Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу умерщвления насекомого Phyllotreta spp., к способу задержки развития насекомого Phyllotreta spp., а также к способу борьбы с насекомым Phyllotreta spp. Также раскрыта инсектицидная композиция, обладающая инсектицидной активностью против Phyllotreta spp., а также способ, обеспечивающий растение, имеющее повышенную стойкость к насекомому Phyllotreta spp. Изобретение также относится к растению, имеющему повышенную устойчивость к насекомому Phyllotreta spp., клетке такого растения, а также к рекомбинантному ДНК конструкту для борьбы с насекомым Phyllotreta spp. Изобретение позволяет эффективно бороться с Phyllotreta spp. 10 н. и 18 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ И ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/030430, поданной 29 июля 2014 года, которая включена посредством ссылки в данный документ в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащихся в файле ʺ40-21_60779_0000_US_ST25.txtʺ (2098 Кб, созданный 26 июля 2014 года, поданный с предварительной заявкой на патент США № 62/030430 29 июля 2014 года), включен посредством ссылки в данный документ в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащихся в файле ʺ40-21_60779_0000_WO_ST25.txtʺ (2103 Кб, созданный 8 июля 2015 года), подан таким образом и включен посредством ссылки в данный документ в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] В данном документе описаны способы борьбы с заражениями беспозвоночными вредителями, особенно у растений, композиции и полинуклеотиды, полезные в таких способах, и растения, имеющие повышенную устойчивость к беспозвоночным вредителям. Более конкретно, раскрыты полинуклеотиды и способы их использования для модификации экспрессии генов у насекомых-вредителей, в частности с помощью РНК-интерференции. Виды вредителей включают блошек, таких как Phyllotreta spp. и Psylliodes spp.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Коммерческие сельскохозяйственные культуры часто являются объектами нападений со стороны беспозвоночных вредителей, таких как насекомые. Композиции для борьбы с заражениями насекомыми у растений, как правило, были в форме химических инсектицидов. Однако есть несколько недостатков при использовании химических инсектицидов. Например, химические инсектициды, как правило, не селективны, и применение химических инсектицидов, предназначенных для борьбы с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур, может оказывать свои воздействия на не целевых насекомых, а также других беспозвоночных. Химические инсектициды часто сохраняются в окружающей среде и могут медленно деградировать, таким образом, потенциально накапливаясь в пищевой цепи. Кроме того, использование стойких химических инсектицидов может привести к развитию резистентности у целевых видов насекомых. Таким образом, уже давно назрела необходимость более экологически чистых способов для борьбы или истребления заражения насекомыми на или в растениях, например, способы, которые являются видоспецифическими, экологически инертными, нестойкими и биодеградируемыми, и которые хорошо вписываются в схемы управления устойчивостью к вредителям.

[0004] РНК-интерференция (РНКи, РНК-опосредованное подавление гена) - это подход, который показывает перспективы для использования в экологически чистой борьбе с вредителями. У беспозвоночных, РНКи-основанное подавление гена было впервые продемонстрировано у нематод (Fire et al., (1998) Nature, 391:806-811; Timmons & Fire (1998) Nature, 395:854). Впоследствии, о РНКи-основанном подавлении генов беспозвоночных с использованием техник рекомбинантных нуклеиновых кислот сообщалось у ряда видов, включая сельскохозяйственно- или экономически значимых вредителей от различных таксонов насекомых и нематод, таких как: корневые нематоды (Meloidogyne spp.), см. Huang и др. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:14302-14306, doi:10.1073/pnas.0604698103); хлопковая совка (Helicoverpa armigera), см. Mao и др. (2007) Nature Biotechnol., 25:1307-1313, doi:10.1038/nbt1352; Западная блошка длинноуса (Diabrotica virgifera LeConte), см. Baum и др. (2007) Nature Biotechnol., 25:1322-1326, doi:10.1038/nbt1359; нематода сахарной свеклы (Heterodera schachtii), см. Sindhu и др. (2008) J. Exp. Botany, 60:315-324, doi:10.1093/jxb/ern289; комар (Aedes aegypti), см. Pridgeon и др. (2008) J. Med. Entomol., 45:414-420, doi: full/10.1603/0022-2585%282008%2945%5B414%3ATAADRK%5D2.0.CO%3B2; плодовые мошки (Drosophila melanogaster), мучные жуки (Tribolium castaneum), гороховые тли (Acyrthosiphon pisum), и табачная гусеница с рогом (Manduca sexta), см. Whyard и др. (2009) Insect Biochem. Mol. Biol., 39:824-832, doi:10.1016/j.ibmb.2009.09.00; капустная моль (Plutella xylostella), см. Gong и др. (2011) Pest Manag. Sci., 67: 514-520, doi:10.1002/ps.2086; зеленая персиковая тля (Myzus persicae), см. Pitino и др. (2011) PLoS ONE, 6:e25709, doi:10.1371/journal.pone.0025709; бурая рисовая цикадка (Nilaparvata lugens), см. Li и др. (2011) Pest Manag. Sci., 67:852-859, doi:10.1002/ps.2124; и белокрылка (Bemisia tabaci), см. Upadhyay и др. (2011) J. Biosci., 36:153-161, doi:10.1007/s12038-011-9009-1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Данные варианты реализации изобретения относятся к контролю видов насекомых, особенно видов земляных блошек, которые являются экономически или сельскохозяйственно важными вредителями. Композиции и способы, описанные в данном документе, включают рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, такие как рекомбинантные ДНК конструкты для создания трансгенных растений, устойчивых к заражению видами насекомых, и полинуклеотидные агенты, такие как РНК ʺтриггерыʺ, которые полезны для борьбы с или предотвращения заражения этими видами насекомых. Несколько вариантов реализации изобретения, описанных в данном документе, относятся к полинуклеотид-содержащим композициям (например, композиция, содержащая дцРНК триггер для подавления гена-мишени) которые наружно применяются к видам насекомых или растению, части растения, или семенам для защиты от заражения видами насекомых. Другие варианты реализации изобретения относятся к способам отбора предпочтительных генов-мишеней насекомых, которые наиболее вероятно будут эффективными мишенями для РНКи-опосредованного контроля видов насекомых.

[0006] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения насекомыми, включая контактирование насекомого с дцРНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит цепь РНК с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит цепь РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724. В различных вариантах реализации изобретения, контактирование с насекомым осуществляется путем перорального введения, или непероральным контактом, например, путем проникновения через кутикулу, или путем комбинирования перорального и неперорального введения. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК триггер подавляет ген-мишень у насекомого и тормозит рост, развитие или размножение насекомого, или убивает насекомое.

[0007] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу умерщвления или приостановки роста насекомого, включая предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один подавленный элемент, отличающийся тем, что по меньшей мере один подавленный элемент является по существу идентичным или по существу комплементарным фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, и при этом проглатывание полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательность гена-мишени является выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, подавленный элемент содержит цепь РНК с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, подавленный элемент содержит цепь РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид предусмотрен в рационе насекомого в форме растительной или бактериальной клетки, содержащей полинуклеотид, или как синтетическая полинуклеотидная молекула, или как продукт ферментации (например, дцРНК шпилькообразной формы, произведенная в бактерии). В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой молекулу рекомбинантной РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу РНК.

[0008] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащей инсектицидно-эффективное количество полинуклеотида, отличающегося тем, что полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на от около 95% до около 100% комплементарных соответствующей части гена-мишени насекомого, которое заражает растение. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной соответствующей части гена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединица коатомеры) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на около 95% до около 100% комплементарных последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой рекомбинантную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой молекулу являющуюся дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция дополнительно содержит один или более агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых и регулятор роста насекомых. Варианты реализации инсектицидных композиций включают неполинуклеотидные инсектициды, например, бактериально-произведенный инсектицидный белок.

[0009] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего повышенную стойкость к насекомым, включая экспрессирование в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК полинуклеотид, имеющий последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, причем прием внутрь полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в структуре стебель-петля. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0010] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к рекомбинантному ДНК конструкту, содержащему гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарни с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к коммерческим единицам семян, таким как мешок, в котором все или практически все семена содержат рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в структуре стебель-петля. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт содержит РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, имеющей от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт содержит РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0011] В связанных аспектах, предусмотренных в данном документе, присутствуют искусственные композиции, содержащие полинуклеотид или триггер, как описано в данном документе, такой как дцРНК составы, используемые для местного нанесения на растение, или вещество, нуждающееся в защите от заражения насекомыми; рекомбинантные конструкции и векторы, пригодные для получения трансгенных растительных клеток и трансгенных растений; составы и покрытия, используемые для обработки растений (включая семена растений или части, пригодные для размножения, такие как клубни); семена растений или части, пригодные для размножения, такие как клубни, обработанные с или содержащие полинуклеотид как описано в данном документе, а также товарную продукцию и продукты питания, произведенные из таких растений; семена или части, пригодные для размножения (особенно товарную продукцию и продукты питания, имеющие обнаруживаемое количество полинуклеотида, описанного в данном документе). Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам, которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам, которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их комплемента. Такие антитела производят с помощью рутинных способов известных среднему специалисту в данной области техники.

[0012] Другие аспекты и конкретные варианты реализации изобретения описаны в следующем подробном описании и работающих примерах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] Настоящие варианты реализации изобретения относятся к способам и композициям для борьбы с насекомыми-вредителями, в частности группой жесткокрылых насекомых, широко известных как ʺблошкиʺ, среди которых существует несколько родов. Описанные в данном документе, гены-мишени определены как полезные для проектирования полинуклеотидных агентов для предотвращения или лечения заражений блошкой, особенно у коммерчески важных растений. Способы и композиции являются особенно полезными для предотвращения или лечения заражений блошкой коммерчески важных видов Brassica, включая виды, используемые в промышленности в качестве масличного сырья, продуктов питания, или корма для скота (например, канола, рапс, репа, и горчица полевая или турнепс). Такие виды рода Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Также описаны последовательности для подавления одного или более генов-мишеней блошки. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидным агентам, например, в форме дцРНК ʺтриггеровʺ, которые подавляют гены-мишени блошек. В некоторых вариантах реализации изобретения предусмотрены полинуклеотиды и рекомбинантные молекулы ДНК и конструкты полезные для способов борьбы с насекомыми-вредителями, особенно блошками. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к инсектицидным композициям, а также к трансгенным растениям устойчивым к заражению насекомыми-вредителями. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам идентификации эффективных полинуклеотидных агентов, например, двухцепочечных молекул РНК, для борьбы с насекомыми-вредителями и способам идентификации генов-мишеней, которые, вероятно, выполняют важные функции, что делает эти гены предпочтительными целями для РНКи-опосредованного подавления и контроля насекомых-вредителей.

[0014] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам и композициям для ингибирования или контролирования заражения растения блошками с помощью ингибирования экспрессии одного или более гена-мишеней блошки, выбранных из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ингибирование экспрессии одного или более гена-мишени у блошки приводит к замедлению роста или гибели.

[0015] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидной молекуле, такой как дцРНК, которая содержит один или более сегментов, содержащих 18 или более смежных нуклеотидов, например, 21 или более смежных нуклеотидов, имеющих 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера ) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит несколько сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит 21 смежных нуклеотидов, имеющих 100% комплементарность фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Например, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит сегменты, соответствующие различным участкам гена-мишени, или может содержать множественные копии сегмента. В других вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, такой как дцРНК, содержит несколько сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарной фрагменту другого гена-мишени; таким образом несколько генов-мишеней, или несколько видов насекомых, могут быть подавлены.

[0016] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекуле дцРНК, иногда упоминаемой в данном документе как ʺтриггерʺ, который ингибирует экспрессию одного или более генов-мишеней насекомых, выбранных из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к дцРНК имеющей длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК (таких как эндогенно образующиеся миРНК и зрелые микроРНК), например, дцРНК состоит из по меньшей мере около 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК имеет длину от между около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК имеет по меньшей мере 50 пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК формируется из двух отдельных, по существу комплементарных цепочек (например, где каждая цепь представлена отдельно, или где каждая цепь кодируется на отдельной молекуле ДНК, или где две цепи кодируются на отдельных участках ДНК и отдельно транскрибируются или создаются отдельно, например, под действием рекомбиназы или нуклеазы), при этом по меньшей мере одна цепь РНК содержит последовательность, имеющая от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК является тупоконечной, например, две раздельные, равной длины цепи РНК, которые формируют дцРНК посредством межмолекулярной гибридизации. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК имеет "липкие" концы на одном или обоих концах (сайт терминации транскрипции), например, две раздельные, неравной длины цепи РНК, которые формируют дцРНК посредством межмолекулярной гибридизации; "липкий" конец может быть отдельным нуклеотидом или 2, 3, 4, 5, 6 или более нуклеотидами, и может быть расположен на 5ʹ конце или на 3ʹ конце цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один стебель-петлю, например, одна молекула РНК, которая формирует дцРНК с вторичной структурой ʺшпилькаʺ посредством внутримолекулярной гибридизации. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК формируется из одного самогибридизующегося транскрипта шпильки, где одна ʺрукаʺ шпильки содержит последовательность, имеющую от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, самогибридизующиеся транскрипты, которые формируют шпильки (или частичные шпильки), включают в себя молекулы дцРНК, которые включают ʺспейсерныеʺ нуклеотиды или одноцепочечный ʺучасток петлиʺ между дцРНК-формирующими комплементарными ʺрукамиʺ смысловой последовательности и анти-смысловой последовательности. В вариантах реализации изобретения, такие спейсеры или петли включают в себя нуклеотиды, имеющие последовательность несвязанного (не комплементарных или идентичных) гена-мишени, соответствующего двухцепочечному фрагменту шпильки. Примеры спейсеров или петель включают те, что кодируются с помощью SEQ ID NO: 1719-1721. В вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит несколько стеблей-петель с или без нуклеотидов спейсера между каждым стеблем-петлей. В вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит модифицированный стебель-петлю, такой как ʺстабилизированную анти-смысловуюʺ петлю или ʺстабилизированную смысловуюʺ петлю; см., например, патент США № 7855323 и 9006414, которые включены посредством ссылки в данный документ в полном объеме.

[0017] ДцРНК может быть химически синтезирована (например, с помощью in vitro транскрипции, такой как транскрипция с использованием T7 полимеразы или других полимераз), или может быть получена путем экспрессии в микроорганизме, путем экспрессии в растительной клетке, или путем микробной ферментации. ДцРНК может быть химически модифицирована, например, для улучшения стабильности, простоты препарата или эффективности. В некоторых вариантах реализации изобретения, молекула дцРНК представлена в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует дцРНК (такую как дцРНК триггер шпилькообразной формы), или в микробном продукте ферментации.

[0018] Различные способы конструирования и производства разнообразных форм дцРНК известны в данной области техники и являются полезными в композициях и способах, описанных в данном документе. См., например, следующие патенты, которые включены посредством ссылки в данный документ в полном объеме: (1) патент США № 8598332 Waterhouse и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая ДНК, кодирующую последовательность смысловой РНК и анти-смысловой РНК в одном транскрипте, который формирует искусственную ʺшпильковуюʺ РНК структуру с двухцепочечным стеблем РНК с помощью спаривания оснований между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; варианты реализации изобретения включают шпильки со спейсерными нуклеотидами между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; (2) патент США № 8158414 Rommens и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая конвергентно ориентированные первый и второй промоторы, которые производят, например, дуплекс-РНК, которая сформирована с помощью отжига двух отдельных РНК транскриптов; и (3) патент США № 7855323 и 9006414 Huang и др., которые раскрывают рекомбинантные ДНК конструкты, содержащие ДНК, кодирующую ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ транскрипты которые формируют петлю анти-смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней; рекомбинантные ДНК конструкты могут быть сконструированы для подобного кодирования ʺстабилизированных смысловыхʺ транскриптов, которые формируют петлю смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней.

[0019] Варианты реализации изобретения композиций, содержащих полинуклеотиды, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, дополнительно содержать один или более дополнительных компонентов или адъювантов, например, агент-переносчик, инкапсулирующий агент, эмульгирующий агент, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, расширяющий агент, фотозащитный агент, агент устойчивости к осадкам, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, неполинуклеотидный фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, феромоны насекомых, и регулятор роста насекомых. В вариантах реализации изобретения, эти дополнительные компоненты или адъюванты являются съедобными или усваиваются, если попадают в организм блошки.

[0020] В вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, используются в сочетании с ненуклеотидным пестицидным агентом, таким как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент, одновременно или последовательно. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататин, растительные лектины, фитоэкдистероиды, и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки от Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (ранее Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (ранее Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae), бактерию, которая продуцирует инсектицидный белок, и энтомицидные виды бактерий. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными пестицидами, такими как спиромезифен, спиродиклофен, спиротетрамат, пиридабен, тебуфенпирад, толфенпирад, фенпироксимат, флуфенерим, пиримидифен, феназахин, ротенон, циенопирафен, гидраметилнон, ацехиноцил, флуакрипирим, фосфид алюминия, фосфид кальция, фосфин, фосфид цинка, цианид, диафентиурон, азоциклотин, цигексатин, оксид фенбутатина, пропаргит, тетрадифон, бенсультап, тиоциклам, тиосултап-натрия, флоникамид, этоксазол, клофентезин, дифловидазин, гекситиазокс, хлорфлуазурон, бистрифлурон, дифлубензурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, новалурон, новифлумурон, тефлубензурон, трифлумурон, бупрофезин, циромазин, гидропрен, кинопрен, метопрен, феноксикарб, пирипроксифен, пиметрозин, пирифлукваиназон, хлорфенапир, тралопирил, B.t. (Bacillus thuringiensis) var. aizawai, B.t. var. israelensis, B.t. var. kurstaki, B.t. var. sphaericus, B.t. var. tenebrionensis, Bacillus thuringiensis белки сельскохозяйственных культур, включая Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Ab1, бромистый метил и другие алкилгалогениды, хлорпикрин, фторид серы, бенклотиаз, хинометионат, криолит, метилнеодеканамид, бензоксимат, цимиазол, флуенсульфон, азадирахтин, бифеназат, амидофлумет, дикофол, плифенат, цифлуметофен, пиридалил, Beauveria bassiana GHA, сульфоксафлор, спинеторам, спиносад, эмамектинбензоат, лепимектин, милбемектин, абамектин, метоксифенозид, хромафенозид, галофенозид, тебуфенозид, амитраз, хлорантранилипрол, циантранилипрол, флубендиамид, альфа-эндосульфан, хлордан, эндосульфан, фипронил, ацетопрол, этипрол, пирафлупрол, пирипрол, индоксакарб и метафлумизон, акринатрин, аллетрин, аллетрин-цис-транс, транс-аллетрина, бета-цифлутрин, бета-циперметрин, бифентрин, биоаллетрин, биоаллетрин S-циклопентенил, биоресметрин, циклопротрин, цифлутрин, цигалотрин, циперметрин, цифенотрин [(1R)-транс-изомеры], димефлутрин, эмпентрин [(EZ)-(1R)-изомеры], эсфенвалерат, этофенпрокс, фенпропатрин, фенвалерат, флюцитринат, флюметрин, гамма-цигалотрин, лямбда-Цигалотрин, меперфлутрин, метофлутрин, перметрин, фенотрин [(1R)-транс-изомер], праллетрин, профлутрин, протрифенбут, ресметрин, силафлуофен, тау-флувалинат, тефлутрин, тетраметрин, тетраметрин [(1R)-изомеры], тетраметилфлутрин, тета-циперметрин, тралометрин, трансфлутрин, дзета-циперметрин, альфа-циперметрин, дельтаметрин, DDT и метоксихлор, тиодикарб, аланикарб, алдикарб, бендиокарб, бенфуракарб, бутоксикарбоксим, карбарил, карбофуран, карбосульфан, этиофенкарб, фенобукарб, форметанат, фуратиокарб, изопрокарб, метиокарб, метомил, метолкарб, оксамил, пиримикарб, пропоксур, тиофанокс, триазамат, триметакарб, ХМС, ксилилкарб, хлорпирифос, малатион, ацефат, азаметифос, азинфос-этил, азинфос-метил, кадусафос, хлоретоксифос, хлорфенвинфос, хлормефос, хлорпирифосметил, кумафос, цианофос, метилмеркаптофос, диазинон, дихлорвос/ДДВФ, дикротофос, диметоат, диметилвинфос, дисульфотон, EPN, этион, этопрофос, фамфос, фенамифос, фенитротион, фентион, фонофос, фостиазат, имициафос, изофенфос-метил, мекарбам, метамидофос, метидатион, мевинфос, монокротофос, налед, ометоат, оксидеметон-метил, паратион, паратион-метил, фентоат, форат, фосалон, фосмет, фосфамидон, фоксим, пиримофоз-этил, профенофос, пропафос, пропетамфос, протиофос, пираклофос, пиридафентион, хиналфосом, сульфотеп, тебупиримфос, темефос, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиометон, триазофос, хлорофос, вамидотион имидаклоприд, тиаметоксам, ацетамиприд, клотиандин, динотефуран, нитенпирам, нитиозин, никотин, тиаклоприд, хлорантранилипрол и циантранилипрол. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов рода Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из дельтаметрина, циперметрина, лямбда-цигалотрина, перметрина, карбарила, карбофурана и малатиона, или обработкой семян, содержащей один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из тиаметоксама, имидаклоприда и клотианадина.

[0021] В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными фунгицидами, такими как бупиримат, диметиримол, этиримол, ципродинил, пириметанил, мепанипирим, фенпиклонил, флудиоксонил; фениламиды, беналаксил, фуралаксил, металаксил, R-металаксил, офурак, оксадиксил, беномил, карбендазим, дебакарб, фуберидазол, тиабендазол, хлозолинат, дихлозолин, ипродин, миклозолин, процимидон, винклозолин, карбоксин, фенфурам, флутоланил, мепронил, оксикарбоксин, тифлузамид, гуазатин, додин, иминоктадин, азоксистробин, крезоксим-метил, метоминостробин или трифлоксистробин, фербам, манкозеб, манеб, метирам, пропинеб, тирам, зинеб, зирам, каптафол, каптан, дихлофлуанид, флуоромид, фолпет, толуфлуанид, гидроксид меди, оксихлорид меди, сульфат меди, оксид меди, манкуппер, оксин-медь, динокап, нитротал-изопропил, эдифенфос, ипробенфос, изопротиолан, фосдифен, пиразофо, токлофос-метил, ацибензолар-S-метил, харпин, анилазин, бластицидин-S, хинометионат, хлоронеб, хлороталонил, цимоксанил, дихион, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, диметоморфу, дитианон, этридиазол, фамоксадон, фенамидон, фентин, фенпиразамине, феримзон, флуазинам, флусульфамид, фосетил-алюминий, гимексазол, касугамицин, метасульфокарб, пенцикурон, фталид, полиоксины, пробеназол, пропамокарб, пироквуилон, хиноксифен, квинтозин, сера, триазоксид, трициклазол, валидамицин, азаконазол, битертанол, пропиконазол, дифеноконазол, диниконазол, ципроконазол, эпоксиконазол, флухинконазол, флусилазол, флутриафол, гексаконазол, имазалил, имибенконазол, ипконазол, тебуконазол, тетраконазол, фенбуконазол, метконазол, миклобутанил, перфуразоат, пенконазол, бромуконазол, пирифенокс, прохлораз, триадимефон, триадименол, трифлумизол, тритиконазол, трифорин, анцимидол, фенаримол или нуаримол, додеморф, фенпропидин, фенпропиморф, спироксамин, тридеморф и фенгексамид. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов рода Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, штамма QST 2808 Bacillus subtilis, боскалида, флуксопироксада, пираклостробина, метконазола, протиоконазола, пентиопирада, пикоксистробина и тиофанат метила, или обработкой семян, содержащей один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, металаксила, трифлоксистробина, пираклостробина, седаксана, пенфлуфена, флудиоксонила и мефеноксама.

[0022] В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой, такие как дцРНК триггеры, описанные в данном документе, могут дополнительно включать или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными гербицидами, такими как глифосат, ауксин-подобными гербицидами, такими как дикамба, фосфинотрицин, глюфосинат, 2,2-дихлоропропионовая кислота (далапон), ингибиторы ацетолактат синтазы, такие как сульфонилмочевины, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты, и фталид, бромоксинил, циклогександион (сетоксидим) и арилоксифеноксипропионат (галоксифоп), сульфонамид гербициды, триазиновые гербициды, 5-метилтриптофан, аминоэтил цистеин, пиридазиноновые гербициды, такие как норфлуразон, циклопропилизоксазол гербициды, такие как изоксафлютол, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы, гербициды, содержащие фрагмент арилоксиалканоата, фенокси ауксины, такие как 2,4-D и дихлорпроп, пиридилокси ауксины, такие как фтороксипира и триклопира, арилоксифеноксипропионаты (AOPP), ингибиторы ацетил-коэнзим A карбоксилазы (ACCase), такие как галоксифоп, хизалофоп и дислофоп, и 5-замещенные ингибиторы феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX, такие как пирафлуфен и флумиклорак. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов рода Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более послевсходовых гербицидов, выбранных из группы, состоящей из хизалофопа, сетоксидима, клетодима, и клопиралида. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с блошкой у устойчивых к гербицидам видов рода Brassica, включая устойчивый к гербицидам рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более гербицидов, выбранных из группы, состоящей из имазамокас, глифосата и глюфосината.

[0023] Описанные композиции и способы являются полезными для ингибирования или борьбы с заражением блошкой растения, такого как виды рода Brassica. В вариантах реализации изобретения, композиции и способы используются для лечения растущего растения, такого как полевые растения рода Brassica. Варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие полинуклеотиды, описанные в данном документе, в композиции в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы или композиции для обработки семян. В вариантах реализации изобретения такие композиции наносятся на поверхность растения, нуждающегося в защите или лечении от заражения блошками, или наносятся прямо на блошек, или предусмотрены в пищевой для блошек форме. В вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотиды, описанные в данном документе, наносится прямо на непроросшие семена (такие как непроросшие семена видов рода Brassica), обеспечивая растению, проросшему из обработанных семян, повышенную устойчивость к заражению блошками; примеры способов обработки семян описаны в патентной заявке США 14/143836, которая включена посредством ссылки в данный документ в полном объеме. Варианты реализации изобретения включают семена рода Brassica, которые обрабатываются с помощью непосредственного контакта семян с полинуклеотидом (таким как дцРНК триггер), описанным в данном документе, после прорастания в растение рода Brassica, которое демонстрируют повышенную устойчивость к заражению блошкой.

[0024] Если не указано иное, используемые технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области техники. Термины ʺсодержатьʺ или ʺвключатьʺ подразумевают ʺвключает, но без ограниченияʺ. Как правило, используемая номенклатура и производственные или лабораторные методики, описанные ниже, являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники. Обычные способы используются для выполнения этих процедур, таких, как те, которые предусмотрены в данной области техники и различных общих ссылках. В случае, когда термин предусмотрен в единственном числе, авторы данного изобретения также рассматривают аспекты, описываемые множественным числом этого термина. Там, где есть расхождения в терминах и определениях, используемых в ссылках, которые включены посредством ссылки, термины, используемые в данной заявке, должны иметь приведенные определения. Другие технические термины имеют их обычное значение в области техники, в которой они используются, как проиллюстрировано с помощью различных технико-специфических словарей, например, ʺThe American Heritage® Science Dictionaryʺ (Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Хоутон Миффлин Харкорт, Бостон и Нью-Йорк), ʺMcGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Termsʺ (6th edition, 2002, МакГроу-Хилл, Нью-Йорк), или ʺOxford Dictionary of Biologyʺ (6th edition, 2008, Oxford University Press, Оксфорд и Нью-Йорк). Авторы данного изобретения не намерены ограничиваться механизмом или способом действия. Ссылка к ним предоставляется только для иллюстрации.

[0025] Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот в тексте данного описания изобретения приведены так, что читаются слева направо в направлении 5' к 3' концу. Специалисту в данной области техники будет известно, что данная последовательность ДНК понимается для определения соответствующей последовательности РНК, которая идентична последовательности ДНК за исключением замены нуклеотидов тимина (T) в ДНК на нуклеотиды урацила (U). Таким образом, предоставляемая конкретная последовательность ДНК понимается для определения точного РНК эквивалента. Данная первая полинуклеотидная последовательность, будь то ДНК или РНК, дополнительно определяет последовательность ее точного комплемента (который может быть ДНК или РНК), т.е., второй полинуклеотид, который гибридизируется идеально с первым полинуклеотидом путем формирования Уотсона-Криковских пар оснований. Под термином "по существу идентичны" или ʺпо существу комплементарны" гену-мишени или фрагменту гена-мишени, подразумевается, что полинуклеотидная цепь (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) сконструирована для гибридизации (как правило, при физиологических условиях, таких как те, что можно найти в клетке живых растений или животных) с геном-мишенью, или с фрагментом гена-мишени, или с транскриптом гена-мишени или фрагмента гена-мишени; специалисту в данной области техники будет понятно, что такая гибридизация не обязательно требует 100% идентичности или комплементарности последовательности. Первая последовательность нуклеиновой кислоты "функционально" соединена или "связана" со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательность промотора является ʺфункционально связаннойʺ с ДНК, если промотор обеспечивает транскрипцию или экспрессию ДНК. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными.

[0026] Термин ʺполинуклеотидʺ обычно относится к молекуле ДНК или РНК, содержащей несколько нуклеотидов и, в общем, относится к обоим ʺолигонуклеотидамʺ (полинуклеотидная молекула из 18-25 нуклеотидов в длину) и более длинным полинуклеотидам из 26 или более нуклеотидов. Полинуклеотиды также включают молекулы, содержащие несколько нуклеотидов, включая неканонические нуклеотиды или химически модифицированные нуклеотиды, как это обычно практикуется в данной области техники; см., например, химические модификации, раскрытые в техническом руководстве ʺRNA Interference (RNAi) and DsiRNAsʺ, 2011 (Integrated DNA Technologies Коралвилл, Айова). Как правило, полинуклеотид, как описано в данном документе, будь то ДНК или РНК, или оба, и будь то одно- или двухцепочечный, включает по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов (или в случае двухцепочечных полинуклеотидов по меньшей мере 18 смежных пар оснований), которые, по сути, идентичны или комплементарны фрагменту эквивалентного размера ДНК гена-мишени или РНК транскрипта гена-мишени. На протяжении этого описания, "по меньшей мере 18 смежных" означает "от около 18 до около 10000, включая каждый целый номер точки между ними". Таким образом, варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие олигонуклеотиды, имеющие длину от 18-25 нуклеотидов (18-членные, 19-членные, 20-членные, 21-членные, 22-членные, 23-членные, 24-членные, или 25-членные), или средней длины полинуклеотиды, имеющие длину от 26 или более нуклеотидов (полинуклеотиды из 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, или около 300 нуклеотидов), или длинные полинуклеотиды, имеющие длину, более чем около 300 нуклеотидов (например, полинуклеотиды от между около 300 до около 400 нуклеотидов, между около 400 до около 500 нуклеотидов, между около 500 до около 600 нуклеотидов, между около 600 до около 700 нуклеотидов, между около 700 до около 800 нуклеотидов, между около 800 до около 900 нуклеотидов, между около 900 до около 1000 нуклеотидов, между около 300 до около 500 нуклеотидов, между около 300 до около 600 нуклеотидов, между около 300 до около 700 нуклеотидов, между около 300 до около 800 нуклеотидов, между около 300 до около 900 нуклеотидов, или около 1000 нуклеотидов в длину, или даже более чем около 1000 нуклеотидов в длину, например, по всей длине гена-мишени, содержащего кодирующие или некодирующие или оба кодирующие или некодирующие участки гена-мишени). Там, где полинуклеотид представляет собой двухцепочечный, такой как дцРНК триггеры, описанные в рабочих примерах, его длина может быть аналогичным образом описана в терминах пар оснований. Двухцепочечные полинуклеотиды, такие как дцРНК триггеры, описанные в рабочих примерах, могут быть дополнительно описаны в терминах одного или нескольких одноцепочечных компонентов.

[0027] Полинуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть одноцепочечными (оц) или двухцепочечными (дц). «Двухцепочечный» относится к спариванию оснований, которое происходит между полностью комплементарными, анти-параллельными цепями нуклеиновой кислоты с образованием структуры двухцепочечной нуклеиновой кислоты, как правило, при физиологически подходящих условиях. Варианты реализации изобретения включают те, где полинуклеотид является выбранным из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной ДНК (оцДНК), смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), двухцепочечной ДНК (дцДНК), двухцепочечного ДНК/РНК гибрида, анти-смысловой оцДНК или смысловой оцРНК; смесь полинуклеотидов любого из этих типов может быть использована. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК длиной более чем, та, которая характерна для естественных регуляторных малых РНК (таких как, эндогенно полученные миРНК и зрелые микроРНК). В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК из по меньшей мере около 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК с длиной между около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеоти может содержать компоненты отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, вариант реализации изобретения представляет собой РНК, которая содержит терминальные дезоксирибонуклеотиды.

[0028] Эффективные полинуклеотиды любого размера могут быть использованы по отдельности или в сочетании, в различных способах и композициях, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, один полинуклеотидный триггер используется для создания композиции (например, композиции для местного применения, или рекомбинантного конструкта ДНК пригодного для создания трансгенного растения). В других вариантах реализации изобретения, используется смесь или совокупность разных полинуклеотидных триггеров; в таких случаях полинуклеотидные триггеры могут быть для одного гена-мишени или нескольких генов-мишеней.

[0029] В различных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как те, которые присутствуют в ДНК и РНК. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетические полинуклеотиды, состоящие в основном из рибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дезоксирибонуклеотидов или одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов, или синтетических полинуклеотидов, состоящих в основном из дезоксирибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит химически модифицированные нуклеотиды. Примеры химически модифицированных олигонуклеотидов или полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники; см., например, публикацию патента США 2011/0171287, публикацию патента США 2011/0171176, публикацию патента США 2011/0152353, публикацию патента США 2011/0152346, и публикацию патента США 2011/0160082, которые включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные примеры включают, но без ограничения, встречающиеся в природе фосфодиэфирный остов олигонуклеотида или полинуклеотид, который может быть частично или полностью модифицирован с фосфоротиоатом, фосфородитиоатом, или метилфосфонатными межнуклеотидными модификациями связи, модифицированные основания нуклеозидов или модифицированные сахара могут быть использованы в синтезе олигонуклеотида или полинуклеотида, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут быть помечены флуоресцентными фрагментами (например, флуоресцеином или родамином) или другой меткой (например, биотином).

[0030] Термин ʺрекомбинантныйʺ, используемый для обозначения полинуклеотида (такого как молекулы рекомбинантной РНК или конструкты рекомбинантной ДНК, описанные в данном документе), означает, что полинуклеотид не является встречающейся в природе молекулой, т.e., что требуется вмешательство человека для существования полинуклеотида. Рекомбинантный полинуклеотид получают с использованием методики рекомбинантной нуклеиновой кислоты или путем химического синтеза, и он может включать комбинации последовательностей, которые не встречаются в природе (например, комбинации гетерологичного промотора и ДНК, кодирующей экспрессируемую РНК, или молекулу РНК, содержащую связанные сегменты гена-мишени которые в природе не встречаются рядом друг с другом). Рекомбинантный полинуклеотид может быть биологически произведен в клетке (такой как бактериальная, или растительная или животная клетка), например, когда эту клетку трансфицируют или трансформируют с вектором, кодирующим рекомбинантный полинуклеотид (например, вектор, кодирующий дцРНК шпилькообразной формы, произведенный в бактерии). Рекомбинантный полинуклеотид может включать последовательность нуклеотидов, сконструированную in silico с использованием соответствующих алгоритмов.

[0031] Полинуклеотиды или триггеры, описанные в данном документе, как правило, сконструированы для подавления или сайленсинга одного или более генов (ʺгенов-мишенейʺ). Термин ʺгенʺ относится к любому участку нуклеиновой кислоты, который обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт, или который является наследуемой последовательностью нуклеиновой кислоты. ʺГенʺ может включать, но без ограничения, участок промотора, 5ʹ нетранслируемый участок, кодирующий транскрипт участок, который может включать интронный участок, 3ʹ нетранслируемый участок, или комбинации этих регионов. В вариантах реализации изобретения, гены-мишени могут включать кодирующую или некодирующую последовательность или обе. В других вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность идентичную или комплементарную матричной РНК, например, в вариантах реализации изобретения ген-мишень представляет собой кДНК.

[0032] Как используется в данном документе, термин ʺизолированныйʺ относится к отделению молекулы от других молекул обычно связанных с ней в своем нативном или естественном состоянии. Термин ʺизолированныйʺ таким образом, может относиться к молекуле ДНК, которая была отделена от других молекул(ы) ДНК, которые обычно связаны с ней в своем нативном или естественном состоянии. Такая молекула ДНК может присутствовать в рекомбинированном состоянии, таком как рекомбинантная молекула ДНК. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями с которыми они обычно не связаны, например посредством рекомбинантных технологий, рассматриваются изолированно, даже при интегрировании в качестве трансгена в хромосому клетки или в присутствии с другими молекулами ДНК.

[0033] Под "инсектицидно-эффективным" подразумевается эффективный в индукции физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослой блошки или личинок), которое заражает растение, таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала или снижение плодовитости, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах реализации изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, к растению повышает устойчивость растений к заражению насекомым. В некоторых вариантах реализации изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, к культурному растению повышает урожайность (например, увеличивает биомассу, повышает семенную или плодовую продукцию, или увеличивает содержание масла, крахмала, сахара или белка) культурного растения, в сравнении с культурным растением не обработанным полинуклеотидом. В то время как не существует верхнего предела концентраций и доз полинуклеотида, как описано в данном документе, которые могут быть полезны в способах и композициях, представленных в данном документе, более низкие эффективные концентрации и дозировки, как правило, будут искать для эффективности и экономии. Неограничивающие варианты реализации изобретения эффективных количеств полинуклеотида включают диапазон от около 10 нанограмм на миллилитр до около 100 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в жидкой форме распыляемого на растение, или от около 10 микрограмм на акр до около 100 грамм на акр полинуклеотида применяемого к полевым растениям, или от около 0,001 до около 0,1 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в искусственном питании для кормления насекомых. В то время как композиции, описанные в данном документе, наружно применяют к растению, концентрация может быть скорректирована с учетом объема спрея или обработки, применяемой к листьям растений или другим частям поверхности растения, таким как лепестки цветка, стебли, клубни, плоды, пыльники, пыльца, листья, корни или семена. В одном варианте реализации изобретения, пригодная обработка травянистых растений с использованием 25-членного полинуклеотида, как описано в данном документе, составляет около 1 наномоля (нмоль) полинуклеотида на растение, например, от около 0,05 дo 1 нмоль полинуклеотида на растение. Другие варианты реализации изобретения для травянистых растений включают полезные диапазоны от около 0,05 до около 100 нмоль, или около 0,1 до около 20 нмоль, или около 1 нмоль до около 10 нмоль полинуклеотида на растение. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется от около 40 до около 50 нмоль одноцепочечного полинуклеотида, как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется от около 0,5 нмоль до около 2 нмоль дцРНК, как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется композиция, содержащая около 0,5 до около 2,0 миллиграмм на миллилитр, или около 0,14 миллиграмм на миллилитр дцРНК (или одноцепочечного 21-членного), как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется композиция от около 0,5 до около 1,5 миллиграмм на миллилитр полинуклеотида дцРНК, описанного в данном документе, содержащего от около 50 до около 200 или более нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения, применяется к растению от около 1 нмоль до около 5 нмоль дцРНК, как описано в данном документе. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотидная композиция, как наружно применяемая к растению, содержит по меньшей мере один полинуклеотид, как описано в данном документе, в концентрации от около 0,01 дo около 10 миллиграмм на миллилитр, или около 0,05 дo около 2 миллиграмм на миллилитр, или около 0,1 дo около 2 миллиграмм на миллилитр. Очень большие растения, деревья или лианы, требуют соответственно больших количеств полинуклеотидов. При использовании длинных молекул дцРНК, которые могут быть переработанны в несколько олигонуклеотидов (например, несколько триггеров, кодируемых с помощью одной молекулы рекомбинантной ДНК, как описано в данном документе), могут быть использованы более низкие концентрации. Неограничивающие примеры эффективных режимов обработки полинуклеотидом включают обработку от между около 0,1 дo около 1 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 1 нмоль дo около 10 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 10 нмоль дo около 100 нмоль молекул полинуклеотида на растение.

СПОСОБЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ ГИБЕЛЬ НАСЕКОМЫХ, И СПОСОБЫ БОРЬБЫ С ЗАРАЖЕНИЯМИ НАСЕКОМЫМИ

[0034] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу умерщвления или приостановки роста насекомого, включая предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одной рекомбинантной РНК, содержащей по меньшей мере один подавленный элемент по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, причем последовательность гена мишени выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859, при этом проглатывание рекомбинантной РНК насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. Эти способы могут быть использованы для борьбы с заражением насекомыми растения, например, для предотвращения или лечения заражения блошкой сельскохозяйственного растения, особенно коммерчески важных видов рода Brassica.

[0035] В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого, отличающийся тем, что ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей их SEQ ID NO: 1-859. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит дцРНК, содержащую по меньшей мере одну цепь РНК, содержащую последовательность, имеющую от около 95% дo около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0036] В вариантах реализации изобретения, рекомбинантная РНК представлена в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует рекомбинантную РНК, или в микробном продукте ферментации, или является химически синтезированной. В вариантах реализации изобретения, по меньшей мере один подавленный элемент содержит дцРНК. В вариантах реализации изобретения, дцРНК является тупоконечной, или имеет "липкий" конец на по меньшей мере одном конце, или содержит по меньшей мере один стебель-петлю. ДцРНК обеспечивается удобными, обычно используемыми методами. В вариантах реализации изобретения, дцРНК является химически синтезированной, полученной путем экспрессии в микроорганизме, полученной путем экспрессии в растительной клетке, или полученной путем микробной ферментации. В вариантах реализации изобретения, дцРНК изготавливается из встречающихся в природе рибонуклеотидов; в других вариантах реализации изобретения, дцРНК является химически модифицированной.

[0037] В вариантах реализации изобретения, способ применяется для умерщвления или приостановки роста насекомых, которые являются вредителями коммерчески важных сельскохозяйственных растений, таких как насекомые-вредители видов рода Brassica. В вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой блошку. В вариантах реализации изобретения, насекомое является представителем рода выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0038] Варианты реализации способа включают те, в которых рекомбинантная РНК сконструирована для подавления гена-мишени родо- или видоспецифическим способом, например, где (a) насекомое представляет собой вид рода Phyllotreta и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-551; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошку репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551; (e) насекомое представляет собой виды рода Psylliodes и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859. Варианты реализации изобретения способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой вид рода Phyllotreta и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1410 или их фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391 или их фрагмента; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410 или их фрагмента; (e) насекомое представляет собой виды рода Psylliodes и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и подавленный элемент содержит цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента.

[0039] Варианты реализации способа включают те, в которых по меньшей мере одна рекомбинантная РНК представлена в композиции, содержащей по меньшей мере одну рекомбинантную РНК, при этом композицию наносят на поверхность насекомого, либо на поверхность семян или растений, нуждающихся в защите от заражения насекомыми. Варианты реализации таких композиций, включают те, в которых композиция включает твердое вещество, жидкость, порошок, суспензию, эмульсию, спрей, инкапсуляцию, микрогранулы, частицы носителей, пленки, матрицы, орошения почвы или обработку семян. Во многих вариантах реализации изобретения, композицию составляют в форме, которая проглатывается насекомым. В вариантах реализации изобретения, композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, удобрения, микроэлемента, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. В вариантах реализации изобретения, композиция дополнительно содержит по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.

[0040] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения насекомыми, включая контактирование растения и/или насекомого, которое заражает растение, с двухцепочечной РНК (дцРНК), при этом дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% ( например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарной фрагменту гену-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на около 95% до около 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В этом контексте ʺборьба сʺ включает стимулирование физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки, или нимфы) таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В вариантах реализации изобретения, дцРНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента, или их комплемента.

[0041] В различных вариантах реализации изобретения, насекомое представляет собой блошку, например, вида рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки) и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0042] Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться полинуклеотидами, описанными в данном документе. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты реализации способа включают те, в которых растение представляет собой растение из семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. В других вариантах реализации изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0043] Способы включают те, которые разработаны для конкретных блошек-вредителей данного растения, например, в которых растение представляет собой растение картофеля и насекомое представляет собой Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах реализации изобретения, конкретные гены-мишени были идентифицированы в качестве мишеней для РНКи-опосредованного контроля данного вида насекомого. Различные варианты реализации способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859.

[0044] В некоторых вариантах реализации изобретения, определенные дцРНК ʺтриггерыʺ разработаны для конкретных генов-мишеней данного вида насекомых. Варианты реализации изобретения способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391 или их фрагмента; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410 или их фрагмента; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и дцРНК содержит по меньшей мере одну последовательность РНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента.

[0045] Способ включает стадию, в которой насекомое, такое как блошка, приводят в контакт с двухцепочечной РНК (дцРНК). Варианты реализации изобретения включают стадию приведения в контакт через пероральное введение насекомому, или непероральное введение насекомому, или комбинацию перорального и неперорального введения насекомому. Варианты реализации изобретения включают приведение в контакт насекомых во взрослой стадии, или в личиночной стадии, или в стадии яйца. В некоторых вариантах реализации изобретения, приведение в контакт насекомого приводит к гибели (смерти) или задержки роста (отставание в росте, или снижение или прекращение стадии развития метаморфоза) насекомого, тем самым предотвращая или вылечивая заражение растения насекомым. В некоторых вариантах реализации изобретения, приведение в контакт приводит к стимулированию физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки, или нимфы), что приводит к уменьшенной способности насекомого заражать или повреждать растение, например, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения.

[0046] В некоторых вариантах реализации способа, приведение в контакт включает применение композиции, содержащей дцРНК, на поверхности насекомых или на поверхности растений, зараженных насекомыми. Композиция может содержать или быть в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы или обработки семян. В вариантах реализации изобретения, приведение в контакт включает предоставление дцРНК в композиции, которая дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения, приведение в контакт включает предоставление дцРНК в композиции, которая дополнительно содержит один или более пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.

[0047] В некоторых вариантах реализации способа, стадия контакта включает предоставление дцРНК в композиции, которая проглатывается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Такие композиции могут дополнительно содержат один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. Такие композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В вариантах реализации изобретения, сочетание дцРНК и пестицидного агента обеспечивает уровень борьбы с насекомыми, который больше, чем сумма эффектов дцРНК и компонентов пестицидного агента, если они тестированы отдельно.

Инсектицидные Композиции

[0048] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащей инсектицидно-эффективное количество полинуклеотида, такого как молекула дцДНК, причем полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих около 95% до около 100% комплементарности с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов, имеющих 100% комплементарности с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0049] В различных вариантах реализации инсектицидной композиции, насекомое представляет собой, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки) и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0050] Инсектицидная композиция используется для обработки растения или участка в непосредственной близости от растения для обеспечения защиты или лечения от насекомых, особенно блошек. Связанный аспект представляет собой растение, обработанное инсектицидной композицией, как описано в данном документе, или семена обработанных растений, причем растение проявляет повышенную устойчивость к насекомым (например, повышенную стойкость к блошкам). В некоторых вариантах реализации изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением, не обработанным инсектицидной композицией. В вариантах реализации изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается с помощью использования инсектицидно-эффективного количества полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, нацеливающегося на один или более генов, идентифицированных у Phyllotreta cruciferae (блошки канолы); в отдельных вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей их SEQ ID NO: 297-532. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться с помощью инсектицидной композиции. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены в рубрике ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты реализации способа включают те, в которых растение представляет собой растение из семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. В других вариантах реализации изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0051] В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция, разработана для конкретной блошки-вредителя для данного растения, например, где растение представляет собой растение картофеля и насекомое представляет собой Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция, разработана для конкретного гена-мишени у данного вида насекомого. Конкретные варианты реализации инсектицидной композиции включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (светлоногую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошку канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатую блошку) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859.

[0052] В некоторых вариантах реализации изобретения, молекула дцРНК, используемая в данном способе, представлена как изолированная молекула дцРНК (не часть экспрессионного конструкта, например, отсутствуют дополнительные элементы, такие как промотор или последовательности терминатора). Такие молекулы дцРНК могут быть относительно короткими, такими как одно- или двухцепочечные молекулы РНК от между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую сегмент, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0053] В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, пищи насекомых или приманки насекомых и обработки семян. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция представлена в форме, которая проглатывается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых и регулятора роста насекомых. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В некоторых вариантах реализации изобретения, сочетание молекулы рекомбинантной РНК и пестицидного агента обеспечивает уровень борьбы с насекомыми, который больше, чем сумма эффектов молекулы рекомбинантной РНК и компонентов пестицидного агента, если они тестированы отдельно.

[0054] Варианты реализации композиций дополнительно содержат соответствующие наклейки и смачиватели, необходимые для эффективного лиственного покрытия, а также УФ-протекторы для защиты полинуклеотидов, такие как дцРНК от УФ-повреждений. Такие добавки обычно используются в биоинсектицидной промышленности и известны специалистам в данной области техники. Композиции для нанесения на грунт могут включать гранулированные составы, которые служат приманкой для личинок насекомых. Варианты реализации изобретения включают агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганику, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых и регулятор роста насекомых.

[0055] Варианты реализации композиций могут содержать ʺагент переносаʺ: агент, который в сочетании с композицией, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе, который наружно применяют на поверхность организма, дает возможность полинуклеотиду проникать в клетки этого организма. Такой агент переноса может быть включен как часть композиции, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе, или может быть нанесен до, одновременно с или после нанесения композиции, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса представляет собой агент, который улучшает поглощение полинуклеотида насекомым. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса представляет собой агент, который находится на поверхности растительной ткани, например, семян, листьев, стеблей, корней, цветов, или плодов, для проникновения полинуклеотида в клетки растений. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса обеспечивает путь для полинуклеотида через кутикуло-восковые барьеры, устьица, и/или клеточную стенку или мембранные барьеры в клетки растений.

[0056] Подходящие агенты переноса включают в себя агенты, которые повышают проницаемость внешней части организма, или которые увеличивают проницаемость клеток организма к полинуклеотидам. Подходящие агенты переноса включают в себя химический агент, или физический агент, или их сочетания. Химические агенты для создания необходимых условий или переноса включают (a) поверхностно-активные вещества, (b) органический растворитель, или водный раствор или водную смесь органических растворителей, (c) окисляющие агенты, (d) кислоты, (e) основания, (f) масла, (g) ферменты, или их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения, использование полинуклеотида и агента переноса дополнительно включает стадию инкубации, стадию нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания, или окисляющего агента, или инактивации фермента), стадию отмывания, или их комбинацию. Подходящий агент переноса может быть в форме эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции, или может вызывать переход полинуклеотидной композиции в форму эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции. Варианты реализации агентов переноса включают противоионы или другие молекулы, которые, как известно, ассоциируются с молекулами нуклеиновых кислот, например, катионные липиды, неорганические ионы аммония, ионы алкил аммония, ионы лития, полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин, и другие катионы. Варианты реализации агентов переноса включают органические растворители, такие как ДМСО, ДМФ, пиридин, N-пирролидин, гексаметилфосфорамид, ацетонитрил, диоксан, полипропилен гликоль или другие растворители, смешиваемые с водой или растворяющие фосфонуклеотиды в неводных системах (такие, как используются в синтетических реакциях). Варианты реализации изобретения агентов переноса включают масла природного происхождения или синтетические с добавлением или без поверхностно-активных веществ или эмульгаторов, например, масла из растительных источников, растительных масел (таких как те, которые перечислены в 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, в открытом доступе в режиме онлайн на herbicide.adjuvants.com), парафиновых масел, эфиров жирной кислоты и многоатомного спирта, или масел с короткими цепочками молекул, модифицированных амидами или полиаминами, такими как полиэтиленимин или N-пирролидин.

[0057] Варианты реализации агентов переноса включают кремнийорганические препараты. Например, подходящий агент переноса представляет собой кремнийорганический препарат - ПАВ, который коммерчески доступен под торговой маркой SILWET L-77®, имеющий CAS № 27306-78-1 и EPA №: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, и в настоящее время доступен в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В вариантах реализации изобретения, кремнийорганический препарат - ПАВ, который коммерчески доступен под торговой маркой SILWET L-77® используется в качестве агента переноса в форме обработки спреем (применяется до, одновременно с или после нанесения композиции, содержащей полинуклеотид, как описано в данном документе) листьев растения или других поверхностей растения, свежеприготовленные концентрации в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент) ( например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента) эффективны при подготовке листа или другой поверхности растения для переноса полинуклеотида, как описано в данном документе, в растительные клетки через местное нанесение на поверхность. Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, содержащий кремнийорганический препарат, такой как Silwet L-77 в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента). Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, содержащий ПАВ, коммерчески доступный под торговой маркой SILWET L-77®, в диапазоне от около 0,3 до около 1 процента по массе (массовый процент) или около 0,5 до около 1% по массе (массовый процент).

[0058] Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, соединения, которые содержат: (a) головную группу трисилоксана, которая ковалентно связана с, (b) алкильным линкером, включая, но без ограничения, n-пропил линкер, который ковалентно связан с, (c) цепью полигликоля, которая ковалентно связана с, (d) терминальной группой. Головные группы трисилоксана таких кремнийорганических соединений включают, но без ограничения, гептаметилтрисилоксан. Алкильные линкеры могут включать, но без ограничения, n-пропил линкер. Полигликолевые цепи включают, но без ограничения, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. Полигликолевые цепи могут включать смесь, которая обеспечивает среднюю длину цепи ʺnʺ около ʺ7,5ʺ. В конкретных вариантах реализации изобретения, средняя длина цепи ʺnʺ может варьировать от около 5 дo около 14. Терминальные группы могут включать, но без ограничения, алкильные группы, такие как метильная группа. Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, трисилоксан этоксилатные поверхностно-активные вещества или полиалкиленоксид модифицированный гептаметил трисилоксан. Пример агента переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, представляет собой Соединение I:

(Соединение I: полиалкиленоксид гептаметилтрисилоксан, среднее n=7,5).

[0059] Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, используются, например, как свежеприготовленные концентрации в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента).

[0060] Варианты реализации агентов переноса включают одну или более соль, такую как хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид и сульфат аммония, представленные в или используемые в композиции, содержащей полинуклеотид, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид и/или сульфат аммония используют в концентрации от около 0,5% до около 5% (м./об.), или около 1% до около 3% (м./об.), или около 2% (м./об.). В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит соли аммония в концентрации большей или равной 300 миллимолям. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит кремнийорганический агент переноса в концентрации около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент), а также сульфат аммония в концентрации от около 80 до около 1200 миллимолей или около 150 миллимолей до около 600 миллимолей.

[0061] Варианты реализации агентов переноса включают фосфатные соли. Фосфатные соли, используемые в композиции, содержащей полинуклеотид, включают, но без ограничения, кальциевые, магниевые, калиевые или фосфат-натриевые соли. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации от около 5 миллимолей, около 10 миллимолей, или около 20 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль натрия в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит фосфатную соль натрия в диапазоне от около 10 миллимолей до около 160 миллимолей или в диапазоне от около 20 миллимолей до около 40 миллимолей. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, содержит натрий-фосфатный буфер при рН около 6,8.

[0062] Варианты реализации агентов переноса включают поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них. Поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них, включают, но без ограничения, натриевые или литиевые соли жирных кислот (таких как талловый жир или амины или фосфолипиды таллового жира) и кремнийорганические поверхностно-активные вещества. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, составлена из противоионов или других молекул, которые, как известно, связываются с молекулами нуклеиновых кислот. Не ограничивающие примеры включают, ионы тетраалкил аммония, ионы триалкил аммония, ионы сульфония, ионы лития, и полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, составлена из неполинуклеотидного гербицида, например, глифосата, ауксин-подобных гербицидов бензойной кислоты, включающих дикамбу, хлорамбен и ТВА, глуфосинат, ауксин-подобных гербицидов, включающих гербицид фенокси карбоксильной кислоты, гербицид пиридин карбоксильной кислоты, гербицид хинолин карбоксильной кислоты, гербицид пиримидин карбоксильной кислоты, и беназолин-этиловый гербицид, сульфонилмочевину, имидазолиноны, бромоксинил, делапон, циклохезанедион, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы и 4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназо ингибирующих гербицидов. В конкретных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая полинуклеотид, составлена из неполинуклеотидного пестицида, например, пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

Способы обеспечения растений с улучшенной устойчивостью к насекомым

[0063] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего повышенную устойчивость к насекомым, включающему экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую РНК, имеющую последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК, содержащую последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Несколько вариантов реализации изобретения относятся к растению, полученному с помощью такого способа. В некоторых вариантах реализации изобретения, ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК, имеющую от около 95% до около 100% ( например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичности или комплементарности последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0064] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт дополнительно содержит гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК, причем гетерологичный промотор является функционирующим в растительной клетке. ʺГетерологичныйʺ относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые обычно функционально не связаны в нативном или встречающемся в природе геноме; с помощью ʺгетерологичного промотораʺ означает, что промотор изначально функционально не связан с ДНК, кодирующей РНК. Промоторы, функционирующие в растительной клетке, содержат те, которые перечислены под заголовком ʺПромоторыʺ.

[0065] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт экспрессируется в растении путем трансгенной экспрессии или транзиторной экспрессии. В некоторых вариантах реализации изобретения, способ дополнительно включает экспрессию в растении по меньшей мере одного пестицидного агента, выбранного из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая производит инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Пестицидный агент может быть экспрессирован из того же рекомбинантного ДНК конструкта, который содержит ДНК, кодирующую РНК, или из другого рекомбинантного ДНК конструкта.

[0066] Связанный аспект представляет собой растение, имеющее повышенную устойчивость к насекомым (например, повышенную стойкость к блошкам), или семена такого растения, причем растение предусматривается способом, включающим экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую РНК, имеющую последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, причем ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую РНК, содержащую последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением не экспрессирующим рекомбинантный ДНК конструкт. В вариантах реализации изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается с помощью экспрессирования в растениях канолы или масличного рапса полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, нацеливающегося на один или более генов Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), например, в котором ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. Несколько вариантов реализации изобретения относятся к плоду, семенам, или частям, пригодными для размножения растения, предусмотренным этим способом, и проявляющих повышенную устойчивость к насекомым. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которое может контролироваться с помощью экспрессии у растения рекомбинантного ДНК конструкта соответственно этому способу. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены в рубрике ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для обеспечения декоративного растения или сельскохозяйственного растения с повышенной устойчивостью к блошкам. Различные варианты реализации способа включают те, в которых растение представляет собой растение из семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. В других вариантах реализации изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum. В варианте осуществления способ предусматривает растение картофеля с повышенной устойчивостью к Epitrix cucumeris (картофельной блошке).

[0067] Варианты реализации способов предусматривают растение, имеющее повышенную стойкость к одному или более видов блошек, например, виду рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах реализации изобретения, насекомое выбирается из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах реализации изобретения, способ предусматривает растение, имеющее улучшенную устойчивость к насекомым, выбранным из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения, способ разработан для конкретных генов-мишеней у данного вида насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (блошки полосатой), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта цепь дцРНК, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта дцРНК, содержащую цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (блошке полосатой), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта дцРНК, содержащую цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта дцРНК, содержащую цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или их фрагмента.

Рекомбинантный ДНК конструкт, кодирующий РНК для борьбы с насекомым

[0069] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к рекомбинантному ДНК конструкту, содержащему гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0070] В некоторых вариантах реализации рекомбинантного ДНК конструкта, РНК транскрипт содержит по меньшей мере одну РНК цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100%) идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт формирует дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь, содержащую по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую по меньшей мере одну РНК цепь, содержащую последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, РНК транскрипт представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь, содержащую последовательность, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента.

[0071] В некоторых вариантах реализации рекомбинантного ДНК конструкта, гетерологичный промотор является функционирующим для экспрессирования РНК транскрипта в бактерии. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых рекомбинантный ДНК конструкт должен экспрессироваться в бактерии, бактерию выбирают из группы, состоящей из Escherichia coli, видов Bacillus, видов Pseudomonas, видов Xenorhabdus или видов Photorhabdus. В других вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит гетерологичный промотор, который является функционирующим в растительной клетке.

[0072] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержится в рекомбинантном векторе, таком как вектор рекомбинантного растительного вируса или рекомбинантный вектор бакуловируса. В вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт интегрирован в растительную хромосому или пластиду, например, путем стабильной трансформации.

[0073] Связанные аспекты включают трансгенную растительную клетку, содержащую в своем геноме рекомбинантный ДНК конструкт, и трансгенное растение, содержащее такую трансгенную растительную клетку. Трансгенные растительные клетки и растения созданы с помощью способов, известных в данной области техники, таких как описанные под заголовком ʺСоздание и использование трансгенных растительных клеток и трансгенных растенийʺ. Дополнительные аспекты включают товарный продукт, полученный из такого трансгенного растения, и семян трансгенного потомства или частей трансгенного растения, пригодных для размножения.

Дополнительная информация и методы

Растения

[0074] Способы и композиции, описанные в данном документе, для лечения и защиты растений от насекомых-вредителей могут быть использованы у широкого спектра растений. Подходящие растения, у которых способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы, включают, но без ограничения, зерновые и кормовые травы (рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, овес, сорго, просо, пальчатое просо, кормовые травы холодного сезона и гречку заметную), масличные культуры (сою, масличные рода капусты, включая канолу и масличный рапс, подсолнечник, арахис, лен, кунжут и сафлор), бобовые, зерновые и кормовые растения (обыкновенную фасоль, китайскую вигну, горох, стручковую фасоль, чечевицу, фасоль остролистную, азиатскую фасоль, голубиный горох, вику, нут, люпин, люцерну и клеверы), фрукты и орехи умеренного пояса (яблоко, грушу, персик, сливы, ягодные культуры, вишни, виноград, оливы, миндаль и грецкий орех), тропические и субтропические фрукты и орехи (цитрусовые, включая лимоны, апельсины и грейпфруты; банан и банан райский, ананас, папайю, манго, авокадо, киви, маракуйю и хурму), овощные культуры (растения семейства пасленовых, включая помидоры, баклажаны и перцы; овощи рода капуста; редис, морковь, тыквы, луки, спаржи и листовые овощи), сахарные, клубневые и лубяные культуры (сахарный тростник, сахарную свеклу, стевию, картофель, сладкий картофель, маниоку и хлопок), плантационные культуры, декоративные растения и газонные травы (табак, кофе, какао, чай, каучуковое дерево, лекарственные растения, декоративные растения и газонные травы) и виды лесных деревьев. Конкретные виды растений представляющих интерес, являются растениями семейства Brassicaceae, включая виды рода Brassica B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii и B. fructiculosa. Дополнительными видами растений, представляющих интерес, являются Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

Дополнительные элементы конструкта

[0075] Варианты реализации изобретения полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, могут содержать дополнительные элементы, такие как промоторы, сайты распознавания малых РНК, аптамеры и рибозимы и дополнительные кассеты экспрессии для экспрессирования кодирующих последовательностей (например, для экспрессирования трансгенов, таких как инсектицидный белок или выбираемый маркер) или некодирующих последовательностей (для экспрессирования дополнительных элементов подавления). Например, аспект обеспечивает рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента. В другом варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей: (a) РНК транскрипт, содержащий последовательность, имеющую от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724 или их фрагмента, и (b) аптамер, стабильно интегрированный в растительный геном, из которого РНК транскрипт, содержащий РНК аптамер и подавленный элемент РНК, экспрессируются в клетках растения; аптамер служит для направления подавленного элемента РНК в нужное место в клетке. В другом варианте реализации изобретения, включение одного или более сайтов распознавания для связывания и расщепления с помощью малых РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которые экспрессируются только в определенной клетке или ткани) позволяет более точно экспрессировать паттерны в растении, в котором экспрессия рекомбинантного ДНК конструкта подавляется, где экспрессируются малые РНК. Такие дополнительные элементы описаны ниже.

Промоторы

[0076] Промоторы, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, являются функциональными в клетке, в которой данная конструкция предназначена для транскрипции. Как правило, эти промоторы являются гетерологичными промоторами, как используется в рекомбинантных конструктах, т. e., они не обнаружены в природе функционально связанными с другими нуклеиновыми элементами, используемыми в конструктах. В различных вариантах реализации изобретения, промотор является выбранным из группы, состоящей из конститутивного промотора, пространственно специфического промотора, специфического во времени промотора, связанного с развитием специфического промотора и индуцибельного промотора. Во многих вариантах реализации изобретения, промотор представляет собой промотор функциональный в растении, например, pol II промотор, pol III промотор, pol IV промотор, или pol V промотор.

[0077] Неконститутивные промоторы, пригодные для применения с конструктами рекомбинантной ДНК, описанными в данном документе, включают пространственно специфические промоторы, специфические во времени промоторы и индуцибельные промоторы. Пространственно специфические промоторы могут включать органелло-, клеточно-, ткане- или органоспецифические промоторы ( например, пластидспецифический, корнеспецифический, пыльцаспецифический или семяспецифический промотор для экспрессии в пластидах, корнях, пыльце или семенах соответственно). Во многих случаях особенно полезен семяспецифический, эмбрионоспецифический, алейроноспецифический или эндоспермоспецифический промотор. Специфические во времени промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию промотировать экспрессию во время конкретных стадий развития в цикле роста растения или в течение различного времени дня или ночи, или в различные времена года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами или условиями окружающей среды, таким как, но без ограничения, биотический или абиотический стресс (например, недостаток воды или засуха, жара, холод, высокие или низкие количества питательных веществ или соли, высокие или низкие уровни света, или вредитель, или патогенная инфекция). Промоторы микроРНК могут быть использованы, особенно те, которые имеют паттерн временной специфичности, пространственной специфичности или индуцибельной специфичности; примеры миРНК промоторов, а также способов для идентификации миРНК промоторов, имеющих специфические паттерны экспрессии, представлены в публикации заявки на патент США 2006/0200878, 2007/0199095 и 2007/0300329, которые специально включены в данный документ посредством ссылки. Промотор со специфической экспрессией может также включать промоторы, которые обычно конститутивно экспрессируются, но с разной степенью или "силой" экспрессии, включая промоторы, обычно рассматриваемые как "сильные промоторы" или как "слабые промоторы.

[0078] Промоторы, представляющие особый интерес, включают следующие примеры: промотор опалинсинтазы, выделенный из Т-ДНК Agrobacterium; промотор вируса мозаики цветной капусты 35S; усовершенствованные промоторные элементы или химерные промоторные элементы, такие как усовершенствованный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, связанный с энхансерным элементом (интрон белка теплового шока 70 Zea mays); корнеспецифические промоторы, такие как те, что описаны в патентах США 5837848; 6437217 и 6426446; промотор L13 олеозина кукурузы, описанный в патенте США 6433252; промотор для гена ядра растения, кодирующий локализованную в пластиде альдолазу, описанный в публикации заявки на патент США 2004/0216189; холодо-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6084089; солеиндуцибельные промоторы, описанные в патенте США № 6140078; светоиндуцибельные промоторы, описанные в патенте США 6294714; патоген-индуцибельные промоторы, описанные в патенте США 6252138; и водного дефицита индуцибельные промоторы, описанные в публикации заявки на патент США 2004/0123347 A1. Все описанные выше патенты и патентные публикации, описывающие промоторы и их использование, особенно в рекомбинантных ДНК конструктах, функциональных в растениях, включены в данный документ посредством ссылки.

[0079] Интересующие растительные сосудо- или флоэмоспецифические промоторы включают rolC или rolA промотор Agrobacterium rhizogenes, промотор Т-ДНК гена 5 Agrobacterium tumefaciens, промотор гена RSs1 сахарозосинтазы риса, промотор баднавируса желтой крапчатости Commelina, промотор вируса лиственного распада кокоса, промотор палочковидного вируса риса тунгро, промотор гена GS3A глутамин синтетазы гороха, промоторы генов invCD111 и invCD141 инвертазы картофеля, промотор, изолированный из Arabidopsis, который имеет флоэмоспецифическую экспрессию у табака, что показано Kertbundit и др. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 88:5212-5216, промотор VAHOX1 участка, промотор гена инвертазы клеточной стенки гороха, промотор гена кислой инвертазы из моркови, промотор гена сульфат транспортера Sultr1;3, промотор гена синтазы сахарозы растения и промотор гена переносчика сахарозы растений.

[0080] Промоторы, пригодные для применения с конструктом рекомбинантной ДНК или полинуклеотидом, описанными в данном документе, включают промоторы полимеразы II (ʺpol IIʺ) и промоторы полимеразы III (ʺpol IIIʺ). РНК полимераза II транскрибирует структурные и каталитические РНК, которые обычно короче, чем 400 нуклеотидов в длину, и распознает простой запуск Т-остатков в качестве сигнала терминации; она была использована для транскрибирования миРНК дуплексов (см., например, Lu et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32:e171). Промоторы рol II являются предпочтительными в некоторых вариантах реализации изобретения, где короткий РНК-транскрипт должен быть получен из рекомбинантного ДНК конструкта. В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит промотор pol II для экспрессирования РНК транскрипта, фланкированного с помощью саморасщепляющихся последовательностей рибозима (например, саморасщепляющихся рибозимов типа «hammerhead»), в результате чего обработанная РНК, такая как одноцепочечная РНК, которая связывается с транскриптом гена-мишени блошки, с определенными 5ʹ и 3ʹ концами, свободна от потенциально интерферирующих фланкирующих последовательностей. В альтернативном подходе используются промоторы pol III для создания транскриптов с относительно определенными 5ʹ и 3ʹ концами, т. e., для транскрибирования РНК с минимальными 5ʹ и 3ʹ фланкирующими последовательностями. В некоторых вариантах реализации изобретения, промоторы pol III (например, промоторы U6 или H1) являются предпочтительными для добавления короткого AT-насыщенного сайта терминации транскрипции, что приводит к образованию 2 пар оснований липких концов (UU) в транскрибируемой РНК; это полезно, например, для экспрессии конструктов миРНК-типа. Сообщалось об использование промоторов pol III для запуска экспрессии конструктов миРНК; см. van de Wetering и др. (2003) EMBO Rep., 4: 609-615, и Tuschl (2002) Nature Biotechnol., 20: 446-448. Промоторы бакуловируса, такие как полиэдрин бакуловируса и промоторы p10, известны в данной области техники и коммерчески доступны; см., например, Invitrogenʹs ʺGuide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniquesʺ, 2002 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и F. J. Haines и др. ʺBaculovirus Expression Vectorsʺ, без указания даты (Oxford Expression Technologies, Оксфорд, Великобритания).

[0081] Элемент промотора может содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые не являются природными промоторами, или промоторными элементами или их гомологами, но которые могут регулировать экспрессию гена. Примеры таких "ген независимых" регуляторных последовательностей включают природные или искусственно созданные последовательности РНК, которые содержат лиганд-связывающий участок, или аптамер (см. ʺАптамерыʺ, ниже) и регуляторный участок (который может быть цис-активным). См., например, Isaacs и др. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841-847, Bayer и Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, Mandal и Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463, Davidson and Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23:109-112, Winkler и др. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan и др. (2003) RNA, 9:644-647, и Mandal и Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35. Такие "риборегуляторы" можно выбирать или конструировать для конкретной пространственной или временной специфичности, например, для регуляции трансляции ДНК, которая кодирует подавленный элемент гена-мишени только в присутствии (или в отсутствие) данной концентрации подходящего лиганда. Одним из примеров является риборегулятор, который является чувствительным к эндогенному лиганду (например, жасмоновой кислоте или салициловой кислоте), вырабатываемому растением в условиях стресса (например, абиотического стресса, такого как вода, температура, или стресса питательных веществ, или биотического стресса, такого как прикрепление вредителей или патогенов); при стрессе, уровень эндогенного лиганда увеличивается до уровня, достаточного риборегулятору для начала транскрипции ДНК, которая кодирует подавленный элемент для подавления гена-мишени.

Сайты рекомбиназы

[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержит ДНК, кодирующую один или более сайтов узнавания сайт-специфической рекомбиназы. В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит по меньшей мере пару сайтов loxP, причем сайт-специфическая рекомбинация ДНК между сайтами loxP опосредуется Cre-рекомбиназой. Положения и относительная ориентация сайтов loxP выбранны для достижения желаемой рекомбинации; например, когда сайты loxP находятся в той же ориентации, ДНК между сайтами loxP вырезают в круговой форме. В другом варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую один сайт loxP; в присутствии Cre-рекомбиназы и другой ДНК с сайтом loxP, две ДНК рекомбинируются.

Аптамеры

[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, которая обрабатывается в РНК аптамер, то есть РНК, которая связывается с лигандом по механизму связывания, который, прежде всего, не основан на спаривании оснований по Уотсон-Крику (в противоположность, например, спариванию оснований, происходящему между комплементарными, антипараллельными цепями нуклеиновой кислоты с образованием структуры двухцепочечной нуклеиновой кислоты). См., например, Ellington и Szostak (1990) Nature, 346:818-822. Примеры аптамеров могут быть найдены, например, в общедоступной базе данных аптамеров на сайте aptamer.icmb.utexas.edu (Lee et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32(1):D95-100). Аптамеры могут, однако, быть моновалентными (связывающими один лиганд) или поливалентными (связывающими более чем один отдельный лиганд, например, связывающими одну единицу из двух или более различных лигандов).

[0084] Лиганды содержат любую молекулу (или часть молекулы), которая может быть распознана и будет связана с помощью нуклеиновой кислоты вторичной структуры с помощью механизма, прежде всего, не основанного на спаривании оснований по Уотсон-Крику. Таким образом, распознавание и связывание лиганда и аптамера аналогично антигену и антителу, или биологическому эффектору и рецептору. Лиганды могут содержать единичные молекулы (или часть молекулы), или сочетание двух или более молекул (или частей молекул), и могут содержать один или более макромолекулярных комплексов (например, полимеров, липидных бислоев, липосом, клеточных мембран или других клеточных структур, или клеточных поверхностей). Примеры специфических лигандов включают витамины, такие как коэнзим B12 и тиаминпирофосфат, флавинмононуклеотид, гуанин, аденозин, S-аденозилметионин, S-аденозилгомоцистеин, коэнзим A, лизин, тирозин, дофамин, глюкозамин-6-фосфат, кофеин, теофиллин, антибиотики, такие как хлорамфеникол и неомицин, гербициды, такие как глифосат и дикамба, белки, включая вирусные или фаговые белки оболочки и эпидермальные или поверхностные белки пищеварительного тракта беспозвоночного, и РНК, включая вирусную РНК, транспортную РНК (т-РНК), рибосомную РНК (рРНК) и РНК полимеразы, такие как РНК-зависимые РНК полимеразы (РзРп). Одним классом РНК аптамеров являются "термовыключатели", которые не связывают лиганд, но являются термочувствительными, то есть, конформация аптамера определяется температурой; см., например, вставку 3 в Mandal и Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463.

Трансгенные транскрипционные единицы

[0085] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид, описанные в данном документе, содержат трансгенную транскрипционную единицу. Трансгенная транскрипционная единица содержит последовательность ДНК, кодирующую интересующий ген, например, природный белок или гетерологичный белок. Представляющий интерес ген может быть кодирующей или некодирующей последовательностью любых видов (включая, но без ограничения, не эукариотов, таких как бактерии и вирусы; грибы, протисты, растения, беспозвоночные и позвоночные животные). Конкретные гены, представляющие интерес, являются генами, кодирующими один или более белков, придающих устойчивость к гербициду, и генами, кодирующими по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus и инсектицидного белка, производимого с помощью Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Трансгенная транскрипционная единица может дополнительно содержать 5ʹ или 3ʹ последовательность или обе, как требуется для транскрипции трансгена.

Интроны

[0086] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую сшивающий интрон. ʺИнтронʺ обычно означает сегмент ДНК (или РНК, транскрибированную из такого сегмента), который расположен между экзонами (белок-кодирующими сегментами ДНК или соответствующей транскрибированной РНК), причем, в ходе созревания матричной РНК, интрон является ферментативно "сращенным из" или удаленным из цепи РНК с помощью процесса расщепления/лигирования, который происходит в ядре эукариот. Термин ʺинтронʺ также применяется для некодирующих последовательностей ДНК, которые транскрибируются в сегменты РНК, которые могут быть сращены из созревающего РНК-транскрипта, но интроны не обнаружены между белок-кодирующих экзонами. Одим из примеров таких являются сшивающие последовательности, которые обладают способностью усиливать экспрессию расположенной ниже кодирующей последовательности в растениях (в некоторых случаях, особенно, у однодольных); эти сшивающие последовательности в норме расположены в 5ʹ нетранслируемом участке некоторых генов растений, а также в некоторых вирусных генах (например, 5ʹ лидерная последовательность вируса табачной мозаики или ʺомегаʺ лидер, описанные как усиливающие экспрессию генов растений в Gallie и Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20:4631-4638). Эти сшивающие последовательности или ʺусиливающие экспрессию интроныʺ могут быть искусственно вставлены в 5ʹ нетранслируемый участок гена растения между промотором, но до любого из белок-кодирующих экзонов. Примеры таких усиливающих экспрессию интронов включают, но без ограничения, алкогольдегидрогеназу кукурузы (Zm-Adh1), Bronze-1 усиливающий экспрессию интрон кукурузы, интрон актина 1 (Os-Act1) риса, Shrunken-1 (Sh-1) интрон, интрон синтетазы сахарозы кукурузы, интрон белка теплового шока 18 (hsp18) и интрон белка теплового шока 82 килодальтон (hsp82). Патенты США 5593874 и 5859347, специально включенные в данный документ посредством ссылки, описывают способы улучшения рекомбинантных ДНК конструктов для применения у растений с помощью включения усиливающего экспрессию интрона, полученного из белка теплового шока 70 килодальтон (hsp70) в нетранслируемом лидере, расположенном в 3' от промотора гена и 5' от первого белок-кодирующего экзона.

Рибозимы

[0087] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую один или более рибозимов. Рибозимы, представляющие особый интерес, включают саморасщепляющийся рибозим, рибозим со структурой "hammerhead" или рибозим со структурой "шпильки". В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую один или более рибозим, которые служат для расщепления транскрибируемой РНК для получения определенных сегментов РНК, таких как отдельные смысловые или анти-смысловые одноцепочечные сегменты РНК (которые в вариантах реализации изобретения гибридизируются с образованием дцРНК), или сегмент РНК, имеющий самокомплементарные нуклеотидные последовательности, которые формируют по меньшей мере частично дцРНК (например, в стебель-петля структуру) для подавления гена-мишени блошки.

Элементы супрессии генов

[0088] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую дополнительный элемент супрессии гена для подавления гена-мишени, отличного от гена-мишени блошки. Ген-мишень, который должен быть подавлен может содержать кодирующую или не кодирующую последовательность или обе.

[0089] Подходящие элементы супрессии гена подробно описаны в публикации заявки на патент США 2006/0200878, описание которых специально включено в данный документ посредством ссылки, и содержат один или более из:

(a) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмент анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;

(b) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;

(c) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмент смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(d) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(e) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит по меньшей мере один сегмент анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и по меньшей мере один сегмент смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(f) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит многочисленные серии сегментов анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми к меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленным сериям сегментов смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(g) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен, с помощью формирования многочисленных двойных цепочек РНК и содержит многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми по меньшей мере к одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленными сегментами смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен, и при этом многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК и многочисленные сегменты смысловой ДНК расположены в серии инвертированных повторов;

(h) ДНК, которая содержит нуклеотиды, полученные из растительной микроРНК;

(i) ДНК, которая содержит нуклеотиды миРНК;

(j) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом; и

(k) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную к регулированию экспрессии гена, который должен быть подавлен, причем регулирование зависит от конформации регуляторных РНК и конформация регуляторной РНК аллостерически влияет на состояния связывания РНК аптамеров.

[0090] В некоторых вариантах реализации изобретений, интрон используется для доставки элемента супрессии гена в отсутствии любого белок-кодирующего экзона (кодирующей последовательности). В одном примере, интрон, такой как усиливающий экспрессию интрон (предпочтительный в конкретных вариантах реализации изобретения), прерывается путем встраивания в интрон элемента супресси гена, причем, при транскрипции элемент супресси гена вырезается из интрона. Таким образом, белок-кодирующие экзоны не требуются для обеспечения функции супрессии гена конструктов рекомбинантной ДНК, описанных в данном документе.

Транскрипционные регуляторные элементы

[0091] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую транскрипционный регуляторный элемент. Транскрипционные регуляторные элементы содержат элементы, которые регулируют уровень экспрессии рекомбинантного ДНК конструкта (относительно их экспрессии в отсутствии таких регуляторных элементов). Примеры подходящих транскрипционных регуляторных элементов включают рибопереключатель (цис- или транс-действующие), стабилизирующие транскрипт последовательности и сайты узнавания микроРНК, как подробно описано в публикации заявки на патент США 2006/0200878, специально включенной в данный документ посредством ссылки.

Трансгенные растительные клетки и трансгенные растения

[0092] Рекомбинантные ДНК конструкты, описанные в данном документе, могут быть cложены с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей, (например, в случае трансформированных растений, особенности включают устойчивость к гербицидам, устойчивость к вредителям, устойчивость к холодному проращиванию, устойчивость к водному дефициту и так далее) например, с помощью экспрессирования или подавления других генов. Конструкты для скоординированного уменьшения и увеличения экспрессии генов представлены в публикации заявки на патент США 2004/0126845 A1, специально включенной в качестве ссылки.

[0093] В конкретных трансгенных растительных клетках и трансгенных растениях, иногда желательно, чтобы одновременно экспрессировался интересующий ген, в то время как также модулируется экспрессия гена-мишени блошки. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретений, трансгенное растение содержит рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую элемент экспрессии гена для экспрессирования по меньшей мере одного интересующего гена, и транскрипция рекомбинантного ДНК конструкта для борьбы с блошкой предпочтительно осуществляется с одновременной транскрипцией элемента экспрессии гена. В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК транскрипт, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую не-нуклеотидный пестицидный агент, такой как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент; такие ДНК могут быть сложены в один рекомбинантный конструкт или экспрессионную кассету, или, альтернативно, могут быть экспрессированы из дискретных рекомбинантных конструкций или кассет экспрессии. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататин, растительные лектины, фитоэкдистероиды, и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки из Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae). В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК транскрипт, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую один или более белков, отвечающих за толерантность к гербицидам. Примеры белков, отвечающих за толерантность к гербицидам включают 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS; см., например, патенты США № 5627061, 5633435 RE39247, 6040497 и 5094945, и PCT международную публикацию заявки на патент WO04074443 и WO04009761), глифосат оксидоредуктазу (GOX; патент США № 5463175), глифосата декарбоксилазу (PCT международная публикация заявки на патент WO05003362, патент США № 7405347 и публикация заявки на патента США 2004/0177399), глифосат-N-ацетил трансферазу (GAT; патент США № 7714188) отвечающую за толерантность к глифосату; дикамбу монооксигеназу, отвечающую за толерантность к ауксин-подобным гербицидам, таким как дикамба (патент США № 7105724); фосфинотрицин ацетилтрансферазу (pat или bar), отвечающую за толерантность к фосфинотрицину или глюфосинату (патент США № 5646024); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты, отвечающую за толерантность к 2,2-дихлорпропионовой кислоте (Далапон) (PCT международная публикация заявки на патент WO9927116); ацетогидроксиацид синтазу или ацетолактатсинтазу, отвечающие за толерантность к ингибиторам ацетолактатсинтазы, таким как сульфонилмочевина, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты и фталид (патент США № 6225105); галоарилнитрилазу (Bxn) для придания устойчивости к бромоксинилу (патент США № 4810648); модифицированную ацетил-коэнзим A карбоксилазу для придания устойчивости к циклогексанэдиону (сетоксидим) и арилоксифеноксипропионату (галоксифоп) (патент США № 6414222); дигидроптероат синтазу (sul I) для придания устойчивости к сульфонамидным гербицидам (патент США № 5719046); полипептид 32 кДa фотосистемы II (psbA) для придания устойчивости к триазиновым гербицидам (Hirschberg et al., 1983, Science, 222:1346-1349); антранилат синтазу для придания устойчивости к 5-метилтриптофану (патент США № 4581847); синтазу дигидродипиколиновой кислоты (dap A) для придания устойчивости к аминоэтил цистеину (PCT международная публикация заявки на патент WO8911789); фитоен десатуразу (crtI) для придания устойчивости к пиридазиноновым гербицидам, таким как норфлуразон (патент Японии JP06343473); гидроксифенилпируват диоксигеназу, оксидазу 4-гидроксифенилуксусной кислоты и 4-гидроксифенилуксусную 1-гидролазу (патент США 7304209) для придания устойчивости к циклопропилизоксазоловым гербицидам, таким как изоксафлютол (патент США № 6268549); модифицированную протопорфириноген оксидазу I (protox) для придания устойчивости к ингибиторам протопорфириногеноксидазы (патент США № 5939602); арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD-1) для придания устойчивости к гербициду, содержащему компонент арилоксиалканоата (WO05107437); серин гидроксиметилтрансферазу (в публикации заявки на патента США 2008/0155716), глюфосинат-толерантную глютамин синтетазу (в публикации заявки на патента США 2009/0018016). Примеры таких гербицидов включают фенокси ауксины (такие как 2,4- D и дихлорпроп), пиридоксин ауксины (такие как флуроксипир и трихлопир), ингибиторы арилоксифеноксипропионат (AOPP) ацетилкоэнзим A карбоксилазы (ACCase) (такие как галоксифоп, хизалофоп и диклофоп), и ингибиторы 5-замещенной феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Нуклеотидные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки гербицид-толерантности и последовательности белков гербицид-толерантности, как описано в патенте США и публикациях заявки на патент, цитируемые в этом параграфе, включены в данный документ посредством ссылки.

[0094] В некоторых вариантах реализации изобретения, конструкты рекомбинантный ДНК, описанные в данном документе, могут быть транскрибированы в любой растительной клетке или ткани или в целом растении на любой стадии развития. Трансгенные растения могут быть получены из любого однодольного или двудольного растения, такого как, но без ограничения, растения коммерческого или сельскохозяйственного интереса, такие как культурные растения (особенно сельскохозяйственные растения, используемые для продуктов питания человека или корма для животных), дерево- или целлюлозо-продуцирующие деревья, овощные растения, плодовые растения и декоративные растения. Примеры растений, представляющих интерес, включают растения зерновых злаков (таких как пшеница, овес, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, квиноа, амарант и гречку); растения кормовых культур (например, кормовые травы и кормовые двудольные включая люцерну, вику, клевер и т.п.); растения масличных культур (таких как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канолу, рапс, лен, арахис и масличную пальму); древесные орехи (такие как грецкий орех, кешью, фундук, пекан, миндаль, и т.п.); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, оливу, сахарную свеклу, чай, кофе; дерево- или целлюлозно-продуцирующие деревья; растения овощных культур, таких как бобовые (например, фасоли, горохи, чечевицы, люцерна, арахис), салат-латук, спаржа, артишоки, сельдерей, морковь, редис, крестоцветные (например, капусты, кормовые капусты, горчицы и другие листовые крестоцветные, брокколи, цветная капусту, брюссельскую капусту, репу, кольраби), пищевые тыквенные (например, огурцы, дыни, летние тыквы, зимние тыквы), пищевые луковые (например, луки, чеснок, луки-порей, луки-шалот, лук-резанец), съедобные представители семейства Solanaceae (например, помидоры, баклажаны, картофель, перец, физалис), и съедобные представители семейства Chenopodiaceae (например, свекла, мангольд, шпинат, квиноа, амарант); растения плодовых культур, таких как яблоки, груши, цитрусовые (например, апельсин, лайм, лимон, грейпфрут и другие), косточковые плоды (например, абрикос, персик, слива, нектарин), банан, ананас, виноград, киви, папайя, авокадо, и ягоды; растения, выращенные для биомассы или биотоплива (например, травы Miscanthus, просо, ятрофа, масличная пальма, эукариотические микроводоросли, такие как Botryococcus braunii, Chlorella spp. и Dunaliella spp., и эукариотические макроводоросли, такие как Gracilaria spp. и Sargassum spp.); и декоративные растения, включая декоративные цветущие растения, декоративные деревья и кустарники, декоративные почвопокровные растения и декоративные травы. Конкретные виды растений, представляющих интерес, в которых транскрибируется рекомбинантный ДНК конструкт для обеспечения устойчивости к блошкам, являются растениями из семейства Brassicaceae, включающие виды рода Brassica B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Дополнительными видами растений, представляющих интерес, в которых транскрибируется рекомбинантный ДНК конструкт для обеспечения устойчивости к блошкам, являются Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocos nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxima, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0095] Кроме того, в данном документе описаны товарные продукты, полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян, экспрессирующих рекомбинантный ДНК конструкт, придающий повышенную устойчивость к блошкам, описанным в данном документе, включающие, но без ограничения, собранные листья, корни, побеги, клубни, стебли, плоды, семена или другие части растения, муку, масла, экстракты, продукты ферментации или расщепления, дробленные или цельные зерна или семена растения, или любой пищевой или непищевой продукт, включая такие товарные продукты, полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян как описано в данном документе. Обнаружение одной или более последовательностей нуклеиновой кислоты конструктов рекомбинантной ДНК для борьбы с блошками, как описано в данном документе, в одном или более товаров или товарных продуктах, рассмотренных в данном документе, является de facto доказательством того, что товар или товарный продукт содержит или получен из трансгенной клетки растения, растения или семян, экспрессирующих такой рекомбинантный ДНК конструкт.

[0096] Как правило, трансгенное растение, имеющее в своем геноме рекомбинантный ДНК конструкт, как описано в данном документе, проявляет повышенную стойкость к заражению насекомым, в частности, повышенную устойчивость к заражению блошкой. В различных вариантах реализации изобретения, например, где трансгенное растение экспрессирует рекомбинантный ДНК конструкт для борьбы с блошкой, который сложен с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей, трансгенное растение имеет по меньшей мере один дополнительный измененный признак по отношению к растению с отсутствующим рекомбинантным ДНК конструктом, выбранный из группы признаков, состоящей из:

(a) повышенной толерантности к абиотическому стрессу;

(b) повышенной толерантности к биотическому стрессу;

(c) модифицированного состава первичных метаболитов;

(d) модифицированного состава вторичных метаболитов;

(e) модифицированного состава микроэлементов, каротиноидов или витаминов;

(f) повышенного урожая;

(g) повышенной способности усваивать азот, фосфат или другие питательные вещества;

(h) модифицированных агротехнических характеристик;

(i) модифицированных характеристик роста и репродукции

(j) улучшенного качества сбора урожая, хранения и обработки.

[0097] В некоторых вариантах реализации изобретения, трансгенное растение характеризуется повышенной толерантностью к абиотическому стрессу (например, толерантностью к недостатку воды или засухе, тепловому, холодовому стрессу, неоптимальным уровням питательных веществ или соли, неоптимальным уровням освещенности) или к биотическому стрессу (например, перенаселению, аллелопатии или скарификации); модифицированным составом первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода); модифицированным составом вторичных метаболитов (например, алкалоидов, терпеноидов, поликетидов, нерибосомных пептидов и вторичных метаболитов смешанного биосинтетического происхождения); модифицированным составом микроэлементов (например, железа, цинка), каротиноидов (например, β-каротина, ликопена, лютеина, зеаксантина или других каротиноидов и ксантофиллов) или витаминов (например, токоферолов); повышенным урожаем (например, повышенным урожаем в условиях отсутствия стресса или повышенным урожаем в условиях биотического или абиотического стресса); повышенной способностью усваивать азот, фосфат или другие питательные вещества; модифицированными агротехническими характеристиками (например, замедленным созреванием; замедленным старением; более ранней или более поздней спелостью; повышенной толерантностью к тени; повышенной устойчивостью к полеганию корней и стеблей; повышенной устойчивостью к "разрыву" стеблей; модифицированным ответом на фотопериод); модифицированными характеристиками роста и репродукции (например, преднамеренной карликовостью; преднамеренной мужской стерильностью, пригодной, например, в методиках улучшения гибридизации; повышенной скоростью вегетативного роста; улучшенным прорастанием; повышенной мужской или женской фертильностью); улучшенными свойствами для сбора урожая, хранения и качества обработки (например, повышенной устойчивостью к вредителям при хранении, повышенной устойчивостью к повреждениям, большей привлекательностью для потребителя) или любой комбинацией этих признаков.

[0098] В другом варианте реализации изобретения, трансгенные семена или семена, образуемые трансгенным растением, имеют модифицированный состав первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода), модифицированный состав вторичных метаболитов, модифицированный состав микроэлементов, каротиноидов или витаминов, улучшенные свойства для сбора урожая, хранения и качества обработки или их комбинацию. В другом варианте реализации изобретения, может быть желательно изменить уровни нативных компонентов трансгенного растения или семян трансгенного растения, например, уменьшить уровни аллергенного белка или гликопротеина или токсичного метаболита.

Примеры

Пример 1

[0099] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации кодирующих ДНК последовательностей, используемых в качестве генов-мишеней для борьбы с видами насекомых и для изготовления композиций для борьбы с насекомыми и устойчивых к насекомым трансгенных растений, и определяет последовательности дцРНК триггера, полезного для борьбы с видами насекомых. Более конкретно, варианты реализации генов-мишеней, идентифицированных по имени (аннотации) и идентификатору последовательности (SEQ ID NO.), для борьбы с блошками представлены в SEQ ID NO: 1-859, и варианты реализации последовательностей дцРНК триггера, расположенные по размеру от 135 дo 352 пар оснований и сконструированные для подавления этих генов-мишеней, представлены в SEQ ID NO: 860-1718.

Таблица 1

Ген-мишень SEQ ID NO. Триггер SEQ ID NO.* Ген-мишень SEQ ID NO. Триггер SEQ ID NO.* Ген-мишень SEQ ID NO. Триггер SEQ ID NO.* Ген-мишень SEQ ID NO. Триггер SEQ ID NO.*
1 860 216 1075 431 1290 646 1505
2 861 217 1076 432 1291 647 1506
3 862 218 1077 433 1292 648 1507
4 863 219 1078 434 1293 649 1508
5 864 220 1079 435 1294 650 1509
6 865 221 1080 436 1295 651 1510
7 866 222 1081 437 1296 652 1511
8 867 223 1082 438 1297 653 1512
9 868 224 1083 439 1298 654 1513
10 869 225 1084 440 1299 655 1514
11 870 226 1085 441 1300 656 1515
12 871 227 1086 442 1301 657 1516
13 872 228 1087 443 1302 658 1517
14 873 229 1088 444 1303 659 1518
15 874 230 1089 445 1304 660 1519
16 875 231 1090 446 1305 661 1520
17 876 232 1091 447 1306 662 1521
18 877 233 1092 448 1307 663 1522
19 878 234 1093 449 1308 664 1523
20 879 235 1094 450 1309 665 1524
21 880 236 1095 451 1310 666 1525
22 881 237 1096 452 1311 667 1526
23 882 238 1097 453 1312 668 1527
24 883 239 1098 454 1313 669 1528
25 884 240 1099 455 1314 670 1529
26 885 241 1100 456 1315 671 1530
27 886 242 1101 457 1316 672 1531
28 887 243 1102 458 1317 673 1532
29 888 244 1103 459 1318 674 1533
30 889 245 1104 460 1319 675 1534
31 890 246 1105 461 1320 676 1535
32 891 247 1106 462 1321 677 1536
33 892 248 1107 463 1322 678 1537
34 893 249 1108 464 1323 679 1538
35 894 250 1109 465 1324 680 1539
36 895 251 1110 466 1325 681 1540
37 896 252 1111 467 1326 682 1541
38 897 253 1112 468 1327 683 1542
39 898 254 1113 469 1328 684 1543
40 899 255 1114 470 1329 685 1544
41 900 256 1115 471 1330 686 1545
42 901 257 1116 472 1331 687 1546
43 902 258 1117 473 1332 688 1547
44 903 259 1118 474 1333 689 1548
45 904 260 1119 475 1334 690 1549
46 905 261 1120 476 1335 691 1550
47 906 262 1121 477 1336 692 1551
48 907 263 1122 478 1337 693 1552
49 908 264 1123 479 1338 694 1553
50 909 265 1124 480 1339 695 1554
51 910 266 1125 481 1340 696 1555
52 911 267 1126 482 1341 697 1556
53 912 268 1127 483 1342 698 1557
54 913 269 1128 484 1343 699 1558
55 914 270 1129 485 1344 700 1559
56 915 271 1130 486 1345 701 1560
57 916 272 1131 487 1346 702 1561
58 917 273 1132 488 1347 703 1562
59 918 274 1133 489 1348 704 1563
60 919 275 1134 490 1349 705 1564
61 920 276 1135 491 1350 706 1565
62 921 277 1136 492 1351 707 1566
63 922 278 1137 493 1352 708 1567
64 923 279 1138 494 1353 709 1568
65 924 280 1139 495 1354 710 1569
66 925 281 1140 496 1355 711 1570
67 926 282 1141 497 1356 712 1571
68 927 283 1142 498 1357 713 1572
69 928 284 1143 499 1358 714 1573
70 929 285 1144 500 1359 715 1574
71 930 286 1145 501 1360 716 1575
72 931 287 1146 502 1361 717 1576
73 932 288 1147 503 1362 718 1577
74 933 289 1148 504 1363 719 1578
75 934 290 1149 505 1364 720 1579
76 935 291 1150 506 1365 721 1580
77 936 292 1151 507 1366 722 1581
78 937 293 1152 508 1367 723 1582
79 938 294 1153 509 1368 724 1583
80 939 295 1154 510 1369 725 1584
81 940 296 1155 511 1370 726 1585
82 941 297 1156 512 1371 727 1586
83 942 298 1157 513 1372 728 1587
84 943 299 1158 514 1373 729 1588
85 944 300 1159 515 1374 730 1589
86 945 301 1160 516 1375 731 1590
87 946 302 1161 517 1376 732 1591
88 947 303 1162 518 1377 733 1592
89 948 304 1163 519 1378 734 1593
90 949 305 1164 520 1379 735 1594
91 950 306 1165 521 1380 736 1595
92 951 307 1166 522 1381 737 1596
93 952 308 1167 523 1382 738 1597
94 953 309 1168 524 1383 739 1598
95 954 310 1169 525 1384 740 1599
96 955 311 1170 526 1385 741 1600
97 956 312 1171 527 1386 742 1601
98 957 313 1172 528 1387 743 1602
99 958 314 1173 529 1388 744 1603
100 959 315 1174 530 1389 745 1604
101 960 316 1175 531 1390 746 1605
102 961 317 1176 532 1391 747 1606
103 962 318 1177 533 1392 748 1607
104 963 319 1178 534 1393 749 1608
105 964 320 1179 535 1394 750 1609
106 965 321 1180 536 1395 751 1610
107 966 322 1181 537 1396 752 1611
108 967 323 1182 538 1397 753 1612
109 968 324 1183 539 1398 754 1613
110 969 325 1184 540 1399 755 1614
111 970 326 1185 541 1400 756 1615
112 971 327 1186 542 1401 757 1616
113 972 328 1187 543 1402 758 1617
114 973 329 1188 544 1403 759 1618
115 974 330 1189 545 1404 760 1619
116 975 331 1190 546 1405 761 1620
117 976 332 1191 547 1406 762 1621
118 977 333 1192 548 1407 763 1622
119 978 334 1193 549 1408 764 1623
120 979 335 1194 550 1409 765 1624
121 980 336 1195 551 1410 766 1625
122 981 337 1196 552 1411 767 1626
123 982 338 1197 553 1412 768 1627
124 983 339 1198 554 1413 769 1628
125 984 340 1199 555 1414 770 1629
126 985 341 1200 556 1415 771 1630
127 986 342 1201 557 1416 772 1631
128 987 343 1202 558 1417 773 1632
129 988 344 1203 559 1418 774 1633
130 989 345 1204 560 1419 775 1634
131 990 346 1205 561 1420 776 1635
132 991 347 1206 562 1421 777 1636
133 992 348 1207 563 1422 778 1637
134 993 349 1208 564 1423 779 1638
135 994 350 1209 565 1424 780 1639
136 995 351 1210 566 1425 781 1640
137 996 352 1211 567 1426 782 1641
138 997 353 1212 568 1427 783 1642
139 998 354 1213 569 1428 784 1643
140 999 355 1214 570 1429 785 1644
141 1000 356 1215 571 1430 786 1645
142 1001 357 1216 572 1431 787 1646
143 1002 358 1217 573 1432 788 1647
144 1003 359 1218 574 1433 789 1648
145 1004 360 1219 575 1434 790 1649
146 1005 361 1220 576 1435 791 1650
147 1006 362 1221 577 1436 792 1651
148 1007 363 1222 578 1437 793 1652
149 1008 364 1223 579 1438 794 1653
150 1009 365 1224 580 1439 795 1654
151 1010 366 1225 581 1440 796 1655
152 1011 367 1226 582 1441 797 1656
153 1012 368 1227 583 1442 798 1657
154 1013 369 1228 584 1443 799 1658
155 1014 370 1229 585 1444 800 1659
156 1015 371 1230 586 1445 801 1660
157 1016 372 1231 587 1446 802 1661
158 1017 373 1232 588 1447 803 1662
159 1018 374 1233 589 1448 804 1663
160 1019 375 1234 590 1449 805 1664
161 1020 376 1235 591 1450 806 1665
162 1021 377 1236 592 1451 807 1666
163 1022 378 1237 593 1452 808 1667
164 1023 379 1238 594 1453 809 1668
165 1024 380 1239 595 1454 810 1669
166 1025 381 1240 596 1455 811 1670
167 1026 382 1241 597 1456 812 1671
168 1027 383 1242 598 1457 813 1672
169 1028 384 1243 599 1458 814 1673
170 1029 385 1244 600 1459 815 1674
171 1030 386 1245 601 1460 816 1675
172 1031 387 1246 602 1461 817 1676
173 1032 388 1247 603 1462 818 1677
174 1033 389 1248 604 1463 819 1678
175 1034 390 1249 605 1464 820 1679
176 1035 391 1250 606 1465 821 1680
177 1036 392 1251 607 1466 822 1681
178 1037 393 1252 608 1467 823 1682
179 1038 394 1253 609 1468 824 1683
180 1039 395 1254 610 1469 825 1684
181 1040 396 1255 611 1470 826 1685
182 1041 397 1256 612 1471 827 1686
183 1042 398 1257 613 1472 828 1687
184 1043 399 1258 614 1473 829 1688
185 1044 400 1259 615 1474 830 1689
186 1045 401 1260 616 1475 831 1690
187 1046 402 1261 617 1476 832 1691
188 1047 403 1262 618 1477 833 1692
189 1048 404 1263 619 1478 834 1693
190 1049 405 1264 620 1479 835 1694
191 1050 406 1265 621 1480 836 1695
192 1051 407 1266 622 1481 837 1696
193 1052 408 1267 623 1482 838 1697
194 1053 409 1268 624 1483 839 1698
195 1054 410 1269 625 1484 840 1699
196 1055 411 1270 626 1485 841 1700
197 1056 412 1271 627 1486 842 1701
198 1057 413 1272 628 1487 843 1702
199 1058 414 1273 629 1488 844 1703
200 1059 415 1274 630 1489 845 1704
201 1060 416 1275 631 1490 846 1705
202 1061 417 1276 632 1491 847 1706
203 1062 418 1277 633 1492 848 1707
204 1063 419 1278 634 1493 849 1708
205 1064 420 1279 635 1494 850 1709
206 1065 421 1280 636 1495 851 1710
207 1066 422 1281 637 1496 852 1711
208 1067 423 1282 638 1497 853 1712
209 1068 424 1283 639 1498 854 1713
210 1069 425 1284 640 1499 855 1714
211 1070 426 1285 641 1500 856 1715
212 1071 427 1286 642 1501 857 1716
213 1072 428 1287 643 1502 858 1717
214 1073 429 1288 644 1503 859 1718
215 1074 430 1289 645 1504

*Последовательности триггера предоставлены для анти-смысловой цепи дцРНК триггера в 5ʹ дo 3ʹ направлении.

** T44966 и T44967 являются положительным контролем, основанным на мРНК аргинин киназы Phyllotreta striolata, описанной в Zhao и др. (2008), Eur. J. Entomol., 5:815.

[0100] Варианты реализации дцРНК триггера, предоставленные в Таблице 1, как правило, используются для РНК-опосредованного подавления соответствующего гена-мишени идентифицированного в Таблице 1. Эти дцРНК триггеры используются для борьбы с насекомыми, особенно с блошками, включая вид-источник, у которого были идентифицированы гены-мишени из Таблицы 1. РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для умерщвления или приостановки роста или другой борьбой с видами-мишенями насекомых из следующих родов: Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие дцРНК триггер для подавления одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1 (например, композиция, содержащая эффективное количество одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1) используются для борьбы по меньшей мере с одной из Altica ambiens (блошкой ольхи), Altica canadensis (блошкой земляной), Altica chalybaea (блошкой виноградной), Altica prasina (блошкой тополя), Altica rosae (блошкой розы), Altica sylvia (блошкой голубики), Altica ulmi (блошкой вяза), Chaetocnema pulicaria (блошкой кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошкой сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошкой картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошкой) и Systena frontalis (рыжей блошкой), таким образом, предотвращая или вылечивая заражение растения этими видами. Например, композиция, содержащая эффективное количество одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для предотвращения или лечения заражения растений картофеля Epitrix cucumeris (блошкой картофельной).

[0101] В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для умерщвления или приостановки роста видов блошки родов Phyllotreta и Psylliodes, таким образом, предотвращая или вылечивая заражения этими видами. В конкретных вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, используется для умерщвления или приостановки роста по меньшей мере одного вида блошки, выбранного из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala и Psylliodes punctulata (блошки конопляной). В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-296, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Phyllotreta atra (блошки репы), например, с помощью приведения в контакт взрослых особоей, личинок или яиц Phyllotreta atra с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), например, с помощью приведения в контакт взрослых особей, личинок или яиц Phyllotreta cruciferae с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 533-551, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Phyllotreta striolata (блошки полосатой), например, с помощью приведения в контакт взрослых особей, личинок или яиц Phyllotreta striolata с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 552-859, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой особи или личинок Psylliodes chrysocephala, например, с помощью приведения в контакт взрослых особей, личинок или яиц Psylliodes chrysocephala с эффективным количеством дцРНК триггера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718.

[0102] Растения, которые могут быть защищены от такого заражения с помощью трансгенной экспрессии или местного применения одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, включают любой вид растения или сорт, который подвержен заражению блошками, особенно растения, имеющие важное экономическое значение, включая декоративные растения и сельскохозяйственных растения. Варианты реализации таких растений включают растения из семейства Brassicaceae (семейство крестоцветных), такие как растение из рода Brassica включающие, например, один из следующих вариантов: B. napus (семена рапса, включающие сорта, такие как канола и брюква), B. juncea (индийская горчица), B. carinata (абиссинская горчица), B. rapa (репа), B. oleracea (дикая капуста, включающая одомашненные сорта такие как, кормовая капуста, капуста, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста и т. д.) B. rupestris (коричневая горчица), B. septiceps (горчица seventop), B. nigra (черная горчица), B. narinosa (капуста ноздреватая), B. perviridus (горчица, шпинат), B. tournefortii (азиатская горчица) и B. fructiculosa (средиземноморская капуста). В дополнительных вариантах реализации изобретения, растения-мишени могут включать, но без ограничения, один из следующих вариантов: Glycine max (соя), Linum usitatissimum (льняное семя/лен), Zea mays (кукуруза), Carthamus tinctorius (сафлор), Helianthus annuus (подсолнечник), Nicotiana tabacum (табак), Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa (бразильский орех), Ricinus communis (клещевина), Cocos nucifera (кокосовый орех), Coriandrum sativum (кориандр), Gossypium spp. (хлопок), Arachis hypogaea (земляной орех или арахис), Simmondsia chinensis (жожоба), Solanum tuberosum (картофель) Elaeis guineensis (масличная пальма), Olea europaea (олива), Oryza sativa (рис), Cucurbita maxima (тыква большая столовая), Hordeum vulgare (ячмень) и Triticum aestivum (пшеница).

[0103] Аспект включает композиции, содержащие эффективное количество одного или более дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, для местного лечения растения, которое нужно обработать от, или защищать от заражения блошкой. Другой аспект включает рекомбинантный ДНК конструкт, кодирующий по меньшей мере одну цепь одного дцРНК триггеров, представленных в Таблице 1, для трансгенной экспрессии в растении, которое имеет повышенную устойчивость к заражению блошкой по сравнению с растением не экспрессирующим такой конструкт.

Пример 2

[0104] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации тестирования эффективности последовательностей дцРНК триггера и проверки полезности триггеров для подавления кодирующих последовательностей ДНК, используемых в качестве генов-мишеней для борьбы с видами насекомых. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий приведение в контакт насекомого, такого как взрослая блошка или личинка, с одним или более дцРНК триггером, сконструированным для вызывания задержки роста или гибели насекомого. Другие варианты реализации изобретений содержат способы, где дцРНК триггер доставляется насекомому путем перорального введения (например, на или в пищевом материале, поглощаемым насекомым), или с помощью неперорального введения (например, доставки через кутикулу насекомых, или доставки с помощью приведения в контакт с яйцом насекомого).

[0105] В одном варианте реализации изобретения, анализ питания используется для определения эффективности дцРНК триггера в вызывании задержки роста или гибели насекомых, таких как блошки. Для того, чтобы проверить эффективность дцРНК триггеров для уничтожения или задержки рост блошек, одна дискриминирующая доза (например, 100 нанограмм/миллилитр) используется для идентификации дцРНК триггеров с измеряемой способностью к уничтожению или задержки рост блошек в этой дозе. Отрицательный контроль дцРНК триггера, такой как дцРНК нацеливающийся зеленый флуоресцентный белок (GFP), также включен в анализ. Каждый дцРНК триггер наносят равномерно на диски листьев рапса диаметром 1,0 сантиметр и помещают в многолуночные планшеты с 2 самцами и 2 самками взрослых блошек или 4 личинками блошки на лунку. Каждые 24 часа в течение определенного периода (например, 2 недели) предоставляются новые, свежепокрытые листья. Отставание в росте и смертность периодически оцениваются (например, ежедневно или каждые 2 или 3 дня).

[0106] ДцРНК триггеры, которые демонстрируют эффективность в этом однодозовом анализе, тестируются дополнительно. Используя подобный протокол, тестируются различные дозы дцРНК триггеров, как описано выше, для определения ЛК50 дозы для каждой из активных дцРНК. Биопробы включают 12-24 насекомых на дозу, выполненных в трех повторностях. Отставание в росте и смертность, оценивающиеся в течение 2-недельного периода, оценивают каждый третий день.

[0107] Последовательности дцРНК триггера, которые подтвердили свою эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, используют для идентификации эффективных агентов доставки РНК и составов. Инсектицидная активность составов, содержащих дцРНК триггеры, может быть оптимизирована с помощью различных методов, таких как модифицирование химических объектов в составе или модифицирование соотношения химических компонентов в составе. Неограничивающие примеры агентов доставки и составов представлены в Примере 5.

Пример 3

[0108] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов для проверки эффективности дцРНК триггера для подавления или сайленсинга гена-мишени в клетке насекомого или вызывания отставания в росте или гибели у насекомого. Более конкретно, этот пример иллюстрирует методы тестирования дцРНК триггеров на эффективность в предотвращении или лечении заражений блошкой у целых растений.

[0109] Полинуклеотиды (такие как последовательности дцРНК триггера, описанные в Примерах 1 и 2), у которых была подтверждена эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, дополнительно оценивали в анализах целого растения. В одном способе, полинуклеотиды (например, дцРНК триггеры) наносятся непосредственно на поверхность насекомых (например, с помощью распыления или опудривания). В другом способе, полинуклеотиды предоставляются насекомому в рационе насекомого (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей дцРНК триггер, такой как дцРНК триггер формы шпилька, или в искусственной приманке, содержащей РНК). Отставание в росте и смертность периодически оцениваются, как описано в Примере 2.

[0110] В различных способах, которые также подходят для широкомасштабного применения (например, на полях сельскохозяйственных культур), полинуклеотиды наносятся внекорневой подкормкой через воздушное или наземное распыление, или опудривание, или внесение ядохимикатов с поливной водой на листовую поверхность, чтобы контролировать ранние сезонные повреждения от взрослой стадии жизненного цикла, или наносятся как обработка семян, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого, или наносятся в грунт внутрирядно или наносятся смачиванием, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого. Пример режима лиственного тестирования включает обработку растения сразу же после появления из земли и оценку лиственного повреждения, причиненного взрослыми блошками через 1-2 недели после появления всходов. Для внутрирядной обработки или обработки семян следует аналогичный временной паттерн для оценки ущерба.

Пример 4

[0111] Полинуклеотиды, как правило, сконструированы для модулирования экспрессии путем индукции регулирования или подавления гена-мишени насекомого и сконструированы, чтобы иметь нуклеотидную последовательность, по существу, одинаковую или, по существу, комплементарную нуклеотидной последовательности гена-мишени насекомого или кДНК (например, SEQ ID NO: 1-859) или последовательности РНК, транскрибируемой из гена-мишени насекомого, которая может быть кодирующей последовательностью или некодирующей последовательностью. Эти эффективные полинуклеотидные молекулы, которые модулируют экспрессию, упоминаются в данном документе как ʺтриггерʺ, или ʺтриггерыʺ. Этот пример описывает неограничивающие методики, используемые в конструировании и выборе полинуклеотидов в качестве ʺтриггеровʺ для модулирования экспрессии гена-мишени насекомого.

Выбор полинуклеотидных триггеров с помощью ʺПерекрыванияʺ

[0112] Полинуклеотиды, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, не обязательно должны быть полной длины гена-мишени, и во многих вариантах реализации изобретения имеют гораздо меньшую длину по сравнению с геном-мишенью. Примером методики, которая используется для выбора эффективных триггеров, является ʺперекрываниеʺ, или оценка полинуклеотидов, соответствующих смежным или частично перекрывающим друг друга сегментам гена-мишени.

[0113] Эффективные полинуклеотидные ʺтриггерыʺ могут быть определены с помощью ʺперекрыванияʺ генных мишеней в фрагментах выбранной длины, например, фрагментах 200-300 нуклеотидов в длину, с частично перекрывающимися участками, например, около 25 нуклеотидов, вдоль длины гена-мишени. Для подавления одного гена, последовательности триггера сконструированные для соответствия (имеют нуклеотидную идентичность или комплементарность с) участкам, которые являются уникальными для гена-мишени; выбранный участок гена-мишени может содержать кодирующую последовательность или некодирующую последовательность (например, участки промотора, 3ʹ нетранслируемые участки, интроны и т. д.) или комбинацию обоих.

[0114] Там, где это представляет интерес для конструирования целевой последовательности, эффективной в подавлении множественных генов-мишеней, множественные последовательности гена-мишени выравниваются и полинуклеотидные триггеры, сконструированные для соответствия участкам с высокой гомологией последовательности общей среди нескольких целей. И, наоборот, там, где это представляет интерес для разработки целевой эффективности в селективном подавлении одной среди нескольких целевых последовательностей, последовательности множественных генов-мишеней были выровнены и полинуклеотидные триггеры, сконструированы для соответствия участкам с отсутствующей или низкой гомологией последовательности общей среди нескольких целей.

[0115] В неограничивающем примере, анти-смысловые одноцепочечные РНК триггеры сконструированы для каждого из генов-мишеней, перечисленных в Таблице 1 следующим образом. Множественные анти-смысловые одноцепочечные РНК триггеры, каждый из 200-300 нуклеотидов в длину и с последовательностью, соответствующей (например, анти-смысловым триггерам, комплементарным с) фрагменту гена-мишени, имеющему последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, сконструированы так, что каждая триггерная последовательность перекрывает около 25 нуклеотидов следующей смежной триггерной последовательности, таким образом, что несколько триггеров в сочетании покрывают всю длину гена-мишени. (Смысловые триггеры сконструированы аналогичным образом, где последовательность триггера идентична фрагменту гена-мишени. Аналогично, двухцепочечные триггеры могут быть сконструированы с помощью обеспечения пар смысловых и анти-смысловых триггеров, каждая пара триггеров перекрывает следующую смежную пару триггеров.)

[0116] Полинуклеотидные триггеры тестируются любым удобным способом на эффективность в подавление экспрессии гена-мишени насекомого. Примеры подходящего теста включают биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах. Другой тест включает местное применение полинуклеотидных триггеров или напрямую к отдельным насекомых, или на поверхности растения, которое должно быть защищено от заражения насекомым. Одним из желаемых результатов обработки полинуклеотидом, как описано в данном документе, является предотвращение или борьба с заражением насекомым, например, с помощью индуцирования у насекомого физиологических или поведенческих изменений таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. Другим желаемым результатом обработки полинуклеотидом, как описано в данном документе, является обеспечение растения, которое демонстрирует повышенную устойчивость к заражению насекомыми.

[0117] Процедуру перекрывания при желании можно повторить. Полинуклеотидный триггер, обеспечивающий требуемую активность, может быть сам подвергнут процедуре перекрывания. Например, сконструированные множественные перекрывающиеся анти-смысловые одноцепочечные РНК триггеры, каждый из 50-60 нуклеотидов в длину и с последовательностью, соответствующей (например, анти-смысловым триггерам, комплементарным) фрагменту гена-мишени, имеющему последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, для которой была установлена эффективность одного полинуклеотидного триггера из 300 нуклеотидов. Дополнительные циклы анализа перекрывания могут быть проведены, в которых протестированы триггеры короче, чем 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов.

[0118] Эффективные полинуклеотидные триггеры любого размера могут использоваться по отдельности или в комбинации в различных способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, один полинуклеотидный триггер используется для создания композиции (например, композиции для местного применения, или рекомбинантного конструкта ДНК пригодного для создания трансгенного растения). В других вариантах реализации изобретения, используется смесь или совокупность разных полинуклеотидных триггеров; в таких случаях полинуклеотидные триггеры могут быть для одного гена-мишени или нескольких генов-мишеней. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотидный триггер сконструирован для направленного воздействия на различные участки гена-мишени, например, триггер может содержать несколько сегментов, которые соответствуют различным экзонным участкам гена-мишени, и ʺспейсерныеʺ нуклеотиды, которые не соответствуют гену-мишени, при необходимости могут быть использованы между или смежно с сегментами.

Термодинамические соображения при выборе полинуклеотидных триггеров

[0119] Полинуклеотидные триггеры могут быть сконструированы или их последовательность оптимизирована с использованием термодинамических соображений. Например, полинуклеотидные триггеры могут быть выбраны на основании термодинамически контролируемой гибридизации между одной цепью нуклеиновой кислоты (например, полинуклеотидным триггером или отдельной миРНК) и другой (например, транскриптом гена-мишени).

[0120] Способы и алгоритмы для прогнозирования нуклеотидных последовательностей, которые, вероятно, будут эффективными при РНКи-опосредованном подавлении гена-мишени, известны в данной области техники. Не ограничивающие примеры таких способов и алгоритмов включают ʺi-scoreʺ, описанную Ichihara и др. (2007) Nucleic Acids Res., 35(18): 123e; ʺOligowalkʺ, в открытом доступе на rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk и описанную Lu и др. (2008) Nucleic Acids Res., 36:W104-108; и ʺоценку Рейнольдсаʺ, описанную Khovorova и др. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330.

Допустимые несовпадения

[0121] "По существу идентичный" или "по существу комплементарный" означает, что полинуклеотидный триггер (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) обладает достаточной идентичностью и комплементарностью к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени (например, транскрипт), для подавления экспрессии гена-мишени (например, для осуществления снижения уровней или активности транскрипта гена-мишени и/или кодируемого белка). Полинуклеотидам не нужно иметь 100-процентную идентичность или комплементарности к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени, для подавления экспрессии гена-мишени (например, для осуществления снижения уровней или активности транскрипта гена-мишени или кодируемого белка, или обеспечения борьбы с видами насекомого). В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть по существу идентичными или по существу комплементарными последовательностями по меньшей мере 18 или 19 смежных нуклеотидов в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть точно идентичными или точно комплементарными последовательностями из 21 смежного нуклеотида в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В конкретных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу идентичныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную идентичность или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность последовательности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов в любом эндогенном гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В конкретных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу комплементарныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную комплементарность последовательности или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную комплементарность последовательности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени.

[0122] Полинуклеотиды, содержащие несовпадения гена-мишени или транскрипта, могут быть использованы в определенных вариантах реализации композиций и способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 19 смежных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом (т. e., 1 или 2 несовпадений между 19 смежными нуклеотидами полинуклеотида и сегментом эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени). В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 20 или более нуклеотидов, который содержит смежный 19 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 21 непрерывных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В конкретных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 22 или более нуклеотидов, который содержит смежный 21 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом.

[0123] При конструировании полинуклеотидов с несовпадениями с эндогенным геном-мишенью или РНК, транскрибированной из гена-мишени, могут быть использованы несовпадения определенных типов и в определенных позициях, которые, скорее всего, будут допускаться. В определенных иллюстративных вариантах реализации изобретения, используются несовпадения образованные между остатками аденина и цитозина или гуанозина и урацила, как описано Du и др. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. В некоторых вариантах реализации изобретения, несовпадения в 19 паре оснований участков перекрытия расположены при низкой толерантности к позициям 5, 7, 8 или 11 (от 5ʹ конца 19-нуклеотидной мишени), при средней толерантности к позициям 3, 4 и 12-17 (от 5ʹ конца 19-нуклеотидной мишени), и/или при высокой толерантности к позициям на любом конце участка комплементарности, например, позициях 1, 2, 18 и 19 (от 5ʹ конца 19-нуклеотидной мишени), как описано Du и др. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. Допускаемые несовпадения могут быть эмпирически определены в рутинных анализах, таких как те, что описаны в данном документе в рабочих примерах.

[0124] В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды содержат дополнительные нуклеотиды для обеспечения стабильности или для удобства клонирования и синтеза. В одном вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь с сегментом из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, и дополнительно содержащую дополнительный 5ʹ G или дополнительный 3ʹ C или оба, смежные с сегментом. В другом варианте реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для формирования "липкого" конца, например, дцРНК, содержащая 2 дезоксирибонуклеотида для формирования 3ʹ "липкого" конца.

Вставка активных триггеров в нейтральную последовательность

[0125] В варианте реализации изобретения, биоактивный триггер (т. e., полинуклеотид с последовательностью, соответствующей гену-мишени, и который отвечает за наблюдаемое подавление гена-мишени) вставлен в ʺнейтральнуюʺ последовательность, например, вставлен в дополнительные нуклеотиды, которые не имеют идентичности или комплементарности последовательности к гену-мишени. Нейтральная последовательность может быть желательной, например, для увеличения общей длины полинуклеотида. Например, может быть желательно, чтобы полинуклеотид был определенного размера для обеспечения стабильности, эффективности в производстве или биологической активности.

[0126] Сообщалось, что у другого вида жесткокрылых, Diabrotica virgifera, дцРНК, больше чем или равные приблизительно 60 парам оснований (п.о.), необходимы для биологической активности в биоанализе искусственного корма; см. Bolognesi и др. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения, дцРНК триггер из 21-пары оснований, соответствующий гену-мишени из Таблицы 1 и обеспечивающий контроль за заражением насекомым, вставлен в нейтральную последовательность из дополнительных 39 пар оснований, формируя таким образом полинуклеотид из около 60 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения, один триггер из 21-пары оснований оказывается эффективным при встраивании в большие участки нейтральной последовательности, например, где общая длина полинуклеотида составляет от около 60 до около 300 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере один сегмент из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, вставлен в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного триггера. В другом варианте реализации изобретения, сегменты из нескольких последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, вставлены в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного триггера.

[0127] Предполагается, что комбинация некоторых рекомбинантных РНК, описанных в данном документе (например, дцРНК триггеров, содержащих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1724, или активные фрагменты этих триггеров), с одним или более полинуклеотидных пестицидных агентов приведет к синергетическому улучшению предотвращения и борьбы с заражениями насекомым, если сравнивать эффект, получаемый с помощью только одной рекомбинантной РНК или с только одним неполинуклеотидным пестицидным агентом. Рутинные биоанализы насекомого, такие как биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах, могут быть использованы для определения дозы-ответов для гибели личинок или ингибирования роста, используя комбинации из полинуклеотидов, описанных в данном документе, и одного или более неполинуклеотидиных пестицидных агентов (например, пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus). Специалист в данной области техники может тестировать комбинации полинуклеотидных и неполинуклеотидных пестицидных агентов в рутинных биоанализах для выявления комбинаций биоактивных веществ, которые являются синергичными и желательными для использования в защите растений от заражения насекомым.

Пример 5

[0128] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов тестирования эффективности дцРНК триггеров у блошек. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий пероральное введение дцРНК блошкам, в результате чего задерживается рост или наступает гибель блошек.

[0129] P. cruciferae были собраны с поля канолы, где никакие пестициды не применялась в предыдущие 3 месяца. Три гена (SEQ ID NO: 1169, 1193 и 1392) Phyllotreta, являющиеся мишенью, и одна дцРНК отрицательного контроля, являющиеся мишенью GFP, были протестированы в группах из 30 P. cruciferae. ДцРНК были ресуспендированы в воде и нанесены на 6 миллиметровые диски листа (55 ± 6 миллиграмм каждый) в дискриминирующей дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа, которые были даны с кормом группам из 5 блошек. Листовые диски со свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и количество выживших особей было зарегистрировано за 2-недельный период. Низкий показатель коэффициента неспецифической смертности наблюдался в группе отрицательного контроля насекомых (3 из 30 насекомых, умирающих за 2 недели, или 10% от неспецифической смертности). Гибель наблюдается в начале 4-го дня и продолжается в течение 2 недельного периода. Специфическая смертность наблюдалась для всех дцРНК обработок (Таблица 2). Корректируя неспецифическую смертность (вычитая коэффициент неспецифической смертности для 3 насекомых на группу для исправления N= 27), процент смертности, наблюдаемый в конце 2-недельного периода составил 85% (SEQ ID NO: 1169), 0,70% (SEQ ID NO: 1193) и 0,63% (SEQ ID NO: 1392). Эти результаты показали эффективность дцРНК триггеров для умерщвления блошек при предоставлении в рационе блошек.

Таблица 2: Совокупное число умерших P. cruciferae (N=30)

День Отрицательный контроль SEQ ID NO: 1169 SEQ ID NO: 1193 SEQ ID NO: 1392
0 0 0 0 0
2 1 2 1 1
4 2 6 2 2
6 2 9 3 3
8 2 13 8 9
10 3 18 16 15
12 3 23 19 18
14 3 26 22 20

[0130] Во второй серии экспериментов, выполненных в подобной манере, несколько дцРНК триггеров были протестированы в дискриминирующей дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа на P. cruciferae; также были протестированы две меньшие дозы (15 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа и 2 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа). Десять блошек были протестированы на каждую дозу. Использованным отрицательным контролем (пять повторностей) был дцРНК триггер, нацеливающийся на бактериальный ген uidA, кодирующий бета-глюкуронидазу (номер доступа NCBI NC_000913.3). Листовые диски со свеженанесенной дцРНК меняли каждый день, и гибель была зафиксирована в течение 12-дневного периода. Общий коэффициент смертности для отрицательного контроля составил ~4% вероятно из-за манипуляционных повреждений) в течение 12-дневного периода наблюдения. Наблюдаемая кумулятивная смертность (N=10) после 12 дней воздействия дцРНК представлена в Таблице 3; значения отрицательного контроля смертности приведены как среднее (N=5). Восемь дцРНК триггеров (показаны с помощью рейтинга смертности +++) вызывали 90-100% смертность при самой высокой дозе и были все еще эффективны (80% смертность или выше) при самой низкой протестированной дозе. Некоторые дцРНК триггеры (показаны с помощью рейтинга смертности ++) вызывали смертность у части насекомых при самой высокой дозе, но были менее эффективны при более низких дозах (<20% смертности).

Таблица 3

кумулятивная смертность (N=10) Оценка смертности*
Триггер SEQ ID NO: 50 нг/мг 15 нг/мг 2 нг/мг
870 3 1 0 -
876 3 1 0 -
1156 2 0 0 -
1157 10 3 0 -
1158 2 0 0 -
1159 5 2 0 -
1160 2 0 0 -
1161 10 3 1 -
1163 4 4 2 -
1164 10 8 4 ++
1165 8 7 5 ++
1166 5 2 2 -
1167 6 2 0 -
1168 8 5 0 -
1169 10 10 8 +++
1170 9 5 3 -
1171 10 10 6 ++
1392 3 2 0 -
1393 6 1 0 -
1186 9 7 5 -
1394 9 9 5 -
1187 9 9 8 +++
1193 10 10 9 +++
1210 6 3 1 -
1219 8 3 2 -
1224 10 9 8 +++
1234 10 7 6 ++
1243 5 2 0 -
1258 9 4 2 -
1396 9 6 5 ++
1397 6 3 0 -
1398 8 7 7 ++
1399 10 10 8 +++
1400 2 1 1 -
1403 9 6 6 -
1404 10 7 4 -
1405 6 6 2 -
1406 9 9 7 +++
1407 10 9 8 +++
1408 9 9 9 +++
отрицательный контроль (GFP) 0,6 0,6 0,4 -
отрицательный контроль (бета-глюкуронидаза) 0,4 0,6 0,2 -
отрицательный контроль (только вода) 0,2 0,4 0,6 -

*+++ оценка указывает на высокую (>80%) смертность для всех трех доз; ++ оценка указывает на высокую смертность для самой высокой дозы, и в пределах от 40 дo 70% смертности с двумя низкими дозами.

[0131] Другие методы доставки этих или подобных дцРНК триггеров рассматриваются и включают нанесение дцРНК триггеров непосредственно на поверхность насекомых (например, с помощью распыления или опудривания), или предоставление дцРНК триггеров насекомому в рационе или наживке (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей дцРНК триггер, такой как дцРНК триггер формы шпилька, или в искусственной приманке, содержащей дцРНК). В варианте реализации изобретения, сконструирована версия триггера Phyllotreta формы шпилька с последовательностью SEQ ID NO: 1169; эта версия формы шпилька кодируется с помощью последовательности ДНК SEQ ID NO: 1722, которая содержит в 5ʹ дo 3ʹ порядке анти-смысловую последовательность (позиции нуклеотидов 1-267), последовательность петли (позиции нуклеотидов 268-373), которая не содержит совпадений с последовательностями Phyllotreta, и смысловую последовательность (позиции нуклеотидов 374-640). Эта последовательность ДНК экспрессируется как одноцепочечный РНК транскрипт, в котором анти-смысловые и смысловые участки отжигаются для формирования двухцепочечного участка ʺстебляʺ шпильки. Конструкт экпрессируется в бактерии, такой как E. coli; полученная дцРНК шпилька, произведенная в бактерии, предоставляется блошкам в виде неочищенного или очищенного продукта ферментации, или в форме бактериальных клеток. Подобные конструкты сконструированы кодирующими дцРНК, имеющими модифицированные стебель-петли, такие как ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ и ʺстабилизированные смысловыеʺ версии, которые содержат стабилизированные петли, образованные с помощью расширенной анти-смысловой или смысловой последовательности, соответственно, последовательность триггера, соответствующая предполагаемому гену-мишени.

Пример 6

[0132] Этот пример описывает варианты реализации изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность, содержащую определенные модификации, такие как нуклеотидные замены. Варианты реализации таких модификаций содержат модифицированные дцРНК триггеры, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию последовательности между предполагаемым геном-мишенью интересующего насекомого-вредителя и генетическими последовательностями других, не целевых видов.

[0133] Выбранные дцРНК триггеры, определенные в Таблице 1, подвергали скринингу на незапланированные совпадения последовательности с последовательностью из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов в не целевом гене или не целевом организме (НЦO, например, Apis mellifera, Bombus impatiens и B. terrestris; Coleomegilla spp.; Danaus plexippus; Homo sapiens; Megachile rotundata; Mus musculus; и Brassica rapa). Нуклеотидные изменения сделаны в исходной последовательности триггера для устранения нежелательных совпадений последовательности с не целевым геном или не целевым организмом. Примеры таких модифицированных последовательностей триггера предоставляются в SEQ ID NO: 1723, которая соответствует SEQ ID NO: 1393 (которая нацелена на тот же ген блошки, как и триггер SEQ ID NO: 1392) и SEQ ID NO: 1724, которая соответствует SEQ ID NO: 1169. Эти модифицированные последовательности триггера обеспечивают улучшенную дискриминацию между предполагаемым целевым видом и не целевым организмом.

Пример 7

[0134] Этот пример описывает варианты реализации изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность для подавления гена-мишени у более чем одного вида. Варианты реализации изобретения включают последовательности дцРНК из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов, определенных как имеющие 100% комплементарность или идентичность с более чем одним видоспецифическим геном-мишенью.

[0135] Таблица 3 содержит перечень последовательностей, каждая из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов в длину и определенных по координатам последовательности в дцРНК триггере для одного вида блошки, причем идентичная последовательность также находится в дцРНК триггере для разных видов блошек. Эти последовательности могут быть использованы в качестве триггеров у множества видов, у которых последовательности встречаются совместно. Например, триггер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1186 (нацеливающуюся на COPI альфа ген-мишень Phyllotreta cruciferae, SEQ ID NO: 327) содержит пять последовательностей из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов в позициях 1-71, 88-116, 136-209, 238-266 и 274-296, все из которых совпадают с последовательностью триггеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 882 и 888 (нацеливающиеся на COPI альфа гены-мишени Phyllotreta atra, SEQ ID NO: 23 и 29, соответственно); таким образом, эти пять последовательностей являются полезными в нацеливании на ген у двух видов рода Phyllotreta.

Таблица 3

Триггер ЗАПРОСА Триггер СУБЪЕКТА Триггер ЗАПРОСА Триггер СУБЪЕКТА
SSEQ ID NO: cтарт кконец SEQ ID NO: SSEQ ID NO: сстарт конец Триггер SEQ ID NO:
1186 1 71 882, 888 1333 329 351 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 88 116 882, 888 1334 42 98 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 136 209 882, 888 1334 109 185 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 238 266 882, 888 1334 187 254 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 274 296 882, 888 1334 271 302 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 51 96 900-908, 910 1335 2 47 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 137 177 900-908, 910 1335 49 116 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 179 216 900-908, 910 1335 133 164 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 218 255 900-908, 910 1335 229 251 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 342 900-908, 910 1336 34 90 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 2 25 900-908, 910 1336 101 177 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 66 106 900-908, 910 1336 179 246 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 108 145 900-908, 910 1336 263 294 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 147 184 900-908, 910 1338 40 96 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 271 900-908, 910 1338 107 183 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 273 298 900-908, 910 1338 185 252 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 300 330 900-908, 910 1338 269 300 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 58 96 900-908, 910 1328 35 59 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 300 336 900-908, 910 1331 60 84 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 44 96 900-908, 910 1332 1 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 179 200 900-908, 910 1333 36 60 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 108 129 900-908, 910 1334 74 98 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 218 242 900-908, 910 1336 66 90 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 147 171 900-908, 910 1338 72 96 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 277 900-908, 910 1331 1 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 206 900-908, 910 1334 2 40 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 334 900-908, 910 1336 2 32 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 263 900-908, 910 1338 2 38 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 320 900-908, 910 1328 36 59 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 249 900-908, 910 1331 61 84 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1193 15 101 911, 915, 916, 919 1332 3 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1194 6 92 911, 915, 916, 919 1333 37 60 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1195 2 107 911, 915, 916, 919 1334 75 98 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1195 121 207 911, 915, 916, 919 1336 67 90 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1196 2 122 911, 915, 916, 919 1338 73 96 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1196 136 222 911, 915, 916, 919 1329 172 191 1039-1043 1045
1197 2 20 911, 915, 916, 919 1329 265 296 1039-1043 1045
1197 22 42 911, 915, 916, 919 1329 298 317 1039-1043 1045
1197 44 180 911, 915, 916, 919 1329 319 343 1039-1043 1045
1197 194 280 911, 915, 916, 919 1330 181 200 1039-1043 1045
1198 18 38 911, 915, 916, 919 1330 274 305 1039-1043 1045
1198 40 176 911, 915, 916, 919 1330 307 326 1039-1043 1045
1198 190 276 911, 915, 916, 919 1330 328 352 1039-1043 1045
1199 5 25 911, 915, 916, 919 1335 283 302 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1199 27 163 911, 915, 916, 919 1337 1 19 1043, 1045
1199 177 263 911, 915, 916, 919 1337 93 124 1043, 1045
1200 16 152 911, 915, 916, 919 1337 126 145 1043, 1045
1200 166 252 911, 915, 916, 919 1337 147 171 1043, 1045
1201 19 105 911, 915, 916, 919 1329 319 352 1039-1043 1045
1202 2 119 911, 915, 916, 919 1337 147 180 1043, 1045
1202 133 219 911, 915, 916, 919 1386 2 38 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1203 14 100 911, 915, 916, 919 1386 40 59 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1193 123 189 911, 915, 916, 919 1386 70 95 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1194 114 180 911, 915, 916, 919 1386 103 161 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1195 229 295 911, 915, 916, 919 1386 196 262 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1196 244 310 911, 915, 916, 919 1388 2 51 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1197 302 350 911, 915, 916, 919 1388 53 72 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1198 298 350 911, 915, 916, 919 1388 83 108 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1199 285 352 911, 915, 916, 919 1388 116 174 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1200 274 340 911, 915, 916, 919 1388 209 275 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1201 127 193 911, 915, 916, 919 1390 88 119 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1202 241 307 911, 915, 916, 919 1390 145 194 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1203 122 188 911, 915, 916, 919 1390 196 215 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1193 123 196 911, 915, 916, 919 1390 226 251 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1193 198 230 911, 915, 916, 919 1390 259 317 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1194 114 187 911, 915, 916, 919 1391 19 50 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1194 189 221 911, 915, 916, 919 1391 76 125 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1195 229 302 911, 915, 916, 919 1391 127 146 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1195 304 336 911, 915, 916, 919 1391 157 182 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196 1 122 911, 915, 916, 919 1391 190 248 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196 244 317 911, 915, 916, 919 1391 283 349 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196 319 351 911, 915, 916, 919 1384 20 39 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1197 60 180 911, 915, 916, 919 1384 62 84 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1198 56 176 911, 915, 916, 919 1384 134 204 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1199 43 163 911, 915, 916, 919 1384 206 249 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1199 285 351 911, 915, 916, 919 1384 251 270 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1200 32 152 911, 915, 916, 919 1384 284 305 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1200 274 347 911, 915, 916, 919 1385 21 40 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1201 127 200 911, 915, 916, 919 1385 63 85 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1201 202 234 911, 915, 916, 919 1385 135 205 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1202 241 314 911, 915, 916, 919 1385 207 250 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1202 316 348 911, 915, 916, 919 1385 252 271 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1203 122 195 911, 915, 916, 919 1385 285 306 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1203 197 229 911, 915, 916, 919 1387 2 21 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204 6 25 920, 921, 922, 923, 924 1387 23 42 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204 27 49 920, 921, 922, 923, 924 1387 56 77 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204 51 118 920, 921, 922, 923, 924 1389 1 55 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 186 214 920, 921, 922, 923, 924 1389 57 100 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 219 268 920, 921, 922, 923, 924 1389 102 121 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 270 295 920, 921, 922, 923, 924 1389 135 156 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 306 351 920, 921, 922, 923, 924 1386 196 255 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1205 180 199 920, 921, 922, 923, 924 1388 209 268 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1205 201 223 920, 921, 922, 923, 924 1391 283 342 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1205 225 292 920, 921, 922, 923, 924 1387 257 321 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206 10 29 920, 921, 922, 923, 924 1387 332 351 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206 31 53 920, 921, 922, 923, 924 1390 25 56 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1206 55 122 920, 921, 922, 923, 924 1384 284 321 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206 190 218 920, 921, 922, 923, 924 1385 285 322 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206 223 272 920, 921, 922, 923, 924 1387 56 93 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206 274 299 920, 921, 922, 923, 924 1389 135 172 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206 310 351 920, 921, 922, 923, 924 1386 196 332 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1207 11 33 920, 921, 922, 923, 924 1388 209 345 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1207 35 102 920, 921, 922, 923, 924 1391 283 352 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1207 170 198 920, 921, 922, 923, 924 1384 323 348 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1207 203 252 920, 921, 922, 923, 924 1385 324 349 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1207 254 279 920, 921, 922, 923, 924 1387 95 120 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1207 290 335 920, 921, 922, 923, 924 1387 128 153 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208 18 40 920, 921, 922, 923, 924 1387 161 186 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208 42 109 920, 921, 922, 923, 924 1387 191 210 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208 177 205 920, 921, 922, 923, 924 1389 174 199 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208 210 259 920, 921, 922, 923, 924 1389 207 232 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208 261 286 920, 921, 922, 923, 924 1389 240 265 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208 297 342 920, 921, 922, 923, 924 1389 270 289 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1209 101 120 920, 921, 922, 923, 924 1283 177 208 1064-1070
1209 122 144 920, 921, 922, 923, 924 1284 130 161 1064-1070
1209 146 213 920, 921, 922, 923, 924 1284 301 351 1064-1070
1209 281 309 920, 921, 922, 923, 924 1286 210 241 1064-1070
1209 314 351 920, 921, 922, 923, 924 1287 126 157 1064-1070
1205 2 91 920, 921, 922, 923, 924 1287 297 351 1064-1070
1205 114 142 920, 921, 922, 923, 924 1288 326 351 1064-1070, 1071
1205 144 178 920, 921, 922, 923, 924 1289 41 72 1064-1070
1209 35 63 920, 921, 922, 923, 924 1289 212 288 1064-1070
1209 65 99 920, 921, 922, 923, 924 1289 320 351 1064-1070
1204 306 347 920, 921, 922, 923, 924 1290 178 209 1064-1070
1207 290 331 920, 921, 922, 923, 924 1291 228 259 1064-1070, 1071
1208 297 338 920, 921, 922, 923, 924 1292 43 74 1064-1070
1207 290 352 920, 921, 922, 923, 924 1292 214 290 1064-1070
1208 297 351 920, 921, 922, 923, 924 1292 322 351 1064-1070
1205 18 91 920, 921, 922, 923, 924 1293 330 351 1064-1070, 1071
1224 1 43 947-949, 951-956 1377 37 68 1064-1070
1224 57 95 947-949, 951-956 1377 208 284 1064-1070
1224 97 145 947-949, 951-956 1377 316 348 1064-1070
1224 147 175 947-949, 951-956 1289 212 274 1064-1070
1224 177 208 947-949, 951-956 1292 214 276 1064-1070
1224 210 262 947-949, 951-956 1377 208 270 1064-1070
1224 285 350 947-949, 951-956 1285 123 148 1067, 1069, 1071
1225 150 192 947, 949, 951-956 1288 107 132 1064-1070, 1071
1225 206 244 947, 949, 951-956 1291 9 34 1064-1070, 1071
1225 246 294 947, 949, 951-956 1293 111 136 1064-1070, 1071
1225 296 324 947, 949, 951-956 1287 297 347 1064-1070
1225 326 351 947, 949, 951-956 1289 212 262 1064-1070
1226 258 300 947, 949, 951-955 1292 214 264 1064-1070
1226 314 351 947, 949, 951-955 1377 208 258 1064-1070
1227 253 295 947, 949, 951-955 1287 297 352 1064-1070
1227 309 347 947, 949, 951-955 1289 212 266 1064-1070
1228 206 248 947, 949, 951-956 1292 214 268 1064-1070
1228 262 300 947, 949, 951-956 1377 208 262 1064-1070
1228 302 350 947, 949, 951-956 1285 18 61 1067, 1069, 1071
1229 171 213 947, 949, 951-956 1288 2 45 1064-1070, 1071
1229 227 265 947, 949, 951-956 1293 6 49 1064-1070, 1071
1229 267 315 947, 949, 951-956 1357 1 40 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 317 345 947, 949, 951-956 1357 63 85 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 252 294 947, 949, 951-955 1357 102 157 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 308 346 947, 949, 951-955 1357 159 189 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 191 233 947, 949, 951-956 1357 191 322 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 247 285 947, 949, 951-956 1358 25 47 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 287 335 947, 949, 951-956 1358 64 119 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 196 238 947, 949, 951-956 1358 121 151 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 252 290 947, 949, 951-956 1358 153 284 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 292 340 947, 949, 951-956 1359 31 53 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 209 251 947, 949, 951-956 1359 70 125 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 265 303 947, 949, 951-956 1359 127 157 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 305 351 947, 949, 951-956 1359 159 290 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1224 177 202 947-949, 951-956 1360 38 60 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 1 72 947, 949, 951-956 1360 77 132 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 74 135 947, 949, 951-956 1360 134 164 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 137 192 947, 949, 951-956 1360 166 297 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 110 180 947, 949, 951-955 1361 1 41 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 182 243 947, 949, 951-955 1361 64 86 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 245 300 947, 949, 951-955 1361 103 158 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 105 175 947, 949, 951-955 1361 160 190 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 177 238 947, 949, 951-955 1361 192 323 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 240 295 947, 949, 951-955 1362 31 53 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 58 128 947, 949, 951-956 1362 70 125 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 130 191 947, 949, 951-956 1362 127 157 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 193 248 947, 949, 951-956 1362 159 290 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 23 93 947, 949, 951-956 1363 33 55 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 95 156 947, 949, 951-956 1363 72 127 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 158 213 947, 949, 951-956 1363 129 159 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 104 174 947, 949, 951-955 1363 161 292 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 176 237 947, 949, 951-955 1364 4 59 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 239 294 947, 949, 951-955 1364 61 91 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 43 113 947, 949, 951-956 1364 93 224 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 115 176 947, 949, 951-956 1365 35 57 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 178 233 947, 949, 951-956 1365 74 129 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 48 118 947, 949, 951-956 1365 131 161 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 120 181 947, 949, 951-956 1365 163 294 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 183 238 947, 949, 951-956 1366 2 26 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 61 131 947, 949, 951-956 1366 28 58 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 133 194 947, 949, 951-956 1366 60 191 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 196 251 947, 949, 951-956 1367 2 116 1079, 1080, 1081, 1082, 1152, 1153, 1154
1224 227 262 947-949, 951-956 1358 322 345 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1224 57 94 947-949, 951-956 1359 328 350 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 2 72 947, 949, 951-956 1362 328 351 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 206 243 947, 949, 951-956 1363 330 352 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 1 96 947, 949, 951-955 1364 262 285 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 98 180 947, 949, 951-955 1365 332 351 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 2 91 947, 949, 951-955 1366 229 252 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 93 175 947, 949, 951-955 1367 154 177 1079-1082, 1152-1154
1227 309 346 947, 949, 951-955 1358 322 344 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 2 44 947, 949, 951-956 1362 328 350 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 46 128 947, 949, 951-956 1364 262 284 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 262 299 947, 949, 951-956 1366 229 251 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 11 93 947, 949, 951-956 1367 154 176 1079-1082, 1152-1154
1229 227 264 947, 949, 951-956 1368 126 145 1083, 1087
1230 2 90 947, 949, 951-955 1368 153 177 1083, 1087
1230 92 174 947, 949, 951-955 1368 186 208 1083, 1087
1230 308 345 947, 949, 951-955 1368 224 253 1083, 1087
1231 2 29 947, 949, 951-956 1369 161 180 1083, 1084, 1089
1231 31 113 947, 949, 951-956 1370 124 143 1083, 1087
1231 247 284 947, 949, 951-956 1370 151 175 1083, 1087
1232 2 34 947, 949, 951-956 1370 184 206 1083, 1087
1232 36 118 947, 949, 951-956 1370 222 251 1083, 1087
1232 252 289 947, 949, 951-956 1369 278 303 1083, 1084, 1089
1233 2 47 947, 949, 951-956 1369 182 201 1083, 1084, 1089
1233 49 131 947, 949, 951-956 1371 1 71 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233 265 302 947, 949, 951-956 1371 82 122 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226 7 96 947, 949, 951-955 1371 124 180 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227 1 91 947, 949, 951-955 1371 182 244 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226 8 96 947, 949, 951-955 1372 16 56 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227 3 91 947, 949, 951-955 1372 58 114 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1230 1 90 947, 949, 951-955 1372 116 178 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226 54 96 947, 949, 951-955 1373 2 61 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227 49 91 947, 949, 951-955 1373 72 112 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1228 1 44 947, 949, 951-956 1373 114 170 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1230 48 90 947, 949, 951-955 1373 172 234 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233 5 47 947, 949, 951-956 1374 1 68 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1224 125 145 947-949, 951-956 1374 79 119 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1225 274 294 947, 949, 951-956 1374 121 177 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1228 330 350 947, 949, 951-956 1374 179 241 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1229 295 315 947, 949, 951-956 1375 2 41 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1231 315 335 947, 949, 951-956 1375 52 92 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1232 320 340 947, 949, 951-956 1375 94 150 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233 333 351 947, 949, 951-956 1375 152 214 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 50 135 960, 964 1376 7 47 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 149 168 960, 964 1376 49 105 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 170 350 960, 964 1376 107 169 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 175 260 960, 963, 964 1371 124 148 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 274 293 960, 963, 964 1372 58 82 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 295 351 960, 963, 964 1373 114 138 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 190 275 960, 963, 964 1374 121 145 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 289 308 960, 963, 964 1375 94 118 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 310 351 960, 963, 964 1376 49 73 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 269 350 960, 963, 964 1371 182 276 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 51 136 960, 964 1371 278 333 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 150 169 960, 964 1372 116 210 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 171 350 960, 964 1372 212 267 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 50 135 960, 964 1372 269 309 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 149 168 960, 964 1372 311 352 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 170 351 960, 964 1373 172 266 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 103 188 960, 963, 964 1373 268 323 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 202 221 960, 963, 964 1373 325 351 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 223 351 960, 963, 964 1374 179 273 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 269 351 960, 963, 964 1374 275 330 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 87 172 960, 963, 964 1374 332 351 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 186 205 960, 963, 964 1375 152 246 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 207 351 960, 963, 964 1375 248 303 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 2 23 960, 963, 964 1375 305 345 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 25 114 960, 963, 964 1376 107 201 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 2 38 960, 963, 964 1376 203 258 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 40 129 960, 963, 964 1376 260 300 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 2 39 960, 963, 964 1376 302 342 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 41 117 960, 963, 964 1371 278 303 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 119 208 960, 963, 964 1372 212 237 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 2 42 960, 963, 964 1373 268 293 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 2 39 960, 963, 964 1374 275 300 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 41 117 960, 963, 964 1375 248 273 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 119 208 960, 963, 964 1376 203 228 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 2 26 960, 963, 964 1371 124 155 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 38 135 960, 964 1372 58 89 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 170 211 960, 964 1373 114 145 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 25 136 960, 963, 964 1374 121 152 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 163 260 960, 963, 964 1375 94 125 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 295 336 960, 963, 964 1376 49 80 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 1 38 960, 963, 964 1371 182 241 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 40 151 960, 963, 964 1372 116 175 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 178 275 960, 963, 964 1373 172 231 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 81 117 960, 963, 964 1374 179 238 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 119 230 960, 963, 964 1375 152 211 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 257 350 960, 963, 964 1376 107 166 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 39 136 960, 964 1371 278 325 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 171 212 960, 964 1372 212 259 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 38 135 960, 964 1373 268 315 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 170 211 960, 964 1374 275 322 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 2 64 960, 963, 964 1375 248 295 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 91 188 960, 963, 964 1376 203 250 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 223 264 960, 963, 964 1309 1 69 1114, 1115
1241 81 117 960, 963, 964 1309 71 96 1114, 1115
1241 119 230 960, 963, 964 1309 98 144 1114, 1115
1241 257 351 960, 963, 964 1309 152 195 1114, 1115
1242 2 48 960, 963, 964 1309 197 237 1114, 1115
1242 75 172 960, 963, 964 1309 254 352 1114, 1115
1242 207 248 960, 963, 964 1310 25 92 1114, 1115
1243 118 158 965, 966, 968, 969 1310 94 119 1114, 1115
1243 283 304 965, 966, 968, 969 1310 121 167 1114, 1115
1243 310 348 965, 966, 968, 969 1310 175 218 1114, 1115
1244 165 205 965, 966, 968, 969 1310 220 260 1114, 1115
1244 330 351 965, 966, 968, 969 1310 277 351 1114, 1115
1246 205 245 965, 966, 967, 968, 969 1311 7 74 1114, 1115
1247 206 246 965, 966, 967, 968, 969 1311 76 101 1114, 1115
1248 163 203 965, 966, 968, 969 1311 103 149 1114, 1115
1248 328 349 965, 966, 968, 969 1311 157 200 1114, 1115
1245 1 20 967 1311 202 242 1114, 1115
1245 22 42 967 1311 259 351 1114, 1115
1245 104 135 967 1312 9 76 1114, 1115
1245 137 155 967 1312 78 103 1114, 1115
1245 187 209 967 1312 105 151 1114, 1115
1246 36 58 965, 966, 967, 968, 969 1312 159 202 1114, 1115
1247 37 59 965, 966, 967, 968, 969 1312 204 244 1114, 1115
1244 330 352 965, 966, 968, 969 1312 261 352 1114, 1115
1249 2 20 970, 973, 974, 978, 979 1309 2 69 1114, 1115
1250 5 84 969-971, 973-979 1309 254 327 1114, 1115
1250 86 270 969-971, 973-979 1310 22 92 1114, 1115
1250 278 306 969-971, 973-979 1310 277 350 1114, 1115
1250 326 351 969-971, 973-979 1311 4 74 1114, 1115
1251 2 52 969-971, 973-979 1311 259 332 1114, 1115
1251 54 238 969-971, 973-979 1312 6 76 1114, 1115
1251 246 274 969-971, 973-979 1312 261 334 1114, 1115
1251 294 322 969-971, 973-979 1315 56 87 1117, 1119-1125
1253 115 194 969-971, 973-979 1315 91 114 1117, 1119-1125
1253 196 351 969-971, 973-979 1315 116 144 1117, 1119-1125
1254 3 31 970, 971, 973, 974, 977-979 1315 146 171 1117, 1119-1125
1254 51 79 970, 971, 973, 974, 977-979 1315 185 225 1117, 1119-1125
1255 282 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1315 275 294 1117, 1119-1125
1256 1 53 970, 971, 973-978 1315 317 342 1117, 1119-1125
1256 55 239 970, 971, 973-978 1316 22 45 1117, 1119-1125
1256 247 275 970, 971, 973-978 1316 47 75 1117, 1119-1125
1256 295 323 970, 971, 973-978 1316 77 102 1117, 1119-1125
1257 6 85 970, 971, 973-978 1316 116 156 1117, 1119-1125
1257 87 271 970, 971, 973-978 1316 206 225 1117, 1119-1125
1257 279 307 970, 971, 973-978 1316 248 273 1117, 1119-1125
1257 327 351 970, 971, 973-978 1316 275 317 1117, 1119-1125
1250 1 84 969-971, 973-979 1318 144 175 1117, 1119-1125
1250 326 352 969-971, 973-979 1318 179 202 1117, 1119-1125
1251 294 319 969-971, 973-979 1318 204 232 1117, 1119-1125
1253 112 194 969-971, 973-979 1318 234 259 1117, 1119-1125
1254 51 76 970, 971, 973, 974, 977-979 1318 273 313 1117, 1119-1125
1255 279 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1319 2 20 1117, 1119-1125
1256 295 320 970, 971, 973-978 1319 24 47 1117, 1119-1125
1257 3 85 970, 971, 973-978 1319 49 77 1117, 1119-1125
1252 31 89 972 1319 79 104 1117, 1119-1125
1252 91 236 972 1319 118 158 1117, 1119-1125
1252 238 266 972 1319 208 227 1117, 1119-1125
1252 277 337 972 1319 250 275 1117, 1119-1125
1249 2 23 970, 973, 974, 978, 979 1319 277 319 1117, 1119-1125
1249 25 44 970, 973, 974, 978, 979 1313 17 81 1118, 1125
1250 34 84 969-971, 973-979 1313 92 117 1118, 1125
1251 1 52 969-971, 973-979 1313 137 204 1118, 1125
1251 294 325 969-971, 973-979 1313 215 240 1118, 1125
1251 327 346 969-971, 973-979 1313 242 291 1118, 1125
1253 144 194 969-971, 973-979 1313 293 329 1118, 1125
1254 51 82 970, 971, 973, 974, 977-979 1314 22 89 1118-1125
1254 84 103 970, 971, 973, 974, 977-979 1314 100 125 1118-1125
1255 311 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1314 127 176 1118-1125
1256 3 53 970, 971, 973-978 1314 178 214 1118-1125
1256 295 326 970, 971, 973-978 1317 25 92 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1256 328 347 970, 971, 973-978 1317 103 128 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1257 35 85 970, 971, 973-978 1317 130 179 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1250 47 84 969-971, 973-979 1317 181 217 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1251 15 52 969-971, 973-979 1314 332 351 1118-1125
1253 157 194 969-971, 973-979 1315 27 51 1117, 1119-1125
1255 324 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1316 275 306 1117, 1119-1125
1256 16 53 970, 971, 973-978 1318 115 139 1117, 1119-1125
1257 48 85 970, 971, 973-978 1319 277 308 1117, 1119-1125
1250 2 84 969-971, 973-979 1314 330 351 1118-1125
1250 86 241 969-971, 973-979 1315 25 51 1117, 1119-1125
1251 54 209 969-971, 973-979 1316 275 303 1117, 1119-1125
1253 1 68 969-971, 973-979 1317 333 351 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1253 91 194 969-971, 973-979 1318 113 139 1117, 1119-1125
1253 196 352 969-971, 973-979 1319 277 305 1117, 1119-1125
1255 169 235 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1314 262 293 1118-1125
1255 258 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1314 295 314 1118-1125
1256 55 210 970, 971, 973-978 1314 316 351 1118-1125
1257 1 85 970, 971, 973-978 1315 11 51 1117, 1119-1125
1257 87 242 970, 971, 973-978 1317 265 296 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1250 86 110 969-971, 973-979 1317 298 317 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1251 54 78 969-971, 973-979 1317 319 351 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1253 2 68 969-971, 973-979 1318 45 76 1117, 1119-1125
1253 196 220 969-971, 973-979 1318 78 97 1117, 1119-1125
1255 39 130 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1318 99 139 1117, 1119-1125
1255 132 235 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1316 275 324 1117, 1119-1125
1256 55 79 970, 971, 973-978 1319 277 326 1117, 1119-1125
1257 87 111 970, 971, 973-978 1299 50 96 1126-1131, 1651-1653
1250 326 350 969-971, 973-979 1300 2 43 1126-1131, 1651-1653
1251 294 318 969-971, 973-979 1300 66 112 1126-1131, 1651-1653
1253 110 194 969-971, 973-979 1300 123 154 1126-1131, 1651-1653
1254 51 75 970, 971, 973, 974, 977-979 1300 183 211 1126-1131, 1651-1653
1255 277 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1300 213 232 1126-1131, 1651-1653
1256 295 319 970, 971, 973-978 1300 264 310 1126-1131, 1651-1653
1257 327 352 970, 971, 973-978 1301 1 35 1126-1131
1250 32 84 969-971, 973-979 1301 37 84 1126-1131
1253 142 194 969-971, 973-979 1301 107 153 1126-1131
1255 309 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1301 164 195 1126-1131
1257 33 85 970, 971, 973-978 1301 224 252 1126-1131
1249 46 68 970, 973, 974, 978, 979 1301 254 273 1126-1131
1250 61 84 969-971, 973-979 1301 305 351 1126-1131
1251 29 52 969-971, 973-979 1302 26 54 1126-1131, 1651-1653
1253 171 194 969-971, 973-979 1302 56 75 1126-1131, 1651-1653
1254 105 127 970, 971, 973, 974, 977-979 1302 107 153 1126-1131, 1651-1653
1256 30 53 970, 971, 973-978 1303 11 39 1126-1131, 1651-1653
1257 62 85 970, 971, 973-978 1303 41 60 1126-1131, 1651-1653
1259 192 226 999-1004 1303 92 138 1126-1131, 1651-1653
1259 249 298 999-1004 1299 50 114 1126-1131, 1651-1653
1259 321 352 999-1004 1299 131 162 1126-1131, 1651-1653
1260 190 224 999-1004 1299 215 236 1126-1131, 1651-1653
1260 247 296 999-1004 1299 248 270 1126-1131, 1651-1653
1260 319 351 999-1004 1299 272 309 1126-1131, 1651-1653
1261 99 133 999-1004 1300 264 328 1126-1131, 1651-1653
1261 156 205 999-1004 1302 107 171 1126-1131, 1651-1653
1261 228 289 999-1004 1302 188 219 1126-1131, 1651-1653
1261 300 334 999-1004 1302 272 293 1126-1131, 1651-1653
1262 82 116 999-1004 1302 305 327 1126-1131, 1651-1653
1262 139 188 999-1004 1302 329 351 1126-1131, 1651-1653
1262 211 272 999-1004 1303 92 156 1126-1131, 1651-1653
1262 283 317 999-1004 1303 173 204 1126-1131, 1651-1653
1262 319 350 999-1004 1303 257 278 1126-1131, 1651-1653
1263 324 351 999-1004 1303 290 312 1126-1131, 1651-1653
1264 191 225 999-1004 1303 314 351 1126-1131, 1651-1653
1264 248 297 999-1004 1299 272 352 1126-1131, 1651-1653
1264 320 351 999-1004 1299 272 344 1126-1131, 1651-1653
1265 98 132 999-1004 1299 272 318 1126-1131, 1651-1653
1265 155 204 999-1004 1299 272 310 1126-1131, 1651-1653
1265 227 288 999-1004 1304 2 25 1132, 1134, 1135, 1136
1265 299 333 999-1004 1304 36 169 1132, 1134, 1135, 1136
1259 95 145 999-1004 1304 186 214 1132, 1134, 1135, 1136
1259 165 226 999-1004 1304 231 250 1132, 1134, 1135, 1136
1260 93 143 999-1004 1304 264 307 1132, 1134, 1135, 1136
1260 163 224 999-1004 1306 2 70 1132, 1134, 1135, 1136
1261 1 52 999-1004 1306 87 115 1132, 1134, 1135, 1136
1261 72 133 999-1004 1306 132 151 1132, 1134, 1135, 1136
1262 1 35 999-1004 1306 165 208 1132, 1134, 1135, 1136
1262 55 116 999-1004 1307 1 27 1132, 1134, 1135, 1136
1263 227 277 999-1004 1307 29 69 1132, 1134, 1135, 1136
1263 297 351 999-1004 1307 80 213 1132, 1134, 1135, 1136
1264 94 144 999-1004 1307 230 258 1132, 1134, 1135, 1136
1264 164 225 999-1004 1307 275 294 1132, 1134, 1135, 1136
1265 2 51 999-1004 1307 308 351 1132, 1134, 1135, 1136
1265 71 132 999-1004 1308 2 33 1132, 1134, 1135, 1136
1259 15 40 999-1004 1308 44 177 1132, 1134, 1135, 1136
1259 42 64 999-1004 1308 194 222 1132, 1134, 1135, 1136
1259 66 88 999-1004 1308 239 258 1132, 1134, 1135, 1136
1259 90 145 999-1004 1308 272 315 1132, 1134, 1135, 1136
1259 165 219 999-1004 1347 2 28 1132, 1134, 1135, 1136
1260 13 38 999-1004 1347 39 172 1132, 1134, 1135, 1136
1260 40 62 999-1004 1347 189 217 1132, 1134, 1135, 1136
1260 64 86 999-1004 1347 234 253 1132, 1134, 1135, 1136
1260 88 143 999-1004 1347 267 310 1132, 1134, 1135, 1136
1260 163 217 999-1004 1305 1 133 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261 2 52 999-1004 1305 135 154 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261 72 126 999-1004 1305 156 178 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1262 55 109 999-1004 1305 195 280 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 1 60 999-1004 1305 330 351 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 105 127 999-1004 1344 13 35 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 147 172 999-1004 1344 52 137 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 174 196 999-1004 1344 187 208 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 198 220 999-1004 1345 50 181 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 222 277 999-1004 1345 183 202 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 297 352 999-1004 1345 204 226 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1264 14 39 999-1004 1345 243 328 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1264 41 63 999-1004 1346 2 81 1133, 1137, 1138
1264 65 87 999-1004 1346 131 152 1133, 1137, 1138
1264 89 144 999-1004 1304 1 25 1132, 1134, 1135, 1136
1264 164 218 999-1004 1304 264 334 1132, 1134, 1135, 1136
1265 71 125 999-1004 1306 165 235 1132, 1134, 1135, 1136
1259 190 226 999-1004 1307 46 69 1132, 1134, 1135, 1136
1260 188 224 999-1004 1308 10 33 1132, 1134, 1135, 1136
1261 97 133 999-1004 1308 272 342 1132, 1134, 1135, 1136
1262 80 116 999-1004 1347 5 28 1132, 1134, 1135, 1136
1263 322 351 999-1004 1347 267 337 1132, 1134, 1135, 1136
1264 189 225 999-1004 1304 101 169 1132, 1134, 1135, 1136
1265 96 132 999-1004 1306 1 70 1132, 1134, 1135, 1136
1259 96 145 999-1004 1306 237 310 1132, 1134, 1135, 1136
1260 94 143 999-1004 1306 312 352 1132, 1134, 1135, 1136
1261 3 52 999-1004 1307 145 213 1132, 1134, 1135, 1136
1263 228 277 999-1004 1308 109 177 1132, 1134, 1135, 1136
1264 95 144 999-1004 1347 104 172 1132, 1134, 1135, 1136
1265 1 51 999-1004 1307 38 69 1132, 1134, 1135, 1136
1259 165 218 999-1004 1308 1 33 1132, 1134, 1135, 1136
1260 163 216 999-1004 1344 187 239 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261 72 125 999-1004 1344 241 272 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1262 55 108 999-1004 1344 286 308 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 2 60 999-1004 1344 310 329 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 297 350 999-1004 1346 131 183 1133, 1137, 1138
1264 164 217 999-1004 1346 185 216 1133, 1137, 1138
1265 71 124 999-1004 1346 230 252 1133, 1137, 1138
1266 2 39 1016-1023 1346 254 273 1133, 1137, 1138
1266 41 87 1016-1023 1305 227 280 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1266 89 129 1016-1023 1344 84 137 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1267 2 74 1016-1023 1345 275 328 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1267 76 122 1016-1023 1346 28 81 1133, 1137, 1138
1267 124 164 1016-1023 1346 290 351 1133, 1137, 1138
1268 2 53 1016-1023 1348 44 66 1139, 1140, 1141, 1142
1268 55 101 1016-1023 1348 104 129 1139, 1140, 1141, 1142
1268 103 143 1016-1023 1348 131 156 1139, 1140, 1141, 1142
1269 2 72 1016-1023 1348 158 195 1139, 1140, 1141, 1142
1269 74 120 1016-1023 1348 167 189 1139, 1140, 1141, 1142
1269 122 162 1016-1023 1348 197 237 1139, 1140, 1141, 1142
1270 2 107 1016-1023 1348 215 234 1139, 1140, 1141, 1142
1270 109 155 1016-1023 1348 4 49 1139, 1140, 1141, 1142
1270 157 197 1016-1023 1348 4 74 1139, 1140, 1141, 1142
1271 2 62 1016-1023 1348 4 85 1139, 1140, 1141, 1142
1271 64 110 1016-1023 1349 19 90 1143
1271 112 152 1016-1023 1349 146 207 1143
1266 131 177 1016-1023 1349 209 256 1143
1266 179 207 1016-1023 1350 32 51 1144-1151, 1703
1266 209 243 1016-1023 1350 71 90 1144-1151, 1703
1267 166 212 1016-1023 1351 118 137 1144-1151
1267 214 242 1016-1023 1351 157 176 1144-1151
1267 244 278 1016-1023 1353 81 100 1144-1151
1268 145 191 1016-1023 1353 120 139 1144-1151
1268 193 221 1016-1023 1354 1 42 1144-1151
1268 223 257 1016-1023 1354 218 237 1144-1151
1269 164 210 1016-1023 1354 257 276 1144-1151
1269 212 240 1016-1023 1356 43 62 1144-1151
1269 242 276 1016-1023 1356 82 101 1144-1151
1270 199 245 1016-1023 1350 176 201 1144-1151, 1703
1270 247 275 1016-1023 1350 209 231 1144-1151, 1703
1270 277 311 1016-1023 1350 236 267 1144-1151, 1703
1271 154 200 1016-1023 1351 262 287 1144-1151
1271 202 230 1016-1023 1351 295 317 1144-1151
1271 232 266 1016-1023 1351 322 351 1144-1151
1266 209 294 1016-1023 1353 225 250 1144-1151
1266 296 316 1016-1023 1353 258 280 1144-1151
1267 1 74 1016-1023 1353 285 316 1144-1151
1267 244 329 1016-1023 1356 187 212 1144-1151
1267 331 351 1016-1023 1356 220 242 1144-1151
1268 223 308 1016-1023 1356 247 278 1144-1151
1268 310 330 1016-1023 1350 236 265 1144-1151, 1703
1269 242 327 1016-1023 1351 322 352 1144-1151
1269 329 349 1016-1023 1353 285 314 1144-1151
1270 35 107 1016-1023 1356 247 276 1144-1151
1270 277 351 1016-1023 1350 287 306 1144-1151, 1703
1271 232 317 1016-1023 1350 323 348 1144-1151, 1703
1271 319 339 1016-1023 1352 2 21 1147, 1150, 1151, 1703
1266 296 318 1016-1023 1352 38 63 1147, 1150, 1151, 1703
1267 4 74 1016-1023 1355 5 24 1147, 1150, 1151, 1703
1268 310 332 1016-1023 1355 41 66 1147, 1150, 1151, 1703
1269 1 72 1016-1023 1356 298 317 1144-1151
1269 329 351 1016-1023 1358 322 351 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1270 37 107 1016-1023 1364 262 291 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1271 319 341 1016-1023 1366 229 258 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1266 131 157 1016-1023 1367 154 183 1079-1082, 1152-1154
1267 166 192 1016-1023 1361 2 41 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1268 145 171 1016-1023 1210 1 35 1431
1269 164 190 1016-1023 1211 30 63 1431
1270 199 225 1016-1023 1213 15 48 1431
1271 154 180 1016-1023 1217 19 52 1431
1295 113 168 1026, 1027, 1024 1357 162 200 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295 170 201 1026, 1027, 1024 1358 124 162 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295 203 233 1026, 1027, 1024 1359 130 168 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295 236 258 1026, 1027, 1024 1360 137 175 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297 128 183 1026, 1027, 1024 1361 163 201 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297 185 216 1026, 1027, 1024 1362 130 168 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297 218 248 1026, 1027, 1024 1363 132 170 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1296 1 44 1025, 1028, 1029, 1515-1518, 1520 1364 64 102 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298 7 57 1025, 1028, 1029 1365 134 172 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298 59 96 1025, 1028, 1029 1366 31 69 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298 110 132 1025, 1028, 1029 1054 198 244 1492, 1496, 1497, 1498
1298 143 210 1025, 1028, 1029 1054 285 319 1492, 1496, 1497, 1498
1295 17 87 1026, 1027, 1024 1056 191 237 1492, 1496, 1497, 1498
1297 32 102 1026, 1027, 1024 1056 278 312 1492, 1496, 1497, 1498
1294 127 153 1027 1057 14 60 1492, 1496, 1497, 1498
1295 17 46 1026, 1027, 1024 1057 101 135 1492, 1496, 1497, 1498
1297 32 61 1026, 1027, 1024 1057 233 264 1492, 1496, 1497, 1498
1298 5 57 1025, 1028, 1029 1060 269 315 1492, 1496, 1497, 1498
1320 249 268 1033, 1035, 1076 1390 10 50 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1324 2 23 1036, 1037, 1038 1390 142 173 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1326 14 38 1036, 1037, 1038 1391 73 104 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1326 95 117 1036, 1037, 1038 1055 85 131 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1326 152 174 1036, 1037, 1038 1058 117 163 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1326 227 248 1036, 1037, 1038 1059 118 164 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1327 44 65 1036, 1037, 1038 1061 109 155 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1321 65 86 1037 1062 222 268 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1321 88 132 1037 1063 262 308 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1322 2 34 1037 1054 15 64 1492, 1496, 1497, 1498
1322 36 67 1037 1054 165 196 1492, 1496, 1497, 1498
1322 135 156 1037 1056 8 57 1492, 1496, 1497, 1498
1322 158 202 1037 1056 158 189 1492, 1496, 1497, 1498
1323 1 35 1037 1060 86 135 1492, 1496, 1497, 1498
1323 37 68 1037 1060 236 267 1492, 1496, 1497, 1498
1323 136 157 1037 1386 199 248 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1323 159 203 1037 1388 212 261 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1324 2 51 1036, 1037, 1038 1391 286 335 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1324 56 93 1036, 1037, 1038 1384 311 351 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1324 95 126 1036, 1037, 1038 1385 312 351 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1324 194 215 1036, 1037, 1038 1387 83 123 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1324 217 261 1036, 1037, 1038 1389 162 202 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1325 2 31 1037 1296 69 101 1025, 1028, 1029, 1515, 1516, 1517, 1518, 1520
1325 33 64 1037 909 305 340 1531
1325 132 153 1037 960 70 101 1543, 1551
1325 155 199 1037 964 259 290 1543, 1551
1326 227 276 1036, 1037, 1038 1305 180 226 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1326 281 318 1036, 1037, 1038 1133 195 226 1580, 1581
1326 320 350 1036, 1037, 1038 1137 52 83 1580, 1581
1327 44 93 1036, 1037, 1038 1344 37 83 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 98 135 1036, 1037, 1038 1345 228 274 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 137 168 1036, 1037, 1038 1305 180 217 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 236 257 1036, 1037, 1038 1344 37 74 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 259 303 1036, 1037, 1038 1345 228 265 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1324 2 24 1036, 1037, 1038 1039 176 210 1590, 1594, 1597, 1598
1326 227 249 1036, 1037, 1038 1040 142 176 1590, 1594, 1597, 1598
1327 44 66 1036, 1037, 1038 1041 248 282 1590, 1594, 1597, 1598
1328 3 59 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1042 141 175 1590, 1594, 1597, 1598
1328 70 146 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1328 175 209 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328 148 215 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1331 2 54 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328 232 263 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1331 200 234 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328 328 350 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1332 142 176 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1329 22 53 1039-1043 1045 1333 176 210 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1329 118 140 1039-1043 1045 1334 16 68 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1330 31 62 1039-1043 1045 1334 214 248 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1330 127