Липосомальная форма смолы abies sibirica для неинвазивной доставки биологически активного вещества живицы abies sibirica в мозг, обладающая антиоксидантной, цитотоксической активностью в отношении раковых клеток шейки матки, и способ ее получения

Изобретение относится к области молекулярной медицины и фармакологии, а именно к липосомальной форме смолы Abies sibirica. Способ получения липосомальной формы смолы Abies sibirica, представляющей собой фосфолипидную мембрану с включением в нее природной смолы (живицы) Abies sibirica в количестве до 1% масс., включающий следующие стадии: простое смешивание 0,55 г фосфолипида, 0,03 г холестерина, 0,04 г ПЭГилирующего агента - до 6% масс. и действующего вещества - смолы Abies sibirica - до 1% масс. в подходящем растворителе, испарение растворителя при температуре выше фазового перехода фосфолипида с получением однородной липидной пленки, ее регидратацию в среде, выбранной из ультра-очищенной воды или физиологического 0,9% водного раствора хлорида натрия - до 100% масс., при перемешивании при постоянной температуре выше фазового перехода фосфолипида и последующее диспергирование частиц до размера порядка 100 нм. Липосомальная форма смолы Abies sibirica, полученная вышеописанным способом, обладающая активностью, выбранной из: функции направленной доставки биологически активного вещества живицы Abies sibirica в мозг, антиоксидантной активности in vitro, цитотоксической активности in vitro в отношении опухолевых клеток Μ-Hela человека. Применение липосомальной формы смолы Abies sibirica для обеспечения активности, выбранной из: проникновения в центральную нервную систему (ЦНС), проникновения в ЦНС при интраназальном введении, антиоксидантной активности in vitro, цитотоксической активности in vitro в отношении опухолевых клеток Μ-Hela человека. Вышеописанная липосомальная форма смолы Abies sibirica обладает повышенной биодоступностью смолы Abies sibirica, которая является водорастворимой, способна неинвазивно проникать в ЦНС и одновременно обладает фармакологической активностью, одновременно проявляя in vitro антиоксидантные свойства и цитотоксическую активность в отношении раковых клеток шейки матки М-Hela. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной медицины и фармакологии, а именно к водорастворимой лекарственной форме - липосомальной - смолы (живицы), полученной из пихты сибирской (Abies sibirica Led.), способу ее получения, использованию в качестве лекарственного средства, обладающего цитотоксической активностью в отношении раковых клеток шейки матки, антиоксидантной активностью и функцией направленной доставки биологически активного вещества живицы Abies sibirica в мозг. Изобретение может быть использовано в фармакологии, медицине и ветеринарии при получении и использовании указанного средства.

Живица, полученная из пихты сибирской (Abies sibirica Led.), представляет собой многокомпонентную смесь биологически активных веществ, содержит природный набор терпеноидов, синтезируемый эпителиальными клетками этого хвойного дерева.

В состав живицы входят так называемые смоляные (резиноловые) кислоты, в основе структуры которых лежит скелет абиетана. Массовая доля смоляных кислот в живице составляет 40-65%. Наряду с кислотами присутствуют смоляные спирты (резинолы), дитерпеновые углеводороды (резены), сесквитерпеновые углеводороды, а также монотерпеновые углеводороды (20-35%). Таким образом, живица представляет собой типичный растительный бальзам, где смолы (дитерпеноиды) растворены в эфирном масле (монотерпеновых углеводородах). Основными смоляными кислотами живицы являются левопимаровая и декстропимаровая. При переработке живицы, когда из нее отгоняют монотерпеновые углеводороды, указанные кислоты в результате нагревания в значительной мере изомеризуются, превращаясь в абиетиновую кислоту.

Известно, что живица обладает противовоспалительным, ранозаживляющим, антибактериальным, иммуномодулирующим и противоопухолевым действием.

На основе живицы создан лекарственный препарат Абисил® (Abisil - 20% solutio oleose), представляющий собой многокомпонентную смесь биологически активных веществ, полученных из пихты сибирской (Abies sibirica Led.). Препарат содержит природный набор терпеноидов, синтезируемый эпителиальными клетками этого хвойного дерева, с содержанием борнилацетата 10,0% - 20,0 г, вспомогательным веществом маслом подсолнечника - до 100,0 г. Лекарственный препарат выпускается фармацевтической промышленностью (Регистрационный номер: PN 003339/02), рекомендован к применению в качестве противовоспалительного средства. Оказывает выраженное противовоспалительное, ранозаживляющее, антибактериальное, обезболивающее, антиэкссудативное действие, обусловленное свойствами природных терпеноидов, входящих в его состав. Обладает широким спектром противомикробной активности в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе и к антибиотикоустойчивым штаммам. Создает оптимальные условия для заживления раневой поверхности мягких тканей, ускоряет процесс эпителизации, улучшает микроциркуляцию. Применение препарата способствует быстрому восстановлению сил после травм, инсультов, последствий длительного лечения химиопрепаратами онкобольных [https://initium-pharm.com/abisil/,2019].

Описано [RU 2198653 C1, 20.02.2003] применение препарата Абисил в качестве действующего вещества (Абисил - 10,0-20,0 мас. %, липофильная основа - 90,0-80,0 мас. %) лекарственного средства в форме суппозиториев, обладающего противовоспалительным, ранозаживляющим, антибактериальным, иммуномодулирующим и противоопухолевым действием и предлагаемого для лечения и/или профилактики урологических, проктологических и гинекологических заболеваний.

Известна композиция [RU 2054945 C1, 27.02.1996] на основе растительного компонента пихты сибирской Abies sibiricus Zedebur - АБИСИЛ-1, состоящая из следующих компонентов, в соотношении мас. %: капсульного экстракта пихты сибирской - 19,0-20,0; монотерпеновых соединений эфирных масел - 0,02-0,20 и растительное масло - остальное, обладающая противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью, которая рекомендована для наружного применения (Рег. Удостоверение 95/351/6 и ФС 42-3869-99).

В патенте [RU 2061491 C1, 10.06.1996] раскрыт способ получения водного экстракта хвои пихты сибирской (АБИСИБ), повышающего резистентность организма, для которого обнаружено свойство стимулировать систему кроветворения и снимать воспалительные явления при заболеваниях верхних дыхательных путей, и который также эффективен в комплексном лечении туберкулеза [RU 2050855 C1, 27.12.1995].

АБИСИБ также предложено использовать [RU 2104020 C1, 10.02.1998] в качестве средства, оказывающего ингибирующий эффект на рост и метастазирование перевиваемых опухолей и тормозящего развитие химически-индуцированных опухолей.

Заявлено средство [PCT/RU 2008/000147, 14.03.2008] для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции ангиогенеза, в частности, к способу лечения онкологических заболеваний различного генеза, путем индукции ингибирования ангиогенеза на фоне прямого противоопухолевого, антирецидивного и антиметастатического воздействий, а также сопутствующей активации эндогенной системы апоптоза - Абисилин. Средство является новой пероральной формой, в которой активными ингредиентами являются терпены (изопреноиды) из хвойных деревьев семейства сосновых.

В приведенных патентных документах описано противовоспалительное, ранозаживляющее, антибактериальное, иммуномодулирующее и противоопухолевое действие препаратов на основе смолы Abies sibirica, экспериментально доказана их способность не только тормозить рост опухолей, но и оказывать прямой лечебный эффект [RU 2054945 C1, 27.02.1996; RU 2198653 C1, 20.02.2003; PCT/RU 2008/000147 14.03.2008], что повышает перспективность исследований в данном направлении.

Таким образом, анализ литературных данных показывает широкое применение смолы Abies sibirica, но большинство описанных средств труднорастворимы или не растворимы в воде, что снижает возможности их использования в качестве фармакологических средств. Кроме того, не была изучена способность лекарственных средств на основе смолы Abies sibirica проникать в центральную нервную систему (ЦНС).

Возможность получения новой формы фармацевтического препарата, биологически активным веществом которого является смола Abies sibirica, с функцией направленной доставки активного вещества в мозг, на сегодняшний день является актуальной и востребованной.

Техническая проблема, решаемая заявляемым изобретением, заключается в повышении биодоступности смолы Abies sibirica, а именно в создании водорастворимого средства, содержащего смолу Abies sibirica, позволяющего неинвазивно проникать в ЦНС и одновременно обладающего фармакологической активностью, расширяющего арсенал лекарственных средств, содержащих смолу Abies sibirica.

Технический результат, который может быть получен при реализации заявленного решения, заключается в обеспечении новых свойств смолы Abies sibirica, таких как проникать в ЦНС при интраназальном введении, одновременно проявляя in vitro антиоксидантные свойства и цитотоксическую активность в отношении раковых клеток шейки матки М-Hela, за счет создания новой формы ее доставки, а именно, липосомальной водорастворимой формы смолы Abies sibirica.

Создание новых поколений лекарственных средств - одна из важнейших научных и социальных проблем, для решения которой необходимо проведение междисциплинарных исследований в различных областях химии, биологии, медицины. С учетом возрастающих требований к уровню эффективности и безопасности лекарств в качестве отдельной важной задачи предполагается разработка инновационных систем их доставки. Использование наноконтейнеров позволяет решать проблемы их низкой растворимости в воде, биодоступности, защиты от биодеградации, длительной циркуляции в организме, преодоления биологических барьеров, адресной доставки, снижения токсичности, побочных эффектов и пр. В настоящее время интенсивно развивается направления исследований, связанных с созданием систем доставки (наноконтейнеров) для лекарственных средств: наноконтейнеры на основе амфифильных соединений (липидные формулировки), полимерные системы и минеральные носители. Липидные формулировки (мицеллярные наноконтейнеры, микро- и наноэмульсии, липосомы, твердые липидные наночастицы) обладают высокой эффективностью и в настоящее время широко представлены в научной литературе. Наиболее широко исследованным типом липидных формулировок является липосомальная форма. Липосомы - это неравновесные системы, состоящие из одного или нескольких фосфолипидных бислоев, разделенных водной фазой. Диаметр липосом может колебаться от 25 до 10000 нм.

Техническая проблема решается, и технический результат достигается заявленной новой водорастворимой формой - липосомальной формой смолы (живицы) Abies sibirica, представляющей собой фосфолипидную мембрану с включением в нее природной смолы (живицы) Abies sibirica в количестве до 1% масс.

Техническая проблема также решается, и технический результат достигается заявляемым способом получения липосомальной формы смолы Abies sibirica в качестве действующего вещества, включающим простое смешивание 0,55 г фосфолипида, 0,03 г холестерина, 0,04 г ПЭГилирующего агента - до 6% масс., и действующего вещества - смолы Abies sibirica – до 1% масс., в подходящем растворителе, испарение растворителя при температуре выше фазового перехода фосфолипида с получением однородной липидной пленки, ее регидратацию в подходящей среде (до 100% масс.) при перемешивании и постоянной температуре выше фазового перехода фосфолипида, и последующим диспергированием частиц до размера порядка 100 нм с применением известных методов, таких как, например, ультразвуковая диспергация, или многократная экструзия полученного раствора через мембраны с диаметром пор 100 нм.

Липосомальная форма представляет собой ПЭГ-модифицированные липосомы (стелс-липосомы), которые как таковые не являются новыми, известны из уровня техники [T.N. Pashirova, N.A. Zhukova, S.S. Lukashenko, F.G. Valeeva, E.A. Burilova, A.S. Sapunova, A.D. Voloshina, A.B. Mirgorodskaya, L.Y. Zakharova, O.G. Sinyashin, V.A. Mamedov, Multi-targeted approach by 2-benzimidazolylquinoxalines-loaded cationic arginine liposomes against cervical cancer cells in vitro, Colloids Surf В Biointerfaces. 178 (2019) 317-328; A. Gabizon, D. Papahadjopoulos, Liposome formulations with prolonged circulation time in blood and enhanced uptake by tumors, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (18) (1988) 6949-6953; A.L. Klibanov, K. Maruyama, V.P. Torchilin, L. Huang, Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes, FEBS Lett. 268 (1990) 235-237; V.P. Krasnov, M.A. Koroleva, E.L. Vodovozova, Nano-sized melphalan and sarcolysine drug delivery systems: synthesis and prospects of application, Russ. Chem. Rev 82 (2013) 783-814; T.M. Allen, C. Hansen, F. Martin, C. Redemann, A. Yau-Young, Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo, Biochim. Biophys. Acta 1066 (1991) 29-36, D. Paolino, M.L. Accolla, F. Cilurzo, M.C. Cristiano, D. Cosco, F. Castelli, M.G. Sarpietro, M. Fresta, C. Celia, Interaction between PEG lipid and DSPE/DSPC phospholipids: an insight of PEGylation degree and kinetics of de-PEGylation, Colloids Surf. В Biointerfaces 155 (2017) 266-275; R. Pignatello, A. Leonardi, R. Pellitteri, C. Carbone, S. Caggia, A.C.E. Graziano, V. Cardile, Evaluation of new amphiphilic PEG derivatives for preparing stealth lipid nanoparticles, Colloids Surf. A Physicochem. Eng. Asp. 434 (2013) 136-144, T. Nakamura, Y. Noma, Y. Sakurai, H. Harashima, Modifying cationic liposomes with cholesteryl-PEG prevents their aggregation in human urine and enhances cellular uptake by bladder cancer cells, Biol. Pharm. Bull. 40 (2) (2017) 234-237; V. Awasthi, Surface engineering of liposomes for stealth behavior, Pharmaceutics 5 (4) (2013) 542-569] и выбраны в качестве носителей для создания водорастворимой формы смолы Abies sibirica в силу своих свойств - являются нетоксичными, идеально биосовместимыми, хорошо адаптируются к различным типам лекарственных веществ и способам введения (в том числе интраназальному), не захватываются ретикуло-эндотелиальной системой вследствие ПЭГилирования и способны преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Липосомальная форма смолы Abies sibirica из уровня техники не известна.

В качестве фосфолипида могут быть использованы L-α-фосфатидилхолин сои, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин или их смеси;

в качестве ПЭГилирующего агента - поли(этиленгликоль-2000)стеарат, или (1,2-дистеароил-SN-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония));

в качестве полициклического липофильного агента - холестерин;

в качестве подходящего растворителя - хлороформ, метанол, этанол, этиловый эфир или их смеси.

Регидратация липидной пленки может быть осуществлена по методу Бенгхема [A.D. Bangham, М.М. Standish, J.С. Watkins, Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids, J. Mol. Biol., 1965, 13, 238-252].

Средой регидратации могут являться, например, ультра-очищенная (деионизированная) вода или любой буферный, физиологический раствор.

Диспергирование может быть осуществлено, например, многократной экструзией полученного липосомального раствора через поликарбонатные мембраны с фиксированным диаметром пор (миниэкструдер, Extrusion Technique, Avanti Polar Lipids, Inc. или экструдер LiposoFast LF-50, Avestin) или с применением диспергации с помощью любого ультразвукового гомогенизатора, например, типа Sonopuls (Bandelin-Electronic, Germany).

Липосомальная форма смолы Abies sibirica может быть использована в виде раствора, в предпочтительном варианте растворителем в котором является физиологический раствор, например, при интраназальном или инъекционном введении. Для хранения предпочтительно использовать созданную липосомальную форму в виде лиофилизированного порошка, для чего после стадии диспергирования липосомальную форму смолы Abies sibirica подвергают сушке и стерилизации известными методами.

Концентрация смолы Abies sibirica (живицы) в созданной липосомальной форме составляет до 1.0% масс. Последующее увеличение концентрации может приводить к увеличению вязкости системы.

Состав используемого активного агента заявляемого средства - смолы Abies sibirica (живицы) из Прибайкальского региона - подтвержден полуколичественным методом газового хромато-масс-спектрометрического анализа (ГХ-МС) на приборе GCMS 2010 Plus Shimadzu (Япония, 2012 года выпуска, s/n O20524976051 US). Идентификация компонентов проводилась с использованием библиотеки масс-спектров NIST-11, включающей 212961 индивидуальных соединений, и проведением количественного анализа абиетиновый кислоты (Производство ACROS, США, Нью-Джерси (www.acros.com); Code: 173130250, Lot: А0355613). Использовалась неполярная колонка SLB-5ms, длина - 30 м, диаметр - 0.32 мм, толщина слоя фазы 0.32 мкм. Газ-носитель - гелий. Условия получения хроматограммы: Температура инжектора - 320°С; Скорость газа-носителя в колонке - 1.83 мл/мин; давление - 20.0 кПа; Split - 1:5; начальная температура колонки - 30°С (3 мин), скорость нагрева термостата 10°С/мин до 200°С (10 мин), далее 50°С/мин до 320°С (30 мин). В инжектор вводили 1 мкл образца при нормальных условиях. Время анализа: 62 минуты. Пробоподготовка: Образец предварительно растворяли в изопропаноле 1:100. Состав используемого активного агента заявляемого средства - смолы Abies sibirica (живицы) представлен в таблице 1. Растительный материал (живица Abies sibirica) был собран методом подсочки в Прибайкальском регионе Российской Федерации в октябре 2017 года и без предварительной очистки охарактеризован в Коллективном спектро-аналитическом Центре изучения строения, состава и свойств веществ и материалов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра «Казанского научного центра Российской академии наук» (ЦКП-САЦ ФИЦ КазНЦ РАН).

Эффективность инкапсуляции и загрузки смолы Abies sibirica в заявляемой липосомальной форме, определенные с помощью метода центрифугирования, составляют 73±7% и 13±1%, соответственно.

Характеристики заявленной новой липосомальной формы смолы Abies sibirica, на примере липосомальной формы, где в качестве ПЭГилирующего агента использован поли(этиленгликоль-2000)стеарат, а именно гидродинамический диаметр (Diam, нм), усредненный по числу частиц (Diam_N), объему (Diam_V) и интенсивности (Diam_Int), а также средний диаметр частиц (Z-Aver, нм), полидисперсный индекс (PdI) и дзета-потенциал (ZP, мВ) (среднее значение ± стандартное отклонение) приведены в таблице 2. Размеры (Diam, нм), полидисперсный индекс (PdI) и дзета-потенциал (ZP, мВ) определяли с помощью метода динамического рассеяния света с использованием системы для характеристики наночастиц Malvern Zetasizer Nano (Великобритания), угол рассеяния света составлял 173°. Источником лазерного излучения служил газовый Не-Ne-лазер с длиной волны 633 нм. Значение дзета-потенциала определяли в том случае, когда средой приготовления была очищенная и деионизированная вода, полученная с помощью установки Direct-Q 5 UV (Millipore S.A.S. 67120 Molsheim-France).

Для липосомальной формы, содержащей 1.0% масс. смолы Abies sibirica, средой приготовления которой является ультра-очищенная (деионизированная) вода, Diam_N составляет 91±1 нм, Diam_V=122±1 нм, Diam_Int=122±1 нм, Z-Aver=127±1 нм, PdI - 0.12±0.02 и ZP - -19.4±1 мВ, для липосомальной формы, содержащей 1.0% масс. смолы Abies sibirica, средой приготовления которой является физиологический раствор, Diam_N=79±1 нм, Diam_V=142±2 нм, Diam_Int=164±2 нм, Z-Aver=166±2 нм, PdI - 0.2±0.02, и для липосомальной формы, содержащей 0.5% масс. смолы Abies sibirica, средой приготовления которой является физиологический раствор, Diam_N=91±3 нм, Diam_V=122±2 нм, Diam_Int=142±2 нм, Z-Aver=141±1 нм, PdI - 0.1±0.01.

Оценка высвобождения и растворения смолы Abies sibirica из липосомальной формы проведена методом диффузии (диализа), в качестве среды для растворения использован фосфатный буфер (0,025 М), содержащий метанол (50% об.), рН=7.4, 37°С, диализный мешок (Dialysis sacks, Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), Sigma-Aldrich), анализ образцов был проведен трехкратно; контроль за высвобождением осуществляли с помощью метода оптической спектроскопии на спектрофотометре Specord 250 Plus (Analytik Jena AG, Германия), максимум поглощения λ_max=243 нм. Высвобождение смолы Abies sibirica из липосом в условиях in vitro происходит очень медленно, продолжительностью более 100 часов.

Для заявляемой водорастворимой липосомальной формы смолы Abies sibirica обнаружено, что она обладает:

- функцией направленной доставки биологически активного вещества в мозг, что было подтверждено методом флуоресцентной микроскопии [N.S. White, R.J. Errington, Fluorescence techniques for drug delivery research: theory and practice, Adv Drug Deliv Rev. 2005 57(1) 17-42; Z.H. Wang, Z.Y. Wang, C.S. Sun, C.Y. Wang, T.Y. Jiang, S.L. Wang, Trimethylated chitosan-conjugated PLGA nanoparticles for the delivery of drugs to the brain, Biomaterials. 2010 31(5) 908-15; T.N. Pashirova, I.V. Zueva, K.A. Petrov, V.M. Babaev, S.S. Lukashenko, I.K. Rizvanov, E.B. Souto, E.E. Nikolsky, L.Y. Zakharova, P. Masson, O.G. Sinyashin, Nanoparticle-delivered 2-PAM for rat brain protection against paraoxon central toxicity, ACS Appl. Mater. Interfaces. 9 (2017) 16922-16932];

- высокой цитотоксической противоопухолевой активностью, исследования были проведены в отношении раковых клеток М-Hela клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки (из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия);

- менее токсичны в отношении нормальных клеток печени человека Chang liver (из коллекции НИИ вирусологии РАМН);

- антиоксидантными свойствами, что подтверждено хемилюминесцентным методом [Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Y.A., Determination of antioxidants by sensitized chemiluminescence using 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane), Moscow Univ Chem Bull. 2012; 67(3): 127-132; Krasowska A., Rosiak D., Szkapiak K., Lukaszewicz M., Chemiluminescence detection of peroxyl and comparison of antioxidant activity of phenolic compounds, Curr Top Biophis. 2000; 24(2): 89-95].

Как видно из таблицы 1, в составе смолы Abietic sibirica 59,8% приходится на абиетиновую кислоту - 13-изопропилподокарпа-7,13-диен-15-овую кислоту - наиболее известную из смоляных кислот, входящую в состав смолы хвойных, основной компонент канифоли и янтаря. Ее относят к дитерпеновой трициклической группе природных соединений (соединения, полученные из четырех изопреновых фрагментов). Абиетиновая кислота [F.J. Aranda, J. , The interaction of abietic acid with phospholipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta 1327, 1997, 171-180], терпеновые кислоты [V. Jagalski, R. Barker, D. Topgaard, et al. Biophysical study of resin acid effects on phospholipid membrane structure and properties, Biochimica et Biophysica Acta 1858 (2016) 2827-2838] и другие терпены [Witzke S., Duelund L., Kongsted J., et al. Inclusion of terpenoid plant extracts in lipid bilayers investigated by molecular dynamics simulations, J Phys Chem B. 2010, 114(48): 15825-31] оказывают существенное влияние на структурные и полиморфные свойства природных мембранных фосфолипидов, влияя на функциональные свойства биологических мембран.

В связи с этим в качестве систем сравнения аналогично заявленному способу были получены следующие липосомальные формы: липосомальная форма без загрузки смолы Abies sibirica активного вещества (пустая липосомальная форма), липосомальная форма, содержащая абиетиновую кислоту (до 1% масс.) (85%, Acros Organics, Lot Number A0355613), липосомальная форма, содержащая смолу Abies sibirica (до 1% масс.) и липосомальная форма, содержащая смолу Abies sibirica (до 1% масс.) и флуоресцентный краситель (кумарин-6) (≥99%, Sigma-Aldrich, CAS Number 38215-36-0) (до 0,02% масс.).

Характеристики систем сравнения представлены в таблице 2. Размер липосомальных форм составляет около 100 нм. Размеры липосомальных форм увеличиваются на 20%, если в качестве среды приготовления использовать физиологический раствор (0.9% раствор хлорида натрия). Значение дзета-потенциала смещается к более отрицательным значениям от -10 мВ (пустая липосомальная форма) до -19 мВ (липосомальная форма, содержащая смолу Abies sibirica). В случае липосомальной формы, содержащей абиетиновую кислоту, дзета-потенциал составляет -6 мВ. Вероятно, различие в значениях дзета-потенциала липосомальной формы смолы Abies sibirica, и липосомальной формы, содержащей абиетиновую кислоту, может свидетельствовать об их различном интегрировании в мембрану липосом.

Изобретение иллюстрируется примерами получения заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica, и исследования ее свойств - антиоксидантной активности (in vitro), цитотоксичности в отношении раковых клеток шейки матки M-Hela (in vitro), и способности проникать в ЦНС (in vivo).

Пример 1.

Получение липосомальной формы смолы Abies sibirica (1% масс.)

Липосомальную форму смолы Abies sibirica получают взаимодействием 0.55 г L-α-фосфатидилхолина (95%, Soy, Avanti Polar Lipids, Inc.), 0.03 г холестерина (Sigma Grade, ≥99%), 0.04 г поли(этиленгликоль-2000) стеарата (синтезирован по методике [T.N. Pashirova, E.A. Burilova, S.S. Lukashenko, O.A. Lenina, V.V. Zobov, A.R. Khamatgalimov, V.I. Kovalenko, L.Ya. Zakharova, O.G. Sinyashin, Synthesis, self-association, and solubilizing ability of an amphiphilic derivative of poly(ethylene glycol)methyl ether, Russ. J. Gen. Chem. 87 (2017) 2832-2837]) и 0.1 г смолы Abies sibirica, для чего необходимое количество указанных веществ смешивают и растворяют в 3 мл этилового спирта (absolute Sigma-Aldrich, CAS Number 64-17-5). Полученный гомогенный раствор выдерживают на водяной бане при 60°С до полного испарения спирта и получения однородной липидной пленки. Далее проводят регидратацию липидной пленки в присутствии ультра-очищенной воды (Milli-Q, Direct-Q5 UV) до 100% масс, при 60°С. Полученный раствор перемешивают в течение 30 минут на магнитной мешалке Heidolph MR Hei-End (Heidolph Instruments, Germany) со скоростью перемешивания 750 об/мин при 60°С. Далее раствор выдерживают в течение 1.5 часов при температуре 37°С, после чего раствор подвергают экструзии (20 раз) через две поликарбонатные мембраны (диаметр пор 100 нм, Mini-Extruder Extrusion Technique). Выход 10 г (100%). Гидродинамический диаметр Diam_N составляет - 91±1 нм, Diam_V=122±1 нм, Diam_Int=122±1 нм, Z-Aver=127±1 нм, полидисперсный индекс (PdI) - 0.12±0.02 и дзета-потенциал (ZP) - -19.4±1 мВ.

Пример 2.

Получение липосомальной формы смолы Abies sibirica (0,5% масс.)

Липосомальную форму смолы Abies sibirica получают аналогично примеру 1, однако в качестве фосфолипида используют 0.55 г дистеароилфосфатидил-холина (Lipoid или Avanti Polar Lipids, Inc.), в качестве ПЭГлирующего агента - 0.04 г (1,2-дистеароил-SN-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония)) (Lipoid), в качестве подходящего растворителя - 3 мл хлороформа (anhydrous, ≥99%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer, Sigma-Aldrich, CAS Number 67-66-3), добавляют 0.05 г смолы Abies sibirica и регидратацию липидной пленки проводят в присутствии физиологического раствора (0.9% водный раствор хлорида натрия, раствор для инфузий, ОАО Мосфарм) до 100% масс. Выход: 10 г (100%). Diam_N составляет 79±1 нм, Diam_V=122±2 нм, Diam_Int=142±2 нм, Z-Aver=141±1 нм, PdI - 0.2±0.02.

Пример 3.

Оценка эффективности инкапсуляции (ЕЕ,%), загрузки (LC,%) смолы Abies sibirica и оценка высвобождения смолы Abies sibirica из липосомальной формы

Процедуру определения инкапсуляции ЕЕ,% и загрузки LC,% проводят следующим образом: липосомальный раствор, содержащий смолу Abies sibirica или абиетиновую кислоту, объемом 1 мл помещают в пробирку Эппендорфа объемом 2 мл и центрифугируют (Eppendorf AG, Гамбург, Германия) в течение 10 минут при 5000 об./мин для удаления осажденной смолы Abies sibirica или абиетиновой кислоты. Далее липосомальный раствор, содержащий смолу Abies sibirica или абиетиновую кислоту, объемом 25 мкл помещают в новые пробирки Эппендорфа объемом 2 мл и сюда же добавляют 0,5 мл дихлорметана. Затем проводят экстракцию смолы Abies sibirica или абиетиновой кислоты с использованием шейкера (Neutec F202A0176 Model ZX3) при 4000 об./мин в течение 10 минут. Далее растворы (~0,5 мл) центрифугируют (Eppendorf AG, Гамбург, Германия) в течение 6 минут при 5000 об./мин для разделения слоев. Нижний органический слой переносят в колбу и упаривают досуха. Процедуру экстракции смолы Abies sibirica или абиетиновой кислоты повторяют 2 раза. Затем сухой остаток растворяют в 5 мл и 7 мл дихлорметана для смолы Abies sibirica или абиетиновой кислоты соответственно. Измерения эффективности инкапсуляции проводят 3 раза. Загруженную смолу Abies sibirica и абиетиновую кислоту количественно определяют по УФ-поглощению с использованием Specord 250 Plus (Analytik Jena AG, Германия) при 243 (фигура 1) и 244 нм (фигура 2) соответственно. Коэффициенты экстинкции смолы Abies sibirica и абиетиновой кислоты в дихлорметане составляют 9743 и 10196 (М^-1⋅см^-1) (фигуры 3, 4), соответственно. Эффективность инкапсуляции (ЕЕ,%) и загрузки (LC,%) рассчитывают по соответствующей калибровочной кривой (фигуры 3, 4), используя уравнения 1 и 2 [Pashirova T.N., Zhukova N.A., Lukashenko S.S., Valeeva F.G., Burilova E.A., Sapunova A.S., Voloshina A.D., Mirgorodskaya A.B., Zakharova L.Y., Sinyashin O.G., Mamedov V.A., Multi-targeted approach by 2-benzimidazolylquinoxalines-loaded cationic arginine liposomes against cervical cancer cells in vitro, Colloids Surf В Biointerfaces. 2019 178 317-328]:

Эффективность инкапсуляции (EE,%) и загрузки (LC,%) смолы Abies sibirica и абиетиновой кислоты близки по значению. Способность к инкапсуляции и загрузке составляет для Abies sibirica ЕЕ=73±7% и LC=13±1%, соответственно, и для абиетиновой кислоты - ЕЕ=90±7% и LC=16±1%, соответственно.

Высвобождение смолы Abies sibirica проводят в сравнении с абиетиновой кислотой из липосом в условиях in vitro. Оценку высвобождения смолы Abies sibirica из липосомальной формы выполняют методом диффузии (диализа), который является наиболее широко исследованным способом оценки высвобождения и растворения лекарственного вещества из наноразмерных систем in vitro. В этом методе наноразмерная система доставки лекарственного вещества отделена от среды растворения диализной мембраной, проницаемой для свободного лекарственного вещества и непроницаемой для наночастиц, которые размещены внутри специальных диализных мешочков, помещенных в емкость со средой растворения при постоянном перемешивании. Перед использованием диализный мешок (Dialysis sacks, Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), Sigma-Aldrich) вымачивают в ультра-очищенной воде в течение 12 часов. Образец липосомальной формы объемом 0.5 мл помещают в диализный мешок, два конца мешка запечатаны зажимами, мешок помещен в сосуд, содержащий 100 мл среду растворения. Поскольку смола Abies sibirica и абиетиновая кислота нерастворимы в воде, в качестве среды используют смешанный органический растворитель - метанол/фосфатный буфер (50% об.). Сосуд помещают в термостатируемый шейкер (New Brunswick, NJ) при 37°С со скоростью перемешивания 150 об./мин. Образцы отбирают через заданные интервалы времени и анализируют с использованием Specord 250 Plus (Analytik Jena AG, Германия) при 243 нм. Анализ образцов проводят трехкратно. Состав смолы Abies sibirica является многокомпонентным, методом УФ-спектроскопии было проконтролировано высвобождение абиетиновой кислоты. Анализ высвобождения других компонентов системы было затруднено вследствие отсутствия их поглощения в среде растворения.

На фигурах 5 и 6 представлены спектры поглощения смолы Abies sibirica и абиетиновой кислоты и калибровочные прямые при их различных концентрациях (фигуры 7, 8) в среде метанол/фосфатный буфер (50% об.). Наглядно видно, что спектры поглощения в ультрафиолетовой области имеют характерный максимум при 243 нм, который можно отнести к абиетиновой кислоте. Коэффициенты экстинкции смолы Abies sibirica и абиетиновой кислоты в среде метанол/фосфатный буфер (50% об.) при 243 нм, составляют 8080 М^-1⋅см^-1 и 9959 М^-1⋅см^-1, соответственно (фигуры 7 и 8) Профиль высвобождения смолы Abies sibirica и абиетиновой кислоты при 37°С, рН=7.4 при λ_max=243 нм представлен на фигуре 9.

Процесс высвобождения абиетиновой кислоты из липосомальной формы смолы Abies sibirica протекает более 100 часов и значительно медленнее, чем из липосомальной формы, содержащей абиетиновую кислоту, что, вероятно, связано с составом смолы Abies sibirica.

Пример 4.

Гистологический анализ срезов коры головного мозга

Для подтверждения способности липосомальной формы смолы Abies sibirica проходить в ткани головного мозга проводят гистологический анализ срезов коры головного мозга методом флуоресцентной микроскопии для визуализации частиц с флуоресцентным маркером в ткани головного мозга и фармакокинетическое исследование для определения концентрации лекарственного вещества в мозге. Флуоресцентная микроскопия предоставляет комплексный инструмент для изучения аспектов адресной доставки лекарств в отдельные клетки или цельные ткани. Для проведения данного исследования была получена липосомальная форма, содержащая смолу Abies sibirica (до 1% масс.) и флуоресцентный краситель (кумарин-6) (0,02% масс.), способом, аналогичным заявленному способу получения целевой липосомальной формы по примеру 1. Размер липосомальной формы с флуоресцентным красителем кумарин-6 составляет около 100 нм (Таблица 2). Дзета-потенциал липосом слегка увеличивается от -10 мВ (пустая липосомальная форма) до -14 мВ в присутствии кумарина-6. В исследовании используют крыс-самцов линии Wistar (240-250 г), полученных из питомника лабораторных животных «Пущино» (Пущино, Московская область).

Каждой крысе однократно интраназально вводят липосомальную форму, содержащую смолу Abies sibirica (до 1% масс.) и флуоресцентный краситель (кумарин-6) (0,02% масс.), в объеме 0,2 мл в каждый носовой ход (доза смолы Abies sibirica составляет 10 мг/кг, доза кумарина-6 - 0,4 мг/кг). В качестве контроля в отношении фоновой флуоресценции используют животных без введения липосомальной формы. Через 45 минут после интраназального введения животных анестезируют, мозг изымают, замораживают в жидком азоте и хранят при температуре -80°С. Замороженную ткань перемещают в морозильную камеру при -20°С за 24 часа до анализа срезов. Ткани мозга разрезают на срезы диаметром 10 мкм с использованием микротома Sakura tissues-tek Cryo3 (Sakura Finetek, США). Анализ срезов коры головного мозга проводят с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия), фильтр CY3 для возбуждения флуоресценции при 470 нм; эмиссия 510 нм. Микрофотографии были сделаны с использованием программы Leica LAS AF. У животных, которым интраназально вводили меченые кумарином липосомальные формы, в головном мозге наблюдают яркие флуоресцентные частицы (фигура 10), что свидетельствует о потенциальной возможности липосомальной формы проникать в ЦНС.

Пример 5.

Фармакокинетическое исследование

Для подтверждения способности липосомальной формы смолы Abies sibirica проникать в ткани головного мозга проводят фармакокинетическое исследование для определения концентрации лекарственного вещества в мозге. Эксперимент включает в себя 6 групп животных, по 5 животных в группе, итого 30 крыс. Каждой крысе однократно интраназально вводят липосомальную форму смолы Abies sibirica (до 1% масс.), в объеме 0,2 мл в каждый носовой ход (доза смолы Abies sibirica составляет 10 мг/кг). Через временные промежутки (15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 120 мин, 180 мин) после введения липосомальной формы смолы Abies sibirica крыс умерщвляют посредством цервикальной дислокации, головной мозг изымают, замораживают в жидком азоте и хранят при температуре -80°С.

Измерение концентрации смолы Abies sibirica в гомогенате мозга лабораторных животных проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением масс-спектрометрического детектирования с химической ионизацией при атмосферном давлении. В качестве репера для обнаружения липосомальной формы смолы Abies sibirica в гомогенате мозга с использованием масс-спектрометра AmazonX (BrukerDaltonics, Германия) используют абиетиновую (неоабиетиновую) кислоту, так как она является основным компонентом смолы Abies sibirica.

Процедуру экстракции абиетиновой кислоты из ткани мозга проводят следующим образом: образцы мозга взвешивают и гомогенизируют в девятикратной аликвоте физиологического раствора (0.9% водный раствор хлорида натрия, раствор для инфузий, ОАО Мосфарм) на ледяной бане с помощью гомогенизатора (Ultra-Turax Т-18, IKA). 500 мкл гомогената мозга переносят в пробирки Эппендорфа объемом 2 мл. 1 мл хлористого метилена добавляют к каждому образцу гомогената мозга и перемешивают с использованием шейкера (Neutec F202A0176 Model ZX3 Advanced Vortex Mixer, VELP Scientifica, Италия) при 4000 об./мин в течение 10 мин. Затем смесь центрифугируют в центрифуге (Eppendorf AG, Гамбург, Германия) в течение 6 минут при 5000 об./мин для разделения слоев. Нижний органический слой переносят в колбу и упаривают досуха. Процедуру экстракции абиетиновой кислоты проводят 2 раза. Затем сухой остаток растворяют в 1 мл хлористого метилена и центрифугируют при 12000 об./мин в течение 2 минут. Далее аликвоту абиетиновой кислоты в хлористом метилене (100 мкл) разбавляют в растворе метанол-вода (70:30, объем/объем, 900 мкл). Для введения образцов используют систему высокоэффективной жидкостной хроматографии серии Agilent HPLC 1200 (Agilent Technologies, США), оснащенную бинарным насосом, вакуумным дегазатором и автосамплером. Аликвоты пробы для анализа составляют 20 мкл. Анализ проводят с использованием изократической подвижной фазы, состоящей из метанола и воды (70:30, объем/объем), перекачиваемых с постоянной скоростью потока 0.6 мл/мин. Масс-спектрометрический анализ проводят в режиме регистрации положительных ионов, в ионоселективном режиме по иону m/z 257, являющемуся фрагментным ионом протонированной молекулы абиетиновой/неоабиетиновой кислот (m/z 303). Оптимизированными рабочими параметрами для масс-спектрометрического анализа были: температура газа-осушителя - 250°С; скорость потока газа-осушителя - 3 л/мин; температура испарителя - 400°С, напряжение на капилляре - 4 кВ; коронный разряд - 5000 нА. На фигуре 11 показаны хроматограммы по фрагментному иону m/z 257 образцов гомогената мозга и масс-спектр фрагментации протонированной молекулы абиетиновой кислоты. Аналитические данные обрабатывают с использованием программного обеспечения Bruker Daltonics. Калибровочные кривые получают путем построения графика площади пика аналита (иона m/z 257) в зависимости от номинальной концентрации смолы Abies sibirica в гомогенате мозга.

На фигуре 12 показана зависимость содержания абиетиновой кислоты в гомогенате мозга в течение времени после однократного интраназального введения липосомальной формы смолы Abies sibirica в дозе 10 мг/кг. Каждая точка представляет среднее значение ±SD для пяти крыс. Из фигуры 12 видно, что наблюдается тенденция снижения концентрации абиетиновой кислоты до 100 нг/мл в течение 30 минут и затем остается на уровне 100 нг/мл в течение 3 часов. Таким образом установлено, что липосомальная форма смолы Abies sibirica проникает в ЦНС после ее однократного интраназального введения.

Пример 6.

Оценка антиоксидантных свойств заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica

Оценку in vitro антиоксидантных свойств заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica, проводят в сравнении с препаратом Абисил® (Инитиум-Фарм, Россия), для которого антиоксидантные свойства известны [http://vskmjournal.org/images/Files/Issues_Archive/2017/Issue_2/VSKM_2017_N_2_p34-39.pdf, Essential oils of aromatic plants with antibacterial, antifungal, antiviral, and cytotoxic properties-an overview / J. Reichling, P. Schnitzler, U. Suschke, R. Salier // Forsch Komplementmed. - 2009. - Vol. 16. No 2. - P. 79-90]. Абисил® представляет собой 20%-ный масляный раствор комплекса терпеноидов, полученных из экстракта Abies sibirica семейства сосновых, обогащенный монотерпеноидами. Абисил® охарактеризован газожидкостной хроматографией [Kudryavtseva A., Krasnov G., Lipatova А., Alekseev В., Maganova F., Shaposhnikov M., Fedorova M., Snezhkina A., Moskalev A. Effects of Abies sibirica terpenes on cancer- and aging-associated pathways in human cells. Oncotarget. 2016 7(50) 83744-83754].

Оценку антиоксидантных свойств заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica и препарата сравнения проводят по методике [Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Y.A., Determination of antioxidants by sensitized chemiluminescence using 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane), Moscow Univ Chem Bull. 2012; 67(3): 127-132; Krasowska A., Rosiak D., Szkapiak K., Lukaszewicz M., Chemiluminescence detection of peroxyl and comparison of antioxidant activity of phenolic compounds, Curr Top Biophis. 2000; 24(2): 89-95] с использованием хемилюминометра Lum-100 (ООО «ДИСофт», Россия) на модели 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорида (АВАР, 98%, ACROS Organics)) и 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона (люминола (LM), 98%, Alfa Aesar).

Антиоксидантные свойства оценивают по способности взаимодействовать со свободными радикалами, образующимися в реакционной системе, содержащими АВАР и LM. Раствор LM (0.001 М) готовили растворением LM в 0.1 М NaOH растворе. Непосредственно перед анализом исходный раствор LM разбавляют в 4 раза ультра-очищенной водой. В кювету, содержащую 1 мл реакционной смеси АВАР (100 мкл 0.04 М водного раствора), 400 мкл раствора LM и 500 мкл 0.5 М трис-буфера (Fisher Chemical) рН 8.6 добавляют 10 мкл растворов сравниваемых препаратов. После добавления веществ интенсивность хемилюминесценции регистрируют в течение 1000 секунд при постоянной температуре 30°С. Результаты выражены в % относительно исходного уровня хемилюминесценции (базовой линии).

Так как Абисил® не растворим в воде, то для получения 1% масс. раствора используют органический растворитель диметилсульфоксид (ДМСО). Липосомальную форму смолы Abies sibirica (1% масс.) и раствор Абисил® (1% масс.) вносят в хемилюминесцентную систему и исследуют способность взаимодействовать со свободными радикалами вышеописанным методом. Результаты исследования представлены на фигуре 13. Из полученных результатов следует, что антиоксидантные свойства липосомальной формы смолы Abies Sibirica более выражены, так как при взаимодействии со свободными радикалами наблюдают более выраженное снижение интенсивности хемилюминесценции (максимальное снижение до 17% от исходного уровня). В случае раствора препарата Абисил® (1% масс.), максимальное снижение хемилюминесценции достигало лишь 25%. Более того, для липосомальной формы смолы Abies sibirica (1% масс.), отмечают более быстрое взаимодействие со свободными радикалами, о чем свидетельствует максимальное снижение линии изменения хемилюминесценции сразу после введения вещества. Для раствора Абисил® падение интенсивности хемилюминесценции в ответ на введение вещества наблюдают лишь до 60%, а максимальное снижение до 25% - лишь по истечении 80-100 секунд.

Пример 7.

Оценка цитотоксичности заявляемой липосомольной формы смолы Abies sibirica в отношении раковых клеток

Оценку цитотоксичности в отношении раковых клеток in vitro заявляемого средства проводят в отношении клеток опухолевой линии М-Hela (рак шейки матки) по методике [Pashirova T.N., Zhukova N.A., Lukashenko S.S., Valeeva F.G., Burilova E.A., Sapunova A.S., Voloshina A.D., Mirgorodskaya A.B., Zakharova L.Y., Sinyashin O.G., Mamedov V.A., Multi-targeted approach by 2-benzimidazolylquinoxalines-loaded cationic arginine liposomes against cervical cancer cells in vitro, Colloids Surf В Biointerfaces. 2019, 178, 317-328] с использованием эквивалентных растворов (1% масс.) - формы, содержащей смолу Abies Sibirica, абиетиновую кислоту, препарата Абисил® (Инитиум-Фарм, Россия), абиетиновой кислоты в водном этиловом спирте. Известно, что абиетиновая кислота проявляет высокую противоопухолевую активность в отношении клеток меланомы, и улучшает эффективность противоопухолевого препарата таксол [Hsieh Y.S., Yang S.F., Hsieh Y.H., Hung C.H., Chu S.C., Yang S.H., Chen P.N., The Inhibitory Effect of Abietic Acid on Melanoma Cancer Metastasis and Invasiveness In vitro and In vivo, Am J Chin Med. 2015; 43(8): 1697-1714]. Экспериментально доказана способность препарата Абисил® не только тормозить рост опухолей, но и оказывать прямой лечебный эффект [RU 2054945 C1, 27.02.1996; RU 2198653 C1, 20.02.2003; PCT/RU 2008/000147 14.03.2008]. Поэтому в качестве систем сравнения (эталонов) были выбраны абиетиновая кислота в водном этаноле, препарат Абисил®, а также липосомальная форма, содержащая абиетиновую кислоту, метанольные экстракты природных соединений - мяты болотной, тимьяна обыкновенного, и синтетический препарат сравнения Тамоксифен. Данные заявляемого средства по цитотоксичности в отношении раковых клеток опухолевой линии М-Hela (рак шейки матки) in vitro также сравнивают с данными по цитотоксичности таких природных соединений, как Mentha pulegium Thymus vulgaris L (мята болотная) (метанольный экстракт) и Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) (метанольный экстракт), и известным препаратом Тамоксифен (SIGMA), применяемым для лечения рака молочной железы, который в зарубежных научных публикациях часто используют в качестве препарата сравнения. В [R.R. Sharipova, M.G. Belenok, B.F. Garifullin, A.S. Sapunova, A.D. Voloshina, O.V. Andreeva, I.Yu. Strobykina, P.V. Skvortsova, Y.F. Zuev, V.E. Kataeva Synthesis and anti-cancer activities of glycosides and glycoconjugates of diterpenoid isosteviol // Med. Chem. Commun., 2019, 10, 1488-1498] приводятся данные по Тамоксифену в отношении клеток М-Hela.

Определение цитотоксического действия проводят при помощи многофункциональной системы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), используя приложение Cell Viability BioApp, на основании интенсивности флуоресценции. Эксперименты проводят на опухолевой культуре клеток М-Hela клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки, сублиния Hela, клон М-Hela) и культуре нормальных клеток печени (Chang liver) из Коллекции Института цитологии РАН. Для культивирования клеток используют стандартную питательную среду «Игла» производства Московского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова фирмы «ПанЭко» с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот. Клетки рассевают на 96-луночную панель фирмы «Eppendorf» в концентрации 100 тыс. кл/мл в каждую лунку в объеме 100 мкл среды и культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°С. Через 24 часа после посадки клеток в лунки культуральную среду отбирают и в лунки вносят по 150 мкл растворов исследуемых соединений в заданных разведениях. Растворы исследуемых веществ готовят непосредственно в ростовой питательной среде. Для исследованных систем представлены значения концентрации IC₅₀, при которой погибает 50% жизнеспособных клеток. Для сравнения проводят оценку цитотоксичности нормальных клеток печени (Chang liver). Определяют значения полумаксимальной ингибирующей концентрации IC₅₀ (при которой погибает 50% жизнеспособных клеток) исследуемых систем, эффективных в отношении раковых клеток М-Hela и нормальных клеток печени (Chang liver).

Для наглядности на фигуре 14 представлено сравнение IC₅₀ для опухолевой линии М-Hela и для Chang liver для заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica (1% масс.) и систем сравнения в виде гистограммы. Данные таблицы 3 и фигуры 14 свидетельствуют, что все исследуемые соединения обладают цитотоксическим действием в отношении опухолевой линии М-Hela. IC₅₀ для заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica составила 0.100±0.008 мг/мл, для липосомальной формы, содержащей абиетиновую кислоту, - 0.230±0.017 мг/мл, для абиетиновой кислоты - 0.26±0.02 мг/мл, для препарата Абисил® - 1.20±0.09 мг/мл, для метанольного экстракта мяты болотной - 0.50±0.03 мг/мл, метанольного экстракта тимьяна обыкновенного - 2.5±0.2 мг/мл, и препарата Тамоксифен - 1.50±0.1 мг/мл.

Данные, представленные в таблице 3, показывают, что значения IC₅₀ соединений, использованных в качестве веществ сравнения, оказались существенно выше, чем для заявляемой липосомальной формы, которой требуется для гибели 50% жизнеспособных клеток опухолевой линии М-Hela в 2.3, 2.6 и в 12 раз меньше, чем для липосомальной формы, содержащей абиетиновую кислоту, абиетиновую кислоту как таковую, и Абисил® соответственно, а также в 5, 25 и 15 раз меньше, чем для метанольного экстракта мяты болотной, метанольного экстракта тимьяна обыкновенного и препарата Тамоксифена соответственно.

Все исследуемые соединения более токсичны на раковых клетках (М-Hela), чем на нормальных клетках печени Chang liver. Важно отметить, что липосомальная форма смолы Abies sibirica проявляет значительно меньшую токсичность на культуре нормальных клеток печени Chang liver: значения IC₅₀ для липосомальной формы смолы Abies sibirica составило 1.4±0.1 мг/мл, для липосомальной формы, содержащей абиетиновую кислоту - 0.50±0.04 мг/мл, для абиетиновой кислоты - 0.45±0.03 мг/мл, для препарата Абисил® - 1.4±0.1 мг/мл и для препарата Тамоксифена - 2.6±0.2. Из представленных данных следует, что липосомальная форма смолы Abies sibirica и препарат Абисил® в 2.8 и 3.1 раза менее токсичны, чем липосомальная форма, содержащая абиетиновую кислоту, и абиетиновая кислота соответственно. Тамоксифен менее токсичен в отношении Chang liver, но и менее активен против раковых клеток по сравнению с практически всеми исследуемыми субстанциями. При помощи многофункциональной системы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), используя приложение Apoptosis BioApp, проводят эксперименты по изучению способности исследуемых соединений вызывать апоптоз в клетках опухолевой линии М-Hela. Данные приведены в таблице 3 и на фигуре 15 в виде гистограммы. Данные таблицы 3 и фигуры 15 показывают количество клеток (в %), находящихся в апоптозе, что составило 13.0±1.1% для липосомального раствора, содержащего смолу Abies sibirica, 45.8±3.5% - для липосомльного раствора, содержащего абиетиновую кислоту, и 58.1±4.6% - для абиетиновой кислоты. Таким образом, заявляемая липосомальная форма смолы Abies sibirica и сравниваемые - липосомальная форма, содержащая абиетиновую кислоту, и абиетиновая кислота способствуют успешному протеканию апоптоза - одного из механизмов программируемой гибели раковых клеток.

Приведенный пример свидетельствует, что липосомальная форма смолы Abies sibirica является активной в отношении опухолевых клеток М-Hela человека и менее токсичной по отношению к нормальным клеткам печени Chang liver, вызывая апоптоз в клетках культуры М-Hela при концентрации IC₅₀.

Таким образом, заявляемое средство представляет собой наноразмерную систему - водорастворимую липосомальную форму смолы Abies sibirica, обладающую антиоксидантной активностью и цитотоксической активностью в отношении раковых клеток шейки матки М-Hela. Заявленным изобретением решается задача повышения биодоступности смолы Abies sibirica - созданием водорастворимого лекарственного средства на основе смолы Abies sibirica, позволяющего неинвазивно проникать в ЦНС и одновременно обладающего фармакологической активностью, расширяющего арсенал лекарственных средств, содержащих смолу Abies sibirica.

Предложен способ получения заявляемой липосомальной формы смолы Abies sibirica со 100% выходом.

Интраназальное введение крысам липосомальной формы смолы Abies sibirica в дозе 10 мг/кг показывает возможность реализации неинвазивного подхода «нос-мозг». Доказана способность заявляемого средства проникать в ЦНС. Это делает объект изобретения перспективным в качестве противоопухолевого средства с направленной доставкой непосредственно к опухолевым клеткам при минимизации влияния на здоровую ткань и нормальную клеточную функцию. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в будущем целесообразно расширение нейральных опухолевых клеточных линий, опухолей нервной системы и опухолей головного мозга - глиомы, а также проведение исследований для реализации одновременного введения липосомальной формы смолы Abies sibirica и противораковых лекарственных веществ (например, доксорубицин, таксол и т.д.) с использованием альтернативного неинвазивного интраназального подхода «нос-мозг». Выявленная высокая антиоксидантная активность липосомальной формы смолы Abies sibirica вызывает интерес при ее дальнейшем использовании в комбинации с известными препаратами для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера.

1. Способ получения липосомальной формы смолы Abies sibirica, представляющей собой фосфолипидную мембрану с включением в нее природной смолы (живицы) Abies sibirica в количестве до 1% масс., включающий следующие стадии:

- простое смешивание 0,55 г фосфолипида, 0,03 г холестерина, 0,04 г ПЭГилирующего агента - до 6% масс. и действующего вещества - смолы Abies sibirica - до 1% масс. в подходящем растворителе,

- испарение растворителя при температуре выше фазового перехода фосфолипида с получением однородной липидной пленки,

- ее регидратацию в среде, выбранной из ультра-очищенной воды или физиологического 0,9% водного раствора хлорида натрия - до 100% масс., при перемешивании при постоянной температуре выше фазового перехода фосфолипида и

- последующее диспергирование частиц до размера порядка 100 нм.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фосфолипида используют L-α-фосфатидилхолин сои, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин или их смеси.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве ПЭГилирующего агента используют поли(этиленгликоль-2000)стеарат или (1,2-дистеароил-SN-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000](соль аммония)).

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что холестерин - полициклический липофильный агент.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве подходящего растворителя используют хлороформ, метанол, этанол, этиловый эфир или их смеси.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что диспергирование частиц до размера порядка 100 нм осуществляют посредством ультразвуковой диспергации или многократной экструзии полученного раствора через мембраны с диаметром пор 100 нм.

7. Липосомальная форма смолы Abies sibirica, полученная способом по п. 1, обладающая активностью, выбранной из: функции направленной доставки биологически активного вещества живицы Abies sibirica в мозг, антиоксидантной активности in vitro, цитотоксической активности in vitro в отношении опухолевых клеток Μ-Hela человека.

8. Применение липосомальной формы смолы Abies sibirica по п. 7 для обеспечения активности, выбранной из: проникновения в центральную нервную систему (ЦНС), проникновения в ЦНС при интраназальном введении, антиоксидантной активности in vitro, цитотоксической активности in vitro в отношении опухолевых клеток Μ-Hela человека.