Способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиентов сердца

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Определяют в плазме периферической крови реципиента концентрацию протеина плазмы А (РАРР-А) и при уровне РАРР-А выше 7 мМЕ/л диагностируют наличие острого отторжения трансплантата. Способ позволяет сократить время проведения диагностики при одновременном достижении достоверной диагностики острого отторжения трансплантата, а также повысить выживаемость реципиентов и улучшить результаты трансплантации сердца за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии. 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении реципиентов сердца для диагностики острого отторжения трансплантата.

Несмотря на значительные достижения и существенный прогресс в лечении реципиентов сердца, острое отторжение трансплантированного сердца является главной причиной потери трансплантата на ранних и отдаленных сроках после операции. Частыми причинами возникновения кризов отторжения выступают: недостаточная дозировка иммуносупрессивнных препаратов, несоблюдение реципиентом предписанной схемы лекарственной терапии, активация иммунной системы пациента вследствие развития воспалительных процессов инфекционного генеза и др.

Приоритетной задачей большинства современных исследований в области трансплантации сердца стоит повышение продолжительности и качества жизни реципиентов, в том числе за счет совершенствования технологий диагностики посттрансплантационных осложнений. Однако диагностика острого клеточного и гуморального отторжения сердечного трансплантата по-прежнему базируется на результатах инвазивных методов – эндомиокардиальной биопсии и коронароангиографии.

Объективным отражением системности процессов, происходящих в организме реципиентов, является изменение концентрации в крови ряда специфических молекул - биомаркеров. С этой позиции поиски новых эффективных биомаркеров, сигнализирующих о развитии патологии трансплантированного сердца приобретают особую актуальность.

В последние годы получены убедительные данные о прогностическом значении ряда биомаркеров воспаления, неоангиогенеза в отношении развития сердечно-сосудистых осложнений у больных ишемической болезнью сердца и у пациентов с трансплантированным сердцем.

Показан диагностический потенциал измерения концентрации VEGF-A в образцах крови пациентов в отношении развития острого клеточного отторжения [RU 2618404 С1], но данная методика эффективна только в отношении диагностики острого клеточного отторжения, несмотря на то, что около 20% случаев острого отторжения трансплантированного сердца протекает по гуморальному типу.

Известно, что ассоциированный с беременностью протеин плазмы А (РАРР-А), будучи цинксодержащей металлопротеиназой, активирующей инсулиноподобный фактор роста, в изобилии продуцируется клетками атеросклеротической бляшки, особенно нестабильной [Cosin-Sales J., Christiansen M., Kaminski P. et al., Pregnancy-associated plasma protein A and its endogenous inhibitor, the proform of eosinophil major basic protein (proMBP), are related to complex stenosis morphology in patients with stable angina pectoris // Circulation. - 2004. - Vol. 109. - P. 1724-1728]. Источниками РАРР-А являются макрофаги, фибробласты, остеобласты, стромальные клетки костного мозга и гладкомышечные клетки сосудистой стенки.

Прогностическое значение уровней РАРР-А в отношении развития сердечно-сосудистых осложнений (острого коронарного синдрома, острого инфаркта миокарда и мозгового инсульта) показано не только у больных ишемической болезнью сердца [Steffensen L.B., Conover С.А., Oxvig С. РАРР-А and the IGF system in atherosclerosis: what's up, what's down? // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2019. - Vol. 317(5): H1039-H1049], но и у реципиентов солидных органов. Болезнь коронарных артерий пересаженного сердца (васкулопатия трансплантата) является наиболее частой причиной ретрансплантации сердца и смерти пациентов, проживших более года после операции [Nagumo S, Gallinoro E, Candreva A. et al., Vessel Fractional Flow Reserve and Graft Vasculopathy in Heart Transplant Recipients // J Interv Cardiol. - 2020. - Vol. 12. - doi: 10.1155/2020/9835151]. В исследовании Шевченко О.П. и соавт. показано, что у реципиентов с васкулопатией уровень РАРР-А выше, чем у пациентов без таковой [Шевченко О.П. Ассоциированный с беременностью протеин плазмы а (РАРР-А) при васкулопатии трансплантированного сердца / О.П. Шевченко, О.В. Орлова, Э.Н. Казаков и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - Том XIII. - №2. - С. 46-51]. В то же время не была изучена диагностическая значимость РАРР-А в отношении острого отторжения сердечного трансплантата, развивающегося как в ранние, так и в отдаленные сроки после пересадки.

На сегодняшний день объективным методом верификации степени и характера острого отторжения трансплантированного сердца является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) и коронографическое исследование [Клинические рекомендации. Трансплантация сердца, наличие трансплантированного сердца, отмирание и отторжение трансплантата сердца / Профессиональная ассоциация: Общероссийская общественная организация трансплантологов «Российское трансплантологическое общество». - 2020] (прототип). ЭМБ выполняются в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированного сердца.

Однако ЭМБ имеет ряд ограничений и рисков, свойственных инвазивным методам диагностики. Кроме того, при получении биоптата исследуют локальный участок, который не всегда может отражать состояние целого трансплантированного органа. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода. В связи с его трудоемкостью существует очевидная необходимость в разработке нового неинвазивного диагностического средства, которое может не только выявить наличие острого отторжения трансплантата, но и контролировать лечение реципиента.

Нами поставлена задача – разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики острого отторжения трансплантата клеточного и/или гуморального типов у реципиентов трансплантированного сердца.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого отторжения клеточного и/или гуморального типов как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационном периоде у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов трансплантации сердца, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой ЭМБ и уточнения тактики ведения больных путем определения концентрации РАРР-А в плазме периферической крови.

Нами эмпирически установлен достоверный диагностический показатель развития острого отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке уровня концентрации РАРР-А в плазме периферической крови реципиентов сердца, который оказался информативным в любые сроки после трансплантации.

Использование предполагаемого маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение ЭМБ для уточнения диагноза острого отторжения трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики острого отторжения (клеточного и/или гуморального типа) трансплантированного сердца в плазме периферической крови реципиентов определяют концентрацию РАРР-А и при уровне РАРР-А выше 7 мМЕ/л диагностируют острое отторжение трансплантата.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования концентрации биомаркера используют плазму периферической крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму переносят в пробирки объемом 1,5 мл и замораживают при необходимости. Образцы плазмы необходимо хранить при температуре -20°С.

Концентрация РАРР-А может быть измерена иммуноферментным методом, например, с помощью наборов реагентов РАРР-А ELISA (IBL Internatinal GMBH, Hamburg, Germany).

Определение проводят в соответствии с инструкцией к набору.

В подготовленные для работы планшеты с фиксированными на дне лунок моноклональными антителами к РАРР-А, добавляют калибраторы, контроли, образцы плазмы периферической крови пациентов по 10 мкл и 100 мкл рабочего буфера. Тщательно размешав смесь в течение 10 секунд, микропланшет инкубируют 30 минут при комнатной температуре (18-25°С).

После трехкратной промывки планшета от несвязавшихся компонентов в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата (HRP). Инкубируют планшет при комнатной температуре (18-25°С) в течение 30 минут.

На заключительном этапе трехкратно отмывают планшет и вносят по 100 мкл ТМБ-субстрата для выявления ферментной метки.

Время инкубации составляет 15 минут при комнатной температуре (18-25°С). Реакцию останавливают с помощью стоп-реагента (50 мкл в лунку). Оптическую плотность при длине волны 450 нм измеряют на спектрофотометре. Интенсивность изменения цвета реагентной смеси прямо коррелирует с концентрацией РАРР-А в исследуемом образце.

При уровне РАРР-А выше 7 мМЕ/л у реципиентов сердца диагностируют острое отторжение трансплантата.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1.

Пациенту Н., 26 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Измеренный на 378 сутки после операции уровень концентрации РАРР-А в плазме периферической крови составил 26 мМЕ/л. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие острого отторжения трансплантата. По данным морфологического исследования образца посредством ЭМБ диагноз подтвержден: выявлено острое клеточное отторжение, что соответствует степени клеточного отторжения R1G по классификации ISHLT-2014. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.

Пример 2.

Пациенту П., 25 лет, выполнена ортотопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал без осложнений. В течение периода наблюдения (с 7 суток и до 14 месяцев после трансплантации) у пациента данных морфологических исследований образцов ЭМБ об эпизодах развития острого отторжения сердечного трансплантата не получено. Измеренный на 325 сутки после операции уровень концентрации РАРР-А составил 2 мМЕ/л. По данным морфологического исследования образца посредством ЭМБ признаков острого отторжения трансплантата не выявлено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 28 реципиентах сердца. У 9 (32,1%) реципиентов отмечены эпизоды острого клеточного и/или гуморального отторжения, верифицированных ЭМБ; из них в 8 (88,9%) случаях уровень концентрации РАРР-А был выше рассчитанного порогового значения 7 мМЕ/л.

Чувствительность предлагаемого способа составляет 88,9%.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность диагностировать острое отторжение трансплантата у реципиентов сердца.

Способ диагностики острого отторжения трансплантата у реципиента трансплантированного сердца, отличающейся тем, что в плазме периферической крови реципиента определяют концентрацию протеина плазмы А (РАРР-А) и при уровне РАРР-А выше 7 мМЕ/л диагностируют наличие острого отторжения трансплантата.