Антитело к il-13ra2 и его применение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, которое специфически распознает человеческий IL-13RA2, а также многофункциональный иммуноконъюгат и химерный антигенный рецептор на основе такого антитела. Кроме того, рассмотрена нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, вирус, иммунная клетка, фармацевтическая композиция, набор и применение. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии опухолей, экспрессирующих человеческий IL-13RA2. 11 н. и 9 з.п. ф-лы, 24 ил., 1 табл., 12 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области опухолевой иммунотерапии или диагностики и более конкретно к антителу, которое специфично распознает IL-13RA2, и его применению.

Предшествующий уровень техники

Каждый год в США насчитывается 20000 новых случаев злокачественной глиомы (MG - malignant gliomas), включая плеоморфную глиобластому и глиобластому. Согласно статистическим данным Американской ассоциации по онкологии мозга, на 2010 г., у 140000 человек в США имеются злокачественные опухоли мозга. Несмотря на то что MG является редким заболеванием, степень его злокачественности и смертность в результате него являются очень высокими. Стандартные средства лечения в настоящее время имеют очень ограниченные эффекты, и показатель пятилетней выживаемости после хирургического вмешательства и радиотерапии также является очень низким. Для пациентов, которые с рецидивом после хирургического вмешательства, существует очень мало новых вариантов лечения. Таким образом, разработка новых мишеней и новых средств лечения является острой необходимостью для большинства пациентов.

Альфа-субъединица 2 рецептора интерлейкина 13 (IL-13RA2) представляет собой опухолеспецифичный маркер, который специфично на высоком уровне экспрессируется на поверхности злокачественной опухолевой клетки, такой как глиома (Dehinski et al., (1995) Clin.Cancer Res.1, 1253-1258) или тому подобное. IL-13RA2 человека в качестве мишени лечения в случае глиомы человека привлекла внимание FDA (Food and Drug Administration - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) США с 1988, и организация последовательно получила лекарственное средство IL-13-PE38 для IL-13RA2 человека в качестве мишени лечения и слитую молекулу на основе одноцепочечного антитела scFv-PE (single-chain variable fragment-одноцепочечный вариабельный фрагмент; phycoerythrin - фикоэритрин) для IL-13RA2 человека. Несмотря на то что IL-13-PE38 достигло эффективности в лечении злокачественных опухолей, таких как глиома, опухоль головы и шеи, рак яичника и рак почки, и было одобрено FDA США для клинического лечения, однако в процессе лечения IL-13-PE38 не только связывается с IL-13RA2 человека, специфично экспрессируемым на поверхности опухолевой клетки, но также связывается с IL13-RA1, экспрессируемым на поверхности клеток нормальных тканей, повреждая нормальные ткани и клетки. Дальнейшее применение IL-13-PE38 ограничено вследствие отсутствия точного нацеливания.

Цель изобретение состоит в обнаружении антитела, специфичного к IL-13RA2, и разработке эффекторной иммунной клетки, нацеленной на IL-13RA2.

Краткое описание изобретения

Объектом изобретения является обеспечение антитела против IL-13RA2 и его применения.

В первом аспекте изобретение обеспечивает антитело, которое специфично распознает IL-13RA2, где EC50 относительной аффинности связывания антитела с клетками U251, эндогенно экспрессирующими IL-13RA2, составляет не выше чем 100 нМ, предпочтительно не выше чем 10 нМ, более предпочтительно от 0,01 до 10 нМ.

В предпочтительном примере используют программное обеспечение GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) при обработке данных по относительной аффинности.

В конкретном воплощении антитело выбрано из любых следующих антител:

(1) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 или 64, и/или HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 или 66, и/или HCDR3, представленную в любой из SEQ ID NO: 11 или 12;

(2) антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, и/или LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и/или LCDR3, представленную в любой из SEQ ID NO: 15 или 16;

(3) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела (1) и вариабельную область легкой цепи антитела (2); и

(4) антитело, которое представляет собой вариант антитела согласно любому из (1) - (3), и обладает активностью, идентичной или схожей с активностью антитела согласно любому из (1)-(3).

В конкретном воплощении антитело выбрано из любых следующих антител:

(1) антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или последовательность варианта SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8;

(2) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 или 61, или вариант последовательности;

(3) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела (1) и вариабельную область легкой цепи антитела (2).

В конкретном воплощении вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16.

В конкретном воплощении вариабельная область легкой цепи антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или 8, или имеет последовательность с по меньшей мере 80 %, например, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % сходством с любой их указанных выше последовательностей.

В конкретном воплощении вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 или 64, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 или 66, и HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.

В конкретном воплощении вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID NOs: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 или 61, или имеет последовательность с по меньшей мере 80 %, более предпочтительно 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % сходством с любой из указанных выше последовательностей.

В конкретном воплощении области CDR (complementarity-determining region-область, определяющая комплементарность) вариабельной области легкой цепи и области CDR вариабельной области тяжелой цепи имеют следующие возможные последовательности или их варианты:

(1) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(2) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 16; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 12;

(3) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 16; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 64, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 66, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 12;

(4) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 45, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 52, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(5) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 16; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 63, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 65, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 12;

(6) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 50, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 56, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(7) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 46, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 52, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(8) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 48, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 54, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(9) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 47, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 53, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(10) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 49, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 55, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(11) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 51, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 57, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11; или

(12) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 49, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 58, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO:11.

В конкретном воплощении:

(1) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или ее варианта;

(2) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или ее варианта;

(3) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61, или ее варианта;

(4) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, или ее варианта;

(5) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, или ее варианта;

(6) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, или ее варианта;

(7) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31, или ее варианта;

(8) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, или ее варианта;

(9) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, или ее варианта;

(10) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, или ее варианта;

(11) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, или ее варианта; или

(12) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или ее варианта, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43, или ее варианта;

Во втором аспекте изобретения обеспечивает антитело, которое специфично распознает IL-13RA2, где антитело распознает ту же антигенную детерминанту, что и антитело по первому аспекту.

В третьем аспекте изобретение обеспечивает антитело, которое специфично распознает IL-13RA2, где антитело конкурирует за связывание с IL-13RA2 с антителом по первому аспекту.

В четвертом аспекте изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующей антитело по аспектам с первого по третий.

В пятом аспекте изобретение обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по четвертому аспекту.

В шестом аспекте изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащей экспрессионный вектор по пятому аспекту или имеющая нуклеиновую кислоту по четвертому аспекту, интегрированную в геном.

В седьмом аспекте изобретение обеспечивает многофункциональный иммуноконъюгат, содержащий:

антитело по аспектам с первого по третий; и

связанную с ним функциональную молекулу; причем функциональная молекула выбрана из молекулы, которая нацелена на маркер поверхности опухолевой клетки, молекулы, которая ингибирует опухоль, молекулы, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, или детектируемой метки.

В конкретном воплощении молекула, которая нацелена на маркер поверхности опухолевой клетки, представляет собой антитело или лиганд, который связывается с маркером поверхности опухолевой клетки, отличным от IL-13RA2; или

молекула, которая ингибирует опухоль, представляет собой противоопухолевый цитокин или противоопухолевый токсин; предпочтительно, цитокин выбран из IL-12, IL-15, интерферона типа I и ФНО-альфа.

В конкретном воплощении молекула, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности иммунной клетки, предпочтительно, связанный маркер поверхности иммунной клетки выбран из CD3, CD16 и CD28, и более предпочтительно антитело, которое связывается с маркером поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело против CD3.

В конкретном воплощении молекула, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности T-клетки, и образует бифункциональное антитело с антителом по любому из первого-третьего аспектов, в которых задействованы T-клетки.

В конкретном воплощении многофункциональный иммуноконъюгат представляет собой слитый полипептид, дополнительно содержащий линкерный пептид между антителом по любому из аспектов с первого по третий и связанной с ним функциональной молекулой.

В восьмом аспекте изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующей многофункциональный иммуноконъюгат по седьмому аспекту.

В девятом аспекте изобретение обеспечивает химерный антигенный рецептор антитела по аспектам с первого по третий, где химерный антигенный рецептор содержит антитело по аспектам с первого по третий, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область, соединенные последовательно.

В конкретном воплощении внутриклеточная сигнальная область выбрана из функциональных сигнальных доменов белков CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, FcRγ (FCER1G), FcRβ (FcεR1b), CD79a, CD79b, FcγRIIa, DAP10 и DAP12 или их комбинации.

В конкретном воплощении внутриклеточная сигнальная область дополнительно имеет костимулирующий сигнальный домен, и костимулирующий сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из: CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, ассоциированного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганда, специфично связывающегося с CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46 и NKG2D или их комбинации.

В конкретном воплощении химерный антигенный рецептор содержит антитело, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область, соединенные последовательно следующим образом:

антитело по аспектам с первого по третий, CD8 и CD3ζ;

антитело по аспектам с первого по третий, CD8, CD137 и CD3ζ; или

антитело по аспектам с первого по третий, трансмембранная область молекулы CD28, внутриклеточная сигнальная область молекулы CD28, и CD3ζ; или

антитело по аспектам с первого по третий, трансмембранная область молекулы CD28, внутриклеточная сигнальная область молекулы CD28, CD137 и CD3ζ.

В десятом аспекте изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующей химерный антигенный рецептор по девятому аспекту.

В одиннадцатом аспекте изобретение обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по десятому аспекту.

В двенадцатом аспекте изобретение обеспечивает вирус, содержащий вектор по одиннадцатому аспекту.

В тринадцатом аспекте согласно изобретение обеспечивает иммунную клетку, модифицированная химерным антигенным рецептором, где иммунная клетка трансдуцирована нуклеиновой кислотой по десятому аспекту или экспрессионным вектором по одиннадцатому аспекту или вирусом по двенадцатому аспекту; или экспрессирует химерный антигенный рецептор по девятому аспекту на поверхности;

предпочтительно, иммунная клетка представляет собой: T-лимфоцит, NK-клетку (Natural killer - естественный киллер) или NKT-лимфоцит.

В конкретном воплощении иммунная клетка дополнительно несет кодирующую последовательность экзогенного цитокина; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует другой химерный антигенный рецептор, который не содержат CD3ζ; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует хемокиновый рецептор; предпочтительно хемокиновый рецептор включает CCR; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует миРНК (малая интерферирующая РНК), которая уменьшает экспрессию PD-1, или белок, который блокирует PD-L1; или эндогенный PD-1 в иммунной клетке подвергается нокауту посредством метода генной редактирования гена; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует «предохранитель» (safety switch).

В четырнадцатом аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую:

антитело по аспектам с первого по третий или нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело; или

иммуноконъюгат по седьмому аспекту или нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноконъюгат; или

химерный антигенный рецептор по девятому аспекту или нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор; или

иммунную клетку, модифицированную химерным антигенным рецептором, по тринадцатому аспекту;

и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В пятнадцатом аспекте изобретение обеспечивает набор, содержащий:

контейнер и фармацевтическую композицию по четырнадцатому аспекту в контейнере; или

контейнер и антитело по аспектам с первого по третий или нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело в контейнере; или иммуноконъюгат по седьмому аспекту или нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноконъюгат; или химерный антигенный рецептор по девятому аспекту или нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор; или клетку, модифицированную химерным антигенным рецептором, по тринадцатому аспекту.

В шестнадцатом аспекте изобретение обеспечивает применение антитела по аспектам с первого по третий или нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело; или иммуноконъюгата по седьмому аспекту или нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноконъюгат; или химерного антигенного рецептора по девятому аспекту или нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор; или применение иммунной клетки, модифицированной химерным антигенным рецептором, по тринадцатому аспекту для лечения опухоли, экспрессирующей IL-13RA2,

предпочтительно, опухоль, экспрессирующая IL-13RA2, представляет собой рак мозга, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак кишечника, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, рак предстательной железы и саркому Капоши. Более предпочтительно, рак мозга выбран из астроцитомы, менингиомы, олигодендроглиомы и глиомы.

Следует понимать, что все из различных технических признаков, описанных выше, и конкретно описанных ниже в данном документе (как например, раздел с примерами), можно объединять друг с другом в пределах объема изобретения, таким образом, чтобы образовать новые или предпочтительные технические решения. Из-за нехватки места они не будут повторяться здесь.

Описание графических материалов

На Фиг. 1 показана электроферограмма SDS (sodium dodecyl sulphate -додецилсульфат натрия) (восстановительные условия) IL-13RA2_huFc и IL13RA1_huFc;

На Фиг. 2 показано обнаружение связывания 31C2 и 32H4 с IL-13RA2 и IL13Ra1 посредством ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay - иммуноферментный анализ);

На Фиг. 3 показано обнаружение связывания антител 31C2 и 32H4 с IL-13RA2 мыши посредством ИФА;

На Фиг. 4 показано обнаружение связывания антител 31C2 и 32H4 с клетками U251 (IL-13RA2-позитивные) и 293T (IL-13RA2-негативные) посредством FACs (fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активацией флуоресценции);

На Фиг. 5 показано обнаружение аффинности антител 31C2 и 32H4 (scFv_Fc) посредством Biacore;

На Фиг. 6 показано обнаружение EC50 связывания антител 31C2 и 32H4 с клетками U215 посредством FACs;

На Фиг. 7 показана информация о праймерах в отношении созревания аффинности;

На Фиг. 8 показана константа диссоциации Kd 10 клонов, подвергавшихся скринингу после созревания аффинности;

На Фиг. 9A показано выравнивание последовательностей тяжелой цепи клонов 31C2 с созревшей аффинностью, на Фиг. 9B показаны последовательности HCDR1 и HCDR2 клонов 31C2 с созревшей аффинностью, на Фиг. 9C показано выравнивание последовательностей тяжелой цепи клонов 32H4 с созревшей аффинностью, и на Фиг. 9D показаны последовательности HCDR1 и HCDR2 клонов 32H4 с созревшей аффинностью;

На Фиг. 10A показаны константы ассоциации и диссоциации антител с созревшей аффинностью; и на Фиг. 10B показаны конкретные результаты идентификации антител 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 и 1B11;

На Фиг. 11A показаны результаты выходов форм scFv_Fc антител в 30 мл системах экспрессии и анализа степени агрегации очищенных продуктов после созревания аффинности; На Фиг. 11B-G показана аффиность форм scFv_Fc антител; и на Фиг. 11H показаны результаты по константам ассоциации и диссоциации антител;

На Фиг. 12 показана EC₅₀ связывания форм scFv_Fc антител 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 и 1B11 с клетками U251; и

На Фиг. 13 показана цитолитическая активность in vitro разных CAR-T-клеток (Т-клетки c химерным антигенным рецептором).

Подробное описание изобретения

Авторы изобретения получают антитела, которые специфично распознают IL-13RA2, включая одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела, посредством интенсивного исследования и скрининга. Антитело по изобретению можно использовать в изготовлении разных нацеленных противоопухолевых лекарственных средств, а также лекарственных средств для диагностирования опухоли.

Для того чтобы упростить понимание изобретения, сначала даны определения некоторых терминов.

Термин «IL-13RA2», также называемый в данном документе CD213A2, представляет собой субъединицу комплекса рецептора интерлейкина-13. Она представляет собой трансмембранный белок, состоящий из 380 аминокислотных остатков (референсная последовательность NCBI (National Center for Biotechnological Information - Национальный центр биотехнологической информации США): NP_000631.1). Она схожа с IL-13RA1 (Референсная последовательность NCBI: NP_001551.1) и крепко связывается с IL-13, но не имеет внутриклеточного сигнального домена.

Термин «антитело» в данном документе относится к антигенсвязывающему белку иммунной системы; и включает интактное полноразмерное антитело, имеющее антигенсвязывающую область, и также фрагмент, имеющий «антигенсвязывающую часть» или «антигенсвязывающую область», или одну его часть в виде одноцепочечного вариабельного фрагмента», или его одну цепь, как например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), а также вариант антитела, предложенный в данном документе. Фрагмент антитела включает, но не ограничивается следующими фрагментами: (i) фрагмент Fab, который состоит из доменов VL, VH, CL и CH1 и включает Fab’ и Fab’-SH, (ii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iii) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) фрагмент dAb, состоящий из одной вариабельной области (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546); (v) фрагмент F(ab')₂, который представляет собой бивалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента Fab; (vi) антигенсвязывающий сайт одноцепочечной молекулы Fv; (vii) биспецифичный димер одноцепочечного Fv (PCT/US 92/09965); (viii) «диатело» или «триатело», многовалентный или мультиспецифичный фрагмент, сконструированный посредством генетического слияния; и (ix) scFv, генетически слитый с тем же или другим антителом.

Термин «Fc» или «область Fc» в данном документе включает полипептид, содержащий константную область антитела, отличную от первого домена константной области иммуноглобулина. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константной области IgA, IgD и IgG, последним трем доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM и гибким шарнирным областям на N-концах данных доменов. В случае IgA и IgM Fc может содержать цепь J. В случае IgG Fc содержит домены иммуноглобулина Cγ2 и Cγ3 и шарнирную область между Cγ1 и Cγ2. Несмотря на то, что границы области Fc могут варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определена как содержащая остаток C226 или P230 на своем С-конце, где нумерация основана на EU-индексе Kabat. В случае IgG1 человека в данном документе определено, что Fc содержит остаток P232 на своем C-конце, где нумерация основана на EU-индексе Kabat. Fc может относиться к выделенной области или области в окружающей среде полипептида Fc (как например, антитело). Упомянутая выше «шарнирная область» включает гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно, домен CH1 IgG кончается в положении EU220, и домен CH2 IgG начинается с остатка EU237. Таким образом, в случае IgG, шарнирная область антитела, как определено в данном документе, содержит положения от 221 (D221 IgG1) до 231 (A231 IgG1), где нумерация основана на EU-индексе Kabat.

Термин «вариант» относится к одному или более чем одному активному полипептиду, который имеет по существу такую же аминокислотную последовательность или кодируется по существу такой же нуклеотидной последовательностью, как и последовательность антитела, предложенного в настоящей заявке. Вариант обладает такой же или схожей активностью, что и антитело, предложенное в примерах настоящей заявки.

Вариант имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, по сравнению с исходным антителом. В конкретном воплощении последовательность варианта в данному документе предпочтительно обладает по меньшей мере примерно 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью исходного антитела. Вариант может относиться к как таковому антителу и также может относиться к композиции, содержащей исходное антитело. Термин «аминокислотная модификация» включает в себя аминокислотные замены, вставки и/или делеции, «аминокислотная замена» означает замещение аминокислоты в конкретном положении в последовательности исходного полипептида другой аминокислотой, «аминокислотная вставка» означает добавление аминокислоты в конкретном положении в последовательности исходного полипептида, и «аминокислотная делеция» или «делеция» означает удаление аминокислоты в конкретном положении в последовательности исходного полипептида.

«Аминокислотную модификацию» можно вводить в антитело по изобретению стандартными методиками, известными в данной области, такими как сайтонаправленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, который имеет схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в данной области. Данные семейства содержат аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), с кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, серин, треонин, тирозин, цистеин и триптофан), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин и метионин), с β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин и изолейцин), и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин). Таким образом, один или более чем один аминокислотный остаток в областях CDR или в каркасных областях антитела по изобретению может быть замещен другими аминокислотными остатками, принадлежащими к такому же семейству боковых цепей, и можно тестировать функцию, сохраняющуюся измененным антителом (вариантом антитела).

Термин «исходное антитело», как упоминается выше, относится к антителу, предложенному настоящей заявкой, или антителу, полученному посредством мутации, созревания аффинности или другими средствами обработки, на основе антитела, предложенного настоящей заявкой, и предпочтительно относится к антителам, показанным в примерах. Исходное антитело может представлять собой встречающееся в природе антитело или вариант или модифицированную версию встречающегося в природе антитела. Исходное антитело может относиться к самому антителу, композиции, содержащей исходное антитело, или кодирующей аминокислотной последовательности исходного антитела.

Термин «антигенная детерминанта», в том виде, в котором он используется в данном документе, также называется антигенным эпитопом, может состоять из непрерывной последовательности белковой последовательности IL-13RA2 или может состоять из фрагментарной трехмерной структуры последовательности белка IL-13RA2.

Антитело против IL-13RA2

В настоящем документе описан антигенсвязывающий белок, включая антитело, имеющий антигенсвязывающую область, на основе scFv. scFv выбран из библиотеки фагового дисплея scFv человека с использованием рекомбинантного IL-13RA2. Данные молекулы демонстрируют высокую специфичность. Например, антитело распознает только IL-13RA2 и не распознает IL-13RA1. В изобретении IL-13RA2 относится к IL-13RA2 человека, если не указано иное.

В некоторых воплощениях изобретение охватывает антитело, имеющее последовательность scFv, слитую с одной или более чем одной константной областью тяжелой цепи, с образованием антитела, имеющего область Fc иммуноглобулина человека, с получением бивалентного белка, что, таким образом, повышает общую аффинность и стабильность антитела. Кроме того, Fc-часть делает возможной прямую конъюгацию с другими молекулами (включая флуоресцентные красители, цитотоксины, радиоизотопы и т.д., но, не ограничиваясь ими), например, антителами, используемыми в исследовании количественной оценки антигена, для иммобилизации антител для измерения аффинности, для направленной доставки терапевтического агента, для выявления Fc-опосредованной цитотоксичности с использованием эффекторных иммунных клеток, и многих других применений.

Результаты, представленные в данном документе, подчеркивают специфичность, чувствительность и практическую ценность антитела по изобретению при нацеливании на IL-13RA2.

Молекула по изобретению основана на одноцепочечном вариабельном фрагменте (scFv), идентифицированном и выбранном с использованием фагового дисплея, аминокислотная последовательность одноцепочечного вариабельного фрагмента придает специфичность молекуле против IL-13RA2 и образует основу всех антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению. Таким образом, scFv можно использовать для разработки целого ряда различных молекул «антител», включая, например, полноразмерные антитела, их фрагменты, такие как Fab и F(ab')2, слитые белки (включая scFv_Fc), и многовалентные антитела, то есть антитела, имеющие больше чем одну специфичность в отношении одного и того же антигена или разных антигенов, например, в отношении биспецифичного рекрутера Т-клеток (BiTE - bispecific T-cell engager), триатела и тому подобное (см.Cuesta et al. Multivalent antibodies:when design surpasses evolution, Trends in Biotechnology 28: 355-362, 2010).

В одном воплощении, где антигенсвязывающий белок представляет собой полноразмерное антитело, тяжелые и легкие цепи антитела по изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело может содержать по меньшей мере одну, предпочтительно две интактных тяжелых цепи и по меньшей мере одну, предпочтительно две интактных легких цепи); или может быть охвачена антигенсвязывающая группировка (Fab, F(ab’)2, Fv или scFv). В других воплощениях константная область тяжелой цепи антитела выбрана, например, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, и IgE. Выбор типа антитела будет зависеть от функции иммунного эффектора, которую, сконструированное антитело, как предполагают, будет вызывать. Подходящие аминокислотные последовательности для константных областей разных изотипов иммуноглобулина и способы получения большого разнообразия антител при конструировании рекомбинантных иммуноглобулинов известны специалистам в данной области.

В первом аспекте изобретение обеспечивает антитело, которое специфично распознает IL-13RA2, которое обладает EC₅₀ относительной аффинности связывания меньше чем 100 нМ, предпочтительно меньше чем 10 нМ, более предпочтительно от 0,1 до 1 нМ и наиболее предпочтительно от 0,3 до 0,6 нМ, в отношении клеток U251, стабильно трансфицированных IL-13RA2 человека.

В предпочтительном воплощении антитело против IL-13RA2, предложенное изобретением, содержит: CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12. В другом предпочтительном воплощении антитело, которое связывается с IL-13RA2, предложенное изобретением, содержит: CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и/или CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и/или CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или 16. В другом предпочтительном воплощении согласно изобретению предложено антитело, которое связывается с IL-13RA2, содержащее: CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12, CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и/или CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и/или CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или 16. Предпочтительно, антитело, которое связывается с IL-13RA2, содержит: HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 11, LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 15; или содержит HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 12, LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 16.

Более предпочтительно, антитело, которое связывается с IL-13RA2, содержит HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 12, LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 16.

В другом аспекте изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с IL-13RA2, и вариабельная область тяжелой цепи антитела выбрана из последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6, или последовательности варианта или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 6.

В другом аспекте изобретение обеспечивает антитело или его фрагмент, которое связывается с IL-13RA2, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.

При условии, что данные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей могут связываться с IL-13RA2 по отдельности, последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей можно «смешивать и сочетать» с получением связывающей молекулы против IL-13RA2 по изобретению.

В другом аспекте изобретение обеспечивает вариант антитела или его фрагмент, который связывается с IL-13RA2. Таким образом, изобретение обеспечивает антитело или его фрагмент, имеющее вариабельную область тяжелой цепи и/или легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи. Предпочтительно, идентичность аминокислотной последовательностей вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно 95%, конкретно 96%, более конкретно 97%, даже более конкретно 98%, наиболее конкретно 99%, включая, например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%. Вариант может быть получен посредством осуществления скрининга дрожжевой библиотеки, осуществления скрининга фаговой библиотеки, точечной мутации и других средств с использованием антитела в настоящей заявке в качестве исходного антитела.

В другом аспекте согласно изобретению предложено антитело, которое распознает такую же антигенную детерминанту, как и антитело против IL-13RA2, описанное выше.

Свойства антитела против IL-13RA2

Стандартные анализы для оценки способности антитела к связыванию, такого как антитело против IL-13RA2, известны в данной области и включают, например: ИФА, biacore, Вестерн-блоттинг и проточную цитометрию. Подходящие анализы подробно описаны в примерах.

Нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева

Изобретение дополнительно обеспечивает нуклеиновую кислоту и вектор, кодирующий антитело и его фрагмент, который связывается с IL-13RA2; и клетку-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор. Нуклеиновая кислота может быть расположена в интактной клетке и в клеточном лизате или представлена в частично очищенной или по существу очищенной форме.

Нуклеиновая кислота по изобретению может быть получена с применением стандартных методик молекулярной биологии, например, посредством стандартной ПЦР-амплификации или методик клонирования кДНК с получением кДНК, кодирующей легкую и тяжелую цепи или сегменты VH и VL антитела. Для антитела, полученного из библиотек генов иммуноглобулинов (например, с использованием технологии фагового дисплея), одну или более чем одну нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно выделить из библиотеки. Способ введения экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина хорошо известен в данной области и может отличаться в зависимости от используемой клетки-хозяина.

Предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельную область легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7, и/или вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5. Более предпочтительной является молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 3, или последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 5 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 7.

Для экспресии белка нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по изобретению, может быть интегрирована в экспрессионный вектор. Разнообразие экспрессионных векторов доступно для экспресии белка. Экспресионные векторы могут содержать самореплицирующиеся внехромосомные векторы или векторы, интегрированные в геном хозяина. Экспрессионные векторы для применения в изобретении включают, но не ограничиваются ими, экспрессионные векторы, которые позволяют экспрессировать белки в клетках млекопитающих, бактериях, клетках насекомых, дрожжах и системах in vitro. Как известно в данной области, множество векторов имеется в продаже или их получают другими путями, и их можно применять в изобретении для экспрессии антител.

Иммуноконъюгаты

Изобретение дополнительно обеспечивает многофункциональный иммуноконъюгат, содержащий антитело, описанное в данном документе, и дополнительно содержащий по меньшей мере один тип функциональной молекулы. Функциональная молекула выбрана из, но не ограничивается ими, молекулы, которая нацелена на маркер поверхности опухолевой клетки, молекулы, которая ингибирует опухоль, молекулы, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, или детектируемой метки,. Антитело и функциональная молекула могут составлять конъюгат посредством ковалентной связи, соединения, присоединения, поперечного сшивания и тому подобное.

В предпочтительном способе иммуноконъюгат может содержать: антитело по изобретению и по меньшей мере одну молекулу, которая нацелена на маркер поверхности опухолевой клетки, или молекулу, которая ингибирует опухоль. Молекула, которая ингибирует опухоль, может представлять собой противоопухолевый цитокин или противоопухолевый токсин; предпочтительно, цитокин включает, но не ограничивается ими, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN типа I (interferon – интерферон) и ФНО-альфа,. В конкретном воплощении молекула, которая нацелена на маркер поверхности опухолевой клетки, представляет собой молекулу, которая нацелена маркер поверхности такой же опухоли, на которую нацелено антитело по изобретению. Например, молекула, которая нацелена на маркер поверхности опухолевой клетки, может представлять собой антитело или лиганд, который связывается с маркером поверхности опухолевой клетки, например, такая молекула может совместно действовать с антителом по изобретению с более точным нацеливанием на опухолевые клетки. Возможно,

В качестве предпочтительного воплощения иммуноконъюгат может содержать: антитело по изобретению и детектируемую метку. Детектируемая метка включает следующие метки, но не ограничивается ими: флуоресцентная метка, хромогенная метка; как например, фермент, простетическая группа, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, биолюминесцентное вещество, радиоактивное вещество, позитронно-активный металл и ион нерадиоактивного парамагнитнго металла. Можно также включать более чем одну метку. Метка, используемая для мечения антитела для выявления и/или анализа и/или в целях диагностики, зависит от конкретных методик выявления/анализа/диагностики и/или используемых способов, таких как иммуногистохимическое окрашивание образцов (ткани), проточная цитометрия и тому подобное. Подходящие метки для методик выявления/анализа/диагностики и/или способы, известные в данной области, хорошо известны специалистам в данной области.

В качестве предпочтительного способа иммуноконъюгат может содержать: антитело по изобретению и молекулу, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки. Молекула, которая нацелена на маркер поверхности иммунной клетки, может представлять собой антитело или лиганд, который связывается с маркером поверхности иммунной клетки, и такая молекула способна распознавать иммунную клетку, доставляя, таким образом, антитело по изобретению к иммунной клетке, затем антитело по изобретению может нацеливать иммунную клетку на опухолевые клетки, индуцируя, таким образом, специфичное в отношении иммунной клетки уничтожение опухолей. Маркер поверхности иммунной клетки может быть выбран из CD3, CD16 и CD28, и более предпочтительно, антитело, которое связывается с маркером поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело против CD3. Иммунная клетка может быть выбрана из T-клетки, NK-клетки и NKT-клетки.

Посредством химического получения иммуноконъюгата путем прямой или непрямой (например, через линкер) конъюгации, иммуноконъюгат можно получать в виде слитого белка, содержащего антитело по изобретению и другой подходящий белок. Слитый белок может быть получен способом, известным в данной области, например, получен рекомбинантно посредством конструирования и последующей экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, в соответствии с рамкой считывания, и нуклеотидную последовательность, кодирующую подходящую метку.

Другой аспект изобретения обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одно антитело, его функциональный вариант или иммуноконъюгат по изобретению. Сразу после получения релевантной последовательности, способ рекомбинации можно использовать для получения релевантной последовательности в больших количествах. Это обычно осуществляют посредством клонирования последовательности в вектор, его переноса в клетку и затем выделения релевантной последовательности из пролиферированной клетки-хозяина общепринятыми способами.

В другом аспекте изобретение обеспечивает химерный антигенный рецептор, содержащий внеклеточный связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Термин «химерный антигенный рецептор (CAR)», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к домену, связывающему опухолевый антиген, слитому с внутриклеточным доменом трансдукции сигнала, который может активировать T-клетки. Обычно, внеклеточный связывающий домен CAR получен из мышиного или гуманизированного или моноклонального антитела.

Внеклеточный связывающий домен представляет собой антитело по изобретению, и неограничивающие примеры включают одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из антитела, антигенсвязывающий фрагмент (Fab), выбранный из библиотеки, однодоменный фрагмент или природный лиганд, вступающий в контакт с гомологичным рецептором. В некоторых воплощениях внеклеточная антигенсвязывающая область может содержать scFv, Fab или природный лиганд, а также любое его производное. Внеклеточная антигенсвязывающая область может относиться к молекуле, отличной от интактного антитела, которая может содержать часть интактного антитела и может связываться с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваются ими Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; бифункциональное антитело, линейное антитело; молекулу одноцепочечного антитела (например, scFv); и мультиспецифичное антитело, образованное из фрагментов антитела.

Внеклеточная антигенсвязывающая область, как, например, scFv, Fab или природный лиганд, может представлять собой часть CAR, которая определяет специфичность к антигену. Внеклеточная антигенсвязывающая область может связываться с любой комплементарной мишенью. Внеклеточная антигенсвязывающая область может быть получена из антитела с известной последовательностью вариабельной области. Внеклеточная антигенсвязывающая область может быть получена из последовательности антитела, полученной из доступной гибридомы мыши. В качестве альтернативы, внеклеточная антигенсвязывающая область может быть получена в результате полного секвенирования при внешнем расщеплении в отношении опухолевой клетки или первичной клетки, такой как опухоль-инфильтрирующий лимфоцит (TIL - tumor infiltrating lymphocyte).

В некоторых воплощениях специфичность связывания внеклеточной антигенсвязывающей области может определяться областью, определяющей комплементарность, или CDR, такой как CDR легкой цепи или CDR тяжелой цепи. Во многих случаях специфичность связывания может определяться CDR легкой цепи и CDR тяжелой цепи. Комбинация данной CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи может обеспечивать данный связывающий карман, что может придавать более высокую аффинность и/или специфичность в отношении антигена, по сравнению с другими референсными антигенами.

В некоторых аспектах любого из воплощений, раскрытых в данном документе, внеклеточная антигенсвязывающая область, например, scFv, может содержать CDR легкой цепи, специфичную к антигену. CDR легкой цепи может представлять собой область, определяющая комплементарность легкой цепи scFv антитела, как например, CAR. CDR легкой цепи может содержать непрерывную последовательность аминокислотных остатков или две или более чем две непрерывные последовательности аминокислотных остатков, разделенные областями, отличными от областей, определяющих комплементарность (например, каркасной областью). В некоторых воплощениях CDR легкой цепи может содержать две или более CDR легкой цепи, которые могут называться CDR-1 легкой цепи, CDR-2 легкой цепи и тому подобное. В некоторых воплощениях CDR легкой цепи может содержать три CDR легкой цепи, которые могут называться CDR-1 легкой цепи, CDR-2 легкой цепи и CDR-3 легкой цепи, соответственно. В некоторых примерах набор из CDR, находящихся на общей легкой цепи, может в совокупности быть назван CDR легкой цепи.

В определенных аспектах любого из воплощений, раскрытых в данном документе, внеклеточная антигенсвязывающая область, например, scFv, может содержать CDR тяжелой цепи, которая специфична к антигену. CDR тяжелой цепи может представлять собой область, определяющая комплементарность тяжелой цепи антитела, как например, scFv. CDR тяжелой цепи может содержать непрерывную последовательность аминокислотных остатков или две или более чем две непрерывные последовательности аминокислотных остатков, разделенные областями, отличными от областей, определяющих комплементарность (например, каркасной областью). В некоторых воплощениях CDR тяжелой цепи может содержать две или более CDR тяжелой цепи, которые могут называться CDR-1 тяжелой цепи, CDR-2 тяжелой цепи и тому подобное. В некоторых воплощениях CDR тяжелой цепи может содержать три CDR тяжелой цепи, которые могут называться CDR-1 тяжелой цепи, CDR-2 тяжелой цепи и CDR-3 тяжелой цепи, соответственно. В некоторых воплощениях набор CDR, находящихся на общей тяжелой цепи, может быть в совокупности назван CDR тяжелой цепи.

Внеклеточная антигенсвязывающая область может быть модифицирована разными путями посредством генной инженерии. В некоторых воплощениях внеклеточная антигенсвязывающая область может быть мутирована, таким образом, чтобы можно было выбрать внеклеточную антигенсвязывающую область, обладающую более высокой аффинностью в отношении своей мишени. В некоторых воплощениях аффинность внеклеточной антигенсвязывающей области в отношении ее мишени можно оптимизировать для мишени, которая может экспрессироваться на низком уровне в нормальной ткани. Данную оптимизацию можно проводить с минимизацией потенциальной токсичности. В других примерах клоны внеклеточной антигенсвязывающей области с более высокой аффинностью в отношении связанной с мембраной формы мишени могут быть предпочтительными, по сравнению с аналогами в растворимой форме мишени. Данную модификацию можно осуществлять, поскольку разные уровни растворимой формы мишени также можно выявлять, и нацеливание на такую форму может вызывать нежелательную токсичность.

В некоторых воплощениях внеклеточная антигенсвязывающая область содержит шарнир или спейсер. Термины «шарнир» и «спейсер» используют взаимозаменяемо. Шарнир можно рассматривать как часть CAR для придания внеклеточной антигенсвязывающей области гибкости. В некоторых воплощениях шарнир можно использовать для выявления CAR на клеточной поверхности клетки, в частности, когда антитело для выявления внеклеточной антигенсвязывающей области является неэффективным или недоступным. Например, может быть необходимым оптимизировать длину шарнира, полученного из иммуноглобулина, в зависимости от положения эпитопа на мишени, на которую нацелена внеклеточная антигенсвязывающая область.

В некоторых воплощениях шарнир может не принадлежать к иммуноглобулину, а принадлежать к другой молекуле, как например, нативный шарнир молекулы CD8α. Шарнир CD8α может содержать остатки цистеина и пролина, как известно, играющие роль во взаимодействии корецептора CD8 и молекулы ГКГС (главный комплекс гистосовместимости). Остатки цистеина и пролина могут влиять на эффективность CAR.

Шарнир CAR можно регулировать в размере. Данная морфология иммунологического синапса между клеткой иммунного ответа и клеткой-мишенью также определяет расстояние, которое функционально не может быть охвачено CAR из-за наиболее удаленного от мембраны эпитопа на молекуле-мишени поверхности клетки, в случае чего даже применение короткого шарнира CAR не позволяет синаптическому расстоянию достичь приближенной величины, при которой может осуществляться сигнализация. Аналогично, в случае ближайшего к мембране антигенного эпитопа мишени CAR наблюдают выход сигнала только применительно к длинному шарниру CAR. Шарнир можно регулировать, в зависимости от используемой внеклеточной антигенсвязывающей области. Шарнир может быть любой длины.

Трансмембранный домен может заякоривать CAR в плазматической мембране клетки. Природную трансмембранную часть CD28 можно использовать для CAR. В других случаях природная трансмембранная часть CD8α может быть также использована в CAR. «CD8» может представлять собой белок, обладающий по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью с референсным номером NCBI: NP_001759, или его фрагмент, обладающий стимулирующей активностью. «Молекула нуклеиновой кислоты CD8» может представлять собой полинуклеотид, кодирующий полипептид CD8, и в определенных случаях трансмембранная область может представлять собой природную трансмембранную часть CD28, и «CD28» может относиться к белку, обладающему по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью с референсным номером NCBI: NP_006130, или его фрагменту, обладающему стимулирующей активностью. «Молекула нуклеиновой кислоты CD28» может представлять собой полинуклеотид, кодирующий полипептид CD28. В некоторых воплощениях трансмембранная часть может содержать область CD8α.

Внутриклеточная сигнальная область CAR может отвечать за активацию по меньшей мере одной из эффекторных функций клеток иммунного ответа, в которые был помещен CAR. CAR может индуцировать эффекторные функции T-клеток, например, эффекторная функция представляет собой цитолитическую активность или активность хелперов, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «внутриклеточная сигнальная область» относится к части белка, которая осуществляет трансдукцию сигнала эффекторной функции и направляет клетку с осуществлением конкретной функции. Несмотря на то, что обычно может использоваться полная внутриклеточная сигнальная область, во многих случаях нет необходимости использовать полную цепь сигнального домена. В некоторых воплощениях используется усеченная часть внутриклеточной сигнальной области. В некоторых воплощениях, таким образом, предполагается, что термин «внутриклеточная сигнальная область» включает любую усеченную часть внутриклеточной сигнальной области, достаточную для трансдукции сигнала эффекторной функции.

Предпочтительные примеры сигнального домена для применения в CAR могут включать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора (TCR - T cell receptor) и корецептора, которые действуют синергетически с инициацией трансдукции сигнала после связывания мишени с рецептором, а также любое производное или вариант последовательности обоих, и любую синтетическую последовательность данных последовательностей, которые имеют такую же функциональность.

В некоторых воплощениях внутриклеточная сигнальная область может содержать известный сигнальный мотив иммунорецепторного тирозинового активирующего мотива (ITAM - immunoreceptor tyrosine activation motif). Примеры ITAM-содержащих цитоплазматических сигнальных последовательностей включают последовательности, полученные из TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. Однако в предпочтительном воплощении внутриклеточный сигнальный домен получен из цепи CD3ζ.

Примером T-клеточного сигнального домена, содержащего один или более чем один мотив ITAM, является домен CD3ζ, также известный как цепь T3ζ T-клеточного рецептора или CD247. Данный домен представляет собой часть комплекса T-клеточный рецептор-CD3 и играет важную роль в объединении распознавания антигена нескольких внутриклеточных путей трансдукции сигнала с активацией основного эффектора T-клеток. В том виде, в котором он используется в данном документе, CD3ζ в основном относится к CD3ζ человека и его изоформам, как известно из введения Swissprot P20963, включая белок, имеющий по существу такую же последовательность. В составе химерного антигенного рецептора, подтверждено, что полноразмерной цепи T3ζ T-клеточного рецептора не требуется и что подходит любое производное, содержащее сигнальный домен цепи T3ζ T-клеточного рецептора, включая его любой функциональный эквивалент.

Внутриклеточный сигнальный домен может быть выбран из любого из доменов Таблицы 1. В некоторых воплощениях домен может быть модифицирован таким образом, чтобы идентичность референсному домену могла находиться в диапазоне от примерно 50% до примерно 100%. Любой домен согласно Таблице 1 может быть модифицирован таким образом, чтобы модифицированная форма могла обладать примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или вплоть до примерно 100% идентичностью.

Внутриклеточная сигнальная область CAR может дополнительно содержать один или более костимулирующий домен. Внутриклеточная сигнальная область может содержать единственный костимулирующий домен, такой как цепь ζ (первое поколение CAR) или плюс CD28 или 4-1BB (второе поколение CAR). В других примерах внутриклеточная сигнальная область может содержать два костимулирующих домена, таких как CD28/OX40 или CD28/4-1BB (третье поколение).

Вместе с внутриклеточными сигнальными доменами, такими как CD8, данные костимулирующие домены могут вызывать активацию после путей киназы, таким образом, поддерживая транскрипцию генов и функциональные клеточные ответы. Костимулирующие домены CAR могут активировать проксимальные сигнальные белки, ассоциированные с активацией пути CD28 (фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат 3-киназа) или 4-1BB/OX40 (адаптер фактора, ассоциированный с ФНО), а также MAPK (mitogen-activated protein kinase - митоген-активируемая протеинкиназа) и Akt (протеинкиназа B).

В некоторых случаях сигналы, генерируемые CAR, можно объединять со вспомогательными или костимулирующими сигналами. В случае костимулирующих сигнальных доменов можно конструировать комплексы, подобные химерному антигенном рецептору, с содержанием нескольких возможных костимулирующих сигнальных доменов. Как хорошо известно в данной области, в необученных T-клетках отдельно взятого участия T-клеточных рецепторов недостаточно для того, чтобы вызвать полную активацию T-клеток в цитотоксические T-клетки. Для полной продуктивной активации T-клеток требуется второй костимулирующий сигнал. Сообщалось, что несколько рецепторов обеспечивают костимуляцию для активации T-клеток, включая CD28, OX40, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BBL, MyD88 и 4-1BB, но, не ограничиваясь ими. Сигнальные пути, используемые данными костимулирующими молекулами, могут действовать синергетически с основным сигналом активации T-клеточного рецептора. Сигналы, обеспеченные данными костимулирующими сигнальными областями, могут действовать синергетически с основными сигналами активации эффекторов, полученными из одного или более чем одного мотива ITAM (например, домен трансдукции сигнала CD3 дзета), и могут удовлетворять требованиям к активации T-клеток.

В некоторых воплощениях добавление костимулирующего домена к комплексу, подобному химерному антигенному рецептору, может усиливать эффективность и жизнестойкость сконструированных клеток. В некоторых других воплощениях T-клеточный сигнальный домен и костимулирующий домен слиты друг с другом с образованием сигнальной области.

Таблица 4. Костимулирующие домены

Маркер гена	Сокращение	Название
CD27	CD27, T14, S152, Tp55, TNFRSF7, S152. LPFS2	Молекула CD27
CD28	Tp44, CD28, антиген CD28	Молекула CD28
TNFRSF9	ILA, 4-1BB, CD137, CDw137	Член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 9
TNFRSF4	OX40, ACT35, CD134, IMD16, TXGP1L	Член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 4
TNFRSF8	CD30, Ki-1, D1S166E	Член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 8
CD40LG	IGM, IMD3, TRAP, gp39, CD154, CD40L, HIGM1, T-BAM, TNFSF5, hCD40L	Лиганд CD40
ICOS	AILIM, CD278, CVID1	Индуцибельный костимулятор T-клеток
ITGB2	LAD, CD18, MF17, MFI7, LCAMB, LFA-1, MAC-1	Интегрин β2 (субъединицы 3 и 4 рецептора компонента 3 комплемента)
CD2	T11, SRBC, LFA-2	Молекула CD2
CD7	GP40, TP41, Tp40, LEU-9	Молекула CD7
KLRC2	NKG2C, CD159c, NKG2-C	Член 2 суперсемейства C лектин-подобных рецепторов клеток-киллеров
TNFRSF18	AITR, GITR, CD357, GITR-D	Член 18 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли
TNFRSF14	TR2, ATAR, HVEA, HVEM, CD270, LIGHTR	Член 14 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли
HAVCR1	TIM, KIM1, TIM1, CD365, HAVCR, KIM-1, TIM-1, TIMD1, TIMD-1, HAVCR-1	Рецептор клеток вируса гепатита A 1
LGALS9	HUAT, LGALS9A, Галектин-9	Лектин, галактозид-связывающий, растворимый, 9
CD83	BL11, HB15	Молекула CD83

Химерный антигенный рецептор связывается с антигеном-мишенью. Когда активацию T-клеток измеряют in vitro или ex vivo, антиген-мишень можно получить или выделить из разных источников. Антиген-мишень в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой антиген или антигенный эпитоп на антигене, который является особо важным у млекопитающих в отношении иммунного распознавания и окончательной элиминации или контроля патогенных факторов или состояний заболевания. Иммунное распознавание может представлять собой клеточное и/или гуморальное иммунное распознавание. В случае внутриклеточных патогенов и рака иммунное распознавание может представлять собой, например, реакцию T-лимфоцитов.

В некоторых воплощениях антиген-мишень включает антиген, ассоциированный с предраковым или пролиферативным состоянием. Антиген-мишень может также быть ассоциирован с раком или вызван раком. Например, в некоторых воплощениях химерный антигенный рецептор по изобретению распознает и связывается с опухолевым антигеном, включая IL-13RA2, как описано ранее в данном документе.

В некоторых воплощениях, когда химерный антигенный рецептор находится на плазматической мембране клетки, связывается со своей мишенью и активируется, клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор, может обуславливать цитотоксичность для клетки, несущей мишень. Например, в некоторых воплощениях, когда химерный антигенный рецептор находится на цитотоксической клетке, такой как NK-клетка или цитотоксическая T-клетка, и активируется мишенью, токсичность цитотоксической клетки для клетки-мишени может повышаться. В некоторых воплощениях химерный антигенный рецептор в данном документе может увеличивать эффект иммунореактивных клеток на клетки, экспрессирующие IL-13RA2, такие как опухолевые клетки. В некоторых воплощениях клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор, описанный в данном документе, увеличивает цитотоксический эффект на клетки, экспрессирующие IL-13RA2, на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 или по меньшей мере в 10 раз, по сравнению с клеткой, которая не экспрессирует химерный антигенный рецептор в данном документе.

Трансген, кодирующий исследуемый антиген-связывающий рецептор, или CAR, может быть встроен в клетку. Например, трансген можно встраивать в клетку иммунного ответа, такую как T-клетка. Будучи вставленным в клетку, трансген может представлять собой фрагмент комплементарной ДНК (кДНК), который представляет собой копию матричной РНК (мРНК); или сам ген (с интронами или без интронов), расположенный в исходной области своей геномной ДНК.

Нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность трансгена, такая как ДНК, может быть случайным образом вставлена в хромосому клетки. Случайная интеграция может быть получена любым способом, который вводит в клетку нуклеиновую кислоту, такую как ДНК. Например, способ может включать электропорацию, ультразвук, применение генной пушки, липофекцию, трансфекцию на основе фосфата кальция, применение дендримеров, микроинъекцию и применение вирусных векторов, включая аденовирус, AAV (Adeno-associated virus - аденоассоциированный вирус) и ретровирусные векторы, и/или рибозим типа II, но не ограничивается ими.

Также может быть сконструирована ДНК, кодирующая трансген, содержащая репортерный ген, так чтобы наличие трансгена или продукта его экспрессии можно было выявлять посредством активации репортерного гена. Можно использовать любой репортерный ген, такой как репортерные гены, описанные выше. Клетки, содержащие трансген, могут быть выбраны посредством селекции клеток в клеточной культуре, в которых был активирован репортерный ген.

Экспрессию CAR можно проверять посредством анализов экспрессии, таких как количественная ПЦР, или посредством измерения уровня РНК. Уровень экспрессии может также показывать число копий. Например, если уровень экспрессии является очень высоким, это может указывать на то, что в геном встроено больше одной копии CAR. В качестве альтернативы, высокий уровень экспрессии может указывать на то, что трансген встроен в область с высоким уровнем транскрипции, как например, рядом с промотором с высоким уровнем экспрессии. Экспрессия также может быть проверена посредством измерения уровней белка, например, посредством Вестерн-блоттинга.

В некоторых воплощениях клетка иммунного ответа по изобретению может содержать один или более чем один трансген. Один или более чем один трансген могут экспрессировать белок CAR, который распознает и связывается с по меньшей мере одним эпитопом на антигене или связывается с мутантным эпитопом на антигене. CAR может представлять собой функциональный CAR. В некоторых воплощениях клетки иммунного ответа могут содержать один или более чем один CAR, или они могут содержать единственный CAR и вторичный сконструированный рецептор.

В некоторых воплощениях трансген может кодировать ген самоубийства. Как доказано многими эффективными видами лечения пациентов с раком, клетки иммунного ответа с CAR вызывают регресс опухоли, но также могут сопровождаться токсичностью. В некоторых воплощениях, когда антиген-мишень существует и в нормальных тканях и в опухолевых клетках, клетки иммунного ответа с CAR могут не быть способными различать опухоли и нормальные ткани («целевая/нецелевая токсичность»). В некоторых случаях может происходить системное нарушение иммунной системы, называемое синдромом высвобождения цитокинов (CRS - cytokine release syndrome). CRS может включать синдром системного воспалительного ответа или цитокиновый шторм, который может быть следствием быстрого размножения клеток иммунного ответа с CAR in vivo. CRS представляет собой расстройство, характеризующееся лихорадкой и гипотензией, которые в серьезном случае приводят к полиорганной недостаточности. В большинстве случаев токсичность ассоциирована с размножением in vivo клеток иммунного ответа с CAR после инфузии, что может приводить к общему нарушению иммунной системы, а также высвобождению высоких уровней провоспалительных цитокинов, таких как ФНОα и IL-6 (interleukin 6 - интерлейкин 6). Ген самоубийства может вызывать элиминацию иммунореактивных клеток с CAR. Ген самоубийства может представлять собой любой ген, который вызывает апоптоз в иммунореактивных клетках с CAR. Ген самоубийства может кодироваться в вирусном векторе вместе с антигенсвязывающим рецептором. Кодирование гена самоубийства обеспечивает снижение или полное прекращение токсичности, вызываемой in vivo размножением клеток иммунного ответа с CAR после инфузии в конкретных условиях.

В некоторых воплощениях иммунореактивные клетки с CAR в отношении антигенов, которые представлены в нормальных тканях, могут быть получены таким образом, чтобы они временно экспрессировали CAR, например, после введения мРНК, кодирующей данный рецептор, посредством электропорации. Кроме того, большое усилие для дальнейшего усиления иммунореактивных клеток с CAR посредством включения «предохранителя», может значительно элиминировать иммунореактивные клетки с CAR в случае сильной токсичности мишени.

В некоторых воплощениях вектор, кодирующий CAR, можно объединять, например, с индуцибельным геном каспазы-9 (активируемым димерным химическим индуктором) или усеченной формой рецептора R EGF (Epidermal Growth Factor -эпидермальный фактор роста) (активируемой моноклональным антителом Цетуксимаб) или «предохранителем» RQR8.

Один или более трансген, используемый в данном документе, может быть получен из разных видов. Например, один или более трансген может включать ген человека, ген мыши, ген крысы, ген свиньи, ген быка, ген собаки, ген кошки, ген обезьяны, ген шимпанзе или любую их комбинацию. Например, трансген может быть получен из человека, имея генетическую последовательность человека. Один или более трансген может включать ген человека. В некоторых случаях один или более трансген не являются аденовирусными генами.

Как описано выше, трансген может быть вставлен в геном иммунореактивной клетки случайным или сайт-специфичным образом. Например, трансген может быть вставлен в геном иммунной клетки в случайный сайт. Трансген может быть функциональным, например, полностью функциональным, будучи вставленным в любой сайт генома. Например, трансген может кодировать свой собственный промотор или может быть вставлен в положении, контролируемом эндогенным промотором. В качестве альтернативы, трансген может быть вставлен в ген, как например, в интрон или экзон, промотор или некодирующую область гена. Трансген может быть вставлен с нарушением гена, таким как эндогенная иммунная контрольная точка, в результате вставки.

В некоторых воплощениях одна или более чем одна копия трансгена может быть вставлена в геном в многочисленных случайных сайтах. Например, многочисленные копии могут быть вставлены в геном в случайных сайтах. Это может приводить к увеличению общей экспрессии, по сравнению с одной случайной вставкой трансгена. В качестве альтернативы, копия трансгена может быть вставлена в один ген, а другая копия трансгена может быть вставлена в другой ген. На трансген можно нацеливаться таким образом, что он может быть вставлен в геном иммунореактивной клетки в конкретный сайт.

В некоторых воплощениях полинуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий рецептор, может находиться в виде плазмидного вектора. Плазмидный вектор может содержать промотор. В некоторых случаях промотор может быть конститутивным. В некоторых воплощениях промотор может быть индуцибельным. Промотор может быть или может быть получен из CMV (cytomegalovirus – цитомегаловирус), U6, MND или EF1a (elongation factor 1-alpha - фактор элонгации 1-альфа). В некоторых воплощениях промотор может примыкать к последовательности CAR. В некоторых воплощениях плазмидный вектор дополнительно содержит акцептор сплайсинга. В некоторых воплощениях акцептор сплайсинга может примыкать к последовательности CAR. Последовательность промотора может представлять собой промотор PKG или MND. Промотор MND может представлять собой синтетический промотор, содержащий область U3 LTR (long terminal repeat - длинный концевой повтор) MoMuLV (Moloney murine leukemia virus - вирус лейкоза мышей Молони), модифицированную энхансером миелопролиферативного вируса саркомы.

В некоторых воплощениях полинуклеиновая кислота, кодирующая исследуемый рецептор, может быть сконструирована для доставки к клетке посредством невирусных методик. В некоторых случаях полинуклеиновая кислота может представлять собой реагент, совместимый с надлежащей производственный практикой (GMP - Good Manufacturing Practice).

Экспрессию полинуклеиновой кислоты, кодирующей исследуемый антигенсвязывающий рецептор, или CAR, можно контролировать одним или более чем одним промотором. Промоторы могут быть универсальными, конститутивными (неограниченные промоторы, обеспечивающие продолжительную транскрипцию релевантных генов), тканеспецифичными промоторами или индуцибельными промоторами. Экспрессию вставленного трансгена, примыкающего к или находящегося возле промотора, можно регулировать. Например, трансген можно вставлять рядом или возле универсального промотора. Некоторые универсальные промоторы могут представлять собой промотор CAGGS, промотор hCMV, промотор PGK, промотор SV40 или промотор ROSA26.

Промоторы могут быть эндогенными и экзогенными. Например, один или более чем один трансген может быть вставлен примыкающим к или возле эндогенного или экзогенного промотора ROSA26. Кроме того, промотор может быть специфичным в отношении иммунореактивных клеток. Например, один или более чем один трансген может быть вставлен примыкающим к или возле промотора ROSA26 свиньи.

Тканеспецифичные промоторы или промоторы, специфичные в отношении клетки, можно использовать для контроля положения экспрессии. Например, один или более чем один трансген могут быть вставлены примыкающими к или возле тканеспецифичного промотора. Тканеспецифичные промоторы могут представлять собой промотор FABP, промотор Lck, промотор CamKII, промотор CD19, промотор кератина, промотор альбумина, промотор aP2, промотор инсулина, промотор MCK, промотор MyHC, промотор WAP или промотор Col2A.

Также можно использовать индуцибельные промоторы. Данные индуцибельные промоторы можно включать и выключать посредством добавления или удаления индуктора, при необходимости. Ожидают, что индуцибельный промотор представляет собой, но не ограничивается ими, Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx и/или Trex.

Термин «индуцибельный промотор», в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой контролируемый промотор, который не управляет экспрессией или управляет экспрессией гена, функционально связанного с ним, на низком уровне до достижения желательных условий, и управляет экспрессией или управляет экспрессией гена, функционально связанного с ним, на высоком уровне в желательных условиях.

Кроме того, хотя и не существенно для экспрессии, последовательности трансгенов могут также содержать транскрипционные или трансляционные регуляторные последовательности, такие как промоторы, энхансеры, инсуляторы, участки внутренней посадки рибосомы и последовательности, кодирующие пептиды 2A и/или сигналы полиаденилирования.

В некоторых воплощениях трансген кодирует исследуемый антигенсвязывающий рецептор или CAR, где трансген вставлен в «безопасную гавань» (safe harbor), таким образом, что антигенсвязывающий рецептор экспрессируется. В некоторых воплощениях трансген вставлен в локус PD1 и/или CTLA-4. В других случаях трансген доставляют с помощью лентивируса к клетке для случайной вставки, в то время как PD1- или CTLA-4-специфичная нуклеаза может быть предложена в виде мРНК. В некоторых воплощениях трансген доставляют посредством векторной системы вируса, такого как ретровирус, AAV или аденовирус, и мРНК, кодирующей нуклеазу (например, AAVS1, CCR5, альбумин или HPRT), специфичную к «безопасной гавани». Клетки могут также быть обработаны мРНК, кодирующей нуклеазу, специфичную к PD1 и/или CTLA-4. В некоторых воплощениях полинуклеотид, кодирующий CAR, предложен вместе с мРНК, кодирующей HPRT-специфичную нуклеазу и PD1- или CTLA-4-специфичную нуклеазу посредством вирусной системы доставки. CAR, которые могут быть использованы со способами и композициями, раскрытыми в данном документе, могут включать все типы данных химерных белков.

В некоторых воплощениях трансген можно вводить в иммунореактивную клетку, используя ретровирусный вектор (γ-ретровирусный или лентивирусный вектор). Например, трансген, кодирующий CAR или любой антигенсвязывающий рецептор, или его вариант или фрагмент, можно клонировать в ретровирусный вектор, и им можно управлять посредством эндогенного промотора, ретровирусного длинного концевого повтора или промотора, специфичного к типу клетки-мишени. Также могут быть использованы невирусные векторы. Системы доставки на основе невирусных векторов могут включать ДНК плазмиды, «оголенные» нуклеиновые кислоты и нуклеиновые кислоты в комплексе с векторами доставки, такими как липосомы или Полоксамеры.

Многие системы на основе вирусов были разработаны для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген может быть вставлен в вектор и упакован в ретровирусной частице с использованием методик, известных в данной области. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирусы, являются подходящими инструментами для достижения длительного переноса гена, поскольку они делают возможной длительную стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеет дополнительное преимущество над векторами, полученными из ретровирусов, таких как вирус лейкоза мыши, в том, что они могут трансдуцировать непролиферирующие клетки. Они также имеют дополнительное преимущество низкой иммуногенности. Преимущество аденовирусных векторов заключается в том, что они не слиты в геном клетки-мишени, избегая, таким образом, негативных событий, связанных с интеграцией.

Клетки можно трансфицировать трансгеном, кодирующим антигенсвязывающий рецептор. Концентрация трансгена может находиться в интервале от примерно 100 пикограмм до примерно 50 микрограмм. В некоторых воплощениях количество нуклеиновой кислоты (например, оцДНК (одноцепочечная ДНК), дцДНК (двухцепочечная ДНК) или РНК), вводимое в клетку, можно менять для оптимизации эффективности трансфекции и/или жизнеспособности клеток. Например, 1 микрограмм дцДНК можно добавлять к каждому образцу клеток для электропорации. В некоторых воплощениях количество нуклеиновой кислоты (например, двухцепочечной ДНК), требуемое для оптимальной эффективной трансфекции и/или жизнеспособности клеток, варьирует в зависимости от типа клетки. В некоторых воплощениях количество нуклеиновой кислоты (например, дцДНК), используемое для каждого образца, может прямо соответствовать эффективности трансфекции и/или жизнеспособности клеток. Например, используют целый ряд концентраций для трансцекции. Трансген, кодируемый вектором, может быть интегрирован в геном клетки. В некоторых воплощениях трансген, кодируемый вектором, прямо интегрирован. В некоторых воплощениях трансген, кодируемый вектором, обратно интегрирован.

Обычно вектор доставляется in vivo посредством введения отдельно взятому пациенту посредством системного введения (например, внутривенная, внутрибрюшинная, внутримышечная, подкожная или внутричерепная инфузия) или местного нанесения, как описано ниже. В качестве альтернативы, вектор может быть доставлен ex vivo в клетку, такую как клетка, забранная у отдельно взятого пациента (например, лимфоциты, T-клетки, пунктат костного мозга, биопсии ткани) и затем обычно реимплантируемая пациенту после отбора клетки, в которую был включен вектор. Клетки могут быть размножены до или после отбора.

Подходящими иммунореактивными клетками для экспрессии антигенсвязывающего рецептора могут быть клетки, которые являются аутологичными или неаутологичными в отношении нуждающегося в них индивидуума.

Подходящий источник клеток иммунного ответа может быть получен из индивидуума. В некоторых случаях могут быть получены T-клетки. T-клетки могут быть получены из целого ряда источников, включая PBMC (peripheral blood mononuclear cells - мононуклеарные клетки периферической крови), костный мозг, ткань лимфоузлов, пуповинная кровь, ткань тимуса и ткани из инфицированных мест, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухолевую ткань. В некоторых случаях T-клетки могут быть получены из крови, собранной у индивидуума с использованием любого количества методик, известных специалистам в данной области, таких как разделение FicollTM. В некоторых воплощениях клетки из циркулирующей крови индивидуума получают посредством афереза. Продукты афереза обычно содержат лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие лейкоциты с ядром, эритроциты и тромбоциты. В некоторых воплощениях клетки, собранные посредством сбора на основе афереза, можно промывать для удаления фракций плазмы и помещать в подходящий буфер или среду для последующих стадий обработки.

В качестве альтернативы, клетки могут быть получены из здорового донора, из пациента, у которого диагностирован рак, или пациента, у которого диагностирована инфекция. В некоторых воплощениях клетки могут быть частью смешанной клеточной популяции с разными фенотипическими характеристиками. Клеточные линии также могут быть получены из трансформированных T-клеток в соответствии со способами, описанными ранее. Клетки могут быть также получены из библиотеки клеточной терапии. Модифицированные клетки, которые устойчивы к иммуносупрессивной терапии, могут быть получены любым из способов, описанных в данном документе. Также возможно выбрать подходящую популяцию клеток перед модификацией. Популяция сконструированных клеток может быть выбрана после модификации. Сконструированные клетки можно использовать для аутологичной трансплантации. В качестве альтернативы, клетки можно использовать для аллогенной трансплантации. В некоторых воплощениях клетки вводят тому же пациенту, чей образец используют для идентификации целевой последовательности, ассоциированной с раком. В других примерах клетки вводят пациенту, отличному от пациента, чей образец используют для идентификации целевой последовательности, ассоциированной с раком.

В некоторых воплощениях подходящие первичные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), лимфоциты периферической крови (PBL - peripheral blood lymphocyte) и другие субпопуляции клеток крови, такие как, но, не ограничиваясь ими, T-клетки, естественные киллеры, моноциты, естественные киллеры Т-клетки, клетки-предшественники моноцитов, гемопоэтические стволовые клетки или неплюрипотентные клетки. В некоторых воплощениях клетка может представлять собой любою иммунную клетку, включая T-клетку, такую как инфильтрирующая опухоль клетка (TIL - tumor infiltrating cell), как например, CD3+ T-клетка, CD4+ T-клетка, CD8+ T-клетка или любой другой тип T-клетки. T-клетки могут также включать T-клетки памяти, стволовые T-клетки памяти или эффекторные T-клетки. Также возможно выбирать T-клетки из большой популяции, например, выбирать T-клетки из цельной крови. T-клетки также могут быть размножены из большой популяции. T-клетки могут также предпочтительно представлять собой клетки конкретных популяций и фенотипов. Например, T-клетки могут предпочтительно иметь фенотип, включающий CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) и/или IL-7Rα(+). Подходящие клетки могут иметь один или более чем один маркер, выбранный из списка CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) и/или IL-7Rα(+). Подходящие клетки также могут включать стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, нервные стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки. Подходящие клетки могут содержать любое количество первичных клеток, таких как клетки человека, клетки, не являющиеся человеческими, и/или клетки мыши. Подходящие клетки могут представлять собой клетки-предшественники. Подходящие клетки могу быть получены из субъекта, подлежащего лечению (например, пациента).

Терапевтически эффективное количество клеток, которое требуется пациенту, может варьировать в зависимости от жизнеспособности клеток и эффективности, с которой клетки генетически модифицированы (например, эффективность, с которой трансген интегрируют в одну или более чем одну клетку, или уровень экспрессии белка, кодируемого трансгеном). В некоторых воплощениях результат (например, размножение) жизнеспособности клеток после генетической модификации и эффективности интеграции трансгена может соответствовать терапевтическому количеству клеток, доступному для введения субъекту. В некоторых воплощениях повышение жизнеспособности клеток после генетической модификации может соответствовать уменьшению существенного количества вводимых клеток, эффективных для лечения пациента. В некоторых воплощениях повышение эффективности интеграции трансгена в одну или более чем одну клетку может соответствовать уменьшению существенного количества вводимых клеток, эффективных для лечения пациента. В некоторых воплощениях определение терапевтически эффективного количества клеток, которое требуется, может включать определение функции, ассоциированной с изменением в клетках с течением времени. В некоторых воплощениях определение терапевтически эффективного количества клеток, которое требуется, может включать определение функции, соответствующей изменению в эффективности интеграции трансгена в одну или более чем одну клетку в соответствии с переменной, зависящей от времени (например, время культивирования клеток, время электропорации, время стимуляции клеток). В некоторых воплощениях терапевтически эффективная клетка может представлять собой популяцию клеток, включающих экспрессию от примерно 30% до примерно 100% антигенсвязывающих рецепторов на поверхности клетки. В некоторых воплощениях терапевтически эффективные клетки могут экспрессировать примерно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или более чем примерно 99,9% антигенсвязывающих рецепторов на поверхности клетки, как измерено посредством проточной цитометрии.

Согласно одному аспекту изобретения изобретение также охватывает нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенсвязывающий рецептор. Изобретение также относится к варианту упомянутого выше полинуклеотида, который кодирует полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как изобретение, или фрагмент, аналог и производное данного полипептида.

Изобретение дополнительно обеспечивает вектор, содержащий упомянутую выше нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, представляющий собой антигенсвязывающий рецептор, который экспрессируется на поверхности клетки иммунного ответа.

Изобретение дополнительно охватывает вирус, содержащий упомянутый выше вектор. Вирус по изобретению включает упакованный инфекционный вирус, и также включает вирус, подлежащий упаковке, содержащий компоненты, необходимые для упаковки, в качестве инфекционного вируса. Другие вирусы, известные в данной области, которые можно использовать для трансдукции экзогенного гена в клетку иммунного ответа, и их соответствующие плазмидные векторы можно также использовать в изобретении.

В другом аспекте в данном документе предложена клетка-хозяин, содержащая антитело или химерный антигенный рецептор, как описано в данном документе, и необязательно интерферон типа I. В другом аспекте в данном документе предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело или химерный антигенный рецептор, описанный в данном документе, и возможно интерферон типа I.

В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку иммунного ответа. В некоторых воплощениях клетка иммунного ответа представляет собой T-клетку, естественный киллер, цитотоксический T-лимфоцит, естественный киллер Т-клетку, DNT-клетку(double negative T-cell – дважды негативная Т-клетка), и/или регуляторную T-клетку. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой NK92.

Клетка иммунного ответа по изобретению может дополнительно нести кодирующую последовательность экзогенного цитокина; и цитокин включает, но не ограничивается ими: IL-12, IL-15 или IL-21, и т.д. Данные цитокины обладают дополнительной иммуномодулирующей или противоопухолевой активностью и могут усиливать функцию эффекторных T-клеток и активированных NK-клеток или прямо оказывать противоопухолевое действие. Таким образом, специалистам в данной области будет понятно, что применение данных цитокинов лучше поможет функции клеток иммунного ответа.

Клетка иммунного ответа по изобретению может также экспрессировать антигенсвязывающий рецептор, отличный от антигенсвязывающего рецептора, описанного выше.

Клетка иммунного ответа по изобретению может также экспрессировать хемокиновый рецептор; и хемокиновый рецептор включает, но не ограничивается им CCR2. Специалистам в данной области будет понятно, что хемокиновый рецептор CCR2 может обеспечить конкурирование за связывание CCR2 in vivo с хемокином, что является преимущественным для блокирования метастаза опухоли.

Клетка иммунного ответа по изобретению также экспрессирует миРНК (малая интерферирующая РНК), которая снижает уровень экспрессии PD-1, или белок, который блокирует PD-L1. Специалистам в данной области будет понятно, что конкурирование за блокирование взаимодействия PD-L1 с его рецептором PD-1 облегчает восстановление противоопухолевых T-клеточных ответов, ингибируя, таким образом, рост опухоли.

Клетка иммунного ответа по изобретению может также экспрессировать «предохранитель»; предпочтительно «предохранитель» включает: индуцибельную Каспазу-9, усеченный EGFR (epidermal growth factor receptor - рецептор эпидермального фактора роста) или RQR8.

В некоторых воплощениях клетка иммунного ответа по изобретению не экспрессирует костимулирующий лиганд, такой как 4-1BBL.

Соответственно, в другом аспекте данного документа предложен способ получения антитела или химерного антигенного рецептора, описанного в данном документе, или содержащей их композиции, включающий культивирование клетки-хозяина, описанной в данном документе, в подходящих условиях. В некоторых воплощениях способ включает выделение и получение продукта экспрессии клетки-хозяина.

В другом аспекте данного документа предложена композиция, содержащая антитело, химерный антигенный рецептор или нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе. В некоторых воплощениях композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую антитело, химерный антигенный рецептор или нуклеиновую кислоту. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте данного документа предложена фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяина, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает то, что когда саму молекулу и композицию соответствующим образом вводят животному или человеку, они не вызывают побочного, аллергического или другого побочного действия.

В некоторых воплощениях композиция содержит дополнительный терапевтический агент. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент, такой как агенты, описанные в документе US 20140271820, и/или их фармацевтически приемлемые соли или их аналоги. В некоторых воплощениях терапевтический агент включает, но не ограничивается следующими агентами: ингибитор митоза (алкалоид барвинка), включая винкристин, винбластин, виндезин и навельбин (TM) (винорелбин, сульфид 5’-дегидроводорода); ингибитор топоизомеразы I, такой как соединения камптотецина, включая КамптосарTM (иринотекан HCL), ГикамтинTM (топотекан HCL) и другие соединения, полученные из камптотецина и его аналогов; производное подофиллотоксина, такое как этопозид, тенипозид и мидоксизоз; алкилирующий агент, такой как цисплатин, циклофосфамид, азотистый иприт, триметилентиофосфорамид, кармустин, бусульфан, хлорамбуцил, брихинолизин, урациловый иприт, клопрофен и дакарбазин; антиметаболит, включая цитарабин, 5-фторурацил, метотрексат, меркаптопурин, азатиоприн и прокарбазин; антибиотик, включая, но, не ограничиваясь ими, доксорубицин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, мицинмицин, митомицин, саркомицин C и дауномицин; и другие химиотерапевтические лекарственные средства, включая, но, не ограничиваясь ими противоопухолевые антитела, дакарбазин, азацитидин, амсакон, мелфалан, ифосфамид и митоксантрон. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент выбран из одного или более чем одного из эпирубицина, оксалиплатина и 5-фторурацила. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент включает, но не ограничивается ими, антиангиогенное средство, включая антитела против VEGF (vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов) (включая гуманизированные и химерные антитела, аптамеры против VEGF и антисмысловые олигонуклеотиды), и другие ингибиторы ангиогенеза, такие как ангиостатин, эндостатин, интерферон, интерлейкин 1 (включая α и β), интерлейкин 12, ретиноевая кислота, тканевые ингибиторы металлопротеиназ-1 и -2, и тому подобное.

Конкретные примеры некоторых веществ, которые могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов, представляют собой следующие вещества: сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; порошок трагаканта; солод; желатин; тальк; твердые смазывающие вещества, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и какао-масло; многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновая кислота; эмульгаторы, такие как Tween (Твин); увлажнители, такие как лаурилсульфат натрия; красители; вкусовые добавки; агенты таблетирования, стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; апирогенная вода; изотонические солевые растворы; фосфатные буферы и тому подобное.

Фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, может содержать одну или более чем одну фармацевтически приемлемую соль. «Фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не оказывает какого-либо неблагоприятного токсикологического действия (см., например, Berge, S.M et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Примеры такой соли включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания.

Соли присоединения кислоты включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, серная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота и фосфористая кислота, и т.д..; и соли, полученные из нетоксичных органических кислот, таких как алифатическая монокарбоновая кислота и дикарбоновая кислота, фенил-замещенная алкановая кислота, гидроксиалкановая кислота, ароматическая кислота и алифатическая или ароматическая сульфоновая кислота и т.д. Соли присоединения основания включают соли, полученные из щелочноземельных металлов (таких как натрий, калий, магний и кальций), и соли, полученные из нетоксичных органических аминов, таких N,N’-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкозамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин и прокаин и т.д.

Фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, может также содержать антиоксидант. Примеры антиоксиданта включают следующие антиоксиданты, но не ограничиваются ими: водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, гидросульфат натрия, метабисульфит натрия и сульфит натрия, и т.д..; жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (BHA - butylated hydroxyanisole), бутилированный гидрокситолуол (BHT - butylated hydroxytoluene), лецитин, промилгаллат и ɑ-токоферол, и т.д.; и металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid), сорбит, винная кислота и фосфорная кислота и т.д.

Композиция по изобретению может быть приготовлена в разных лекарственных формах, по необходимости, и может вводиться после определения врачом дозы, полезной для пациента в соответствии с факторами, такими как тип пациента, возраст, масса тела и общее состояние при заболевании, и способ введения и т.д. Способ введения может, например, представлять собой парентеральное введение (например, инъекция) или любые другие способы лечения.

«Парентеральное» введение иммуногенной композиции включает, например, подкожное (п.к.), внутривенное (в.в.), внутримышечное (в.м.) или внутригрудинную инъекцию или методики инфузии.

Состав, содержащий популяцию иммунореактивных клеток, вводимая индивидууму, содержит множество иммунореактивных клеток, эффективных для лечения и/или предупреждения конкретного симптом или заболевания. Таким образом, индивидууму можно вводить терапевтически эффективную популяцию иммунореактивных клеток. Обычно, вводят композицию, содержащую от примерно 1×10⁴ до примерно 1×10¹⁰ иммунореактивных клеток. В большинстве случаев композиция будет содержать от примерно 1×10⁵ до примерно 1×10⁹ иммунореактивных клеток, от примерно 5×10⁵ до примерно 5×10⁸ иммунореактивных клеток или от примерно 1×10⁶ до примерно 1×10⁷ иммунореактивных клеток. Однако, в зависимости от положения, источника, идентичности, степени и тяжести рака, возраста и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, и тому подобного, количество иммунореактивных клеток с CAR, вводимое индивидууму, будет варьировать в пределах широкого диапазона. Доктор, наконец, будет определять соответствующую дозу, предназначенную для применения.

В некоторых воплощениях химерный антигенный рецептор используют для стимуляции иммунного ответа, опосредованного иммунными клетками. Например, иммунный ответ, опосредованный T-клетками, представляет собой иммунный ответ, включающий активацию T-клеток. Активированные антиген-специфичные цитотоксические T-клетки способны вызывать апоптоз в клетках-мишенях, которые представляют на поверхности экзогенных антигенных эпитопов, как например, раковые клетки, которые представляют опухолевые антигены. В некоторых других воплощениях химерный антигенный рецептор используют для обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего. У субъекта будет развиваться противоопухолевый иммунитет вследствие иммунных ответов, опосредованных T-клетками.

В некоторых случаях способ лечения субъекта с раком может включать введение одной или более чем одной клетки иммунного ответа по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении. Клетки иммунного ответа могут связываться с опухолевыми молекулами-мишенями и вызывать гибель раковых клеток. Как описано выше, согласно изобретению дополнительно предложен способ лечения у индивидуума патогенной инфекции, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества клетки иммунного ответа по изобретению.

Частота введения иммунореактивных клеток по изобретению будет зависеть от факторов, включающих заболевание, подлежащих лечению, элементы конкретных иммунореактивных клеток и способ введения. Например, иммунореактивные клетки могут дозироваться 4 раза, 3 раза, 2 раза в сутки, один раз в сутки, один раз в двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток, каждые шесть суток, раз в неделю, один раз каждые восемь суток, один раз каждые девять суток, один раз каждые десять суток, один раз в неделю или два раза в месяц. Как описано в данном документе, так как клетки иммунного ответа по настоящей заявке улучшили жизнеспособность, их можно вводить не только в меньшем терапевтически эффективном количестве, но также с меньшей частотой, с получением по меньшей мере схожей и предпочтительно более ярко выраженной эффективности, по сравнению с клеткой иммунного ответа, которая является аналогичной, но не экспрессирует экзогенный интерферон типа I.

В некоторых воплощениях композиции могут являться изотоническими, то есть они могут иметь такое же осмотическое давление, как кровь и слезная жидкость. Желательной изотоничности композиции по изобретению можно достигать с использованием хлорида натрия или других фармацевтически приемлемых агентов, таких как глюкоза, борная кислота, тартрат натрия, пропиленгликоль или другие неорганические или органические растворенные вещества. При желании, вязкость композиции можно поддерживать на выбранном уровне, используя фармацевтически приемлемый загуститель. Подходящие загустители включают, например, метилцеллюлозу, ксантановую камедь, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, карбомер и тому подобное. Предпочтительная концентрация загустителя будет зависеть от выбранного реагента. Будет очевидно, что выбор подходящего носителя и других добавок будет зависеть от точного пути введения и природы конкретной лекарственной формы, такой как жидкая лекарственная форма.

Изобретение дополнительно обеспечивает набор, содержащий антитело, химерный антигенный рецептор и нуклеиновую кислоту или клетку иммунного ответа, описанную в данном документе. В некоторых воплощениях набор может содержать терапевтическую или профилактическую композицию, содержащую эффективное количество антитела, химерного антигенного рецептора, нуклеиновой кислоты или клетки иммунного ответа, описанных в данном документе, в одной или более чем одной единице лекарственных форм. В некоторых воплощениях набор содержит стерильный контейнер, который может содержать терапевтическую или профилактическую композицию; такой контейнер может представлять собой картридж, ампулу, бутыль, флакон, пробирку, пакетик или блистерную упаковку, или другие подходящие формы контейнера, известные в данной области. Такие контейнеры могут быть сделаны из пластмассы, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, подходящих для хранения лекарственного средства. В некоторых воплощениях набор содержит антитело, химерный антигенный рецептор, нуклеиновую кислоту или клетку иммунного ответа, описанные в данном документе, и инструкции, указывающие на введение индивидууму антитела, химерного антигенного рецептора, нуклеиновой кислоты или клетки иммунного ответа, описанных в данном документе. В инструкциях обычно включено применение антитела, химерного антигенного рецептора, нуклеиновой кислоты или клетки иммунного ответа, описанных в данном документе, для лечения или предупреждения рака или опухолей. В некоторых воплощениях набор содержит клетку-хозяина, описанную в данном документе, и может содержать от примерно 1×10⁴ клеток до примерно 1×10⁶ клеток. В некоторых воплощениях набор может содержать по меньшей мере примерно 1×10⁵ клеток, по меньшей мере примерно 1×10⁶ клеток, по меньшей мере примерно 1×10⁷ клеток, по меньшей мере примерно 4×10⁷ клеток, по меньшей мере примерно 5×10⁷ клеток, по меньшей мере примерно 6×10⁷ клеток, по меньшей мере примерно 6×10⁷ клеток, 8×10⁷ клеток, по меньшей мере примерно 9×10⁷ клеток, по меньшей мере примерно 1×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 2×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 3×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 4×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 5×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 6×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 6×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 8×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 9×10⁸ клеток, по меньшей мере примерно 1×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 2×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 3×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 4×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 5×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 6×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 8×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 9×10⁹ клеток, по меньшей мере примерно 1×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 2×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 3×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 4×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 5×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 6×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 7×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 8×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 9×10¹⁰ клеток, по меньшей мере примерно 1×10¹¹ клеток, по меньшей мере примерно 2×10¹¹ клеток, по меньшей мере примерно 3×10¹¹ клеток, по меньшей мере примерно 4×10¹¹ клеток, по меньшей мере примерно 5×10¹¹ клеток, по меньшей мере примерно 8×10¹¹ клеток, по меньшей мере примерно 9×10¹¹ клеток или по меньшей мере примерно 1×10¹² клеток. Например, в наборе может содержаться приблизительно 5×10¹⁰ клеток. В другом примере набор может содержать 3×10⁶ клеток; и клетки могут быть размножены до примерно 5×10¹⁰ клеток и введены субъекту.

В некоторых воплощениях набор может содержать аллогенные клетки. В некоторых воплощениях набор может содержать клетки, которые могут содержать геномные модификации. В некоторых воплощениях набор может содержать «готовые к использованию» клетки. В некоторых воплощениях набор может содержать клетки, которые могут быть размножены для клинического применения. В некоторых случаях в наборе может содержаться содержание для научно-исследовательских целей.

В некоторых воплощениях в инструкциях содержится по меньшей мере одно из следующего: описание терапевтического агента; схема дозировки и введение для лечения или предупреждения опухоли или ее симптома; профилактические меры, предостережения, противопоказания, особые указания, побочные действия, фармакология на животных, клинические исследования и/или ссылки. Инструкции могут быть напечатаны непосредственно на контейнере (при возможности) или в виде этикетки на контейнере или в виде отдельной бумажки, буклета, карты или брошюры с внутренней стороны контейнера или в контейнере. В некоторых воплощениях в инструкциях предложен способ введения клетки иммунного ответа по изобретению для лечения или предупреждения опухоли. В некоторых случаях инструкции обеспечивают способ введения иммунореактивной клетки по изобретению до, после или одновременно с введением химиотерапевтического агента.

В другом аспекте в данном документе предложен способ индукции гибели клетки, содержащей IL-13RA2, включающий приведение клетки в контакт с антителом, описанным в данном документе, химерным антигенным рецептором, описанным в данном документе, композицией, описанной в данном документе, или клеткой-хозяином, описанной в данном документе. В некоторых воплощениях приведение в контакт представляет собой приведение в контакт in vitro. В некоторых воплощениях приведение в контакт представляет собой приведение в контакт in vivo.

В некоторых воплощениях клетка представляет собой опухолевую клетку. В некоторых воплощениях клетка представляет собой опухоль мозга и более конкретно может представлять собой астроцитому, менингиому и глиому.

В другом аспекте в данном документе предложен способ лечения опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела, химерного антигенного рецептора, композиции, вектора или клетки-хозяина, описанных в данном документе.

В некоторых воплощениях иммунореактивную клетку можно вводить субъекту, где иммунореактивная клетка, которую можно вводить, может быть в возрасте от примерно 1 до примерно 35 дней. Например, вводимые клетки могут быть в возрасте 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 дня или вплоть до примерено 40 дней. Возраст иммунореактивных клеток с CAR можно рассчитывать, исходя из времени стимуляции. Возраст иммунореактивной клетки можно рассчитывать, исходя из времени забора крови. Возраст иммунореактивной клетки можно рассчитывать, исходя из времени трансдукции. В некоторых воплощениях возраст иммунореактивных клеток, которые можно вводить субъекту, составляет от примерно 10 до примерно 14 или примерно 20 дней. В некоторых воплощениях «возраст» иммунореактивной клетки может быть определен по длине теломер. Например, «молодая» клетка иммунного ответа может иметь большую длину теломер, чем «истощенная» или «старая» иммунореактивная клетка. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что иммунореактивная клетка теряет расчетную длину теломер примерно 0,8 тыс. нуклеотидов в неделю в культуре, и культура молодых иммунореактивных клеток может иметь теломеру, которая примерно на 1,4 тыс. нуклеотидов длиннее, чем у иммунореактивной клетки в возрасте примерно 44 дня. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, полагают, что большая длина теломер может быть ассоциирована с положительным объективным клиническим ответом у пациента и стойкостью клеток in vivo.

Клетки (например, сконструированные клетки или сконструированные первичные T-клетки) могут быть функциональными до, после и/или во время трансплантации. Например, трансплантированные клетки могут функционировать по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 суток после трансплантации. Трансплантированные клетки могут функционировать по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев после трансплантации. Трансплантированные клетки могут функционировать по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 30 лет после трансплантации. В некоторых воплощениях трансплантированные клетки могут функционировать на протяжении жизни реципиента.

Кроме того, трансплантированные клетки могут функционировать на уровне 100 % от их нормальной ожидаемой функции. Трансплантированные клетки могут также выполнять примерно 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или вплоть до примерно 100 % от их нормальной ожидаемой функции.

Трансплантированные клетки также могут выполнять более 100 % от своей нормальной предполагаемой функции. Например, трансплантированные клетки могут выполнять приблизительно 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % или вплоть до примерно 5000 % от нормальной ожидаемой функции.

Трансплантацию можно осуществлять любым типом трансплантации. Местная трансплантация может включать, но не ограничивается ими подпеченочное пространство, подселезеночное пространство, подпочечное пространство, сальник, желудочную или кишечную подслизистую оболочку, малый кишечный сосудистый сегмент, венозное пространство, семенник, мозг, селезенку или роговицу. Например, трансплантация может представлять собой подкапсульную трансплантацию. Трансплантация также может представлять собой внутримышечную трансплантацию. Трансплантация также может представлять собой трансплантацию в воротную вену.

Отторжение трансплантата может быть уменьшено после лечения клеткой иммунного ответа по изобретению, по сравнению со случаями, когда реципиенту трансплантируется одна или более чем одна клетка дикого типа. Например, отторжение трансплантата может представлять собой сверхострое отторжение. Отторжение трансплантата также может представлять собой острое отторжение. Другие типы отторжения могут включать хроническое отторжение. Отторжение трансплантата также может представлять собой отторжение, опосредованное клетками, или отторжение, опосредованное T-летками. Отторжение трансплантата также может представлять собой отторжение, опосредованное клетками - естественными киллерами.

Улучшение трансплантации может означать облегчение сверхострого отторжения, которое может включать уменьшение, облегчение или сокращение неблагоприятных побочных эффектов или симптомов. Трансплантация может относиться к адоптивной трансплантации клеточных продуктов.

Другие показатели успешной трансплантации могут представлять собой количество суток, в течение которых реципиент не нуждается в иммуносупрессивной терапии. Например, после предоставления клетки иммунного ответа по изобретению реципиенту может не требоваться иммуносупрессивная терапия в течение по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большего количества суток. Это может указывать на то, что трансплантация является успешной. Это также может указывать на то, что не происходит отторжения трансплантированных клеток, тканей и/или органов.

В некоторых воплощениях антитело, химерный антигенный рецептор, композицию, вектор или клетку-хозяина, описанные в данном документе, можно вводить в комбинации с другим терапевтическим агентом. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент, такой как описан в документе US 20140271820. Химиотерапевтическое лекарственное средство, которое можно использовать в комбинации с клеткой иммунного ответа по изобретению, включает, но не ограничивается ими, следующие агенты: ингибитор митоза (алкалоид барвинка), включая винкристин, винбластин, виндезин и навельбин (TM) (винорелбин, сульфид 5’-дегидроводорода); ингибитор топоизомеразы I, такой как соединения камптотецина, включая CamptosarTM (КамптосарTM) (иринотекан HCL), HycamtinTM (ГикамтинTM) (топотекан HCL) и другие соединения, полученные из камптотецина и его аналогов; производное подофиллотоксина, такое как этопозид, тенипозид и мидоксизоз; алкилирующий агент, такой как цисплатин, циклофосфамид, азотистый иприт, триметилентиофосфорамид, кармустин, бусульфан, хлорамбуцил, брихинолизин, урациловый иприт, клопрофен и дакарбазин; антиметаболит, включая цитарабин, 5-фторурацил, метотрексат, меркаптопурин, азатиоприн и прокарбазин; антибиотик, включая, но не ограничиваясь ими, доксорубицин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, мицинмицин, митомицин, саркомицин C и дауномицин; и другие химиотерапевтические лекарственные средства, включая но, не ограничиваясь ими, противоопухолевые антитела, дакарбазин, азацитидин, амсакон, мелфалан, ифосфамид и митоксантрон, но, не ограничиваясь ими. В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент выбран из одного или более чем одного из эпирубицина, оксалиплатина и 5-фторурацила.

В некоторых воплощениях химиотерапевтическое лекарственное средство, которое может быть использовано в комбинации с клеткой иммунного ответа по изобретению, включает, но не ограничивается ими, антиангиогенное средство, включая антитела против VEGF (включая гуманизированные и химерные антитела, аптамеры против VEGF и антисмысловые олигонуклеотиды), и другие ингибиторы ангиогенеза, такие как ангиостатин, эндостатин, интерферон, интерлейкин 1 (включая α и β), интерлейкин 12, ретиноевая кислота, тканевые ингибиторы металлопротеиназ-1 и -2.

Изобретение дополнительно относится к вектору, содержащему упомянутую выше соответствующую последовательность ДНК, а также соответствующий промотор или контрольную последовательность. Вектор можно использовать для трансформации соответствующей клетки-хозяина для обеспечения экспрессии ею белка Клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка; или клетку низшего эукариота, такую как дрожжевая клетка; или клетку высшего эукариота, такую как клетка млекопитающего.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано в связи с конкретными примерами, следующими ниже. Следует понимать, что данные примеры являются исключительно иллюстративными в отношении изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения. Экспериментальные способы в следующих примерах, в которых не уточняются конкретные условия, обычно осуществляют в соответствии с общепринятыми условиями, такими, как описано J. Sambrook et al. in Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3^rd Edition, Science Press, 2002, или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем.

Пример 1. Получение рекомбинантных белков IL-13RA2 и IL-13RA1

a. Конструирование экспрессионных плазмид IL-13RA2_huFc и IL-13RA1_huFc

Ген (SEQ ID NO: 17) внеклеточного сегмента Asp27-Arg343 (SEQ ID NO: 18) IL-13RA2 человека синтезировали in vitro; и ген вставляют в эукариотическую экспрессионную плазмиду, содержащую сегмент Fc Asp104-Lys330 константной области тяжелой цепи IgG1 человека, соединяют между собой посредством «GS» с образованием слитого экспрессионного белка IL-13RA2_huFc (SEQ ID NO: 22), и соответствующая последовательность гена слитого экспрессионного белка представлена на в SEQ ID NO: 11. В качестве альтернативы, ген (SEQ ID NO: 19) внеклеточного сегмента IL-13RA1 вставляют в эукариотическую экспрессионную плазмиду, содержащую сегмент Fc Asp104-Lys330 константной области тяжелой цепи IgG1 человека, соединяют между собой посредством «GS» с образованием слитого экспрессионного белка IL-13RA1_huFc (SEQ ID NO: 24), и соответствующая последовательность гена слитого экспрессионного белка представлена в SEQ ID NO: 23.

b. Экспрессия IL-13RA2_huFc и IL-13RA1_huFc посредством временной трансфекции

1) За одни сутки до трансфекции 6-7×10⁵/мл клеток 293F инокулируют в 125 мл колбу для культуры.

2) В день трансфекции 3×10⁷ клеток адаптируют в 28 мл среды для экспрессии FreeStyleTM 293.

3) Комплекс липид-ДНК получают посредством следующих рабочих стадий:

30 мкг ДНК разводят Opti-MEM I до конечного объема 1 мл и тщательно перемешивают.

60 мкл 293fectinTM разбавляют Opti-MEM I до конечного объема 1 мл и тщательно перемешивают.

Смесь инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре.

4) Разведенную ДНК смешивают с 293fectinTM и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре.

5) 2 мл комплекса ДНК-293fectin добавляют к 28 мл клеток, культивируют при 37 ºC, в 8 % CO₂, при 125 об/мин в течение 3-4 суток и собирают супернатант.

c. Очистка IL-13RA2_huFc и IL-13RA1_huFc

1) Супернатант культивируют при центрифугировании при 13000 об/мин в течение 15 мин.

2) Аффинную очистку проводят с использованием белка A в качестве наполнителя, и конкретные рабочие стадии выглядели следующим образом:

Уравновешивание: белковый наполнитель уравновешивают 10 объемами колонки уравновешивающего буфера.

Загрузка: загружают все образцы, обработанные с помощью 0,45 мкм мембраны фильтра.

Промывка: примеси промывают 20 объемами колонки уравновешивающего буфера до окончания потока.

Элюирование: исследуемый белок элюируют 10 объемами колонки элюирующего буфера (6 % нейтрализующий буфер заранее добавляют в пробирку для сбора).

Состав растворов:

Уравновешивающий буфер: ФБР (фосфатно-солевой буферный раствор) при pH 7,4

Элюирующий буфер: 0,1 M глицин при pH 2,6

Нейтрализующий буфер: 1 M Tris (трис(гидроксиметил)аминометана (HOCH₂)₃CNH₂)

3) Элюат фильтруют через 0,22 мкм мембрану, концентрируют с использованием пробирки для ультратонкой фильтрации millipore с отсекаемым количеством 10 кД до объема не больше чем 1 мл, обессоливают с использованием колонки для обессоливания PD-Midi и собирают 1,5 мл образца. Концентрацию белка измеряют посредством OD (optical density - оптическая плотность) 280/1,47.

2 мкг отбирают для запуска SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле с использованием натрия додецилсульфата), и результаты показаны на Фиг. 1.

Пример 2. Скрининг scFv, специфичного к IL-13RA2, и использованием целой библиотеки фагового дисплея человека

Библиотека фагового дисплея, используемая в изобретении, представляет собой целую фаговую библиотеку природного scFv человека, сконструированную компанией, и имеет емкость библиотеки 1E+11. Фрагмент scFv, высокоспецифичный к IL-13RA2, получают с использованием способов скрининга, известных специалистам в данной области. Кратко, 10 мкг/мл антигенов IL-13RA2_huFc и IL-13RA1_huFc наносят в качестве покрытия в иммунопробирки, соответственно. Для проведения скрининга антител, которые специфично связываются с IL-13RA2, фаговую библиотеку добавляют в иммунопробирку, покрытую IL-13RA1_huFc, для связывания в течение 1 часа. Супернатант добавляют в иммунопробирку, покрытую IL-13RA2_huFc, для связывания в течение 1,5 часов, затем неспецифичные фаги отмывают, связанные фаги элюируют и отбирают для инфицирования E. coli TG1 в логарифмической фазе роста. Элюированные фаги культивируют для размножения, и размноженную фаговую библиотеку очищают посредством использования способа осаждения PEG/NaCl для следующего цикла скрининга. Пэннинг проводили за 3-4 цикла для обогащения в отношении фаговых клонов scFv, которые специфично связываются с IL-13RA2. Позитивные клоны определяют стандартными способами ИФА для IL-13RA2_huFc. IL-13RA1_huFc используют в ИФА в качестве несвязанного антигена для проверки специфичности антитела. Всего проводят скрининг 3420 клонов, из которых 44 клона, как выявляют посредством анализа ИФА, специфично связываются с IL-13RA2_huFc и не связываются с IL-13RA1_huFc. После секвенирования получают 5 единичных последовательностей. 5 данных клонов экспрессируют и очищают, только 2 из них специфично связывались с клетками U251, экспрессирующими IL13RA2 (приобретенными у банка клеток китайской академии наук) (Фиг. 2 и 4), и названиями данных клонов являются 31C2 и 32H4.

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи 31C2 представлена как в SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена как в SEQ ID NO: 4; аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи 32H4 представлена как в SEQ ID NO: 6 и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена как в SEQ ID NO: 8. Аминокислотная последовательность HDCR1 31C2 представлена как в SEQ ID NO: 9, аминокислотная последовательность HDCR2 представлена как в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность HDCR3 представлена как в SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность LDCR1 представлена как в SEQ ID NO: 13, аминокислотная последовательность LDCR2 представлена как в SEQ ID NO: 14, аминокислотная последовательность LDCR3 представлена как в SEQ ID NO: 15; аминокислотная последовательность HDCR1 32H4 представлена как в SEQ ID NO: 9, аминокислотная последовательность HDCR2 представлена как в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность HDCR3 представлена как в SEQ ID NO: 12, аминокислотная последовательность LDCR1 представлена как в SEQ ID NO: 13, аминокислотная последовательность LDCR2 представлена как в SEQ ID NO: 14 и аминокислотная последовательность LDCR3 представлена как в SEQ ID NO: 16.

Пример 3. Анализ связывания ИФА

Видоспецифичность антител 31C2 и 32H4 определяют стандартным ИФА. IL-13RA2 мыши приобретают у Sino Biological Inc. Планшет ИФА покрывают 100 мкл 5 мкг/мл IL-13RA2 мыши на лунку при 4 ºC в течение ночи. Планшет ИФА с нанесенным покрытием три раза промывали ФБР. 200 мкл раствора 2 % сухого обезжиренного молока в ФБР на лунку добавляют для блокирования при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет три раза промывают ФБР. Подверженные градиентному разведению антитела с исходной концентрацией 10 мкг/мл, подверженные 3-кратному серийному разведению, добавляют и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь три раза промывают PBST и три раза промывают ФБР. Меченное HRP (Horseradish peroxidase - пероксидаза хрена) антитело козы против человеческого Fc добавляют и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь три раза промывают PBST и три раза промывают PBS. Затем добавляют TMB (tetramethylbenzidine - тетраметилбензидин) для развития окраски в течение 15 минут, и реакцию останавливают посредством добавления серной кислоты и снимают показания на микропланшетном ридере. Результат показан на Фиг. 3. Антитело 31C2 может связываться с IL-13RA2 мыши, а антитело 32H4 не связывается с IL-13RA2 мыши.

Пример 4. Конструирование слитого антитела против IL-13RA2 scFv_Fc, и его временная трансфекция, экспрессия, очистка и идентификация активности в эукариотической клетке

Осуществляют подбор праймеров для фрагментов VH и VL 31C2 и 32H4, соответственно, и линкер, состоящий из 15 гибких аминокислот (GGGGSGGGGSGGGGS), вводят с образованием scFv; подходящий сайт рестрикции и защитное основание вводят до VH, и подходящий сайт рестрикции и защитное основание вводят после VL. ПЦР-продукт анализируют посредством электрофореза в 1 % агарозном геле, очищают и выделяют. После ферментативного расщепления продукт лигируют в подходящий эукариотический экспрессионный вектор. Осуществляют временную трансфекцию клеток 293F в логарифмическую фазу роста с реагентом для трансфекции 293fectin™ (Invitrogen, 12347-019) или полиэтиленимином (PEI - polyethyleneimine) (Sigma-Aldrich, 408727). Супернатант культуры собирают через 5-7 суток после трансфекции и подвергают аффинной очистке посредством Белка A.

Связывание антитела с клетками U251, эндогенно экспрессирующими IL-13RA2, тестируют посредством проточной цитометрии с клетками 293T в качестве контроля с негативными клетками. Конкретный способ анализа FAC выглядел следующим образом: клетки собирают, один раз промывали средой для выращивания и ресуспендируют в ФБР, и концентрацию клеток доводят до 4E+5 клеток/мл. Разведенное слитое антитело scFv_Fc инкубируют с клетками в течение 30 минут на льду, и концентрация антитела составляла 111 нМ. Затем смесь инкубируют с FITC (Fluorescein isothiocyanate – флуоресцеин изотиоцианат)-меченным вторичным антителом против человеческого IgG. После двух стадий промывки проводят выявление с использованием системного инструмента Guava easyCyteTM HT. На Фиг. 4 показано состояние связывания слитых форм scFv_Fc антител 31C2 и 32H4 с клетками U251 и 293T. Оба антитела специфично связываются с клетками U251, эндогенно экспрессирующими IL-13RA2, и не связываются с негативными клетками 293T.

Пример 5. Определение аффинности антитела с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR - surface plasmon resonance)

Аффинность разных антител в отношении IL-13RA2 определяют с использованием biacore T200. Конкретные процедуры выглядели следующим образом:

IL-13RA2_huFc в качестве покрытия наносят на чип CM5 посредством аминосвязывания, наносят в качестве покрытия до примерно 500 RU, и антитела, подвергавшиеся градиентному разведению, пропускают через канал, покрытый антигеном, при скорости потока 30 мкл/мин в качестве подвижной фазы. Электродный буфер представлял собой HBS-N, и температура составляла 25°C. Экспериментальные данные анализируют посредством BIAevaluation 3.2, и кинетические кривые подгоняют с использованием 1:1 модели Ленгмюра. KD 31C2 (scFv_Fc) составляла 1,79 нМ, и KD 32H4 (scFv_Fc) составляла 3,76 нМ (см. Фиг. 5).

Пример 6. Определение EC50 связывания антитела с клетками U251 с использованием FACs

Клетки собирают, один раз промывают средой для выращивания и ресуспендируют в ФБР, и концентрацию клеток доводят до 4E+5 клеток/мл. Градиентно разведенное слитое антитело scFv_Fc инкубируют с клетками в течение 30 минут на льду, и антитело подвергают 5-кратному серийному разведению, с 500 нМ в качестве исходной концентрации, до 8 градиентов. Затем смесь инкубируют с FITC-меченным вторичным антителом против человеческого IgG. После двух стадий промывки проводят обнаружение с использованием системного инструмента Guava easyCyteTM HT. На Фиг. 6 показаны результаты, в которых оба антитела имеют связывание с клетками U251, зависимое от концентрационного градиента, 31C2 (ScFv_Fc) имеет EC₅₀ 2,8 нМ, и 32H4 (ScFv_Fc) имеет EC₅₀ 1 нМ.

Пример 7. Созревание аффинности антител

Созревание аффинности проводят с использованием технологии фагового дисплея.

Используя 31C2 и 32H4 в качестве исходных антител, конструируют две фаговые библиотеки, соответственно: одну, имеющую рандомизированные CDR1 и CDR2 легкой цепи, и другую, имеющую рандомизированные CDR1 и CDR2 тяжелой цепи. Затем проводят пэннинг библиотек в отношении антигена, и проводят скрининг антител с высокой аффинностью, то есть вариантов 31C2 и 32H4, посредством технологии SPR и тому подобное. Информация о праймерах показана на Фиг. 7.

Сначала конструируют плазмиду-матрицу на основе антитела 31C2 (scFv) (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 26). Для фаговых библиотек с рандомизированными CDR1 и CDR2 легкой цепи фрагмент 1 амплифицируют посредством ПЦР с использованием праймеров LMF и IL1R; фрагмент 2 амплифицируют посредством ПЦР с использованием праймеров IL2F и FdR; затем фрагмент 1 и фрагмент 2 лигируют посредством мостиковой ПЦР с получением полноразмерного scFv, содержащего рандомизированные последовательности, затем полноразмерный фрагмент расщепляют с помощью NcoI и NotI и лигируют посредством лигазы T4 в плазмиду-матрицу, аналогично расщепленную, и плазмиду подвергают электротрансформации в компетентные клетки TG1 с емкость библиотеки 1,68E+9. Для фаговых библиотек с рандомизированными CDR1 и CDR2 тяжелой цепи фрагмент 3 амплифицируют посредством ПЦР с использованием праймеров LMF и BH1R; фрагмент 4 амплифицируют посредством ПЦР с использованием праймером BH2F и FdR; затем фрагмент 3 и фрагмент 4 лигируют посредством мостиковой ПЦР с получением полноразмерного scFv, содержащего рандомизированные последовательности, затем полноразмерный фрагмент расщепляют с помощью NcoI и NotI, и лигируют посредством лигазы T4 в плазмиду-матрицу, аналогично расщепленную, и плазмиду подвергают электротрансформации к компетентные клетки TG1 с емкостью библиотеки 1,75E+9.

Конструирование библиотеки созревания аффинности антитела 32H4 было схоже на конструирование 31C2, и плазмиду-матрицу конструируют на основе антитела 32H4 (scFv) (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 27). CDR1 и CDR2 легкой цепи рандомизируют с использованием таких же праймеров, как и праймеры для 31C2, и полученная в результате емкость фаговой библиотеки составляла 2,1 E+9. Аналогично, CDR1 и CDR2 тяжелой цепи рандомизируют с использованием таких же праймеров, как и праймеры для 31C2, и полученная емкость фаговой библиотеки составляла 1,5 E+9.

Пример 8. Скрининг фаговых библиотек

Можно сослаться на способ в Примере 2 патента. Исходная концентрация антигена IL13RA2_huFc составляла 50 нМ и 2-кратное градиентное разведение проводят для следующего цикла скрининга. Пэннинг проводят в течение 2-3 циклов для обогащения фаговых клонов scFv, которые специфично связываются с IL13RA2_huFc. Позитивные клоны определяют стандартными способами ИФА в отношении IL13RA2_huFc. Сегмент IL13RA1_huFc человека используют в ИФА в качестве неродственного антигена для проверки специфичности антитела. Всего отбирают 111 ИФА-позитивных клонов; и константу диссоциации Kd индуцированного супернатанта определяют посредством biacore после повторной индукции. Среди них 10 клонов имели константу диссоциации Kd более чем в 10 раз ниже, чем константа диссоциации исходного клона, как показано на Фиг. 8.

Посредством секвенирования легкие цепи клонов 2C7, 2D3, 1D11, 1B11, 2A5, 2D4, 1H7 и 1D8 были идентичны легкой цепи 31C2 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3). Аминокислотные последовательности тяжелой цепи клонов 2C7 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 30), 2D3 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 31 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32), 1D11 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 33 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34), 1B11 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 35 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36), 2A5 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 37 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 38), 2D4 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 39 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 40), 1H7 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 41 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 42), 1D8 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 43 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 44) и 31C2 (имеющего аминокислоту SEQ ID NO: 2 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1) сравнивают на Фиг. 9A.

В клонах с созревшей аффинностью 31C2 последовательности HCDR1 показаны как в SEQ ID NO: 45-51, соответственно, и последовательности HCDR2 показаны как в SEQ ID NO: 52-58, соответственно. Для подробной информации см. Фиг. 9B.

По сравнению с VH исходного антитела 31C2, 2C7 имеет мутации 4 сайтов со сходством 96,7 %; 2D3 имеет мутации 5 сайтов, со сходством 95,8 %; 1D11 имеет мутации 6 сайтов, со сходством 95 %; 1B11 имеет мутации 5 сайтов, со сходством 95,8 %; 2A5 имеет мутации 4 сайтов, со сходством 96,7 %; 2D4 имеет мутации 5 сайтов, со сходством 95,8 %; 1H7 имеет мутации 4 сайтов, со сходством 96,7 %; и 1D8 имеет мутации 4 сайтов, со сходством 96,7 %.

Посредством секвенирования легкие цепи клонов 5G3 и 5D7 были идентичны легкой цепи 32H4 (имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7). Аминокислотные последовательности тяжелой цепи клонов 5G3 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 60), 5D7 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 62), и 32H4 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5) сравнивают на Фиг. 9C.

В клонах с созревшей аффинностью 32H4 последовательности HCDR1 показаны на SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно, и последовательности HCDR2 показаны как в SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно. Для подробной информации см. Фиг. 9D.

По сравнению с VH исходного антитела 32H4, 5G3 имеет мутации 5 сайтов со сходством 95,7 %; 2D3 имеет мутации 5 сайтов с 95,8 %; 5D7 имеет мутации 8 сайтов со сходством 95 %; и 1B11 имеет мутации 5 сайтов со сходством 93,2 %.

Пример 9. Экспрессия и очистка scFv

TG1, содержащий ген антитела, сеят штрихом для культуры, единичные клоны отбирают и инокулируют в среду 2xTY-Amp-5 % Глюкоза и культивируют при 37°C, при 220 об/мин до OD600 нМ, равной 0,8-0,9, и IPTG добавляют до конечной концентрации 1 мМ с последующей инкубацией при 220 об/мин при 25°C в течение ночи с индукцией экспрессии scFv.

Штаммы собирают посредством центрифугирования, суспендируют в 30 мМ Tris HCl, 20% сахарозе и 1 мМ EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid - этилендиаминтетрауксусная кислота) (pH 8,0) (80 мл на грамм штаммов), держат на льду и центрифугируют при 4°C при 8000 g. Отбирают супернатант A, осадок суспендируют8 мл 5 мМ MgSO₄, держат на льду, осторожно встряхивают в течение 10 минут и центрифугируют при 4°C при 8000 g и отбирают супернатант B. Супернатант A и супернатант B объединяют, центрифугируют при 12000 g в течение 15 минут и супернатант отбирают в виде холодной жидкости после осмотического шока.

Аффинную очистку проводят с использованием никелевой колонки, аффинность измеряют с использованием biacore T200, и константы диссоциации и ассоциации антител с созревшей аффинностью показаны как на Фиг. 10A.

Специфичность антител 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 и 1B11 определяют стандартным ИФА в соответствии со способом согласно Примеру 3. Результаты показаны как на Фиг. 10B. Клоны 1B11, 2C7, 2D3 и 2D4 от исходного антитела 31C2 специфично связываются с IL13RA2 человека, не связываются с IL13RA1 человека, и вступают в перекрестную реакцию с IL13RA2 мыши. Клоны 5D7 и 5G3 от исходного антитела 32H4 специфично связываются с IL13RA2 человека, не связываются с IL13RA1 человека и не связываются с IL13RA2 мыши.

Пример 10. Определение экспрессии и аффинности форм антител scFv_Fc

Отбирают шесть антител 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 и 1B11 с более высокой аффинностью для конструирования слитой формы scFv_Fc.

Ссылаясь на Пример 4, подходящий рестрикционный сайт и защитное основание вводят до VH, и подходящий рестрикционный сайт и защитное основание вводят после VL. ПЦР-продукт анализируют посредством электрофореза в 1 % агарозном геле; очищают и выделяют. После ферментативного расщепления продукт лигируют в эукариотический экспрессионный вектор V152, содержащий сегмент Fc человека (приобретенный в ShangHai Raygene Biotechnology Co., Ltd.). Проводят временную трансфекцию 30 мл клеток 293F вектором с помощью 293Fectin и его экспрессируют. Супернатант культуры собирают за 5-7 суток после трансфекции и подвергают аффинной очистке с помощью Белка A. Агрегирование антител анализируют посредством SEC (size exclusion chromatography - эксклюзионная хроматография). Результат показан на Фиг. 11.

Аффинность определяют с использованием способа согласно Примеру 5 с использованием biacore T200, и результаты показаны на Фиг. 11B-11G. Антитела с созревшей аффинностью имеют аффинность в 3-10 раз выше, чем аффинность исходного антитела. Константы диссоциации и ассоциации антител показаны на Фиг. 11F.

Пример 11. Определение EC50 связывания форм антител scFv_Fc с клетками U251

В соответствии со способом в соответствии с Примером 6, клетки собирают, промывают один раз средой для выращивания и ресуспендируют в ФБР, и концентрацию клеток доводят до 4E+5 клеток/мл. Подверженное градиентному разведению слитое антитело scFv_Fc инкубируют с клетками в течение 30 минут на льду, и антитело подвергают 5-кратному серийному разведению, с 2000 нМ в качестве исходной концентрации, на 11 градиентов. Затем смесь инкубируют с меченным FITC вторичным антителом против IgG человека. После двух стадий промывки проводят выявление с использованием системного инструмента Guava easyCyteTM HT. Результаты показаны на Фиг. 12: EC50 связывания форм антитела scFv_Fc 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 и 1B11 с клетками U251 составляют 0,56 нМ, 0,57 нМ, 0,53 нМ, 0,37 нМ, 0,33 нМ и 0,47 нМ, соответственно. Имеет место также 2-8 кратное увеличение, по сравнению с исходным антителом.

Пример 12. Получение CAR-T-клеток

2D4 и 5G3 отбирают для получения CAR-T-клеток и исследований противоопухолевой активности.

1. Конструирование лентивирусной пакующей плазмиды pRRL-hu8E3-28Z

Используя PRRLSIN-cPPT.EF-1α в качестве вектора, конструируют лентивирусные плазмиды, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы антител 2D4 и 5G3, включая PRRLSIN-cPPT.EF-1α-2D4-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-2D4-BBZ, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-2D4-28BBZ и PRRLSIN-cPPT.EF-1α-5G3-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-5G3-BBZ, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-5G3-28BBZ.

Последовательность 2D4-28Z состоит из сигнального пептида CD8α (SEQ ID NO: 68), 2D4scFv (SEQ ID NO: 67), шарнир CD8 (SEQ ID NO: 69), трансмембранной области CD28 (SEQ ID NO: 70) и внутриклеточного сигнального домена (SEQ ID NO: 71) и внутриклеточного сегмента CD3ζ (SEQ ID NO: 72) CD3.

Последовательность 2D4-BBZ состоит из сигнального пептида CD8α (SEQ ID NO: 68), 2D4scFv (SEQ ID NO: 67), шарнира CD8 (SEQ ID NO: 69), трансмембранной области CD8 (SEQ ID NO: 73), внутриклеточного сигнального домена CD137 (SEQ ID NO: 74) и внутриклеточного сегмента CD3ζ (SEQ ID NO: 72) CD3.

Последовательность 2D4-28BBZ состоит из сигнального пептида CD8α (SEQ ID NO: 68), 2D4scFv (SEQ ID NO: 67), шарнира CD8 (SEQ ID NO: 69), трансмембранной области CD28 (SEQ ID NO: 70) и внутриклеточного сигнального домена (SEQ ID NO: 71), внутриклеточного сигнального домена CD137 (SEQ ID NO: 74) и внутриклеточного сегмента CD3ζ (SEQ ID NO: 72) CD3.

Последовательность 5G3-28Z состоит из сигнального пептида CD8α (SEQ ID NO: 68), 5G3scFv (SEQ ID NO: 75), шарнира CD8 (SEQ ID NO: 69), трансмембранной области CD28 (SEQ ID NO: 70) и внутриклеточного сигнального домена (SEQ ID NO: 71) и внутриклеточного сегмента CD3ζ (SEQ ID NO: 72) CD3.

Последовательность 5G3-BBZ состоит из сигнального пептида CD8α (SEQ ID NO: 68), 5G3scFv (SEQ ID NO: 75), шарнира CD8 (SEQ ID NO: 69), трансмембранной области CD8 (SEQ ID NO: 73), внутриклеточного сигнального домена CD137 (SEQ ID NO: 74) и внутриклеточного сегмента CD3ζ (SEQ ID NO: 72) CD3.

Последовательность 5G3-28BBZ состоит из сигнального пептида CD8α (SEQ ID NO: 68), 5G3scFv (SEQ ID NO: 75), шарнира CD8 (SEQ ID NO: 69), CD28 трансмембранной области (SEQ ID NO: 70) и внутриклеточного сигнального домена (SEQ ID NO: 71), внутриклеточного сегмента CD137 (SEQ ID NO: 74) и внутриклеточного сегмента CD3ζ (SEQ ID NO: 72) CD3.

2. Лентивирусная упаковка, концентрирование вируса и определение титра лентивирусного вектора CAR, нацеленного на IL13Ra2

Осуществляют посев клеток 293T при плотности 1,7×10⁷ в 15 см чашке для культуры, и среда представляет собой DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium - среда Игла, модифицированная по Дульбекко), содержащую 10 % фетальную телячью сыворотку (BioWest). 13,73 мкг плазмид с целевым геном PRRLSIN-2D4-28Z, PRRLSIN-2D4-BBZ, PRRLSIN-2D4-28BBZ, PRRLSIN-5G3-28Z, PRRLSIN-5G3-BBZ и PRRLSIN-5G3-28BBZ и 16,4 мкг пакующих плазмид pRsv-REV, 16,4 мкг RRE-PMDLg и 6,4 мкг Vsvg соответственно растворяют в 2,048 мкл холостой культуральной жидкости DMEM и хорошо перемешивают.

158,4 мкг PEI (1 мкг/мкл) растворяют в 2,048 мкл культуральной жидкости DMEM, не содержащей сыворотку, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре. Смесь с плазмидой добавляют к смеси с PEI и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. 4,096 мл трансфекционного комплекса по каплям добавляют в 15 см чашку для культуры, содержащую 20 мл среды DMEM. После 4-5 часов трансфицированные клетки 293T заменяют средой DMEM, содержащей 10 % FBS (fetal bovine serum - фетальная бычья сыворотка), и инкубируют при 37°C в течение 72 ч. Супернатант раствора вируса собирают и концентрируют и определяют титр вируса. Титры концентрированного вируса составляют:

2D4-28Z: 3,89E×10⁸ U/мл,

2D4-BBZ: 3,08E×10⁸ U/мл,

2D4-28BBZ: 2,72E×10⁸ U/мл,

5G3-28Z: 3,7E×10⁸ U/мл,

5G3-BBZ: 1,88E×10⁸ U/мл, и

5G3-28BBZ: 3,11E×10⁸ U/мл, соответственно.

3. Лентивирусная трансдукция T-лимфоцитов, получение CAR-позитивных T-лимфоцитов

Активация T-лимфоцитов: T-лимфоциты добавляют в жидкую среду с культурой лимфоцитов при плотности примерно 5×10⁵/мл, и магнитные частицы (Invitrogen), покрытые антителом против CD3 и антителом против CD28, одновременно добавляют на магнитные частицы: соотношение клеток 2:1, и рекомбинантный IL-2 человека (Shanghai Huaxin Biotechnology Co., Ltd.) с конечной концентрацией 500 U/мл добавляют для стимуляции и культивируют в течение 24-48 часов;

Покрытие 24-луночного планшета ретронектином: 380 мкл 5 мкг/мл раствора ретронектина (ФБР) добавляют в каждую лунку и инкубируют при 4°C в течение ночи. Раствор ретронектина (ФБР) в 24-луночном планшете утилизируют с последующей двукратной промывкой 1 мл ФБР, промывкой средой один раз (лунки поддерживают во влажном состоянии); клетки инокулируют в 24-луночном планшете, покрытом ретронектином, причем количество клеток на лунку составляло 5×10⁵ и объем культурального раствора составлял 500 мкл; концентрированный летивирус добавляют к клеткам PBMC с MOI 15, центрифугируют при 32°C при 1200 g в течение 60 мин, переносят в инкубатор для клеток и после инфицирования вирусом в течение 24 ч культуральную жидкость центрифугируют с низкой скоростью (300 об/мин, 10 мин, большая центрифуга) для замены культуральной жидкости. Магнитные частицы можно удалять через 3-4 дня после инфицирования.

4. Экспрессия химерного антигенного рецептора T-лимфоцитов

T-лимфоциты, инфицированные лентивирусом, культивируют и на сутки 7 отбирают 1×10⁶ T-клеток, их разделяют на две части, центрифугируют при 4°C при 5000 об/мин в течение 5 мин, супернатант утилизируют и остаток дважды промывают ФБР. Клетки контрольной группы инкубируют с 50 мкл антитела PE-SA (разведение 1:200) на льду в течение 45 мин, дважды промывают ФБР (2 % NBS) и ресуспендируют в качестве контроля. Клетки опытной группы инкубируют с 50 мкл 1:50 разведенного меченного биотином антитела козы против человеческого IgG, антитела F(ab’)2 на льду в течение 45 мин и дважды промывают ФБР (2 % NBS); 50 мкл антитела PE-SA (разведение 1:200) добавляют и инкубируют на льду в течение 45 мин; 2 мл ФБР (2 % NBS) добавляют для ресуспендирования клеток и центрифугируют при 4 ºC при 5000 об/мин в течение 5 минут, супернатант утилизируюст, и процесс повторяют дважды; долю CAR-позитивных T-клеток выявляют посредством проточного цитометра.

5. Анализ цитотоксичности T-клеток с CAR, нацеленных на IL13Ra2

При сравнении in vitro цитолитической активности T-клеток с CAR UTD, 2D4-28Z, 2D4-BBZ, 2D4-28BBZ, 5G3-28Z, 5G3-BBZ, 5G3-28BBZ, положительные степени инфицирования для шести T-клеток с CAR составляли 66,0 %, 26,3 %, 34,8 %, 59,9 %, 35,5 % и 23,8 %, соответственно.

50 мкл RMPI плюс 10 % фетальная телячья сыворотка (Gibco) плюс двойное антитело добавляют в каждый из трех 16-луночных планшетов E-Plate 16, соответственно, и помещают в контрольно-измерительное устройство, работающее в реальном времени, для установления исходного уровня.

Клетки-мишени: 50 мкл 1×10⁴/мл клеток U251 инокулируют в 16-луночный планшет E-Plate 16, соответственно, выдерживают в течение 30-40 мин и помещают в контрольно-измерительное устройство, работающее в реальном времени, для начала мониторинга;

Эффекторные клетки: После 18 часов T-клетки с UTD и CAR, экспрессирующие разные химерные антигенные рецепторы, добавляют в соотношении эффектор:мишень 3:1, 1:1 или 1:3;

Две дублирующие лунки предоставляют в каждой группе, и берут среднее от двух дублирующих лунок. Время выявления составляло 38 ч.

Каждая опытная группа и каждая контрольная группа выглядят следующим образом:

Каждая опытная группа: каждая клетка-мишень плюс T-клетки с CAR, экспрессирующие разные химерные антигенные рецепторы;

Контрольная группа 1: клетки-мишени

Контрольная группа 2: холостая среда;

Формула расчета цитотоксичности выглядит следующим образом: цитотоксичность, % = [(опытная группа – спонтанная группа эффекторной клетки – спонтанная группа клетки-мишени)/(клетка-мишень max – спонтанная группа клетки-мишени)] * 100

Результаты эксперимента показаны на Фиг. 13. Каждая из T-клеток с CAR, экспрессирующих разные химерные антигенные рецепторы, обладала значимой цитолитической активностью in vitro в отношении IL13Ra2-позитивных клеток.

Все документы, упомянутые в изобретении, перечислены в виде ссылки, как если бы каждый документ был перечислен в виде ссылки по отдельности. Кроме того, следует понимать, что после прочтения об идеях изобретения, описанных выше, специалисты в данной области могут вносить различные изменения или модификации изобретения, и данные эквивалентные формы также будут попадать в объем настоящей заявки, как определено прилагаемой формулой изобретения.

--->

Перечень последовательностей

<110> КАРСГЕН ТЕРАПЬЮТИКС КО., ЛТД.

<120> АНТИТЕЛО К IL-13RA2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> P2018-0140

<150> 201710087299.2

<151> 2017-02-17

<150> 201810079015.X

<151> 2018-01-26

<160> 75

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 VH

<400> 1

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 2

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 VH

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 VL

<400> 3

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tacgatacct acccaccaat cacgtttggc 300

cagggcacca aagtcgagat caag 324

<210> 4

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2VL

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4 VH

<400> 5

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttgca 300

ttctctggtt ctttcgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354

<210> 6

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4 VH

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4 VL

<400> 7

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag agaaacagat acccaccaac gtttggccag 300

ggcaccaaag tcgagatcaa g 321

<210> 8

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4 VL

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Arg Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 и 32H4 HCDR1

<400> 9

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 и 32H4 HCDR2

<400> 10

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 HCDR3

<400> 11

Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4 HCDR3

<400> 12

Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 и 32H4 LCDR1

<400> 13

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 и 32H4 LCDR2

<400> 14

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2 LCDR3

<400> 15

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4 LCDR3

<400> 16

Gln Gln Arg Asn Arg Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 17

<211> 951

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra2 ECD

<400> 17

gacaccgaga taaaagttaa ccctcctcag gattttgaga tagtggatcc cggatactta 60

ggttatctct atttgcaatg gcaaccccca ctgtctctgg atcattttaa ggaatgcaca 120

gtggaatatg aactaaaata ccgaaacatt ggtagtgaaa catggaagac catcattact 180

aagaatctac attacaaaga tgggtttgat cttaacaagg gcattgaagc gaagatacac 240

acgcttttac catggcaatg cacaaatgga tcagaagttc aaagttcctg ggcagaaact 300

acttattgga tatcaccaca aggaattcca gaaactaaag ttcaggatat ggattgcgta 360

tattacaatt ggcaatattt actctgttct tggaaacctg gcataggtgt acttcttgat 420

accaattaca acttgtttta ctggtatgag ggcttggatc atgcattaca gtgtgttgat 480

tacatcaagg ctgatggaca aaatatagga tgcagatttc cctatttgga ggcatcagac 540

tataaagatt tctatatttg tgttaatgga tcatcagaga acaagcctat cagatccagt 600

tatttcactt ttcagcttca aaatatagtt aaacctttgc cgccagtcta tcttactttt 660

actcgggaga gttcatgtga aattaagctg aaatggagca tacctttggg acctattcca 720

gcaaggtgtt ttgattatga aattgagatc agagaagatg atactacctt ggtgactgct 780

acagttgaaa atgaaacata caccttgaaa acaacaaatg aaacccgaca attatgcttt 840

gtagtaagaa gcaaagtgaa tatttattgc tcagatgacg gaatttggag tgagtggagt 900

gataaacaat gctgggaagg tgaagaccta tcgaagaaaa ctttgctacg t 951

<210> 18

<211> 317

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra2 ECD

<400> 18

Asp Thr Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp

1 5 10 15

Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Asp His Phe Lys Glu Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg

35 40 45

Asn Ile Gly Ser Glu Thr Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His

50 55 60

Tyr Lys Asp Gly Phe Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His

65 70 75 80

Thr Leu Leu Pro Trp Gln Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser

85 90 95

Trp Ala Glu Thr Thr Tyr Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr

100 105 110

Lys Val Gln Asp Met Asp Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu

115 120 125

Cys Ser Trp Lys Pro Gly Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn

130 135 140

Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp

145 150 155 160

Tyr Ile Lys Ala Asp Gly Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu

165 170 175

Glu Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser

180 185 190

Glu Asn Lys Pro Ile Arg Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn

195 200 205

Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser

210 215 220

Ser Cys Glu Ile Lys Leu Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro

225 230 235 240

Ala Arg Cys Phe Asp Tyr Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr

245 250 255

Leu Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr

260 265 270

Asn Glu Thr Arg Gln Leu Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile

275 280 285

Tyr Cys Ser Asp Asp Gly Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys

290 295 300

Trp Glu Gly Glu Asp Leu Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg

305 310 315

<210> 19

<211> 964

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra1 ECD

<400> 19

gggcgggggc gccgcgccta cggaaactca gccacctgtg acaaatttga gtgtctctgt 60

tgaaaacctc tgcacagtaa tatggacatg gaatccaccc gagggagcca gctcaaattg 120

tagtctatgg tattttagtc attttggcga caaacaagat aagaaaatag ctccggaaac 180

tcgtcgttca atagaagtac ccctgaatga gaggatttgt ctgcaagtgg ggtcccagtg 240

tagcaccaat gagagtgaga agcctagcat tttggttgaa aaatgcatct cacccccaga 300

aggtgatcct gagtctgctg tgactgagct tcaatgcatt tggcacaacc tgagctacat 360

gaagtgttct tggctccctg gaaggaatac cagtcccgac actaactata ctctctacta 420

ttggcacaga agcctggaaa aaattcatca atgtgaaaac atctttagag aaggccaata 480

ctttggttgt tcctttgatc tgaccaaagt gaaggattcc agttttgaac aacacagtgt 540

ccaaataatg gtcaaggata atgcaggaaa aattaaacca tccttcaata tagtgccttt 600

aacttcccgt gtgaaacctg atcctccaca tattaaaaac ctctccttcc acaatgatga 660

cctatatgtg caatgggaga atccacagaa ttttattagc agatgcctat tttatgaagt 720

agaagtcaat aacagccaaa ctgagacaca taatgttttc tacgtccaag aggctaaatg 780

tgagaatcca gaatttgaga gaaatgtgga gaatacatct tgtttcatgg tccctggtgt 840

tcttcctgat actttgaaca cagtcagaat aagagtcaaa acaaataagt tatgctatga 900

ggatgacaaa ctctggagta attggagcca agaaatgagt ataggtaaga agcgcaattc 960

caca 964

<210> 20

<211> 322

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra1 ECD

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val Thr Asn

1 5 10 15

Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe Ser His

35 40 45

Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg Arg Ser

50 55 60

Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly Ser Gln

65 70 75 80

Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu Lys Cys

85 90 95

Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln

100 105 110

Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu Pro Gly

115 120 125

Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp His Arg

130 135 140

Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu Gly Gln

145 150 155 160

Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser Ser Phe

165 170 175

Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly Lys Ile

180 185 190

Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys Pro Asp

195 200 205

Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu Tyr Val

210 215 220

Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe Tyr Glu

225 230 235 240

Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe Tyr Val

245 250 255

Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val Glu Asn

260 265 270

Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu Asn Thr

275 280 285

Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asp Lys

290 295 300

Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys Arg Asn

305 310 315 320

Ser Thr

<210> 21

<211> 1638

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra2 ECD_huFc

<400> 21

gacaccgaga taaaagttaa ccctcctcag gattttgaga tagtggatcc cggatactta 60

ggttatctct atttgcaatg gcaaccccca ctgtctctgg atcattttaa ggaatgcaca 120

gtggaatatg aactaaaata ccgaaacatt ggtagtgaaa catggaagac catcattact 180

aagaatctac attacaaaga tgggtttgat cttaacaagg gcattgaagc gaagatacac 240

acgcttttac catggcaatg cacaaatgga tcagaagttc aaagttcctg ggcagaaact 300

acttattgga tatcaccaca aggaattcca gaaactaaag ttcaggatat ggattgcgta 360

tattacaatt ggcaatattt actctgttct tggaaacctg gcataggtgt acttcttgat 420

accaattaca acttgtttta ctggtatgag ggcttggatc atgcattaca gtgtgttgat 480

tacatcaagg ctgatggaca aaatatagga tgcagatttc cctatttgga ggcatcagac 540

tataaagatt tctatatttg tgttaatgga tcatcagaga acaagcctat cagatccagt 600

tatttcactt ttcagcttca aaatatagtt aaacctttgc cgccagtcta tcttactttt 660

actcgggaga gttcatgtga aattaagctg aaatggagca tacctttggg acctattcca 720

gcaaggtgtt ttgattatga aattgagatc agagaagatg atactacctt ggtgactgct 780

acagttgaaa atgaaacata caccttgaaa acaacaaatg aaacccgaca attatgcttt 840

gtagtaagaa gcaaagtgaa tatttattgc tcagatgacg gaatttggag tgagtggagt 900

gataaacaat gctgggaagg tgaagaccta tcgaagaaaa ctttgctacg tggatccgac 960

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 1020

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1080

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1140

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1200

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1260

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1320

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1380

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1440

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1500

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1560

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1620

tccctgtctc cgggtaaa 1638

<210> 22

<211> 546

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra2 ECD_huFc

<400> 22

Asp Thr Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp

1 5 10 15

Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Asp His Phe Lys Glu Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg

35 40 45

Asn Ile Gly Ser Glu Thr Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His

50 55 60

Tyr Lys Asp Gly Phe Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His

65 70 75 80

Thr Leu Leu Pro Trp Gln Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser

85 90 95

Trp Ala Glu Thr Thr Tyr Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr

100 105 110

Lys Val Gln Asp Met Asp Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu

115 120 125

Cys Ser Trp Lys Pro Gly Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn

130 135 140

Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp

145 150 155 160

Tyr Ile Lys Ala Asp Gly Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu

165 170 175

Glu Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser

180 185 190

Glu Asn Lys Pro Ile Arg Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn

195 200 205

Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser

210 215 220

Ser Cys Glu Ile Lys Leu Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro

225 230 235 240

Ala Arg Cys Phe Asp Tyr Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr

245 250 255

Leu Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr

260 265 270

Asn Glu Thr Arg Gln Leu Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile

275 280 285

Tyr Cys Ser Asp Asp Gly Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys

290 295 300

Trp Glu Gly Glu Asp Leu Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Gly Ser Asp

305 310 315 320

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

325 330 335

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

340 345 350

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

355 360 365

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

370 375 380

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

385 390 395 400

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

405 410 415

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

420 425 430

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

435 440 445

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

450 455 460

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

465 470 475 480

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

485 490 495

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

500 505 510

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

515 520 525

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

530 535 540

Gly Lys

545

<210> 23

<211> 1653

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra1 ECD_huFc

<400> 23

gggggcgggg gcgccgcgcc tacggaaact cagccacctg tgacaaattt gagtgtctct 60

gttgaaaacc tctgcacagt aatatggaca tggaatccac ccgagggagc cagctcaaat 120

tgtagtctat ggtattttag tcattttggc gacaaacaag ataagaaaat agctccggaa 180

actcgtcgtt caatagaagt acccctgaat gagaggattt gtctgcaagt ggggtcccag 240

tgtagcacca atgagagtga gaagcctagc attttggttg aaaaatgcat ctcaccccca 300

gaaggtgatc ctgagtctgc tgtgactgag cttcaatgca tttggcacaa cctgagctac 360

atgaagtgtt cttggctccc tggaaggaat accagtcccg acactaacta tactctctac 420

tattggcaca gaagcctgga aaaaattcat caatgtgaaa acatctttag agaaggccaa 480

tactttggtt gttcctttga tctgaccaaa gtgaaggatt ccagttttga acaacacagt 540

gtccaaataa tggtcaagga taatgcagga aaaattaaac catccttcaa tatagtgcct 600

ttaacttccc gtgtgaaacc tgatcctcca catattaaaa acctctcctt ccacaatgat 660

gacctatatg tgcaatggga gaatccacag aattttatta gcagatgcct attttatgaa 720

gtagaagtca ataacagcca aactgagaca cataatgttt tctacgtcca agaggctaaa 780

tgtgagaatc cagaatttga gagaaatgtg gagaatacat cttgtttcat ggtccctggt 840

gttcttcctg atactttgaa cacagtcaga ataagagtca aaacaaataa gttatgctat 900

gaggatgaca aactctggag taattggagc caagaaatga gtataggtaa gaagcgcaat 960

tccacaggat ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 1020

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 1080

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 1140

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1200

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1260

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1320

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1380

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1440

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1500

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1560

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1620

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1653

<210> 24

<211> 551

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL13Ra1 ECD_huFc

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val Thr Asn

1 5 10 15

Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe Ser His

35 40 45

Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg Arg Ser

50 55 60

Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly Ser Gln

65 70 75 80

Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu Lys Cys

85 90 95

Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln

100 105 110

Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu Pro Gly

115 120 125

Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp His Arg

130 135 140

Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu Gly Gln

145 150 155 160

Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser Ser Phe

165 170 175

Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly Lys Ile

180 185 190

Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys Pro Asp

195 200 205

Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu Tyr Val

210 215 220

Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe Tyr Glu

225 230 235 240

Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe Tyr Val

245 250 255

Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val Glu Asn

260 265 270

Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu Asn Thr

275 280 285

Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asp Lys

290 295 300

Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys Arg Asn

305 310 315 320

Ser Thr Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

325 330 335

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

340 345 350

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

355 360 365

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

370 375 380

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

385 390 395 400

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

405 410 415

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

420 425 430

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

435 440 445

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

450 455 460

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

465 470 475 480

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

485 490 495

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

500 505 510

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

515 520 525

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

530 535 540

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550

<210> 25

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2(scFv)

<400> 25

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys Arg

245

<210> 26

<211> 735

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 31C2(scFv)

<400> 26

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agtggtggag gcggttcagg cggaggtggt tctggcggtg gcggatcgga catccagatg 420

acccagtctc cttccaccct gtctgcatct gtaggagacc gtgtcaccat cacttgccgt 480

gccagtcaga gtattagtag ctggttggcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 540

aagctcctga tctatgatgc ctccagtttg gaaagtgggg tcccatcacg tttcagcggc 600

agtggatccg ggacagaatt cactctcacc atcagcagct tgcagcctga tgattttgca 660

acttattact gccaacagta cgatacctac ccaccaatca cgtttggcca gggcaccaaa 720

gtcgagatca agcgt 735

<210> 27

<211> 241

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4(scFv)

<400> 27

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg

210 215 220

Asn Arg Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

Arg

<210> 28

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 32H4(scFv)

<400> 28

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttgca 300

ttctctggtt ctttcgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgg acatccagat gacccagtct 420

ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac cgtgtcacca tcacttgccg tgccagtcag 480

agtattagta gctggttggc ctggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 540

atctatgatg cctccagttt ggaaagtggg gtcccatcac gtttcagcgg cagtggatcc 600

gggacagaat tcactctcac catcagcagc ttgcagcctg atgattttgc aacttattac 660

tgccaacaga gaaacagata cccaccaacg tttggccagg gcaccaaagt cgagatcaag 720

cgt 723

<210> 29

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2C7 VH

<400> 29

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Leu Pro

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2C7 VH

<400> 30

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttaaa ctgccggcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attactggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 31

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D3 VH

<400> 31

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Pro

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D3 VH

<400> 32

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgc agacctgcca tgacatgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attacaggta gtggtggtag tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgt gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 33

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D11 VH

<400> 33

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Ile

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D11 VH

<400> 34

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgga acaattccca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtggta gtgctggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 35

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1B11 VH

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asp

20 25 30

Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1B11 VH

<400> 36

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agggatgctt tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacattttac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 37

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A5 VH

<400> 37

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A5 VH

<400> 38

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc aggtatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgcta gtggtggtgg gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 39

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D4 VH

<400> 39

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D4 VH

<400> 40

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgc aagtatgcca tgggctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtgttggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 41

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1H7 VH

<400> 41

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1H7 VH

<400> 42

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgt cgctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagcggga gtggtggtgg gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 43

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D8 VH

<400> 43

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 44

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D8 VH

<400> 44

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agatacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attaatgcaa gtggaggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300

tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 45

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2C7 HCDR1

<400> 45

Lys Leu Pro Ala Met Ser

1 5

<210> 46

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D3 HCDR1

<400> 46

Arg Arg Pro Ala Met Thr

1 5

<210> 47

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D11 HCDR1

<400> 47

Gly Thr Ile Pro Met Ser

1 5

<210> 48

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1B11 HCDR1

<400> 48

Ser Arg Asp Ala Leu Asn

1 5

<210> 49

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A5 и 1D8 HCDR1

<400> 49

Ser Arg Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D4 HCDR1

<400> 50

Arg Lys Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 51

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1H7 HCDR1

<400> 51

Arg Arg Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 52

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2C7 и 2D3 HCDR2

<400> 52

Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 53

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D11 HCDR2

<400> 53

Ser Ile Ser Gly Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 54

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1B11 HCDR2

<400> 54

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 55

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2A5 HCDR2

<400> 55

Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 56

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D4 HCDR2

<400> 56

Gly Ile Ser Gly Ser Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 57

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1H7 HCDR2

<400> 57

Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 1D8 HCDR2

<400> 58

Ala Ile Asn Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 59

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5G3 VH

<400> 59

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Arg Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5G3 VH

<400> 60

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttacgtcc tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attaggggta gtgctggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttgca 300

ttctctggtt ctttcgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354

<210> 61

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5D7 VH

<400> 61

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Ser Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5D7 VH

<400> 62

gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc aactatgcaa tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggc attcgtagta gtggtggtcg cacattctac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttgca 300

ttctctggtt ctttcgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354

<210> 63

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5G3 HCDR1

<400> 63

Ser Ser Tyr Val Leu Ser

1 5

<210> 64

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5D7 HCDR1

<400> 64

Ser Asn Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 65

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5G3 HCDR2

<400> 65

Ala Ile Arg Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 66

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5D7 HCDR2

<400> 66

Gly Ile Arg Ser Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 67

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 2D4 scFv

<400> 67

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys Arg

245

<210> 68

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид CD8

<400> 68

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 69

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнир CD8α

<400> 69

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 70

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранная область CD28

<400> 70

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 71

<211> 123

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> внутриклеточный домен CD28

<400> 71

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 72

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен CD3Z

<400> 72

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 73

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный CD8

<400> 73

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 74

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> внутриклеточный сигнальный домен CD137

<400> 74

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 75

<211> 241

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5G3 scFv

<400> 75

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Arg Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg

210 215 220

Asn Arg Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

Arg

<---

1. Антитело, которое специфично распознает человеческий IL-13RA2, где антитело выбрано из любого из следующих антител:

антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 или 64, и HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 или 66, и HCDR3, представленную в любой из SEQ ID NO: 11 или 12, и вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, и LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленную в любой из SEQ ID NO: 15 или 16.

2. Антитело по п. 1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 или 61, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.

3. Антитело по п. 1, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16,

где предпочтительно вариабельная область легкой цепи антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или 8.

4. Антитело по п. 3, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 или 64, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 или 66, и HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12;

где предпочтительно вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 или 61.

5. Антитело по п. 4, где области CDR (область, определяющая комплементарность) вариабельной области легкой цепи и области CDR вариабельной области тяжелой цепи имеют следующие возможные последовательности:

(1) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(2) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 16; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 9, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 12;

(3) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 16; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 64, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 66, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 12;

(4) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 45, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 52, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(5) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 16; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 63, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 65, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 12;

(6) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 50, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 56, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(7) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 46, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 52, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(8) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 48, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 54, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(9) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 47, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 53, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(10) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 49, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 55, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11;

(11) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 51, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 57, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO: 11; или

(12) LCDR1, представленная в SEQ ID NO: 13, LCDR2, представленная в SEQ ID NO: 14, и LCDR3, представленная в SEQ ID NO: 15; HCDR1, представленная в SEQ ID NO: 49, HCDR2, представленная в SEQ ID NO: 58, и HCDR3, представленная в SEQ ID NO:11;

где предпочтительно:

(1) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

(2) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6;

(3) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61;

(4) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29;

(5) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59;

(6) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39;

(7) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31;

(8) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35;

(9) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33;

(10) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37;

(11) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41; или

(12) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43.

6. Многофункциональный иммуноконъюгат для лечения опухоли, экспрессирующей человеческий IL-13RA2, где многофункциональный иммуноконъюгат содержит:

антитело по любому из пп. 1-5; и

связанную с ним функциональную молекулу; причем функциональная молекула выбрана из молекулы, нацеленной на маркер поверхности опухолевой клетки, молекулы, ингибирующей опухоль, молекулы, нацеленной на маркер поверхности иммунной клетки, или детектируемой метки.

7. Многофункциональный иммуноконъюгат по п. 6, где молекула, нацеленная на маркер поверхности опухолевой клетки, представляет собой антитело или лиганд, который связывается с маркером поверхности опухолевой клетки, отличным от IL-13RA2; или

молекула, ингибирующая опухоль, представляет собой противоопухолевый цитокин или противоопухолевый токсин; предпочтительно, цитокин выбран из IL-12, IL-15, интерферона типа I и ФНО-альфа.

8. Многофункциональный иммуноконъюгат по п. 6, где молекула, нацеленная на маркер поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности иммунной клетки, где предпочтительно связанный маркер поверхности иммунной клетки выбран из CD3, CD16 и CD28, и более предпочтительно антитело, которое связывается с маркером поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело против CD3;

где предпочтительно молекула, нацеленная на маркер поверхности иммунной клетки, представляет собой антитело, которое связывается с маркером поверхности T-клетки, и образует бифункциональное антитело с антителом по любому из пп. 1-5, в котором задействованы T-клетки.

9. Многофункциональный иммуноконъюгат по п. 8, где многофункциональный иммуноконъюгат представляет собой слитый полипептид, дополнительно содержащий линкерный пептид между антителом по любому из пп. 1-5 и связанной с ним функциональной молекулой.

10. Химерный антигенный рецептор, специфично распознающий человеческий IL-13RA2 и содержащий антитело по любому из пп. 1-5, где химерный антигенный рецептор содержит антитело по любому из пп. 1-5, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область, соединенные последовательно;

где предпочтительно внутриклеточная сигнальная область выбрана из функциональных сигнальных доменов белков CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, FcRγ (FCER1G), FcRβ (FcεR1b), CD79a, CD79b, FcγRIIa, DAP10 и DAP12 или их комбинации;

более предпочтительно внутриклеточная сигнальная область дополнительно имеет костимулирующий сигнальный домен, и костимулирующий сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из: CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антигена-1, ассоциированного с функцией лимфоцита (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганда, специфично связывающегося с CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46 и NKG2D или их комбинации.

11. Химерный антигенный рецептор по п. 10, где химерный антигенный рецептор содержит антитело, трансмембранную область и внутриклеточную сигнальную область, соединенные последовательно следующим образом:

антитело по любому из пп. 1-5, CD8 и CD3ζ;

антитело по любому из пп. 1-5, CD8, CD137 и CD3ζ; или

антитело по любому из пп. 1-5, трансмембранная область молекулы CD28, внутриклеточная сигнальная область молекулы CD28, и CD3ζ; или

антитело по любому из пп. 1-5, трансмембранная область молекулы CD28, внутриклеточная сигнальная область молекулы CD28, CD137 и CD3ζ.

12. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 1-5; или

кодирующая химерный антигенный рецептор по п. 10 или 11.

13. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 12.

14. Клетка-хозяин для экспрессии антитела по любому из пп. 1-5, содержащая экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по любому из пп. 1-5, или содержащая указанную нуклеиновую кислоту, интегрированную в геном.

15. Вирус, содержащий экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор по п. 10 или 11.

16. Иммунная клетка, модифицированная xимерным антигенным рецептором, которая нацелена на опухолевые клетки, экспрессирующие человеческий IL-13RA2, где

иммунная клетка представляет собой клетку, имеющую эффективную цитотоксичность против клеток;

иммунная клетка трансдуцирована нуклеиновой кислотой, кодирующей химерный антигенный рецептор по п. 10 или 11; или

экспрессионным вектором, который содержит указанную нуклеиновую кислоту; или

вирусом по п. 15; и

где иммунная клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор по п. 10 или 11 на поверхности.

17. Иммунная клетка, модифицированная xимерным антигенным рецептором, по п. 16, где

иммунная клетка выбрана из T-лимфоцита, NK-клетки (естественный киллер) или NKT-лимфоцита;

предпочтительно

иммунная клетка дополнительно несет кодирующую последовательность экзогенного цитокина; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует другой химерный антигенный рецептор, который не содержит CD3ζ; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует хемокиновый рецептор, предпочтительно содержащий CCR; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует миРНК (малая интерферирующая РНК), которая уменьшает экспрессию PD-1, или белок, блокирующий PD-L1; или эндогенный PD-1 в иммунной клетке подвергается нокауту посредством редактирования гена; или

иммунная клетка дополнительно экспрессирует «предохранитель» (safety switch).

18. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, экспрессирующей человеческий IL-13RA2, содержащая:

эффективное количество антитела по любому из пп. 1-5; или

эффективное количество иммуноконъюгата по любому из пп. 6-9; или

эффективное количество химерного антигенного рецептора по п. 10 или 11; или

эффективное количество иммунной клетки, модифицированной химерным антигенным рецептором, по п. 16 или 17;

и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

19. Набор для лечения опухоли, экспрессирующей человеческий IL-13RA2, содержащий:

контейнер и фармацевтическую композицию по п. 18 в контейнере; или

контейнер и антитело по любому из пп. 1-5; или иммуноконъюгат по любому из пп. 6-9; или химерный антигенный рецептор по п. 10 или 11; или иммунную клетку, модифицированную химерным антигенным рецептором, по п. 16 или 17 в контейнере.

20. Применение антитела по любому из пп. 1-5; или иммуноконъюгата по любому из пп. 6-9; или химерного антигенного рецептора по п. 10 или 11; или иммунной клетки, модифицированной химерным антигенным рецептором, по п. 16 или 17 для лечения опухоли, экспрессирующей человеческий IL-13RA2,

где опухоль, экспрессирующая человеческий IL-13RA2, представляет собой рак мозга, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак кишечника, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, рак предстательной железы и саркому Капоши, и более предпочтительно, рак мозга выбран из астроцитомы, менингиомы, олигодендроглиомы и глиомы.