Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови

Изобретение относится к области биологии и медицины и предназначено для выделения опухолевых клеток из периферической крови. Периферическую кровь разбавляют буфером и фильтруют через трековую мембрану с порами при пониженном давлении, на которой предварительно иммобилизуют антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM). Трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками заливают раствором, сохраняющим структуру клеток, представляющим собой сыворотку крови человека или животных, высушивают путем вращения трековой мембраны вокруг оси и проводят цитологическое исследование опухолевых клеток непосредственно на трековой мембране. Изобретение обеспечивает повышение достоверности определения патологической природы опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови, за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной/клеточной биологии и диагностической медицины, а именно к разработке способов выделения клеток определенного типа из биологических образцов и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний, пренатальной диагностики и др.

Задачи выделения малочисленных диагностически значимых клеток из периферической крови актуальны в различных областях медицины. В частности, разработка методов выделения и характеризации опухолевых клеток, отделившихся от основной опухоли и циркулирующих в периферической крови (так называемых циркулирующих клеток опухоли), является активно развивающейся областью науки и биотехнологии. Хотя происхождение метастазов и факторы, определяющие их развитие в том или другом органе, до конца не изучены, не вызывает сомнения, что циркулирующие опухолевые клетки играют основную роль в их образовании. В то время как обнаружение микрометастазов является дорогостоящим и ограничено по чувствительности возможностями существующих методов визуализации, анализ периферической крови для обнаружения циркулирующих клеток опухоли призван обнаружить предпосылки к метастазированию до фактического образования метастазов, а в силу своей малоинвазивности может проводиться так часто, как требуется. Поэтому, в случае достаточной чувствительности и специфичности, выделение и исследование циркулирующих клеток опухоли может быть в дальнейшем использовано для контроля прогресса и хода лечения онкологических заболеваний. Установление опухолевой принадлежности детектируемых клеток требует цитологического, а в ряде случаев иммуноцитохимического и генетического анализа обнаруженных клеток. Поэтому среди способов выделения циркулирующих опухолевых клеток из периферической крови наиболее пригодными для клинического применения являются те из них, которые позволяют проведение цитологического исследования выделенных клеток с целью подтверждения их опухолевой природы.

Известен способ селективного выделения популяции жизнеспособных клеток из биологических жидкостей, защищенный патентом РФ № 2 423 698 C1, кл. G01N 33/48, G01N 33/53 , опубл 10.07.2011.

Для выделения популяции жизнеспособных клеток образец биологической жидкости помещают в ячейку микрофлюидного устройства, содержащую в качестве фильтрующего материала кремниевую микроканальную матрицу со сквозными отверстиями размером 3-30 мкм и длиной каналов 50-300 мкм, и пропускают ее через матрицу со скоростью 0,1-4 мл/мин. В случае разделения клеток по размеру, фракцию клеток, имеющих размер меньше, чем размер сквозных отверстий в матрице, собирают после прохождения микроканальной матрицы, а более крупные клетки элюируют с каналов микроканальной матрицы обратным током элюента. В случае рецептор-специфичного выделения клеток поверхность матрицы предварительно модифицируют антителами против специфических рецепторов клеток, а целевые клетки элюируют с каналов матрицы изотипическими иммуноглобулинами или гаптенами.

Недостатком известного способа является непрозрачность используемой кремниевой матрицы и, как следствие, невозможность цитологического исследования задержанных ей клеток.

Известен способ обнаружения или выделения/получения циркулирующей опухолевой клетки, использующий метод пролиферации клеток, защищенный патентом РФ № 2 707 083 С1, кл. G01N 33/487, C12N 5/09, C12N 5/095, опубл. 03.03.2016.

В известном способе для выделения циркулирующих опухолевых клеток сначала производят выделение мононуклеарной фракции периферической крови, затем производят посев полученной фракции в луночный планшет, в который предварительно вводят культуральную среду для культивирования циркулирующих опухолевых клеток и инкубируют посеянные клетки. После инкубации культуральную среду удаляют и обнаруживают адгезивные опухолевые клетки, прикрепленные к лунке планшета.

Недостатком описанного способа является длительность проведения анализа.

Наиболее близким к заявляемому изобретению, выбранным в качестве прототипа, является способ осторожного отделения жизнеспособных спорадических клеток из жидкостей организма, таких как кровь, от злокачественных выпотов, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, жидкости перитонеального лаважа и околоплодных вод. описанный в WO 2014/198242 Al, опубл.2014.12.18. Al

В способе используется фильтрующая мембрана, которая находится в тесном контакте с абсорбирующим материалом. Используя настоящий способ, можно изолировать, например, циркулирующие и диссеминированные опухолевые клетки, клетки эндометрия и циркулирующие клетки трофобласта, что дает возможность последующего обнаружения, количественной оценки, характеризации и культивирования указанных клеток.

Недостатком известного способа является недостаточная достоверность определения опухолевой принадлежности изолированных клеток, связанная с невозможностью их полноценного цитологического анализа непосредственно на трековой мембране, без их культивирования.

Техническая проблема, решаемая предлагаемым изобретением, - создание эффективного способа выделения опухолевых клеток из периферической крови с помощью фильтрации.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении достоверности определения патологической природы опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови, за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения опухолевых клеток из периферической крови, включающем разбавление буфером периферической крови и фильтрацию через трековую мембрану с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, фильтрацию осуществляют из разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками заливают раствором, сохраняющим структуру клеток, таким как сыворотка крови человека или животных, высушивают путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности и проводят цитологическое исследование опухолевых клеток непосредственно на трековой мембране .

В качестве раствора, сохраняющего структуру клеток, используют фетальную телячью сыворотку.

Предварительно на трековой мембране могут быть иммобилизованы антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, отсутствующим на поверхности нормальных клеток крови, например, к эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM).

Изобретение поясняется клиническими примерами и иллюстрациями.

На фиг. 1 изображена фильтр-кассета, общий вид

На фиг. 2 – цитологическая картина к примеру 2 задержанных трековой мембраной клеток, когда до фильтрации фильтр-кассету не заполняют фосфатным буфером;

На фиг. 3 – цитологическая картина к примеру 3 задержанных трековой мембраной клеток, когда после окончания фильтрации трековую мембрану высушивают на воздухе и окрашивают по Паппенгейму,

На фиг. 4 - цитологическая картина к примеру 1 задержанных трековой мембраной клеток, когда фильтрацию осуществляют предлагаемым способом.

Фиг. 5 - цитологическая картина к примеру 4 задержанных трековой мембраной циркулирующих опухолевых клеток пациента с плоскоклеточной карциномой слизистой оболочки полости рта.

Фильтр-кассета (фиг. 1) состоит из верхней части 1, содержащей трубку для загрузки образца периферической крови 2, расположенной между двумя кольцевыми силиконовыми прокладками 3 трековой мембраны 4 с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, и нижней части 5, содержащей трубку 6 для подключения к шприцевому насосу 7. Винты 8 и гайки 9 служат для скрепления обеих половин 1 и 5 фильтр-кассеты между собой. В шприцевом насосе 7 установлен шприц 10.

Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови осуществляют следующим образом.

Трековую мембрану 4 с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, например, трековую мембрану в виде диска диаметром 25 мм из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10⁵/см² производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, вкладывают между двумя кольцевыми прокладками 3, например, кольцами из пищевого силикона толщиной 1 мм с внешним диаметром 25 мм и внутренним диаметром 16 мм. Кольцевые прокладки 3 с трековой мембраной 4 между ними вкладывают между верхней частью 1 фильтр-кассеты и нижней частью 5 фильтр-кассеты и скрепляют с помощью винтов 8 и гаек 9.

Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7, например SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., со шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца в верхней части 1 фильтр-кассеты образец периферической крови пациента, разбавленной в 2 – 2,5 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4. Начинают фильтрацию разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, созданном за счет включения шприцевого насоса 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной периферической крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 50-100 мкл раствора, сохраняющего структуру клеток, таким как сыворотка крови человека или животных (например, фетальная телячья сыворотка, Sigma-Aldrich, USA). Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки раствора, сохраняющего структуру клеток, кладут мембрану 4 клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения мембраны на предметном стекле вокруг оси, перпендикулярной его поверхности со скоростью 4000-6000 об/мин с помощью специальной центрифуги, например Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования, которое проводят непосредственно на трековой мембране 4.

Использование буфера с рН 7.2-7.4 объясняется тем, что данный диапазон рН является физиологическим для плазмы крови, при другом рН возможно изменение объема или повреждение клеток. При разбавлении периферической крови перед фильтрацией менее, чем в два раза, могут забиваться поры трековой мембраны 4 вследствие слишком высокой концентрации клеток в образце. Разбавление более, чем в два раза, возможно, но большее, чем в 2,5 раза, разбавление приводит к увеличению общего объема фильтруемого образца и, как результат, к увеличению времени фильтрации.

Давление, создаваемое в буфере под трековой мембраной, определяется скоростью откачки жидкости и параметрами системы, например, диаметром трубок.

Максимальная рекомендуемая скорость откачки 0.5 мл/мин выбрана как приблизительно в 10 раз меньшая, чем скорость фильтрации в той же фильтр-кассете, если не подключать шприцевой насос 7, и трубка 6, присоединенная к нижней части 5 фильтр-кассеты, будет открытой снизу. Поскольку фильтрация эритроцитов и лейкоцитов через трековую мембрану 4 сопряжена с значительной обратимой деформацией клеток, увеличение скорости фильтрации выше определенного порога может приводить к повреждению фильтруемых клеток за счет создания высокой концентрации клеток и повышенного давления в области непосредственно над мембраной. Фильтрация со скоростью меньшей, чем 0.5 мл/мин, не влияет на результаты, но увеличивает общее время фильтрации.

Пример 1

Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 по предлагаемому способу.

На трековой мембране 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10⁵/см² производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, иммобилизуют антитела к поверхностному антигену выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM), отсутствующему на поверхности нормальных клеток крови.

Для этого трековую мембрану обрабатывают кислородной плазмой (Harrick plasma PDC-002-CE, давление кислорода в камере - 400 mTorr, режим “HIGH” (частота 12 МГц)) в течении 3 минут. Затем заливают обработанную плазмой трековую мембрану 4 раствором антител к EpCAM в концентрации 50 мкг/мл в фосфатном буфере рН 7.2-7.4. Залитую раствором антител трековую мембрану 4 помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 10-14 часов при +4 ⁰С, затем отмывают 3 раза пятикратным объемом фосфатного буфера рН 7.2-7.4 и высушивают.

Клеточную линию MCF7 культивируют при температуре 37 ⁰С при 5% СО₂ в среде DMEM с GlutaMAX-1, Gibco, USA, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA, и раствора пенициллина-стрептомицина, BioWest, USA. Клетки отделяют от стенок культивационных флаконов с использованием раствора TrypLE, Gibco, USA, и определяют их концентрацию с помощью камеры Горяева. Венозную кровь здорового донора, взятую на К₃ЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема.

Сборку фильтр-кассеты (фиг. 1) осуществляют следующим образом. Модифицированную трековую мембрану 4 вкладывают между двумя кольцевыми прокладками 3. Кольцевые прокладки 3 и трековую мембрану 4 помещают между верхней частью 1 и нижней частью 5 фильтр-кассеты и скрепляют обе части фильтр-кассеты с помощью винтов 8 и гаек 9. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., со шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4. После этого, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной периферической крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA.

Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат проведения описанной процедуры представлен на фиг. 4. На фиг. 4 можно видеть мономорфную популяцию эпителиальных клеток с частично вакуолизированной цитоплазмой, ядрами округлой формы с одним или несколькими ядрышками, полностью соответствующую виду клеточной линии MCF7 в стандартных цитологических препаратах.

Пример 2.

Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 с фильтрацией из жидкой фазы в воздушную

Модификацию трековой мембраны 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10⁵/см² производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, осуществляют аналогично примеру 1. Клеточную линию MCF7 культивируют аналогично примеру 1. Венозную кровь здорового донора, взятую на К₃ЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема. Фильтр-кассету (фиг. 1) собирают аналогично примеру 1. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., с шприцем 10. Заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей фильтруемой клеточной смеси через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. Затем сливают с трековой мембраны излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат проведения описанной процедуры представлен на фиг. 3. На фиг. 3 можно видеть голое ядро клетки (внизу) и безъядерный фрагмент цитоплазмы (в центре), что свидетельствует о повреждении клеток в процессе фильтрации по данному протоколу.

Пример 3.

Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 без последующей сушки в цитоцентрифуге.

Модификацию трековой мембраны 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10⁵/см² производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, осуществляют аналогично примеру 1. Клеточную линию MCF7 культивируют аналогично примеру 1. Венозную кровь здорового донора, взятую на К₃ЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема. Фильтр-кассету (фиг. 1) собирают аналогично примеру 1. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., с шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4. После этого, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию в буфер при пониженном давлении, созданном за счет включения шприцевого насоса 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей фильтруемой клеточной смеси через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками, помещают на предметное стекло и высушивают на воздухе при комнатной температуре. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат проведения описанной процедуры представлен на фиг. 4. На фиг. 4 видна полностью разрушенная клетка (внизу), а также клетки с частично отсутствующей цитоплазмой и разрыхленной структурой хроматина ядра (в центре).

Сравнение цитологической картины клеток линии MCF7 на фиг. 2 (после фильтрации по предлагаемому способу) с результатами неполного протокола (фиг. 3-4) показывает, что проведение фильтрации из разбавленной фосфатным буфером периферической крови в фосфатный буфер, заливка трековой мембраны с задержанными на ней опухолевыми клетками фетальной телячьей сывороткой с последующим высушиванием путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности, уменьшает количество поврежденных опухолевых клеток и приближает их цитологическую картину к виду соответствующих клеток в стандартных цитологических препаратах.

Пример 4.

Выделение циркулирующих опухолевых клеток из периферической крови пациента с плоскоклеточной карциномой слизистой оболочки полости рта.

Сборку фильтр-кассеты (фиг. 1) осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве трековой мембраны 4 используют трековую мембрану iPORE из поликарбоната толщиной 19 мкм с порами диаметром 7±0,5 мкм и плотностью пор 2•10⁴/см² производства it4ip S.A., Belgium. После сборки фильтр-кассеты и подключению ее к шприцевому насосу 7, заполняют фильтр-кассету буфером, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10.

После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца кровь пациента c раком слизистой оболочки дна полости рта справа T4aN2aM0 стадия IV, разбавленную в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4. Начинают фильтрацию разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования. Цитологическая картина задержанных трековой мембраной клеток, полученная непосредственно на мембране, представленная на фиг. 5, полностью соответствует цитологической картине плоскоклеточной карциномы в стандартных цитологических препаратах. Сохранность клеток на фиг. 5 и отсутствия среди них артефактов, представленных на фиг. 3-4 к примерам 2 и 3, позволяет с высокой степенью уверенности отнести представленные на фиг. 5 клетки к плоскому эпителию и сделать вывод об их патологической природе.

Таким образом, предлагаемый способ выделения опухолевых клеток из периферической крови является более достоверным за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток, что позволяет цитологу надежно определять опухолевое происхождение задержанных клеток.

1. Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови, характеризующийся тем, что периферическую кровь разбавляют буфером и фильтруют через трековую мембрану с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, при пониженном давлении, на которой предварительно иммобилизуют антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM), трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками заливают раствором, сохраняющим структуру клеток, представляющим собой сыворотку крови человека или животных, высушивают путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности, и проводят цитологическое исследование опухолевых клеток непосредственно на трековой мембране.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки крови человека или животных используют фетальную телячью сыворотку.