NO.), для борьбы с блошками представлены в SEQ ID NO: 1-859, и варианты реализации последовательностей дцРНК триггера, расположенные по размеру от 135 дo 352 пар оснований и сконструированные для подавления этих генов-мишеней, представлены в SEQ ID NO: 860-1718.
Таблица 1
Ген-мишень SEQ ID NO. | Триггер SEQ ID NO.* | Ген-мишень SEQ ID NO. | Триггер SEQ ID NO.* | Ген-мишень SEQ ID NO. | Триггер SEQ ID NO.* | Ген-мишень SEQ ID NO. | Триггер SEQ ID NO.* | |||
1 | 860 | 216 | 1075 | 431 | 1290 | 646 | 1505 | |||
2 | 861 | 217 | 1076 | 432 | 1291 | 647 | 1506 | |||
3 | 862 | 218 | 1077 | 433 | 1292 | 648 | 1507 | |||
4 | 863 | 219 | 1078 | 434 | 1293 | 649 | 1508 | |||
5 | 864 | 220 | 1079 | 435 | 1294 | 650 | 1509 | |||
6 | 865 | 221 | 1080 | 436 | 1295 | 651 | 1510 | |||
7 | 866 | 222 | 1081 | 437 | 1296 | 652 | 1511 | |||
8 | 867 | 223 | 1082 | 438 | 1297 | 653 | 1512 | |||
9 | 868 | 224 | 1083 | 439 | 1298 | 654 | 1513 | |||
10 | 869 | 225 | 1084 | 440 | 1299 | 655 | 1514 | |||
11 | 870 | 226 | 1085 | 441 | 1300 | 656 | 1515 | |||
12 | 871 | 227 | 1086 | 442 | 1301 | 657 | 1516 | |||
13 | 872 | 228 | 1087 | 443 | 1302 | 658 | 1517 | |||
14 | 873 | 229 | 1088 | 444 | 1303 | 659 | 1518 | |||
15 | 874 | 230 | 1089 | 445 | 1304 | 660 | 1519 | |||
16 | 875 | 231 | 1090 | 446 | 1305 | 661 | 1520 | |||
17 | 876 | 232 | 1091 | 447 | 1306 | 662 | 1521 | |||
18 | 877 | 233 | 1092 | 448 | 1307 | 663 | 1522 | |||
19 | 878 | 234 | 1093 | 449 | 1308 | 664 | 1523 | |||
20 | 879 | 235 | 1094 | 450 | 1309 | 665 | 1524 | |||
21 | 880 | 236 | 1095 | 451 | 1310 | 666 | 1525 | |||
22 | 881 | 237 | 1096 | 452 | 1311 | 667 | 1526 | |||
23 | 882 | 238 | 1097 | 453 | 1312 | 668 | 1527 | |||
24 | 883 | 239 | 1098 | 454 | 1313 | 669 | 1528 | |||
25 | 884 | 240 | 1099 | 455 | 1314 | 670 | 1529 | |||
26 | 885 | 241 | 1100 | 456 | 1315 | 671 | 1530 | |||
27 | 886 | 242 | 1101 | 457 | 1316 | 672 | 1531 | |||
28 | 887 | 243 | 1102 | 458 | 1317 | 673 | 1532 | |||
29 | 888 | 244 | 1103 | 459 | 1318 | 674 | 1533 | |||
30 | 889 | 245 | 1104 | 460 | 1319 | 675 | 1534 | |||
31 | 890 | 246 | 1105 | 461 | 1320 | 676 | 1535 | |||
32 | 891 | 247 | 1106 | 462 | 1321 | 677 | 1536 | |||
33 | 892 | 248 | 1107 | 463 | 1322 | 678 | 1537 | |||
34 | 893 | 249 | 1108 | 464 | 1323 | 679 | 1538 | |||
35 | 894 | 250 | 1109 | 465 | 1324 | 680 | 1539 | |||
36 | 895 | 251 | 1110 | 466 | 1325 | 681 | 1540 | |||
37 | 896 | 252 | 1111 | 467 | 1326 | 682 | 1541 | |||
38 | 897 | 253 | 1112 | 468 | 1327 | 683 | 1542 | |||
39 | 898 | 254 | 1113 | 469 | 1328 | 684 | 1543 | |||
40 | 899 | 255 | 1114 | 470 | 1329 | 685 | 1544 | |||
41 | 900 | 256 | 1115 | 471 | 1330 | 686 | 1545 | |||
42 | 901 | 257 | 1116 | 472 | 1331 | 687 | 1546 | |||
43 | 902 | 258 | 1117 | 473 | 1332 | 688 | 1547 | |||
44 | 903 | 259 | 1118 | 474 | 1333 | 689 | 1548 | |||
45 | 904 | 260 | 1119 | 475 | 1334 | 690 | 1549 | |||
46 | 905 | 261 | 1120 | 476 | 1335 | 691 | 1550 | |||
47 | 906 | 262 | 1121 | 477 | 1336 | 692 | 1551 | |||
48 | 907 | 263 | 1122 | 478 | 1337 | 693 | 1552 | |||
49 | 908 | 264 | 1123 | 479 | 1338 | 694 | 1553 | |||
50 | 909 | 265 | 1124 | 480 | 1339 | 695 | 1554 | |||
51 | 910 | 266 | 1125 | 481 | 1340 | 696 | 1555 | |||
52 | 911 | 267 | 1126 | 482 | 1341 | 697 | 1556 | |||
53 | 912 | 268 | 1127 | 483 | 1342 | 698 | 1557 | |||
54 | 913 | 269 | 1128 | 484 | 1343 | 699 | 1558 | |||
55 | 914 | 270 | 1129 | 485 | 1344 | 700 | 1559 | |||
56 | 915 | 271 | 1130 | 486 | 1345 | 701 | 1560 | |||
57 | 916 | 272 | 1131 | 487 | 1346 | 702 | 1561 | |||
58 | 917 | 273 | 1132 | 488 | 1347 | 703 | 1562 | |||
59 | 918 | 274 | 1133 | 489 | 1348 | 704 | 1563 | |||
60 | 919 | 275 | 1134 | 490 | 1349 | 705 | 1564 | |||
61 | 920 | 276 | 1135 | 491 | 1350 | 706 | 1565 | |||
62 | 921 | 277 | 1136 | 492 | 1351 | 707 | 1566 | |||
63 | 922 | 278 | 1137 | 493 | 1352 | 708 | 1567 | |||
64 | 923 | 279 | 1138 | 494 | 1353 | 709 | 1568 | |||
65 | 924 | 280 | 1139 | 495 | 1354 | 710 | 1569 | |||
66 | 925 | 281 | 1140 | 496 | 1355 | 711 | 1570 | |||
67 | 926 | 282 | 1141 | 497 | 1356 | 712 | 1571 | |||
68 | 927 | 283 | 1142 | 498 | 1357 | 713 | 1572 | |||
69 | 928 | 284 | 1143 | 499 | 1358 | 714 | 1573 | |||
70 | 929 | 285 | 1144 | 500 | 1359 | 715 | 1574 | |||
71 | 930 | 286 | 1145 | 501 | 1360 | 716 | 1575 | |||
72 | 931 | 287 | 1146 | 502 | 1361 | 717 | 1576 | |||
73 | 932 | 288 | 1147 | 503 | 1362 | 718 | 1577 | |||
74 | 933 | 289 | 1148 | 504 | 1363 | 719 | 1578 | |||
75 | 934 | 290 | 1149 | 505 | 1364 | 720 | 1579 | |||
76 | 935 | 291 | 1150 | 506 | 1365 | 721 | 1580 | |||
77 | 936 | 292 | 1151 | 507 | 1366 | 722 | 1581 | |||
78 | 937 | 293 | 1152 | 508 | 1367 | 723 | 1582 | |||
79 | 938 | 294 | 1153 | 509 | 1368 | 724 | 1583 | |||
80 | 939 | 295 | 1154 | 510 | 1369 | 725 | 1584 | |||
81 | 940 | 296 | 1155 | 511 | 1370 | 726 | 1585 | |||
82 | 941 | 297 | 1156 | 512 | 1371 | 727 | 1586 | |||
83 | 942 | 298 | 1157 | 513 | 1372 | 728 | 1587 | |||
84 | 943 | 299 | 1158 | 514 | 1373 | 729 | 1588 | |||
85 | 944 | 300 | 1159 | 515 | 1374 | 730 | 1589 | |||
86 | 945 | 301 | 1160 | 516 | 1375 | 731 | 1590 | |||
87 | 946 | 302 | 1161 | 517 | 1376 | 732 | 1591 | |||
88 | 947 | 303 | 1162 | 518 | 1377 | 733 | 1592 | |||
89 | 948 | 304 | 1163 | 519 | 1378 | 734 | 1593 | |||
90 | 949 | 305 | 1164 | 520 | 1379 | 735 | 1594 | |||
91 | 950 | 306 | 1165 | 521 | 1380 | 736 | 1595 | |||
92 | 951 | 307 | 1166 | 522 | 1381 | 737 | 1596 | |||
93 | 952 | 308 | 1167 | 523 | 1382 | 738 | 1597 | |||
94 | 953 | 309 | 1168 | 524 | 1383 | 739 | 1598 | |||
95 | 954 | 310 | 1169 | 525 | 1384 | 740 | 1599 | |||
96 | 955 | 311 | 1170 | 526 | 1385 | 741 | 1600 | |||
97 | 956 | 312 | 1171 | 527 | 1386 | 742 | 1601 | |||
98 | 957 | 313 | 1172 | 528 | 1387 | 743 | 1602 | |||
99 | 958 | 314 | 1173 | 529 | 1388 | 744 | 1603 | |||
100 | 959 | 315 | 1174 | 530 | 1389 | 745 | 1604 | |||
101 | 960 | 316 | 1175 | 531 | 1390 | 746 | 1605 | |||
102 | 961 | 317 | 1176 | 532 | 1391 | 747 | 1606 | |||
103 | 962 | 318 | 1177 | 533 | 1392 | 748 | 1607 | |||
104 | 963 | 319 | 1178 | 534 | 1393 | 749 | 1608 | |||
105 | 964 | 320 | 1179 | 535 | 1394 | 750 | 1609 | |||
106 | 965 | 321 | 1180 | 536 | 1395 | 751 | 1610 | |||
107 | 966 | 322 | 1181 | 537 | 1396 | 752 | 1611 | |||
108 | 967 | 323 | 1182 | 538 | 1397 | 753 | 1612 | |||
109 | 968 | 324 | 1183 | 539 | 1398 | 754 | 1613 | |||
110 | 969 | 325 | 1184 | 540 | 1399 | 755 | 1614 | |||
111 | 970 | 326 | 1185 | 541 | 1400 | 756 | 1615 | |||
112 | 971 | 327 | 1186 | 542 | 1401 | 757 | 1616 | |||
113 | 972 | 328 | 1187 | 543 | 1402 | 758 | 1617 | |||
114 | 973 | 329 | 1188 | 544 | 1403 | 759 | 1618 | |||
115 | 974 | 330 | 1189 | 545 | 1404 | 760 | 1619 | |||
116 | 975 | 331 | 1190 | 546 | 1405 | 761 | 1620 | |||
117 | 976 | 332 | 1191 | 547 | 1406 | 762 | 1621 | |||
118 | 977 | 333 | 1192 | 548 | 1407 | 763 | 1622 | |||
119 | 978 | 334 | 1193 | 549 | 1408 | 764 | 1623 | |||
120 | 979 | 335 | 1194 | 550 | 1409 | 765 | 1624 | |||
121 | 980 | 336 | 1195 | 551 | 1410 | 766 | 1625 | |||
122 | 981 | 337 | 1196 | 552 | 1411 | 767 | 1626 | |||
123 | 982 | 338 | 1197 | 553 | 1412 | 768 | 1627 | |||
124 | 983 | 339 | 1198 | 554 | 1413 | 769 | 1628 | |||
125 | 984 | 340 | 1199 | 555 | 1414 | 770 | 1629 | |||
126 | 985 | 341 | 1200 | 556 | 1415 | 771 | 1630 | |||
127 | 986 | 342 | 1201 | 557 | 1416 | 772 | 1631 | |||
128 | 987 | 343 | 1202 | 558 | 1417 | 773 | 1632 | |||
129 | 988 | 344 | 1203 | 559 | 1418 | 774 | 1633 | |||
130 | 989 | 345 | 1204 | 560 | 1419 | 775 | 1634 | |||
131 | 990 | 346 | 1205 | 561 | 1420 | 776 | 1635 | |||
132 | 991 | 347 | 1206 | 562 | 1421 | 777 | 1636 | |||
133 | 992 | 348 | 1207 | 563 | 1422 | 778 | 1637 | |||
134 | 993 | 349 | 1208 | 564 | 1423 | 779 | 1638 | |||
135 | 994 | 350 | 1209 | 565 | 1424 | 780 | 1639 | |||
136 | 995 | 351 | 1210 | 566 | 1425 | 781 | 1640 | |||
137 | 996 | 352 | 1211 | 567 | 1426 | 782 | 1641 | |||
138 | 997 | 353 | 1212 | 568 | 1427 | 783 | 1642 | |||
139 | 998 | 354 | 1213 | 569 | 1428 | 784 | 1643 | |||
140 | 999 | 355 | 1214 | 570 | 1429 | 785 | 1644 | |||
141 | 1000 | 356 | 1215 | 571 | 1430 | 786 | 1645 | |||
142 | 1001 | 357 | 1216 | 572 | 1431 | 787 | 1646 | |||
143 | 1002 | 358 | 1217 | 573 | 1432 | 788 | 1647 | |||
144 | 1003 | 359 | 1218 | 574 | 1433 | 789 | 1648 | |||
145 | 1004 | 360 | 1219 | 575 | 1434 | 790 | 1649 | |||
146 | 1005 | 361 | 1220 | 576 | 1435 | 791 | 1650 | |||
147 | 1006 | 362 | 1221 | 577 | 1436 | 792 | 1651 | |||
148 | 1007 | 363 | 1222 | 578 | 1437 | 793 | 1652 | |||
149 | 1008 | 364 | 1223 | 579 | 1438 | 794 | 1653 | |||
150 | 1009 | 365 | 1224 | 580 | 1439 | 795 | 1654 | |||
151 | 1010 | 366 | 1225 | 581 | 1440 | 796 | 1655 | |||
152 | 1011 | 367 | 1226 | 582 | 1441 | 797 | 1656 | |||
153 | 1012 | 368 | 1227 | 583 | 1442 | 798 | 1657 | |||
154 | 1013 | 369 | 1228 | 584 | 1443 | 799 | 1658 | |||
155 | 1014 | 370 | 1229 | 585 | 1444 | 800 | 1659 | |||
156 | 1015 | 371 | 1230 | 586 | 1445 | 801 | 1660 | |||
157 | 1016 | 372 | 1231 | 587 | 1446 | 802 | 1661 | |||
158 | 1017 | 373 | 1232 | 588 | 1447 | 803 | 1662 | |||
159 | 1018 | 374 | 1233 | 589 | 1448 | 804 | 1663 | |||
160 | 1019 | 375 | 1234 | 590 | 1449 | 805 | 1664 | |||
161 | 1020 | 376 | 1235 | 591 | 1450 | 806 | 1665 | |||
162 | 1021 | 377 | 1236 | 592 | 1451 | 807 | 1666 | |||
163 | 1022 | 378 | 1237 | 593 | 1452 | 808 | 1667 | |||
164 | 1023 | 379 | 1238 | 594 | 1453 | 809 | 1668 | |||
165 | 1024 | 380 | 1239 | 595 | 1454 | 810 | 1669 | |||
166 | 1025 | 381 | 1240 | 596 | 1455 | 811 | 1670 | |||
167 | 1026 | 382 | 1241 | 597 | 1456 | 812 | 1671 | |||
168 | 1027 | 383 | 1242 | 598 | 1457 | 813 | 1672 | |||
169 | 1028 | 384 | 1243 | 599 | 1458 | 814 | 1673 | |||
170 | 1029 | 385 | 1244 | 600 | 1459 | 815 | 1674 | |||
171 | 1030 | 386 | 1245 | 601 | 1460 | 816 | 1675 | |||
172 | 1031 | 387 | 1246 | 602 | 1461 | 817 | 1676 | |||
173 | 1032 | 388 | 1247 | 603 | 1462 | 818 | 1677 | |||
174 | 1033 | 389 | 1248 | 604 | 1463 | 819 | 1678 | |||
175 | 1034 | 390 | 1249 | 605 | 1464 | 820 | 1679 | |||
176 | 1035 | 391 | 1250 | 606 | 1465 | 821 | 1680 | |||
177 | 1036 | 392 | 1251 | 607 | 1466 | 822 | 1681 | |||
178 | 1037 | 393 | 1252 | 608 | 1467 | 823 | 1682 | |||
179 | 1038 | 394 | 1253 | 609 | 1468 | 824 | 1683 | |||
180 | 1039 | 395 | 1254 | 610 | 1469 | 825 | 1684 | |||
181 | 1040 | 396 | 1255 | 611 | 1470 | 826 | 1685 | |||
182 | 1041 | 397 | 1256 | 612 | 1471 | 827 | 1686 | |||
183 | 1042 | 398 | 1257 | 613 | 1472 | 828 | 1687 | |||
184 | 1043 | 399 | 1258 | 614 | 1473 | 829 | 1688 | |||
185 | 1044 | 400 | 1259 | 615 | 1474 | 830 | 1689 | |||
186 | 1045 | 401 | 1260 | 616 | 1475 | 831 | 1690 | |||
187 | 1046 | 402 | 1261 | 617 | 1476 | 832 | 1691 | |||
188 | 1047 | 403 | 1262 | 618 | 1477 | 833 | 1692 | |||
189 | 1048 | 404 | 1263 | 619 | 1478 | 834 | 1693 | |||
190 | 1049 | 405 | 1264 | 620 | 1479 | 835 | 1694 | |||
191 | 1050 | 406 | 1265 | 621 | 1480 | 836 | 1695 | |||
192 | 1051 | 407 | 1266 | 622 | 1481 | 837 | 1696 | |||
193 | 1052 | 408 | 1267 | 623 | 1482 | 838 | 1697 | |||
194 | 1053 | 409 | 1268 | 624 | 1483 | 839 | 1698 | |||
195 | 1054 | 410 | 1269 | 625 | 1484 | 840 | 1699 | |||
196 | 1055 | 411 | 1270 | 626 | 1485 | 841 | 1700 | |||
197 | 1056 | 412 | 1271 | 627 | 1486 | 842 | 1701 | |||
198 | 1057 | 413 | 1272 | 628 | 1487 | 843 | 1702 | |||
199 | 1058 | 414 | 1273 | 629 | 1488 | 844 | 1703 | |||
200 | 1059 | 415 | 1274 | 630 | 1489 | 845 | 1704 | |||
201 | 1060 | 416 | 1275 | 631 | 1490 | 846 | 1705 | |||
202 | 1061 | 417 | 1276 | 632 | 1491 | 847 | 1706 | |||
203 | 1062 | 418 | 1277 | 633 | 1492 | 848 | 1707 | |||
204 | 1063 | 419 | 1278 | 634 | 1493 | 849 | 1708 | |||
205 | 1064 | 420 | 1279 | 635 | 1494 | 850 | 1709 | |||
206 | 1065 | 421 | 1280 | 636 | 1495 | 851 | 1710 | |||
207 | 1066 | 422 | 1281 | 637 | 1496 | 852 | 1711 | |||
208 | 1067 | 423 | 1282 | 638 | 1497 | 853 | 1712 | |||
209 | 1068 | 424 | 1283 | 639 | 1498 | 854 | 1713 | |||
210 | 1069 | 425 | 1284 | 640 | 1499 | 855 | 1714 | |||
211 | 1070 | 426 | 1285 | 641 | 1500 | 856 | 1715 | |||
212 | 1071 | 427 | 1286 | 642 | 1501 | 857 | 1716 | |||
213 | 1072 | 428 | 1287 | 643 | 1502 | 858 | 1717 | |||
214 | 1073 | 429 | 1288 | 644 | 1503 | 859 | 1718 | |||
215 | 1074 | 430 | 1289 | 645 | 1504 |
*Последовательности триггера предоставлены для анти-смысловой цепи дцРНК триггера в 5ʹ дo 3ʹ направлении.
** T44966 и T44967 являются положительным контролем, основанным на мРНК аргинин киназы Phyllotreta striolata, описанной в Zhao и др. (2008), Eur. J. Entomol., 5:815.
[0100] Варианты реализации дцРНК триггера, предоставленные в Таблице 1, как правило, используются для РНК-опосредованного подавления соответствующего гена-мишени идентифицированного в Таблице 1. Эти дцРНК триггеры используются для борьбы с насекомыми, особенно с блошками, включая вид-источник, у которого были идентифицированы гены-мишени из Таблицы 1. РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для умерщвления или приостановки роста или другой борьбой с видами-мишенями насекомых из следующих родов: Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие дцРНК триггер для подавления одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1 (например, композиция, содержащая эффективное количество одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1) используются для борьбы по меньшей мере с одной из Altica ambiens (блошкой ольхи), Altica canadensis (блошкой земляной), Altica chalybaea (блошкой виноградной), Altica prasina (блошкой тополя), Altica rosae (блошкой розы), Altica sylvia (блошкой голубики), Altica ulmi (блошкой вяза), Chaetocnema pulicaria (блошкой кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошкой сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошкой картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошкой) и Systena frontalis (рыжей блошкой), таким образом, предотвращая или вылечивая заражение растения этими видами. Например, композиция, содержащая эффективное количество одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для предотвращения или лечения заражения растений картофеля Epitrix cucumeris (блошкой картофельной).
[0101] В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для умерщвления или приостановки роста видов блошки родов Phyllotreta и Psylliodes, таким образом, предотвращая или вылечивая заражения этими видами. В конкретных вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для умерщвления или приостановки роста по меньшей мере одного вида блошки, выбранного из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной). В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Phyllotreta atra (блошки репы), например, с помощью приведения в контакт взрослых особоей, личинок или яиц Phyllotreta atra с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), например, с помощью приведения в контакт взрослых особей, личинок или яиц Phyllotreta cruciferae с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Phyllotreta striolata (блошки полосатой), например, с помощью приведения в контакт взрослых особей, личинок или яиц Phyllotreta striolata с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Psylliodes chrysocephala, например, с помощью приведения в контакт взрослых особей, личинок или яиц Psylliodes chrysocephala с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718.
[0102] Растения, которые могут быть защищены от такого заражения с помощью трансгенной экспрессии или местного применения одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, включают любой вид растения или сорт, который подвержен заражению блошками, особенно растения, имеющие важное экономическое значение, включая декоративные растения и сельскохозяйственных растения. Варианты реализации таких растений включают растения из семейства Brassicaceae (семейство крестоцветных), такие как растение из рода Brassica включающие, например, один из следующих вариантов: B. napus (семена рапса, включающие сорта, такие как канола и брюква), B. juncea (индийская горчица), B. carinata (абиссинская горчица), B. rapa (репа), B. oleracea (дикая капуста, включающая одомашненные сорта такие как, кормовая капуста, капуста, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста и т. д.) B. rupestris (коричневая горчица), B. septiceps (горчица seventop), B. nigra (черная горчица), B. narinosa (капуста ноздреватая), B. perviridus (горчица, шпинат), B. tournefortii (азиатская горчица) и B. fructiculosa (средиземноморская капуста). В дополнительных вариантах реализации изобретения, растения-мишени могут включать, но без ограничения, один из следующих вариантов: Glycine max (соя), Linum usitatissimum (льняное семя/лен), Zea mays (кукуруза), Carthamus tinctorius (сафлор), Helianthus annuus (подсолнечник), Nicotiana tabacum (табак), Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa (бразильский орех), Ricinus communis (клещевина), Cocos nucifera (кокосовый орех), Coriandrum sativum (кориандр), Gossypium spp. (хлопок), Arachis hypogaea (земляной орех или арахис), Simmondsia chinensis (жожоба), Solanum tuberosum (картофель) Elaeis guineensis (масличная пальма), Olea europaea (олива), Oryza sativa (рис), Cucurbita maxima (тыква большая столовая), Hordeum vulgare (ячмень) и Triticum aestivum (пшеница).
[0103] Аспект включает композиции, содержащие эффективное количество одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, для местного лечения растения, которое нужно обработать от, или защищать от заражения блошкой. Другой аспект включает рекомбинантный ДНК конструкт, кодирующий по меньшей мере одну цепь одного дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, для трансгенной экспрессии в растении, которое имеет повышенную устойчивость к заражению блошкой по сравнению с растением не экспрессирующим такой конструкт.
Пример 2
[0104] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации тестирования эффективности последовательностей дцРНК триггера и проверки полезности триггеров для подавления кодирующих последовательностей ДНК, используемых в качестве генов-мишеней для борьбы с видами насекомых. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий приведение в контакт насекомого, такого как взрослая блошка или личинка, с одним или более дцРНК триггером, сконструированным для вызывания задержки роста или гибели насекомого. Другие варианты реализации изобретений содержат способы, где дцРНК триггер доставляется насекомому путем перорального введения (например, на или в пищевом материале, поглощаемым насекомым), или с помощью неперорального введения (например, доставки через кутикулу насекомых, или доставки с помощью приведения в контакт с яйцом насекомого).
[0105] В одном варианте реализации изобретения, анализ питания используется для определения эффективности дцРНК триггера в вызывании задержки роста или гибели насекомых, таких как блошки. Для того, чтобы проверить эффективность дцРНК триггеров для уничтожения или задержки рост блошек, одна дискриминирующая доза (например, 100 нанограмм/миллилитр) используется для идентификации дцРНК триггеров с измеряемой способностью к уничтожению или задержки рост блошек в этой дозе. Отрицательный контроль дцРНК триггера, такой как дцРНК нацеливающийся зеленый флуоресцентный белок (GFP), также включен в анализ. Каждый дцРНК триггер наносят равномерно на диски листьев рапса диаметром 1,0 сантиметр и помещают в многолуночные планшеты с 2 самцами и 2 самками взрослых блошек или 4 личинками блошки на лунку. Каждые 24 часа в течение определенного периода (например, 2 недели) предоставляются новые, свежепокрытые листья. Отставание в росте и смертность периодически оцениваются (например, ежедневно или каждые 2 или 3 дня).
[0106] ДцРНК триггеры, которые демонстрируют эффективность в этом однодозовом анализе, тестируются дополнительно. Используя подобный протокол, тестируются различные дозы дцРНК триггеров, как описано выше, для определения ЛК50 дозы для каждой из активных дцРНК. Биопробы включают 12-24 насекомых на дозу, выполненных в трех повторностях. Отставание в росте и смертность, оценивающиеся в течение 2-недельного периода, оценивают каждый третий день.
[0107] Последовательности дцРНК триггера, которые подтвердили свою эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, используют для идентификации эффективных агентов доставки РНК и составов. Инсектицидная активность составов, содержащих дцРНК триггеры, может быть оптимизирована с помощью различных методов, таких как модифицирование химических объектов в составе или модифицирование соотношения химических компонентов в составе. Неограничивающие примеры агентов доставки и составов представлены в Примере 5.
Пример 3
[0108] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов для проверки эффективности дцРНК триггера для подавления или сайленсинга гена-мишени в клетке насекомого или вызывания отставания в росте или гибели у насекомого. Более конкретно, этот пример иллюстрирует методы тестирования дцРНК триггеров на эффективность в предотвращении или лечении заражений блошкой у целых растений.
[0109] Полинуклеотиды (такие как последовательности дцРНК триггера, описанные в Примерах 1 и 2), у которых была подтверждена эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, дополнительно оценивали в анализах целого растения. В одном способе, полинуклеотиды (например, дцРНК триггеры) наносятся непосредственно на поверхность насекомых (например, с помощью распыления или опудривания). В другом способе, полинуклеотиды предоставляются насекомому в рационе насекомого (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей дцРНК триггер, такой как дцРНК триггер формы шпилька, или в искусственной приманке, содержащей РНК). Отставание в росте и смертность периодически оцениваются, как описано в Примере 2.
[0110] В различных способах, которые также подходят для широкомасштабного применения (например, на полях сельскохозяйственных культур), полинуклеотиды наносятся внекорневой подкормкой через воздушное или наземное распыление, или опудривание, или внесение ядохимикатов с поливной водой на листовую поверхность, чтобы контролировать ранние сезонные повреждения от взрослой стадии жизненного цикла, или наносятся как обработка семян, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого, или наносятся в грунт внутрирядно или наносятся смачиванием, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого. Пример режима лиственного тестирования включает обработку растения сразу же после появления из земли и оценку лиственного повреждения, причиненного взрослыми блошками через 1-2 недели после появления всходов. Для внутрирядной обработки или обработки семян следует аналогичный временной паттерн для оценки ущерба.
Пример 4
[0111] Полинуклеотиды, как правило, сконструированы для модулирования экспрессии путем индукции регулирования или подавления гена-мишени насекомого и сконструированы, чтобы иметь нуклеотидную последовательность, по существу, одинаковую или, по существу, комплементарную нуклеотидной последовательности гена-мишени насекомого или кДНК (например, SEQ ID NO: 1-859) или последовательности РНК, транскрибируемой из гена-мишени насекомого, которая может быть кодирующей последовательностью или некодирующей последовательностью. Эти эффективные полинуклеотидные молекулы, которые модулируют экспрессию, упоминаются в данном документе как ʺтриггерʺ, или ʺтриггерыʺ. Этот пример описывает неограничивающие методики, используемые в конструировании и выборе полинуклеотидов в качестве ʺтриггеровʺ для модулирования экспрессии гена-мишени насекомого.
Выбор полинуклеотидных триггеров с помощью ʺПерекрыванияʺ
[0112] Полинуклеотиды, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, не обязательно должны быть полной длины гена-мишени, и во многих вариантах реализации изобретения имеют гораздо меньшую длину по сравнению с геном-мишенью. Примером методики, которая используется для выбора эффективных триггеров, является ʺперекрываниеʺ, или оценка полинуклеотидов, соответствующих смежным или частично перекрывающим друг друга сегментам гена-мишени.
[0113] Эффективные полинуклеотидные ʺтриггерыʺ могут быть определены с помощью ʺперекрыванияʺ генных мишеней в фрагментах выбранной длины, например, фрагментах 200-300 нуклеотидов в длину, с частично перекрывающимися участками, например, около 25 нуклеотидов, вдоль длины гена-мишени. Для подавления одного гена, последовательности триггера сконструированные для соответствия (имеют нуклеотидную идентичность или комплементарность с) участкам, которые являются уникальными для гена-мишени; выбранный участок гена-мишени может содержать кодирующую последовательность или некодирующую последовательность (например, участки промотора, 3ʹ нетранслируемые участки, интроны и т. д.) или комбинацию обоих.
[0114] Там, где это представляет интерес для конструирования целевой последовательности, эффективной в подавлении множественных генов-мишеней, множественные последовательности гена-мишени выравниваются и полинуклеотидные триггеры, сконструированные для соответствия участкам с высокой гомологией последовательности общей среди нескольких целей. И, наоборот, там, где это представляет интерес для разработки целевой эффективности в селективном подавлении одной среди нескольких целевых последовательностей, последовательности множественных генов-мишеней были выровнены и полинуклеотидные триггеры, сконструированы для соответствия участкам с отсутствующей или низкой гомологией последовательности общей среди нескольких целей.
[0115] В неограничивающем примере, анти-смысловые одноцепочечные РНК триггеры сконструированы для каждого из генов-мишеней, перечисленных в Таблице 1 следующим образом. Множественные анти-смысловые одноцепочечные РНК триггеры, каждый из 200-300 нуклеотидов в длину и с последовательностью, соответствующей (например, анти-смысловым триггерам, комплементарным с) фрагменту гена-мишени, имеющему последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, сконструированы так, что каждая триггерная последовательность перекрывает около 25 нуклеотидов следующей смежной триггерной последовательности, таким образом, что несколько триггеров в сочетании покрывают всю длину гена-мишени. (Смысловые триггеры сконструированы аналогичным образом, где последовательность триггера идентична фрагменту гена-мишени. Аналогично, двухцепочечные триггеры могут быть сконструированы с помощью обеспечения пар смысловых и анти-смысловых триггеров, каждая пара триггеров перекрывает следующую смежную пару триггеров.)
[0116] Полинуклеотидные триггеры тестируются любым удобным способом на эффективность в подавление экспрессии гена-мишени насекомого. Примеры подходящего теста включают биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах. Другой тест включает местное применение полинуклеотидных триггеров или напрямую к отдельным насекомых, или на поверхности растения, которое должно быть защищено от заражения насекомым. Одним из желаемых результатов обработки полинуклеотидом, как описано в данном документе, является предотвращение или борьба с заражением насекомым, например, с помощью индуцирования у насекомого физиологических или поведенческих изменений таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. Другим желаемым результатом обработки полинуклеотидом, как описано в данном документе, является обеспечение растения, которое демонстрирует повышенную устойчивость к заражению насекомыми.
[0117] Процедуру перекрывания при желании можно повторить. Полинуклеотидный триггер, обеспечивающий требуемую активность, может быть сам подвергнут процедуре перекрывания. Например, сконструированные множественные перекрывающиеся анти-смысловые одноцепочечные РНК триггеры, каждый из 50-60 нуклеотидов в длину и с последовательностью, соответствующей (например, анти-смысловым триггерам, комплементарным) фрагменту гена-мишени, имеющему последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, для которой была установлена эффективность одного полинуклеотидного триггера из 300 нуклеотидов. Дополнительные циклы анализа перекрывания могут быть проведены, в которых протестированы триггеры короче, чем 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов.
[0118] Эффективные полинуклеотидные триггеры любого размера могут использоваться по отдельности или в комбинации в различных способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, один полинуклеотидный триггер используется для создания композиции (например, композиции для местного применения, или рекомбинантного конструкта ДНК пригодного для создания трансгенного растения). В других вариантах реализации изобретения, используется смесь или совокупность разных полинуклеотидных триггеров; в таких случаях полинуклеотидные триггеры могут быть для одного гена-мишени или нескольких генов-мишеней. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотидный триггер сконструирован для направленного воздействия на различные участки гена-мишени, например, триггер может содержать несколько сегментов, которые соответствуют различным экзонным участкам гена-мишени, и ʺспейсерныеʺ нуклеотиды, которые не соответствуют гену-мишени, при необходимости могут быть использованы между или смежно с сегментами.
Термодинамические соображения при выборе полинуклеотидных триггеров
[0119] Полинуклеотидные триггеры могут быть сконструированы или их последовательность оптимизирована с использованием термодинамических соображений. Например, полинуклеотидные триггеры могут быть выбраны на основании термодинамически контролируемой гибридизации между одной цепью нуклеиновой кислоты (например, полинуклеотидным триггером или отдельной миРНК) и другой (например, транскриптом гена-мишени).
[0120] Способы и алгоритмы для прогнозирования нуклеотидных последовательностей, которые, вероятно, будут эффективными при РНКи-опосредованном подавлении гена-мишени, известны в данной области техники. Не ограничивающие примеры таких способов и алгоритмов включают ʺi-scoreʺ, описанную Ichihara и др. (2007) Nucleic Acids Res., 35(18): 123e; ʺOligowalkʺ, в открытом доступе на rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk и описанную Lu и др. (2008) Nucleic Acids Res., 36:W104-108; и ʺоценку Рейнольдсаʺ, описанную Khovorova и др. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330.
Допустимые несовпадения
[0121] "По существу идентичный" или "по существу комплементарный" означает, что полинуклеотидный триггер (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) обладает достаточной идентичностью и комплементарностью к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени (например, транскрипт), для подавления экспрессии гена-мишени (например, для осуществления снижения уровней или активности транскрипта гена-мишени и/или кодируемого белка). Полинуклеотидам не нужно иметь 100-процентную идентичность или комплементарности к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени, для подавления экспрессии гена-мишени (например, для осуществления снижения уровней или активности транскрипта гена-мишени или кодируемого белка, или обеспечения борьбы с видами насекомого). В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть по существу идентичными или по существу комплементарными последовательностями по меньшей мере 18 или 19 смежных нуклеотидов в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть точно идентичными или точно комплементарными последовательностями из 21 смежного нуклеотида в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В конкретных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу идентичныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную идентичность или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность последовательности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов в любом эндогенном гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В конкретных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу комплементарныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную комплементарность последовательности или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную комплементарность последовательности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени.
[0122] Полинуклеотиды, содержащие несовпадения гена-мишени или транскрипта, могут быть использованы в определенных вариантах реализации композиций и способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 19 смежных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом (т. e., 1 или 2 несовпадений между 19 смежными нуклеотидами полинуклеотида и сегментом эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени). В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 20 или более нуклеотидов, который содержит смежный 19 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 21 непрерывных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 22 или более нуклеотидов, который содержит смежный 21 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом.
[0123] При конструировании полинуклеотидов с несовпадениями с эндогенным геном-мишенью или РНК, транскрибированной из гена-мишени, могут быть использованы несовпадения определенных типов и в определенных позициях, которые, скорее всего, будут допускаться. В определенных иллюстративных вариантах реализации изобретения, используются несовпадения образованные между остатками аденина и цитозина или гуанозина и урацила, как описано Du и др. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. В некоторых вариантах реализации изобретения, несовпадения в 19 паре оснований участков перекрытия расположены при низкой толерантности к позициям 5, 7, 8 или 11 (от 5ʹ конца 19-нуклеотидной мишени), при средней толерантности к позициям 3, 4 и 12-17 (от 5ʹ конца 19-нуклеотидной мишени), и/или при высокой толерантности к позициям на любом конце участка комплементарности, например, позициях 1, 2, 18 и 19 (от 5ʹ конца 19-нуклеотидной мишени), как описано Du и др. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. Допускаемые несовпадения могут быть эмпирически определены в рутинных анализах, таких как те, что описаны в данном документе в рабочих примерах.
[0124] В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды содержат дополнительные нуклеотиды для обеспечения стабильности или для удобства клонирования и синтеза. В одном вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь с сегментом из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, и дополнительно содержащую дополнительный 5ʹ G или дополнительный 3ʹ C или оба, смежные с сегментом. В другом варианте реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для формирования "липкого" конца, например, дцРНК, содержащая 2 дезоксирибонуклеотида для формирования 3ʹ "липкого" конца.
Вставка активных триггеров в нейтральную последовательность
[0125] В варианте реализации изобретения, биоактивный триггер (т. e., полинуклеотид с последовательностью, соответствующей гену-мишени, и который отвечает за наблюдаемое подавление гена-мишени) вставлен в ʺнейтральнуюʺ последовательность, например, вставлен в дополнительные нуклеотиды, которые не имеют идентичности или комплементарности последовательности к гену-мишени. Нейтральная последовательность может быть желательной, например, для увеличения общей длины полинуклеотида. Например, может быть желательно, чтобы полинуклеотид был определенного размера для обеспечения стабильности, эффективности в производстве или биологической активности.
[0126] Сообщалось, что у другого вида жесткокрылых, Diabrotica virgifera, дцРНК, больше чем или равные приблизительно 60 парам оснований (п.о.), необходимы для биологической активности в биоанализе искусственного корма; см. Bolognesi и др. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения, дцРНК триггер из 21-пары оснований, соответствующий гену-мишени из Таблицы 1 и обеспечивающий контроль за заражением насекомым, вставлен в нейтральную последовательность из дополнительных 39 пар оснований, формируя таким образом полинуклеотид из около 60 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения, один триггер из 21-пары оснований оказывается эффективным при встраивании в большие участки нейтральной последовательности, например, где общая длина полинуклеотида составляет от около 60 до около 300 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере один сегмент из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, вставлен в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного триггера. В другом варианте реализации изобретения, сегменты из нескольких последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, вставлены в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного триггера.
[0127] Предполагается, что комбинация некоторых рекомбинантных РНК, описанных в данном документе (например, дцРНК триггеров, содержащих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, или активные фрагменты этих триггеров), с одним или более полинуклеотидных пестицидных агентов приведет к синергетическому улучшению предотвращения и борьбы с заражениями насекомым, если сравнивать эффект, получаемый с помощью только одной рекомбинантной РНК или с только одним неполинуклеотидным пестицидным агентом. Рутинные биоанализы насекомого, такие как биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах, могут быть использованы для определения дозы-ответов для гибели личинок или ингибирования роста, используя комбинации из полинуклеотидов, описанных в данном документе, и одного или более неполинуклеотидиных пестицидных агентов (например, пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus). Специалист в данной области техники может тестировать комбинации полинуклеотидных и неполинуклеотидных пестицидных агентов в рутинных биоанализах для выявления комбинаций биоактивных веществ, которые являются синергичными и желательными для использования в защите растений от заражения насекомым.
Пример 5
[0128] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов тестирования эффективности дцРНК триггеров у блошек. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий пероральное введение дцРНК блошкам, в результате чего задерживается рост или наступает гибель блошек.
[0129] P. cruciferae были собраны с поля канолы, где никакие пестициды не применялась в предыдущие 3 месяца. Три гена (SEQ ID NO: 1169, 1193 и 1392) Phyllotreta, являющиеся мишенью, и одна дцРНК отрицательного контроля, являющиеся мишенью GFP, были протестированы в группах из 30 P. cruciferae. ДцРНК были ресуспендированы в воде и нанесены на 6 миллиметровые диски листа (55 ± 6 миллиграмм каждый) в дискриминирующей дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа, которые были даны с кормом группам из 5 блошек. Листовые диски со свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и количество выживших особей было зарегистрировано за 2-недельный период. Низкий показатель коэффициента неспецифической смертности наблюдался в группе отрицательного контроля насекомых (3 из 30 насекомых, умирающих за 2 недели, или 10% от неспецифической смертности). Гибель наблюдается в начале 4-го дня и продолжается в течение 2 недельного периода. Специфическая смертность наблюдалась для всех дцРНК обработок (Таблица 2). Корректируя неспецифическую смертность (вычитая коэффициент неспецифической смертности для 3 насекомых на группу для исправления N= 27), процент смертности, наблюдаемый в конце 2-недельного периода составил 85% (SEQ ID NO: 1169), 0,70% (SEQ ID NO: 1193) и 0,63% (SEQ ID NO: 1392). Эти результаты показали эффективность дцРНК триггеров для умерщвления блошек при предоставлении в рационе блошек.
Таблица 2: Совокупное число умерших P. cruciferae (N=30)
День | Отрицательный контроль | SEQ ID NO: 1169 | SEQ ID NO: 1193 | SEQ ID NO: 1392 |
0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
2 | 1 | 2 | 1 | 1 |
4 | 2 | 6 | 2 | 2 |
6 | 2 | 9 | 3 | 3 |
8 | 2 | 13 | 8 | 9 |
10 | 3 | 18 | 16 | 15 |
12 | 3 | 23 | 19 | 18 |
14 | 3 | 26 | 22 | 20 |
[0130] Во второй серии экспериментов, выполненных в подобной манере, несколько дцРНК триггеров были протестированы в дискриминирующей дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа на P. cruciferae; также были протестированы две меньшие дозы (15 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа и 2 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа). Десять блошек были протестированы на каждую дозу. Использованным отрицательным контролем (пять повторностей) был дцРНК триггер, нацеливающийся на бактериальный ген uidA, кодирующий бета-глюкуронидазу (номер доступа NCBI NC_000913.3). Листовые диски со свеженанесенной дцРНК меняли каждый день, и гибель была зафиксирована в течение 12-дневного периода. Общий коэффициент смертности для отрицательного контроля составил ~4% вероятно из-за манипуляционных повреждений) в течение 12-дневного периода наблюдения. Наблюдаемая кумулятивная смертность (N=10) после 12 дней воздействия дцРНК представлена в Таблице 3; значения отрицательного контроля смертности приведены как среднее (N=5). Восемь дцРНК триггеров (показаны с помощью рейтинга смертности +++) вызывали 90-100% смертность при самой высокой дозе и были все еще эффективны (80% смертность или выше) при самой низкой протестированной дозе. Некоторые дцРНК триггеры (показаны с помощью рейтинга смертности ++) вызывали смертность у части насекомых при самой высокой дозе, но были менее эффективны при более низких дозах (<20% смертности).
Таблица 3
кумулятивная смертность (N=10) | Оценка смертности* | |||
Триггер SEQ ID NO: | 50 нг/мг | 15 нг/мг | 2 нг/мг | |
870 | 3 | 1 | 0 | - |
876 | 3 | 1 | 0 | - |
1156 | 2 | 0 | 0 | - |
1157 | 10 | 3 | 0 | - |
1158 | 2 | 0 | 0 | - |
1159 | 5 | 2 | 0 | - |
1160 | 2 | 0 | 0 | - |
1161 | 10 | 3 | 1 | - |
1163 | 4 | 4 | 2 | - |
1164 | 10 | 8 | 4 | ++ |
1165 | 8 | 7 | 5 | ++ |
1166 | 5 | 2 | 2 | - |
1167 | 6 | 2 | 0 | - |
1168 | 8 | 5 | 0 | - |
1169 | 10 | 10 | 8 | +++ |
1170 | 9 | 5 | 3 | - |
1171 | 10 | 10 | 6 | ++ |
1392 | 3 | 2 | 0 | - |
1393 | 6 | 1 | 0 | - |
1186 | 9 | 7 | 5 | - |
1394 | 9 | 9 | 5 | - |
1187 | 9 | 9 | 8 | +++ |
1193 | 10 | 10 | 9 | +++ |
1210 | 6 | 3 | 1 | - |
1219 | 8 | 3 | 2 | - |
1224 | 10 | 9 | 8 | +++ |
1234 | 10 | 7 | 6 | ++ |
1243 | 5 | 2 | 0 | - |
1258 | 9 | 4 | 2 | - |
1396 | 9 | 6 | 5 | ++ |
1397 | 6 | 3 | 0 | - |
1398 | 8 | 7 | 7 | ++ |
1399 | 10 | 10 | 8 | +++ |
1400 | 2 | 1 | 1 | - |
1403 | 9 | 6 | 6 | - |
1404 | 10 | 7 | 4 | - |
1405 | 6 | 6 | 2 | - |
1406 | 9 | 9 | 7 | +++ |
1407 | 10 | 9 | 8 | +++ |
1408 | 9 | 9 | 9 | +++ |
отрицательный контроль (GFP) | 0,6 | 0,6 | 0,4 | - |
отрицательный контроль (бета-глюкуронидаза) | 0,4 | 0,6 | 0,2 | - |
отрицательный контроль (только вода) | 0,2 | 0,4 | 0,6 | - |
*+++ оценка указывает на высокую (>80%) смертность для всех трех доз; ++ оценка указывает на высокую смертность для самой высокой дозы, и в пределах от 40 дo 70% смертности с двумя низкими дозами.
[0131] Другие методы доставки этих или подобных дцРНК триггеров рассматриваются и включают нанесение дцРНК триггеров непосредственно на поверхность насекомых (например, с помощью распыления или опудривания), или предоставление дцРНК триггеров насекомому в рационе или наживке (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей дцРНК триггер, такой как дцРНК триггер формы шпилька, или в искусственной приманке, содержащей дцРНК). В варианте реализации изобретения, сконструирована версия триггера Phyllotreta формы шпилька с последовательностью SEQ ID NO: 1169; эта версия формы шпилька кодируется с помощью последовательности ДНК SEQ ID NO: 1722, которая содержит в 5ʹ дo 3ʹ порядке анти-смысловую последовательность (позиции нуклеотидов 1-267), последовательность петли (позиции нуклеотидов 268-373), которая не содержит совпадений с последовательностями Phyllotreta, и смысловую последовательность (позиции нуклеотидов 374-640). Эта последовательность ДНК экспрессируется как одноцепочечный РНК транскрипт, в котором анти-смысловые и смысловые участки отжигаются для формирования двухцепочечного участка ʺстебляʺ шпильки. Конструкт экпрессируется в бактерии, такой как E. coli; полученная дцРНК шпилька, произведенная в бактерии, предоставляется блошкам в виде неочищенного или очищенного продукта ферментации, или в форме бактериальных клеток. Подобные конструкты сконструированы кодирующими дцРНК, имеющими модифицированные стебель-петли, такие как ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ и ʺстабилизированные смысловыеʺ версии, которые содержат стабилизированные петли, образованные с помощью расширенной анти-смысловой или смысловой последовательности, соответственно, последовательность триггера, соответствующая предполагаемому гену-мишени.
Пример 6
[0132] Этот пример описывает варианты реализации изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность, содержащую определенные модификации, такие как нуклеотидные замены. Варианты реализации таких модификаций содержат модифицированные дцРНК триггеры, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию последовательности между предполагаемым геном-мишенью интересующего насекомого-вредителя и генетическими последовательностями других, не целевых видов.
[0133] Выбранные дцРНК триггеры, определенные в Таблице 1, подвергали скринингу на незапланированные совпадения последовательности с последовательностью из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов в не целевом гене или не целевом организме (НЦO, например, Apis mellifera, Bombus impatiens и B. terrestris; Coleomegilla spp.; Danaus plexippus; Homo sapiens; Megachile rotundata; Mus musculus; и Brassica rapa). Нуклеотидные изменения сделаны в исходной последовательности триггера для устранения нежелательных совпадений последовательности с не целевым геном или не целевым организмом. Примеры таких модифицированных последовательностей триггера предоставляются в SEQ ID NO: 1723, которая соответствует SEQ ID NO: 1393 (которая нацелена на тот же ген блошки, как и триггер SEQ ID NO: 1392) и SEQ ID NO: 1724, которая соответствует SEQ ID NO: 1169. Эти модифицированные последовательности триггера обеспечивают улучшенную дискриминацию между предполагаемым целевым видом и не целевым организмом.
Пример 7
[0134] Этот пример описывает варианты реализации изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность для подавления гена-мишени у более чем одного вида. Варианты реализации изобретения включают последовательности дцРНК из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов, определенных как имеющие 100% комплементарность или идентичность с более чем одним видоспецифическим геном-мишенью.
[0135] Таблица 3 содержит перечень последовательностей, каждая из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов в длину и определенных по координатам последовательности в дцРНК триггере для одного вида блошки, причем идентичная последовательность также находится в дцРНК триггере для разных видов блошек. Эти последовательности могут быть использованы в качестве триггеров у множества видов, у которых последовательности встречаются совместно. Например, триггер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1186 (нацеливающуюся на COPI альфа ген-мишень Phyllotreta cruciferae, SEQ ID NO: 327) содержит пять последовательностей из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов в позициях 1-71, 88-116, 136-209, 238-266 и 274-296, все из которых совпадают с последовательностью триггеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 882 и 888 (нацеливающиеся на COPI альфа гены-мишени Phyllotreta atra, SEQ ID NO: 23 и 29, соответственно); таким образом, эти пять последовательностей являются полезными в нацеливании на ген у двух видов рода Phyllotreta.
Таблица 3
Триггер ЗАПРОСА | Триггер СУБЪЕКТА | Триггер ЗАПРОСА | Триггер СУБЪЕКТА | |||||
SSEQ ID NO: | cтарт | кконец | SEQ ID NO: | SSEQ ID NO: | сстарт | конец | Триггер SEQ ID NO: | |
1186 | 1 | 71 | 882, 888 | 1333 | 329 | 351 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1186 | 88 | 116 | 882, 888 | 1334 | 42 | 98 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1186 | 136 | 209 | 882, 888 | 1334 | 109 | 185 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1186 | 238 | 266 | 882, 888 | 1334 | 187 | 254 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1186 | 274 | 296 | 882, 888 | 1334 | 271 | 302 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 51 | 96 | 900-908, 910 | 1335 | 2 | 47 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 137 | 177 | 900-908, 910 | 1335 | 49 | 116 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 179 | 216 | 900-908, 910 | 1335 | 133 | 164 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 218 | 255 | 900-908, 910 | 1335 | 229 | 251 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 257 | 342 | 900-908, 910 | 1336 | 34 | 90 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 2 | 25 | 900-908, 910 | 1336 | 101 | 177 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 66 | 106 | 900-908, 910 | 1336 | 179 | 246 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 108 | 145 | 900-908, 910 | 1336 | 263 | 294 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 147 | 184 | 900-908, 910 | 1338 | 40 | 96 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 186 | 271 | 900-908, 910 | 1338 | 107 | 183 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 273 | 298 | 900-908, 910 | 1338 | 185 | 252 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 300 | 330 | 900-908, 910 | 1338 | 269 | 300 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 58 | 96 | 900-908, 910 | 1328 | 35 | 59 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 300 | 336 | 900-908, 910 | 1331 | 60 | 84 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 44 | 96 | 900-908, 910 | 1332 | 1 | 26 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 179 | 200 | 900-908, 910 | 1333 | 36 | 60 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 108 | 129 | 900-908, 910 | 1334 | 74 | 98 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 218 | 242 | 900-908, 910 | 1336 | 66 | 90 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 147 | 171 | 900-908, 910 | 1338 | 72 | 96 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 257 | 277 | 900-908, 910 | 1331 | 1 | 26 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 186 | 206 | 900-908, 910 | 1334 | 2 | 40 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 257 | 334 | 900-908, 910 | 1336 | 2 | 32 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 186 | 263 | 900-908, 910 | 1338 | 2 | 38 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1191 | 257 | 320 | 900-908, 910 | 1328 | 36 | 59 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1192 | 186 | 249 | 900-908, 910 | 1331 | 61 | 84 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1193 | 15 | 101 | 911, 915, 916, 919 | 1332 | 3 | 26 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1194 | 6 | 92 | 911, 915, 916, 919 | 1333 | 37 | 60 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1195 | 2 | 107 | 911, 915, 916, 919 | 1334 | 75 | 98 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1195 | 121 | 207 | 911, 915, 916, 919 | 1336 | 67 | 90 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1196 | 2 | 122 | 911, 915, 916, 919 | 1338 | 73 | 96 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1196 | 136 | 222 | 911, 915, 916, 919 | 1329 | 172 | 191 | 1039-1043 1045 | |
1197 | 2 | 20 | 911, 915, 916, 919 | 1329 | 265 | 296 | 1039-1043 1045 | |
1197 | 22 | 42 | 911, 915, 916, 919 | 1329 | 298 | 317 | 1039-1043 1045 | |
1197 | 44 | 180 | 911, 915, 916, 919 | 1329 | 319 | 343 | 1039-1043 1045 | |
1197 | 194 | 280 | 911, 915, 916, 919 | 1330 | 181 | 200 | 1039-1043 1045 | |
1198 | 18 | 38 | 911, 915, 916, 919 | 1330 | 274 | 305 | 1039-1043 1045 | |
1198 | 40 | 176 | 911, 915, 916, 919 | 1330 | 307 | 326 | 1039-1043 1045 | |
1198 | 190 | 276 | 911, 915, 916, 919 | 1330 | 328 | 352 | 1039-1043 1045 | |
1199 | 5 | 25 | 911, 915, 916, 919 | 1335 | 283 | 302 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1199 | 27 | 163 | 911, 915, 916, 919 | 1337 | 1 | 19 | 1043, 1045 | |
1199 | 177 | 263 | 911, 915, 916, 919 | 1337 | 93 | 124 | 1043, 1045 | |
1200 | 16 | 152 | 911, 915, 916, 919 | 1337 | 126 | 145 | 1043, 1045 | |
1200 | 166 | 252 | 911, 915, 916, 919 | 1337 | 147 | 171 | 1043, 1045 | |
1201 | 19 | 105 | 911, 915, 916, 919 | 1329 | 319 | 352 | 1039-1043 1045 | |
1202 | 2 | 119 | 911, 915, 916, 919 | 1337 | 147 | 180 | 1043, 1045 | |
1202 | 133 | 219 | 911, 915, 916, 919 | 1386 | 2 | 38 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1203 | 14 | 100 | 911, 915, 916, 919 | 1386 | 40 | 59 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1193 | 123 | 189 | 911, 915, 916, 919 | 1386 | 70 | 95 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1194 | 114 | 180 | 911, 915, 916, 919 | 1386 | 103 | 161 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1195 | 229 | 295 | 911, 915, 916, 919 | 1386 | 196 | 262 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1196 | 244 | 310 | 911, 915, 916, 919 | 1388 | 2 | 51 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1197 | 302 | 350 | 911, 915, 916, 919 | 1388 | 53 | 72 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1198 | 298 | 350 | 911, 915, 916, 919 | 1388 | 83 | 108 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1199 | 285 | 352 | 911, 915, 916, 919 | 1388 | 116 | 174 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1200 | 274 | 340 | 911, 915, 916, 919 | 1388 | 209 | 275 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1201 | 127 | 193 | 911, 915, 916, 919 | 1390 | 88 | 119 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1202 | 241 | 307 | 911, 915, 916, 919 | 1390 | 145 | 194 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1203 | 122 | 188 | 911, 915, 916, 919 | 1390 | 196 | 215 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1193 | 123 | 196 | 911, 915, 916, 919 | 1390 | 226 | 251 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1193 | 198 | 230 | 911, 915, 916, 919 | 1390 | 259 | 317 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1194 | 114 | 187 | 911, 915, 916, 919 | 1391 | 19 | 50 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1194 | 189 | 221 | 911, 915, 916, 919 | 1391 | 76 | 125 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1195 | 229 | 302 | 911, 915, 916, 919 | 1391 | 127 | 146 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1195 | 304 | 336 | 911, 915, 916, 919 | 1391 | 157 | 182 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1196 | 1 | 122 | 911, 915, 916, 919 | 1391 | 190 | 248 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1196 | 244 | 317 | 911, 915, 916, 919 | 1391 | 283 | 349 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1196 | 319 | 351 | 911, 915, 916, 919 | 1384 | 20 | 39 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1197 | 60 | 180 | 911, 915, 916, 919 | 1384 | 62 | 84 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1198 | 56 | 176 | 911, 915, 916, 919 | 1384 | 134 | 204 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1199 | 43 | 163 | 911, 915, 916, 919 | 1384 | 206 | 249 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1199 | 285 | 351 | 911, 915, 916, 919 | 1384 | 251 | 270 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1200 | 32 | 152 | 911, 915, 916, 919 | 1384 | 284 | 305 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1200 | 274 | 347 | 911, 915, 916, 919 | 1385 | 21 | 40 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1201 | 127 | 200 | 911, 915, 916, 919 | 1385 | 63 | 85 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1201 | 202 | 234 | 911, 915, 916, 919 | 1385 | 135 | 205 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1202 | 241 | 314 | 911, 915, 916, 919 | 1385 | 207 | 250 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1202 | 316 | 348 | 911, 915, 916, 919 | 1385 | 252 | 271 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1203 | 122 | 195 | 911, 915, 916, 919 | 1385 | 285 | 306 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1203 | 197 | 229 | 911, 915, 916, 919 | 1387 | 2 | 21 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1204 | 6 | 25 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 23 | 42 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1204 | 27 | 49 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 56 | 77 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1204 | 51 | 118 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 1 | 55 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1204 | 186 | 214 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 57 | 100 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1204 | 219 | 268 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 102 | 121 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1204 | 270 | 295 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 135 | 156 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1204 | 306 | 351 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1386 | 196 | 255 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1205 | 180 | 199 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1388 | 209 | 268 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1205 | 201 | 223 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1391 | 283 | 342 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1205 | 225 | 292 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 257 | 321 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1206 | 10 | 29 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 332 | 351 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1206 | 31 | 53 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1390 | 25 | 56 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1206 | 55 | 122 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1384 | 284 | 321 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1206 | 190 | 218 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1385 | 285 | 322 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1206 | 223 | 272 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 56 | 93 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1206 | 274 | 299 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 135 | 172 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1206 | 310 | 351 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1386 | 196 | 332 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1207 | 11 | 33 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1388 | 209 | 345 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1207 | 35 | 102 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1391 | 283 | 352 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1207 | 170 | 198 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1384 | 323 | 348 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1207 | 203 | 252 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1385 | 324 | 349 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1207 | 254 | 279 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 95 | 120 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1207 | 290 | 335 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 128 | 153 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1208 | 18 | 40 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 161 | 186 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1208 | 42 | 109 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1387 | 191 | 210 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1208 | 177 | 205 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 174 | 199 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1208 | 210 | 259 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 207 | 232 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1208 | 261 | 286 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 240 | 265 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1208 | 297 | 342 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1389 | 270 | 289 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1209 | 101 | 120 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1283 | 177 | 208 | 1064-1070 | |
1209 | 122 | 144 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1284 | 130 | 161 | 1064-1070 | |
1209 | 146 | 213 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1284 | 301 | 351 | 1064-1070 | |
1209 | 281 | 309 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1286 | 210 | 241 | 1064-1070 | |
1209 | 314 | 351 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1287 | 126 | 157 | 1064-1070 | |
1205 | 2 | 91 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1287 | 297 | 351 | 1064-1070 | |
1205 | 114 | 142 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1288 | 326 | 351 | 1064-1070, 1071 | |
1205 | 144 | 178 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1289 | 41 | 72 | 1064-1070 | |
1209 | 35 | 63 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1289 | 212 | 288 | 1064-1070 | |
1209 | 65 | 99 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1289 | 320 | 351 | 1064-1070 | |
1204 | 306 | 347 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1290 | 178 | 209 | 1064-1070 | |
1207 | 290 | 331 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1291 | 228 | 259 | 1064-1070, 1071 | |
1208 | 297 | 338 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1292 | 43 | 74 | 1064-1070 | |
1207 | 290 | 352 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1292 | 214 | 290 | 1064-1070 | |
1208 | 297 | 351 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1292 | 322 | 351 | 1064-1070 | |
1205 | 18 | 91 | 920, 921, 922, 923, 924 | 1293 | 330 | 351 | 1064-1070, 1071 | |
1224 | 1 | 43 | 947-949, 951-956 | 1377 | 37 | 68 | 1064-1070 | |
1224 | 57 | 95 | 947-949, 951-956 | 1377 | 208 | 284 | 1064-1070 | |
1224 | 97 | 145 | 947-949, 951-956 | 1377 | 316 | 348 | 1064-1070 | |
1224 | 147 | 175 | 947-949, 951-956 | 1289 | 212 | 274 | 1064-1070 | |
1224 | 177 | 208 | 947-949, 951-956 | 1292 | 214 | 276 | 1064-1070 | |
1224 | 210 | 262 | 947-949, 951-956 | 1377 | 208 | 270 | 1064-1070 | |
1224 | 285 | 350 | 947-949, 951-956 | 1285 | 123 | 148 | 1067, 1069, 1071 | |
1225 | 150 | 192 | 947, 949, 951-956 | 1288 | 107 | 132 | 1064-1070, 1071 | |
1225 | 206 | 244 | 947, 949, 951-956 | 1291 | 9 | 34 | 1064-1070, 1071 | |
1225 | 246 | 294 | 947, 949, 951-956 | 1293 | 111 | 136 | 1064-1070, 1071 | |
1225 | 296 | 324 | 947, 949, 951-956 | 1287 | 297 | 347 | 1064-1070 | |
1225 | 326 | 351 | 947, 949, 951-956 | 1289 | 212 | 262 | 1064-1070 | |
1226 | 258 | 300 | 947, 949, 951-955 | 1292 | 214 | 264 | 1064-1070 | |
1226 | 314 | 351 | 947, 949, 951-955 | 1377 | 208 | 258 | 1064-1070 | |
1227 | 253 | 295 | 947, 949, 951-955 | 1287 | 297 | 352 | 1064-1070 | |
1227 | 309 | 347 | 947, 949, 951-955 | 1289 | 212 | 266 | 1064-1070 | |
1228 | 206 | 248 | 947, 949, 951-956 | 1292 | 214 | 268 | 1064-1070 | |
1228 | 262 | 300 | 947, 949, 951-956 | 1377 | 208 | 262 | 1064-1070 | |
1228 | 302 | 350 | 947, 949, 951-956 | 1285 | 18 | 61 | 1067, 1069, 1071 | |
1229 | 171 | 213 | 947, 949, 951-956 | 1288 | 2 | 45 | 1064-1070, 1071 | |
1229 | 227 | 265 | 947, 949, 951-956 | 1293 | 6 | 49 | 1064-1070, 1071 | |
1229 | 267 | 315 | 947, 949, 951-956 | 1357 | 1 | 40 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1229 | 317 | 345 | 947, 949, 951-956 | 1357 | 63 | 85 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1230 | 252 | 294 | 947, 949, 951-955 | 1357 | 102 | 157 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1230 | 308 | 346 | 947, 949, 951-955 | 1357 | 159 | 189 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1231 | 191 | 233 | 947, 949, 951-956 | 1357 | 191 | 322 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1231 | 247 | 285 | 947, 949, 951-956 | 1358 | 25 | 47 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1231 | 287 | 335 | 947, 949, 951-956 | 1358 | 64 | 119 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1232 | 196 | 238 | 947, 949, 951-956 | 1358 | 121 | 151 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1232 | 252 | 290 | 947, 949, 951-956 | 1358 | 153 | 284 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1232 | 292 | 340 | 947, 949, 951-956 | 1359 | 31 | 53 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1233 | 209 | 251 | 947, 949, 951-956 | 1359 | 70 | 125 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1233 | 265 | 303 | 947, 949, 951-956 | 1359 | 127 | 157 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1233 | 305 | 351 | 947, 949, 951-956 | 1359 | 159 | 290 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1224 | 177 | 202 | 947-949, 951-956 | 1360 | 38 | 60 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1225 | 1 | 72 | 947, 949, 951-956 | 1360 | 77 | 132 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1225 | 74 | 135 | 947, 949, 951-956 | 1360 | 134 | 164 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1225 | 137 | 192 | 947, 949, 951-956 | 1360 | 166 | 297 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1226 | 110 | 180 | 947, 949, 951-955 | 1361 | 1 | 41 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1226 | 182 | 243 | 947, 949, 951-955 | 1361 | 64 | 86 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1226 | 245 | 300 | 947, 949, 951-955 | 1361 | 103 | 158 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1227 | 105 | 175 | 947, 949, 951-955 | 1361 | 160 | 190 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1227 | 177 | 238 | 947, 949, 951-955 | 1361 | 192 | 323 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1227 | 240 | 295 | 947, 949, 951-955 | 1362 | 31 | 53 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1228 | 58 | 128 | 947, 949, 951-956 | 1362 | 70 | 125 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1228 | 130 | 191 | 947, 949, 951-956 | 1362 | 127 | 157 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1228 | 193 | 248 | 947, 949, 951-956 | 1362 | 159 | 290 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1229 | 23 | 93 | 947, 949, 951-956 | 1363 | 33 | 55 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1229 | 95 | 156 | 947, 949, 951-956 | 1363 | 72 | 127 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1229 | 158 | 213 | 947, 949, 951-956 | 1363 | 129 | 159 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1230 | 104 | 174 | 947, 949, 951-955 | 1363 | 161 | 292 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1230 | 176 | 237 | 947, 949, 951-955 | 1364 | 4 | 59 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1230 | 239 | 294 | 947, 949, 951-955 | 1364 | 61 | 91 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1231 | 43 | 113 | 947, 949, 951-956 | 1364 | 93 | 224 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1231 | 115 | 176 | 947, 949, 951-956 | 1365 | 35 | 57 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1231 | 178 | 233 | 947, 949, 951-956 | 1365 | 74 | 129 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1232 | 48 | 118 | 947, 949, 951-956 | 1365 | 131 | 161 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1232 | 120 | 181 | 947, 949, 951-956 | 1365 | 163 | 294 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1232 | 183 | 238 | 947, 949, 951-956 | 1366 | 2 | 26 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1233 | 61 | 131 | 947, 949, 951-956 | 1366 | 28 | 58 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1233 | 133 | 194 | 947, 949, 951-956 | 1366 | 60 | 191 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1233 | 196 | 251 | 947, 949, 951-956 | 1367 | 2 | 116 | 1079, 1080, 1081, 1082, 1152, 1153, 1154 | |
1224 | 227 | 262 | 947-949, 951-956 | 1358 | 322 | 345 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1224 | 57 | 94 | 947-949, 951-956 | 1359 | 328 | 350 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1225 | 2 | 72 | 947, 949, 951-956 | 1362 | 328 | 351 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1225 | 206 | 243 | 947, 949, 951-956 | 1363 | 330 | 352 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1226 | 1 | 96 | 947, 949, 951-955 | 1364 | 262 | 285 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1226 | 98 | 180 | 947, 949, 951-955 | 1365 | 332 | 351 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1227 | 2 | 91 | 947, 949, 951-955 | 1366 | 229 | 252 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1227 | 93 | 175 | 947, 949, 951-955 | 1367 | 154 | 177 | 1079-1082, 1152-1154 | |
1227 | 309 | 346 | 947, 949, 951-955 | 1358 | 322 | 344 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1228 | 2 | 44 | 947, 949, 951-956 | 1362 | 328 | 350 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1228 | 46 | 128 | 947, 949, 951-956 | 1364 | 262 | 284 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1228 | 262 | 299 | 947, 949, 951-956 | 1366 | 229 | 251 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1229 | 11 | 93 | 947, 949, 951-956 | 1367 | 154 | 176 | 1079-1082, 1152-1154 | |
1229 | 227 | 264 | 947, 949, 951-956 | 1368 | 126 | 145 | 1083, 1087 | |
1230 | 2 | 90 | 947, 949, 951-955 | 1368 | 153 | 177 | 1083, 1087 | |
1230 | 92 | 174 | 947, 949, 951-955 | 1368 | 186 | 208 | 1083, 1087 | |
1230 | 308 | 345 | 947, 949, 951-955 | 1368 | 224 | 253 | 1083, 1087 | |
1231 | 2 | 29 | 947, 949, 951-956 | 1369 | 161 | 180 | 1083, 1084, 1089 | |
1231 | 31 | 113 | 947, 949, 951-956 | 1370 | 124 | 143 | 1083, 1087 | |
1231 | 247 | 284 | 947, 949, 951-956 | 1370 | 151 | 175 | 1083, 1087 | |
1232 | 2 | 34 | 947, 949, 951-956 | 1370 | 184 | 206 | 1083, 1087 | |
1232 | 36 | 118 | 947, 949, 951-956 | 1370 | 222 | 251 | 1083, 1087 | |
1232 | 252 | 289 | 947, 949, 951-956 | 1369 | 278 | 303 | 1083, 1084, 1089 | |
1233 | 2 | 47 | 947, 949, 951-956 | 1369 | 182 | 201 | 1083, 1084, 1089 | |
1233 | 49 | 131 | 947, 949, 951-956 | 1371 | 1 | 71 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1233 | 265 | 302 | 947, 949, 951-956 | 1371 | 82 | 122 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1226 | 7 | 96 | 947, 949, 951-955 | 1371 | 124 | 180 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1227 | 1 | 91 | 947, 949, 951-955 | 1371 | 182 | 244 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1226 | 8 | 96 | 947, 949, 951-955 | 1372 | 16 | 56 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1227 | 3 | 91 | 947, 949, 951-955 | 1372 | 58 | 114 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1230 | 1 | 90 | 947, 949, 951-955 | 1372 | 116 | 178 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1226 | 54 | 96 | 947, 949, 951-955 | 1373 | 2 | 61 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1227 | 49 | 91 | 947, 949, 951-955 | 1373 | 72 | 112 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1228 | 1 | 44 | 947, 949, 951-956 | 1373 | 114 | 170 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1230 | 48 | 90 | 947, 949, 951-955 | 1373 | 172 | 234 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1233 | 5 | 47 | 947, 949, 951-956 | 1374 | 1 | 68 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1224 | 125 | 145 | 947-949, 951-956 | 1374 | 79 | 119 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1225 | 274 | 294 | 947, 949, 951-956 | 1374 | 121 | 177 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1228 | 330 | 350 | 947, 949, 951-956 | 1374 | 179 | 241 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1229 | 295 | 315 | 947, 949, 951-956 | 1375 | 2 | 41 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1231 | 315 | 335 | 947, 949, 951-956 | 1375 | 52 | 92 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1232 | 320 | 340 | 947, 949, 951-956 | 1375 | 94 | 150 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1233 | 333 | 351 | 947, 949, 951-956 | 1375 | 152 | 214 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1234 | 50 | 135 | 960, 964 | 1376 | 7 | 47 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1234 | 149 | 168 | 960, 964 | 1376 | 49 | 105 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1234 | 170 | 350 | 960, 964 | 1376 | 107 | 169 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 175 | 260 | 960, 963, 964 | 1371 | 124 | 148 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 274 | 293 | 960, 963, 964 | 1372 | 58 | 82 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 295 | 351 | 960, 963, 964 | 1373 | 114 | 138 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 190 | 275 | 960, 963, 964 | 1374 | 121 | 145 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 289 | 308 | 960, 963, 964 | 1375 | 94 | 118 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 310 | 351 | 960, 963, 964 | 1376 | 49 | 73 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 269 | 350 | 960, 963, 964 | 1371 | 182 | 276 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1238 | 51 | 136 | 960, 964 | 1371 | 278 | 333 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1238 | 150 | 169 | 960, 964 | 1372 | 116 | 210 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1238 | 171 | 350 | 960, 964 | 1372 | 212 | 267 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1239 | 50 | 135 | 960, 964 | 1372 | 269 | 309 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1239 | 149 | 168 | 960, 964 | 1372 | 311 | 352 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1239 | 170 | 351 | 960, 964 | 1373 | 172 | 266 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 103 | 188 | 960, 963, 964 | 1373 | 268 | 323 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 202 | 221 | 960, 963, 964 | 1373 | 325 | 351 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 223 | 351 | 960, 963, 964 | 1374 | 179 | 273 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1241 | 269 | 351 | 960, 963, 964 | 1374 | 275 | 330 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1242 | 87 | 172 | 960, 963, 964 | 1374 | 332 | 351 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1242 | 186 | 205 | 960, 963, 964 | 1375 | 152 | 246 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1242 | 207 | 351 | 960, 963, 964 | 1375 | 248 | 303 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 2 | 23 | 960, 963, 964 | 1375 | 305 | 345 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 25 | 114 | 960, 963, 964 | 1376 | 107 | 201 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 2 | 38 | 960, 963, 964 | 1376 | 203 | 258 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 40 | 129 | 960, 963, 964 | 1376 | 260 | 300 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 2 | 39 | 960, 963, 964 | 1376 | 302 | 342 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 41 | 117 | 960, 963, 964 | 1371 | 278 | 303 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 119 | 208 | 960, 963, 964 | 1372 | 212 | 237 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 2 | 42 | 960, 963, 964 | 1373 | 268 | 293 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1241 | 2 | 39 | 960, 963, 964 | 1374 | 275 | 300 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1241 | 41 | 117 | 960, 963, 964 | 1375 | 248 | 273 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1241 | 119 | 208 | 960, 963, 964 | 1376 | 203 | 228 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1242 | 2 | 26 | 960, 963, 964 | 1371 | 124 | 155 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1234 | 38 | 135 | 960, 964 | 1372 | 58 | 89 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1234 | 170 | 211 | 960, 964 | 1373 | 114 | 145 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 25 | 136 | 960, 963, 964 | 1374 | 121 | 152 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 163 | 260 | 960, 963, 964 | 1375 | 94 | 125 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1235 | 295 | 336 | 960, 963, 964 | 1376 | 49 | 80 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 1 | 38 | 960, 963, 964 | 1371 | 182 | 241 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 40 | 151 | 960, 963, 964 | 1372 | 116 | 175 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1236 | 178 | 275 | 960, 963, 964 | 1373 | 172 | 231 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 81 | 117 | 960, 963, 964 | 1374 | 179 | 238 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 119 | 230 | 960, 963, 964 | 1375 | 152 | 211 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1237 | 257 | 350 | 960, 963, 964 | 1376 | 107 | 166 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1238 | 39 | 136 | 960, 964 | 1371 | 278 | 325 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1238 | 171 | 212 | 960, 964 | 1372 | 212 | 259 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1239 | 38 | 135 | 960, 964 | 1373 | 268 | 315 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1239 | 170 | 211 | 960, 964 | 1374 | 275 | 322 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 2 | 64 | 960, 963, 964 | 1375 | 248 | 295 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 91 | 188 | 960, 963, 964 | 1376 | 203 | 250 | 1093-1095, 1098, 1100 -1103 | |
1240 | 223 | 264 | 960, 963, 964 | 1309 | 1 | 69 | 1114, 1115 | |
1241 | 81 | 117 | 960, 963, 964 | 1309 | 71 | 96 | 1114, 1115 | |
1241 | 119 | 230 | 960, 963, 964 | 1309 | 98 | 144 | 1114, 1115 | |
1241 | 257 | 351 | 960, 963, 964 | 1309 | 152 | 195 | 1114, 1115 | |
1242 | 2 | 48 | 960, 963, 964 | 1309 | 197 | 237 | 1114, 1115 | |
1242 | 75 | 172 | 960, 963, 964 | 1309 | 254 | 352 | 1114, 1115 | |
1242 | 207 | 248 | 960, 963, 964 | 1310 | 25 | 92 | 1114, 1115 | |
1243 | 118 | 158 | 965, 966, 968, 969 | 1310 | 94 | 119 | 1114, 1115 | |
1243 | 283 | 304 | 965, 966, 968, 969 | 1310 | 121 | 167 | 1114, 1115 | |
1243 | 310 | 348 | 965, 966, 968, 969 | 1310 | 175 | 218 | 1114, 1115 | |
1244 | 165 | 205 | 965, 966, 968, 969 | 1310 | 220 | 260 | 1114, 1115 | |
1244 | 330 | 351 | 965, 966, 968, 969 | 1310 | 277 | 351 | 1114, 1115 | |
1246 | 205 | 245 | 965, 966, 967, 968, 969 | 1311 | 7 | 74 | 1114, 1115 | |
1247 | 206 | 246 | 965, 966, 967, 968, 969 | 1311 | 76 | 101 | 1114, 1115 | |
1248 | 163 | 203 | 965, 966, 968, 969 | 1311 | 103 | 149 | 1114, 1115 | |
1248 | 328 | 349 | 965, 966, 968, 969 | 1311 | 157 | 200 | 1114, 1115 | |
1245 | 1 | 20 | 967 | 1311 | 202 | 242 | 1114, 1115 | |
1245 | 22 | 42 | 967 | 1311 | 259 | 351 | 1114, 1115 | |
1245 | 104 | 135 | 967 | 1312 | 9 | 76 | 1114, 1115 | |
1245 | 137 | 155 | 967 | 1312 | 78 | 103 | 1114, 1115 | |
1245 | 187 | 209 | 967 | 1312 | 105 | 151 | 1114, 1115 | |
1246 | 36 | 58 | 965, 966, 967, 968, 969 | 1312 | 159 | 202 | 1114, 1115 | |
1247 | 37 | 59 | 965, 966, 967, 968, 969 | 1312 | 204 | 244 | 1114, 1115 | |
1244 | 330 | 352 | 965, 966, 968, 969 | 1312 | 261 | 352 | 1114, 1115 | |
1249 | 2 | 20 | 970, 973, 974, 978, 979 | 1309 | 2 | 69 | 1114, 1115 | |
1250 | 5 | 84 | 969-971, 973-979 | 1309 | 254 | 327 | 1114, 1115 | |
1250 | 86 | 270 | 969-971, 973-979 | 1310 | 22 | 92 | 1114, 1115 | |
1250 | 278 | 306 | 969-971, 973-979 | 1310 | 277 | 350 | 1114, 1115 | |
1250 | 326 | 351 | 969-971, 973-979 | 1311 | 4 | 74 | 1114, 1115 | |
1251 | 2 | 52 | 969-971, 973-979 | 1311 | 259 | 332 | 1114, 1115 | |
1251 | 54 | 238 | 969-971, 973-979 | 1312 | 6 | 76 | 1114, 1115 | |
1251 | 246 | 274 | 969-971, 973-979 | 1312 | 261 | 334 | 1114, 1115 | |
1251 | 294 | 322 | 969-971, 973-979 | 1315 | 56 | 87 | 1117, 1119-1125 | |
1253 | 115 | 194 | 969-971, 973-979 | 1315 | 91 | 114 | 1117, 1119-1125 | |
1253 | 196 | 351 | 969-971, 973-979 | 1315 | 116 | 144 | 1117, 1119-1125 | |
1254 | 3 | 31 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1315 | 146 | 171 | 1117, 1119-1125 | |
1254 | 51 | 79 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1315 | 185 | 225 | 1117, 1119-1125 | |
1255 | 282 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1315 | 275 | 294 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 1 | 53 | 970, 971, 973-978 | 1315 | 317 | 342 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 55 | 239 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 22 | 45 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 247 | 275 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 47 | 75 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 295 | 323 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 77 | 102 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 6 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 116 | 156 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 87 | 271 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 206 | 225 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 279 | 307 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 248 | 273 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 327 | 351 | 970, 971, 973-978 | 1316 | 275 | 317 | 1117, 1119-1125 | |
1250 | 1 | 84 | 969-971, 973-979 | 1318 | 144 | 175 | 1117, 1119-1125 | |
1250 | 326 | 352 | 969-971, 973-979 | 1318 | 179 | 202 | 1117, 1119-1125 | |
1251 | 294 | 319 | 969-971, 973-979 | 1318 | 204 | 232 | 1117, 1119-1125 | |
1253 | 112 | 194 | 969-971, 973-979 | 1318 | 234 | 259 | 1117, 1119-1125 | |
1254 | 51 | 76 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1318 | 273 | 313 | 1117, 1119-1125 | |
1255 | 279 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1319 | 2 | 20 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 295 | 320 | 970, 971, 973-978 | 1319 | 24 | 47 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 3 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1319 | 49 | 77 | 1117, 1119-1125 | |
1252 | 31 | 89 | 972 | 1319 | 79 | 104 | 1117, 1119-1125 | |
1252 | 91 | 236 | 972 | 1319 | 118 | 158 | 1117, 1119-1125 | |
1252 | 238 | 266 | 972 | 1319 | 208 | 227 | 1117, 1119-1125 | |
1252 | 277 | 337 | 972 | 1319 | 250 | 275 | 1117, 1119-1125 | |
1249 | 2 | 23 | 970, 973, 974, 978, 979 | 1319 | 277 | 319 | 1117, 1119-1125 | |
1249 | 25 | 44 | 970, 973, 974, 978, 979 | 1313 | 17 | 81 | 1118, 1125 | |
1250 | 34 | 84 | 969-971, 973-979 | 1313 | 92 | 117 | 1118, 1125 | |
1251 | 1 | 52 | 969-971, 973-979 | 1313 | 137 | 204 | 1118, 1125 | |
1251 | 294 | 325 | 969-971, 973-979 | 1313 | 215 | 240 | 1118, 1125 | |
1251 | 327 | 346 | 969-971, 973-979 | 1313 | 242 | 291 | 1118, 1125 | |
1253 | 144 | 194 | 969-971, 973-979 | 1313 | 293 | 329 | 1118, 1125 | |
1254 | 51 | 82 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1314 | 22 | 89 | 1118-1125 | |
1254 | 84 | 103 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1314 | 100 | 125 | 1118-1125 | |
1255 | 311 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1314 | 127 | 176 | 1118-1125 | |
1256 | 3 | 53 | 970, 971, 973-978 | 1314 | 178 | 214 | 1118-1125 | |
1256 | 295 | 326 | 970, 971, 973-978 | 1317 | 25 | 92 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1256 | 328 | 347 | 970, 971, 973-978 | 1317 | 103 | 128 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1257 | 35 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1317 | 130 | 179 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1250 | 47 | 84 | 969-971, 973-979 | 1317 | 181 | 217 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1251 | 15 | 52 | 969-971, 973-979 | 1314 | 332 | 351 | 1118-1125 | |
1253 | 157 | 194 | 969-971, 973-979 | 1315 | 27 | 51 | 1117, 1119-1125 | |
1255 | 324 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1316 | 275 | 306 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 16 | 53 | 970, 971, 973-978 | 1318 | 115 | 139 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 48 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1319 | 277 | 308 | 1117, 1119-1125 | |
1250 | 2 | 84 | 969-971, 973-979 | 1314 | 330 | 351 | 1118-1125 | |
1250 | 86 | 241 | 969-971, 973-979 | 1315 | 25 | 51 | 1117, 1119-1125 | |
1251 | 54 | 209 | 969-971, 973-979 | 1316 | 275 | 303 | 1117, 1119-1125 | |
1253 | 1 | 68 | 969-971, 973-979 | 1317 | 333 | 351 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1253 | 91 | 194 | 969-971, 973-979 | 1318 | 113 | 139 | 1117, 1119-1125 | |
1253 | 196 | 352 | 969-971, 973-979 | 1319 | 277 | 305 | 1117, 1119-1125 | |
1255 | 169 | 235 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1314 | 262 | 293 | 1118-1125 | |
1255 | 258 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1314 | 295 | 314 | 1118-1125 | |
1256 | 55 | 210 | 970, 971, 973-978 | 1314 | 316 | 351 | 1118-1125 | |
1257 | 1 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1315 | 11 | 51 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 87 | 242 | 970, 971, 973-978 | 1317 | 265 | 296 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1250 | 86 | 110 | 969-971, 973-979 | 1317 | 298 | 317 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1251 | 54 | 78 | 969-971, 973-979 | 1317 | 319 | 351 | 1118, 1120-1122, 1124, 1125 | |
1253 | 2 | 68 | 969-971, 973-979 | 1318 | 45 | 76 | 1117, 1119-1125 | |
1253 | 196 | 220 | 969-971, 973-979 | 1318 | 78 | 97 | 1117, 1119-1125 | |
1255 | 39 | 130 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1318 | 99 | 139 | 1117, 1119-1125 | |
1255 | 132 | 235 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1316 | 275 | 324 | 1117, 1119-1125 | |
1256 | 55 | 79 | 970, 971, 973-978 | 1319 | 277 | 326 | 1117, 1119-1125 | |
1257 | 87 | 111 | 970, 971, 973-978 | 1299 | 50 | 96 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1250 | 326 | 350 | 969-971, 973-979 | 1300 | 2 | 43 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1251 | 294 | 318 | 969-971, 973-979 | 1300 | 66 | 112 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1253 | 110 | 194 | 969-971, 973-979 | 1300 | 123 | 154 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1254 | 51 | 75 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1300 | 183 | 211 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1255 | 277 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1300 | 213 | 232 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1256 | 295 | 319 | 970, 971, 973-978 | 1300 | 264 | 310 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1257 | 327 | 352 | 970, 971, 973-978 | 1301 | 1 | 35 | 1126-1131 | |
1250 | 32 | 84 | 969-971, 973-979 | 1301 | 37 | 84 | 1126-1131 | |
1253 | 142 | 194 | 969-971, 973-979 | 1301 | 107 | 153 | 1126-1131 | |
1255 | 309 | 352 | 970, 971, 973-978, 1626, 1629 | 1301 | 164 | 195 | 1126-1131 | |
1257 | 33 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1301 | 224 | 252 | 1126-1131 | |
1249 | 46 | 68 | 970, 973, 974, 978, 979 | 1301 | 254 | 273 | 1126-1131 | |
1250 | 61 | 84 | 969-971, 973-979 | 1301 | 305 | 351 | 1126-1131 | |
1251 | 29 | 52 | 969-971, 973-979 | 1302 | 26 | 54 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1253 | 171 | 194 | 969-971, 973-979 | 1302 | 56 | 75 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1254 | 105 | 127 | 970, 971, 973, 974, 977-979 | 1302 | 107 | 153 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1256 | 30 | 53 | 970, 971, 973-978 | 1303 | 11 | 39 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1257 | 62 | 85 | 970, 971, 973-978 | 1303 | 41 | 60 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1259 | 192 | 226 | 999-1004 | 1303 | 92 | 138 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1259 | 249 | 298 | 999-1004 | 1299 | 50 | 114 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1259 | 321 | 352 | 999-1004 | 1299 | 131 | 162 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1260 | 190 | 224 | 999-1004 | 1299 | 215 | 236 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1260 | 247 | 296 | 999-1004 | 1299 | 248 | 270 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1260 | 319 | 351 | 999-1004 | 1299 | 272 | 309 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1261 | 99 | 133 | 999-1004 | 1300 | 264 | 328 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1261 | 156 | 205 | 999-1004 | 1302 | 107 | 171 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1261 | 228 | 289 | 999-1004 | 1302 | 188 | 219 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1261 | 300 | 334 | 999-1004 | 1302 | 272 | 293 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1262 | 82 | 116 | 999-1004 | 1302 | 305 | 327 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1262 | 139 | 188 | 999-1004 | 1302 | 329 | 351 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1262 | 211 | 272 | 999-1004 | 1303 | 92 | 156 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1262 | 283 | 317 | 999-1004 | 1303 | 173 | 204 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1262 | 319 | 350 | 999-1004 | 1303 | 257 | 278 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1263 | 324 | 351 | 999-1004 | 1303 | 290 | 312 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1264 | 191 | 225 | 999-1004 | 1303 | 314 | 351 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1264 | 248 | 297 | 999-1004 | 1299 | 272 | 352 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1264 | 320 | 351 | 999-1004 | 1299 | 272 | 344 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1265 | 98 | 132 | 999-1004 | 1299 | 272 | 318 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1265 | 155 | 204 | 999-1004 | 1299 | 272 | 310 | 1126-1131, 1651-1653 | |
1265 | 227 | 288 | 999-1004 | 1304 | 2 | 25 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1265 | 299 | 333 | 999-1004 | 1304 | 36 | 169 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 95 | 145 | 999-1004 | 1304 | 186 | 214 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 165 | 226 | 999-1004 | 1304 | 231 | 250 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 93 | 143 | 999-1004 | 1304 | 264 | 307 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 163 | 224 | 999-1004 | 1306 | 2 | 70 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1261 | 1 | 52 | 999-1004 | 1306 | 87 | 115 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1261 | 72 | 133 | 999-1004 | 1306 | 132 | 151 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1262 | 1 | 35 | 999-1004 | 1306 | 165 | 208 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1262 | 55 | 116 | 999-1004 | 1307 | 1 | 27 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1263 | 227 | 277 | 999-1004 | 1307 | 29 | 69 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1263 | 297 | 351 | 999-1004 | 1307 | 80 | 213 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1264 | 94 | 144 | 999-1004 | 1307 | 230 | 258 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1264 | 164 | 225 | 999-1004 | 1307 | 275 | 294 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1265 | 2 | 51 | 999-1004 | 1307 | 308 | 351 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1265 | 71 | 132 | 999-1004 | 1308 | 2 | 33 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 15 | 40 | 999-1004 | 1308 | 44 | 177 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 42 | 64 | 999-1004 | 1308 | 194 | 222 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 66 | 88 | 999-1004 | 1308 | 239 | 258 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 90 | 145 | 999-1004 | 1308 | 272 | 315 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 165 | 219 | 999-1004 | 1347 | 2 | 28 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 13 | 38 | 999-1004 | 1347 | 39 | 172 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 40 | 62 | 999-1004 | 1347 | 189 | 217 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 64 | 86 | 999-1004 | 1347 | 234 | 253 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 88 | 143 | 999-1004 | 1347 | 267 | 310 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 163 | 217 | 999-1004 | 1305 | 1 | 133 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1261 | 2 | 52 | 999-1004 | 1305 | 135 | 154 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1261 | 72 | 126 | 999-1004 | 1305 | 156 | 178 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1262 | 55 | 109 | 999-1004 | 1305 | 195 | 280 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 1 | 60 | 999-1004 | 1305 | 330 | 351 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 105 | 127 | 999-1004 | 1344 | 13 | 35 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 147 | 172 | 999-1004 | 1344 | 52 | 137 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 174 | 196 | 999-1004 | 1344 | 187 | 208 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 198 | 220 | 999-1004 | 1345 | 50 | 181 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 222 | 277 | 999-1004 | 1345 | 183 | 202 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 297 | 352 | 999-1004 | 1345 | 204 | 226 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1264 | 14 | 39 | 999-1004 | 1345 | 243 | 328 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1264 | 41 | 63 | 999-1004 | 1346 | 2 | 81 | 1133, 1137, 1138 | |
1264 | 65 | 87 | 999-1004 | 1346 | 131 | 152 | 1133, 1137, 1138 | |
1264 | 89 | 144 | 999-1004 | 1304 | 1 | 25 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1264 | 164 | 218 | 999-1004 | 1304 | 264 | 334 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1265 | 71 | 125 | 999-1004 | 1306 | 165 | 235 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 190 | 226 | 999-1004 | 1307 | 46 | 69 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 188 | 224 | 999-1004 | 1308 | 10 | 33 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1261 | 97 | 133 | 999-1004 | 1308 | 272 | 342 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1262 | 80 | 116 | 999-1004 | 1347 | 5 | 28 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1263 | 322 | 351 | 999-1004 | 1347 | 267 | 337 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1264 | 189 | 225 | 999-1004 | 1304 | 101 | 169 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1265 | 96 | 132 | 999-1004 | 1306 | 1 | 70 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 96 | 145 | 999-1004 | 1306 | 237 | 310 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 94 | 143 | 999-1004 | 1306 | 312 | 352 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1261 | 3 | 52 | 999-1004 | 1307 | 145 | 213 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1263 | 228 | 277 | 999-1004 | 1308 | 109 | 177 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1264 | 95 | 144 | 999-1004 | 1347 | 104 | 172 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1265 | 1 | 51 | 999-1004 | 1307 | 38 | 69 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1259 | 165 | 218 | 999-1004 | 1308 | 1 | 33 | 1132, 1134, 1135, 1136 | |
1260 | 163 | 216 | 999-1004 | 1344 | 187 | 239 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1261 | 72 | 125 | 999-1004 | 1344 | 241 | 272 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1262 | 55 | 108 | 999-1004 | 1344 | 286 | 308 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 2 | 60 | 999-1004 | 1344 | 310 | 329 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1263 | 297 | 350 | 999-1004 | 1346 | 131 | 183 | 1133, 1137, 1138 | |
1264 | 164 | 217 | 999-1004 | 1346 | 185 | 216 | 1133, 1137, 1138 | |
1265 | 71 | 124 | 999-1004 | 1346 | 230 | 252 | 1133, 1137, 1138 | |
1266 | 2 | 39 | 1016-1023 | 1346 | 254 | 273 | 1133, 1137, 1138 | |
1266 | 41 | 87 | 1016-1023 | 1305 | 227 | 280 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1266 | 89 | 129 | 1016-1023 | 1344 | 84 | 137 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1267 | 2 | 74 | 1016-1023 | 1345 | 275 | 328 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1267 | 76 | 122 | 1016-1023 | 1346 | 28 | 81 | 1133, 1137, 1138 | |
1267 | 124 | 164 | 1016-1023 | 1346 | 290 | 351 | 1133, 1137, 1138 | |
1268 | 2 | 53 | 1016-1023 | 1348 | 44 | 66 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1268 | 55 | 101 | 1016-1023 | 1348 | 104 | 129 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1268 | 103 | 143 | 1016-1023 | 1348 | 131 | 156 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1269 | 2 | 72 | 1016-1023 | 1348 | 158 | 195 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1269 | 74 | 120 | 1016-1023 | 1348 | 167 | 189 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1269 | 122 | 162 | 1016-1023 | 1348 | 197 | 237 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1270 | 2 | 107 | 1016-1023 | 1348 | 215 | 234 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1270 | 109 | 155 | 1016-1023 | 1348 | 4 | 49 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1270 | 157 | 197 | 1016-1023 | 1348 | 4 | 74 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1271 | 2 | 62 | 1016-1023 | 1348 | 4 | 85 | 1139, 1140, 1141, 1142 | |
1271 | 64 | 110 | 1016-1023 | 1349 | 19 | 90 | 1143 | |
1271 | 112 | 152 | 1016-1023 | 1349 | 146 | 207 | 1143 | |
1266 | 131 | 177 | 1016-1023 | 1349 | 209 | 256 | 1143 | |
1266 | 179 | 207 | 1016-1023 | 1350 | 32 | 51 | 1144-1151, 1703 | |
1266 | 209 | 243 | 1016-1023 | 1350 | 71 | 90 | 1144-1151, 1703 | |
1267 | 166 | 212 | 1016-1023 | 1351 | 118 | 137 | 1144-1151 | |
1267 | 214 | 242 | 1016-1023 | 1351 | 157 | 176 | 1144-1151 | |
1267 | 244 | 278 | 1016-1023 | 1353 | 81 | 100 | 1144-1151 | |
1268 | 145 | 191 | 1016-1023 | 1353 | 120 | 139 | 1144-1151 | |
1268 | 193 | 221 | 1016-1023 | 1354 | 1 | 42 | 1144-1151 | |
1268 | 223 | 257 | 1016-1023 | 1354 | 218 | 237 | 1144-1151 | |
1269 | 164 | 210 | 1016-1023 | 1354 | 257 | 276 | 1144-1151 | |
1269 | 212 | 240 | 1016-1023 | 1356 | 43 | 62 | 1144-1151 | |
1269 | 242 | 276 | 1016-1023 | 1356 | 82 | 101 | 1144-1151 | |
1270 | 199 | 245 | 1016-1023 | 1350 | 176 | 201 | 1144-1151, 1703 | |
1270 | 247 | 275 | 1016-1023 | 1350 | 209 | 231 | 1144-1151, 1703 | |
1270 | 277 | 311 | 1016-1023 | 1350 | 236 | 267 | 1144-1151, 1703 | |
1271 | 154 | 200 | 1016-1023 | 1351 | 262 | 287 | 1144-1151 | |
1271 | 202 | 230 | 1016-1023 | 1351 | 295 | 317 | 1144-1151 | |
1271 | 232 | 266 | 1016-1023 | 1351 | 322 | 351 | 1144-1151 | |
1266 | 209 | 294 | 1016-1023 | 1353 | 225 | 250 | 1144-1151 | |
1266 | 296 | 316 | 1016-1023 | 1353 | 258 | 280 | 1144-1151 | |
1267 | 1 | 74 | 1016-1023 | 1353 | 285 | 316 | 1144-1151 | |
1267 | 244 | 329 | 1016-1023 | 1356 | 187 | 212 | 1144-1151 | |
1267 | 331 | 351 | 1016-1023 | 1356 | 220 | 242 | 1144-1151 | |
1268 | 223 | 308 | 1016-1023 | 1356 | 247 | 278 | 1144-1151 | |
1268 | 310 | 330 | 1016-1023 | 1350 | 236 | 265 | 1144-1151, 1703 | |
1269 | 242 | 327 | 1016-1023 | 1351 | 322 | 352 | 1144-1151 | |
1269 | 329 | 349 | 1016-1023 | 1353 | 285 | 314 | 1144-1151 | |
1270 | 35 | 107 | 1016-1023 | 1356 | 247 | 276 | 1144-1151 | |
1270 | 277 | 351 | 1016-1023 | 1350 | 287 | 306 | 1144-1151, 1703 | |
1271 | 232 | 317 | 1016-1023 | 1350 | 323 | 348 | 1144-1151, 1703 | |
1271 | 319 | 339 | 1016-1023 | 1352 | 2 | 21 | 1147, 1150, 1151, 1703 | |
1266 | 296 | 318 | 1016-1023 | 1352 | 38 | 63 | 1147, 1150, 1151, 1703 | |
1267 | 4 | 74 | 1016-1023 | 1355 | 5 | 24 | 1147, 1150, 1151, 1703 | |
1268 | 310 | 332 | 1016-1023 | 1355 | 41 | 66 | 1147, 1150, 1151, 1703 | |
1269 | 1 | 72 | 1016-1023 | 1356 | 298 | 317 | 1144-1151 | |
1269 | 329 | 351 | 1016-1023 | 1358 | 322 | 351 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1270 | 37 | 107 | 1016-1023 | 1364 | 262 | 291 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1271 | 319 | 341 | 1016-1023 | 1366 | 229 | 258 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1266 | 131 | 157 | 1016-1023 | 1367 | 154 | 183 | 1079-1082, 1152-1154 | |
1267 | 166 | 192 | 1016-1023 | 1361 | 2 | 41 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1268 | 145 | 171 | 1016-1023 | 1210 | 1 | 35 | 1431 | |
1269 | 164 | 190 | 1016-1023 | 1211 | 30 | 63 | 1431 | |
1270 | 199 | 225 | 1016-1023 | 1213 | 15 | 48 | 1431 | |
1271 | 154 | 180 | 1016-1023 | 1217 | 19 | 52 | 1431 | |
1295 | 113 | 168 | 1026, 1027, 1024 | 1357 | 162 | 200 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1295 | 170 | 201 | 1026, 1027, 1024 | 1358 | 124 | 162 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1295 | 203 | 233 | 1026, 1027, 1024 | 1359 | 130 | 168 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1295 | 236 | 258 | 1026, 1027, 1024 | 1360 | 137 | 175 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1297 | 128 | 183 | 1026, 1027, 1024 | 1361 | 163 | 201 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1297 | 185 | 216 | 1026, 1027, 1024 | 1362 | 130 | 168 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1297 | 218 | 248 | 1026, 1027, 1024 | 1363 | 132 | 170 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1296 | 1 | 44 | 1025, 1028, 1029, 1515-1518, 1520 | 1364 | 64 | 102 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1298 | 7 | 57 | 1025, 1028, 1029 | 1365 | 134 | 172 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1298 | 59 | 96 | 1025, 1028, 1029 | 1366 | 31 | 69 | 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458 | |
1298 | 110 | 132 | 1025, 1028, 1029 | 1054 | 198 | 244 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1298 | 143 | 210 | 1025, 1028, 1029 | 1054 | 285 | 319 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1295 | 17 | 87 | 1026, 1027, 1024 | 1056 | 191 | 237 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1297 | 32 | 102 | 1026, 1027, 1024 | 1056 | 278 | 312 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1294 | 127 | 153 | 1027 | 1057 | 14 | 60 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1295 | 17 | 46 | 1026, 1027, 1024 | 1057 | 101 | 135 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1297 | 32 | 61 | 1026, 1027, 1024 | 1057 | 233 | 264 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1298 | 5 | 57 | 1025, 1028, 1029 | 1060 | 269 | 315 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1320 | 249 | 268 | 1033, 1035, 1076 | 1390 | 10 | 50 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1324 | 2 | 23 | 1036, 1037, 1038 | 1390 | 142 | 173 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1326 | 14 | 38 | 1036, 1037, 1038 | 1391 | 73 | 104 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1326 | 95 | 117 | 1036, 1037, 1038 | 1055 | 85 | 131 | 1493, 1494, 1495, 1499, 1500 | |
1326 | 152 | 174 | 1036, 1037, 1038 | 1058 | 117 | 163 | 1493, 1494, 1495, 1499, 1500 | |
1326 | 227 | 248 | 1036, 1037, 1038 | 1059 | 118 | 164 | 1493, 1494, 1495, 1499, 1500 | |
1327 | 44 | 65 | 1036, 1037, 1038 | 1061 | 109 | 155 | 1493, 1494, 1495, 1499, 1500 | |
1321 | 65 | 86 | 1037 | 1062 | 222 | 268 | 1493, 1494, 1495, 1499, 1500 | |
1321 | 88 | 132 | 1037 | 1063 | 262 | 308 | 1493, 1494, 1495, 1499, 1500 | |
1322 | 2 | 34 | 1037 | 1054 | 15 | 64 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1322 | 36 | 67 | 1037 | 1054 | 165 | 196 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1322 | 135 | 156 | 1037 | 1056 | 8 | 57 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1322 | 158 | 202 | 1037 | 1056 | 158 | 189 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1323 | 1 | 35 | 1037 | 1060 | 86 | 135 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1323 | 37 | 68 | 1037 | 1060 | 236 | 267 | 1492, 1496, 1497, 1498 | |
1323 | 136 | 157 | 1037 | 1386 | 199 | 248 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1323 | 159 | 203 | 1037 | 1388 | 212 | 261 | 1054-1057, 1060, 1496, 1498 | |
1324 | 2 | 51 | 1036, 1037, 1038 | 1391 | 286 | 335 | 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498 | |
1324 | 56 | 93 | 1036, 1037, 1038 | 1384 | 311 | 351 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1324 | 95 | 126 | 1036, 1037, 1038 | 1385 | 312 | 351 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1324 | 194 | 215 | 1036, 1037, 1038 | 1387 | 83 | 123 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057 | |
1324 | 217 | 261 | 1036, 1037, 1038 | 1389 | 162 | 202 | 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500 | |
1325 | 2 | 31 | 1037 | 1296 | 69 | 101 | 1025, 1028, 1029, 1515, 1516, 1517, 1518, 1520 | |
1325 | 33 | 64 | 1037 | 909 | 305 | 340 | 1531 | |
1325 | 132 | 153 | 1037 | 960 | 70 | 101 | 1543, 1551 | |
1325 | 155 | 199 | 1037 | 964 | 259 | 290 | 1543, 1551 | |
1326 | 227 | 276 | 1036, 1037, 1038 | 1305 | 180 | 226 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1326 | 281 | 318 | 1036, 1037, 1038 | 1133 | 195 | 226 | 1580, 1581 | |
1326 | 320 | 350 | 1036, 1037, 1038 | 1137 | 52 | 83 | 1580, 1581 | |
1327 | 44 | 93 | 1036, 1037, 1038 | 1344 | 37 | 83 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1327 | 98 | 135 | 1036, 1037, 1038 | 1345 | 228 | 274 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1327 | 137 | 168 | 1036, 1037, 1038 | 1305 | 180 | 217 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1327 | 236 | 257 | 1036, 1037, 1038 | 1344 | 37 | 74 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1327 | 259 | 303 | 1036, 1037, 1038 | 1345 | 228 | 265 | 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583 | |
1324 | 2 | 24 | 1036, 1037, 1038 | 1039 | 176 | 210 | 1590, 1594, 1597, 1598 | |
1326 | 227 | 249 | 1036, 1037, 1038 | 1040 | 142 | 176 | 1590, 1594, 1597, 1598 | |
1327 | 44 | 66 | 1036, 1037, 1038 | 1041 | 248 | 282 | 1590, 1594, 1597, 1598 | |
1328 | 3 | 59 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | 1042 | 141 | 175 | 1590, 1594, 1597, 1598 | |
1328 | 70 | 146 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | 1328 | 175 | 209 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1328 | 148 | 215 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | 1331 | 2 | 54 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1328 | 232 | 263 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | 1331 | 200 | 234 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1328 | 328 | 350 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | 1332 | 142 | 176 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1329 | 22 | 53 | 1039-1043 1045 | 1333 | 176 | 210 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1329 | 118 | 140 | 1039-1043 1045 | 1334 | 16 | 68 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1330 | 31 | 62 | 1039-1043 1045 | 1334 | 214 | 248 | 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 | |
1330 | 127 |