Питательная среда для культивирования микроорганизмов из burkholderia cepacia complex

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для первичного посева клинического материала и культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex. Питательная среда для культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia содержит агар Мюллера-Хинтона, железа (III) гидроксида полимальтозата и селективную добавку и в заданных количествах. При этом селективная добавка содержит полимиксин Б, гентамицин и тиканциллин в заданных количествах. Изобретение позволяет улучшить микробиологическую диагностику инфекционных осложнений, вызванных микроорганизмами из Burkholderia cepacia complex при первичном посеве из клинического материала от пациентов с муковисцидозом. 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для первичного посева клинического материала и культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex.

Уровень техники

Микроорганизмы из Burkholderia cepacia complex относятся к неферментирующим грамотрицательным бактериями, отличаются культуральными и биологическими свойствами, а также имеют доказанное клиническое значение в развитии инфекционно-воспалительных процессов в бронхолегочной системе у пациентов с муковисцидозом и являются причиной тяжелого осложнения - «цепация-синдрома». Данное состояния сопровождается некротизирующей пневмонией, лихорадкой, сепсисом и может развиться в течение нескольких часов [R. Lord, A.M. Jones, A. Horsley. Antibiotic treatment for Burkholderia cepacia complex in people with cystic fibrosis experiencing a pulmonary exacerbation. Cochrane Database of Systematic Reviews 2020, Issue 4]. Однако культивирование, идентификация и определение чувствительности к антимикробным препаратам микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex требует особых условий с затратой длительного периода времени - до нескольких суток. В связи с этим необходима среда для первичного посева клинического материала от пациентов с муковисцидозом с целью ускоренного выделения микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex. Известно, что одним из незаменимых факторов роста и метаболизма микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex является железо, которое данные бактерии приобретают из внешней среды с помощью специфических механизмов получения и усвоения, в частности из физиологического депо железа в клетках человека - белка ферритина. [А.Т. Butt, M.S. Thomas. Iron Acquisition Mechanisms and Their Role in the Virulence of Burkholderia Species. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2017; 7:460.]. В связи с этим нами предложено использование железа (III) гидроксида полимальтозата, имеющего сходную структуру с ферритином в качестве одного из дополнительных компонентов питательной среды.

Известно использование для первичного посева клинического материала от пациентов с муковисцидозом с целью выявления микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex селективной среды OFPBL Agar - оксидазно/ферментативный-полимиксин-бацитрацин-лактозный агар. [Руководство по микробиологической диагностике инфекций дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом / С.В. Поликарпова, С.В. Жилина, О.В. Кондратенко и др. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2019, - 128 с.]. Данный способ принимается за прототип.

Недостатком использования данной питательной среды является длительное срок культивирования микроорганизмов, продолжающийся не менее 5 суток.

В научной литературе имеются данные о возможности культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex с использованием 5% кровяного агара [М.Ю. Чернуха, И.А. Шагинян, В.Г. Жуховицкий и др. Применение системы MALDI Biotyper и алгоритма микробиологической диагностики для идентификации неферментирующих микроорганизмов, выделенных из дыхательных путей у больных муковисцидозом. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2017. - Т. 17 - №4. - С. 327-334].

Недостатком использования данной питательной среды является то, что 5% кровяной агар не является селективной средой, а, следовательно, при работе с нестерильным в норме клиническим материалом возможно подавление роста микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex другими быстрорастущими микроорганизмами, что может привести к ложноотрицательному результату исследования.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения улучшение микробиологической диагностики инфекционных осложнений, вызванных микроорганизмами из Burkholderia cepacia complex при первичном посеве из клинического материала от пациентов с муковисцидозом.

Это достигается тем, что в отличие от известных питательных сред 38 г агара Мюллера-Хинтона растворяется в 1000 мл воды, размешивается до растворения и нагревается до кипения. После этого стерилизуется автоклавированием 15 минут при температуре 121°С и охлаждается до 45-50°С. Далее добавляется селективная добавка, содержащая 150000 ЕД полимиксина Б, 5 мг гентамицина и 100 мг тиканциллина из расчета на 1000 мл готовой среды. Затем дополнительно вносится 285,76 мг железа (III) гидроксида полимальтозата, что соответствует 80 мг железа.

Технический результат изобретения заключается в том, что заявленная питательная среда позволяет выделить микроорганизмы из Burkholderia cepacia complex при первичном посеве материала от пациентов с муковисцидозом в более короткие сроки - за 24-48 часов.

Осуществление изобретения

Приготовление предложенной питательной среды заключается в следующем: 38 г агара Мюллера-Хинтона растворяется в 1000 мл воды, размешивается до растворения и нагревается до кипения. После этого стерилизуется автоклавированием 15 минут при температуре 121°С и охлаждается до 45-50°С. Далее добавляется селективная добавка, содержащая 150000 ЕД полимиксина Б, 5 мг гентамицина и 100 мг тиканциллина из расчета на 1000 мл готовой среды. Затем дополнительно вносится 285,76 мг железа (III) гидроксида полимальтозата, что соответствует 80 мг железа.

Предлагаемая питательная среда позволяет сократить сроки культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex до 24-48 часов.

Использование предлагаемой питательной среды не требует применения дорогостоящего оборудования, позволяет выделить микроорганизмы из Burkholderia cepacia complex при первичном посеве клинического материала от пациентов с муковисцидозом.

Сущность применения заявленной питательной среды поясняется следующими результатами оценки продуктивности предлагаемой питательной среды в сравнении со средами с содержанием других концентраций железа (III) гидроксида полимальтозата в пересчете на железо. Продуктивность - количество клеток, давших видимый рост, выраженный в процентах по трем показателям: менее 50%, 50-69%, 70% и более от количества клеток в инокулюме. Для оценки продуктивности сравнивался рост 50 штаммов микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex на питательных средах с добавлением железа (III) гидроксида полимальтозата в концентрациях, соответствующих 10 мг, 20 мг, 40 мг, 80 мг и 120 мг железа. В качестве контрольной среды использовался OFPBL Agar без добавления железа (III) гидроксида полимальтозата. Показатели продуктивности питательной среды на первые сутки культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex представлены в таблице 1. Показатели продуктивности питательной среды на вторые сутки культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex представлены в таблице 2. После первых суток культивирования статистически достоверные различия (р<0,01, при расчете критерия χ²) были получены по предлагаемой питательной среде с концентрацией железа 80 мг по отношению к OFPBL Agar без добавки, содержащей железо и питательным средам с концентрацией железа 20 мг и 40 мг. На вторые сутки культивирования статистически достоверные различия были получены по предлагаемой питательной среде с концентрацией железа 80 мг по отношению к OFPBL Agar без добавки, содержащей железо и питательным средам с концентрацией железа 10 мг. Полученные сопоставимые результаты для концентраций 80 и 120 мг железа позволяют использовать добавку в меньшей из тестируемых концентраций для достижения лучшего результата по показателю продуктивности.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов из Burkholderia cepacia complex, приготавливаемая путем растворения 38 г агара Мюллера-Хинтона в 1000 мл воды, размешивания до растворения и нагревания до кипения с последующим автоклавированием 15 минут при температуре 121°С и охлаждением до 45-50°С, ОТЛИЧАЮЩАЯСЯ добавлением селективной добавки, содержащей 150000 ЕД полимиксина Б, 5 мг гентамицина и 100 мг тиканциллина из расчета на 1000 мл готовой среды с дополнительным внесением 285,76 мг железа (III) гидроксида полимальтозата, что соответствует 80 мг железа.