Способ криоконсервации вегетативного посевного материала micromonospora purpurea var. violacea штамма 7r продуцента гентамицина

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве гентамицина-антибиотика аминогликозидного ряда с широким спектром действия, как препарат выбора для экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекций. Способ предусматривает приготовление, стерилизацию защитной среды (сахарозо-желатиновой или 0,5% водного раствора бетаина гидрохлорида) и проверку ее на стерильность; выращивание вегетативного посевного материала (ВПМ) Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R; приготовление ВПМ штамма 7R с защитной средой в соотношении 1:1; предварительное замораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 40°С и выдерживание при указанной температуре в течение одного часа, дальнейшее замораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С; хранение ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С. Заявленный способ позволяет длительно хранить ВПМ штамма 7R и использовать его после размораживания при температуре 37°С для биосинтеза гентамицина. 5 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве гентамицина-антибиотика аминогликозидного ряда с широким спектром действия, как препарат выбора для экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекций [1, 2]. Способ предусматривает приготовление защитной среды (сахарозо-желатиновой или 0,5% водного раствора бетаина гидрохлорида), ее стерилизацию и проверку на стерильность; выращивание вегетативного посевного материала (ВПМ) Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R; приготовление ВПМ штамма 7R с защитной средой в соотношении 1:1; предварительное замораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 40°С и выдерживание при указанной температуре в течение одного часа, дальнейшее замораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С; хранение ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С. Способ позволяет длительно (в течение восемнадцати месяцев) хранить ВПМ штамма 7R и использовать его после размораживания при температуре 37°С для биосинтеза гентамицина.

При производстве гентамицина необходимо обеспечить стадию биосинтеза качественным вегетативным посевным материалом производственного штамма Micromonospora purpurea var. violacea 7R.

Длительное хранение штаммов продуцентов антибиотиков осуществляют с помощью замораживания культур при низких и сверхнизких температурах [3, 4]. По данным научной литературы, культуры Streptomyces fradiae, S. hygroscopious, S. rimosus (продуцентов тилозина) хранят при температуре минус 20°С, минус 70°С и минус 196°С [5, 6], S. hygroscopicus (продуцента рапамицина), Nonomuraea roseoviolacea subsp.carminata (продуцента карминомицина) - при температуре минус 70°С [7], S. roscolus (продуцента линкомицина), S. venezuelae (продуцента хлорамфеникола) и S. griseus (продуцента стрептомицина) - при температуре минус 196°С [8, 9].

Для хранения микроорганизмов в замороженном состоянии используют криопротекторы и защитные среды на их основе [4, 10, 11]. Различные виды стрептомицетов при использовании 10% водного раствора глицерина можно длительно хранить при температуре от минус 150 до минус 196°С [4]. Оптимальными защитными средами при криоконсервации культуры S. ruber К-3946 (продуцента флавофунгина) являются 15% водный раствор глицерина и композиция на основе 3% водного раствора диметилсульфоксида с добавлением 4н-гексилрезорцина [11]. Штамм S. fradiae 99 при использовании 40% водного раствора глицерина можно хранить при температуре минус 70°С в течение одного года [12]. Эффективными при замораживании спорового посевного материала культуры S. roscolus 7-219 являются 10% водный раствор глицерина и 12% водный раствор сахарозы, которые при температуре хранения штамма минус 196°С обеспечивают сохранение его основных биологических свойств в течение шести месяцев [8].

Представленные выше способы хранения актиномицетов-продуцентов антибиотиков в замороженном состоянии касаются хранения споровых культур, используемых при промышленном производстве антибиотиков для получения ВПМ, этапы получения которого сопряжены со значительными материальными- и трудозатратами.

В общедоступной патентной и научно-технической литературе сведения о способах криоконсервации ВПМ продуцента гентамицина отсутствуют.Таким образом, предлагаемое изобретение обладает новизной.

Существует способ хранения вегетативного мицелия Streptomyces sp.(продуцента а-глюкозидаз) в 25% водном растворе сахарозы при температуре минус 20°С, обеспечивающий сохранение активности культуры в течение 12 месяцев [13]. Разработан способ хранения ВПМ S. fradiae 25А (продуцента антибиотика тилозина) в 5% водном растворе глицерина при температуре минус 70°С, позволяющий использовать для биосинтеза антибиотика ВПМ продуцента, хранившегося в замороженном состоянии в течение трех месяцев. При использовании для биосинтеза антибиотика ВПМ S. fradiae 25А, хранящегося более трех месяцев, необходимо проведение пассажа размороженного вегетативного посевного материала для получения ВПМ новой (второй) генерации, так как после использования непассированного ВПМ при биосинтезе антибиотика происходит снижение его активности в 1,5 раза[14].

Основным отличительным признаком заявленного способа является хранение ВПМ М. purpurea var. violacea штамма 7R при температуре минус 150°С в защитной среде (сахарозо-желатиновой или 0,5% водном растворе бетаина гидрохлорида). Необходимо отметить, что по данным научной литературы хранение микроорганизмов при температуре минус 150°С и ниже является предпочтительнее по сравнению с более высокими температурами [4, 15, 16]. При температуре минус 150°С клетки микроорганизмов находятся в состоянии полного (глубокого) анабиоза, для которого характерно обратимое прекращение жизнедеятельности.

Для биосинтеза гентамицина используют ВПМ Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R, хранившийся при температуре 4°С не более одних суток (далее- исходный ВПМ). Цель изобретения – разработка способа криоконсервации ВПМ Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R, обеспечивающего хранение качественного посевного материала.

Заявленный способ криоконсервации ВПМ штамма 7R осуществляют следующим образом:

1. Готовят защитную среду.

Для криоконсервации ВПМ штамма 7R используют защитные среды: сахарозо-желатиновую (традиционно применяемую при лиофилизации различных видов микроорганизмов [17, 18, 19]) или 0,5% водный раствор бетаина гидрохлорида (органический эндоцеллюлярный осмопротектор, обладающий криозащитными свойствами [10]). Компоненты защитных сред безопасны при использовании в пищевой, микробиологической промышленности и др. [20].

Для приготовления сахарозо-желатиновой среды к 3,0 г желатина добавляют дистиллированную воду до 70,0 см3; раствор выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим нагреванием на водяной бане при температуре 40°С в течение 5 минут. В полученный раствор желатина вносят предварительно приготовленный раствор сахарозы (к 3,0 г сахарозы добавляют дистиллированную воду до 30,0 см3). Сахарозо-желатиновую среду стерилизуют при 0,1 МПа и температуре 112°С в течение 20 минут.

Для приготовления защитной среды с бетаином гидрохлоридом 0,5 г бетаина гидрохлорид растворяют в 99,5 см3 дистиллированной воды. Защитную среду стерилизуют методом мембранной фильтрации с использованием фильтра с размером пор 0,2 мкм.

Приготовленные защитные среды проверяют на стерильность. Для этого в пробирки с мясо-пептонным бульоном и мясо-пептонным агаром вносят по 0,5 см3 защитной среды в каждую и выдерживают при температуре 37°С от 3 до 5 суток. Стерильные защитные среды хранят при температуре 4°С не более 30 суток со дня их приготовления.

2. Выращивают ВПМ штамма 7R.

Для выращивания ВПМ штамма 7R используют посевную питательную среду следующего состава, %:

- крахмал картофельный 2,4
- экстракт кукурузный 0,5
- мука соевая 1,0
- мел химически осажденный 0,3
- вода питьевая до 100,0

Значение рН после стерилизации от 6,8 до 7,2.

Перед приготовлением посевной питательной среды навеску крахмала предварительно разводят в пятикратном объеме холодной питьевой воды. В оставшийся объем холодной питьевой воды вносят навеску соевой муки, тщательно размешивают для предотвращения образования комочков, нагревают до температуры 80°С и выдерживают при данной температуре в течение 15 минут, не допуская пригорания, затем вносят при постоянном перемешивании навеску кукурузного экстракта и мела.

В соево-солевую смесь, нагретую до температуры 80°С, вносят при перемешивании приготовленную суспензию крахмала. При необходимости в посевную питательную среду доливают до расчетного объема питьевую воду, рН оставляют естественным.

Готовую посевную питательную среду разливают по 80 см3 в колбы вместимостью 750 см3. Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, затем бумажными колпачками и стерилизуют в автоклаве при температуре 119°С и давлении 0,1 МПа в течение 30 минут.

После стерилизации две-три колбы с посевной питательной средой выдерживают при температуре 37°С не менее трех суток. Для выявления бактериальной и грибковой микрофлоры производят посев по 0,5 см3 посевной питательной среды соответственно в тиогликолевую среду и в жидкую среду Сабуро, используя по три пробирки каждой среды. Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при температуре 35°С, в среде Сабуро - при температуре 23°С в течение семи суток, осуществляя ежедневно визуальный контроль посевов.

В посевной питательной среде определяют содержание общего сахара (по Шоорлю) и общего азота (по Кьельдалю), которое должно быть от 2,1 до 2,7% и от 70 до 90 мг% соответственно. Значение рН посевной питательной среды должно быть от 6,8 до 7,2.

Культурой для приготовления исходного ВПМ является споровая культура штамма продуцента гентамицина. Агаровый блок (площадью 1,0-1,5 см2) со споровой культурой штамма 7R, выращенной на скошенной питательной среде Гаузе 1, засевают в колбы с жидкой посевной питательной средой. Колбы устанавливают на шейкер-инкубатор GEL 3031 и выращивают вегетативную культуру продуцента гентамицина при температуре 33°С и скорости перемешивания 220 оборотов в минуту в течение 48 часов.

Для криоконсервации используют вегетативную культуру Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R (исходную АПМ), удовлетворяющую следующим требованиям (21):

- внешний вид культуры: средней густоты или густая взвесь хлопьевидного мицелия от бежевого до грязно-розово-сиреневого цвета, при взбалтывании культура обволакивает стенки колбы, при стоянии не расслаивается;

- микроморфология мицелия: множество отдельных рыхлых микроколоний, гифы длинные или средней длины, волнистые, слабо ветвящиеся часто образуют сетку, протоплазма базофильная, иногда в виде пунктира;

- посторонняя микрофлора отсутствует.

3. Готовят партию ВПМ штамма 7R с защитной средой.

В стерильные металлические емкости вместимостью 100 см3 вносят 15 см3 вегетативной культуры штамма 7R и защитную среду в соотношении 1:1. Емкости закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками и маркируют с указанием штамма микроорганизма и даты приготовления партии. Затем емкости с вегетативной культурой штамма 7R в защитной среде замораживают при температуре минус 40°С, выдерживают при данной температуре в течение одного часа и переносят в криогенную установку для дальнейшего замораживания и хранения при температуре минус 150°С.

Размораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой осуществляют на водяной бане при температуре 37°С до полного оттаивания.

Возможность осуществления заявленного изобретения и его эффективность подтверждены экспериментально в лабораторных условиях. Эффективность предложенного способа оценивали по следующим показателям:

- соответствие размороженного ВПМ штамма 7R требованиям, предъявляемым к исходному ВПМ;

- уровень активности культуральной жидкости (КЖ), полученной после биосинтеза антибиотика с использованием криоконсервированного в защитных средах ВПМ штамма 7R, по сравнению с уровнем активности КЖ, полученной после биосинтеза антибиотика с использованием ВПМ штамма 7R, хранившегося при температуре 4°С не более одних суток, с подтверждением подлинности антибиотика.

Криоконсервированный в защитных средах ВПМ штамма 7R после размораживания оценивали на соответствие следующим требованиям:

внешний вид культуры, микроморфология мицелия и отсутствие посторонней микрофлоры.

Для определения микроморфологии мицелия размороженный ВПМ штамма 7R тонким слоем распределяли по поверхности предметного стекла, высушивали на воздухе. После этого на мазок наносили фиксатор Карнуа и выдерживали в течение десяти минут, затем смывали 70% этиловым спиртом, мазок высушивали на воздухе, наносили метиленовый синий и выдерживали в течение трех минут. Остатки краски удаляли фильтровальной бумагой. Микроскопию мазка осуществляли под увеличением 100х.

Для проверки криоконсервированного ВПМ штамма 7R на отсутствие посторонней микрофлоры в пробирки с мясо-пептонным бульоном и мясо-пептонным агаром (не менее трех на каждую среду) вносили от 0,5 до 1,0 см3 размороженного ВПМ продуцента гентамицина и выдерживали при температуре 37°С от трех до пяти суток.

Для проведения биосинтеза антибиотика готовили ферментационную питательную среду следующего состава, %:

- крахмал картофельный 5,0
- мука соевая 3,0
- аммоний сернокислый 0,3
- натрий хлористый 0,3
- мел химически осажденный 0,7
- кобальт хлористый 6-водный без никеля 8,0⋅10-5
- вода питьевая до 100,0

Значение рН после стерилизации от 7,6 до 7,8.

Перед приготовлением ферментационной питательной среды навеску крахмала предварительно разводили в пятикратном объеме холодной питьевой воды. В оставшийся объем холодной воды вносили навеску соевой муки, тщательно размешивали, чтобы не было комочков, нагревали до температуры 80°С и, продолжая непрерывно помешивать, выдерживали при данной температуре в течение 15 минут. Затем вносили соли в следующей последовательности: мел, натрия хлорид, сульфат аммония, перемешивая вручную после внесения каждого компонента. После этого добавляли по 1,0 см3 на 1,0 дм3 4% хлористого кобальта. Исходный 4% водный раствор готовили следующим образом: к 4 г хлористого кобальта приливали 96,0 см3 дистиллированной воды и хранили в холодильнике при температуре 4°С в течение 20 суток.

В нагретую до температуры 80°С соево-солевую смесь вводили при перемешивании 0,5 объема приготовленной суспензии крахмала. Смесь вновь нагревали до температуры 80°С при постоянном перемешивании, после чего вводили оставшуюся суспензию крахмала, рН оставляли естественным.

Приготовленную ферментационную питательную среду разливали, перемешивая перед каждым розливом, с помощью мерного цилиндра через воронку по 50 см3 в колбы вместимостью 750 см3, которые закрывали ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. Колбы с ферментационной питательной средой стерилизовали в автоклаве при температуре 119°С и давлении 0,1 МПа в течение 30 минут.

После стерилизации колбы с ферментационной питательной средой выдерживали в термальной при температуре 37°С в течение трех суток для контроля стерильности. Из двух-трех колб осуществляли посев по 0,5 см3 ферментационной питательной среды в пробирки с мясо-пептонным бульоном и мясо-пептонным агаром (не менее трех пробирок на каждую среду). Пробирки с посевами выдерживали при температуре 37°С в течение трех-пяти суток.

Для исследований использовали стерильную ферментационную питательную среду, удовлетворяющую следующим требованиям:

- значение рН от 7,6 до 8,7;
- общий сахар (по Шоорлю), % от 3,5 до 5,0;
- аммонийный азот, мг % от 60 до 90.

Размороженный ВПМ штамма 7R засевали по 5,0 см3 в три-пять колб с ферментационной питательной средой, которые помещали на платформу шейкера-инкубатора GEL 3031. Биосинтез антибиотика проводили в течение 168 часов при температуре 33°С и скорости перемешивания 220 оборотов в минуту.

После окончания процесса ферментации определяли концентрацию антибиотика в КЖ методом диффузии в агар. В качестве тест-культуры использовали Bacillus pumilus 8241, а в качестве стандартного образца - гентамицина сульфат (ОФС.1.2.4.0010.15) [22].

Определение подлинности антибиотика проводили методом тонкослойной хроматографии (ОФС.1.2.1.2.0003.15) [22]. Культуральные жидкости анализируемых проб разводили (в соответствии с полученной величиной антибиотической активности) до концентрации антибиотика 20 мг⋅см-3 (также как стандартный образец гентамицина сульфата) и наносили на линию старта, обозначенную на хроматографической пластине.

На хроматограмме должны визуально определяться три пятна гентамицинового комплекса (С1 C1a, С2).

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили согласно общепринятым методам [23].

Для определения эффективности заявленного способа изучены:

- влияние времени экспозиции вегетативной культуры штамма 7R с защитной средой, содержащей бетаина гидрохлорид, на активность культуральной жидкости, получаемой после биосинтеза гентамицина с использованием криоконсервированного с защитной средой ВПМ штамма 7R;

- влияние защитных сред (сахарозо-желатиновой, 0,5% водного раствора бетаина гидрохлорида) в сравнении с 10% водным раствором глицерина (защитной средой, часто используемой для криоконсервации различных микроорганизмов) на активность культуральной жидкости, получаемой после биосинтеза гентамицина с использованием криоконсервированного с защитными средами ВПМ штамма 7R;

-влияние температуры хранения (минус 20°С и минус 150°С) ВПМ штамма 7R на активность культуральной жидкости, получаемой после биосинтеза гентамицина с использованием криоконсервированного с защитными средами ВПМ штамма 7R.

При изучении влияния времени экспозиции вегетативной культуры штамма 7R с защитной средой, содержащей криопротектор бетаина гидрохлорид, замораживали без выдержки и через 20 и 60 минут выдержки культуры с 0,5% бетаина гидрохлорида при температуре 20°С. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Из анализа данных, представленных в таблице 1, следует, что антибиотическая активность КЖ, полученных после биосинтеза с использованием размороженного ВПМ с исследуемой защитной средой с предварительным выдерживанием их при температуре 20°С в течение 60 минут до замораживания, снизилась до (64±8) %. На хроматограмме КЖ при исследовании всех проб получены три пятна гентамицинового комплекса, что свидетельствует о подлинности антибиотика.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что время экспозиции вегетативной культуры штамма 7R с защитной средой до замораживания должно быть не более 20 минут.

Результаты влияния предложенных защитных сред, в сравнении с 10% водным раствором глицерина, на антибиотическую активность КЖ, полученных после биосинтеза антибиотика с использованием криоконсервированного и хранящегося в течение одних суток ВПМ с защитными средами, представлены в таблице 2.

Из анализа данных, приведенных в таблице 2, следует, что антибиотическая активность КЖ, полученных после биосинтеза антибиотика с использованием ВПМ с сахарозо-желатиновой средой и с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида, на уровне контрольной концентрации, а с использованием ВПМ с 10% водным раствором глицерина - снизилась по сравнению с контрольной концентрацией и составила (51±7)% На хроматограмме получены три пятна гентамицинового комплекса (С1 C1a, С2), что свидетельствует о подлинности полученного антибиотика.

Данные экспериментальных исследований показали, что наиболее эффективным является хранение ВПМ штамма 7R при температуре минус 150°С в течение одних суток с использованием сахарозо-желатиновой среды или 0,5% водного раствора бетаина гидрохлорида.

При изучении влияния температуры хранения ВПМ штамма 7R с защитными средами на антибиотическую активность культуры для хранения при температуре минус 150°С ВПМ с защитными средами замораживали заявленным способом, а для хранения при температуре минус 20°С использовали защитные среды (сахарозо-желатиновую среду, 0,5% водный раствор бетаина гидрохлорида) и ВПМ штамма 7R в соотношении 1:1 с последующим замораживанием при температуре минус 20°С и хранением при указанной температуре. Размораживание ВПМ штамма 7R с защитными средами, хранившегося при температуре минус 150°С, осуществляли при температуре 37°С, а хранившегося при температуре минус 20°С - при температуре 20°С.

ВПМ штамма 7R, замороженный с защитными средами при температуре минус 20°С и минус 150°С, исследовали через 30 суток его хранения.

Результаты определения антибиотической активности КЖ, полученной после биосинтеза антибиотика с использованием ВПМ, хранившегося в течение 30 суток при температуре минус 20°С и минус 150°С, представлены в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что при биосинтезе гентамицина с использованием хранившегося в течение 30 суток ВПМ штамма 7R с сахарозо-желатиновой средой и с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида при температуре минус 20°С, наблюдали снижение антибиотической активности КЖ до (80±10) %и(81±11)% соответственно, а при температуре минус 150°С антибиотическая активность КЖ была на уровне исходной. На хроматограмме получены три пятна гентамицинового комплекса (С1 C1a, С2), что свидетельствует о подлинности полученного антибиотика.

Анализ полученных данных показал, что наиболее эффективным является хранение ВПМ М. purpurea var. violacea штамма 7R с защитными средами (сахарозо-желатиновой средой и 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида) при температуре минус 150°С.

Примеры осуществления способа

Пример 1

Для получения ВПМ штамма 7R агаровый блок (площадью 1,0-1,5 см2) со споровой культурой засевали в колбы с жидкой питательной средой. Колбы помещали на платформу шейкера-инкубатора GEL 3031 и выращивали культуру штамма 7R при температуре 33°С и скорости перемешивания 220 оборотов в минуту в течение 48 часов. Вегетативную культуру штамма 7R вносили по 15,0 см3 в промаркированные металлические контейнеры с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1:1. Контейнеры с культурой штамма 7R в защитной среде встряхивали и переносили в медицинский морозильник POZIS ММ-180/20/35, замораживали при температуре минус 40°С и выдерживали при указанной температуре в течение одного часа. После этого контейнеры с культурой штамма 7R в защитной среде помещали в камеру криогенного холодильника Forma ULT-7150-9V и замораживали при температуре минус 150°С. Вегетативный посевной материал штамма 7R, криоконсервированный с сахарозо-желатиновой средой, оценивали через три, шесть, девять, двенадцать и восемнадцать месяцев (срок наблюдения) хранения при температуре минус 150°С после размораживания на водяной бане при температуре 37°С.

Показано, что после размораживания ВПМ штамма 7R, криоконсервированного с сахарозо-желатиновой средой, в течение всего срока хранения внешний вид посевного материала, микроморфология мицелия соответствовали требованиям к исходному ВПМ.

Посторонняя микрофлора отсутствовала. Для оценки возможности использования ВПМ штамма 7R, криоконсервированного с сахарозо-желатиновой средой для биосинтеза гентамицина размороженный ВПМ засевали (по 5,0 см3) в колбы (вместимостью 750 см3) с жидкой ферментационной средой (50,0 см3). Колбы помещали на платформу шейкера-инкубатора GEL 3031. Биосинтез антибиотика проводили в течение 168 часов при температуре 33°С и скорости перемешивания 220 оборотов в минуту. Результаты исследования антибиотической активности КЖ, полученных после биосинтеза с использованием ВПМ штамма 7R, криоконсервированного с сахарозо-желатиновой средой, через три, шесть, девять, двенадцать и восемнадцать месяцев хранения при температуре минус 150°С, представлены в таблице 4.

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что антибиотическая активность КЖ, полученных после биосинтеза антибиотика с использованием криоконсервированного ВПМ штамма 7R с сахарозо-желатиновой средой, хранившегося в течение всего срока наблюдения, составляла от (96±14) до (113±17)%. На хроматограмме при исследовании проб КЖ получены три пятна компонентов гентамицинового комплекса (С1 C1a, С2), что свидетельствует о подлинности полученного антибиотика.

Таким образом, при использовании для биосинтеза гентамицина ВПМ штамма 7R, хранящегося в течение восемнадцати месяцев в криоконсервированном состоянии с сахарозо-желатиновой средой и после размораживания соответствующего требованиям, предъявляемым к исходному ВПМ штамма 7R, получены КЖ с антибиотической активностью не ниже антибиотической активности КЖ, полученной после биосинтеза антибиотика с использованием исходного ВПМ штамма 7R.

Криоконсервированный в сахарозо-желатиновой среде ВПМ штамма 7R после размораживания соответствовал требованиям регламента. При проведении биосинтеза гентамицина с использованием криоконсервированного с сахарозо-желатиновой средой и хранившегося в течение восемнадцати месяцев ВПМ штамма 7R. Подлинность полученного при биосинтезе антибиотика (гентамицина) подтверждена методом тонкослойной хроматографии.

Пример 2

Получение ВПМ и криоконсервацию культуры проводили аналогично примеру 1, в качестве защитной среды использовали 0,5% водный раствор бетаина гидрохлорид, конечная концентрация которого при смешивании с культурой штамма 7R составляет 0,25%.

Вегетативный посевной материал штамма 7R, криоконсервированный с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида, исследовали через три, шесть, девять, двенадцать и восемнадцать месяцев его хранения при температуре минус 150°С.

Показано, что после размораживания ВПМ штамма 7R, криоконсервированного с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида, в течение всего срока хранения внешний вид посевного материала, микроморфология мицелия соответствовали требованиям регламента. Посторонняя микрофлора отсутствовала. Результаты исследования антибиотической активности КЖ, полученных после биосинтеза антибиотика с использованием ВПМ штамма 7R, криоконсервированного с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида, через три, шесть, девять, двенадцать и восемнадцать месяцев хранения при температуре минус 150°С, представлены в таблице 5.

Из данных, представленных в таблице 5, следует, что антибиотическая активность КЖ, полученных после биосинтеза антибиотика с использованием криоконсервированного ВПМ штамма 7R с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида, хранившегося в течение всего срока наблюдения, составляла от (95±14) до (111±16)%. На хроматограмме при исследовании проб КЖ получены три пятна компонентов гентамицинового комплекса (С1, C1a, С2), что свидетельствует о подлинности получаемого антибиотика.

Таким образом, при использовании для биосинтеза гентамицина ВПМ штамма 7R, хранящегося в течение восемнадцати месяцев в криоконсервированном состоянии с 0,5% водным раствором бетаина гидрохлорида и после размораживания соответствующего требованиям, предъявляемым к исходному ВПМ штамма 7R, получены КЖ с антибиотической активностью не ниже антибиотической активности КЖ, полученной после биосинтеза антибиотика с использованием исходного ВПМ штамма 7R. Подлинность полученного при биосинтезе антибиотика подтверждена методом тонкослойной хроматографии.

Таким образом, показано, что с помощью заявленного способа вегетативный посевной материал Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R храниться в сахарозо-желатиновой среде и 0,5% водном растворе бетаина гидрохлорида, до восемнадцати месяцев (срок наблюдения) и может быть использован для биосинтеза гентамицина как стандартный посевной материал.

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1 Практическое пособие для подготовки врачей - бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму [Текст] / Г.Г. Онищенко [и др.] - Волгоград: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2004. - 233 с.

2 Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения на 2017 год [Текст] / Утвержден распоряжением Правительства Российской Федерации от 28 декабря 2016. №2885-р.

3 Chetverikova, Е.P. DNA Damage by Reactive Oxygen Species in Cryopreservation and the Antioxidant properties of Cryoprotectors [Text] / E.P. Chetverikova // Biophysics. - 2012. - Vol. 57. - №2. - P. 263-269.

4 Белоус, A. M. Криобиология [Текст] / A.M. Белоус, В.И. Грищенко -Киев: Наукова Думка, 1994. - 432 с.

5 Савочкина, И.В. Разработка технологических аспектов культивирования штаммов Streptomyces fradiae - продуцентов ветеринарного антибиотика тилозина: дис.… канд. техн. наук: 03.00.23 / Савочкина Ирина Владимировна. - АОО «Биохиммаш». - М, 1998. - 129 с.

6 Пат.RU Штамм Streptomyces fradiae - продуцент тилозина / Жданов В.Г.; Юстратова Л.С.; Ярославцева Н.Г.: С12Р 1/06, С12Р 1/06, C12R 1:54, №2018536, №заявки 5035026/13, заявл. 31.03.1992, опубл. 30.08.1994, заявитель и патентообл. Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Бюл. №35.

7 Синева, О.Н. Хранение культур актинобактерий - представителей родов Streptomyces и Nonomuraea методом низкотемпературной консервации [Текст] / О.Н. Синева [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. - 2014. - №11-12.-С. 11-15.

8 Сидякина, Т.М. Научное обоснование методов консервации практически ценных культур и ассоциаций почвенных микроорганизмов / автореф. дис. на соиск. учен. степ, д-ра техн. наук: 03.00.23 / Сидякина Татьяна Михайловна; Научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии. - Москва, 1992 г. - 40 с.

9 Паспорта штаммов [Электронный ресурс] / ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 2017. - Режим доступа: http://www.fbras.ru/glavnaya/institut-mikrobiologii.

10 Грачева, И.В. Традиционные и новые защитные среды для низкотемпературной консервации бактерий [Текст] / И.В. Грачева, Т.В. Валова, Г.В. Григорьева // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2011. -Вып. ПО.-С. 36-40.

11 Hubalec, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms [Text] / Z Hubalec // Criobiology. - 2003. - 46(3):205 - P. 29.

12 Пат.RU Штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99 - продуцент тилозина/ Даниленко B.H.: C12P 001/06, C12P 017/08, C12P 019/62, №заявки 99120284, заявл. 28.09.1999, опубл. 2001, заявитель и патентообл. Автономная некоммерческая организация «Научно-исследовательский центр биотехнологии антибиотиков и других биологически активных веществ «БИОАН».

13 Колодязная, В.А. Продуцент ингибитора А-глюкозидаз, стабилизация его ингибиторной активности и изучение условий биосинтеза: автореферат дис.… канд. биол. наук: 03.00.23 / Колодязная Вера Анатольевна. - С. -Петерб. гос. хим.-фармацевт.акад. - Санкт-Петербург, 2006. - 23 с.

14 Туркин, В.В. Обоснование режимов хранения продуцентов различных биологически активных веществ [Текст] / автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук: 03.00.23 / Туркин Владимир Васильевич;

Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии. - Москва, 1991. - 26 с.

15 Влияние замораживания на микроорганизмы [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://promeat-industry.ru/.

16 Голдовский, A.M. Анабиоз [Текст] / A.M. Голдовский; под ред. Е.М. Крепс. - Л.: Наука, 1981. - 136 с.

17 Литвиченко, В.С.Методы хранения культур микроорганизмов [Текст]. - Сургут.- 2008. - 29 с.

18 Семенов, С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник [Текст]. - М. - 1990. - 240 с.

19 Забокрицкий, А.Н. Хранение продуцента тобрамицина в лиофилизированном состоянии [Текст] / А. Н. Забокрицкий [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2003. - №1. - С.63-65.

20 Бетаин. Основная информация [Текст]. - М. ООО «ВИРУД РУС, 2015.-1 с.

21 Государственная Фармакопея Российской Федерации. Том 1 [Текст] / МЗ РФ. - 13 изд., - М.: ФЭМБ, 2015. - 1003 с.

22 Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях [Текст] / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - Л.: Медгиз, 1962. -180 с.

Способ криоконсервации вегетативного посевного материала Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R продуцента гентамицина, включающий приготовление защитной среды - сахарозо-желатиновой или 0,5% водного раствора бетаина гидрохлорида, ее стерилизацию и проверку на стерильность; выращивание вегетативного посевного материала штамма 7R, приготовление вегетативного посевного материала штамма 7R с защитной средой в соотношении 1:1; предварительное замораживание вегетативного посевного материала штамма 7R с защитной средой при температуре минус 40°С и выдерживание при указанной температуре в течение одного часа, дальнейшее замораживание вегетативного посевного материала штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С; хранение вегетативного посевного материала штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения коллагенолитического фермента, включающий культивирование базидиальных грибов видов Correna unicolor, Ganoderma lucidum, Trametes ochracea, Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus, Hypsizygus ulmarius, Lentinus edodes, Funalia trogii, Fomes fomentarius или Coprinus lagopides на жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 6,0-10,0 г/л лактозы или 10-15 г/л сухой молочной сыворотки, содержащей 70% лактозы, а в качестве источника азота - 1,5-5,0 г/л мочевины, с последующим отделением мицелия фильтрацией, концентрирования нативного раствора с помощью ультрафильтрации, лиофильной сушки.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным связывающим α2-макроглобулин (α2-М) белкам, и может быть использовано для выделения α2-макроглобулина (α2-М) из плазмы крови человека аффинной хроматографией.

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии, пищевой промышленности и медицины. Описан новый штамм молочнокислой бактерии Lactobacillus rhamnosus для продуцирования молочной кислоты с регистрационным номером CECT 8800.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ производства ростовой среды для выращивания культур рода Bifidobacterium, включающий использование на 1000 мл фильтрованной воды 120 мл соевого гидролизата, 1 г пептона, нанофильтрат творожной сыворотки в концентрации 3% от общего объема питательной среды и микробиологический агар-агар в концентрации 0,2% в готовой среде, обеспечивающей гелезирование среды.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм бактерий Bacillus megaterium, обладающий способностью продуцировать пробиотические и антимикробные вещества класса органических кислот, депонирован в ВКМ ИХБФМ РАН под регистрационным номером ВКМ В-3512D.
Изобретение относится к области микробиологии и эпидемиологии. Предложен штамм бактерий Escherichia coli O26:H11, продуцент шигаподобного токсина, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8034.

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии, касается нового штамма Escherichia coli 1654-1, Заявляемый штамм Escherichia coli 1654-1, нового генотипа депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером В-8794 и может быть использован для микробиологических, диагностических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований и разработки диагностических наборов полимеразной цепной реакции.

Изобретение относится к области биотехнологии, клинической микробиологии, в частности микологии, и может быть использовано с целью оптимизации питательных сред для селективного культивирования дрожжевого гриба вида Malassezia furfur (М.furfur).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен трансформант дрожжей Komagataella phaffii, продуцирующий фитазу Cronobacter turicensis.

Группа изобретений относится к морозостойким штаммам пекарских дрожжей и к их применению. Предложены штамм пекарских дрожжей OL-01, депонированный как NCYC 4095, штамм пекарских дрожжей S3-02, депонированный как NCYC 4094, штамм пекарских дрожжей FL-03, депонированный как NCYC 4105, штамм пекарских дрожжей IS-310, депонированный как NCYC 4106, штамм пекарских дрожжей CC-05, депонированный как NCYC 4128, штамм пекарских дрожжей KF-06, депонированный как NCYC-4129.

Изобретение относится к способу получения антибиотиков. Противогрибковые антибиотики астолиды А и В экстрагируют из мицелия штамма Streptomyces hygroscopicus ВКПМ Ас2079.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве гентамицина-антибиотика аминогликозидного ряда с широким спектром действия, как препарат выбора для экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекций. Способ предусматривает приготовление, стерилизацию защитной среды и проверку ее на стерильность; выращивание вегетативного посевного материала Micromonospora purpurea var. violacea штамма 7R; приготовление ВПМ штамма 7R с защитной средой в соотношении 1:1; предварительное замораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 40°С и выдерживание при указанной температуре в течение одного часа, дальнейшее замораживание ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С; хранение ВПМ штамма 7R с защитной средой при температуре минус 150°С. Заявленный способ позволяет длительно хранить ВПМ штамма 7R и использовать его после размораживания при температуре 37°С для биосинтеза гентамицина. 5 табл., 2 пр.

Наверх