Питательная среда жидкая для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба y. pestis ev

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду жидкую для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащая следующие ингредиенты: кислотный гидролизат кукурузной патоки 88,0 мл, натрий хлористый 5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г, соль Мора 0,04 г, натрий сернистокислый 0,35 г, дистиллированная вода до 1 л, стимулирующих добавок сульфита натрия и соли Мора. Изобретение обеспечивает высокий процент живых микробных клеток в биомассе через 20 ч.

 

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред жидких для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV и может быть использовано в получении питательной среды, обеспечивающей высокий процент живых микробных клеток в биомассе.

Известна питательная среда жидкая, включающая ферментативный гидролизат говяжьего мяса 170,0-190,0 мл, натрий хлористый 3,0-5,0 г, натрий сернистокислый 3,0-5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 г, стимулятор Карпузиди 0,01-0,06 г, очищенная вода до 1 л. (Патент РФ №2433170. Опубликовано: 10.11.2011 Бюл. №31).

Недостатком данной среды является высокая себестоимость сырья.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является питательная среда для культивирования чумного микроба вакцинного штамма EV, включающая в качестве питательной основы ферментативный гидролизат бобов сои 320,0-420,0 мл, натрий хлористый 4,0-6,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 г, натрий сернистокислый 0,3-0,5 г, липоевую кислоту 0,4-0,6 г, 20% раствор натрия гидроокиси 2,5-3,5 мл, дистиллированную воду до 1 л (патент РФ №2260620. Опубл. 20.09.2005. Бюл. №26).

Недостатком данной среды является ее многокомпонентность и дефицит сырьевой базы.

Целью изобретения является приготовление питательной среды жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая обеспечивает высокий процент живых микробных клеток в биомассе через 20 ч.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азота при приготовлении среды используется кислотный гидролизат кукурузной патоки, изготовленный из побочного продукта приготовления ферментативного гидролизата кукурузной патоки.

Технический результат заключается в том, что в состав питательной среды входят натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, дистиллированная вода и ростостимулирующие добавки: соль Мора (двойная сернокислая соль железа и аммония) и натрий сернистокислый.

В результате получают биомассу вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV с высоким количеством живых микробных клеток на жидкой питательной среде со следующим соотношением ингредиентов:

Кислотный гидролизат кукурузной патоки	88,0 мл
Натрий хлористый	5,0 г
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный	4,0 г
Соль Мора	0,04 г
Натрий сернистокислый	0,35 г
Дистиллированная вода	до 1 л.

В качестве исходного сырья используют кукурузную патоку жидкую, содержащую около 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), патока является хорошей питательной средой для производства антибиотиков и витаминов. В своем составе она содержит микроэлементы (мг/кг): цинк 22,0, марганец 5,0, медь 5,0, кобальт 0,02, йод 0,30; макроэлементы (%): фосфор 0,25, натрий 0,04, кальций 0,59, калий 0,36, магний 0,12, сера 0,11, хлор 0,04; аминокислоты (%): аргинин 90,0, гистидин 72,0, лейцин 72,0, изолейцин 89,0, фенилаланин 59,0, треонин 95,0, валин 12,7, лизин 0,96, метионин 0,56, триптофан 0,22, метионин + цистин 0,27 и витамины (мг/кг): каротин (витамин А) 8,0, B1 4,0, В2 1,0, В3 (пантотеновая кислота) 6,5, В4 (холин) 400, В5 17, В6 2,9. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.).

Натрий хлористый (хч), ГОСТ 4233-77. Необходим для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала. Является катализатором химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (чда), ГОСТ 4172-76. Используется в качестве источника фосфатов при приготовлении питательных сред для обеспечения буферного действия.

Натрий сернистокислый (чда), ГОСТ 195-77. Используется в качестве стимулятора роста микроорганизмов, является источником серы. Регулирует окислительно-восстановительный потенциал среды, увеличивает ее прозрачность.

Соль Мора, ГОСТ 4208-72. Двойная сернокислая соль железа и аммония (Fe(NH₄)₂(SO₄)₂⋅6H₂O), которые в совокупности повышают накопительные свойства питательных сред.

Дистиллированная вода, ГОСТ 8-51-232-98. Важнейший компонент всех питательных сред. При отсутствии воды замедляются или полностью прекращаются процессы жизнедеятельности микроорганизмов. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важную роль в их физиологических функциях - входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях.

Приготовление ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой

Кукурузную патоку жидкую (ГОСТ 5194-50) в количестве 12,0 кг помещают в варочный котел, добавляют 36,0 л питьевой воды кипятят в течение 15 минут. 40% раствором натрия гидроокиси устанавливают рН 8,2-8,5. Полученный настой охлаждают до 42°С, вносят эмульсию поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС) из расчета 100,0 г на 1 л, добавляют хлороформ до концентрации 1,5%. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 42°С в течение 10 сут. В первые 6 ч смесь перемешивают каждые 15 мин по 5 мин, в последующем - по 5 мин каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. С прекращением нарастания аминного азота - на 7-10 сутки - прекращают перемешивание и убирают в прохладное место. Дают отстояться в течение 2 суток, затем отфильтровывают, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа от объема, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре (4±2)°С.

Приготовление кислотного гидролизата кукурузной патоки из осадка

Ретентант (осадок, оставшийся после фильтрации ферментативного гидролизата кукурузной патоки) в количестве 20,0 кг загружают в варочный котел, добавляют соляную кислоту в разведении 1:1 до установления рН 4,5, кипятят в течение 15 мин. После охлаждения до температуры (42±1)°С переливают в бутыли, остужают и добавляют 1,0% хлороформа от объема. Содержимое тщательно перемешивают, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре (4±2)°С.

Приготовление питательной среды жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV

Питательную среду на основе кислотного гидролизата кукурузной патоки для глубинного выращиванияи вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV готовят следующим способом. Кислотный гидролизат разбавляют дистиллированной водой до показаний аминного азота 0,12%. Смешивают 88,0 мл гидролизата, 5,0 г натрия хлористого, 4,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, добавляют дистиллированную воду до 1 литра. Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси. Вносят стимулирующие добавки: соль Мора 0,04 г и натрий сернистокислый 0,35 г, стерилизуют при температуре (115±1)°С, давлении 1,25-1,3 bar в течение 20 мин. Среду закачивают в биореактор с соблюдением условий асептики и охлаждают до (27±1)°С.

В качестве контроля используют бульон Хоттингера рН 7,1±0,1 приготовленную по ПР 01897080-09-16.

Ампулу с производственной культурой штамма Y. pestis EV вскрывают с соблюдением правил асептики, восстанавливают 1,8 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Полученной суспензией засевают ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера рН 7,1±0,1 (культура I генерации). Посевы инкубируют при (27±1)°С в течение 48 ч. Культуру I генерации пересевают в матрацы с бульоном Хоттингера рН 7,1±0,1 (культура II генерации). Посевы инкубируют при (27±1)°С. Через 48 ч культурой II генерации засевают бутыли с бульоном Хоттингера рН 7,1±0,1. Выращивают 24 ч при температуре (27±1)°С и непрерывной аэрации в объеме 1,0-1,5 л воздуха на 1 л бульона. Полученную посевную культуру используют для засева биореактора BIOSTAT A (SARTORIUS, Германия) объемом 5 л с автоматической регулировкой мешалки. Посевная доза составляет не менее 20 млн. м.к. на 1 мл питательной среды. Культивируют 16-20 ч при (27±1)°С, непрерывной аэрации, подкормке 40% раствором глюкозы. рН поддерживают на уровне 7,0-7,4. Через 10 ч выращивания и в последующем каждые 2 ч отбирают пробы для определения количества микробных клеток. При наступлении стационарной фазы (прекращение нарастания оптической концентрации взвеси и сохранение рН на одном уровне) процесс культивирования останавливают. В полученной биомассе определяют количество микробных клеток по ОСО мутности 10 единиц соответствующего года выпуска, рН, процент живых микробных клеток.

Методика подсчета процента живых микробных клеток

Из полученной биомассы делают последовательные десятикратные разведения от 10^-1 до 10^-8 пипеткой вместимостью 1 мл. Из пробирок с разведениями 10^-7 и 10^-8 высевают по 0,1 мл взвеси на 2 чашки Петри с питательной средой для контроля жизнеспособности. Через 72 ч инкубации при температуре (27±1)°С подсчитывают количество колоний для каждого образца. За количество живых микробных клеток (БК), содержащихся в 1 мл взвеси одного образца, принимают среднее значение количества живых микробных клеток, полученное из двух разведений. Для этого количество выросших колоний умножают на степень разведения взвеси, из которого производили высев и увеличивают в 10 раз.

Методика подсчета процента живых микробных клеток

Количество живых микробных клеток в процентах (% живых м.к.) вычисляют для каждого образца отдельно по формуле:

где:

БК - количество живых м.к. в 1 мл;

ОК - общая концентрация.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Штамм выращивали в питательной среде жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащей кислотный гидролизат кукурузной патоки 68 мл, натрий хлористый - 4,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 3,0 г; дистиллированную воду - до 1 литра и ростостимуляторы - натрий сернистокислый 0,3 г, соль Мора 0,01 г.

При таком соотношении ингредиентов получена биомасса Y. pestis EV со следующими параметрами: 7,2 млрд. м.к./мл, количество живых м. к. через 20 ч 25,8%. Тогда как на контрольной среде (агаре Хоттингера) параметры биомассы Y. pestis EV составили 8,3 млрд. м.к./мл, количество живых микробных клеток через 20 ч 29,9%.

Пример 2. Штамм выращивали в питательной среде жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащей кислотный гидролизат кукурузной патоки 88 мл, натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,0 г; дистиллированную воду - до 1 литра и ростостимуляторы - натрий сернистокислый 0,35 г, соль Мора 0,04 г.

При таком соотношении ингредиентов получена биомасса Y. pestis EV со следующими параметрами: 10,3 млрд. м.к./мл, количество живых м. к. через 20 ч 38,2%. Тогда как на контрольной среде (агаре Хоттингера) параметры биомассы Y. pestis EV составили 8,3 млрд. м.к./мл, количество живых микробных клеток через 20 ч 29,9%.

Пример 3. Штамм выращивали в питательной среде жидкой для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащей кислотный гидролизат кукурузной патоки 108 мл, натрий хлористый - 6,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 5,0 г; дистиллированную воду - до 1 литра и ростостимуляторы - натрий сернистокислый 0,4 г, соль Мора 0,08 г.

При таком соотношении ингредиентов получена биомасса Y. pestis EV со следующими параметрами: 5,7 млрд. м.к./мл, количество живых м. к. через 20 ч 18,4%. Тогда как на контрольной среде (агаре Хоттингера) параметры биомассы Y. pestis EV составили 8,3 млрд. м.к./мл, количество живых микробных клеток через 20 ч 29,9%.

Таким образом, исходя из ряда проведенных экспериментов, заявленная питательная среда жидкая для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV (пример 2) обеспечивает накопительный эффект 10,3 млрд м.к./мл с высоким процентом живых микробных клеток - 38,2%.

Питательная среда жидкая для глубинного выращивания вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, содержащая следующие ингредиенты:

Кислотный гидролизат кукурузной патоки	88,0 мл
Натрий хлористый	5,0 г
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный	4,0 г
Соль Мора	0,04 г
Натрий сернистокислый	0,35 г
Дистиллированная вода	до 1 л.