Nk-клеточная линия, экспрессирующая psma-специфический химерный антигенный рецептор и секретирующая блокатор взаимодействия cd47/sirpa

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлена модифицированная NK-клетка для иммунотерапии PSMA-позитивной опухоли, содержащая: а) химерный антигенный рецептор (CAR) на поверхности клетки, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолеассоциированным маркером PSMA, шарнирный домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной сигнализации, который способен активировать NK-клетку; и б) нуклеиновую кислоту, кодирующую блокатор взаимодействия CD47/SIRPa размером более 40 кДа. Фармацевтическая композиция для иммунотерапии PSMA-позитивной опухоли, содержащая эффективное количество модифицированной NK-клетки и фармацевтически приемлемый наполнитель. Способ уменьшения опухолевой массы у индивидуума, имеющего рак простаты, включающий введение индивидууму эффективного количества NK-клетки. Способ увеличения выживаемости индивидуума, имеющего рак простаты, включающий введение индивидууму эффективного количества NK-клетки. Изобретение позволяет повысить эффективность использования человеческих CAR NK-клеток для элиминации клеток солидных опухолей и терапии новообразований различных этиологий за счёт экспрессии блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и терапии онкологических заболеваний человека, а именно к получению цитотоксических NK-клеточных продуктов с поверхностной экспрессией опухоле-специфичных химерных антигенных рецепторов, секретирующих терапевтические агенты с противоопухолевым или иммуномодулирующим действием.

Уровень техники

Несмотря на весь арсенал препаратов для химиотерапии онкологических заболеваний и значительный прогресс в области хирургического вмешательства и радиотерапии, значительная часть онкологических больных на поздних стадиях тяжело поддается лечению. Одним из возможных способов решения этой проблемы является использование аутологичных или аллогенных цитотоксических Т- или NK-клеток, специфически распознающих раковые клетки при помощи химерных антигенных рецепторов (или CAR, chimeric antigen receptor). Тем не менее, даже при наличии опухоль-специфических или опухоль-ассоциированных поверхностных маркеров терапия CAR Т-/NK-клетками также может быть неэффективна. Данные доклинических исследований и клинических испытаний, полученные в последние годы, свидетельствуют о том, что есть целый ряд факторов, негативно сказывающихся на эффективности CAR-терапии, например: 1) затрудненное проникновение CAR-клеток внутрь опухоли из-за ее высокой плотности, давления и присутствия стромальных клеток; 2) формирование опухолевого иммуносупрессивного микроокружения, угнетающего активность CAR-клеток или приводящего к их гибели; 3) гетерогенность опухолевых клеток в плане экспрессии маркеров-мишеней и как следствие ускользание из-под надзора CAR-клеток. Решение этих проблем возможно при помощи дополнительной модификации CAR-клеток.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является получение "усиленных" цитотоксических NK-клеточных продуктов с поверхностной экспрессией химерных антигенных рецепторов, специфичных к человеческому белку PSMA, и дополнительно секретирующих блокаторы взаимодействия CD47/SIRPa, а также их применение для лечения солидных злокачественных новообразований.

Указанная задача решается путем создания модифицированной NK-клетки для иммунотерапии, содержащей:

а) химерный антигенный рецептор (CAR) на поверхности клетки, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывается с опухоль-ассоциированным маркером PSMA, шарнирный домен, трасмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, который способен активировать NK-клетку; и б) нуклеиновую кислоту, кодирующую секретируемый блокатор взаимодействия CD47/SIRPa размером более 40 кДа.

В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется тем, что шарнирный домен химерного антигенного рецептора содержит внеклеточные примембранные последовательности белка CD8a, CD3z, CD4, CD28, NGFR, IgGl, IgG4 или других поверхностных белков человека, а трансмембранный домен соответствует трансмембранному домену белка CD28, CD8a, CD4, CD2, TNFRSF19 или других трансмембранных белков человека. В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется отсутствием шарнирного домена химерного антигенного рецептора. В некоторых вариантах изобретения последовательности костимулирующего и сигнального домена CAR заимствованы от внутриклеточных последовательностей CD28 и CD3z человека, соответственно, или от других белковых последовательностей на основе CD3z, CD28, CD27, 4-1ВВ, DAP10, DAP12, в том числе других белков, обладающих ITAM-мотивами, и их комбинаций. В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется присутствием только сигнального домена CAR, без костимулирующего домена или доменов.

В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется тем, что антигенраспознающий домен CAR заимствован из последовательностей вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела или наноантитела, специфически узнающего эктодомен белка PSMA человека, например мышиных моноклональных антител J591, J415, J533, Е99 (Liu Н. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res), 3А/12, 3/E7, 3/F11 (. A new generation of monoclonal and recombinant antibodies against cell-adherent prostate specific membrane antigen for diagnostic and therapeutic targeting of prostate cancer. The Prostate), 3C6 (Tino WT. Isolation and characterization of monoclonal antibodies specific for protein conformational epitopes present in prostate-specific membrane antigen (PSMA). Hybridoma), наноантител PSMA6, PSMA30 (Evazalipour M. Generation and characterization of nanobodies targeting PSMA for molecular imaging of prostate cancer. Contrast Media Mol Imaging), JVZ-007 (Chatalic KL. A Novel ¹¹¹In-Labeled Anti-Prostate-Specific Membrane Antigen Nanobody for Targeted SPECT/CT Imaging of Prostate Cancer. J Nucl Med), C3 (Zare H. Production of nanobodies against prostate-specific membrane antigen (PSMA) recognizing LnCaP cells. Int J Biol Markers) и других аффинных в отношении PSMA человека олиго- и полипептидов.

В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется тем, что химерный антигенный рецептор имеет последовательность SEQ ID NO: 1 или кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.

В одном из вариантов осуществления шарнирный домен химерного антигенного рецептора содержит фрагмент внеклеточной области CD8a человека (SEQ ID NO: 10) и трансмембранный домен антигенного рецептора содержит фрагмент трансмембранного домена CD28 человека (SEQ ID NO: 11).

В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется тем, что блокатором взаимодействия CD47/SIRPa является полноразмерное антитело, специфически распознающее эктодомен белка CD47 человека и блокирующее его взаимодействие с белком SIRPa (далее такое антитело, наноантитело и антигенраспознающий район CAR на его основе будет называться CD47-специфическим или специфически распознающим CD47). Примерами таких антител, блокирующих взаимодействие CD47/SIRPa, являются известное мышиное моноклональное антитело В6Н12, гуманизированное антитело 5F9, человеческие моноклональные антитела SF231 и AMMS4-G4, наноантитела HuNb1-IgG4, А4 и другие. В предпочтительных вариантах полноразмерное антитело, специфически распознающее CD47, имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и легкой цепи SEQ ID NO: 4, кодируемые нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется тем, что при взаимодействии указанного рецептора с маркером PSMA NK-клетка активирует экспрессию блокатора взаимодействия CD47/SIRPa.

В некоторых вариантах изобретения данная NK-клетка характеризуется тем, что блокатор взаимодействия CD47/SIRPa усиливает противоопухолевый эффект введения NK-клетки.

Указанная задача также решается путем создания фармацевтической композиции для иммунотерапии, содержащей эффективное количество вышеуказанной модифицированной NK-клетки и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Указанная задача также решается путем создания способа уменьшения опухолевой массы у индивидуума, имеющего солидное злокачественное новообразование, включающего введение индивидууму эффективного количества вышеуказанных модифицированных NK-клеток.

Указанная задача также решается путем создания способа снижения риска смерти индивидуума, имеющего солидное злокачественное новообразование, включающего введение индивидууму эффективного количества вышеуказанных модифицированных NK-клеток.

Указанная задача также решается путем создания набора для лечения солидного злокачественного новообразования у индивидуума, содержащего вышеуказанную модифицированную NK-клетку и письменные инструкции по применению указанной клетки для лечения солидного злокачественного новообразования у индивидуума.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности использования человеческих CAR NK-клеток для элиминации клеток солидных опухолей и терапии новообразований различных этиологий за счет экспрессии блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa. В предпочтительных вариантах также достигается уменьшение системной токсичности используемых CAR NK-клеток за счет локальной экспрессии блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Принципиальная схема молекулярных и клеточных событий, происходящих при ECAR-NK -опосредованной элиминации раковой клетки (на примере PSMA и анти-CD47). I. Экспрессия PSMA-специфичного CAR с интегрировавшейся лентивирусной конструкцией, выход CAR на поверхность. II. При взаимодействии CAR(aPSMA) с PSMA на поверхности раковой клетки в ECAR-NK клетке происходит запуск активационного каскада, в результате которого происходит секреция цитокинов, и перфорин/гранзим-опосредованный лизис клетки-мишени. Со второй лентивирусной конструкции нарабатывается секретируемое анти-CD47 антитело, которое связывается с CD47 на поверхности этой или другой раковой клетки (III), тем самым блокируя взаимодействие SIRPa-CD47 (IV). В результате происходит фагоцитоз раковой клетки (V), причем независимый от ее PSM А-статуса. EF1 а - конститутивный гибридный промотор EFa/HTLV, SP(Gluc) - сигнальная последовательность люциферазы Gaussia princeps, myc - myc-эпитоп, узнаваемый моноклональным антителом 9Е10, ТМ - трансмембранный район CAR, cyto - внутриклеточный район CAR, IRES последовательность внутренней посадки рибосом, aCD47 блокатор взаимодействия CD47/SIRPa, marker селективный маркер, например, ген устойчивости к зеоцину (zeo) или флуоресцентный белок (tdTomato), Prom - конститутивный или активационно-индуцируемый промотор. О - опухолевая клетка, М - макрофаг или моноцит, С - CAR-NK-клетка, способная секретировать блокатор взаимодействия CD47/SIRPa.

Фиг. 2. (А) CAR-NK-клетка уничтожает клетку-мишень при взаимодействии CAR и опухолевого антигена (напр. PSMA). Если такая клетка-мишень обладает повышенным уровнем CD47, то она избегает фагоцитоза. (Б) Если CAR-NK-клетка дополнительно секретирует блокатор взаимодействия CD47/SIRPa, происходит фагоцитоз клеток, в том числе и тех, которые CAR-NK клетка не узнает (напр. клетка PSMA-, справа). 1 - опухолевая клетка, 2 - макрофаг или моноцит, 3 - CAR-NK-клетка, способная секретировать блокатор взаимодействия CD47/SIRPa, 4 - CAR(aPSMA), 5 - PSMA, 6 - CD47, 4 - SIRPa, 7 - SIRPa, 8 - блокатор взаимодействия CD47/SIRPa, 9 - цитотоксическая реакция.

Фиг. 3. Структура лентивирусной конструкции, кодирующей химерный антигенный рецептор против белка PSMA. GlucSP- сигнальный последовательность, обеспечивающая мембранную локализацию рецептора. aPSMA-scFv - последовательность PSMA-специфичного антитела J591 в scFv-формате. Мус - myc-эпитоп. CD8a hinge - шарнирная последовательность CD8a человека. CD28TM - трансмембранная последовательность CD28 человека. CD28+CD3z костимулирующая последовательность CD28 человека, сшитая с сигнальной последовательностью CD3z человека. IRES сайт внутренней посадки рибосомы, обеспечивающий бицистронную экспрессию CAR вместе с геном zeo, определяющим устойчивость клеток к зеоцину. EFla-HTLV promoter сильный конститутивный промотор, образованный последовательностями промотора гена EFla человека и Т-лимфотропного вируса человека.

Фиг. 4. Доменная организация химерного CD47-специфичного моноклонального антитела chmAb(B6H12)-2xFLAG. 10 константная последовательность каппа-цепи иммуноглобулина человека, 11 - 2xFLAG эпитоп, 12 - домены СН1, шарнир, СН2, СН3 IgG4 человека, 13 - вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела В6Н12.

Фиг. 5. Технология создания банка ECAR-NK клеток и их адоптивный перенос пациентам, а) трансдукция CAR- кассетами; б) отбор, размножение, тестирование CAR-NK клеток; в) трансдукция кассетами, кодирующими терапевтические белки, например, блокаторы взаимодействия CD47/SIRPa; г) отбор, размножение, тестирование; д) GMP-производство; е) облучение (в случае линейных NK-клеток); ж) введение пациентам с соответствующим типом рака. 14 - NK-клетки, 15 - ECAR-NK-клеточные продукты.

Фиг. 6. Карта лентивирусной конструкции pLV-aCD47mAb. RSV promoter -промотор вируса саркомы Раусса. HIV 5'LTR 5' длинный концевой повтор вируса иммунодефицита целовека-1 (ВИЧ-1). gag паковочный сигнал gag ВИЧ-1. RRE - Rev-чувствительный регуляторный элемент ВИЧ-1. сРРТ - центральный полипуриновый тракт ВИЧ-1. CMV - конститутивный промоторв цитомегаловируса человека. GlucSP -сигнальный пептид люциферазы Gaussia princeps. VH(B6H12) - вариабельный фрагмент тяжелой цепи CD47-специфичного мышиного моноклонального антитела В6Н12. hIgG4(CHl-CH3) последовательность константной части IgG4 человека (домены СН1-СН3). Р2А - «саморасщепляющийся» 2А пептид тешовируса свиней. Vk(B6H12) -вариабельный фрагмент легкой цепи CD47-специфичного мышиного моноклонального антитела В6Н12. Human kappa С region - последовательность константной части каппа-цепи иммуноглобулина человека. 2xFLAG тандемный FLAG-эпитоп.IRES

последовательность внутренней посадки рибосомы каридиовируса человека, zeo ген устойчивости к зеоцину. WPRE - регуляторный элемент вируса гепатита сурков. 3'dLTR -делетированный 3' длинный концевой повтор ВИЧ-1. AmpR - ген устойчивости к ампициллину.

Фиг. 7. FACS-анализ связывания CD47- и SIRPa-специфических блокаторов, секретируемых ECAR-YT клетками, с клетками-мишеням. А) иммуноокрашивание CD47-позитивных клеток линии Jurkat кондиционированной средой (с/н, супернатант) из-под клеток ECAR-YT-mAb(aCD47), ECAR-YT-scFv(aCD47), клеток YT (отр. контроль) или коммерческими CD47-специфическими моноклональными антителами В6Н12 (eBioscience). Связывание первичных антител против FLAG-эпитопа и против CD47 детектировали при помощи конъюгатов goat-anti-mouse-APC. Б) иммуноокрашивание SIRPa-позитивных клеток линии ТНР-1 кондиционированной средой (с/н) из-под клеток ECAR-YT-eCD47, клеток YT (отр. контроль) или коммерческими SIRPa-специфическими моноклональными антителами МАb4546 (R&D). Связывание первичных антител против FLAG-эпитопа и против SIRPa детектировали при помощи конъюгатов goat-anti-mouse-AF647. Ось Y: нормализованное число клеток, % от максимума.

Фиг. 8. FACS-анализ фагоцитарной активности первичных макрофагов человека в отношении клеток-мишеней линии Jurkat. а) Меченые eFluor450-макрофаги (2) были инкубированы с мечеными eFluor670-клетками-мишенями (16, Т). б) Процент макрофагов, поглотивших клетки-мишени (17) (ось Y), значительно увеличивается при добавлении коммерческого моноклонального антитела В6Н12 (eBioscience) (позитивный контроль), а также при добавлении кондиционированных сред из-под клеток YT-mAb(aCD47) и YT-scFv(aCD47) (р=0.05, n=3). T_irr - предоблученные клетки-мишени.

Фиг. 9. FACS-детекция поверхностной экспрессии CAR на клетках CAR-YT (18), но не контрольных нетрансдуцированных клетках линии YT (19) при помощи тус-специфичных антител и goat-anti-mouse-AF647. Ось Y - нормализованное число клеток, % max.

Фиг. 10. Типичные результаты цитотоксического теста. Немеченые эффекторные (20) клетки анти-PSMA CAR YT были смешаны в соотношении 5:1 и инкубированы в течение 4 часов с клетками-мишенями (21) линии HEK293T(PSMA+), мечеными АРС. Это привело к гибели 49.5% клеток-мишеней. Описание квадрантов: Q1 - мертвые клетки-эффекторы, Q4 - живые клетки-эффекторы, Q2 - мертвые клетки-мишени, Q3 - живые клетки-мишени. Процент мертвых клеток-мишеней был оценен, используя формулу: Q2/(Q2+Q3)*100%. б) данные FACS-анализа для контрольного образца, к которому не были добавлены клетки-эффекторы CAR-YT. 22 мертвые клетки, 23 живые клетки

Фиг. 11. Клетки линии CAR-YT (20) и линии ECAR-YT (24), экспрессирующей chimAb(B6H12)-2xFLAG, обладают выраженной цитотоксической активностью по отношению к клеткам-мишеням линии PC3(PSMA+) в отличие от исходной клеточной линии YT (19). Ось Y: % мертвых клеток-мишеней.

Фиг. 12. Сравнительный анализ in vivo активности ECAR-YT-клеточных продуктов на модели ксеногенной трансплантации опухолевых клеток линии Рс3 (GFP+, PSMA+, FFluc+) иммунодефицитным мышам линии nod scid. А) Дизайн эксперимента. 25 -подкожное введение 2×10⁶ клеток, 26 - в/в введение 3-5×10⁶ летально облученных клеток или PBS, 27 - Измерение объема опухоли (каждые 3-5 дней), забой животных с опухолью больше 1500 мм³. Б) Кривая выживаемости Каплана-Майера для сравниваемых терапевтических групп животных (n=6-7 на группу). По оси Y показан процент выживших животных, по оси х время (дни).

Подробное раскрытие изобретения

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Используемый в настоящем документе термин «одноцепочечное антитело» обозначает рекомбинантное антитело, т.н. одноцепочечный вариабельный фрагмент scFv (single chain variable fragment), кодируется одним геном и содержит только один антиген-связывающий участок, состоящий из вариабельных доменов легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, соединенных гибким пептидным линкером.

Под NK-лимфоцитом, или NK-клеткой следует понимать клетку типа цитотоксических лимфоцитов, участвующих в функционировании врожденного иммунитета. Такие клетки также известны как естественные киллеры или натуральные киллеры (от англ. Natural killer cells, NK cells). В настоящем документе под NK-клетками понимаются как первичные NK-клетки человека из периферической или пуповинной крови, так и иммортализованные NK-клеточные линии (напр. NK-92, YT, KHYG-1), так и NK-клетки, полученные из iPS-клеток или путем перепрограммирования из соматических клеток.

Используемый в настоящем документе термин «химерный антигенный рецептор (CAR)» включает в себя антиген-рас познающую часть, представляющую собой вариабельный фрагмент антитела, пептид, лиганд/рецепторную пару или другой аффинный агент, объединенный с внутриклеточной частью CD3z. Распознавание антигена таким химерным антигенным рецептором является независимым от представления антигена опухолевыми клетками в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (MHCI), связывание с антигеном приводит к секреции модифицированными Т- или NK-лимфоцитами интерлейкина-2 (IL-2) и ряда других цитокинов и проявлению цитотоксического действия, а включение в структуру химерного антигенного рецептора одного или нескольких ко-стимулирующих доменов (например, CD27, CD28, CD30, CD40, 4-1ВВ, ОХ40, ICOS, DAP10, DAP12, LFA-1, CD2, CD7 и т.д.) позволяет повысить выживаемость CAR-лимфоцитов и усилить их цитотоксический противоопухолевый эффект.

Химерный цитокиновый рецептор содержит экзодомен и эндодомен, принадлежащие разным молекулам. В некоторых вариантах осуществления изобретения экзодомен химерного цитокинового рецептора связывается с цитокином, таким как, например, TGFp,, IL10, IL4, IL13, IL6, IL8, IL5, VEGF, IL22, IL1, IL1β, IL35, TNF, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, LAG3 или TIM3. Функция эндодомена химерного цитокинового рецептора - передавать сигнал, возникающий при таком связывании, и эндодомен может быть заимствован от внутриклеточных последовательностей TLR1-9, CD28, ОХ-40, 4-1ВВ, CD80, CD86, ICOS, CD40, CD27, CD30, CD226, IL7, IL2, IL15, FL21, FL12, IFN-gamma и др. В некоторых вариантах осуществления изобретения эндодомен химерного цитокинового рецептора может передавать ингибирующий сигнал и заимствован от внутриклеточных последовательностей таких белков как, например PD-1, CTLA4, KIR2/KIR3, LIR, BTLA или СЕАСАМ. Конкретные примеры химерных цитокиновых рецепторов включают рецептор на основе IL4/7 (Leen et al. Mol Ther 2014), TGFbeta/TLR4 и др.

Используемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» включает в себя трансдуцированные указанными ниже конструкциями Т- и/или NK-лимфоциты периферической крови человека (как аутологичные, так и аллогенные по отношению к клеткам пациента), а также перевиваемые NK-клеточные линии человека (такие как NK-92, NK-92mi, YT, KHYG, NKL и т.д.). В конкретных вариантах Т-лимфоциты могут быть CD4+, CD8+ или Treg-лимфоцитами, а NK-клетки включать в себя в том числе и NKT и gamma-delta NK клетки.

В конкретном варианте пациент любого возраста и пола (младенец, ребенок, подросток, взрослый) мог получать ранее/ получает /будет получать дополнительную противоопухолевую терапию, например, химиотерапию, иммунотерапию, радиотерапию, хирургическое вмешательство, гормональную терапию или их комбинации.

Иммунные клетки, несущие CAR, могут дополнительно нести один и более CAR, такие как CAR против CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD70, CD 123, CD138, CD133, CD171, CLD18, с-МЕТ, ROR1, ВСМА, kappa- или lambda-цепь иммуноглобулина, Glypican-3, ErbB2, ErbB3/4, EGFR, EGFRvIII, EphA2, CEA, EpCAM, EGP2, EGP40, FAP, Mesothelin, TAG72, PSMA, PSCA, лиганды NKG2D, NCR3LG1, Il-13ra2, IL-ILRα, MUC1, MUC16, tMuc1, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, Lewis Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, FRα, CD44v6/7/8, 8H9, NCAM, VEGFR2, 5T4 (TPBG), CD4, CD5, CD7, CAIX и других опухоль-ассоциированных антигенов и мутаций, идентифицированных, например, в результате геномного или транскриптомного анализа опухолей. В конкретных вариантах осуществления в состав CAR может входить два или более одинаковых или различных антиген-распознающих модуля, как например, два и более scFv или их комбинаций с полипептидами неиммуноглобулиновой природы.

В настоящей заявке термины "клетка", "клеточная линия" и "культура клеток" могут использоваться взаимозаменяемо. Все эти термины относятся и к любому поколению дочерних клеток. Подразумевается, что потомки клеток могут отличаться от родительских ввиду случайного накопления или намеренного внедрения дополнительных мутаций. Клетки могут быть использованы в качестве реципиентов экспрессионных конструкций. Такие клетки могут быть "трансфицированы", "трансдуцированы" или "трансформированы", что соответствует любому процессу доставки чужеродной нуклеиновой кислоты в клетки. Термины трансформированная, трансдуцированная или трансфицированная клетка распространяются помимо самих клеток в том числе и на их потомки. Таким образом, такие клетки отличаются от немодифицированных клеток присутствием внедренной нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, например, ECAR-NK-клетки, описанные в настоящей заявке, вводятся в форме, подходящей для пациента с опухолевыми клетками, узнаваемыми CAR. В конкретном варианте осуществления такая подходящая форма для введения пациенту является фармацевтической композицией. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки трансформированы конструкциями, экспрессирующими CAR и один из терапевтических агентов, таких как, например, блокаторы взаимодействия CD47/SIRPa, последовательности которых приведены в данной заявке. Конструкция может представлять собой любую нуклеиновую кислоту, способную реплицироваться в иммунных клетках и приводить к экспрессии ими целевых белков. В конкретных вариантах осуществления такая конструкция лентивирусной природы.

В конкретных вариантах осуществления изобретения экспрессионная конструкция включает в себя последовательности, обеспечивающие ее репликацию и экспрессию в про-и эукариотических клетках. Специалистам в данной области техники также будут известны условия культивирования всех таких клеток в целях поддержания и размножения, а также репликации экспрессионной конструкции. Также специалистам понятны и известны методы и условия, обеспечивающие крупномасштабное производство экспрессионных конструкций.

В некоторых ситуациях, таких как, например, необходимость завершить терапию, злокачественное перерождение введенных клеток, проведение исследования влияния отсутствия таких клеток на ход терапии и т.д., может потребоваться необратимая инактивация введенных ECAR-NK или -Т-клеток. С этой целью в состав экспрессионных конструкций могут дополнительно входить кассеты, кодирующие продукты, способные приводить к гибели трансформированных клеток, такие как, например, индуцируемые суицидальные кассеты, кодирующие модифицированную Caspase 9, tCD20, tEGFR, RQR8 и т.д. Также в качестве дополнительных модификаций необходимо рассматривать получаемые варианты иммунных клеток, экспрессирующих какие-либо цитокины (например, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-12, GM-CSF, M-CSF и др.) или их рецепторы (например, рецепторы IL-4, IL-10, TGFβ и т.д.), дополнительный CAR и/или химерный цитокиновый рецептор. В некоторых вариантах осуществления изобретения CAR, терапевтические агенты, а также другие вспомогательные молекулы могут быть экспрессированы как с одной экспрессионной конструкции, так и с разных.

В одном из вариантов осуществления раскрывается клеточный продукт, обладающий помимо CAR-опосредованных цитотоксических свойств дополнительной способностью прямо или опосредованно уничтожать опухолевые клетки, например, за счет привлечения и активации клеток моноцитоидного ряда, таких как моноциты и макрофаги. Это достигается благодаря доставке тем или иным способом (трансфекция, трансдукция, электропорация, наночастицы и т.д.) в Т- или NK-клетки человека одной из конструкций, кодирующей полипептид, обладающий высоким уровнем связывания с CD47/SIRPa человека, а также блокирования взаимодействия этих двух белков. Экспрессия и секреция этого полипептида из Т- или NK-клетки приводит к местному усилению фагоцитарной активности макрофагов против опухолевых клеток (Фиг. 1, Фиг. 2).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному моноклональному антителу против CD47, которое кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, продуцирующей блокатор взаимодействия CD47/SIRPa.

В одном из вариантов осуществления раскрывается NK-клеточный продукт (модифицированный NK-лимфоцит), обладающий помимо CAR-опосредованных цитотоксических свойств в отношении PSMA-позитивных опухолевых клеток дополнительной способностью прямо или опосредованно уничтожать опухолевые клетки за счет привлечения и активации клеток моноцитоидного ряда, таких как моноциты и макрофаги. Повышение эффективности противоопухолевой иммунотерапии онкологических заболеваний человека, вызванных пролиферацией PSMA-позитивных опухолевых клеток (рак предстательной железы, рак поджелудочной железы и др.), таким образом, достигается за счет комбинирования цитотоксической активности NK-клеточных продуктов с поверхностной экспрессией опухоле-ассоциированных PSMA-специфических химерных антигенных рецепторов и локальной секреции этими клетками терапевтических агентов на основе антител, обеспечивающих привлечение и активацию моноцитов и макрофагов в опухолевом очаге, а также реверсию иммуносуппрессивного опухолевого микроокружения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения раскрыта генетически модифицированная NK-клеточная линия человека YT (далее ECAR-NK), несущая две кассеты (Фиг. 1). Первая кодирует PSMA-специфический химерный антигенный рецептор на основе известного моноклонального антитела J591 (Фиг. 3). Вторая кодирует химерное моноклональное антитело, вариабельные последовательности которого заимствованы от известного мышиного антитела В6Н12, а константные области соответствуют последовательностям IgG4 человека (Cgamma4 и Скарра) (Фиг. 4). Размноженные in vitro ECAR-NK клетки обладают неограниченным пролиферативным потенциалом и после наработки в биореакторах и перевода в готовый для переливания пациентам формат, подвергаются криоконсервации и нелетальному гамма-облучению во избежание случайного приживления в организме пациента. Нарушенная таким образом способность делиться позволяет полученным ECAR-NK-клеточным продуктам после введения пациентам накапливаться в районах PSMA-позитивных опухолей и метастазов, что сопровождается уничтожением опухолевых клеток за счет прямой цитотоксичности в результате активации CAR-модуля, а также усилением фагоцитоза опухолевых клеток независимо от их PSMA-статуса за счет локальной секреции CD47-специфического моноклонального антитела (Фиг. 5).

Из уровня техники известны варианты использования CAR Т-клеток, дополнительно секретирующих блокаторы взаимодействия белков CD47 и SIRPa человека на основе scFv, что приводило к усилению противоопухолевой активности по сравнению с модифицированными CAR Т-клетками (US 20160045551 A1). Недостатком такого решения является то, что секретируемые scFv обладают молекулярным весом около 27 кДа, и таким образом легко выводятся из тканей, а затем и из кровотока за счет фильтрации почками. Таким образом, поддержание высокой локальной концентрации таких блокаторов за счет ограниченного числа проникших в опухолевый очаг CAR Т- или CAR NK-клеток, представляет серьезную проблему. В предпочтительных вариантах изобретения описано использование для блокирования взаимодействия CD47/SIRPa более крупных молекул, имеющих молекулярный вес более 40 кДа. В частности, описано использование полноразмерных антител (молекулярный вес от 150 кДа, что заведомо выше почечного порога фильтрации (20-40 кДа)), секретируемых CAR NK-клетками.

Известные варианты введения препаратов антител-блокаторов CD47/SIRPa как самостоятельно, так и в сочетании с другими моноклональными антителами или противоопухолевыми CAR Т- и NK-клеточными продуктами (US 9017675 B2, US 8758750 B2, US 20140369924 A1, ЕР 3405499 А1) не лишены и других недостатков, поскольку такие препараты могут обладать системным токсическим эффектом (в частности, приводить к анемии ввиду экспрессии CD47 на эритроцитах и других клетках) из-за «размывания» антитела-блокатора по всему организму вместо точечного попадания только в опухолевый очаг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa можно использовать химерные белки, состоящие из эктодомена SIRPa и Fc-фрагментов иммуноглобулинов (например, TTI-621 (Trilium) и ALX-148 (Alexo Therapeutics)), включая их мутантные варианты со сниженной антитело-зависимой и/или комплемент-зависимой цитотоксической активностью, конъюгаты или химерные белки, слитые с человеческим альбумином (HSA). Помимо этого, для целей иммунотерапии онкологических заболеваний крайне привлекательными выглядят гуманизированные (например, Hu47F9-G4 (Forty Seven), СС-90002 (Celgene), and IBI188 (hinovent Biologies)) или полностью человеческие CD47-специфические антитела (например, SRF231 (Surface Oncology)).

В некоторых вариантах осуществления изобретения раскрывается лентивирусная трансдукция в NK-клетки человека одной из конструкций, кодирующей химерное моноклональное антитело, обладающее высоким уровнем связывания с эктодоменом белка CD47 человека, а также способностью блокировать взаимодействие между CD47 и SIRPa, что приводит к экспрессии и секреции этого антитела из NK-клеток и местному усилению активности клеток моноцитиоидного ряда в отношении опухолевых клеток независимо от их PSMA-статуса. Селекция и размножение in vitro полученных таким образом ECAR NK-клеточных линий позволяет получать универсальные NK-клеточные продукты с противоопухолевой активностью, которые можно использовать для терапии онкологических больных, опухолевые клетки которых несут на своей поверхности PSMA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения раскрывается создание оригинальной генетической конструкции, кодирующей секретируемый блокатор взаимодействия CD47/SIRPa в формате CD47-специфического моноклонального антитела (Фиг. 5, Фиг. 6), CD47-специфического одноцепочечного антитела или экстраклеточного домена CD47. Показано, что после доставки таких кассет в Т- или NK-клетки, данные блокаторы секретировались ими в культуральную среду, узнавали целевые молекулы (CD47 и SIRPa) (Фиг. 7), а кондиционированные таким образом супернатанты сред обладали стимулирующими фагоцитоз свойствами (Фиг. 8).

В некоторых вариантах осуществления изобретения раскрывается использование активационно-индуцируемых промоторных кассет для экспрессии блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa, позволяющих обеспечить секрецию таких блокаторов только после того, как CAR T/NK-клетка достигла опухоли. Известно, что когда CAR Т- или NK-клетка обнаруживает клетку-мишень, происходит ее CAR-зависимая активация, сопровождаемая секрецией цитокинов и высвобождением литических гранул в область синапса с клеткой-мишенью. Существует несколько базисных сигнальных путей, зависящих от состава сигнальных и костимулирующих последовательностей CAR, а также от самой природы клетки-носителя CAR (Т или NK) к ним относятся PI3K/AKT, TRAF2/p38MAPK и JNK. Данные сигнальные пути в той или иной мере сходятся на ключевых транскрипционных факторах NF-κВ, NFAT, STAT3, JUN и FOS, которые, собственно и обеспечивают запуск активационных и эффекторных программ CAR T/NK-клеток. Описано множество естественных промоторов (например, промоторы генов CD69, IL2, IFNg) и искусственных промоторных кассет, включающих в себя различные сочетания сайтов связывания упомянутых выше транскрипционных факторов, равно как и негативных регуляторов, предотвращающих их фоновую активацию или терминирующих активацию после того, как в ней отпала необходимость. Соответственно преимуществом использования активационной-индуцируемой активации экспрессии и секреции блокаторов CD47/SIRPa является еще большая избирательность доставки таких агентов в опухоль.

Альтернативным вариантом обеспечения экспрессии блокаторов CD47/SIRPa в опухоли является ипользование того факта, что сама опухоль (опухолевые клетки в сочетании с опухолевой стромой) зачастую является источником весьма специфического спектра цитокинов, позволяющего привлекать в опухолевый очаг иммуносуппрессивные клетки и, наоборот, «отталкивать» противоопухолевые Т-, В- и NK-клетки. Соответственно, использование промоторных элементов от генов-мишеней таких цитокинов в CAR-клетках может быть использовано для обеспечения специфической экспрессии терапевтических молекул-блокаторов именно в опухоли. Создание более сложных систем, основанных на дополнительной экспрессии CAR-клетками гибридных цитокиновых или switch-рецепторов, внеклеточная часть которых запускает узнавание выделяемого опухолью цитокина (или экспрессируемого опухолевыми клетками/стромой поверхностного лиганда), а внутриклеточная часть - переключение его сигнального каскада на проактивационную или костимулирующую программу, обеспечивающую не только секрецию искомого блокатора, но и долговременную пролиферацию таких клеток, является перспективным и логичным продолжением данной платформы.

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Получение линии CAR-YT на основе NK-клеточной линии человека YT.

Проводят трансдукцию клеток YT лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор второго поколения со специфичностью к PSMA человека. Для получения лентивирусных частиц ДНК рекомбинантной плазмиды PSMA-CD8-CAR [Кулемзин С.В, Чикаев Н.А, Волкова О.Ю, Кузнецова В.В, Таранин А.В, Горчаков АА. Модульная система лентивирусных векторов для работы с химерными антигенными рецепторами. Биоорганическая химия. 2017 43(2): с. 124-132.] (Фиг. 3) смешивают с ДНК вспомогательных плазмид pMD.2G и psPAX2, необходимых для упаковки лентивирусных частиц, в молярном соотношении 4:1:3 и трансформируют клетки эмбрионального почечного эпителия человека НЕК293Т методом кальций-фосфатной трансфекции, после чего выращивают 6 ч в среде IMDM с добавлением фетальной сыворотки коров до 10%, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяют на новую и инкубируют клетки 48 часов. После этого супернатанты кондиционированной среды фильтруют через 0.45 мкм PES-фильтры и используют для заражения клеточной NK-линии YT методом спинокуляции в присутствии полибрена (8 мкг/ мл). Из полученной клеточной популяции удаляют нетрансдуцированные клетки путем добавления в питательную среду зеоцина (400 мкг/мл) и инкубирования в течение несколких дней. Полученные таким способом клетки CAR-YT экспрессируют на своей поверхности химерные антигенные рецепторы (CAR), специфичные к белку PSMA человека (Фиг. 9), и обладают цитотоксической активностью в отношении PSMA-позитивных раковых клеток (Фиг. 10, Фиг. 11), в частности, клеток аденокарциномы простаты человека.

Генно-инженерными методами получают плазмиду pLV-aCD47mAb, кодирующую химерное моноклональное антитело chmAb(B6H12)-2xFLAG, способное блокировать взаимодействие белков человека CD47 и SIRPa. Последовательности ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепь данного антитела, слиты с сигнальной последовательностью GlucSP белка люциферазы копеподы Gaussia princeps, отщепляемой при экспорте в эндоплазматический ретикулюм и обеспечивающей его секрецию из клетки. Кроме того, последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь данного антитела, опционально находится в общей рамке считывания с последовательностью эпитопа 2xFLAG, необходимого исключительно для облегчения детекции данного антитела, но не для обеспечения его функциональности. Указанная плазмида устроена таким образом, что клонированная в них кассета находятся под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса человека (CMV).

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pLV-aCD47mAb (Фиг. 6) является:

а) лентивирусный вектор третьего поколения pCDH-CMV-MCS-IRES-copGFP, являющийся дериватом вектора pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP (SystemBio, США) и обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего chmAb(B6H12)-2xFLAG, его экспрессию под контролем конститутивного промотора CMV цитомегаловируса человека и секрецию во внеклеточное пространство за счет использования сигнальной последовательности GlucSP;

б) фланкированный сайтами рестрикции XbaI и NotI фрагмент ДНК, кодирующий chmAb(B6H12)-2xFLAG, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 5. Структурно целевое химерное антитело chmAb(B6H12)-2xFLAG организовано следующим образом: его вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей заимствованы из CD47-специфичного мышиного моноклонального антитела В6Н12, а константные последовательности - от IgG4 и каппа-цепи иммуноглубулина человека (Фиг. 4). Такая организация снижает потенциальную иммуногенность секретируемого химерного антитела, а также обеспечивает снижение его эффекторных функций, в частности проявления антитело- и комплемент-зависимой цитотоксичности.

Лентивирусная конструкция pLV-aCD47mAb была ко-трансфицирована в клетки-паковщицы линии НЕК293Т вместе с паковочными плазмидами pMD2.g и psPAX2, кодирующими оболочечный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита и белки ВИЧ-1 GAG, POL, REV и TAT. Полученными псевдотипированными лентивирусными частицами были трансдуцированы клетки линии CAR-YT, полученные на предыдущем этапе работы. После селекции трансдуцированных клеток за счет экспрессии сцепленного с целевой кассетой флуоресцентного репортера copGFP, способность полученного таким образом химерного антитела, секретируемого в культуральную среду, специфически узнавать целевые молекулы CD47 на поверхности клеток была подтверждена с использованием FACS-анализа С047-позитивных клеток линий Raji и Jurkat (Фиг. 7).

Исследование способности секретируемого в питательную среду химерного моноклонального антитела chmAb(B6H12)-2xFLAG блокировать взаимодействие CD47/SIRPa и тем самым усиливать фагоцитарную активность первичных макрофагов in vitro проводили с мечеными различными флуорохромами макрофагами человека фенотипа М-1 и облученными или необлученными опухолевыми клетками линии Jurkat, ко-инкубированными друг с другом в течение 4 часов (Фиг. 8). Детекцию событий фагоцитоза производили с использованием флуоресцентной проточной цитометрии, с гейтированием по одиночным клеткам. Было показано, что при добавлении к клеткам-мишеням линии Jurkat, окрашенных eFluor670, макрофагов, окрашенных eFluor450, происходит фагоцитоз клеток Jurkat (~28%) (появление eFluor670+, eFluor450+ популяции клеток), уровень которого увеличивается до 51% при добавлении супернатантов, кондиционированных chmAb(B6H12)-2xFLAG. Таким образом, была получена искомая NK-клеточная линия ECAR-YT, обладающая поверхностной экспрессией PSMA-специфичного CAR и способностью секретировать С047-специфичное химерное моноклональное антитело chmAb(B6H12)-2xFLAG.

Полностью аналогичным образом была получена клеточная линия CAR-YT-scFv, секретирующая не полноразмерное химерное моноклональное антитело, а лишь scFv-фрагмент этого антитела (SEQ ID NO 9).

Для проведения экспериментов in vivo были использованы иммунодефицитные мыши линии nod scid (самцы) с введенными подкожно ксенотрансплантатами клеток аденокарциномы простаты человека линии РС3 (PSMA+, GFP+, FFluc+) (2 млн клеток в PBS на мышь), эктопически экспрессирующими на своей поверхности белок PSMA и одновременно маркированные GFP и FFluc (Фиг. 12А). На седьмой день после введения опухолевых клеток были сформированы несколько групп мышей (6-7 животных в каждой группе), которым каждые пять дней на протяжении последующих 20 дней системно вводили либо PBS (контрольная группа), либо немодифицированные клетки линии YT (контроль неспецифической активности), либо клетки линии CAR-YT (контроль CAR-опосредованной активности), либо клетки линии CAR-YT-scFv(aCD47) (группа сравнения), либо клетки линии CAR-YT-mAb(aCD47). С целью наиболее полного моделирования терапии и предотвращения энграфтмента все вводимые NK-клеточные линии (3-5 млн клеток на инъекцию) были предварительно нелетально облучены гамма-радиацией (5 Гр). Начиная с 7 дня после введения ксенографта и по 80 день включительно каждые 3-5 дней производились замеры развивающихся опухолей, а также учет числа выживших животных (мышей выводили из эксперимента при достижении опухолью объема 1500 мм3). Полученные данные приведены на Фиг. 12Б и свидетельствуют о том, что единственной клеточной линией, обнаружившей умеренную терапевтическую эффективность, является линия CAR-YT-mAb(aCD47). Другими словами, само по себе блокирование взаимодействия CD47/SIRPa, например, при использовании scFv(aCD47), является недостаточным для обеспечения противоопухолевого эффекта, и, по-видимому, связано с субоптимальными фармакодинамическим свойствами данного формата блокаторов (быстрым вымыванием из тканей, куда scFv был доставлен при помощи CAR-YT-scFv(aCD47) клеток). Одновременно, локальная доставка в опухоль более крупных и авидных молекул химерного моноклонального антитела chmAb(B6H12)-2xFLAG позволяет обеспечить замедление роста опухолевого ксенографта.

Пример 2. Получение конструкции для экспрессии блокатора взаимодействия CD47/SIRPa.

Генно-инженерными методами получают одну из плазмид pLV-scFv(aCD47), pLV-mAb(aCD47) (Фиг. 6), pLV-eCD47, кодирующих соответственно блокаторы взаимодействия CD47/SIRPa - scFv(B6H12)-2xFLAG, chmAb(B6H 12)-2xFLAG (Фиг. 4) и CD47(ecto)-2xStrep-FLAG, слитые с сигнальными последовательностями GlucSP или CD47, отщепляемыми при экспорте в эндоплазматический ретикулум. Указанные плазмиды устроены таким образом, что клонированные в них кассеты находятся под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса человека (CMV).

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pLV-scFv(aCD47) является:

а) лентивирусный вектор третьего поколения pCDH-CMV-GlucSP-MCS-IRES-copGFP, являющийся дериватом вектора pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP (SystemBio, США) и обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего один из блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa, его экспрессию под контролем конститутивного промотора CMV цитомегаловируса человека и секрецию во внеклеточное пространство за счет использования сигнальной последовательности GlucSP;

б) фланкированный сайтами рестрикции AgeI и NotI фрагмент ДНК, кодирующий scFv(B6H12)-2xFLAG с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 6.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pLV-eCD47 является:

а) лентивирусный вектор третьего поколения pLVX (Clontech, США) и обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего CD47(ecto)-2xStrep-FLAG, его экспрессию под контролем конститутивного промотора CMV цитомегаловируса человека и секрецию во внеклеточное пространство за счет использования собственной сигнальной последовательности CD47;

б) фланкированный сайтами рестрикции XhoI и BglII фрагмент ДНК, кодирующий CD47(ecto)-2xStrep-FLAG, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 8.

Пример 3. Подтверждение экспрессии CAR.

Поверхностная экспрессия PSMA-специфического CAR клетками CAR-YT была подтверждена при помощи иммуноокрашивания. Для этого ~100000 CAR-YT клеток переносили в цитометрическую пробирку и центрифугировали при 500 g в течение 4 минут, после чего отмывали от остатков культуральной среды в 2 мл PBS (рН 7,4: 1,7 мМ KH2PO4, 5,2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl), содержащего 1,5% FCS и 0,06% NaN3, с последующим центрифугированием при тех же условиях. Затем клетки инкубировали с Protein L-bio, способным связывать каппа-цепи иммуноглобулинов (модуль scFv в CAR) (GenScript, М00097) в концентрации 1 мкг/ мкл в течение 30 минут при 4°С. По окончании инкубации клетки дважды отмывали от биотинилированного Protein L раствором PBS с 1,5% FCS и 0,06% NaN3 и инкубировали с флуоресцентно меченым конъюгатом стрептавидин-АРС (Thermo Fisher Scientific). Используемые конъюгаты разводили в соотношении 1:800 в PBS с 1,5% FCS и 0,06% NaN3. Инкубацию проводили в течение 30 минут при 4°С, после чего дважды промывали образцы и для исключения из анализа мертвых клеток добавляли 1 мкг/мкл 7AAD (Biolegend).

Аналогичным образом детекцию поверхностной экспрессии CAR верифицировали, используя myc-специфические мышиные моноклональные антитела (Abeam, клон 9Е10) и флуоресцентный конъюгат goat-anti-mouse-AF647 (Фиг. 9).

Образцы анализировали с помощью проточного цитометра BD F ACSCanto II (Becton Dickinson and Company). Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения BD FACSDiva Software.

Пример 4. Цитотоксический тест.

Необходимое количество клеток-мишеней линии Рс3-PSMA центрифугировали 3 минуты при 500 g при комнатной температуре. После этого клетки 3 раза промывали 2 мл стерильного PBS. Клетки ресуспендировали в 1 мл стерильного PBS и добавляли к ним 1 мкл метки Cell Proliferation Dye eFluor 670. Мечение проводили в течение 10 минут в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Далее добавляли 5 мл среды IMDM и еще раз центрифугировали. Полученные таким образом меченые клетки ресуспендировали в 5 мл среды, переносили в 6-сантиметровую чашку Петри и инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С. CAR-YT клетки центрифугировали 4,5 минуты при 500 g и ресуспендировали в 700 мкл питательной среды. После этого клетки подсчитывали в камере Горяева и доводили плотность до 1000 клеток/мкл. В 96-луночный планшет вносили по 20 мкл меченых клеток-мишеней (20000 клеток на лунку). После этого к ним добавляли разное количество клеток-эффекторов в соотношениях: 1:1, 2:1, 3:1, 5:1 и 10:1 (эффектор:мишень), оставляя в одной лунке клетки-мишени без эффекторов для контроля. Клетки инкубировали 4 часа в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. После этого в каждую лунку добавляли витальный краситель 7AAD и измеряли процент погибших клеток-мишеней на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoII (Фиг. 10, Фиг. 11).

Пример 5. CD47- и SIRPa-специфические блокаторы, секретируемые ECAR-YT клетками, связываются с клетками-мишенями.

В качестве источников последовательностей CD47-специфичных блокаторов взаимодействия CD47/SIRPa были использованы известные последовательности мышиного моноклонального антитела В6Н12. Последовательность внеклеточного домена CD47, обладающего сродством к SIRPa, была использована для создания SIRPa-специфичного блокатора CD47/SIRPa. Лентивирусные конструкции были ко-трансфицированы в клетки-паковщицы линии НЕК293Т вместе с паковочными плазмидами pMD2.g и psPAX2, кодирующими оболочечный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита и белки ВИЧ-1 (GAG, POL, REV и TAT). Полученными псевдотипированными лентивирусными частицами были трансдуцированы клетки NK-клеточной лимфомы человека YT. После селекции трансдуцированных клеток (основанной на экспрессии флуоресцентного репортера, входящего в состав бицистронной кассеты, кодирующей блокатор CD47/SIRPa), присутствие секретируемых блокаторов в культуральной среде было проверено при помощи ELISA и Western-блот гибридизации с FLAG-специфическими антителами, узнающими FLAG-эпитоп, присутствующий в составе всех трех блокаторов. Способность полученных таким образом блокаторов специфически узнавать целевые молекулы на поверхности клеток была проанализирована с использованием CD47-позитивных клеток линий Rji и Jurkat (Фиг. 7А), а также SIRPa-позитивных клеток линии ТНР-1 (Фиг. 7Б).

Пример 6. Функциональные блокаторы CD47/SIRPa, секретируемые YT клетками, индуцируют фагоцитоз раковых клеток in vitro.

Подготовка макрофагов

Мононуклеары периферической крови здорового донора были выделены, используя центрифугирование на градиенте плотности фиколла-верографина. После тройной отмывки теплым раствором 0,1% BSA в PBS (PBS-BSA) эритроциты были удалены посредством осмотического шока за счет добавления к суспензии клеток 2 мл воды, после чего к клеткам был незамедлительно добавлен PBS-BSA. Дважды повторив данную процедуру, очищенные от эритроцитов клетки были рассеяны на 12-луночные планшеты ТРР из расчета 5 млн клеток на лунку. После инкубирования в течение 1.5 часов в С02-инкубаторе клетки были аккуратно промыты PBS, чтобы удалить несвязавшиеся с пластиком клетки. Затем к клеткам было добавлено 2 мл среды IMDM/Optimem 5% FBS и 10 нг/мл GM-CSF. После 3-дневной инкубации была проведена замена среды (половина объема) на аналогичную теплую питательную среду с добавлением с 5 нг/мл GM-CSF. Среда была заменена на свежую спустя трое суток, после чего полученные макрофаги были дважды промыты смесью сред IMDM/Optimem 5% FBS и инкубированы в течение 24 часов со смесью сред IMDM/Optimem 5% FBS с добавлением IFN-gamma до 40 нг/мл (Ингарон) и LPS до 20 нг/мл.

Дифференцированные в присутствии IFN-g/LPS макрофаги из трех лунок планшета были переведены в суспензию следующим образом: после удаления среды к клеткам было добавлено по 0,5 мл TrypLE, инкубирование с которым продолжалось 10 мин в CO2-инкубаторе. Далее клетки ресуспендировали, переносили в 1,5 мл пробирки, после чего производили подсчет числа клеток на клеточном счетчике LUNA2. Полученное усредненное значение принимализа среднюю концентрацию макрофагов во всех лунках планшета (дополнительно проводилась визуальная оценка однородности заполнения лунок макрофагами). В среднем данный протокол позволял получить порядка 10⁵ макрофагов на одну лунку.

Остальные лунки, содержащие макрофаги, дважды промывали теплым PBS. Далее в одну лунку добавляли IMDM 10% FBS (неокрашенные макрофаги для гейтирования в FACS), в остальные добавляли по 1 мл разведенного в PBS ef450 (2 мкл красителя на 5 мл PBS) и инкубировали в течение 10 мин в СО₂-инкубаторе. После окраски реакцию останавливали промывкой IMDM 10% FBS и последующей инкубацией в этой же среде.

Подготовка клеток-мишеней

Клетки линии Jurkat метили с помощью cell proliferation dye efluor 670 (Invitrogen) следующим образом: суспензию, содержащую около 1,5*10⁶ клеток, переносили в 15 мл пробирку, дважды отмывали PBS, затем ресуспендировали в 1 мл PBS и добавляли 1 мкл красителя. Инкубировали 10 мин в СО₂ инкубаторе. Окраску останавливали добавлением 10 мл IMDM+10% FBS и центрифугировали. Окрашенные клетки рассаживали в 6-лучный планшет или в 6 см чашки.

Индукция апоптоза у клеток-мишеней

В среду к ef670-меченным клеткам линии Jurkat добавляли водный раствор NiCl₂ в концентрации 60 мкг/мл, инкубировали 24 часа. В качестве альтернативного варианта использовали гамма-облучение дозой 10G в течение 15 минут.

Фагоцитарный тест

Из чашек, содержащих супензию полностью конфлюентных клеток YT, секретирующих chimAb(B6H12)-2xFLAG и scFv(B6H12)-2xFLAG, были отобраны супернатанты, профильтрованы через 0.45 мкм фильтр и перенесены по 1 мл в лунки 12-луночного планшета. Затем в содержащие супернатанты лунки было внесено по 200 тыс необлученных и не подвергавшихся химической обработке клеток-мишеней линии Jurkat, которые были перенесены на 30 мин в СО₂-инкубатор. Параллельно для приготовления позитивного контроля в пробирку, содержащую 200 тыс.клеток Jurkat (в 0,5 мл PBS), было добавлено 1,5 мкл моноклонального антитела В6Н12 (0.5 мг/мл, eBioscience) и также инкубация продолжалась 30 минут.

После инкубирования клеток линии Jurkat с препаратом моноклонального антитела В6Н12 и супернатантами клеток CAR-YT, секретирующих chimAb(B6H12)-2xFLAG и scFv(B6H12)-2xFLAG, клетки были осаждены центрифугированием, отмыты и добавлены в лунки с окрашенными макрофагами. Параллельно в отдельную лунку были внесены обработанные NiCh или облученные клетки-мишени. Совместная инкубация клеток-мишеней и макрофагов продолжалась 2,5 часа в CO2-инкубаторе. По завершении инкубации в лунки 12-луночного планшета было добавлено 200 мкл TrypLE, с которым инкубировали 10 мин в С02 инкубаторе, затем дополнительно добавляли PBS-EDTA, ресуспендировали и переносили в цитометрические пробирки.

Замеры для каждой исследуемой группы проводили в трех технических репликах. При подсчете уровня фагоцитоза значения усреднялись.

Таким образом, исследование способности секретируемых в питательную среду блокаторов CD47/SIRPa блокировать взаимодействие CD47/SIRPa и тем самым усиливать фагоцитарную активность первичных макрофагов in vitro проводили с мечеными различными флуорохромами макрофагами человека фенотипа М-1 и облученными или необлученными опухолевыми клетками линии Jurkat, ко-инкубированными друг с другом в течение 4 часов. Детекцию событий фагоцитоза производили с использованием флуоресцентной проточной цитометрии, с гейтированием по одиночным клеткам. Было показано, что при добавлении к клеткам-мишеням линии Jurkat, окрашенным eFluor670, макрофагов, окрашенных eFluor450, происходит фагоцитоз клеток Jurkat (~28%) (появление eFluor670+, eFluor450+ популяции клеток), уровень которого увеличивается до 51-58% при добавлении супернатантов, кондиционированных блокаторами scFv(B6H12)-2xFLAG и chmAb(B6H 12)-2xFLAG (Фиг. 8).

Хотя в данном описании изобретения приводится лишь ограниченное число исполнений, специалисты в данной области техники, воспользовавшись данным изобретением, найдут возможность создать другие исполнения, не выходящие за рамки данного изобретения. Настоящее описание и примеры приведены исключительно для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем и применимость настоящего изобретения.

--->

<110> ООО "ЕКАР"

<120> NK-клеточная линия, экспрессирующая PSMA-специфический химерный

антигенный рецептор и секретирующая блокатор взаимодействия CD47/SIRPa

<130> 1

<160> 11

<210> 1

<211> 523

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность PSMA-специфичного CAR на основе

моноклонального антитела J591

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Glu Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

145 150 155 160

Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

210 215 220

Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

260 265 270

Glu Asp Leu Arg Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His

275 280 285

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

290 295 300

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

25

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

325 330 335

Gly Leu Asp Val Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

340 345 350

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

355 360 365

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

370 375 380

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

385 390 395 400

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Arg Val Lys Phe Ser

405 410 415

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

435 440 445

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

450 455 460

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

465 470 475 480

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

485 490 495

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

500 505 510

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520

<210> 2

<211> 1632

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность PSMA-специфичного CAR на основе

моноклонального антитела J591

<400> 2

atggaaaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctct gggtcccagg ctccaccggt 60

gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaaatc 120

tcctgcaaga cctccggcta caccttcacc gagtacacca tccactgggt gaaacaggcc 180

tccggcaagg gcctggaatg gatcggcaac atcaacccta acaacggcgg caccacctac 240

aaccagaagt tcgaggaccg ggccaccctg accgtggaca agtccacctc caccgcctac 300

atggaactgt cctccctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcgc cgctggctgg 360

aacttcgact actggggcca gggcaccaca gtgacagtct cgagcggctc tacctctggc 420

ggaggctctg ggggaggaag cggcggaggc ggctcctctg acatcgtgat gacccagtcc 480

ccctcctccc tgtctgcctc cgtgggcgac agagtgacca tcacatgcaa ggcctcccag 540

gatgtgggca ccgccgtgga ctggtatcag cagaagcctg gcaaggcccc taagctgctg 600

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

26

atctactggg cctccaccag acacaccggc gtgcctgaca gattcaccgg ctccggctct 660

ggcaccgact tcaccctgac catctccagc ctgcagcctg aggacttcgc cgactacttc 720

tgccagcagt acaactccta ccctctgacc ttcggcggag gcaccaagct ggaaatcaaa 780

gagcccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtggcggcgg atctagtggc 840

ggaggatccg gtggcgaaca aaagttgatt tctgaagaag atttgagatc tgccctgagc 900

aactccatca tgtacttcag ccacttcgtg ccggtcttcc tgccagcgaa gcccaccacg 960

acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg 1020

cgcccagagg cgagccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg gctggacgtc 1080

aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 1140

acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 1200

tacatgaaca tgactccccg ccgcccaggg cctacccgca agcattacca gccctatgcc 1260

ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc ggaagagtga agttcagcag gagcgcagac 1320

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1380

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1440

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1500

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1560

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1620

ccccctcgct ga 1632

<210> 3

<211> 468

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи CD47-специфичного

химерного моноклонального антитела сhmAb(B6H12)-2xFLAG

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

27

Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Ser Gly

435 440 445

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

450 455 460

Glu Asn Pro Gly

465

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи CD47-специфичного

химерного моноклонального антитела chmAb(B6H12)-2xFLAG

<400> 4

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

210 215 220

Lys Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Asp Lys

225 230

<210> 5

<211> 2252

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность кассеты между сайтами

клонирования XbaI и NotI, кодирующая CD47-специфичное химерное

моноклональное антитело chmAb(B6H12)-2xFLAG

<400> 5

tctagacacc atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc 60

ctcagaggtg cagctggtgg agtctggggg agacttagtg aagcctggag ggtccctgaa 120

actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cagtggctat ggcatgtctt gggttcgcca 180

gactccagac aagaggctgg agtgggtcgc aaccattact agtggtggta cttacaccta 240

ctatccagac agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacaatgcca agaacaccct 300

gtacttgcaa atagacagtc tgaagtctga ggatacagcc atatatttct gtgcaagatc 360

cctcgcggga aatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctccagcgc 420

tagcaccaag ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag 480

cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg 540

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

29

gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg 600

actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta 660

cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa 720

atatggtccc ccatgcccat catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt 780

cctgttcccc ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg 840

cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg 900

cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg 960

tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg 1020

caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg 1080

gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa 1140

ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg 1200

ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga 1260

cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa 1320

tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct 1380

ctccctgtct ctgggtaaag gatccggcag cggcgccacg aacttctctc tgttaaagca 1440

agcaggagat gttgaagaaa accccgggcc tctcgagatg ggagtcaaag ttctgtttgc 1500

cctgatctgc atcgctgtgg ccgaggccaa gcccaccggt gacattgtga tgactcagtc 1560

tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct ctttcctgca gggccagcca 1620

gactattagc gactacttac actggtatca acaaaaatca catgagtctc caaggcttct 1680

catcaaattt gcttcccaat ccatttctgg gatcccctcc aggttcagtg gcagtggatc 1740

aggctcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct gaagatgttg gagtgtatta 1800

ctgtcaaaat ggtcacggct ttcctcggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa 1860

acgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc agctgaagtc 1920

cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac cccagagagg ccaaggtgca 1980

gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag gagagcgtga ccgagcagga 2040

cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc ctgagcaaag ccgactacga 2100

gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctgagctccc ccgtcaccaa 2160

gagcttcaac aggggggagt gtggctccgg tgattacaag gatgacgacg ataagggtga 2220

ttataaagat catgacgata agtagcggcc gc 2252

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

30

<210> 6

<211> 806

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность кассеты между сайтами AgeI и

NotI, кодирующая scFv(B6H12)-2xFLAG

<400> 6

accggtgaca ttgtgatgac tcagtctcca gccaccctgt ctgtgactcc aggagataga 60

gtctctcttt cctgcagggc cagccagact attagcgact acttacactg gtatcaacaa 120

aaatcacatg agtctccaag gcttctcatc aaatttgctt cccaatccat ttctgggatc 180

ccctccaggt tcagtggcag tggatcaggc tcagatttca ctctcagtat caacagtgtg 240

gaacctgaag atgttggagt gtattactgt caaaatggtc acggctttcc tcggacgttc 300

ggtggaggca ccaagctgga aatcaaaggc agtactagcg gcggtggctc cggaggcggc 360

tccggaggtg gcggcagctc agaggtgcag ctggtggagt ctgggggaga cttagtgaag 420

cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggat tcactttcag tggctatggc 480

atgtcttggg ttcgccagac tccagacaag aggctggagt gggtcgcaac cattactagt 540

ggtggtactt acacctacta tccagacagt gtgaaggggc gattcaccat ctccagagac 600

aatgccaaga acaccctgta cctgcaaata gacagtctga agtctgagga tacagccata 660

tatttctgtg caagatccct cgcgggaaat gctatggact actggggtca aggaacctca 720

gtcaccgtct cgagcggctc cggtgattac aaggatgacg acgataaggg tgattataaa 780

gatcatgacg ataagtgagc ggccgc 806

<210> 7

<211> 411

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность внеклеточного домена CD47

человека

<400> 7

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

31

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt t 411

<210> 8

<211> 575

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность кассеты между сайтами XhoI и

BglII, кодирующая внеклеточный домен CD47в общей рамке считывания

с 2хStrep-FLAG-эпитопом.

<400> 8

ctcgaggcgg gcgcggagat gtggcccctg gtagcggcgc tgttgctggg ctcggcgtgc 60

tgcggatcag ctcagctact atttaataaa acaaaatctg tagaattcac gttttgtaat 120

gacactgtcg tcattccatg ctttgttact aatatggagg cacaaaacac tactgaagta 180

tacgtaaagt ggaaatttaa aggaagagat atttacacct ttgatggagc tctaaacaag 240

tccactgtcc ccactgactt tagtagtgca aaaattgaag tctcacaatt actaaaagga 300

gatgcctctt tgaagatgga taagagtgat gctgtctcac acacaggaaa ctacacttgt 360

gaagtaacag aattaaccag agaaggtgaa acgatcatcg agctaaaata tcgtgttgtt 420

tcatggtttg gcggccgcag cgcttggagc cacccgcagt tcgaaaaagg tggaggttct 480

ggcggtggat cgggaggttc agcgtggagc cacccgcagt tcgagaaagg tgcttctggt 540

gaagattaca aggatgacga cgataagtaa agatc 575

<210> 9

<211> 263

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность scFv(B6H12)-2xFLAG

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg

С УКАЗАНИЕМ ИСПРАВЛЕНИЙ

32

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile

165 170 175

Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile

195 200 205

Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser

210 215 220

Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Asp

245 250 255

Tyr Lys Asp His Asp Asp Lys

260

<210> 10

<211> 63

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность шарнирного района CAR,

представленная мутантным (Cys◊Ser) фрагментом внеклеточной части

белка CD8a человека

<400> 10

Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val

1 5 10 15

Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

20 25 30

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

35 40 45

Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

50 55 60

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Аминокислотная последовательность трансмембранного района CAR,

представленная трансмембранным фрагментом белка CD28 человека

<400> 11

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

1 5 10 15

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<---

1. Модифицированная NK-клетка для иммунотерапии PSMA-позитивной опухоли, содержащая:

а) химерный антигенный рецептор (CAR) на поверхности клетки, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолеассоциированным маркером PSMA, шарнирный домен, трансмембранный домен и домен внутриклеточной сигнализации, который способен активировать NK-клетку;

и

б) нуклеиновую кислоту, кодирующую блокатор взаимодействия CD47/SIRPa размером более 40 кДа.

2. Модифицированная NK-клетка по п. 1, в которой шарнирный домен химерного антигенного рецептора содержит фрагмент внеклеточной области CD8a человека и трансмембранный домен антигенного рецептора содержит фрагмент трансмембранного домена CD28 человека.

3. Модифицированная NK-клетка по п. 2, в которой химерный антигенный рецептор имеет последовательность SEQ ID NO: 1.

4. Модифицированная NK-клетка по п. 1, в которой блокатор взаимодействия CD47/SIRPa представляет собой антитело, специфически распознающее CD47.

5. Модифицированная NK-клетка по п. 4, в которой антитело, специфически распознающее CD47, является одноцепочечным антителом.

6. Модифицированная NK-клетка по п. 5, в которой антитело, специфически распознающее CD47, имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и легкой цепи SEQ ID NO: 4.

7. Модифицированная NK-клетка по любому из пп. 1-5, характеризующаяся тем, что при взаимодействии указанного рецептора с маркером PSMA NK-клетка активирует экспрессию блокатора взаимодействия CD47/SIRPa.

8. Модифицированная NK-клетка по п. 7, где блокатор взаимодействия CD47/SIRPa усиливает иммунный ответ NK-клетки.

9. Фармацевтическая композиция для иммунотерапии PSMA-позитивной опухоли, содержащая эффективное количество модифицированной NK-клетки по п. 1 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, где указанную композицию используют для лечения рака простаты.

11. Способ уменьшения опухолевой массы у индивидуума, имеющего рак простаты, включающий введение индивидууму эффективного количества NK-клетки по п. 1.

12. Способ увеличения выживаемости индивидуума, имеющего рак простаты, включающий введение индивидууму эффективного количества NK-клетки по п. 1.