Биосинтетический гепарин

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения предшественников для получения синтетического гепарина в лабораторных условиях, что может быть применимо в медицине. В настоящем изобретении предложен новый подход к получению синтетического гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину натрия USP, из гепаросана через последовательное получение трех промежуточных соединений – гликозаминогликанов с различным содержанием сульфатированных групп (NS-, NS2S-, NS6S- и/или NS2S6S-групп) в своем составе. Полученный в соответствии с настоящим изобретением синтетический гепарин может быть применим в качестве доступной фармацевтической замены природному гепарину, полученному из различных тканей животных, и может быть использован в медицинской практике в качестве антикоагулянта. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 табл., 4 ил., 9 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/384341, поданной 7 сентября 2016 г., содержание которой полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее описание в целом относится к области химии полисахаридов и, в частности, к биосинтетическому гепарину, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину качества USP; к способам получения биосинтетического гепарина; к интермедиатам (промежуточным соединениям), которые можно применять в указанных способах получения; и к способам применения биосинтетического гепарина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте реализации предложен гликозаминогликан, содержащий некоторое количество N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы, причем указанное количество является эффективным для получения биосинтетического гепарина. Количество дисахаридной группы NS может составлять 78-99%, или 81-97%, или 83-95%, или 85-93%.

В другом варианте реализации предложен гликозаминогликан, содержащий некоторое количество N-сульфатированной, 2-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, причем указанное количество является эффективным для получения биосинтетического гепарина. Количество дисахаридной группы NS2S может составлять 44-80%, или 50-78%, или 55-77%, или 60-76%.

Еще в одном варианте реализации предложен гликозаминогликан, содержащий некоторые количества N-сульфатированной, 2-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS2S6S) дисахаридной группы и N-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы, при этом указанные количества эффективны для получения биосинтетического гепарина. Соответствующие количества NS6S и NS2S6S дисахаридных трупп могут составлять 6-40% NS6S группы и 31-73% NS2S6S группы; 6-32% NS6S группы и 36-70% NS2S6S группы; 6-26% NS6S группы и 40-67% NS2S6S группы; или 6-22% NS6S группы и 43-64% NS2S6S группы.

Еще в одном варианте реализации предложен способ получения биосинтетического гепарина, включающий: а. получение гликозаминогликана, содержащего 31-73% NS2S6S дисахаридной группы, 6-40% NS6S дисахаридной группы, 0-27% NS2S группы и 1-22% NS группы; и b. обработку гликозаминогликана ферментом, который представляет собой изоформу 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1), в присутствии донора сульфата с получением партии биосинтетического гепарина.

Еще в одном варианте реализации предложен способ получения второго интермедиата гликозаминогликана, содержащего 44-80% NS2S группы и 13-39% NS группы. Указанный способ может включать а. превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого гликозаминогликана, содержащего 78-99% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы, при этом указанное количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина соответствует количеству NS группы в первом интермедиате гликозаминогликана; и b. обработку первого интермедиата гликозаминогликана двумя ферментами, которые представляют собой С5-эпимеразу (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансферазу (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата с получением второго интермедиата гликозаминогликана.

И еще в одном варианте реализации предложен способ получения третьего интермедиата гликозаминогликана, содержащего 31-73% NS2S6S дисахаридной группы, 6-40% NS6S дисахаридной группы, 0-27% NS2S группы и 1-22% NS группы. Указанный способ может включать обработку второго интермедиата гликозаминогликана, содержащего 44-80% NS2S группы и 13-39% NS группы, ферментом, который представляет собой изоформы 1 и/или 3 6-O-сульфотрансферазы (6-ОСТ-1/3), в присутствии донора сульфата с превращением второго интермедиата гликозаминогликана в третий интермедиат гликозаминогликана.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 схематически показан путь синтеза из гепаросана биосинтетического гепарина (БСГ), который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP.

На фигуре 2 схематически проиллюстрированы способы анализа интермедиатов и биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP.

На фигуре 3 показаны спектры ID ¹H-ЯМР для гепаросана, интермедиатов NS, NS2S, NS6S, NS2S6S, биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP, и свиного гепарина USP.

На фигуре 4 показаны типичные диапазоны колебаний компонентного состава структур интермедиатов биосинтетического гепарина, которые могут наделить его свойствами, эквивалентными свиному гепарину USP.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гепарин широко применяют в качестве антикоагулянта, как в растворе, так и на имплантированных устройствах. Химический синтез гепарина, как правило, считают неосуществимым, и поэтому гепарин фармацевтической степени чистоты за всю историю получения гепарина получали из различных тканей животных. Но с зависимостью от животных источников связаны проблемы контроля качества и поставок.

Основным источником гепарина является кишечник свиньи, но также доступны гепарин из легкого и кишечника крупного рогатого скота и гепарин из кишечника овцы. Качество продукта может изменяться в зависимости от факторов окружающей среды и подвидов животных, что вносит дополнительные трудности в контроль за лекарственными средствами. Серьезная озабоченность возникновением прионных болезней, таких как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE, «болезнь коровьего бешенства»), которая вызывает болезнь Крейцфельда-Якоба у людей, и прионная болезнь скрепи у овец привели к спаду применения тканей крупного рогатого скота и овец в качестве источника гепарина.

В 2008 г. избыточно сульфатированный хондроитинсульфат (ИСХС) был введен в гепарин, полученный из свиней в Китае, что привело к смерти почти 100 американцев и заметному уменьшению поставок гепарина. Эту преднамеренную фальсификацию было очень трудно обнаружить, поскольку в системе поставок ткани для получения гепарина на бойнях отсутствует надзор современной надлежащей производственной практики (cGMP).

Позже подозревали смешивание гепарина, полученного из различных видов животных. Гепарин из легкого крупного рогатого скота, гепарин из кишечника крупного рогатого скота, гепарин из кишечника овец и гепарин из кишечника свиней можно отличить друг от друга по различному распределению структурных вариантов пентасахаридного сайта связывания антитромбина, а также различиям в дисахаридном составе. Тем не менее, очень трудно обнаружить присутствие небольших количеств гепарина из кишечника крупного рогатого скота или гепарина из кишечника овец в продукте гепарина из кишечника свиней, даже применяя современные аналитические способы из известного уровня техники.

Поставки также являются серьезной проблемой. Несмотря на то, что ежегодно во всем мире забивают 1,2 миллиарда или более свиней, что дает 100 тонн гепарина/год, коммерческие поставщики не смогут соответствовать возросшему мировому спросу, особенно в развивающихся странах. Недавний анализ доли рынка показал, что большая часть неочищенного гепарина поступает из Китая, который обеспечивает приблизительно 57% мирового рынка. Восприимчивость популяций животных к инфекционным заболеваниям, например, эпидемии среди свиней в Китае, чрезмерный промысел или озабоченность состоянием окружающей среды могут сильно уменьшить поставки животных, из которых можно получить гепарин. Точечный дефицит гепарина привел к серьезному рассмотрению вопроса возвращения гепарина крупного рогатого скота на рынок США. Тем не менее гепарин из кишечника крупного рогатого скота не смог удовлетворить установленным USP требованиям к гепарину, и это ограничивает его коммерческое применение. Одобрение гепарина из кишечника крупного рогатого скота также повышает риск смешивания гепаринов из свиней и крупного рогатого скота, которое сложно обнаружить и которое изменяет свойства конечного продукта.

В силу потребности в альтернативных и надежных источниках биоэквивалентного гепарина, исследователи предприняли попытку синтезировать гепарин из гепаросана. Комбинация химических и ферментативных этапов позволила получить продукт, который был похож на гепарин, но, насколько известно авторам настоящего изобретения, биосинтетический гепарин, синтезированный химико-ферментативным способом, еще не соответствовал стандартам USP. После тщательного исследования на множестве тестовых примеров, авторы настоящего изобретения синтезировали гепарин, который может удовлетворить всем требованиям USP. Авторы настоящего изобретения установили три интермедиата с определенными свойствами, которые могут потребоваться для получения такого биоэквивалентного гепарина.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для целей настоящей заявки далее приведены определения следующих терминов.

В данной заявке употребление формы единственного числа означает один или более, если конкретно не указано, что означает только один.

В объем термина «приблизительно» очевидно входит обычное отклонение, которое специалист в данной области понимает как эквивалентное указанному значению. При использовании числового значения, в объем термина «приблизительно» входит ± 20%, или ± 15%, или ± 10%, или ± 8%, или ± 7%, или ± 6%, или ± 5%, или ± 3%, или ± 2%, или ± 1% от указанного значения.

Если приведен % в отношении содержания дисахарида, то он обычно относится к мольному проценту, если не указано иначе.

В данной заявке БСГ относится к биосинтетическому гепарину, т.е., гепарину, полученному посредством одного или более из химического процесса; ферментативного процесса; комбинации химического и ферментативного процессов; процесса с применением культуры клеток микроба и млекопитающего. В некоторых вариантах реализации биосинтетический гепарин может включать гепарин, который биоэквивалентен свиному гепарину USP, т.е., свиному гепарину натрия, например, «биоэквивалентный» гепарин.

В данной заявке «биоэквивалентный гепарин» (БЭкГ) представляет собой эквивалент свиному гепарину натрия USP в отношении уровней активности и распределения молекулярных масс. В некоторых вариантах реализации биоэквивалентный гепарин может содержать дисахаридные группы NS, NS2S, NS6S и NS6S2S в количествах, эквивалентных таковым у свиного гепарина USP, описанных ниже в таблице 2.

В данной заявке термин «партия» может относиться к конкретному количеству лекарственного средства или другого материала, такого как гепарин, который должен иметь однородный состав и качество, в определенных пределах, и быть получен в одном производственном заказе в процессе одного цикла производства.

Гепарин и гепаросан.

Гепаросан представляет собой группу полисахаридов с неразветвленными цепями гетерогенной длины с повторяющимися дисахаридными звеньями [→4) β-D-глюкуроновая кислота (GlcA) (1→4) N-ацетил-α-D-глюкозамин (GlcNAc) (1→]_п.

Гепарин представляет собой гетерогенную группу анионных гликозаминогликанов с неразветвленной цепью, обладающих антикоагулянтными свойствами. Гепарин можно расщепить на различные дисахаридные группы (Yang, В., Chang, Y., Weyers, A.M., Sterner, Е., & Linhardt, R. J. (2012)) и провести анализ с помощью способа жидкостной хроматографии с УФ-спектрометрией (ЖХ/УФ) (Р. Mourier и др. Analytical Chemistry Research 3 (2015) 46-53). Результаты, полученные с помощью способа ЖХ/УФ, высоко сопоставимы с таковыми для обычно применяемого способа жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ/МС). После расщепления смесью трех гепарин-лиаз, из гепарина получают следующие дисахариды:

Где ΔUA соответствует 4-дезокси-α-L-трео-гекс-4-енопиранозилуроновой кислоте. GlcN соответствует D-глюкозамину, Ас соответствует ацетилу и S соответствует сульфогруппе. В настоящем описании содержание дисахаридов можно рассчитать на основе суммарного содержания описанных выше восьми дисахаридов.

Так как гепарин и гепаросан и соответствующие производные представляют собой сложные молекулы, их также можно охарактеризовать в соответствии с их среднемассовой молекулярной массой (Mw) и распределением молекулярных масс. Гепарин можно дополнительно охарактеризовать по его антикоагулянтной активности.

В стандарте Фармакопеи Соединенных Штатов версии 39 (USP39) «гепарин натрия, USP» требуются определенные уровни активности гепарина и распределения молекулярных масс. Согласно USP, средняя масса гепарина составляет 15000-19000 Да; процент цепей гепарина с молекулярной массой более 24000 Да должен составлять не более 20% от общего количества; и отношение цепей с молекулярными массами в диапазоне от 8000 до 16000 Да к цепям с молекулярными массами в диапазоне от 16000 до 24000 Да должно составлять не менее 1,0.

В настоящем изобретении отношение цепей с молекулярными массами в диапазоне от 8000 до 16000 Да к цепям с молекулярными массами в диапазоне от 16000 до 24000 Да должно составлять не менее 1,0, предпочтительно находиться в диапазоне от 1,0 до 2,5, от 1,0 до 2,0, от 1,2 до 1,8, 1,4-1,7, составлять 1,5 или 1,6. Эффективность определяют с помощью биологического анализа, используя эталонный стандарт USP, основанный на единицах активности гепарина на миллиграмм. Согласно данным установленным требованиям, антикоагулянтная активность гепарина против фактора IIa (т.е. против IIa) составляет не менее 180 ед/мг, и отношение активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa (т.е. против Ха/против IIa) находится в диапазоне от 0,9 до 1,1.

В современной монографии USP (USP 39) для свиного гепарина натрия нет требований к дисахаридному составу. Тем не менее, само собой разумеется, что свойства гепарина определяются его структурой. Следовательно, авторы настоящего изобретения установили некоторые структурные особенности свиного гепарина USP. В таблице 1 показан статистический диапазон дисахаридных групп, полученных из свиного гепарина USP после обработки тремя гепарин-лиазами. Всего провели измерения 15 партий свиного гепарина USP. Рассчитывали среднее арифметическое (среднее) и стандартное отклонение (СО) для выборок. Стандартное отклонение аналитической ошибки получали на основании совокупных данных, полученных авторами настоящего изобретения. Следующее уравнение в крайней левой колонке таблицы 1 использовали для вычисления диапазона каждого дисахарида.

Если допустить, что 15 выборок гепарина репрезентативны, то 3 стандартных отклонения охватывают 99,7% ожидаемой вариации.

В некоторых вариантах реализации содержание каждого дисахарида в биосинтетическом гепарине, который биоэквивалентен свиному гепарину натрия USP, находится в пределах 3 стандартных отклонений от оценки среднего значения, полученного для гепарина USP, как показано в таблице 1 выше и представлено в таблице 2.

В некоторых вариантах реализации содержание каждого дисахарида в биосинтетическом гепарине находится в пределах 2,5, 2,0, 1,5 или 1,0 стандартного отклонения от оценки среднего значения, полученной для гепарина USP. В некоторых вариантах реализации содержание каждого из основных дисахаридов NS, NS6S, NS2S и Трис находится в пределах 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 или 1,0 стандартного отклонения от соответствующей оценки среднего значения, полученной для гепарина USP.

Mulloy и др. «USP compendial methods for analysis of heparin: chromatographic determination of molecular weight distributions for heparin sodium» Anal Bioanal Chem (2014) 406:4815-4823, провели обзор распределения по размерам свиного гепарина натрия USP. Согласно фигуре 3, соединения массой 8-16 кДа составляли не более 55% и соединения массой 16-24 кДа составляли не менее 25%. Следовательно, отношение 18-16/16-24 составляло 2,2 (т.е. 55/25) в данном исследовании.

СИНТЕЗ ГЕПАРИНА ИЗ ГЕПАРОСАНА

Гепаросан представляет собой полисахарид с повторяющимися дисахаридными звеньями [→4) β-D-глюкуроновой кислоты (GlcA) (1→4) N-ацетил-α-D-глюкозами на (GlcNAc) (1→]_п. Гепаросан биосинтезируется в виде полисахаридной капсулы в бактериях, включая Escherichia coli и Pasteurella multicida. Lindahl U и др. (1998) «Regulated diversity of heparan sulfate» J Biol Chem 273(39):24979-24982. В исследованиях лабораторного масштаба показали, что гепаросан со среднемассовой молекулярной массой (M_w)>10000, полученный из штамма K5 Е. coli, можно химико-ферментативно превратить в антикоагулянтный полисахарид, названный неогепарином, который не является биоэквивалентным свиному гепарину натрия USP. Lindahl и др. (2005) J Med Chem 48(2):349-352; Zhang и др. (2008) Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007; патент США №6162797; US 2014/0349962.

В следующих противопоставленных материалах описаны биосинтетические гепарины, которые не являются биоэквивалентными свиному гепарину натрия USP. Ни в одном материале не описано получение интермедиатов, обладающих свойствами, описанными в данной заявке, и полученный гепарин не является биоэквивалентом свиного гепарина USP. Там, где это указано, содержание дисахарида в таких гепаринах не находится в пределах 1, 2 или 3 стандартных отклонений от оценки среднего значения, полученного для свиного гепарина USP, и ни один из интермедиатов не соответствует интермедиатам, необходимым для получения биоэквивалентного гепарина.

Дополнительные различия между настоящим изобретением и известным уровнем техники включают, среди прочего, третий интермедиат NS2S6S, также называемый TriS. Некоторые способы известного уровня техники, в которых применяют химические способы сульфатирования, не позволяют получить интермедиат NS2S6S, в котором отсутствует дисахарид 3S. В некоторых химико-ферментативных способах не контролировали содержание основных дисахаридных групп на каждом химико-ферментативном этапе, достаточное для получения интермедиата NS2S6S.

У Bhaskar, U., и др. (2015). Carbohydrate Polymers, 122, 399-407, основные дисахариды, такие как NS6S, NS2S, NS2S6S, в интермедиате перед 3-ОСТ составляют 7,8, 15,7 и 67,9% (по массе), соответственно. Полученный в результате этого «гепарин» не биоэквивалентен свиному гепарину USP, и дисахаридный состав интермедиата перед 3-ОСТ в данном противопоставленном материале не похож на третий интермедиат NS2S6S/TriS, необходимый для получения биоэквивалентного гепарина. Наиболее высокая активность против На, о которой сообщали для «гепарина», полученного в данном противопоставленном материале, составляла 151 ед./мг, что меньше, чем необходимые 180 ед/мг, что делает его неэквивалентным свиному гепарину USP. Кроме того, молекулярная масса продукта, полученного Bhaskar и др., составляла >25000 дальтон.

У Zhang, Z., и др. (2008) Journal of the American Chemical Society, 130(39), 12998-13007, «гепарин», аналог третьего интермедиата NS2S6S, не содержит N-ацетильную группу, которая представляет собой 0S, 2S, 6S и 2S6S. Полученный в результате этого «гепарин» не является биоэквивалентом свиного гепарина USP, и дисахариды интермедиата перед 3-ОСТ в данном противопоставленном материале не могут удовлетворить требованиям, предъявляемым к третьему интермедиату NS2S6S, необходимому для получения биоэквивалентного гепарина. С помощью коагулометрического анализа активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ) определили, что активность данного гепарина составляет 180 ед/мг. Данный анализ не эквивалентен активности против IIa, описанной в современной USP, так что неясно, будет ли он удовлетворять установленным требованиям к активности свиного гепарина USP. Более того, в данном исследовании не проводили анализ активности против Ха, так что отношение активностей против Ха/против IIa данного «гепарина» не определяли. Подводя итог вышесказанному, в отсутствие N-ацетильной группы и без определения активностей против IIa и против Ха данный гепарин не биоэквивалентен свиному гепарину USP.

В J Med Chem 48(2): 349-352 (2005) показана молекула «неогепарина» с молекулярной массой приблизительно 8000 и активностями против Ха - 162; против IIa - 62; против Ха/против IIa - 2,6, т.е. не биоэквивалентная. Учитывая расхождение между молекулярными массами и антикоагулянтной активностью после реакции 3-ОСТ в химико-ферментативной процедуре между неогепарином и биоэквивалентным гепарином, интермедиат неогепарина перед 3-ОСТ не похож на третий интермедиат NS2S6S, необходимый для получения биоэквивалентного гепарина.

В патенте США №6162797 предложено производное гепарина, полученное путем поэтапного химического сульфатирования эпимеризованного N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. Тем не менее, данное производное обладает активностями против Ха - 500-600, против IIa - 250-320 (хотя в указанном описании «аЧТВ» использовали вместо против IIa, и с большой долей вероятности «аЧТВ» должен был быть против IIa), т.е. не является биоэквивалентным. Можно сделать вывод, что в данном документе не описывают и не предлагают интермедиат, эквивалентный третьему интермедиату NS2S6S, необходимому для получения биоэквивалентного гепарина. В данном патенте также не описывают первый (NS) интермедиат или второй интермедиат, описанные ниже.

В US 2014/0349962 А1 показано производное гепарина «митрин», полученное путем химико-ферментативной функционализации гепаросана. «Митрин» представляет собой гексасахарид, лишенный группы 2-O-сульфатированной идуроновой кислоты, с более высокой активностью против Ха, чем у гепарина USP. Следовательно, в данном документе не описывают и не предлагают второй интермедиат (NS2S) или интермедиат, эквивалентный третьему интермедиату (NS2S6S).

Таким образом, хотя «биосинтетические гепарины», которые описаны выше в противопоставленных материалах, обладают некоторыми свойствами свиного гепарина USP, они не являются химически эквивалентными или биоэквивалентными свиному гепарину USP. Описанные выше противопоставленные материалы также не описывают и не предполагают, какие факторы отсутствуют, какие этапы нужно изменить или как их изменить, чтобы получить биосинтетический гепарин. Интермедиаты биосинтетического гепарина, описанные в данной заявке, не находят в интермедиатах продукции гепарина in vivo. В частности, интермедиаты природного гепарина связаны с протеогликановым линкером (Sugahara K, Kitagawa H. (2002) Heparin and heparan sulfate biosynthesis. IUBMB Life, 54(4): 163-75) и, следовательно, не существуют в свободной форме с характеристиками, приведенными в настоящем изобретении. Таким образом, указанный биосинтетический гепарин не является природным продуктом.

Авторы настоящего изобретения получили биосинтетический гепарин, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP. Авторы настоящего изобретения установили три интермедиата, которые, возможно, необходимы для синтеза гепарина, который биоэквивалентен свиному гепарину USP, посредством химико-ферментативных процедур из гепаросана. Для данных интермедиатов, которые обозначены ниже в соответствии с преобладающими в них дисахаридными группами как интермедиат NS, интермедиат NS2S и интермедиат NS2S6S (или интермедиат TriS), характерны определенные диапазоны модифицированных молекул Сахаров, таких как дисахаридные группы. Их можно дополнительно охарактеризовать по особенностям и распределениям молекулярных масс. У данных интермедиатов могут отсутствовать опосредованные антитромбином антикоагулянтные активности.

В настоящем описании предложен синтез биосинтетического гепарина из гепаросана, такого как полученный из бактериального экзополисахарида гепаросан, и выявление свойств ключевых интермедиатов, которые могут потребоваться для получения биоэквивалентного гепарина. В некоторых вариантах реализации биосинтетический гепарин может удовлетворять требованиям фармакопеи США (USP) в отношении активности, в частности, антикоагулянтная активность гепарина против фактора IIa (т.е. против IIa) должна составлять не менее или более 180 ед/мг и отношение активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa (т.е. против Ха/против IIa) должно находится в диапазоне 0,85-1,15 или быть равным 0,9 и 1,1, или приблизительно 1,0. Биосинтетический гепарин может также удовлетворять требованиям USP в отношении распределения молекулярных масс: средняя масса должна составлять 15000-19000 Да; процент цепей гепарина с молекулярной массой более 24000 Да должен составлять не более 20% от общего количества (сюда входят диапазоны 0-15%, 0-10% и 5-10%); и отношение количества цепей с молекулярными массами в диапазоне от 8000 до 16000 Да к количеству цепей с молекулярными массами в диапазоне от 16000 до 24000 Да должно составлять не менее 1,0 (сюда входят диапазоны от 1,0 до 2,5; от 1,0 до 2,0, от 1,2 до 1,8, 1,4-1,7, 1,5 или 1,6). Таким образом, указанный биосинтетический гепарин может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP.

В одном варианте реализации первый интермедиат NS может представлять собой материал гликозаминогликана, содержащий эффективное количество N-сульфатированных (NS) дисахаридных групп. Например, N-сульфатированные (NS) дисахаридные группы могут составлять 78-99,5%, или 78-99%, или 81-97%, или 83-95%, или 84-94%, или 85-93%, или 84-87%, или 85-86%, или 87,5-94%, или 90-93,5%, или 90,5-93%, или 90,3-91,3%, или 92,2-93,2%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, первого интермедиата NS. В некоторых соответствующих вариантах реализации остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Во всех случаях, NS должен содержать некоторое измеримое количество групп NAc.

Характерные молекулярные массы первого интермедиата могут быть подходящими для получения биосинтетического гепарина, который может удовлетворять требованиям к молекулярной массе, установленным для свиного гепарина натрия USP, с применением, например, одного из способов, описанных ниже.

В некоторых вариантах реализации первый интермедиат NS представляет собой материал гликозаминогликана, содержащий 84,7-93,8% по массе N-сульфатированных (NS) дисахаридных групп. В соответствующих вариантах реализации остальная часть представляет собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S).

В некоторых вариантах реализации первый интермедиат NS может содержать 83,4-87,4%, или 83,9-86,9%, или 84,4-86,4%, или 84,9-85,9%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть такого первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S).

В некоторых вариантах реализации первый интермедиат NS может содержать от 87,9% до 92,9%, или от 88,4% до 92,4%, или от 88,9% до 91,9%, или от 89,4% до 91,4%, или от 89,9% до 90,9%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть такого первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S).

В некоторых вариантах реализации первый интермедиат NS может содержать 88,8-94,7%, или 89,3% - 94,2%, или 89,8-93,7%, или 90,3% - 93,2%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть такого первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S).

В некоторых вариантах реализации первый интермедиат NS может содержать 88,8-92,8%, или 89,3-92,3%, или 89,8-91,8%, или 90,3-91,3%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть такого первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S).

В некоторых вариантах реализации первый интермедиат может содержать 90,1-94,7%, или 90,6-94,2%, или 91,1% - 93,7%, или 91,6% - 93,2%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть такого первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S).

В другом варианте реализации может быть предложен второй интермедиат гликозаминогликана NS2S, который может представлять собой материал гликозаминогликана, содержащий эффективное количество N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы. Например, в некоторых вариантах реализации N-сульфатированная, 2-O-сульфатированная (NS2S) дисахаридная группа может составлять 44-80%, или 45-79%, или 50-78%, или 50-77%, или 55-78%, или 55-76%, или 58-77%, или 59-76%, или 60-75%, или 58-62%, или 59-61%, или 65-77%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, второго интермедиата гликозаминогликана NS2S.

Указанный второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может также содержать NS дисахаридную группу, дополнительно к N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группе. Например, NS дисахаридная группа может составлять 12-40%, или 13-39%, или 15-34%, или 15-29%, или 16-29%, или 16-26%, или 17-25%, или 16-18%, или 19-26%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, второго интермедиата гликозаминогликана NS2S. Каждый из указанных диапазонов для NS дисахаридной группы можно использовать с каждым из описанных выше диапазонов для N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы.

Дополнительно к N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группе и NS дисахаридной группе, причем указанный второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может также содержать одну или более второстепенных дисахаридных групп с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и 2-O-сульфатированных, NAc (2S) дисахаридных групп. В некоторых вариантах реализации единственный компонент второго интермедиата гликозаминогликана NS2S, отличный от N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы и N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и/или 2-O-сульфатированную, NAc (2S) дисахаридную группу. В некоторых вариантах реализации объединенное количество 0S и 2S дисахаридных групп может составлять 0,4-25%, или 4-24%, или 5-24%, или 6-20%, или 6-18%, или 6-16%, или 7-23%, или 7-20%, или 7-17%, или 7-15% второго интермедиата NS2S.

Характерные молекулярные массы второго интермедиата могут быть подходящими для получения биосинтетического гепарина, который может удовлетворять требованиям к молекулярной массе, установленным для свиного гепарина натрия USP, с применением, например, одного из способов, описанных ниже.

В некоторых вариантах реализации второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 73,8-75,3% по массе N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, и 18,5-20,2% по массе NS дисахаридной группы. Остальная часть второго интермедиата гликозаминогликана NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы.

В некоторых вариантах реализации второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может со держать 57,5-62,5%, или 58-62%, или 58,5-61,5%, или 59-61%, или 59,5-60,5%, или значение или поддиапазон в рамках данных диапазонов, NS2S дисахаридных групп. Кроме того, второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 23,2-27,2%, или 23,7-26,7%, или 24,2-26,2%, или 24,7-25,7%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата гликозаминогликана NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Объединенное количество 0S и 2S групп может составлять 13,3-16,3%, или 13,8-15,8%, или 14,3-15,3% второго интермедиата.

В некоторых вариантах реализации второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 65,8-77,4%, или 66,3-76,9%, или 66,8-76,4%, или 67,3-75,9%, или значение или поддиапазон в рамках данных диапазонов, NS2S дисахаридных групп. Кроме того, второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 14,8-26%, или 15,3-25,5%, или 15,8-25%, или 16,3-24,5%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата гликозаминогликана NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Объединенное количество 0S и 2S групп может составлять 5,6-10,8%, или 6,1-10,3%, или 6,6-9,8% второго интермедиата.

В некоторых вариантах реализации второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 65,8-74,4%, или 66,3-73,9%, или 66,8-73,4%, или 67,3-72,9%, или значение или поддиапазон в рамках данных диапазонов, NS2S дисахаридных групп. Кроме того, второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 17,9-26%, или 18,4-25,5%, или 18,9-25%, или 19,4-24,5%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата гликозаминогликана NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Объединенное количество 0S и 2S групп может составлять 5,6-10,8%, или 6,1-10,3%, или 6,6-9,8% второго интермедиата.

В некоторых вариантах реализации второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 73,4-77,4%, или 73,9-76,9%, или 74,4-76,4%, или 74,9-75,9%, или значение или поддиапазон в рамках данных диапазонов, NS2S дисахаридных групп. Кроме того, второй интермедиат гликозаминогликана NS2S может содержать 14,8-18,8%, или 15,3-18,3%, или 15,8-17,8%, или 16,3-17,3%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата гликозаминогликана NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Объединенное количество 0S и 2S групп может составлять 5,8-9,8%, или 6,3-9,3%, или 6,8-8,8% второго интермедиата.

Указанный второй интермедиат может быть подходящим для получения гепарина с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP. Другими словами, второй интермедиат может быть таким, что гепарин с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину натрия USP, можно получить, применяя, например, один из способов, описанных ниже. Например, у второго интермедиата может быть среднемассовая молекулярная масса, подходящая для получения конечного продукта гепарина с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину натрия USP. Эффективное количество N-сульфатированных, 2-O-сульфатированных (NS2S) дисахаридных групп во втором интермедиате может быть таким, что гепарин с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину натрия USP, можно получить, применяя, например, один из способов, описанных ниже.

В другом варианте реализации предложен третий интермедиат гликозаминогликана NS2S6S, который может представлять собой материал гликозаминогликана, содержащий эффективные количества N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной, 6-O-сульфатированной (NS2S6S или также известной как TriS) дисахаридной группы и N-сульфатированной, 6-O-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы. Например, NS2S6S дисахаридная группа может составлять 30-74%, или 31-73%, или 36-70%, или 40-67%, или 40-66%, или 42-65%, или 44-64%, или 42-45%, или 48-65%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, третьего интермедиата гликозаминогликана NS2S6S. NS6S дисахаридная группа может составлять 5-40%, или 5 -32%, или 5-26%, или 5-23%, или 5-7%, или 8-16%, или 18-23%, или 6-69%, или 6-32%, или 6-26%, или 6-21%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, третьего интермедиата гликозаминогликана NS2S6S. Каждый из указанных диапазонов для NS6S дисахаридной группы можно использовать с каждым из описанных выше диапазонов для NS2S6S дисахаридной группы.

Предпочтительно, третий интермедиат гликозаминогликана NS2S6S не со держит 3S дисахаридных групп.

Дополнительно к NS2S6S и NS6S дисахаридным группам, третий интермедиат гликозаминогликана NS2S6S также может содержать N-сульфатированную, 2-O-сульфатированную (NS2S) дисахаридную группу и/или NS дисахаридную группу. NS2S дисахаридная группа может составлять 1-28%, или 1-27%, или 4-28%, или 8-28%, или 10-28%, или 11-28%, или 12-27%, или 11-22%, или 19-27%, или 3-23%, или 5-19%, или 7-16%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, третьего интермедиата гликозаминогликана NS2S6S. NS дисахаридная группа может составлять 0,5-23%, или 0,5-20%, или 0,5-19%, или 0,5-18%, или 0,5-17%, или 1-21%, или 1-19%, или 1-18%, или 1-17%, или 1-15%, или любое значение или поддиапазон в рамках указанных диапазонов, третьего интермедиата гликозаминогликана NS2S6S.

Помимо NS2S6S, NS6S, NS2S и NS дисахаридных групп, третий интермедиат гликозаминогликана NS2S6S может содержать одну или более из 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) и 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. В некоторых вариантах реализации единственными компонентами третьего интермедиата гликозаминогликана NS2S6S могут быть (a) 0S; (b) 6S; (с) 2S; и/или (d) 2S6S. Суммарное количество (a) 0S; (b) 6S; (с) 2S; и/или (d) 2S6S в третьем интермедиате гликозаминогликана NS2S6S может составлять, например, 28% или менее, или 27% или менее, или 23%, или 19%, или 16%. В некоторых вариантах реализации объединенное количество (a) 0S; (b) 6S; (с) 2S; и (d) 2S6S в третьем интермедиате гликозаминогликана NS2S6S может составлять 0,5-28%, или 1-27%, или 2-24%, или 3-23%, или 4-20%, или 5-19%, или 8-17%, или 7-16%, или любое значение или поддиапазоны в рамках данных диапазонов.

В некоторых вариантах реализации третий интермедиат может содержать 57,4-62,0% по массе (53,3-59,4 мол. %) N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной, 6-O-сульфатированной (NS2S6S или также известной как TriS) дисахаридной группы, 17,7-22,2% по массе (10,6-15,1 мол. %) N-сульфатированной, 6-O-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы, 8,4-10,9% по массе (12,0-13,8 мол. %) N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы и 3,1-8,1% по массе (5,0-12,2 мол. %) NS дисахаридной группы. В соответствующих вариантах реализации остальная часть может содержать или состоять из 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) и 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. В дополнительном варианте реализации третий интермедиат (NS2S6S) содержит не более 10% по массе всех второстепенных дисахаридных последовательностей, выбранных из (а) 0S; (b) 6S; (с) 2S; и/или (d) 2S6S. Предпочтительно, такой третий интермедиат не содержит 3S дисахаридных групп.

В некоторых вариантах реализации третий интермедиат может содержать 41,5 -45,5%, или 42-45%, или 42,5-44,5%, или 43-44% NS2S6S дисахаридной группы, 8,5-12,5%, или 9-12%, или 9,5-11,5% 10-11% NS6S дисахаридной группы, 12-15%, или 12,5-14,5%, или 13-14% NS2S дисахаридной группы и 14,6-18,6%, или 15,1-18,1%, или 15,6-17,6%, или 16,1-17,1% NS дисахаридной группы. Остальная часть может содержать или состоять из одной или более из 0S; (b) 6S; (с) 2S; и (d) 2S6S. Объединенное количество 0S, 6S, 2S и/или 2S6S групп в третьем интермедиате могут составлять 14,4-17,4%, или 14,9-16,9%, или 15,4-16,4% третьего интермедиата. Предпочтительно, такой третий интермедиат не содержит 3S дисахаридных групп.

В некоторых вариантах реализации третий интермедиат может содержать 51,3-60,3%, или 51,8-59,8%, или 52,3-59,3%, или 52,8-58,8% NS2S6S дисахаридной группы, 8,6-13,5%, или 9,1-13%, или 9,6-12,5%, или 10,1-12% NS6S дисахаридной группы, 10-15,8%, или 10,5-15,3%, или 11-14,8%, или 11,5-14,3% NS2S дисахаридной группы и 7,4-15,2%, или 7,9-14,7%, или 8,4-14,2%, или 8,9-13,7%, или 8,9-9,9%, или 11,7-13,7% NS дисахаридной группы. Остальная часть может содержать или состоять из одной или более из 0S; (b) 6S; (с) 2S; и (d) 2S6S. В некоторых вариантах реализации 2S6S группы могут не присутствовать в третьем интермедиате. Объединенное количество 0S, 6S, 2S и/или 2S6S групп в третьем интермедиате может составлять 7,3-11,6%, или 7,8-11,1%, или 8,3-10,6% третьего интермедиата. Предпочтительно, такой третий интермедиат не содержит 3S дисахаридных групп.

В некоторых вариантах реализации третий интермедиат может содержать 41,5-65,7%, или 42-65,2%, или 42,5% - 64,7%, или 43-64,2% NS2S6S дисахаридной группы, 4,1-23,3%, или 4,6-22,8%, или 5,1% - 22,3%, или 5,6-21,8% NS6S дисахаридной группы, 10-28,6% 10,5-28,1%, или 11-27,6%, или 11,5-27,1%, или 11,1-17,8%, или 19-27,6% NS2S дисахаридной группы и 0,4-15,9%, или 0,7-15,4%, или 1-14,9%, или 1-14,4%, или 0,4 -5,5%, или 10,2-14,9% NS дисахаридной группы. Остальная часть может содержать или состоять из одной или более из 0S; (b) 6S; (с) 2S; и (d) 2S6S. В некоторых вариантах реализации 2S6S группы могут не присутствовать в третьем интермедиате. Объединенное количество 0S, 6S, 2S и/или 2S6S групп в третьем интермедиате может составлять 5,3-9,7%, или 5,8-9,2%%, или 6,3-8,7% третьего интермедиата. Предпочтительно, такой третий интермедиат не содержит 3S дисахаридных групп.

Характерные молекулярные массы третьего интермедиата могут быть подходящими для получения биосинтетического гепарина, который может удовлетворять требованиям к молекулярной массе, установленным для свиного гепарина USP, с применением, например, одного из способов, описанных ниже.

Третий интермедиат может быть подходящим для получения гепарина с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP. Другими словами, третий интермедиат может быть таким, что можно получить гепарин с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP. Например, среднемассовая молекулярная масса третьего интермедиата может быть подходящей для получения конечного продукта гепарина с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP. Другими словами, третий интермедиат может быть таким, что можно получить гепарин с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP. Эффективные количества NS2S6S и NS6S дисахаридных групп в третьем интермедиате могут быть такими, что можно получить гепарин с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP.

Возможно, что ни один из первого, второго и третьего интермедиатов не обладает антикоагулянтной активностью. Ни один из данных интермедиатов не встречается в природе. Авторы настоящего изобретения смогли получить гепарин, который может представлять собой биоэквивалентный гепарин USP с требуемыми размером и активностью, соответствующими свиному гепарину USP, применяя описанные выше три интермедиата.

Также предложены способы получения гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP.

Один вариант реализации может представлять собой способ получения гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP, из третьего интермедиата NS2S6S. В некоторых вариантах реализации указанный способ может включать: (а) получение третьего интермедиата гликозаминогликана NS2S6S, как описано выше; и (b) обработку третьего интермедиата NS2S6S изоформой 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1) в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину натрия USP.

В некоторых вариантах реализации обработку третьего интермедиата NS2S6S можно осуществить в присутствии системы рециркуляции ФАФС, которая может включать пара-нитрофенилсульфат (ПНФС) и ФАФС. Система рециркуляции ФАФС может дополнительно включать катализатор, такой как арилсульфотрансфераза IV (ACT-IV), который можно применять для катализа превращения ПАФ в ФАФС, используя пара-нитрофенилсульфат (ПНФС) в качестве донора сульфата с достаточным количеством ПНФС в реакции, основанной на молярном превращении третьего интермедиата NS2S6S ферментом 3-ОСТ-1. В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить без системы рециркуляции ФАФС с достаточным количеством ФАФС в реакции, основанной на молярном превращении третьего интермедиата NS2S6S ферментом 3-ОСТ-1. В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить в реакционном буфере 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоте (MES) в присутствии фермента 3-ОСТ-1. Можно применять другие подходящие буферы и концентрации буферов, известные специалистам в данной области, такие как фосфатный буфер. Может присутствовать донор сульфата, такой как ФАФС или ПАФ плюс ПНФС. рН буфера может составлять 7,0-7,4, например, приблизительно 7,2. Обработку можно осуществить при повышенной температуре, такой как 30-45°С, или 33-42°С, или 35-40°С. Предпочтительно, для обработки применяют свежие ферменты, такие как 3-ОСТ-1. Указанные ферменты могут быть иммобилизованы или могут находиться в растворе. После обработки, продукт обработки, содержащий биосинтетический гепарин, можно очистить, чтобы удалить оставшиеся после реакции соединения, такие как ПАФ, ФАФС, ПНФС и/или ПНФ. В некоторых вариантах реализации полученный биосинтетический гепарин можно очистить, применяя хроматографический способ, такой как сильная анионообменная хроматография, которая может включать анионообменную смолу, такую как, например, смола Q-сефароза. Полученный биосинтетический гепарин можно присоединить к такой смоле в солевом растворе, который может представлять собой, например, раствор NaCl. Очищенный биосинтетический гепарин можно затем обессолить и концентрировать.

В некоторых вариантах реализации, если у полученного гепарина желательная активность, антикоагулянтная активность и/или активность против На не достигнута, то обработку можно повторить, чтобы получить гепарин с желательной активностью. Например, у изначально полученного гепарина отношение активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa (т.е. против Ха/против IIa) может быть ниже 0,9, например, значение в диапазоне 0,6-0,9 или 0,7-0,9, или выше 1,1, например, значение в диапазоне 1,1-1,5, или 1,1-1,4, или 1,1-1,3, или 1,1-1,2, обработку 3-ОСТ-1 можно повторить для получения гепарина с отношением активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa (т.е. против Ха/против IIa), равным 0,9-1,1 или приблизительно 1,0.

Например, в некоторых вариантах реализации указанный способ может включать:

(a) получение гликозаминогликана, который предпочтительно не содержит 3S дисахаридных групп, но при этом содержит:

(i) 57,4-62,0% по массе N-сульфатированной, 2-сульфатированной, 6-сульфатированной (TriS) дисахаридной группы;

(ii) 17,7-22,2% по массе N-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы;

(iii) 8,4-10,9% по массе N-сульфатированной, 2-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы; и

(iv) 3,1-8,1% по массе N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы; и

(v) необязательно комбинацию остатков N-ацетилированного глюкозамина, содержащих второстепенные дисахаридные группы 0S, 2S, 6S и 2S6S, составляющих остальную часть;

(b) обработку гликозаминогликана изоформой 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1) в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентным гепарину USP. На этапе (b) можно превратить достаточное количество остатков глюкозамина в остатки 3-O-сульфоглюкозамина для получения гепарина, который может проявлять активности против IIa не менее или более 180 единиц/мг и отношение активностей против Ха/против IIa в диапазоне 0,85-1,15, или 0,9-1,1, или приблизительно равное 1,0.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может включать:

(a) получение гликозаминогликана, который предпочтительно не содержит 3S дисахаридных групп, но при этом содержит:

(i) 30-74%, или 31-73%, или 36-70%, или 40-67%, или 40-66%, или 42-65%, или 44-64%, или 42-45%, или 48-65% NS2S6S дисахаридной группы,

(ii) 5-40%, или 5-32%, или 5-26%, или 5-23%, или 5-7%, или 8-16%, или 18-23%, или 6-39%, или 6-32%, или 6-26%, или 6-21% NS6S дисахаридной группы,

(iii) 1-28%, или 1-27%, или 4-28%, или 4-27%, или 8-28%, или 8-27%, или 10-28%, или 11-28%, или 12-27%, или 11-22%, или 19-27% NS2S дисахаридной группы,

(iv) 0,5-23%, или 0,5-20%, или 0,5-19%, или 0,5-18%, или 0,5-17%, или 1-21%, или 1-19%, или 1-18%, или 1-17%, или 1-15% NS дисахаридной группы, и

(v) возможно одну или более дисахаридных групп 0S, 2S, 6S и 2S6S, составляющих остальную часть гликозаминогликана;

(b) обработку гликозаминогликана изоформой 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1) в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентным гепарину USP. На этапе (b) можно превратить достаточное количество остатков глюкозамина в остатки 3-O-сульфоглюкозамина для получения гепарина, который может проявлять активности против IIa не менее или более 180 единиц/мг и отношение активностей против Ха/против IIa в диапазоне 0,85-1,15, или 0,9-1,1, или приблизительно равное 1,0.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может включать:

(a) получение гликозаминогликана, который предпочтительно не содержит 3S дисахаридных групп, но при этом содержит:

(i) 41,5-45,5%, или 42-45%, или 42,5-44,5%, или 43-44% NS2S6S дисахаридной группы,

(ii) 8,5-12,5%, или 9-12%, или 9,5-11,5% 10-11% NS6S дисахаридной группы,

(iii) 12-15%, или 12,5-14,5%, или 13-14% NS2S дисахаридной группы,

(iv) 14,6 -18,6%, или 15,1-18,1%, или 15,6-17,6%, или 16,1-17,1% NS дисахаридной группы и

(v) возможно одну или более групп 0S, 2S, 6S и 2S6S, составляющих остальную часть гликозаминогликана;

(b) обработку гликозаминогликана изоформой 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1) в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентным гепарину USP. На этапе (b) можно превратить достаточное количество остатков глюкозамина в остатки 3-O-сульфоглюкозамина для получения гепарина, который может проявлять активности против IIa не менее или более 180 единиц/мг и отношение активностей против Ха/против IIa в диапазоне 0,85-1,15, или 0,9-1,1, или приблизительно равное 1,0.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может включать:

(а) получение гликозаминогликана, который предпочтительно не содержит 3S дисахаридных групп, но при этом содержит:

(i) 51,3-60,3%, или 51,8-59,8%, или 52,3-59,3%, или 52,8-58,8% NS2S6S дисахаридной группы,

(ii) 8,6-13,5%, или 9,1-13%, или 9,6-12,5%, или 10,1-12% NS6S дисахаридной группы,

(iii) 10-15,8%, или 10,5-15,3%, или 11-14,8%, или 11,5-14,3% NS2S дисахаридной группы,

(iv) 7,4-15,2%, или 7,9-14,7%, или 8,4-14,2%, или 8,9-13,7%, или 8,9-9,9%, или 11,7-13,7% NS дисахаридной группы, и

(v) возможно одну или более дисахаридных групп 0S, 2S, 6S и 2S6S, составляющих остальную часть гликозаминогликана;

(b) обработку третьего интермедиата NS2S6S изоформой 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1) в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентным гепарину USP. На этапе (b) можно превратить достаточное количество остатков глюкозамина в остатки 3-O-сульфоглюкозамина для получения гепарина, который может проявлять активности против IIa не менее или более 180 единиц/мг и отношение активностей против Ха/против IIa в диапазоне 0,85-1,15, или 0,9-1,1, или приблизительно равное 1,0.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может включать:

(а) получение гликозаминогликана, который предпочтительно не содержит 3S дисахаридных групп, но при этом содержит:

(i) 41,5-65,7%, или 42-65,2%, или 42,5% - 64,7%, или 43-64,2% NS2S6S дисахаридной группы,

(ii) 4,1-23,3%, или 4,6-22,8%, или 5,1% - 22,3%, или 5,6-21,8% NS6S дисахаридной группы,

(iii) 10-28,6% 10,5-28,1%, или 11-27,6%, или 11,5-27,1%, или 11,1-17,8%, или 19-27,6% NS2S дисахаридной группы,

(iv) 0,4-15,9%, или 0,7-15,4%, или 1-14,9%, или 1-14,4% или 0,4-5,5%, или 10,2-14,9%NS дисахаридной группы, и

(v) возможно одну или более дисахаридных групп 0S, 2S, 6S и 2S6S, составляющих остальную часть гликозаминогликана;

(b) обработку гликозаминогликана изоформой 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1) в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением биосинтетического гепарина, который может быть биоэквивалентным гепарину USP. На этапе (b) можно превратить достаточное количество остатков глюкозамина в остатки 3-O-сульфоглюкозамина для получения гепарина, который может проявлять активности против IIa не менее или более 180 единиц/мг и отношение активностей против Ха/против IIa в диапазоне 0,85-1,15, или 0,9-1,1, или приблизительно равное 1,0.

В другом варианте реализации может быть предложен способ получения первого интермедиата NS, описанный выше. Указанный способ может включать получение гепаросана, а затем превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. Количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы в первом интермедиате NS. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами - водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В другом варианте реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с водным раствором основания, таким как водный гидроксид натрия или водный гидроксид калия, и N-сульфонирования с помощью фосфоаденозин-фосфосульфата (ФАФС), применяя катализатор N-сульфотрансферазу. Количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству N-сульфатированных (NS) дисахаридных групп в первом интермедиате NS. В другом варианте реализации остатки N-ацетилглюкозамина в гепаросане можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) с получением первого интермедиата NS. Количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы в первом интермедиате NS. В каждом из способов может быть предпочтительно, чтобы количество незамещенных аминогрупп, оставшихся после либо химического, либо ферментативного N-сульфонирования, было не больше, чем количество незамещенных аминогрупп, присутствующих в свином гепарине натрия USP: одна или меньше на цепь (Т. Toida, H. Yoshida, H. Toyoda, I. Koshiishi, T. Imanari, R.E. Hileman, J.R. Fromm, R.J. Linhardt, Biochemical Journal, 322, 499-506, 1997). Количество NS групп в полученном первом интермедиате можно контролировать путем контролирования химических или ферментативных процессов (Z. Wang, и др. (2011), Journal of Biotechnology, 156, 188-196; A. Onishi (2015), Detailed physicochemical and biological analyses of heparins from various sources, докторская диссертация, Ренсселеровский политехнический институт. Трой, Нью-Йорк, США).

Характерные молекулярные массы первого полученного интермедиата могут быть такими, чтобы они подходили для получения биосинтетического гепарина, который может удовлетворять требованиям к молекулярной массе, установленным для свиного гепарина USP, с применением, например, одного из способов, описанных ниже.

Гепаросан, применяемый в способах согласно настоящему описанию, может представлять собой, например, гепаросан, полученный с применением бактерий, таких как Escherichia coli (E. coli) или Pasteurella muliocida. Например, гепаросан можно получить из K5 E. coli или Nissle 1917 E. coli. Перед получением первого интермедиата гепаросан можно N-деацетилировать и деполимеризовать, как описано, например, в Z. Wang и др. (2011), Journal of Biotcchnology, 156, 188-196.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 84,7-93,8% по массе N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение 84,7-93,8% по массе остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения 84,7-93,8% по массе остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения 84,7-93,8% по массе остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 78-99,5%, или 78-99%, или 81-97%, или 83-95%, или 84-94%, или 85-93%, или 84-87%, или 85-86%, или 87,5-94%, или 90-93,5%, или 90,5-93%, или 90,3-91,3%, или 92,2-93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением первого интермедиата NS.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 83,4-87,4%, или 83,9-86,9%, или 84,4-86,4%, или 84,9-85,9% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением первого интермедиата NS. Среднемассовая молекулярная масса полученного первого интермедиата NS может быть достаточной для его превращения с помощью указанного процесса с получением БСГ с подходящими параметрами молекулярных масс.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 87,9% до 92,9%, или 88,4% до 92,4%, или от 88,9% до 91,9%, или от 89,4% до 91,4%, или от 89,9% до 90,9% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением первого интермедиата NS. Среднемассовая молекулярная масса полученного первого интермедиата NS может быть достаточной для его превращения с помощью указанного процесса с получением БСГ с подходящими параметрами молекулярных масс.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 88,8-94,7%, или 89,3% - 94,2%, или 89,8-93,7%, или 90,3% - 93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением первого интермедиата NS.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 88,8-92,8%, или 89,3-92,3%, или 89,8-91,8%, или 90,3-91,3% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением первого интермедиата NS.

В некоторых вариантах реализации превращение гепаросана в первый интермедиат может включать получение или приготовление раствора гепаросана. Указанный раствор может содержать концентрацию гепаросана 0,05-12%, или 0,1-10%, или 0,1-5%, или 0,1-3%, или 0,5-2%. Растворитель может представлять собой, например, воду или растворитель на водной основе. Таким образом, раствор может представлять собой водный раствор. Указанный раствор можно привести во взаимодействие с основанием, таким как гидроксид натрия или гидроксид калия. Реакцию можно вести при повышенной температуре, такой как, например, 30-70°С или 40-65°С или 50-55°С. Затем в реакционную смесь можно добавить кислоту, такую как, например, HCl, чтобы подвести рН до приблизительно 7. Продукт можно подвергнуть реакции N-сульфонирования, которую можно осуществить, например, применяя один или более N-сульфонирующих реагентов, которые могут представлять собой, например, триоксид серы или комплекс триоксида серы, такой как комплекс серы и амина. Лишь некоторые из примеров комплексов серы и амина включают комплекс серы и триалкиламина, такой как, например, комплекс серы и триметиламина, комплекс триоксида серы и диметилэтиламина и комплекс триоксида серы и метилдиэтиламина, а также содержащий триоксид серы и амин ариловый комплекс, такой как комплекс триоксида серы и пиридина. Затем продукт N-сульфонирования можно фракционировать для получения желательных параметров молекулярных масс.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения первого интермедиата NS, содержащего 90,1-94,7%, или 90,6-94,2%, или 91,1% - 93,7%, или 91,6% - 93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы. Остальная часть первого интермедиата NS может представлять собой второстепенную дисахаридную группу с немодифицированным N-ацетилированным глюкозамином (NAc) (0S). Указанный способ может включать превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением N-деацетилированного, N-сульфатированного гепаросана. В соответствующих вариантах реализации первый интермедиат NS можно получить из гепаросана путем приведения во взаимодействие гепаросана с химическими реагентами-водным гидроксидом натрия и сульфонирующим реагентом, таким как комплекс триэтиламина-триоксида серы, при условиях, подходящих для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, в остатки N-сульфоглюкозамина с получением первого интермедиата NS. В качестве альтернативы, гепаросан можно привести во взаимодействие с N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой (N-ДСТ) для превращения некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане, причем указанное количество соответствует количеству NS групп в первом интермедиате, с получением первого интермедиата NS.

В другом варианте реализации может быть предложен способ получения второго интермедиата NS2S, как описано выше. Указанный способ может включать (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы в первом интермедиате NS), а затем (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и/или 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), с получением второго интермедиата NS2S. В некоторых вариантах реализации длины цепей второго интермедиата могут значительно не отличаться от длин цепей первого интермедиата. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

Превращение гепаросана в первый интермедиат можно осуществить, как обсуждалось выше.

В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить в присутствии системы рециркуляции ФАФС, которая может включать пара-нитрофенилсульфат (ПНФС) и ФАФС. Система рециркуляции ФАФС может дополнительно включать катализатор, такой как арилсульфотрансфераза IV (ACT-IV), который можно применять для катализа превращения ПАФ в ФАФС, применяя ПНФС в качестве донора сульфата в реакции, основанной на молярном превращении первого интермедиата ферментами С5-эпи и 2-ОСТ. В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить без системы рециркуляции ФАФС, но с достаточным количеством ФАФС в реакции, основанной на молярном превращении первого интермедиата NS2S6S. В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить, например, в буфере, таком как реакционный буфер-2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES). Можно применять другие подходящие буферы и концентрации буферов, известные специалистам в данной области, в присутствии ферментов С5-эпи и 2-ОСТ. Может присутствовать донор сульфата, такой как ФАФС или ПАФ плюс ПНФС. РН буфера может составлять 7,0-7,4, например, приблизительно 7,2. Обработку можно осуществить при повышенной температуре, такой как 30-45°С, или 33-42°С, или 35-40°С. Предпочтительно, для обработки используют свежие ферменты, такие как С5-эпи и/или 2-ОСТ. Указанные ферменты могут быть иммобилизованы или могут находиться в растворе. После обработки, продукт обработки, содержащий второй интермедиат, можно очистить, чтобы удалить оставшиеся после реакции соединения, такие как ПАФ, ФАФС, ПНФС и/или ПНФ. Очищенный второй интермедиат можно собрать и сконцентрировать для дальнейшего применения, такого как анализ и/или получение третьего интермедиата.

В некоторых вариантах реализации, если желательные дисахаридные характеристики, такие как процент NS2S, не достигнуты в гликозаминогликане, полученном в результате обработки, то обработку можно повторить для получения гликозаминогликана с дисахаридными характеристиками, такими как процент NS2S, желательными для второго интермедиата.

Например, в некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения второго интермедиата NS2S, содержащего 73,8-75,3% по массе N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, и 18,5-20,2% по массе NS дисахаридной группы. Остальная часть второго интермедиата NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным NAc (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Данный способ может включать: (а) превращение 84,7-93,8% по массе остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS; и (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения второго интермедиата NS2S, содержащего 44-80%, или 45-79%, или 50-78%, или 50-77%, или 55-78%, или 55-76%, или 58-77%, или 59-76%, или 60-75%, или 58-62%, или 59-61%, или 65-77% NS2S дисахаридных групп и 12-40%, или 13-39%, или 15-34%, или 15-29%, или 16-29%, или 17-25%, или 16-26%, или 16-18%, или 19-26% NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным NAc (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 78-99,5%, или 78-99%, или 81-97%, или 83-95%, или 84-94%, или 85-93%, или 84-87%, или 85-86%, или 87,5-94%, или 90-93,5%, или 90,5-93%, или 90,3-91,3%, или 92,2-93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); и (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения второго интермедиата NS2S, содержащего 57,5-62,5%, или 58-62%, или 58,5-61,5%, или 59-61%, или 59,5-60,5% NS2S дисахаридных групп и 23,2-27,2%, или 23,7-26,7%, или 24,2-26,2%, или 24,7-25,7% NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным NAc (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 83,4-87,4%, или 83,9-86,9%, или 84,4-86,4%, или 84,9-85,9% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); и (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения второго интермедиата NS2S, содержащего 65,8-77,4%, или 66,3-76,9%, или 66,8-76,4%, или 67,3-75,9% NS2S дисахаридных групп и 14,8-26%, или 15,3-25,5%, или 15,8-25%, или 16,3-24,5% NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным NAc (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 88,8-94,7%, или 89,3% - 94,2%, или 89,8-93,7%, или 90,3% - 93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); и (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения второго интермедиата NS2S, содержащего 65,8-74,4%, или 66,3-73,9%, или 66,8-73,4%, или 67,3-72,9% NS2S дисахаридных групп и 17,9-26%, или 18,4-25,5%, или 18,9-25%, или 19,4-24,5% NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным NAc (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 88,8-92,8%, или 89,3-92,3%, или 89,8-91,8%, или 90,3-91,3% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); и (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения второго интермедиата NS2S, содержащего 73,4-77,4%, или 73,9-76,9%, или 74,4-76,4%, или 74,9-75,9% NS2S дисахаридных групп и 14,8-18,8%, или 15,3 -18,3%, или 15,8-17,8%, или 16,3-17,3% NS дисахаридных групп. Остальная часть второго интермедиата NS2S может включать или состоять из второстепенной дисахаридной группы с немодифицированным NAc (0S) и/или 2-O-сульфатированной, NAc (2S) дисахаридной группы. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 90,1-94,7%, или 90,6-94,2%, или 91,1% - 93,7%, или 91,6% - 93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); и (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S. Предпочтительно, обработка включает оба фермента С5-эпи и 2-ОСТ.

В другом варианте реализации может быть предложен способ получения третьего интермедиата NS2S6S, как описано выше. Указанный способ может включать (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы в первом интермедиате NS); (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и/или 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S и (с) обработку второго интермедиата NS2S ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3), в присутствии донора сульфата, такого как фосфоаденозин-фосфосульфат (ФАФС), с получением третьего интермедиата NS2S6S.

Превращение гепаросана с получением первого интермедиата и обработку первого интермедиата можно осуществить, как описано выше.

В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить в присутствии системы рециркуляции ФАФС, которая может включать пара-нитрофенилсульфат (ПНФС) и ФАФС. Система рециркуляции ФАФС может дополнительно включать катализатор, такой как арилсульфотрансфераза IV (ACT-IV), который можно применять для катализа превращения ПАФ в ФАФС, применяя ПНФС в качестве донора сульфата с достаточным количеством ПНФС в реакции, основанной на молярном превращении второго интермедиата ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3). В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить без системы рециркуляции ФАФС, но с достаточным количеством ФАФС в реакции, основанной на молекулярном превращении второго интермедиата ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3). В некоторых вариантах реализации обработку можно осуществить в буфере, таком как реакционный буфер 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES), в присутствии ферментов 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3. Может присутствовать донор сульфата, такой как ФАФС или ПАФ плюс ПНФС. РН буфера может составлять 7,0-7,4, например, приблизительно 7,2. Обработку можно осуществить при повышенной температуре, такой как 30-45°С, или 33-42°С, или 35-40°С. Предпочтительно для обработки используют свежие ферменты, такие как 6-ОСТ-1 и/или 6-ОСТ-3. Указанные ферменты могут быть иммобилизованы или могут находиться в растворе. После обработки, продукт обработки, содержащий третий интермедиат, можно очистить, чтобы удалить оставшиеся после реакции соединения, такие как ПАФ, ФАФС, ПНФС и/или ПНФ. Очищенный третий интермедиат можно сконцентрировать и собрать для дальнейшего применения, такого как анализ и/или получение биосинтетического гепарина.

В некоторых вариантах реализации, если желаемые дисахаридные характеристики, такие как проценты NS2S6S и NS6S, не достигнуты в гликозаминогликане, полученном в результате обработки второго интермедиата NS, то обработку можно повторить для получения гликозаминогликана с дисахаридными характеристиками, такими как проценты NS2S6S и NS6S, желательными для третьего интермедиата.

Например, в некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения третьего интермедиата NS2S6S, содержащего 57,4-62,0% по массе N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной, 6-O-сульфатированной (NS2S6S) дисахаридной группы, 17,7-22,2% по массе N-сульфатированной, 6-O-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы, 8,4-10,9% по массе N-сульфатированной, 2-O-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, и 3,1-8,1% по массе NS дисахаридной группы. Остальная часть третьего интермедиата NS2S6S может включать или состоять из одной или более 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. Третий интермедиат предпочтительно не со держит 3S дисахаридных групп. Данный способ может включать: (а) превращение 84,7-93,8% по массе остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS; (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S; и (с) обработку второго интермедиата NS2S ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3), в присутствии донора сульфата, такого как фосфоаденозин-фосфосульфат (ФАФС), с получением третьего интермедиата NS2S6S.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения третьего интермедиата NS2S6S, содержащего 30-74%, или 31-73%, или 36-70%, или 40-67%, или 40-66%, или 42-65%, или 44-64%, или 42-45%, или 48-65% NS2S6S дисахаридной группы, 5-40%, или 5-32%, или 5-26%, или 5-23%, или 5-7%, или 8-16%, или 18-23%, или 6-39%, или 6-32%, или 6-26%, или 6-21% NS6S дисахаридной группы, 1-28%, или 1-27%, или 4-28%, или 4-27%, или 8-28%, или 8 -27%, или 10-28%, или 11-28%, или 12-27%, или 11-22%, или 19-27% NS2S дисахаридной группы; и 0,5-23%, или 0,5-20%, или 0,5-19%, или 0,5-18%, или 0,5-17%, или 1-21%, или 1-19%, или 1-18%, или 1-17%, или 1-15% NS дисахаридной группы. Остальная часть третьего интермедиата NS2S6S может включать или состоять из одной или более 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. Третий интермедиат предпочтительно не со держит 3S дисахаридных групп. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением интермедиата NS, содержащего 78-99,5%, или 78-99%, или 81-97%, или 83-95%, или 84-94%, или 85-93%, или 84-87%, или 85-86%, или 87,5-94%, или 90-93,5%, или 90,5-93%, или 90,3-91,3%, или 92,2-93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S, содержащего 44 -80%, или 45-79%, или 50-78%, или 50-77%, или 55-78%, или 55-76%, или 58-77%, или 59-76%, или 60-75%, или 58-62%, или 59-61%, или 65-77% NS2S дисахаридных групп и 12-40%, или 13-39%, или 15-34%, или 15-29%, или 16-29%, или 16-26%, или 17-25%, или 16-18%, или 19-26% NS дисахаридных групп; и (с) обработку второго интермедиата NS2S ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3), в присутствии донора сульфата, такого как фосфоаденозин-фосфосульфат (ФАФС), с получением третьего интермедиата NS2S6S.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения третьего интермедиата NS2S6S, содержащего 41,5-45,5%, или 42-45%, или 42,5-44,5%, или 43-44% NS2S6S дисахаридной группы, 8,5-12,5%, или 9-12%, или 9,5-11,5% 10-11% NS6S дисахаридной группы, 12-15%, или 12,5-14,5%, или 13-14% NS2S дисахаридной группы и 14,6-18,6%, или 15,1-18,1%, или 15,6-17,6%, или 16,1-17,1% NS дисахаридной группы. Остальная часть третьего интермедиата NS2S6S может включать или состоять из одной или более 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. Третий интермедиат предпочтительно не со держит 3S дисахаридных групп. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 83,4-87,4%, или 83,9-86,9%, или 84,4-86,4%, или 84,9-85,9% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S, содержащего 57,5-62,5%, или 58-62%, или 58,5-61,5%, или 59-61%, или 59,5-60,5% NS2S дисахаридных групп и 23,2-27,2%, или 23,7-26,7%, или 24,2-26,2%, или 24,7-25,7% NS дисахаридных групп; и (с) обработку второго интермедиата NS2S ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3), в присутствии донора сульфата, такого как фосфоаденозин-фосфосульфат (ФАФС), с получением третьего интермедиата NS2S6S.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения третьего интермедиата NS2S6S, содержащего 51,3-60,3%, или 51,8-59,8%, или 52,3-59,3%, или 52,8-58,8% NS2S6S дисахаридной группы, 8,6-13,5%, или 9,1-13%, или 9,6-12,5%, или 10,1-12% NS6S дисахаридной группы, 10-15,8%, или 10,5-15,3%, или 11-14,8%, или 11,5-14,3% NS2S дисахаридной группы и 7,4-15,2%, или 7,9-14,7%, или 8,4-14,2%, или 8,9-13,7%, или 8,9-9,9%, или 11,7-13,7% NS дисахаридной группы. Остальная часть третьего интермедиата NS2S6S может включать или состоять из одной или более 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. Третий интермедиат предпочтительно не со держит 3S дисахаридных групп. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 88,8-94,7%, или 89,3% - 94,2%, или 89,8-93,7%, или 90,3% - 93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, такого как 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S, содержащего 65,8-74,4%, или 66,3-73,9%, или 66,8-73,4%, или 67,3-72,9% NS2S дисахаридных групп и 17,9-26%, или 18,4-25,5%, или 18,9-25%, или 19,4-24,5% NS дисахаридных групп; и (с) обработку второго интермедиата NS2S ферментом, таким как 6-O-сульфотрансферазы 1 и 3 (6-ОСТ-1,3), в присутствии донора сульфата, такого как фосфоаденозин-фосфосульфат (ФАФС), с получением третьего интермедиата NS2S6S.

В некоторых вариантах реализации указанный способ может представлять собой способ получения третьего интермедиата NS2S6S, содержащего 41,5-65,7%, или 42-65,2%, или 42,5% - 64,7%, или 43-64,2% NS2S6S дисахаридной группы, 4,1-23,3%, или 4,6-22,8%, или 5,1% - 22,3%, или 5,6-21,8% NS6S дисахаридной группы, 10-28,6% 10,5-28,1%, или 11-27,6%, или 11,5-27,1%, или 11,1-17,8%, или 19-27,6% NS2S дисахаридной группы и 0,4-15,9%, или 0,7-15,4%, или 1-14,9%, или 1-14,4%, или 0,4-5,5%, или 10,2-14,9% NS дисахаридной группы. Остальная часть третьего интермедиата NS2S6S может включать или состоять из одной или более 0S, 2S, 6-O-сульфатированных, NAc (6S) 2-O-сульфатированных, 6-O-сульфатированных, NAc (2S6S) дисахаридных групп. Третий интермедиат предпочтительно не со держит 3S дисахаридных групп. Данный способ может включать: (а) превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого интермедиата NS, содержащего 90,1-94,7%, или 90,6-94,2%, или 91,1% - 93,7%, или 91,6% - 93,2% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы (количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина может соответствовать количеству NS групп в первом интермедиате); (b) обработку указанного первого интермедиата NS ферментом, таким как С5-эпимераза (С5-эпи) и 2-O-сульфотрансфераза (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата, 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфата (ФАФС), с получением второго интермедиата NS2S, содержащего 65,8-77,4%, или 66,3-76,9%, или 66,8-76,4%, или 67,3-75,9% NS2S дисахаридных групп и 14,8-26%, или 15,3-25,5%, или 15,8-25%, или 16,3-24,5%NS дисахаридных групп; и (с) обработку второго интермедиата NS2S 6-O-сульфотрансферазами 1 и 3 (6-ОСТ-1,3) в присутствии фосфоаденозин-фосфосульфата (ФАФС) с получением третьего интермедиата NS2S6S.

В другом варианте реализации может быть предложен способ получения гепарина, который может быть биоэквивалентным гепарину USP, включающий обработку третьего интермедиата NS2S6S, описанного выше, ферментом, таким как изоформа 1 3-O-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1), в присутствии донора сульфата, такого как ФАФС, для превращения 3-гидроксильных групп остатков глюкозамина в остатки 3-O-сульфоглюкозамина, таким образом позволяя получить гепарин, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину натрия USP.

В упомянутых выше реакциях с сульфотрансферазами 2-ОСТ, 3-ОСТ-1, одной или обеими 6-ОСТ-1 или 6-ОСТ-3, указанным ферментам может потребоваться донор сульфата, который обычно представляет собой ФАФС, и система регенерации. Один или более ферментов, таких как 2-ОСТ, 3-ОСТ-1, одна или обе 6-ОСТ-1 или 6-ОСТ-3, и донор сульфата, такой как ФАФС, могут находиться в растворе. Указанные ферменты могут быть иммобилизованы. В некоторых вариантах реализации указанные реакции осуществляют in vitro. В других вариантах реализации один или более этапов про исходят в ну три микробного хозяина, кодирующего гены одной или более из N-ДСТ, С5-эпи, 2-ОСТ, 3-ОСТ-1, одной из 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3, и источника ФАФС.

Хотя описанные выше способы позволяют получить гепарин, который биоэквивалентен свиному гепарину USP, в некоторых вариантах реализации полученный гепарин может быть таким, что он не удовлетворяет одному или более требованиям биоэквивалентности свиному гепарину USP.

В некоторых вариантах реализации полученная партия гепарина может удовлетворять требованиям для свиного гепарина USP к молекулярной массе и антикоагулянтным активностям, но при этом не удовлетворять требованиям для свиного гепарина USP к активностям против IIa. Например, полученная партия гепарина может удовлетворять требованиям для свиного гепарина USP к молекулярной массе и антикоагулянтным активностям, но при этом отношение активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa (т.е. против Ха/против IIa) ниже 0,9, например, его значение находится в диапазонах 0,5-0,9 или 0,6-0,9 или 0,7-0,9, или выше 1,1, например, его значение находится в диапазонах 1,1-1,5 или 1,1-1,4 или 1,1-1,3 или 1,1-1,2. Такую партию можно превратить в партию гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP, с помощью дополнительной обработки ферментом, такой как обработка изоформой 1 3-О-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1), которую можно осуществить в присутствии донора сульфата, такого как ФАФС.

В некоторых вариантах реализации полученная партия гепарина может удовлетворять требованиям для свиного гепарина USP к антикоагулянтным активностям, но при этом не удовлетворять требованиям для свиного гепарина USP к активностям против IIa и к молекулярной массе. Например, для полученной партии отношение активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa (т.е. против Xa/против IIa) может быть ниже 0,9, например, значение в диапазонах 0,5-0,9, или 0,6-0,9, или 0,7-0,9, или выше 1,1, например, значение в диапазонах 1,1-1,5, или 1,1-1,4, или 1,1-1,3, или 1,1-1,2, и можно провести дополнительную обработку ферментом, такую как обработка изоформой 1 3-О-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1), которую можно осуществить в присутствии донора сульфата, такого как ФАФС, для получения отношения активности против фактора Ха к таковой против фактора IIa, которое удовлетворяет требованиям к активностям против IIa для соответствия свиному гепарину USP.

Хотя полученный гепарин может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP, в некоторых вариантах реализации полученный гепарин может физически отличаться от полученного естественным путем гепарина, такого как бычий или свиной гепарин, но все же будет биоэквивалентен свиному гепарину USP. Например, способы согласно настоящему изобретению могут позволить получить партии гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину USP, так что полученные партии более единообразны или однородны между собой по одному или более из: а) химического состава, b) молекулярной массы, такой как среднемассовая молекулярная масса, и с) распределения молекулярных масс, по сравнению с полученными естественным путем партиями гепарина, такими как партии гепарина из кишечника быка.

С помощью способов согласно настоящему изобретению можно получить партии гепарина массой по меньшей мере 50 мг, или по меньшей мере 80 мг, или по меньшей мере 100 мг, или по меньшей мере 200 мг, или по меньшей мере 1 г, или по меньшей мере 2 г.

Полученные партии могут быть однородны между собой по молекулярной массе, дисахаридному составу и биологической активности. Все полученные партии указанного выше масштаба могут удовлетворять требованиям для свиного гепарина USP, таким как требования к молекулярной массе, дисахаридному составу и биологической активности. Количество однородных партий может составлять по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 12, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20.

В настоящем описании также предложена фармацевтическая композиция, содержащая биоэквивалентный гепарин, полученный с применением описанных выше способов. Указанная фармацевтическая композиция также может содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. В некоторых вариантах реализации гепарин может, например, находиться в составе в воде или в изотоническом солевом растворе или глюкозе. В некоторых вариантах реализации композиция гепарина может содержать один или более консервантов, таких как бисульфит, или противомикробное средство, такое как бензиловый спирт.

В некоторых вариантах реализации биоэквивалентный гепарин, полученный согласно настоящему описанию, можно применять в виде фармацевтически приемлемой соли, которая может представлять собой, например, соль натрия или соль калия. Лишь некоторые из примеров фармацевтически приемлемых солей включают соли лития, натрия, кальция, бария, калия, магния и аммония.

В некоторых вариантах реализации биоэквивалентный гепарин, полученный согласно приведенному выше настоящему описанию, можно использовать в качестве исходного материала для получения низкомолекулярного гепарина. Это можно осуществить, например, просто путем замены гепарина из кишечника свиней на биоэквивалентный гепарин, полученный согласно настоящему описанию, а затем использования одного из известных способов синтеза низкомолекулярного гепарина. В одном варианте реализации соль, такую как, например, соль натрия или соль калия, биоэквивалентного гепарина, полученного согласно настоящему описанию, можно превратить в соль бензетония, которую затем можно бензилировать и обработать основанием, таким как гидроксид натрия или гидроксид калия, чтобы частично деполимеризовать. Полученный в результате этого низкомолекулярный продукт гепарина будет превращен в соль, такую как соль натрия или соль калия, и очищен. Данный процесс позволит получить низкомолекулярный гепарин - эноксапарин. Другие процессы можно применять для превращения биоэквивалентного гепарина, полученного согласно настоящему описанию, в другие низкомолекулярные гепарины, такие как, например, далтепарин или тинзапарин.

Настоящее описание также включает способ разжижения крови у субъекта, такого как человек, включающий получение биоэквивалентного гепарина с применением одного из способов, описанных выше, и введение эффективного количества полученного биоэквивалентного гепарина субъекту.

Настоящее описание также включает способ лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, которое чувствительно к гепарину, включающий получение биоэквивалентного гепарина с применением одного из способов, описанных выше, и введение эффективного количества полученного биоэквивалентного гепарина субъекту, такому как человек. Лишь некоторые из примеров такого заболевания или состояния включают тромбоз глубоких вен, эмболию легких и артериальную тромбоэмболию.

Биоэквивалентный гепарин также можно применять в экстракорпоральной терапии, включая диализ почек для пациентов с почечной недостаточностью или для насыщения крови кислородом у пациентов, подключенных к аппарату искусственного кровообращения во время операции на открытом сердце.

Эффективное количество биоэквивалентного гепарина может означать количество, которого может быть достаточно для получения желательного эффекта, такого как разжижение крови или лечение заболевания или состояния, которое чувствительно к гепарину.

Дозы биоэквивалентного гепарина могут быть такими же, как дозы, используемые для гепарина USP, который получен естественным способом, такого как свиной или бычий гепарин.

Биоэквивалентный гепарин можно вводить, применяя множество способов введения. В некоторых вариантах реализации биоэквивалентный гепарин можно вводить парентерально. Например, биоэквивалентный гепарин можно вводить путем внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекции.

В настоящем описании также предложена композиция, содержащая первый интермедиат NS, описанный выше. Такая композиция может содержать по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5% первого интермедиата NS. Указанная композиция может быть такой, что в ней отсутствует или по существу отсутствует любой полисахарид, отличный от первого интермедиата NS. Термин «по существу отсутствует» может означать, что любой другой полисахарид невозможно обнаружить в измеримых количествах. Способы детектирования могут включать спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или обработку тремя гепарин-лиазами, расщепляющими гепарин или интермедиат гепарина на дисахариды, которые можно удалить посредством диализа или эксклюзионной хроматографии. Другое не относящееся к гепарину или к интермедиатам гепарина соединение будет устойчиво к обработке гепарин-лиазами, и его можно будет выделить и обнаружить, применяя обычные способы, такие как ЯМР-спектроскопия.

В настоящем описании также предложена композиция, содержащая второй интермедиат NS2S, описанный выше. Такая композиция может содержать по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5% второго интермедиата NS2S. Указанный набор или композиция могут быть такими, что в них отсутствует или по существу отсутствует любой полисахарид, отличный от второго интермедиата NS2S.

В настоящем описании также предложена композиция, содержащая третий интермедиат NS2S6S, описанный выше. Такой набор или композиция могут содержать по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5% третьего интермедиата NS2S6S. Указанный набор или композиция могут быть такими, что в них отсутствует или по существу отсутствует любой полисахарид, отличный от третьего интермедиата NS2S6S. Например, в некоторых вариантах реализации в указанном наборе или композиции может отсутствовать или по существу отсутствовать гепарин.

Варианты реализации, описанные в данной заявке, далее проиллюстрированы, но ни коим образом не ограничены, следующими рабочими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение гепаросана.

Escherichia coli K5 (серовар O10:K5:H4; Американская коллекция типовых культур (АТСС), №23506) или Escherichia coli Nissle 1917 (серовар O6:K5:H1) использовали для продукции гепаросана (Cress, В.F., Toparlak, О.D., Guleria, S., Lebovich, М., Stieglitz, J.Т., Englaender, J.A., Jones, J.A., Linhardt, R.J., и Koffas, M. A. G. (2015) CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4, 987-1000; Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A.M., Dordick, J.S., и Linhardt, R.J. (2010) E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnology and Bioengineering. 107, 964-973; Wang, Z., Dordick, J.S., и Linhardt, R.J. (2011) Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering. Bioengineered bugs. 2, 63-67). Периодические ферментации с подпиткой при высокой плотности клеток осуществляли в 5 л или 45-90 л, применяя биореактор Eppendorf BioFlo 320 или Biostat, соответственно. Клетки растили в средах с определенным содержанием глюкозы (рН 6,8±0,01), содержащих глюкозу (обычно 20 г/л), однозамещенный фосфат калия (обычно 13,5 г/л), фосфат аммония (обычно 4,0 г/л), гептагидрат сульфата магния (обычно 1,4 г/л), лимонную кислоту (обычно 1,7 г/л) и раствор металлических микроэлементов (обычно 10,0 мл/л). Раствор металлических микроэлементов в 5 М HCl (1,5 л) состоял из FeSO₄⋅7H₂O (15 г), CaCl₂ (3,0 г), ZnSO₄,7H₂O (3,3 г), MnSO₄.H₂O (568 мг), CuSO₄,5H₂O (1,5 г), (NH₄)₆Mo₇O₂₄,4H₂O (0,15 г) и Na₂B₄O₇,10H₂O (0,03 г). В затравочные флаконы (затравка I), содержащие среды с определенным содержанием глюкозы (рН 6,8±0,01), вносили затравку из глицериновых запасов и инкубировали в течение 8-16 ч при 37°С на ротационном шейкере 200-250 об/мин. Затем в затравочные флаконы (затравка II), содержащие среды с определенным содержанием глюкозы (рН 6,8±0,01), вносили затравку I при плотности посева 10% и инкубировали в течение 8-16 ч при 37°С на ротационном шейкере 200-250 об/мин. Затем клетками из затравки II засевали при плотности посева 5-10% биореактор, содержащий стерилизованные среды с определенным содержанием глюкозы (рН 6,8±0,01). Клетки растили при 30% растворенного кислорода при 37°С и поддерживали рН на уровне 6,8±0,01, применяя 2NHCl/5M NH₄OH. Уровни растворенного кислорода, рН и рост клеток (измеряли по оптической плотности ОП_{600 нм}) контролировали на всем протяжении ферментации. Клетки подпитывали экспоненциально и контролировали скорость подпитки, чтобы поддерживать концентрацию глюкозы и уровень растворенного кислорода в культуре, концентрированной стерилизованной подпиткой, содержащей глюкозу (700 г/л), дополненную однозамещенным фосфатом калия (47 г/л), гептагидратом сульфата магния (20 г/л), тиамином (0,4 г/л) и раствором металлических микроэлементов (20 мл/л). Ферментации останавливали, когда ОП₆₀₀ достигала 135-200 (обычно 140). Супернатант (содержащий гепаросан) собирали при 4°С путем центрифугирования. Процесс очистки гепаросана из культурального супернатанта включал отбеливание 1,2% (по массе) гипохлоритом натрия и преципитацию сульфатом аммония, обычно при 60% насыщении. Полученный преципитат растворяли в воде и диализовали с получением гепаросана (Bhaskar, U. Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a Safer Bioengineered Alternative. докторская диссертация, Ренсселеровский политехнический институт, Трой, Нью-Йорк, США (2014)).

Пример 2. Получение интермедиата № 1 (NS).

Гепаросан, полученный в примере 1, химически N-деацетилировали и деполимеризовали, как описано ранее (Z. Wang, J. Li, S. Cheong, U. Bhaskar, A. Onishi, F. Zhang, J.S. Dordick, R.J. Linhardt (2011), Response surface optimization of the heparosan N-deacetylation in producing bioengineered heparin, Journal of Biotechnology, 156, 188-196). Гепаросан при концентрации 1% приводили во взаимодействие с 1 М гидроксидом натрия при 50-55°С в течение 18-28 ч. Затем рН реакционной смеси подводили до 7 с помощью HCl, а затем осуществляли химическое N-сульфонирование в течение 48 ч с помощью избыточного количества комплекса триоксида серы-триметиламина. Затем использовали преципитацию этанолом, чтобы фракционировать первый интермедиат NS с желательными характеристиками молекулярных масс (A. Onishi (2015), Detailed physicochemical and biological analyses of heparins from various sources, докторская диссертация, Ренсселеровский политехнический институт, Трой, Нью-Йорк, США). Содержание дисахаридных групп в первом интермедиате NS составляло от 78,3 до 99,3 мол. %. Молекулярная масса составляла от 15100 до 18100 Да, процент полисахаридных цепей в гепарине с молекулярной массой более 24000 составлял от 7,0 до 17,4; процент цепей с молекулярными массами в диапазоне от 16000 до 24000 Да составлял от 1,1 до 2,3.

Пример 3. Анализ дисахаридов, анализ молекулярных масс и анализ активности.

Общий анализ дисахаридов.

Анализ дисахаридов применяли для измерения дисахаридного состава свиного гепарина USP или биоинженерных интермедиатов гепарина. Образец расщепляли на восемь составляющих дисахаридов путем обработки гепариназой I, II и III. Полученные дисахариды затем разделяли и измеряли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления-спектрометрии в ультрафиолетовой области (ЖХВД-УФ). Для NS (первого интермедиата) также можно применять ¹H-спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР), чтобы определить количество двух составляющих дисахаридов (т.е., OS и NS). Хотя дисахаридные составы согласно настоящему изобретению описаны в виде мол. %, в данной области хорошо известно, что их также можно описать в виде % площади под кривой (%AUC), в виде % по массе или с помощью другой известной терминологии в рамках объема настоящего изобретения.

Следует отметить, что в настоящем изобретении %AUC дисахарида равен мол. % дисахарида с допущением, что у всех восьми дисахаридов одинаковый коэффициент молярной экстинкции на 232 нм, при этом данное допущение считают справедливым по нескольким причинам. Во-первых, хорошо известно, что в структуре каждого из восьми дисахаридов содержится ровно одна Δ-4-5 ненасыщенная уроновая кислота (ΔUA). Во-вторых, в недавней статье по анализу дисахаридов гепарина указано, что количественный анализ дисахаридов основывается на результатах, полученных на основе общей договоренности, что коэффициент молярной экстинкции на 232 нм для Δ-4-5 ненасыщенных олигосахаридов постоянен (P. Mourier и др. Quantitative compositional analysis of heparin using exhaustive heparinase digestion and strong anion exchange chromatography. Anal. Chem. Res. 3, 46-53 (2015)). В-третьих, наблюдается соответствие коэффициентов молярной экстинкции на 232 нм для пяти различных полученных из гепарина олигосахаридов (5063 +/- 10%, 5331 +/- 0,6%, 5066 +/- 3,7%, 5657 +/- 1,4% и 5275 +/- %, М^-1 см^-1) (K.G. Rice и R.J. Linhardt. Study of structurally defined oligosaccharide substrates of heparin and heparan monosulfate lyases. Carbohydr. Res. 190, 219-233 (1989)). Наконец, почти идентичное допущение фактически используют в современном свином гепарине USP: в аналитическом способе для свиного гепарина USP допускают, что у всех таких восьми дисахаридов одинаковые коэффициенты молярной экстинкции на очень близкой длине волны 234 нм (химические испытания USP40, <207> испытание для 1,6-ангидро-производного эноксапарина натрия, стр. 261-266 (Фармакопейная конвенция Соединенных Штатов, Роквилл, Мэриленд, США, 2017)). При ¹H-ЯМР, относительный % AU эквивалентен мол. %.

Анализ интермедиатов с помощью 1Н-ЯМР

1D ¹H-ЯМР осуществляли при следующих условиях: температура 298 К, время ожидания восстановления по меньшей мере 2 с, время сбора данных по меньшей мере 0,75 с, количество накоплений сигнала по меньшей мере 16, растворитель D2O. 1D ¹H-ЯМР спектры очищенного гепаросана, каждого интермедиата, биосинтетического гепарина и свиного гепарина USP показаны на фигуре 3. После четырех этапов химико-ферментативных модификаций от предшественника гепаросана к конечному продукту, полученный биосинтетический гепарин обладал очень сходной химической структурой по сравнению со свиным гепарином USP.

В отношении анализа дисахаридов первого интермедиата с помощью 1Н-ЯМР, площадь пика протона Н-1 остатка глюкозамина использовали для количественного анализа. Протон Н-1 N-ацетилглюкозамина (дисахарид 0S) появился приблизительно на уровне 5,31 м.д., тогда как протон Н-1 N-сульфоглюкозамина (дисахарид NS) появился приблизительно на уровне 5,55 м.д. Дисахаридный состав выражали в виде мол. %; % AUC эквивалентен мол. %.

Анализ дисахаридов с помощью ЖХВД-УФ.

Вкратце, аналитический образец расщепляли гепариназами, а затем полученные дисахариды разделяли и измеряли с помощью сильной анионообменной (САО)-ЖХВД-УФ.

Обычные аналитические условия описаны далее; следует отметить, что можно использовать несущественную(-ые) неболыную(-ые) модификацию(-и), которая(-ые) не влияет(-ют) на дисахаридный состав, такую(-ие) как линейное уменьшение/увеличение масштаба реакции расщепления гепариназами, изменение температуры колонки САО до 50°С.

Аналитический образец (100 мкг) смешивали с концентрированным буфером для расщепления (конечная концентрация составляла 50 мМ NH₄OAc, 2 мМ CaCl₂), гепариназами I, II и III из Flavobacterium heparinum (>100 мМЕ каждой гепариназы, полученной в нашей лаборатории, как описано в Zhang, F., и др. Structural characterization of heparins from different commercial sources. Anal. Bioanal. Chem. 401, 2793-2803 (2011)., Zhang Z, X.J., Liu H, Liu J, Linhardt RJ. Quantification of Heparan Sulfate Disaccharides Using Ion-Pairing Reversed-Phase Microflow High-Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization Trap Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 4349-4355 (2009)) и водой, чтобы общий объем составил 200 мкл. Смесь инкубировали на 35°С в течение 2 ч. После инкубации полученные дисахариды отделяли от гепариназ с помощью либо (а) ультрафильтрации с помощью центрифужной колонки с отсечкой по молекулярной массе 3 кДа (центрифужный фильтрующий блок Ultra-0,5 Amicon с мембраной Ultracel-3, EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс, США), либо (b) инкубации при 95°С в течение по меньшей мере 5 мин, а затем центрифугирования. В исследовании прямым сравнением с применением второго интермедиата NS2S, третьего интермедиата NS2S6S и гепарина USP показали, что различие между (а) и (b) составляло не более 2,6% по массе.

20 мкл полученного дисахарида вводили в хроматографическую колонку САО (хроматографическая колонка Spherisorb-SAX, 4,0× 250 мм, 5 мкм, Waters, Франция). Температура колонки составляла 40°С. Подвижная фаза А представляла собой 1,8 мМ NaH2PO4 с рН, подведенным до 3,0 с помощью фосфорной кислоты, и подвижная фаза В представляла собой 1,8 мМ NaH2PO4 с рН, подведенным до 3,0 с помощью 1 М NaClO4. Линейный градиент подвижной фазы В (0 мин, 3% В; 20 мин, 35% В; 50 мин, 100% В; 60 мин, 3% В, 80 мин, 3% В) наносили при скорости потока 0,45 мл/мин. Детектирование УФ проводили на 232 нм, так как ненасыщенная уроновая кислота (MJA) каждого дисахарида поглощала УФ при данной длине волны. Стандарты дисахаридов приобретали у Iduron (Манчестер, Великобритания), чтобы определить пики, относящиеся к каждому дисахариду, на 232 нм. Для того чтобы убедиться в достоверности и точности анализа, активный фармацевтический ингредиент промышленный гепарин натрия (Celsus, Цинциннати, Огайо, США) также расщепляли и анализировали в каждом анализе. Для того чтобы убедиться в линейности площади пика ЖХВД, серии разведений стандартов дисахарида анализировали в каждом анализе.

Дисахаридный состав выражали в виде % по массе и/или мол. %. Значения % по массе рассчитывали на основе стандартных кривых с помощью ряда коммерчески доступных стандартов. Значения мол. % рассчитывали по следующей формуле:

Мол. % дисахарида i=(100×Ai)/(ΣxAx),

где Ai представляет собой площадь пика дисахарида i на 232 нм. Ax представляет собой площадь пика; указанная сумма относится ко всем восьми дисахаридам, которые встречаются в определениях в настоящем описании. Опять же, в настоящем изобретении % AUC дисахарида равен мол. % дисахарида с допущением, что у всех 8 дисахаридов одинаковые коэффициенты молярной экстинкции на 232 нм.

Анализ дисахаридов с помощью ЖХВД-МС

Данный анализ осуществляли, как описано в публикации (Bhaskar, U. Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a Safer Bioengineered Alternative, докторская диссертация, Ренсселеровский политехнический институт, Трой, Нью-Йорк (2014).

Подробно, 10 мкг аналитического образца в 25 мкл воды смешивали с гепариназами I, II и III из Flavobacterium heparinum (>10 мМЕ каждой гепариназы) в 5 мкл концентрированного буфера (25 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, рН 7,4). Смесь инкубировали при 35°С в течение 10 ч. После инкубации полученные дисахариды выделяли путем центробежной фильтрации на центрифужной колонке с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа (микроконцентратор YM-10, EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс, США). Полученный элюат растворяли в воде до концентрации 50-100 нг/2 мкл для анализа с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ)-масс-спектрометрии (МС).

Анализ ЖХ/МС проводили на устройстве 1200 LC/MSD Agilent (Agilent Technologies, Inc. Уилмингтон, Делавэр, США), оборудованном ионной ловушкой 6300 и бинарным насосом, за которым находится УФ-детектор. Использовали колонку Poroshell 120 С18 (2,1×100 мм, 2,7 мкм, Agilent, США). Элюент А представлял собой воду/ацетонитрил (85:15 в объемном отношении), и элюент В представлял собой воду/ацетонитрил (35:65 в объемном отношении). Оба элюента содержали 12 мМ трибутиламин и 38 мМ ацетат аммония с рН, подведенным до 6,5 с помощью уксусной кислоты. Использовали градиент раствора А в течение 5 мин, а затем линейный градиент с 5 до 15 мин (0-40% раствор В) при скорости потока 150 мкл/мин.

Определение молекулярной массы и концентрации.

Молекулярные массы определяли с помощью гель-проникающей хроматографии (ГПХ), в соответствии со способом в монографии USP 37 для гепарина с несущественными небольшими модификациями. Предохранительную колонку TSK SWXL 6 мм × 4 см, диаметр 7 мкм использовали последовательно с двумя аналитическими колонками: TSK G4000 SWXL 7,8 мм × 30 см, 8 мкм, последовательно с TSK G3000 SWXL 7,8 мм × 30 см, 5 мкм (Tosoh Corporation, Minato-Ku, Токио, Япония). Данные колонки были подсоединены к системе ЖХВД, состоящей из насоса Shimadzu LC-20AD, контроллера Shimadzu СВМ-20А, автодозатора Shimadzu SIL-20AHT, термостата колонок Shimadzu СТО-20АС и рефрактометрического детектора Shimadzu RID-20A (Shimadzu, Киото, Япония). Температуру колонок и детектора RID поддерживали на 30°С. Подвижная фаза представляла собой 0,1 М ацетат аммония с 0,02% по массе азида натрия и скорость потока составляла 0,6 мл/мин. Объем вводимого образца составлял 20 мкл. Хроматограммы ГПХ регистрировали с помощью программного обеспечения LC solution версии 5.73 (Shimadzu, Киото, Япония) и анализировали с помощью функции «GPC Postrun». Для определения молекулярной массы в качестве калибрующего вещества использовали USP Heparin Sodium Molecular Weight Calibrant RS (эталонный стандарт) и USP Heparin Sodium Identification RS (USP, Мэриленд, США) использовали для подтверждения пригодности системы. Также вводили USP Heparin Sodium Identification RS, приготовленный в виде нескольких концентраций, для получения стандартной кривой для вычисления концентрации реакционных образцов с применением площади под кривой (AUC). Все результаты удовлетворили требованиям пригодности системы, установленным в монографии USP. Для расчета применяли полиномиальное уравнение третьего порядка. Определения параметров молекулярной массы приведены ниже.

Среднемассовую молекулярную массу (MW) рассчитывали с помощью:

где Ni представляет собой количество молекул с молекулярной массой Mi. М24000 представляет собой процент цепей гепарина с молекулярной массой более 24000 Да. М8000-16000/М16000-24000 представляет собой отношение процента гепарина с молекулярной массой в диапазоне 8000-16000 Да к проценту гепарина с молекулярной массой в диапазоне 16000-24000 Да.

Измерение антикоагулянтной активности in vitro.

Активности гепаринов против Ха и против IIa определяли, применяя наборы BIOPHEN для гепарина против Ха (двухстадийный) и против IIa (двухстадийный) (Aniara, Вест Честер, Огайо). Антитело человека АТIII, 40 мЕд в 80 мкл буфера R1 (Трис 0,05 М, NaCl 0,175 М, ЭДТА 0,0075 М при рН 8,40, содержащего 0,1% по массе полиэтиленгликоля и 0,02% по массе азида натрия в качестве консерванта), использовали для анализа активности против Ха. Антитело человека ATIII, 10 мЕд в 80 мкл буфера R2 (Трис 0,05 М, NaCl 0,175 М, ЭДТА 0,0075 М при рН 8,40, содержащего 0,2% по массе бычьего сывороточного альбумина и 0,02% по массе азида натрия в качестве консерванта), смешанное с различными массами гепарина (в диапазоне 0, 5, 10, 15 и 20 нг) инкубировали в течение 2 мин при 37°С. Затем добавляли очищенный бычий фактор Ха (320 нг в 40 мкл буфера R1) или очищенный тромбин человека (960 мЕд в 40 мкл буфера R2), предварительно инкубированный при 37°С, и инкубировали в течение 2 мин перед добавлением хромогенного субстрата, специфичного к фактору Ха (CS-01(65), 1,2 мМ, 40 мкл) или хромогенного субстрата, специфичного к тромбину (CS-01(38), 1,25 мМ, 40 мкл). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 мин для анализа против Ха и в течение 1 мин для анализа против IIa, а затем останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты (20 мг/мл, 80 мкл). Поглощение измеряли на 405 нм. Активности против Ха и против IIa рассчитывали, используя стандартную кривую различных концентраций гепарина (0-1 Ед/мл).

Пример 4. Получение ферментов (С5-эпимеразы, 2-ОСТ, 6-ОСТ-1, 6-ОСТ-3, 3-ОСТ-1, ACT-IV).

Осадок клеток (10 г сырой массы) с мечеными MBP ферментами (С5-эпи, 2-ОСТ, 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3) диспергировали в 50 мл буфера для очистки (25 мМ Трис-HCl (BioRad, США), 500 мМ NaCl (Sigma, США), рН 7,5), содержащего ингибитор протеаз (Sigma, США) и 8000 кЕд/л ДНКазы I (Sigma, США). Полученную суспензию клеток пропускали через микрофлюидайзер (Microfluidics LM20, США) при 15000 фунтах/кв. дюйм для лизиса клеток. Обломки клеток удаляли путем центрифугирования при 13000 g в течение 30 мин при 4°С. Растворимый фермент очищали, используя 10 мл амилозной смолы (NEB, США), следуя инструкциям производителя.

Осадок клеток (10 г сырой массы) с мечеными His6 ферментами (3-ОСТ-1 и ACT-IV) диспергировали в 50 мл буфера для очистки (25 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, рН 7,5), содержащего ингибитор протеаз и 8000 кЕд/л ДНКазы I. Лизис клеток проводили, как описано ранее, и растворимый фермент очищали, применяя 10 мл Ni-NTA сефарозы (GE Healthcare, Швеция), следуя протоколу производителя. Очищенные ферменты анализировали с помощью электрофореза в ПААГ/ДСН (BioRad, США).

Пример 5. Получение и определение активности иммобилизованных ферментативных катализаторов.

Меченые His6 ферменты (3-ОСТ-1 и ACT-IV) элюировали буфером 25 мМ Трис-HCl (рН 7,5), содержащим 500 мМ NaCl и 500 мМ имидазол, с гранул Ni-NTA сефарозы и меченые MBP ферменты (С5-эпи, 2-ОСТ, 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3) элюировали с амилозной смолы буфером 25 мМ Трис-HCl (рН 7,5), содержащим 500 мМ NaCl и 40 мМ мальтозу. Буфер элюированных ферментов заменяли на буфер для связывания (натрий-фосфатный буфер (Alfa Aesar, США), 100 мМ; NaCl, 150 мМ; рН 7,5), применяя 10 кДа центрифужный фильтр (Millipore, США). Для ковалентной иммобилизации ферментов 30-40 мг коммерчески доступных гранул, например, CNBr-сефарозу (GE Healthcare, Швеция), Ultralink Biosupport на основе азлактона (ThermoFisher, США) и NHS-агарозу (Thermo Fisher, США), инкубировали с 1-2 мг ферментов отдельно в течение 1 ч при комнатной температуре при плавном переворачивании (следуя инструкциям производителя). После ковалентной иммобилизации соответствующие гранулы промывали буфером для связывания и оставшиеся на гранулах функциональные группы блокировали, применяя блокирующий буфер (100 мМ Трис-HCl и 1 М NaCl при рН 8,0) (следуя инструкциям производителя). Эффективность связывания ферментов с соответствующими гранулами рассчитывали путем измерения исходно добавленного фермента и не связавшегося фермента в супернатанте, промывочном и блокирующем растворе. Количество фермента рассчитывали, применяя анализ методом ЭФ в ПААГ/ДСН, с помощью программного обеспечения ImageLab (BioRad, США) и анализа ВСА (Thermo Fisher, США). Бычий сывороточный альбумин (БСА) (ThermoFisher, США) использовали в качестве стандарта для расчетов эффективности связывания.

Пример 6. Получение интермедиата № 2 (NS2S).

Данный этап сульфатирования можно осуществить с системой рециркуляции ФАФС, включающей ПНФС, ФАФС и иммобилизованную ACT-IV, или без нее. Первый интермедиат NS обрабатывали иммобилизованными 2-ОСТ и С5-эпи. Условия ферментативных реакций подробно описаны далее: реакционный буфер MES (50 мМ, рН 7,2), 1 мг/мл NS, 0,25 мг/мл С5-эпи, 0,5 мг/мл 2-ОСТ, 10 мМ пара-нитрофенилсульфат (ПНФС) и 1 мМ ПАФ (только если использовали систему рециркуляции), температура реакции 37°С и время проведения реакции 24 ч. Для реакций без системы рециркуляции использовали такие же условия, как описанные выше, за исключением того, что в отсутствие ПАФ, ПНФС и ACT-IV 1,2 мМ избыток концентрации ФАФС зависел от скорости превращения мишени NS2S. Перед проведением реакции получали свежие ферменты и иммобилизовали их, как описано в примерах 4 и 5. Для очистки применяли ультрафильтрацию через мембрану 5 кДа MWCO, чтобы удалить оставшиеся после реакции соединения, такие как ПАФ и ФАФС (плюс ПНФ и ПНФС, если использовали систему рециркуляции). Ретентаты концентрировали и собирали для анализа дисахаридов. Данный этап можно было повторить, если % NS2S не достиг целевого значения.

Пример 7. Получение интермедиата № 3 (NS2S6S и NS6S).

Этап реакции для получения интермедиата № 3 соответствовал способу, применяемому для интермедиата № 2, за исключением того, что NS заменили на NS2S и иммобилизованными 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3 (оба при концентрации 0,5 мг/мл) заменили С5-эпи и 2-ОСТ. Данную реакцию можно было повторить, если % NS2S6S (TriS) не достиг целевого значения.

Пример 8. Получение биосинтетического гепарина.

Иммобилизованный рекомбинантный фермент 3-ОСТ-1 получали с помощью такого же способа, который упомянут в примере 5. Реакции вели при таких же условиях, которые использовали для второго и третьего интермедиатов, за исключением того, что ферменты заменяли на иммобилизованную 3-ОСТ-1. Конечный биосинтетический гепарин очищали, применяя сильную анионообменную (САО) хроматографию со смолой сефарозой Q. Вкратце, биосинтетический гепарин связывали со смолой в растворе 40 мМ NaCl с последующей промывкой раствором 400 мМ NaCl. Очищенный биосинтетический гепарин элюировали, применяя раствор 4 М NaCl, с последующим обессоливанием и концентрированием. Очищенный биосинтетический гепарин собирали для дальнейшего анализа компонентного состава дисахаридов, анализа молекулярных масс и анализов антикоагулянтной активности in vitro, описанных в примере 3. Данный этап можно было повторить, если антикоагулянтная активность не достигла требуемой USP.

Пример 9. Точные способы синтеза двух биосинтетических гепаринов (БСГ) с активностью и характеристиками молекулярных масс, которые удовлетворяют установленным требованиям для свиного гепарина USP, и двух биосинтетических гепаринов (БСГ), которые не удовлетворяют установленным для свиного гепарина USP требованиям относительно активности и молекулярной массы.

Получение партии h биосинтетического гепарина.

Всего 40 мг NS (содержание NS 85,4%) обрабатывали с 2-ОСТ и С5-эпи при условиях, описанных в примере 6. Условия реакции описаны далее: реакционный буфер MES (50 мМ, рН 7,2), 1 мг/мл NS, 0,25 мг/мл С5-эпи, 0,5 мг/мл 2-ОСТ и 1,45 мМ ФАФС. Реакционную смесь инкубировали на роликовой мешалке при 37°С в течение 24 ч. Гранулы с ферментом удаляли из раствора и промывали 3 объемами колонки (ОК) 50 мМ буфера MES (рН 7,2), чтобы выделить полисахарид. Реакционный раствор и 3 ОК буфера для промывки объединяли и загружали на центрифужную колонку с мембраной MWCO 5 кДа для концентрирования и удаления оставшихся после реакции соединений. Ретентат собирали и брали образец на анализ дисахаридов, упомянутый в примере 3. Дисахаридный состав полученного интермедиата NS2S показан в таблице 3.

На втором ферментативном этапе 3 мг полученного интермедиата NS2S с 60% содержанием NS2S обрабатывали иммобилизованными 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3 с получением интермедиата NS2S6S. Способ иммобилизации был таким же, как упомянутый в примере 5. Условия реакции сульфатирования были такими же, как упомянутые в примере 7. После завершения реакции полисахарид выделяли, очищали и анализировали, как упомянуто выше для получения NS2S. Дисахаридный состав данного интермедиата NS2S6S после 1^ой обработки ферментами 6-ОСТ был таким, как показано в таблице 3. Для того чтобы увеличить % TriS до более 40%, обработку ферментами 6-ОСТ снова повторяли, применяя такой же способ. Полученный интермедиат NS2S6S после 2ой обработки содержал 43,5% дисахарида NS2S6S и 10,5% дисахарида NS6S.

Данный интермедиат NS2S6S после 2^ой обработки ферментами 6-ОСТ (85,4-60,0-43,5) дополнительно обрабатывали иммобилизованными 3-ОСТ-1 с получением партии h биосинтетического гепарина. Иммобилизацию 3-ОСТ-1 осуществляли, как описано в примере 5. Условия реакции сульфатирования и способы очистки партии h биосинтетического гепарина были такими же, как описано в примере 8, затем проводили анализы молекулярных масс, определение дисахаридов и активностей in vitro, упомянутые в примере 3. Партия h биосинтетического гепарина после 1^ой обработки 3-ОСТ-1 достигла активности против IIa, равной лишь 160 ед/мг, что ниже, чем требуемые для свиного гепарина USP 180 ед/мг (таблица 3). Таким образом, данный интермедиат обрабатывали снова 3-ОСТ-1 с последующим применением такой же очистки и анализа, как описано выше. В партии h биосинтетического гепарина после 2^ой обработки 3-ОСТ-1 наблюдали активность против IIa, равную 396 ед/мг, активность против Ха, равную 365 ед/мг, и активность против Ха/против IIa, равную 0,92, среднемассовая молекулярная масса составляла 17500 Да, процент фракций с Mw выше 24000 составлял 16,8 и каждое из отношений между фракциями с Mw от 8000 до 16000 и с Mw от 16000 до 24000 составляло 1,3. Как антикоагулянтная активность, так и характеристики молекулярных масс партии h биосинтетического гепарина находились в рамках требований, установленных для свиного гепарина USP.

Получение партии w биосинтетического гепарина

Всего 25 мг NS (содержание NS 92,7%) обрабатывали 2-ОСТ и С5-эпи при условиях, описанных в примере 6. Вкратце, условия реакции описаны далее: 1 мг/мл (2,23 мМ) NS, 0,25 мг/мл С5-ЭПИ, 0,5 мг/мл 2-ОСТ, 0,5 мг/мл ACT-IV, 10 мМ ПНФС и 1,61 мМ ФАФС в 50 мМ буфере MES (рН 7,2). Реакционную смесь инкубировали на роликовой мешалке при 37°С в течение 24 ч. Гранулы с ферментом удаляли из раствора и промывали 3 объемами колонки (ОК), применяя 50 мМ буфер MES (рН 7,2), чтобы выделить весь полисахарид. Реакционный раствор и 3 ОК буфера для промывки объединяли и загружали на центрифужную колонку с мембраной MWCO 5 кДа для концентрирования и удаления оставшихся после реакции соединений. Ретентат собирали и брали образец на анализ дисахаридов, упомянутый в примере 3. Дисахаридный состав полученного интермедиата NS2S показан в таблице 4. Данный субстрат после 1^ой обработки 2-ОСТ/С5-эпи достиг только % NS2S, равного 68,9%. Таким образом, реакцию 2-ОСТ-1/С5 повторяли дважды, чтобы повысить % NS2S до 75%, применяя такой же способ (таблица 4).

Всего 3 мг полученного интермедиата NS2S с 75,4% дисахаридных групп NS2S дополнительно обрабатывали иммобилизованными 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3 с получением интермедиата NS2S6S. Способ иммобилизации был таким же, как упомянутый в примере 5. Условия реакции сульфатирования были такими же, как упомянутые в примере 7 с системой рециркуляции ФАФС. После завершения реакции полисахарид выделяли, очищали и анализировали, как упомянуто выше для этапа получения NS2S. Дисахаридный состав данного интермедиата NS2S6S после обработки 6-ОСТ-1 и 3 показан в таблице 4, и данный интермедиат содержал 54,5% дисахарида NS2S6S (TriS) и 14,3% дисахарида NS6S.

Данный интермедиат NS2S6S дополнительно обрабатывали иммобилизованными 3-ОСТ-1 с получением партии w биосинтетического гепарина. Иммобилизация 3-ОСТ-1 была такой же, как упомянутая в примере 5. Условия реакции сульфатирования и способы очистки партии w биосинтетического гепарина были такими же, как в примере 8 с системой рециркуляции ФАФС, а затем проводили анализы молекулярных масс, определения дисахаридов и активностей in vitro, упомянутые в примере 3. В партии w биосинтетического гепарина после обработки 3-ОСТ-1 добились активности против IIa, равной 343 ед/мг, активности против Ха, равной 393 ед/мг, и активности против Ха/против IIa, равной 1,10, среднемассовая молекулярная масса составляла 15500 Да, процент фракций с молекулярной массой выше 24000 составлял 6,6 и отношение между фракциями с Mw от 8000 до 16000 и с Mw от 16000 до 24000 составляло 1,7. Как антикоагулянтная активность, так и Mw партии w биосинтетического гепарина находились в рамках требований, установленных для свиного гепарина USP.

В некоторых случаях партий биосинтетического гепарина, однократные ферментативные обработки второго и третьего интермедиатов, соответственно, удовлетворяют требованиям, установленным для свиного гепарина USP.

Получение партии 1 биосинтетического гепарина, которая не удовлетворят требованиям к активности и молекулярной массе, установленным для свиного гепарина USP.

Всего 140 мг NS (содержание NS 92,7%) обрабатывали с 2-ОСТ-1 и С5-эпи при условиях, упомянутых в примере 6. Вкратце, условия реакции описаны далее: 1 мг/мл (2,23 мМ) NS, 0,25 мг/мл С5-эпи, 0,5 мг/мл 2-ОСТ и 2 мМ ФАФС в 50 мМ буфере MES (рН 7,2). Реакционную смесь инкубировали на роликовой мешалке при 37°С в течение 24 ч. Гранулы с ферментом удаляли из раствора и промывали 3 объемами колонки (ОК), применяя 50 мМ буфер MES (рН 7,2), чтобы выделить весь субстрат. Реакционный раствор и 3 ОК буфера для промывки объединяли и загружали на центрифужную колонку с мембраной MWCO 5 кДа для концентрирования и удаления оставшихся после реакции соединений. Ретентат собирали и брали образец на анализ дисахаридов, упомянутый в примере 3. Второй интермедиат NS2S достиг 72,4% дисахарида NS2S согласно анализу дисахаридов (таблица 5).

Всего 10 мг полученного интермедиата NS2S с содержанием дисахарида NS2S 72,4% дополнительно обрабатывали иммобилизованными 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3 с получением интермедиата NS2S6S. Способ иммобилизации был таким же, как упомянутый в примере 5. Условия реакции сульфатирования были такими же, как упомянутые в примере 7. После завершения реакции полисахарид выделяли, очищали и анализировали, как упомянуто выше на этапе сульфатирования NS2S. Дисахаридный состав данного интермедиата NS2S6S после обработки 6-ОСТ-1 и 3 показан в таблице 5 и представлял собой 41,0% дисахарида NS2S6S (TriS) и 3,7% дисахарида NS6S.

Данный интермедиат NS2S6S дополнительно обрабатывали иммобилизованной 3-ОСТ-1. Иммобилизация 3-ОСТ-1 была такой же, как упомянутая в примере 5. Условия реакции сульфатирования и способ очистки были такими же, как в примере 8, затем проводили анализы среднемассовой молекулярной массы, дисахаридного состава и активности in vitro, упомянутые в примере 3. Данная партия после обработки 3-ОСТ-1 достигла активности против IIa, равной лишь 112 ед/мг, активности против Ха, равной 93 ед/мг, и активности против Ха/против IIa, равной 0,80. Для того чтобы повысить активность против IIa, чтобы удовлетворить требованиям USP, данную неэквивалентную партию 1 снова обрабатывали иммобилизованной 3-ОСТ-1, применяя такой же способ, который упомянут в примере 8. Тем не менее, активность против IIa все еще оставалась низкой (114 ед/мг) и не достигла необходимых 180 ед/мг по требованиям, установленным для свиного гепарина USP.

Получение партии 2 биосинтетического гепарина, которая не удовлетворят требованиям к активности и молекулярной массе, установленным для свиного гепарина USP

Всего 40 мг NS (содержание NS 92,7%) обрабатывали 2-ОСТ и С5-эпи при условиях, упомянутых в примере 6. Вкратце, условия реакции описаны далее: 1 мг/мл (2,23 мМ) NS, 0,25 мг/мл С5-эпи, 0,5 мг/мл 2-ОСТ и 2 мМ ФАФС в 50 мМ буфере MES (рН 7,2). Реакционную смесь инкубировали на роликовой мешалке при 37°С в течение 24 ч. Гранулы с ферментом удаляли из раствора и промывали 3 объемами колонки (ОК), применяя 50 мМ буфер MES (рН 7,2), чтобы выделить весь полисахарид. Реакционный раствор и 3 ОК буфера для промывки объединяли и загружали на центрифужную колонку с мембраной MWCO 5 кДа для концентрирования и удаления оставшихся после реакции соединений. Ретентат собирали и брали образец на анализ дисахаридов, упомянутый в примере 3. Второй интермедиат NS2S достиг содержания дисахарида NS2S 81,4% согласно анализу дисахаридов (таблица 6).

Всего 3 мг полученного интермедиата NS2S с содержанием дисахарида NS2S 81,4% дополнительно обрабатывали иммобилизованными 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3 с получением интермедиата NS2S6S. Способ иммобилизации был таким же, как упомянутый в примере 5. Условия реакции сульфатирования были такими же, как упомянутые в примере 7. После завершения реакции полисахарид выделяли, очищали и анализировали, как упомянуто выше на этапе сульфатирования NS2S. Дисахаридный состав данного интермедиата NS2S6S после обработки 6-ОСТ-1 и 3 показан в таблице 6 и представлял собой 61,0% дисахарида NS2S6S (TriS) и 2,5% дисахарида NS6S.

Данный интермедиат NS2S6S дополнительно обрабатывали иммобилизованной 3-ОСТ-1. Иммобилизация 3-ОСТ-1 была такой же, как упомянутая в примере 5. Условия реакции сульфатирования и способ очистки были такими же, как в примере 8, а затем проводили анализы среднемассовой молекулярной массы, содержания дисахаридов и активностей in vitro, упомянутые в примере 3. Данная партия после обработки 3-ОСТ-1 достигла активности против IIa, равной лишь 49 ед/мг, которая была далека от требуемых USP 180 ед/мг. Подтвердили, что данная неэквивалентная партия 2 была неэквивалентна свиному гепарину USP.

ПОЛУЧЕНИЕ БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕПАРИНА ЧЕРЕЗ ПОЛУЧЕНИЕ ТРЕХ ИНТЕРМЕДИАТОВ

Краткое описание

Ниже описано множество партий биосинтетического гепарина, которые удовлетворили требованиям USP относительно биологической активности и, когда ее измеряли, молекулярной массы. У биосинтетического гепарина также выявили содержание дисахарида, эквивалентное свиному гепарину USP. Данные эксперименты проводили последовательно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса, чтобы количественно установить степень и природу сульфатирования.

Для получения биосинтетического гепарина требуется, чтобы интермедиаты, полученные на каждом этапе процесса, имели определенное содержание дисахаридов. Ниже представлены конкретные сведения относительно: (а) содержания дисахаридных групп NS (все содержания указаны в виде % от общего дисахаридного состава) в первом интермедиате NS; (b) содержания дисахаридных групп NS2S и NS во втором интермедиате NS2S; и (с) содержания дисахаридных групп NS2S6S, NS6S, NS2S и NS в третьем интермедиате NS2S6S/TriS при синтезе биоэквивалентного гепарина. У первого интермедиата NS были подходящие среднемассовая молекулярная масса (Mw) и распределение молекулярных масс, чтобы получить второй и третий интермедиат с подходящими молекулярными массами, чтобы получить биосинтетический гепарин в рамках требований, установленных USP.

СВОДНАЯ ТАБЛИЦА ПАРТИЙ, КОТОРЫЕ УДОВЛЕТВОРЯЮТ ТРЕБОВАНИЯМ, УСТАНОВЛЕННЫМ ДЛЯ СВИНОГО ГЕПАРИНА USP

Партии s, b, c и d были описаны в предварительной заявке на патент США 62/384341. Данные по дисахаридам в таблице в данном разделе представлены в мол. %. Представленное значение мол. % можно представить в виде % по массе, который фигурирует в предварительной заявке на патент США 62/384341.

Сводные данные.

Подводя итоги, может быть важно использовать первый интермедиат NS с определенным содержанием групп NS, Mw и распределением молекулярных масс, показанными выше, чтобы успешно получить определенный второй и третий интермедиаты и, наконец, получить БСГ, который может удовлетворять критериям USP для гепарина.

Для среднего специалиста должно быть очевидно, что данные по дисахаридам можно выразить либо в мол. % (в данной заявке), либо в % по массе (который использовали в указанной предварительной заявке).

Партии биосинтетического гепарина, которые фигурировали в предварительной заявке на патент США 62/384341 и которые не удовлетворяли требованиям к активности и молекулярной массе, установленным для свиного гепарина USP.

В указанной предварительной заявке были описаны две партии, которые не удовлетворяли требованиям к активности и молекулярной массе, установленным для свиного гепарина USP. В таблицах 12 и 13 ниже кратко описаны полученные результаты. Количество дисахаридов выражено как в % по массе, так и в мол. %.

Несмотря на то что выше описаны конкретные предпочтительные варианты реализации, очевидно, что настоящее изобретение не ограничено ими. Средним специалистам в данной области известно, что можно совершить различные модификации описанных вариантов реализации и что предполагается, что такие модификации входят в объем настоящего изобретения.

Все публикации, заявки на патент и патенты, цитированные в настоящем описании, полностью включены в данную заявку посредством ссылки.

1. Гликозаминогликан для получения биосинтетического гепарина, содержащий 13-39% N-сульфатированной и 44-80% 2-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, причем указанное количество является эффективным для получения биосинтетического гепарина.

2. Гликозаминогликан по п. 1, обладающий среднемассовой молекулярной массой, подходящей для получения конечного продукта гепарина с молекулярной массой 15000-19000 Да, причем процент цепей гепарина с молекулярной массой более 24000 Да составляет не более 20% от общего количества цепей, и отношение цепей с молекулярными массами в диапазоне от 8000 до 16000 Да к проценту цепей с молекулярными массами от 16000 до 24000 Да составляет не менее 1,0.

3. Способ получения второго интермедиата гликозаминогликана, содержащего 44-80% N-сульфатированной, 2-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы и 13-39% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы; причем указанный способ включает:

a. превращение 78-99% остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого гликозаминогликана, содержащего 78-99% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы, тем самым указанное количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина соответствует количеству N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы в первом интермедиате гликозаминогликана; и

b. обработку первого интермедиата гликозаминогликана ферментом, который представляет собой C5-эпимеразу (C5-эпи) и 2-O-сульфотрансферазу (2-OСТ), в присутствии донора сульфата с получением второго интермедиата гликозаминогликана.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанное превращение включает проведение реакции гепаросана с основанием и сульфонирующим реагентом или с N-деацетилазой, N-сульфотрансферазой (N-ДСТ).

5. Способ получения третьего интермедиата гликозаминогликана, содержащего 31-73% N-сульфатированной, 2-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS2S6S) дисахаридной группы, 6-40% N-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы, 0-27% N-сульфатированной, 2-сульфатированной (NS2S) группы и 1-22% N-сульфатированной (NS) группы, где указанный способ включает:

обработку второго интермедиата гликозаминогликана, содержащего 44-80% N-сульфатированной, 2-сульфатированной (NS2S) группы и 13-39% N-сульфатированной (NS) группы, ферментом, который представляет собой изоформы 1 и 3 6-O-сульфотрансферазы (6-OСТ-1 и 6-ОСТ-3, соответственно), в присутствии донора сульфата с превращением второго интермедиата гликозаминогликана в третий интермедиат гликозаминогликана.

6. Способ по любому из пп. 3-5, отличающийся тем, что донор сульфата включает ФАФС, предпочтительно при этом ФАФС находится в растворе, причем донор сульфата включает ПАФ и ПНФС, и при этом указанную обработку осуществляют в присутствии системы рециркуляции, включающей ФАФС, ПНФС и катализатор, предпочтительно при этом катализатор представляет собой арилсульфотрансферазу IV (АСТ-IV); или указанную обработку осуществляют внутри сконструированного микробного штамма, содержащего гены, кодирующие N-ДСТ, C5-эпи, 2-OСТ, 3-OСТ-1, одну или обе 6-OСТ-1 и 6-OСТ-3 и источник ФАФС.

7. Способ по любому из пп. 3-5, отличающийся тем, что фермент находится в растворе, или иммобилизован.