Способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиента трансплантированного сердца

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца. Для диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов сердца в плазме венозной крови определяют уровень экспрессии микроРНК-27 и при уровне ниже -5,07 относительных единиц диагностируют наличие острого отторжения трансплантата. Технический результат заключается в обеспечении доступности и неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверной диагностики острого отторжения трансплантата, а также в повышении выживаемости реципиентов и улучшении результатов трансплантации сердца за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии путем определения уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме венозной крови. 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении реципиентов сердца для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца.

Острое отторжение трансплантата является одним из основных факторов, ограничивающих выживаемость реципиентов сердца. Риск развития острого отторжения трансплантированного сердца более высок в раннем послеоперационном периоде, хотя кризы острого отторжения могут возникать в любые сроки после трансплантации. Поздние кризы отторжения чаще возникают при назначении недостаточных доз иммуносупрессивной терапии и несоблюдении реципиентами предписанного врачом режима приема лекарственных средств, а также возникшими вирусными инфекциями, приводящими к активации иммунной системы пациента.

Разработка малоинвазивных методов выявления осложнений в посттрансплантационном периоде и поиск новых биомаркеров, сигнализирующих об их развитии после трансплантации сердца проводится с целью улучшения доклинической диагностики и увеличения продолжительности жизни реципиентов.

В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, связанных с развитием острого отторжения, приводящего к дисфункции трансплантированного сердца. Отдельную группу сигнальных молекул, рассматриваемых в качестве перспективных кандидатов на роль таких биомаркеров, составляют МикроРНК.

МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушении обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов.

Показан диагностический потенциал оценки уровня экспрессии ряда микроРНК в образцах крови пациентов в отношении развития и течения сердечной недостаточности [The diagnostic value of circulating microRNAs in heart failure / Huang YM, Li WW, Wu J, Han M, Li ВН. // Exp Ther Med. - 2019. - 17(3): 1985-2003].

В работе Sukma Dewi et al. было показано различие уровней экспрессии микроРНК, в том числе микроРНК-27, у реципиентов с острым отторжением трансплантата и реципиентов без отторжения, на основании чего высказано только предположение о возможной диагностической роли микроРНК-27 при остром отторжении трансплантированного сердца [Association of Serum MiR-142-3р and MiR-101-3p Levels with Acute Cellular Rejection after Heart Transplantation / Sukma Dewi I, Hollander Z, Lam KK, et al. // PLoS One. - 2017. - 12(1): e0170842].

Однако исследованная группа пациентов включала в себя исключительно реципиентов с острым клеточным отторжением, несмотря на то, что около 20% случаев острого отторжения трансплантированного сердца протекает по гуморальному (антителоопосредованному) типу.

Кроме того, в исследовании не проводилось определение диагностической эффективности метода: не были установлены показатели чувствительности и специфичности, а также диагностически значимые пороговые значения экспрессии микроРНК-27, позволяющие выявлять реципиентов с острым отторжением трансплантата любого типа: клеточного и/или гуморального.

При этом в качестве материала исследования была выбрана сыворотка крови реципиентов, что осложняет процесс работы с образцами в отличие от использования плазмы венозной крови.

На сегодняшний день объективным методом верификации степени и характера острого отторжения трансплантированного сердца является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) и коронографическое исследование [Веревкин А.А., Славинский А.А., Космачева Е.Д. и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2017. -24 (6). - С. 17-21] (прототип). ЭМБ выполняются в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированного сердца.

Однако ЭМБ имеет ряд ограничений и рисков, свойственных инвазивным методам диагностики. Кроме того, при получении биоптата исследуют локальный участок, который не всегда может отражать состояние целого трансплантированного органа [Ставенчук Т.А., Космачева Д.В., Шелестова Е.Д. и др. Оценка предикторов отторжения миокарда у пациентов после ортотопической трансплантации сердца с помощью трансторакальной эхокардиографии и методики speckle tracking echocardiography // Креативная кардиология. - 2015. - №3. - С. 56-66]. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода. В связи с его трудоемкостью существует очевидная необходимость в разработке нового неинвазивного диагностического средства, которое может не только выявить наличие острого отторжения трансплантата, но и контролировать лечение реципиента.

Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца клеточного и/или гуморального типов.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении неинвазивности, снижении трудоемкости, времени проведения, повышении доступности диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов трансплантированного сердца при одновременном достижении достоверной диагностики острого отторжения (как клеточного, так и гуморального типов) у данного контингента пациентов, а также повышении ее объективности за счет возможности вынесения суждения с учетом показателя, отражающего состояние всего сердца.

Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированным сердцем и улучшить результаты трансплантации сердца за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии путем определения уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме венозной крови.

Нами эмпирически установлен достоверный диагностический показатель развития острого отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-27 в плазме венозной крови реципиентов сердца.

Использование предполагаемого маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение эндомиокардиальной биопсии для уточнения диагноза острого отторжения трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца (клеточного и/или гуморального типа) в плазме венозной крови реципиентов определяют уровень экспрессии микроРНК-27 по формуле

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-27,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.

При величине Э менее -5,07 диагностируют наличие острого отторжения трансплантата.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используют плазму венозной крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.

Уровень экспрессии микроРНК-27 определяют методом полимеразной цепной реакции, например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).

Определение проводится в соответствии с инструкцией к наборам. РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляется 1,6×108 копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.

Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируются путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t° = 37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t° = 95°C с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t° = 94°C, 30 секунд при t° = 55°C и 30 секунд при t° = 70°C в амплификаторе.

Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы венозной крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-27, отн.ед.,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27 (то есть значение порогового цикла микроРНК-27 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).

У реципиентов сердца с величиной экспрессии микроРНК-27 Э ниже -5,07 отн. ед. в плазме венозной крови определяют наличие острого отторжения трансплантата.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1

Пациенту Б., 40 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Измеренный на 23 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-27 в плазме венозной крови составил Э = -7,49 отн. ед. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие острого отторжения трансплантата. По данным морфологического исследования образца ЭМБ диагноз подтвержден: выявлена диффузная инфильтрация мононуклеарными клетками в интерстиции и отек субэндокардиальной зоны, что соответствует степени R1G острого клеточного отторжения по классификации ISHLT-2014. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.

Пример 2

Пациентке К., 35 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Измеренный на 128 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-27 в плазме венозной крови составил Э = -5,82 отн. ед.

В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие острого отторжения трансплантата. По данным морфологического исследования образца ЭМБ диагноз подтвержден: выявлена активация эндотелия в сосудах миокарда и периваскулярный клеточный инфильтрат, что соответствует степени pAMR-1 острого гуморального отторжения по классификации ISHLT-2013. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.

Пример 3

Пациенту П., 57 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал без осложнений. В течение периода наблюдения (с первых суток и до 6 месяцев после трансплантации) у пациента данных о воспалительных процессах не получено. Измеренный на 154 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-27 в плазме венозной крови составил Э = -4,14 отн. ед. По данным морфологического исследования образца ЭМБ признаков острого отторжения трансплантата не выявлено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 46 реципиентах сердца, среди них: острое клеточное отторжение наблюдалось у 20 реципиентов, гуморальное - у 6 реципиентов и смешанное - у 1 реципиента. Специфичность предлагаемого способа составляет 70,8%.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность диагностировать острое отторжение трансплантата у реципиентов сердца.

Способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиента трансплантированного сердца, отличающейся тем, что в плазме венозной крови определяют уровень экспрессии микроРНК-27 по формуле

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-27,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-27,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39,

и при величине Э менее -5,07 диагностируют наличие острого отторжения трансплантата.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к различным областям народного хозяйства (медицине, химической и фармацевтической промышленности), где есть потребность в измерении массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах, в том числе животных и растительных тканях методом газожидкостной хроматографии.

Изобретение относится к различным областям народного хозяйства (медицине, химической и фармацевтической промышленности), где есть потребность в измерении массовой концентрации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в биологических средах, в том числе животных и растительных тканях методом газожидкостной хроматографии.

Изобретение относится к области животноводства, ветеринарии и экологии и предназначено для определения концентрации кадмия в мышечной ткани крупного рогатого скота. Способ определения концентрации кадмия в мышечной ткани крупного рогатого скота включает анализ субстрата в виде сыворотки крови.

Изобретение относится к области медицины, в частности к детской оториноларингологии, аллергологии, клинической фармакологии, и может быть предназначено для диагностики хронического экссудативного среднего отита аллергического генеза. У детей в возрасте от 2 до 12 лет включительно с воспалительной патологией среднего уха при индексе аллергизации от 1,6 до 3,7 включительно диагностируют хронический экссудативный средний отит аллергической этиологии.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкогематологии, и предназначено для прогнозирования развития рецидива диффузной В-крупноклеточной лимфомы. В периферической крови больных на этапах обследования после или до очередного курса противоопухолевой терапии проводят общий анализ крови, определяют содержание элементов красной и белой крови, рассчитывают соотношение нейтрофилов к лимфоцитам (N/L).

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии, ангиологии, кардиохирургии, терапии, реабилитологии. До имплантации кардиовертера-дефибриллятора у пациента определяют галектин-3 в сыворотке крови посредством иммуноферментного метода.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и касается способа прогнозирования вероятности позитивного статуса рецептора эпидермального фактора роста Her2/neu в метастатических лимфатических узлах у больных раком молочной железы, характеризующегося тем, что до проведения системной терапии проводят радионуклидное исследование метастатических лимфатических узлов, для чего пациенту вводят радиофармацевтический препарат «99mTc - DARPin9_29» в дозе 1200 мкг, через 2 часа после введения выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) органов грудной клетки, при этом оценивают накопление меченного протеина в пораженном аксиллярном лимфатическом узле и симметричном участке противоположной аксиллярной области, определяют соотношение узел/фон и оценивают в баллах, при этом при соотношении узел/фон менее или равно 5,0 значение оценивают в 1 балл, а при соотношении узел/фон более 5,0 значение оценивают в 2 балла, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле.
Изобретение относится к области физиологии, иммунологии, лабораторной диагностики, патофизиологии и предназначено для оценки адаптированности иммунной системы по уровню лимфопролиферации человека в условиях Арктики. В периферической венозной крови определяют концентрацию фенотипов лимфоцитов CD10+ и CD71+.
Изобретение относится к области физиологии, иммунологии, лабораторной диагностики, патофизиологии и предназначено для прогнозирования сокращения резервных возможностей иммунного гомеостаза у людей со стажем проживания и работы в условиях Арктики более 10 лет. В периферической венозной крови обследуемых лиц определяют содержание лимфоцитов CD95+ с рецепторами к апоптозу и лимфоцитов CD71+ с рецепторами к трансферрину.

Изобретение относится к области биологии и медицины и предназначено для выделения опухолевых клеток из периферической крови. Периферическую кровь разбавляют буфером и фильтруют через трековую мембрану с порами при пониженном давлении, на которой предварительно иммобилизуют антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM).
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано в неврологии, хирургии, анестезиологии-реаниматологии и смежных медицинских специальностях. Способ оценки риска развития бактериального менингита у пациентов в критическом состоянии включает цитологическое, биохимическое и микробиологическое исследования состава спинномозговой жидкости (СМЖ). Дополнительно определяют концентрацию бактериального метаболита – 4-гидроксифенилмолочной кислоты (n-ГФМК) в СМЖ. Концентрация n-ГФМК в СМЖ больше или равная 0,7 мкмоль/л свидетельствует о высоком уровне риска развития бактериального менингита у пациента, концентрация n-ГФМК в СМЖ менее 0,7 мкмоль/л свидетельствует о низком уровне риска развития бактериального менингита. Изобретение обеспечивает диагностику бактериального менингита у пациентов в острой фазе манифестации клинических признаков заболевания, а также оценку риска развития вторичного бактериального менингита, являющегося жизнеугрожающим осложнением у пациентов всех возрастных категорий в отделениях нейрореанимации и нейрохирургии. 4 пр.
Наркология
Наверх