Питательная среда для культивирования лактобактерий

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству. Питательная среда для культивирования микроорганизмов рода Lactobacillus содержит мелассу свекловичную, мелассу кукурузную, K₂НРО₄, дрожжевой экстракт, пектин яблочный, микроорганизмы рода Lactobacillus и воду в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить выход микроорганизмов рода Lactobacillus. 5 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству, а конкретно к способу культивированию микроорганизмов на основе молочнокислых бактерий для получения пробиотической добавки с целью повышения мясной продуктивности перепелов.

Современное птицеводство многими путями решает проблему максимальной реализации биоресурсного потенциала птицы и сохранения при этом ее продуктивного здоровья. Ускорение динамики роста и повышение суточных приростов живой массы птицы при снижении экономических затрат на 1 кг прироста живой массы тела является одной из основных задач птицеводства, в частности, перепеловодства.

Известен способ, предусматривающий внесение в питательную среду пектина из расчета 5-6 г/л (0,5-0,6%), обеспечивающего накопление биомассы микроорганизмов и придачу кисломолочному продукту пребиотических свойств (Патент РФ №2023396, МПК А23С 9/12, А23С 9/127, 02.03.1993 г.).

Недостатком способа является отсутствие информации о виде пектина, его консистенции, при какой температуре он добавляется, что в целом не может гарантировать положительный результат.

Известен способ предусматривающий применение в составе рациона перепелов пробиотической добавки, состоящей из мелассы кормовой, K₂НРО₄ дрожжевого экстракта и воды (Интенсификация процесса культивирования физиологически-адаптированных штаммов лактобацилл как основа создания биопрепаратов микробного происхождения для птицеводства / А.Г. Кощаев, Ю.А. Лысенко, Мищенко В.А. [и др.] // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2017. - №04 (128). - С. 1102-1115).

Наиболее близким является техническое решение, в котором используют питательную среду для культивирования лактобактерий, состоящей из следующих соотношений исходных компонентов (г/л): меласса свекловичная (22-23), меласса кукурузная (22-23), K₂НРО₄ (2,0), дрожжевой экстракт (0,02), микроорганизмы Lactobacillus agilis с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл (99-101), остальное вода (Патент РФ №2686326, МПК C12N 1/20, A61K 35/74, А61Р 43/00, 25.04.2019 г.).

Недостатком данного способа является то, что при использовании данной пробиотической добавки в рационе птицы будет происходить гибель живой культуры микроорганизма из-за агрессивной среды желудочно-кишечного тракта.

Техническим результатом является повышение жизнеспособности молочнокислых культур, являющиеся представителями естественной микрофлоры ЖКТ диких перепелов, за счет использования в питательной среде порошкообразного яблочного пектина.

Технический результат достигается тем, что в питательной среде для культивирования лактобактерий, состоящей из мелассы кормовой, K₂НРО₄, дрожжевого экстракта и воды, согласно изобретению в питательную среду при температуре 30-40°C добавляют порошкообразный яблочный пектин и вводят микроорганизмы Lactobacillus brevis В-13079 с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл при следующем соотношении исходных компонентов, г/л:

Меласса свекловичная - 22-23

Меласса кукурузная - 22-23

K₂НРО₄ - 2,0

Дрожжевой экстракт - 0,02

Пектин яблочный - 2,0-4,0

Микроорганизмы Lactobacillus brevis В-13079 с титром не менее 1,0×10⁵

КОЕ/мл - 99-101

Вода - остальное

Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что используется мелассная среда, включающая в свой состав яблочный пектин (2,0-4,0 г/л), для выращивания молочнокислых микроорганизмов - Lactobacillus brevis В-13079, которые независимыми микробиологическим методом, методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и метагеномными методами были выделены из ЖКТ диких перепелов (Сравнительный анализ и пробиотический потенциал новых штаммов рода Lactobacillus из эволюционно закрепленных ассоциаций желудочно-кишечного тракта дикой птицы / В.В. Радченко, Е.В. Ильницкая, Т.М. Шуваева, М.В. Александрова, А.В. Лунева, Ю.А. Лысенко, Н.Ю. Басова, А.Н. Некрасов, А.Г. Кощаев // Биофармацевтический журнал. - 2020. - Т. 12. №1. - С. 44-49).

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Соответствие заявляемого решения критерию патентоспособности «промышленная применимость» обусловлено тем, что предлагаемое техническое решение работоспособно и возможно его использование для выращивания перепелов.

Питательная среда для культивирования лактобактерий воспроизводится следующим образом.

Культивирование микроорганизмов Lactobacillus brevis В-13079 осуществляют в среде, состоящей из мелассы кормовой - 45,0 г, K₂НРО₄ - 2,0 г, дрожжевого экстракта - 0,02 г и порошкообразного яблочного пектина, взятого в количестве 3,0 г в расчете на 1 литр воды при этом добавленного в питательную среду при температуре 30-40°C для равномерного его распределения и полного растворения. Затем в полученную смесь добавляют микроорганизмы Lactobacillus brevis В-13079 с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл в количестве 100,0 г/л и культивируют при температуре 37°C, в течение 24 ч.

При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре ниже 30°C не происходит его полного растворения и равномерного распределения.

При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре выше 40°C происходит частичное разрушение пектина.

При использовании засевной культуры Lactobacillus brevis В-13079 в количестве менее 100,0 г/л, не будет обеспечиваться достижение необходимого титра культуры в пробиотической добавке.

При использовании засевной культуры Lactobacillus brevis В-13079 в количестве более 100,0 г/л достигается тот же титр и не имеет смысла брать большее количество.

При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве менее 3,0 г/л, не будет обеспечиваться максимальной жизнеспособности культур в пробиотической добавке.

При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве более 3,0 г/л, достигается та же жизнеспособность культур в пробиотической добавке, поэтому не имеет смысла брать большее количество.

Первый этап исследований включает изучение выращивания бактерий на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов без применения пектина. Немаловажным показателем пробиотических свойств молочнокислой флоры является их способность колонизировать желудочно-кишечный тракт, а также их резистентность к биологическим жидкостям организма-хозяина. Последний показатель визуализировали по наличию или отсутствию роста изучаемой микрофлоры в жидкой питательной среде (мелассной), содержащей натуральный желудочный сок лошади (препарат «Эквин», 90%), желчь крупного рогатого скота медицинская консервированная (20%, 30%, 40%), фенол (0,4%) и NaCl (2%, 4%). Время выращивания культуры составляло 48 ч, температурный оптимум 37°C.

Результаты по влиянию агрессивных сред на выживаемость лактобактерий Lactobacillus brevis В-13079 без применения полисахаридного компонента (пектина) представлены в таблице 1.

Результаты исследований показали, что культуры изучаемых лактобактерий проявили хороший рост только на среде с содержанием 2,0 и 4,0% хлорида натрия, а также при наличии в среде желчи в концентрации 20%. Незначительный рост дала культура на питательной среде, содержащей 30% желчи. В остальных случаях рост исследуемой культуры не проявился.

Следующим этапом исследований является обоснование использования порошкообразного яблочного и цитрусового пектинов для выращивания Lactobacillus brevis В-13079 на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов. Выбор пектинов обусловлен тем, что на данные пектины существует стандарт, позволяющий их применять для пищевых целей («ГОСТ 29186-91. Пектин. Технические условия»).

Для проведения эксперимента микроорганизмы Lactobacillus brevis В-13079 выращиванили на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного яблочного пектина:

1. Состав среды №1: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 1,0 г/л.

2. Состав среды №2: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 2,0 г/л.

3. Состав среды №3: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 3,0 г/л.

4. Состав среды №4: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 4,0 г/л.

5. Состав среды №5: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 5,0 г/л.

Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (яблочного пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus brevis В-13079 к агрессивным средам представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерий, яблочного пектина в дозе - 3,0; 4,0 и 5,0 г/л. В дозе 2,0 г/л яблочного пектина в составе мелассной среды выявлена устойчивость ко всем растворам NaCl и желчи, также незначительный рост в среде, содержащей 0,4% фенола, однако наблюдалось отсутствие роста в желудочном соке. При дозе 1,0 г/л яблочного пектина в составе питательной среды выявлена жизнеспособность как без отсутствия пектина.

Третьим этапом исследований является изучение выращивания Lactobacillus brevis В-13079 на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного цитрусового пектина:

1., Состав среды №1:45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 1,0 г/л.

2. Состав среды №2: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 2,0 г/л.

3. Состав среды №3: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 3,0 г/л.

4. Состав среды №4: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 4,0 г/л.

5. Состав среды №5: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 5,0 г/л.

Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (цитрусового пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus brevis В-13079 к агрессивным средам представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерий, цитрусового пектина в дозе - 5,0 г/л.

Результаты проведенных исследований показали, что наиболее эффективной и оптимальной питательной средой является мелассная среда следующего состава: 45 г/л мелассы кормовой, K₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, порошкообразного яблочного пектина - 3,0 г/л и остальное вода. Разработанный состав питательной среды может быть использован в производственных условиях при дальнейшей разработке биопрепаратов для животноводства, в том числе птицеводства.

Для доказательства эффективности полученной пробиотической добавки на основе микроорганизмов Lactobacillus brevis В-13079 в мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина были проведены научные исследования на перепелах Техасской породы.

Методом групп аналогов было сформировано пять групп перепелов по 200 голов в каждой: контрольная группа - в рационе присутствовал только основной полноценный комбикорм и питьевая вода; 1-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали разработанную пробиотическую добавку в дозе 0,25 мл/гол; 2-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,5 мл/гол; 3-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,75 мл/гол; 4-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 1,0 мл/гол. Применение пробиотической добавки в опытных группах осуществлялось ежедневно (таблица 4).

Перепела выращивались в полупромышленных многоярусных металлических клетках.

Результаты хозяйственных показателей при выращивании перепелов представлены в таблице 5.

При изучении сохранности перепелов за период выращивания (56 дней) установлено, что наибольшая выживаемость птиц была зафиксирована в опытных группах. В частности, максимальный показатель был зафиксирован во второй и четвертой опытных группах, который составил 99,0%, затем в третьей опытной группе - 98,5% и далее в первой - 97,5%. Самая низкая сохранность (95,5%) наблюдалась в контрольной группе перепелов, причем основная гибель перепелят была зафиксирована в первые недели жизни птицы.

При изучении живой массы перепелов установлено, что уже на первую неделю жизни, при взвешивании была выявлена незначительная тенденция к повышению данного показателя в опытных группах. Так в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й опытных группах на 7-е сутки взвешивания показатель живой массы перепелов был незначительно выше, чем в контрольной на 2,6; 5,0; 5,6 и 4,6%, соответственно. До 21-х суток наблюдалась аналогичная картина. Однако с 28-и дней и до конца эксперимента во 2-4-й опытных группах была выявлена статистически достоверная разница по изучаемому показателю в сравнении с контрольной группой птиц. На 28-е сутки взвешивания перепелов установлено, что масса птиц во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах была достоверно выше, чем в контрольной на 4,7; 5,5 и 4,8% при Р<0,05. При этом в 1-й опытной группе в данный период статистически достоверной разницы не выявлено, как и в принципе до конца эксперимента, но наблюдалась положительная динамика в изучаемом показатели в сравнении с контрольной группой. На 35-й день живая масса перепелов 2-4-й опытных групп была выше, чем в контрольной на 4,1; 4,5 и 3,8% (Р<0,05). Аналогичные статистически достоверные (Р<0,05) показатели в изучаемых опытных группах по отношению к контрольной были выявлены на 42-й и 49-й день взвешивания перепелов. На 56-е сутки были также зафиксированы достоверные различия во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах в сравнении с контрольной, соответственно, было выше на 6,3; 6,9 и 6,2% (Р<0,05). В 1-й опытной группе масса перепелов не значительно превышала контрольную на 2,5%.

Расчет прироста перепелов во всех группах показал, что в опытных группах изучаемый показатель превосходит контрольную на следующие значения: в 1-й опытной прирост выше на 2,6%; во 2-й группе на 6,6%; в 3-й - 7,1% и в 4-й - 6,4%.

Одним из главных зоотехнических показателей эффективности использования в рационе животных, а в нашем случае птиц, добавок или биопрепаратов является показатель расхода кормов на 1 кг прироста массы (конверсия). Анализ данного значения показал, что в контрольной группе на 1 кг прироста требуется 3,33 кг комбикорма, в то время как в 1-4-й опытных группах необходимо 3,34; 3,28; 3,29 и 3,31 кг. Из этого следует, что наилучшее значение показателя было выявлено во 2-й опытной группе, которое было ниже, чем в группе контроля на 1,5%. В 3-й опытной группе значение показателя было ниже, чем в контроле на 1,2%, в 4-й опытной группе ниже на 0,6%, а в 1-й опытной выше на 0,3%.

В целом, обосновать повышенную динамику живой массы перепелов в опытных группах, можно за счет положительного воздействия пробиотической добавки на основе культур Lactobacillus brevis В-13079 и мелассной питательной среды с яблочным пектином, которые способствуют лучшему усвоению энергии и питательных веществ комбикорма птицей.

Таким образом, результаты испытаний показали, что выращивание перепелов с использованием разработанной пробиотической добавки на основе культуры Lactobacillus brevis В-13079, выделенная из ЖКТ дикого перепела, а также выращенная на мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина, в испытуемых дозах обеспечивает повышение продуктивности перепелов, что особенно выявлено в дозе 0,5 мл/гол, за счет нового состава питательной среды для лактобактерий, в частности Lactobacillus brevis В-13079.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов рода Lactobacillus, состоящая из мелассы кормовой, K₂НРО₄, дрожжевого экстракта и воды, отличающейая тем, что в питательную среду при температуре 30-40°C добавляют порошкообразный яблочный пектин и вводят микроорганизмы рода Lactobacillus с титром не менее 1,0×10⁵ КОЕ/мл при следующем соотношении исходных компонентов, г/л:

Меласса свекловичная	22-23
Меласса кукурузная	22-23
K2НРО4	2,0
Дрожжевой экстракт	0,02
Пектин яблочный	2,0-4,0
Микроорганизмы рода Lactobacillus с титром
не менее 1,0×105 КОЕ/мл	99-101
Вода	Остальное