Способ ранней диагностики опухолей предстательной железы

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины. У пациента осуществляют сбор крови и мочи, выделение свободной цирДНК из плазмы, суммарной цирДНК из супернатанта крови, внДНК из супернатанта мочи, модификацию цирДНК и внДНК бисульфитом натрия. Далее осуществляют детекцию по меньшей мере трех (для диагностики РПЖ) или двух (для диагностики ДГПЖ) аберрантно-метилированных маркерных цитозинов в индивидуальных молекулах ДНК в составе промоторных областей генов GSTP1 (NG_012075.1, 4998-5139) и RNF219 (NC_000013.11, 125-285) любым известным способом, например при помощи массового параллельного секвенирования или при помощи ПЦР в режиме реального времени. При выявлении аберрантно-метилированных цитозинов методом прямого секвенирования выполняют наработку ПЦР продуктов двух исследуемых генов, приготовление библиотек и затем массовое параллельное секвенирование. При выявлении аберрантно-метилированных цитозинов методом ПЦР проводят несколько (до пяти) реакций ПЦР в режиме реального времени с использованием различных комбинаций праймеров и TaqMan-зондов, специфичных к последовательностям промоторных областей исследуемых генов GSTP1 и RNF219. Изобретение позволяет сократить длительность способа, а также повысить чувствительность, специфичность и точность ранней диагностики опухолей предстательной железы (РПЖ или ДГПЖ). 7 з.п. ф-лы, 11 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к молекулярно-генетической диагностике, и направлено на разработку способа неинвазивной ранней диагностики злокачественных и доброкачественных опухолей предстательной железы, а также мониторинга эффективности противораковой терапии.

Своевременная диагностика рецидивов и выявление онкологических заболеваний предстательной железы на ранних стадиях является важной проблемой современной медицины [1]. Разработка диагностики, основанной на анализе циркулирующих в крови нуклеиновых кислот (цирНК) и присутствующих в моче внеклеточных нуклеиновых кислот (внНК) является одним из трендов развития современной онкодиагностики [2, 3]. Аберрантно метилированные циркулирующие ДНК (цирДНК) и внеклеточные ДНК (внДНК) являются перспективными маркерами, поскольку часто сопутствуют трансформации опухолевых клеток и могут быть относительно легко детектированы в присутствие больших избытков ДНК дикого типа [4].

В настоящее время известно, что степень метилирования отдельных CpG-динуклеотидов в составе метилированных локусов может отличаться [5]. Очевидно, что отдельные клоны клеток опухоли с характеристическим профилем метилирования ДНК могут вносить разный вклад как в формирование пула внДНК, так и в развитие опухоли. Таким образом, поиск специфических профилей метилирования локусов, связанных с развитием опухолей разного фенотипа и характерных исключительно для онкотрансформированных клеток необходим для рационального дизайна диагностических систем на наличие в организме очагов доброкачественных и\или злокачественных новообразований.

Известен способ диагностики рака предстательной железы (РПЖ) путем анализа уровня простатического специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови [6]. Однако, при высокой чувствительности метода (94.12%) недостатком является его низкая специфичность (8.64%).

Известен способ диагностики онкологических заболеваний кишечника путем выявления аберрантного метилирования цирДНК в плазме периферической крови [7].

Недостатком способа является частичная потеря информации в связи с использованием только свободных цирДНК (т.е. только циркулирующих ДНК плазмы крови).

Наиболее ближайшим к заявленному способу - прототипом, является способ диагностики рака предстательной железы путем выявления аберрантного метилирования промоторной области генов GSTP1 и RASSF1A в цирДНК плазмы крови и клеточном осадке мочи с использованием метода qMS-PCR [8], включающий следующие стадии: сбор крови (5 мл), разделение крови на плазму и клеточную фракцию, с последующей заморозкой плазмы при -70°С до дальнейшего использования. Сбор мочи (10-40 мл) с последующим ее центрифугированием при 3000 rpm в течении 10 мин и заморозкой полученного клеточного осадка мочи при -70°С до дальнейшего использования. Выделение ДНК из образцов плазмы крови и клеточного осадка мочи с использованием набора QIAmp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany) согласно протоколу производителя, проведение бисульфитной модификации ДНК с использованием набора EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Germany) согласно протоколу производителя, с последующим хранением образца модифицированной ДНК при -70°С до использования. Дальнейшим выявлением аберрантного метилирования промоторных областей генов GSTP1 и RASSF1A с использованием метода количественной ПЦР, специфичной к метилированию (qMS-PCR). Чувствительность анализа составила 27.7% (при специфичности 78.6%) и 31.3% (при специфичности 74.8%) для генов GSTP1 и RASSF1A, соответственно, при анализе метилирования промоторных областей исследуемых генов в цирДНК плазмы; чувствительность составила 47.6% (для гена GSTP1) и 27.7% (для гена RASSF1A) при аналогичной специфичности при анализе процента метилирования ДНК в клеточном осадке мочи. Наивысшая прогностическая ценность системы (93.9%) достигалась за счет дополнительного анализа уровня ПСА (простатического специфического антигена) и количества повторов AR-CAG (методом ПЦР с последующим секвенированием продукта амплификации с использованием BigDye Terminator Cycle Kit V3) в крови.

Основным недостатком известного способа является отсутствие возможности определения метилирования каждого цитозина в отдельной молекуле. К дополнительным недостаткам способа относятся использование только свободно циркулирующих ДНК плазмы (при анализе цирДНК крови), использование ДНК клеточного осадка мочи, а не внеклеточной ДНК мочи (таким образом, велика вероятность «загрязнения препарата фоновой ДНК (ДНК здоровых клеток)»). При комбинации маркеров способ содержит большое количество реакций и используемых методов, что увеличивает расходы и время на анализ образцов.

Задачей изобретения является создание высокоточного теста для дифференциальной диагностики рака предстательной железы (РПЖ) или доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), а также мониторинга проводимой терапии с возможностью исполнения в клиниках разного уровня оснащенности оборудованием и квалифицированным персоналом, что позволяет в будущем перейти к персонализированной медицине и высокотехнологичному здравоохранению.

Технический результат: сокращение длительности способа, а также повышение чувствительности, специфичности и точности ранней диагностики злокачественных или доброкачественных опухолей предстательной железы (РПЖ или ДГПЖ).

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

У пациента осуществляют сбор крови и мочи. В качестве источника диагностического материала используют свободную цирДНК плазмы крови или суммарную цирДНК крови, или внДНК мочи. Для этого получают плазму крови, или супернатант крови, или супернатант мочи при помощи центрифугирования, выделяют свободную цирДНК из плазмы, или суммарную цирДНК из супернатанта крови, или внДНК из супернатанта мочи, проводят модификацию цирДНК крови или внДНК мочи бисульфитом натрия.

Далее осуществляют выявление по меньшей мере трех аберрантно-метилированных маркерных цитозинов (для диагностики РПЖ) или не менее двух маркерных цитозинов (для диагностики ДГПЖ) в индивидуальных молекулах ДНК, выбранных из группы: С2, С3, С4, С5, С7, С9, СП, С13, С16, С17, для гена GSTP1 (NG_012075.1, 4998-5139) и не менее трех маркерных цитозинов (для диагностики РПЖ) или не менее двух маркерных цитозинов (для диагностики ДГПЖ), выбранных из группы С1-С17 для гена RNF219 (NC_000013.11, 125-285) любым известным способом, например, прямым секвенированием или при помощи ПЦР в режиме реального времени.

При выявлении аберрантно-метилированных цитозинов методом прямого секвенирования, выполняют наработку ПЦР продуктов двух исследуемых генов (с использованием баркодированных праймеров при необходимости одновременного исследования образцов от нескольких пациентов), приготовление библиотек и, затем, массовое параллельное секвенирование (например, на платформе MiSeq (Illumina)).

При выявлении аберрантно- метилированных цитозинов методом ПЦР проводят несколько (до пяти) реакций ПЦР в режиме реального времени с использованием различных комбинаций праймеров и TaqMan-зондов, специфичных к последовательностям промоторных областей исследуемых генов GSTP1 и RNF219.

В преимущественном варианте, для получения свободных цирДНК, кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию при помощи центрифугирования. Далее проводят выделение цирДНК из плазмы крови любым известным способом, например, с помощью стекловолокнистых сорбентов при помощи набора «Blood DNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия).

В преимущественном варианте, для получения суммарного пула цирДНК крови (содержащего цирДНК плазмы и цирДНК, связанные с клеточной поверхностью) собранную в вакутейнер кровь смешивают со специальным раствором, как описано в [9], инкубируют 5 минут и затем разделяют кровь на супернатант и клеточную фракцию при помощи центрифугирования. Далее проводят выделение суммарной цирДНК из полученного супернатанта крови любым известным способом, например, с помощью стекловолокнистых сорбентов при помощи набора «Blood DNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия).

Сбор мочи осуществляют в стерильный контейнер, центрифугируют для удаления клеток и полученный супернатант используют для выделения внДНК мочи любым известным способом, например, с помощью стекловолокнистых сорбентов при помощи набора «Urine DNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия).

Полученную цир/внДНК модифицируют бисульфитом натрия с использованием набора EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO Research, CILIA), который обеспечивает максимальный выход цирДНК после бисульфитной конверсии [10].

Использование ПЦР, специфичной к метилированию в качестве метода детекции аберрантно метилированных цитозинов позволяет исключить потребность в дорогостоящем оборудовании и реактивах, а также в высококвалифицированном персонале, который необходим для обработки данных секвенирования и, в свою очередь, позволяет использовать предложенный способ в рутинном обследовании мужчин на предмет наличия онкологических заболеваний предстательной железы на базе практически любых поликлиник.

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

- в качестве источника диагностического материала используют свободную цирДНК плазмы крови или суммарную цирДНК крови, что позволяет увеличить количество получаемой диагностической информации за счет использования не только свободных цирДНК плазмы крови, но и цирДНК, связанных с поверхностью клеток крови;

- в качестве источника диагностического материала используют также внДНК мочи, а не ДНК клеточного осадка мочи (как описано в прототипе), что позволяет уменьшить неспецифический сигнал, получаемый от ДНК здоровых клеток;

- в качестве аберрантно-метилированных маркерных цитозинов выявляют не менее трех цитозинов (для диагностики РПЖ) или не менее двух цитозинов (для диагностики ДГПЖ), выбранных из группы: С2, С3, С4, С5, С7, С9, С11, С13, С16, С17 для гена GSTP1 (NG 012075.1, 4998-5139) и не менее трех цитозинов (для диагностики РПЖ) или не менее двух цитозинов (для диагностики ДГПЖ), выбранных из группы С1-С17 для гена RNF219 (NC_000013.11, 125-285), что позволяет увеличить диагностическую ценность системы за счет исследования статуса метилирования в сочетании с геном GSTP1 гена RNF219, а не RASSF1 А, как описано в прототипе;

- детекцию аберрантного метилирования цитозинов проводят при помощи массового параллельного секвенирования или с использованием ПЦР, специфичной к метилированию, что позволяет увеличить количество получаемой диагностической информации благодаря использованию массового параллельного секвенирования на платформе MiSeq (Illumina).

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

- позволяет увеличить количество получаемой диагностической информации благодаря использованию суммарной фракции цирДНК крови;

- позволяет увеличить количество получаемой диагностической информации благодаря использованию массового параллельного секвенирования на платформе MiSeq (Illumina);

- позволяет выявлять функционально-значимые для диагностики CpG динуклеотиды (С2, С3, С4, С5, С7, С9, С11, С13, С16, С17 для гена GSTP1; С1-С17 для гена RNF219) при использовании секвенирования на платформе MiSeq (Illumina), метилирование которых принципиально для регуляции статуса экспрессии генов за счет оценки представленности молекулярных паттернов метилирования и выявлении корреляций между статусом метилирования CpG-динуклеотидов в составе одной молекулы;

- вне зависимости от используемого метода детекции, позволяет увеличить диагностическую ценность системы за счет анализа попарного метилирования цитозинов в молекуле, а именно, одновременного метилирования, или метилирования одного и отсутствия метилирования второго, или отсутствия метилирования двух цитозинов в одной молекуле ДНК.

- вне зависимости от используемого метода детекции, позволяет увеличить диагностическую ценность системы за счет исследования статуса метилирования двух генов, а не одного, как описано в прототипе.

В совокупности способ позволяет получить дифференциальную диагностику опухолей предстательной железы с чувствительностью, специфичностью и точностью 100%, а именно, идентифицировать больных раком предстательной железы и больных доброкачественной гиперплазией предстательной железы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Предлагаемый способ был апробирован на образцах крови и мочи пациентов со злокачественными опухолями предстательной железы (n=10) на начальных стадиях заболевания (получены из Новосибирского Областного Онкологического диспансера). Клинические показатели доноров указаны в таблице 1.

У всех пациентов взяли кровь при помощи двух вакутейнеров (по 9 мл каждый) с антикоагулянтом (Vacuette, Greiner Bio-one, Австрия). Цельную кровь из одного вакутейнера центрифугировали в течение 20 мин при 400g. Плазму переносили в новую пробирку объемом 13 мл и повторно центрифугировали 20 мин при 800g. Из полученной плазмы (4 мл) выделили свободную цирДНК с помощью набора для выделения ДНК «Blood DNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия) в полном соответствии с рекомендациями производителя. После выделения ДНК осадили ацетоном в присутствии триэтиламина и 20 мкг гликогена (ThermoScientific, Литва), как описано [11], растворили в 55 мкл воды; 50 мкл полученной цирДНК использовали для проведения бисульфитной конверсии (EZ DNA Methylation-GoldTM Kit, ZymoResearch, США) по протоколу, рекомендованному производителем. После бисульфитной конверсии 1/6 часть ДНК использовали для получения ПЦР продуктов в условиях, описанных в таблице 2 для каждого гена с использованием праймеров с баркодами, описанных в таблице 3 (методика баркодирования пациентов описана в [12]). Далее эквимолярные количества ПЦР-продуктов каждого гена объединили, затем при помощи набора NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEBioLabs) по протоколу, рекомендованному производителем, лигировали адаптеры Illumina и получили ДНК библиотеки для секвенирования. Смесь полученных ПЦР-продуктов секвенировали методом массового параллельного секвенирования на платформе MiSeq (Illumina). В качестве контролей секвенирования использовали полностью метилированную и полностью неметилированную ДНК. Поскольку методика секвенирования на платформе MiSeq (Illumina) с использованием праймеров, описанных в таблице 2, всегда обеспечивает данными о состоянии метилирования одновременно 17-ти исследуемых цитозинов за одну постановку реакции, то и анализ проводился сразу всех 17-ти цитозинов в обоих генах (GSTP1, RNF219) у каждого пациента.

В таблице 4 приведены данные секвенирования 9-ти комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 в свободной цирДНК плазмы крови для всех 10 пациентов с РПЖ. Из таблицы 4 видно, что для выявления больных с РПЖ достаточно анализа не менее трех метилированных маркерных цитозинов, например, комбинации (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C2) или (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C16) маркерных цитозинов, обеспечивающих 100% чувствительность при 100% специфичности.

Анализ дополнительной комбинации маркерных цитозинов (GSTP1.C9+RNF219.C2.T10), обеспечивает при 100% специфичности, чувствительность в 95%, что позволяет дополнительно повысить точность предлагаемой диагностической системы (актуально в медицинских учреждениях высокого уровня оснащенности и «медицинского доверия», в том числе и коммерческих учреждениях).

Для постановки диагноза РПЖ также были проанализированы такие комбинации маркерных цитозинов в свободной цирДНК плазмы крови, как GSTP1.C3.C9, GSTP1.C9, GSTP1.C9.T17, GSTP1.T2.C9, GSTP1.T1.C9, GSTP1.T6.C9, GSTP1.T4.C9, GSTP1.C9.T16, GSTP1.C9.T14, GSTP1.T5.C9, GSTP1.C9.C13, обеспечивающие при 100% специфичности интервал чувствительности 70-80%, а при любой их комбинации от четырех штук - обеспечивается и чувствительность в 100%.

Детекция аберрантно-метилированных маркерных цитозинов в суммарной цирДНК крови.

У группы пациентов из 10 человек кровь из второго вакутейнера смешивали со специальным раствором, как описано в [9], инкубировали 5 минут и затем разделяли кровь на супернатант и клеточную фракцию при помощи центрифугирования в течение 20 мин при 400g. Супернатант переносили в новую пробирку объемом 13 мл и повторно центрифугировали 20 мин при 800g. Из полученного супернатанта (4 мл) выделили суммарную цирДНК с помощью набора для выделения ДНК «Blood DNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия) в полном соответствии с рекомендациями производителя. Далее все манипуляции с выделенной суммарной цирДНК крови (от обработки бисульфитом натрия до секвенирования) проводили, как описано выше.

В таблице 4 приведены данные секвенирования 9-ти комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 в суммарной цирДНК крови для всех 10 пациентов. Из таблицы 4 видно, что для идентификации группы больных РПЖ достаточно анализа любой из трех комбинаций (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C2) или (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C16), или (GSTP1.C9+RNF219.C2.T10), обеспечивающих 100% чувствительность при 100% специфичности.

Для постановки диагноза РПЖ также были проанализированы такие комбинации маркерных цитозинов в суммарной цирДНК крови, как GSTP1.C3.C9, GSTP1.C9, GSTP1.C9.T17, GSTP1.T2.C9, GSTP1.T1.C9, GSTP1.T6.C9, GSTP1.T4.C9, GSTP1.C9.T16, GSTP1.C9.T14, GSTP1.T5.C9, GSTP1.C9.C13, GSTP1.C9.T10, GSTP1.C9.T12, RNF219.T2.C14, GSTP1.T8.C9, обеспечивающие при 100% специфичности интервал чувствительности 85-95%, а при любой их комбинации от трех штук - обеспечивается и чувствительность в 100%.

Детекция аберрантно-метилированных маркерных цитозинов во внДНК мочи.

У группы из 10 человек провели сбор мочи в стерильный контейнер. Затем 10 мл мочи центрифугировали при 800g 20 мин. Из полученного супернатанта (8 мл) выделили внДНК мочи при помощи набора «Urine DNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия) в полном соответствии с рекомендациями производителя. Далее все манипуляции с выделенной внДНК мочи (от обработки бисульфитом натрия до секвенирования) проводили как описано выше. В таблице 4 приведены данные секвенирования 9-ти комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 во внДНК мочи для всех 10 пациентов.

Из таблицы 4 видно, что для идентификации группы больных с РПЖ необходимо выполнить анализ одной комбинации (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C16), обеспечивающей 100% чувствительность при 100% специфичности. Для повышения точности диагностической системы (актуально в медицинских учреждениях высокого уровня оснащенности и «медицинского доверия», в том числе и коммерческих учреждениях), выполнялся анализ хотя бы одной из двух дополнительных комбинаций (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C2) или (GSTP1.C9+PxNF219.C2.T10), показавших при 100% специфичности чувствительность в 95%.

Для постановки диагноза РПЖ также были проанализированы и такие комбинации маркерных цитозинов во внДНК мочи, как GSTP1.C3.C9, GSTP1.C9, GSTP1.C9.T17, GSTP1.T2.C9, GSTP1.T1.C9, GSTP1.T6.C9, GSTP1.T4.C9, GSTP1.C9.T16, GSTP1.C9.T14, GSTP1.C9.T12, GSTP1.C9.C13, обеспечивающие при 100% специфичности интервал чувствительности 70-85%, а при любой их

комбинации от трех штук - обеспечивается и чувствительность в 100%.

В результате проведенных исследований видно, что для ранней диагностики РПЖ в качестве аберрантно-метилированных маркерных цитозинов необходимо выявить не менее трех цитозинов, выбранных из группы: С2, C3, С4, С5, С7, С9, СП, С13, С16, С17 для гена GSTP1 (NG 012075.1, 4998-5139) и/или из группы С1-С 17 для гена RNF219(NC_000013.11, 125-285).

Пример 2

Группу из 10 человек, первично обратившихся в Новосибирский Областной Онкологический диспансер по поводу заболевания доброкачественной гиперплазией предстательной железы, обследовали заявляемым способом на наличие аберрантно метилированных маркерных цитозинов в составе промоторных областей генов GSTP1 и RNF219. Клинические показатели всех доноров указаны в таблице 1.

Свободную цирДНК плазмы крови получали как описано в примере 1. Все манипуляции с выделенной цирДНК плазмы крови (от обработки бисульфитом натрия до секвенирования) проводили, как описано в примере 1.

В таблице 5 приведены данные секвенирования 9-ти комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 в свободной цирДНК плазмы крови для всех 10 пациентов. В таблице 6 приведен более полный список наиболее информативных комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 в свободной цирДНК плазмы для идентификации больных ДГПЖ.

Из таблиц 5 и 6 видно, что для идентификации группы больных с ДГПЖ необходимо выполнить анализ любой из 80 комбинаций (анализ метилирования одновременно двух цитозинов в одной молекуле, указанных в таблицах 5 и 6), позволяющий полностью отделить пациентов с ДГПЖ от всех остальных (77 из них для гена RNF219 и 3 для гена GSTP1).

Для постановки диагноза ДГПЖ также были проанализированы и такие комбинации маркерных цитозинов в свободной цирДНК плазмы крови, как RNF219.C5.C7, RNF219.C4.C11, RNF219.C11.C12, RNF219.C9.C13, RNF219.C10.C13, RNF219.C11.C13, RNF219.C3.C14, RNF219.C9.C14, RNF219.C10.C14, RNF219.C3.C15, RNF219.C8.C15, RNF219.C8.C16, RNF219.C11.C17, RNF219.C7.C14, GSTP1.T2.C5, RNF219.C3.C12, RNF219.C3.C13, RNF219.C8.C17, RNF219.C6.C8, RNF219.C3.C10, RNF219.C6.C14, RNF219.C2.C3, RNF219.C3.C6, RNF219.C3.C7, RNF219.C8.C12, RNF219.C11.С14, RNF219.C13.C14, RNF219.C1.C3, RNF219.C2.C8, RNF219.C8.C11, RNF219.C12.C14, RNF219.C3.C5, RNF219.C4.C8, RNF219.C3.C9, RNF219.C14.C15, RNF219.C14.C16, RNF219.C14.C17, RNF219.C6.C16, RNF219.C1.C6, RNF219.C4.C6, RNF219.C16.C17, GSTP1.C3.C9, RNF219.C7.C8, RNF219.C15.C17, RNF219.C3.C4, RNF219.C10.C11, обеспечивающие при 100% специфичности 94% чувствительность, а при любой их комбинации от двух штук - обеспечивается и чувствительность в 100%.

У этой же группы из 10 человек, получали суммарную цирДНК крови, как описано в примере 1. Все манипуляции с выделенной суммарной цирДНК крови (от обработки бисульфитом натрия до секвенирования) проводили, как описано в примере 1. В таблице 5 приведены данные секвенирования 9-ти комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 в суммарной цирДНК крови для всех 10 пациентов. В таблице 7 приведен более полный список наиболее информативных комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 в суммарной цирДНК крови для идентификации больных с ДГПЖ.

Из таблиц 5 и 7 видно, что для идентификации группы больных с ДГПЖ необходимо выполнить анализ любой из 100 комбинаций (анализ одновременно двух цитозинов в одной молекуле цирДНК, указанных в таблицах 5 и 7), позволяющий полностью отделить пациентов с ДГПЖ от всех остальных.

Для постановки диагноза ДГПЖ также были проанализированы и такие комбинации маркерных цитозинов в суммарной цирДНК крови, как RNF219.C10.C14, RNF219.C6.C8, RNF219.C3.C10, RNF219.C12.C14, RNF219.C3.C5, RNF219.C4.C8, RNF219.C3.C9, RNF219.C14.C15, RNF219.C14.C16, RNF219.C14.C17, RNF219.C6.C14, RNF219.C2.C3, RNF219.C3.C6, RNF219.C3.C7, RNF219.C8.C12, RNF219.C11.С14, RNF219.C13.C14, RNF219.C1.C3, RNF219.C2.C8, RNF219.C8.C11, RNF219.C6.C16, GSTP1.C3.C9, RNF219.C7.C8, RNF219.C15.C17, RNF219.C3.C4, RNF219.C10.C11, RNF219.C8.C10, GSTP1.T1.C5, RNF219.C3.C11, RNF219.C3.C16, RNF219.C5.C8, GSTP1.T4.C10, GSTP1.T5.C10, GSTP1.C6.T9, GSTP1.C6.T8, GSTP1.C6.T11, GSTP1.C6.T15, GSTP1.T3.C6, GSTP1.C5.C7, GSTP1.T8.C10, GSTP1.C10.T11, GSTP1.C10.T13, GSTP1.T1.C16, GSTP1.T4.C10, GSTP1.T5.C10, обеспечивающие при 100% специфичности 94% чувствительность, а при любой их комбинации от двух штук - обеспечивается и чувствительность в 100%.

У этой же группы из 10 человек провели сбор мочи в стерильный контейнер. Внеклеточную ДНК мочи получали, как описано в примере 1. Все манипуляции с выделенной внДНК мочи (от обработки бисульфитом натрия до секвенирования) проводили, как описано в примере 1.

В таблице 5 приведены данные секвенирования 9-ти комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 во внДНК мочи для всех 10 пациентов. В таблице 8 приведен более полный список наиболее информативных комбинаций маркерных цитозинов в составе генов GSTP1 и RNF219 во внДНК мочи для идентификации больных с ДГПЖ.

Из таблиц 5 и 8 видно, что для идентификации группы больных с ДГПЖ необходимо выполнить анализ любой из 76 комбинаций, позволяющий полностью отделить пациентов с ДГПЖ от всех остальных.

Для постановки диагноза ДГПЖ также были проанализированы и такие комбинации маркерных цитозинов в суммарной цирДНК крови, как PvNF219.C5.C7, PvNF219.C4.Cll, RNF219.C11.С12, RNF219.C11.С13, RNF219.C3.C14, RNF219.C9.C14, RNF219.C10.C14, RNF219.C3.C15, RNF219.C8.C15, RNF219.C8.C16, RNF219.C7.C14, GSTP1.T2.C5, RNF219.C3.C12, RNF219.C3.C13, RNF219.C8.C17, RNF219.C3.C10, RNF219.C6.C14, RNF219.C2.C3, RNF219.C3.C6, RNF219.C8.C12, RNF219.C11.С14, RNF219.C13.C14, RNF219.C1.C3, RNF219.C2.C8, RNF219.C12.C14, RNF219.C3.C5, RNF219.C4.C8, RNF219.C3.C9, RNF219.C14.C16, RNF219.C14.C17, RNF219.C6.C16, RNF219.C1.C6, RNF219.C16.C17, GSTP1.C3.C9, RNF219.C7.C8, RNF219.C3.C4, RNF219.C10.C11, обеспечивающие при 100% специфичности 94% чувствительность, а при любой их комбинации от двух штук - обеспечивается и чувствительность в 100%.

Пример 3

Больной А., 1973 г. р. поступил в Новосибирский Областной Онкологический диспансер с подозрением на рак предстательной железы. Забор крови и все манипуляции с ней, включая стадию секвенирования свободной цирДНК плазмы проводили, как описано в примере 1. Поскольку методика секвенирования со всеми стадиями пробоподготовки, описанная в примере 1, дает информацию о метилировании сразу всех 17 цитозинов в каждом из исследуемых генов, то больному А. был проведен анализ сразу всех 17-ти цитозинов для гена GSTP1 и 17-ти цитозинов для гена RNF219. В результате проведенного исследования у больного А. было обнаружено несколько аберрантно метилированных цитозинов, включая такие комбинации, как (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C2), (GSTP1.C9+RNF219.C2+GSTP1.C16), (GSTP1.C9.T17), (GSTP1.C9), (GSTP1.T5.C9). Кроме того, у больного А. были обнаружены и дополнительные комбинации, характерные для РПЖ, а именно RNF219.C11.C12, RNF219.C9.C13, RNF219.C11.С13, RNF219.C3.C14, RNF219.C9.C14, RNF219.C10.C14, RNF219.C3.C15, RNF219.C8.C15, RNF219.C7.C14, GSTP1.T2.C5, RNF219.C3.C12, RNF219.C8.C17, RNF219.C6.C8, RNF219.C3.C10, RNF219.C6.C14, RNF219.C2.C3, RNF219.C14.C16, PvNF219.C14.C17, RNF219.C6.C16, RNF219.C1.C6,

PvNF219.C4.C6. Более того, у больного А. не было обнаружено аберрантного метилирования таких цитозинов, которые бы составляли какие-либо комбинации для возможной постановки больному А. диагноза ДГПЖ. Было сделано заключение о вероятности наличия у больного А. РПЖ.

Диагноз РПЖ у больного А. был впоследствии подтвержден при прохождении больным А. всех необходимых, стандартных медицинских обследований.

Пример 4

Для подтверждения пригодности предлагаемого способа для раннего выявления онкологических заболеваний предстательной железы, группу пациентов с РПЖ из примера 1 обследовали заявляемым способом, но детекцию аберрантно метилированных маркерных цитозинов в составе промоторных областей генов GSTP1 и RNF219, осуществляли при помощи ПЦР, специфичной к метилированию. Для этого, оставшиеся после бисульфитной модификации 5/6 частей цир/внДНК использовали для проведения трех реакций ПЦР в режиме реального времени на приборе ICycler iQ (BioRad, Hercules, CA, USA) со специфичными праймерами, зондами и в условиях, описанных в таблице 9. В случае, если Ct хотя бы в одной из трех реакций составляло менее 39 циклов, образец определяли, как положительный, в других случаях - как отрицательный. Результаты анализа представлены в таблице 10. У каждой аналитической системы специфичность составила 100%, диапазон чувствительности составил 70-90%. При одновременном использовании трех систем чувствительность, специфичность и точность диагностического теста составили 100%.

Пример 5

Группу пациентов из примера 2 обследовали заявляемым способом аналогично примеру 2, но детекцию аберрантно метилированных маркерных цитозинов в составе промоторных областей генов GSTP1 и RNF219, осуществляли при помощи ПЦР, специфичной к метилированию. Для этого, оставшиеся после бисульфитной модификации 5/6 частей цир/внДНК использовали для проведения двух реакций ПЦР в режиме реального времени в условиях, описанных в таблице 9. Результаты анализа представлены в таблице 11. У каждой аналитической системы специфичность составила 100%, диапазон чувствительности составил 88-94%. При одновременном использовании этих двух систем чувствительность, специфичность и точность диагностического теста составили 100%.

Пример 6

Больной Ш, 1976 г. р. поступил в Новосибирский Областной Онкологический диспансер с подозрением на рак предстательной железы. Забор мочи и все манипуляции с ней проводили, как описано в примере 1. Детекцию аберрантно метилированных маркерных цитозинов в составе промоторных областей генов GSTP1 и RNF219, осуществляли при помощи ПЦР, специфичной к метилированию. Вначале провели три реакции ПЦР, как описано в примере 4, все результаты оказались отрицательными. Затем провели две реакции, как описано в примере 5, результат одной из них (система 3) был положительный. На основании результатов пяти ПЦР-реакций больному Ш. был поставлен диагноз ДГПЖ. Диагноз ДГПЖ у больного Ш. был впоследствии подтвержден медицинскими работниками при прохождении больным Ш. всех необходимых, стандартных медицинских обследований.

Таким образом, использование описанных выше цитозинов-мишеней, как по отдельности, так и в различных комбинациях, возможно в качестве биомаркеров для идентификации таких заболеваний как, рак предстательной железы и доброкачественная гиперплазия предстательной железы, а, использование предлагаемого способа позволит повысить чувствительность, специфичность и точность диагностики вышеупомянутых заболеваний.

Список используемой литературы

1. Алексеев Б.Я. и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению рака предстательной железы. Общероссийский союз общественных объединений ассоциация онкологов России. Москва, 2014.

2. Otandault A., et al. Recent advances in circulating nucleic acids in oncology. Ann Oncol. 2019 Mar l;30(3):374-384.

3. Zhao F., et al. A urine-based DNA methylation assay, ProCUrE, to identify clinically significant prostate cancer. Clin Epigenetics. 2018.

4. Брызгунова O.E., Лактионов П.П. Современные методы исследования метилирования внеклеточных ДНК. Молекулярная биология. 2017. 51(2): 195- 214.

5. Mikeska Т., et al. The implications of heterogeneous DNA methylation for the accurate quantification of methylation. Epigenomics. 2010. 2(4), 561-573.

6. Camdzic N., et al. Serum total prostate-specific antigen (tPSA): correlation with diagnosis and grading of prostate cancer in core needle biopsy. Med Glas (Zenica). 2021. 18(1).

7. Epigenomics AG, 2015.

8. Sanchez B.E, et al. Using Genetic and Epigenetic Markers to Improve Differential Diagnosis of Prostate Cancer and Benign Prostatic Hyperplasia by Noninvasive Methods in Mexican Patients. Clin Genitourin Cancer. 2018. 16(4):e867-e877.

9. Лактионов П.П. и др. Способ получения суммарной фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из крови. Патент RU 2554746 С1, опубл. 01.06. 2015.

10. Bryzgunova О., et al. Efficacy of bisulfite modification and recovery of human genomic and circulating DNA using commercial kits. Computational Biology and Bioinformatics. 2013, l(6):28-36.

11. Bryzgunova O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Anal Biochem. 2011. 408(2):354-356.

12. Caporaso J.G, et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 2012. 6(8):1621-1624.

Способ ранней диагностики опухолей предстательной железы

1. Способ ранней диагностики опухолей предстательной железы, включающий сбор крови и мочи, получение плазмы крови, выделение свободной цирДНК из плазмы, модификацию цирДНК бисульфитом натрия с последующим выявлением аберрантно-метилированных маркерных цитозинов в составе промоторных областей генов с использованием праймеров и зондов, специфичных для выбранных генов, сравнительным анализом результатов и составлением заключения о наличии или отсутствии злокачественной (РПЖ) или доброкачественной опухоли предстательной железы (ДГПЖ) у пациента, отличающийся тем, что в качестве источника диагностического материала дополнительно используют суммарную цирДНК из крови или внДНК из мочи, в качестве аберрантно-метилированных маркерных цитозинов выявляют не менее трех цитозинов для диагностики РПЖ или не менее двух цитозинов для диагностики ДГПЖ, выбранных из группы: С2, С3, С4, С5, С7, С9, С11, С13, С16, С17 для гена GSTP1 (NG 012075.1, 4998-5139), и не менее трех цитозинов для диагностики РПЖ или не менее двух цитозинов для диагностики ДГПЖ, выбранных из группы С1-С17 для гена RNF219 (NC_000013.11, 125-285), а детекцию аберрантного метилирования цитозинов проводят при помощи массового параллельного секвенирования или с использованием ПЦР, специфичной к метилированию.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при помощи массового параллельного секвенирования анализируют метилирование каждого цитозина в каждой отдельной молекуле.

3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что для диагностики РПЖ в составе свободной цирДНК плазмы с помощью секвенирования, анализируют любую из двух комбинаций маркерных цитозинов в группе GSTP1.C9, RNF219.C2, GSTP1.C2 или в группе GSTP1.C9, RNF219.C2, GSTP1.C16.

4. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что для диагностики РПЖ в составе суммарной цирДНК крови с помощью секвенирования, анализируют любую из трех комбинаций маркерных цитозинов в группе GSTP1.C9, RNF219.C2, GSTP1.C2 или в группе GSTP1.C9, RNF219.C2, GSTP1.C16 или в группе GSTP1.C9, RNF219.C2.T10.

5. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что для диагностики РПЖ в составе внДНК мочи с помощью секвенирования анализируют одну комбинацию маркерных цитозинов GSTP1.C9, RNF219.C2, GSTP1.C16.

6. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что для диагностики ДГПЖ с помощью секвенирования из образца диагностического материала выполняют анализ любой из выбранных комбинаций маркерных цитозинов.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при диагностике РПЖ с помощью ПЦР, специфичной к метилированию, из образца диагностического материала выполняют анализ комбинаций маркерных цитозинов при помощи трех ПЦР-систем.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при диагностике ДГПЖ с помощью ПЦР, специфичной к метилированию, из образца диагностического материала выполняют анализ комбинаций маркерных цитозинов при помощи двух ПЦР-систем.