Способ капсулирования аллергенов в частицы хитозана для снижения распознавания аллергенов ige антителами при проведении аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии

Группа изобретений относится к области иммунологии и медицины. Раскрыта наночастица для проведения аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии, состоящая из ядра и оболочки, причем ядро представляет собой частицу, сформированную из сукциноилхитозана, при этом внутрь нее включен белок, который представляет собой рекомбинантный аналог белков-аллергенов и/или природный экстракт аллергенов, и/или смесь природных экстрактов с рекомбинантными аллергенами или их фрагментами и который иммобилизован на сукциноилхитозане, а оболочка представляет собой кватернизированный хитозан; при этом ядро имеет отрицательный поверхностный заряд и диаметр от 100 до 150 нм, а оболочка имеет положительный поверхностный заряд. Также раскрыты способы получения указанной наночастицы, вакцина, включающая указанную наночастицу, и способ получения вакцины. Группа изобретений обеспечивает отсутствие связывания капсулированных аллергенов с IgE в условиях in vitro, способность частиц вызывать формирование IgG опосредованного гуморального ответа; возможность безопасного введения высокой дозы капсулированного аллергена и сокращение сроков вакцинации. 4 н. и 6. з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.

 

Список сокращений

АСИТ - аллерген-специфическая иммунотерапия

СХ - сукциноилхитозан

КХ - кватернизированный хитозан

Наночастицы - двухслойные наночастицы, состоящие из ядра СХ с иммобилизованными белками-аллергенами покрытые оболочкой КХ Область применения изобретения:

Изобретение относится к области иммунологии и медицины и касается искусственных конструкций - наночастиц типа "ядро/оболочка", содержащих в ядре экстракты природных аллергенов или рекомбинантные аллергены, конъюгированные с хитозаном. Капсулированные аллергены не распознаются IgE антителами при проведении аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и не вызывают побочных реакций, ограничивающих применение стандартных экстрактов аллергенов для АСИТ; капсулированные аллергены при введении вызывают контролируемый протективный гуморальный IgG-опосредованный иммунный ответ против аллергена, что приводит к постепенному замещение патогенного IgE-опосредованного иммунного ответа. Капсулированные аллергены являются безопасной заменой экстрактов аллергенов для проведения АСИТ.

Областью медицинского применения являются все виды пыльцевой, пищевой, грибной, бытовой IgE-опосредованной аллергии.

Биомишенью капсулированных аллергенов является адаптивный (антиген-специфический) иммунный ответ, включающий антиген-представляющие клетки (макрофаги, дендритные и В-клетки), Τ и В клетки.

Общее состояние проблемы:

Аллергия I типа характеризуется формированием антител Ε класса к безвредным объектам, попадающим в организм из окружающей среды, таким как пыльца деревьев и трав, фрагменты бытовых микроорганизмов, яд насекомых и т.д. Единственным способом патогенетического лечения аллергии вот уже более 100 лет остается аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ), состоящая из длительного (до 3-х лет) курсового введения малых доз экстрактов аллергенов [Jacobsen L, Wahn U, Bilo BM. Allergen-specific immunotherapy provides immediate, long-term and preventive clinical effects in children and adults: the effects of immunotherapy can be categorised by level of benefit -the centenary of allergen specific subcutaneous immunotherapy. Clin Transl Allergy. 2012, 13;2(1):8]. После окончания курса АСИТ наблюдается положительный долгосрочный эффект, ассоциированный с формированием IgG4 антител, который предотвращает развитие гиперчувствительности при новых провокациях аллергенами и замедляет прогресс в тяжелые формы аллергии бронхиальную астму и атопический дерматит [Ravetch JV. Fc receptors. Curr Opin Immunol. 1997; 9(1): 121-5].

Исторически для АСИТ используются экстракты аллергенов, при введении которых возникают побочные реакции, которые могут быть летальными при анафилактическом шоке [Cooper PJ. Interactions between helminth parasites and allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2009; 9(1):29-37]. Поскольку такие вакцины представляют собой комплексные смеси белков, гликозилированных белков и небелковых соединений, для них обязательной является процедура стандартизации, чтобы охарактеризовать меняющийся от партии к партии состав вакцин. Из-за недостаточной корреляции между аллергенностью экстрактов и содержанием основных белков в них, стандартизуют экстракты на основании их способности связываться с общим иммуноглобулином Ε in vitro. Основной целью при разработке новых лекарственных средств для АСИТ является поиск возможности предотвращения перекрестного связывания вакцин с IgE-антителами во избежание риска развития побочных реакций.

Уменьшить риск и повысить эффективность АСИТ позволяет изменение поверхностной структуры аллергенов, которое может быть достигнуто различными способами. Препараты, теряющие способность взаимодействовать с IgE-антителами, значительно безопаснее и могут использоваться в дозах, многократно превышающих дозы для стандартных экстрактов аллергенов [Akdis СА, Akdis Μ. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy and immune tolerance to allergens. World Allergy Organ J. 2015; 14;8(1):17].

Положительный эффект АСИТ зависит от нескольких возможных механизмов, которые продолжают изучаться до настоящего времени. Наиболее часто регистрируемым результатом АСИТ является индукция аллерген-специфичных блокирующих антител, в основном субкласса G4 [Ravetch JV. Fc receptors. Curr Opin Immunol. 1997; 9(1): 121-5], и постепенное снижение титров аллерген-специфичного иммуноглобулина Ε [ibid]. Хотя уровень IgE снижается незначительно, после лечения с помощью АСИТ предотвращается его резкое сезонное увеличение.

Одним из путей остановить развитие аллергии может быть включение адаптивного иммунитета в распознавание аллергена, что происходит при повышении доз аллергена, попадающих в контакт с иммунной системой. Как правило, IgE формируются против основных аллергенов, например, при аллергии на гриб A. fumigatus от 50% до 65% IgE антител направлены к двум аллергенам Asp f 2 и Asp f 3, и большая часть оставшихся антител связывается с Asp f 13 и 18 [Kurup VP, Knutsen АР, Moss RB, Bansal NK. Specific antibodies to recombinant allergens of Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ΑΒΡΑ. Clin Mol Allergy. 2006 Jul 21;4:11].

Для диагностики и иммунотерапии аллергических заболеваний в настоящее время все чаще используются рекомбинантные аналоги природных аллергенов, позволяющие стандартизовать препараты для АСИТ. Иммунизация (вакцинация) рекомбинантными белками приводит к выраженному IgG1 и IgG4 гуморальному ответу и индукции ИЛ-10-продуцирующих регуляторных Т-клеток, что было показано в ходе клинических испытаний [Hales BJ, Martin AC, Pearce LJ, Laing IA, Hayden CM, Goldblatt J, Le Souef PN,Thomas WR. IgE and IgG anti-house dust mite specificities in allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2006 Aug;l 18(2):361-7]. Тем не менее, основным недостатком рекомбинантных аллергенов является экспрессия полноразмерными белками всех IgE эпитопов, характерных для их природных аналогов. В настоящее время много внимания уделяется разработке гипоаллергенных конструкций [Yang L, Hirose S, Suzuki К, Hiroi Τ, Takaiwa F. Expression of hypoallergenic Der f 2 derivatives with altered intramolecular disulphide bonds induces the formation of novel ER-derived protein bodies in transgenic rice seeds. J Exp Bot. 2012 May;63(8):2947-59].

Известна гетерологичная конструкция по типу ядро/оболочка на основе пептидов аллергенов, иммобилизованных на оболочке наночастиц (НЧ) с включением в ядро НЧ гетерологичного пептида из ряда распространенных патогенов (пептида капсидного белка Е2 вируса Эпштейн-Барр). Недостатком данной конструкции является использование гетерологичных пептидов, сложных в получении, и иммобилизация их на оболочке НЧ. (РФ №2480479).

Известен способ применения аллергена и адъюванта (не хитозана или альгината), состоящего из кислородсодержащих солей металлов, для производства жидкой композиции для орально-мукозного лечения аллергии. В приведенном способе отсутствует как упаковка аллергенов, так и основные полимеры - хитозан и его производные. (WO 2006034707 А1/СА 2581815 А1)

Известен способ введения (п/к, и/н, per/os) хитиновых микрочастиц в процессе АСИТ, проводимой экстрактами аллергенов (амброзии, гриба A.fumigatus, клещей домашней пыли D. pteronyssinus). В рамках данного способа не осуществляется упаковка аллергенов и используется хитин как адьювант.(WO 2003086454 А1)

Известен способ получения микрочастиц, сконструированных по типу ядро/оболочка, содержащих биодеградируемый полимер и катионный полимер (не хитозан) для использования в иммуногенных композициях (не аллергены). (WO 2007100699 А2).

Известен способ получения композиций из хитина для медицинского применения, в особенности для лечения инфекций, вызванных бактериями рода Streptococcus. Патент US 8551501 В2 аналогичен заявке WO 2003086454 А1.

Известен способ получения композиций, представляющих собой твердые микро/наночастицы по типу ядро/оболочка, размером менее 5 мкм, состоящие из коарцевата полимерного катиона и полианиона - нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, для применения в области иммунологии и аллергических заболеваний. Конструкция направлена на индукцию адаптивного иммунитета и может быть протективной. В способе не используются производные хитозана, и частицы имеют больший размер, не подходящий для трансэпидермальной доставки (WO 1999036090 А1).

Известен способ получения пероральной системы доставки лекарственного вещества белковой природы из липосом, сконструированных по типу ядро/оболочка, содержащих белок, включенный в частицы из поперечносшитого поливалентным металлом пектина (ядро) и поперечносшитого полианионом хитозана в качестве оболочки. В данном способе не используются рекомбинантные белковые аллергены, частицы получаются значительно более крупного размера. Не используется сукциноилхитозан и кватернизированные производные хитозана. Полученные частицы имеют отрицательный заряд. Заявка: 2014124682 WO 2013/075068 (23.05.2013).

Известны наночастицы содержащие ядро и оболочку, при этом в качестве ядра выступает альгинат с включенным в него белком, а в качестве оболочки выступает кватернизированный хитозан, при этом ядро имеет отрицательный поверхностный заряд, а оболочка положительный поверхностный заряд. Подобные частицы не пригодны для сенсибилизации аллергии, поскольку содержащийся в конструкции белок не имеет химических связей с полимером, таким образом, не обеспечивает должной защиты от антител класса Ε (LI Т. et al. Quaternized chitosan/alginate nanoparticles for protein delivery // J. Biomed. Mater. Res. A, 2007, V.83. pp.383-90). В предлагаемой конструкции белки-аллергены или смеси, содержащие основные белки-аллергены, химически связаны с полимером, что препятствует высвобождению белка из частиц.

Известна наночастица для проведении аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии, содержащая ядро и оболочку, причем ядро содержит белок, иммобилизованный на сукциноилхитозане, а оболочка представляет собой альгинат (WO 2017026915 А1, 16.02.2017). Отличие настоящего изобретения заключается в том, что оболочка выполнена из кватернизированного хитозана, а также в заряде ядра и оболочки. Положительный заряд оболочки повышает иммуногенность конструкций.

Недостатки перечисленных аналогов заключаются в отсутствии полного экранирования эпитопов аллергенов от распознавания IgE антителами, отсутствии химического связывания белков с полимером, что не позволяет исключить высвобождение из частиц свободных аллергенов, использовании экстрактов аллергенов или пептидных фрагментов, использовании методов модификаций полимерных носителей, не позволяющих создать частицы подходящего для трансэпидермальной доставки размера и/или поверхностного заряда.

Техническая проблема при разработке препаратов для АСИТ заключается в создании способа безопасного замещения патогенного IgE-опосредованного иммунного ответа и формировании протективного IgG иммунного ответа в ходе короткого курса заместительной иммунотерапии аллергии.

Техническим результатом изобретения является: 1) отсутствие связывания капсулированных аллергенов с IgE в условиях in vivo, что обеспечивает безопасность вакцинации; 2) способность частиц вызывать формирование IgG опосредованного гуморального ответа, что обеспечивает эффективность вакцинации; 3) возможность безопасного введения высокой дозы капсулированного аллергена, что обеспечивает сокращение курса, необходимого для достижения протективного эффекта; 4) сокращение сроков вакцинации повышает комплаентность терапии, что позволит провести терапию на ранней стадии сенсибилизации и остановить прогрессирование аллергии.

Поставленная задача решается за счет экранирования IgE эпитопов аллергенов с помощью капсулирования в полимерную оболочку, полученную на основе производных хитозана. Предлагается наночастица для проведения аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии, содержащая ядро и оболочку, причем ядро содержит белок, иммобилизованный на сукциноилхитозане (СХ), а оболочка представляет собой кватернизированный хитозан (КХ), при этом ядро имеет отрицательный, а оболочка положительный поверхностный заряд. Капсулируемый белковый препарат может быть: рекомбинантным аналогом любого основного белка природных аллергенов (моновалентные вакцины); смеси белков из одного вида аллергенов (мультивалентные вакцины против одного аллергена); смеси основных белков различных природных аллергенов. При этом ядро имеет размер от 100 до 300 нм, а размер самой наночастицы составляет от 300 нм до 500 нм.

Предлагаемые частицы являются действующим компонентом вакцины для проведении аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии, содержащая указанные наночастицы и фармацевтически приемлемый носитель.

Предлагается способ введения вакцины подкожно или трансдермально, включающий введение количества наночастиц, достаточного для индукции IgG ответа. Для определения необходимого количества частиц требуется проведение клинических исследований. Предлагается введение вакцины для достижения эффекта.

Способ получения наночастиц включает три стадии: 1) получение иммобилизованного белка или смеси белков аллергенов на полимерной матрице с отрицательным зарядом; 2) сворачивание конъюгата в частицы диаметром 100-300 нм (ядро частицы); 3) капсулирование ядер в полимер с положительным зарядом.

1. Для синтеза ядра частицы с белком/белками осуществляют предварительную модификацию хитозана для получения отрицательно заряженного производного СХ, суспендируют и химически конъюгируют белок/белки с СХ в присутствии активированной карбодиимидом 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты.

2. Формирование двухслойных частиц осуществляют капсулированием ядер СХ с иммобилизованным белком/белками при постепенном введении положительно заряженного кватернизированного хитозана (КХ), для чего проводят модификацию хитозана для получения КХ. Полученные наночастицы суспендируют и химически конъюгируют в присутствии активированной карбодиимидом 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты.

В результате получаются частицы по типу ядро-оболочка, в которых внутри находится конъюгат СХ-белок/белки (ядро), покрытый оболочкой КХ. Слои наночастицы дополнительно химически соединяют сшивающим агентом.

1. Предварительную модификацию хитозана осуществляют путем введения сукциноильных групп в структуру полимера ангидридным методом при соотношении 60 групп на 100 моносахаридных звеньев хитозана. Указанную иммобилизацию белка осуществляют в растворе, включающем модифицированный полимер, растворитель и сшивающий агент. Модифицированный полимер представляет собой хитозан с сукциноильными группами при степени замещения 60/100 (степень замещения 60%). Растворитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор с нейтральным рН. Сшивающий агент представляет собой 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновую кислоту, активированную карбодиимидом в мольном соотношении 1:3.

2. Ядра наночастиц формируют кальциевой преципитацией. В результате получают наночастицы размером 100-300 нм.

3. Для получения двухслойных частиц к ядрам добавляют при смешивании раствор КХ. В результате получаются двухслойные наночастицы, ядро которых содержит белок, иммобилизованный на СХ, покрытое оболочкой из КХ.

4. Слои наночастиц дополнительно конъюгируют 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислотой, активированной 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом. Диаметр двухслойных частиц составляет 300-500 нм.

Раскрытие изобретения

Существенным признаком изобретения являются экранирование IgE связывающих эпитопов аллергенов с помощью полимерной оболочки. Схема закрытия IgE эпитопов аллергенов представлена фигурой 1. Характеристика компонентов вакцины показана на фигурах 2-4. Закрытие эпитопов осуществляется способом капсулирования аллергенов в наночастицы (НЧ) типа "ядро/оболочка". Ядро конструкции представляет собой частицы размером от 100 до 300 нм, сформированных из СХ, конъюгированного с 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислотой, активированной 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом, в которую в процессе конъюгации включаются рекомбинантные белки-аллергены. Ядро покрыто оболочкой из противоположно заряженного КХ, формирующейся за счет электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными сукциноильными группами СХ и положительно заряженными амино-группами КХ. Последний получают по методике, известной из патента RU 2697872 C1. В результате получаются ядра размером от 100 до 300 нм, а размер двухслойных наночастиц составляет от 300 до 500 нм, как указано на фиг. 4. Формирование оболочки необходимо и достаточно для предотвращения связывания IgE антител с капсулированным аллергеном (Фиг. 5-6). Иммунизация подкожно мышей двухслойными частицами в физрастворе приводит к формированию гуморального IgG-опосредованного иммунного ответа против конкретного аллергена (Фиг. 7). Протективный ответ формируется через 3 иммунизации и сохраняется у мышей до 6 месяцев.

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

Фигура 1. Стадийный процесс получения наночастиц, содержащих ядро из СХ с включенными аллергенами Bos 4, 5, покрытое оболочкой противоположно заряженного КХ. На стадии 1 белок/белки иммобилизуют на СХ (1:10) и формируют частицы с помощью сшивающего агента 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты, активируя карбоксильные группы карбодиимидным методом, и последующей и кальциевой преципитации, Частицы формируются в процессе перемешивания при комнатной температуре. На стадии 2 полученные частицы смешивают с раствором КХ, при этом формируется полиэлектролитный комплекс, имеющий суммарный положительный заряд ζ = +15±5 мВ.

Фигура 2. Схема получения сукциноилхитозана и кватернизированного хитозана.

Фигура 3. 1Н-ЯМР-спектр сукциноилхитозана.

Фигура 4. Диаграммы динамического светорассеяния: размер ядер 100-300 нм, размер наночастиц 300-500 нм.

Фигура 5. Распознавание белка Asp f 2 в составе ядер и двухслойных частиц (НЧ) высокоаффинными IgG1 антителами (черные столбики) и контрольной сывороткой (серые столбики). Анализ проводили методом ИФА с нанесенными на подложку белком Asp f 2, ядрами, содержащими Asp f 2, и частицами, содержащими ядра с Asp f 2. Все препараты наносили в равной концентрации по белку Asp f 2.

Фигура 6. Распознавание сыворотками больных с аллергией на клещей домашней пыли полноразмерного белка Der f 2, ядер и частиц (НЧ), содержащих аналогичное количество Der f 2. Контролем является сыворотка донора без аллергии.

Фигура 7. Продукция IgG при иммунизации мышей линии СВА яичным овальбумином (OVA) в присутствии адъюванта, ядрами и частицами без адъювантов. В качестве подложки использовали белок OVA.

Фигура 8. Титры IgE, IgG1 и IgG4 при 2-кратной подкожной иммунизации здорового донора капсулированным рекомбинантным белком Asp f 2.

Фигура 9. Трансэпидермальная иммунизация частицами, а. Принцип действия шприца Dermapen. б. Общий вид шприца Dermapen. в. Нанесение частиц на кожу. г.Титры IgE, IgGl и IgG4 при 4-кратной трансэпидермальной иммунизации здорового донора капсулированными рекомбинантным белком Asp f 2.

Раскрытие изобретения

Пример 1. Получение и характеристика наночастиц типа «ядро/оболочка», содержащих рекомбинантные белки

Структура и стадийный процесс получения частиц, содержащих ядро из модифицированного хитозана с включенными аллергенами, покрытое оболочкой из противоположно заряженного хитозана, приведены на фигуре 1. В качестве аллергенов можно использовать любые рекомбинантные основные белки аллергенов или их комбинацию. Проведены эксперименты на основных белках различных аллеогенов: гриба Aspergillus fumigatus Asp f 2, коровьего молока Bos 4, 5, 6, 8; клещей домашней пыли Der f 2, яичного белка овальбумина.

На стадии 1 антигены иммобилизуют на СХ (1:10) и формируют частицы при помощи сшивающего агента - трикарбодиимидным. Частицы формируются в течение 12 часов перемешивания при комнатной температуре. На стадии 2 полученные частицы смешивают с раствором активированного карбодиимидом кватернизированного хитозана со степенью замещения 40%, при этом формируется полиэлектролитный комплекс, имеющий суммарный положительный заряд.

В данном примере в качестве матрицы для получения «ядра» используют образцы хитозана с молекулярной массой 40 кДа. Предварительно проводят модификацию полимера с целью оптимизации гидрофильно-липофильных и кислотно-основных свойств. Хитозан модифицируют остатками янтарной кислоты из расчета 60-65 молекул на 100 МЗ. Схема реакции ацилирования хитозана представлена на Фиг.5; степень замещения определяют способом ¹H-ЯМР (Фиг. 2). СХ обладает отрицательным зарядом, что позволяет получать частицы по механизму ковалентного взаимодействия с использованием противоиона.

Для получения «ядер» проводят иммобилизацию рекомбинантных белков на СХ, используя водорастворимый карбодиимид для активации карбоксильных групп на СХ. Для определения выхода частиц и анализа соотношения СХ:белок, которое составило 10-15 к 1, используют массу сухой навески частиц (Таблица 1). Частицы имеют слабый отрицательный заряд (ζ = +10- +12 мВ) и диаметр 100-500 нм, что определяют методом динамического светорассеяния (Фиг. 3; Таблица 1).

Для формирования оболочки целевой конструкции (ядра) используют КХ (поликатион), способный образовывать полиэлектролитный комплекс с СХ за счет электростатических взаимодействий с его отрицательно заряженными группами. Комплекс формируется при добавлении КХ к суспензии полученных ранее наночастиц. Количество полимера подбирают с целью формирования положительно зараженных наночастиц. В результате получают наночастицы типа «ядро/оболочка» с включенными внутрь ядер белками, дополнительно покрытыми пленкой из противоиона. Размер частиц составляет около 300-500 нм (Фиг.4), частицы имеют заряд ζ = +10- +12 мВ (Табл. 1).

Пример 2. Анализ распознавания аллергена в составе наночастиц IgE антителами

Для анализа способности наночастиц связываться с антителами Ε класса из сывороток больных с аллергией на КДП используют иммуноферментный анализ. Ранее мы показали, что бактериальный белок Der f 1 имеет неприродную конформацию и не распознается IgE антителами из сывороток больных в отличие от рекомбинантного Der f 2 [Д.Ю. Рязанцев, П.Е. Дробязина, С.В. Хлгатян, и др. Экспрессия аллергенов клещей домашней пыли Der f 1 Der f 2 в листьях Nicotiana benthamiana. Биоорганическая химия, 2014 том 40, No 4, с. 468-478]. Поэтому при анализе сывороток используют в качестве контроля рекомбинантный белок Der f 2.

При нанесении белков, покрытых оболочкой из положительно заряженного хитозана, связывание может отличаться от связывания чистого белка. Поэтому проверяют наличие связанного белка в свободной форме и в составе ядер и частиц с помощью сывороток мышей, иммунизированных белком Der f 2. Ядра и частицы прикрепляются к поверхности планшета для проведения иммуноферментного анализа так же хорошо, как и некапсулированный белок, поскольку иммунные сыворотки распознают аллергены с равным титром (Фиг. 5). Контрольные сыворотки интактных мышей не распознают антиген.

Для анализа связывания IgE отбирают сыворотки больных с высоким титром IgE. Инкубация со свободным белком приводит к достоверному связыванию (Фиг. 6). Белок в составе ядер распознается достоверно хуже, чем в свободном виде (р<0.01). Связывание белка в составе частиц достоверно снижается (р<0.01) по сравнению с ядрами и свободным белком и не отличается от среднего значения, полученного для сывороток доноров без аллергии (р<0.05). Использование при капсулировании аллергенов двух слоев полимеров (белки-аллергены иммобилизуются на внутренний полимерный слой, образуя «ядро» конструкции, при этом закрывается часть эпитопов, которые полностью экранируются дополнительной полимерной оболочкой, отличной от внутренней) препятствует связыванию с IgE антителами и, как следствие, не вызывает дегрануляцию тучных клеток. Использование двух слоев полимера является необходимым и достаточным условием для предотвращения распознавания аллергена IgE антителами.

Пример 3. Иммуногенность белков в составе наночастиц в модельной системе на мышах

Капсулированные белки сохраняют иммуногенность. После трехкратной (раз в 4 дня, 50, 100, 200 или 400 мкг/инъекцию) в/б иммунизации мышей линии СВА чистыми белками или суспензией частиц в физрастворе, содержащими разное количество белков, формировался IgG ответ (Фиг. 7). Ответ на белок был достоверно выше, чем при иммунизации конструкциями (р<0.01), но достоверно регистрировался по сравнению с интактными животными (р<0.01), что показывает иммуногенность белка в составе конструкций (в составе вакцины). Различий между ответом на белок в составе ядер и в составе наночастиц не было (р>0.05).

Пример 4. Иммуногенность белков в составе наночастиц у человека при подкожном введении

Для проверки иммуногенности капсулированных белков у человека здоровому донору вводили подкожно в область плеча 100 мкл суспензии частиц, содержащих белок Asp f 2 и стерилизованных в микроволновой печи (1 мин на водной бане на максимальной мощности). Стерильность подтверждали в культуре in vitro. Иммунизацию проводили два раза с интервалом в 1 месяц. Иммунизация заявленной вакциной вызывала формирование преимущественно IgG1, и, в меньшей степени, IgG4. При классической АСИТ формируются преимущественно IgG4. Иммунизация вакциной, содержащей капсулированные аллергены, не вызывала формирования IgE (Фиг. 8).

Пример 5. Иммуногенность белков в составе наночастиц у человека при трансэпидермальном введении вакцины

Подкожное введение требует визита пациента к врачу, что для ряда пациентов может быть нежелательным. Альтернативой подкожной АСИТ является сублингвальная или трансэпидермальная АСИТ. Для проверки иммуногенности при сублингвальном введении частицы лиофилизировали, стерилизовали УФ и давали здоровому донору под язык для рассасывания ежедневно в течение 20 дней. Не выявили формирования IgG1 или IgG4.

Для анализа эффективности трансэпидермальной иммунизации использовали шприц для инъекций косметологических препаратов (Фиг. 9). Кожу в районе запястья обезжиривали 70% спиртом, затем протирали диметилсульфоксидом для усиления проницаемости эпидермиса, наносили несколько проколов шприцом и наносили 100 мкл частиц в физрастворе. Место введения закрывали непроницаемой пленкой (парафильм) и сверху лейкопластырем. Инъекции вакциной повторяли 5 раз каждые 3 дня. В результате формировался IgGl ответ (Фиг. 9). Эффективность подкожной АСИТ оказалась несколько выше, чем при трансэпидермальной, но оба протокола достоверно вызывали формирование IgG

1. Наночастица для проведения аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии, состоящая из ядра и оболочки, причем ядро представляет собой частицу, сформированную из сукциноилхитозана, при этом внутрь нее включен белок, который представляет собой рекомбинантный аналог белков-аллергенов и/или природный экстракт аллергенов, и/или смесь природных экстрактов с рекомбинантными аллергенами или их фрагментами и который иммобилизован на сукциноилхитозане, а оболочка представляет собой кватернизированный хитозан; при этом ядро имеет отрицательный поверхностный заряд и диаметр от 100 до 150 нм, а оболочка имеет положительный поверхностный заряд.

2. Наночастица по п. 1, имеющая диаметр от 300 до 500 нм.

3. Вакцина для проведения аллерген-специфической подкожной и трансэпидермальной иммунотерапии, содержащая наночастицы по пп. 1, 2 и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Способ введения вакцины по п. 3, для аллерген-специфической иммунотерапии посредством подкожного или трансэпидермального введения до достижения антиген-специфического IgG ответа.

5. Способ получения наночастиц по пп. 1, 2, включающий стадии создания ядра и формирование оболочки; при этом для формирования ядра осуществляют предварительную модификацию хитозана для получения сукциноилхитозана, суспензирование частиц белка в растворе, иммобилизацию белка на сукциноилхитозане; для формирования оболочки осуществляют предварительную модификацию хитозана для получения кватернизированного хитозана, капсулирование ядра кватернизированным хитозаном с получением частиц по пп. 1, 2; концентрируют раствор или удаляют растворитель.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что предварительную модификацию хитозана осуществляют путем введения сукциноильных групп в структуру полимера ангидридным методом при соотношении 60 групп на 100 моносахаридных звеньев хитозана.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанную иммобилизацию белка/белков аллергенов осуществляют в растворе, включающем сукциноилхитозан, растворитель и сшивающий агент.

8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что для получения ядер активация сукциноилхитозана осуществляется с помощью карбодиимида.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что сшивающий агент представляет собой 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновую кислоту, активированную карбодиимидом в мольном соотношении 1:3.

10. Способ по п. 5, отличающийся тем, что для капсулирования частиц их смешивают с раствором кватернизированного хитозана.