Животные, отличные от человека, характеризующиеся экспансией гексануклеотидных повторов в локусе c9orf72

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к грызуну, содержащему последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72, а также к его клетке, эмбриону и двигательному нейрону. Также раскрыта иммортализованная клеточная линия, содержащая последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72. Изобретение также относится к способу получения вышеуказанного грызуна, предусматривающему модифицирование генома грызуна для содержания последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72. Изобретение эффективно для идентификации кандидатного терапевтического средства для лечения заболевания или состояния, ассоциированных с наличием последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов. 11 н. и 41 з.п. ф-лы, 12 ил., 10 табл., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/402613, поданной 30 сентября 2016 г., и предварительной заявке на патент США №62/452795, поданной 31 января 2017 г.; каждая из которых настоящим включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0002] Официальная копия перечня последовательностей отправлена одновременно с описанием в электронном виде в Ведомство по патентам и товарным знакам США как Получающего ведомства через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с названием файла «2017-09-29-10267WO01-SEQ-LIST_ST25», дата создания 29 сентября 2017 года, размер приблизительно 94 кб. Перечень последовательностей, содержащийся в данном документе в формате ASCII, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Нейродегенеративные заболевания представляют собой основные причины инвалидизации и нарушения здоровья. В частности, боковой амиотрофический склероз (ALS, также называемый болезнью Лу Герига) и лобно-височная деменция (FTD) являются редкими нарушениями нервной системы, характеризующимися прогрессирующей потерей нейронов и/или летальным исходом.

[0004] Хотя старение рассматривают как основной фактор риска возникновения нейродегенеративного заболевания, было открыто несколько генетических компонентов. Например, мутации в гене медь-/цинк-содержащей супероксиддисмутазы (SOD1) уже давно связывают с ALS. Кроме того, экспансия гексануклеотидных повторов GGGGCC в некодирующем участке гена C9ORF72 связывали как с ALS, так и с FTD. В настоящее время не существует средства излечения этих обоих заболеваний, хотя некоторые виды лечения способны продлить жизнь на приблизительно 3-5 месяцев.

[0005] В то время как различные лабораторные модели животных широко используются в разработке большинства терапевтических средств, существует незначительное количество, если вообще существует, каких-либо моделей, направленных на изучение нейродегенеративных и воспалительных заболеваний с помощью путей, которые обеспечивают выяснение точного молекулярного механизма, посредством которого идентифицированные генетические компоненты вызывают заболевание, раскрытие которого, в свою очередь, может выявить потенциальные терапевтические подходы не только в отношении ALS, но и также других нейродегенеративных заболеваний, имеющих сходную клиническую картину. Таким образом, механизм, посредством которого генетические мутации вызывают нейродегенеративное заболевание, в основном остается неизвестным. Наиболее подходящие модели животных должны содержать одинаковые генетические компоненты и моделировать сходные характеристики заболевания человека. Учитывая генетические различия между видами, существует высокая неудовлетворенная потребность в разработке улучшенных моделей животных, которые в высокой степени воспроизводят нейродегенеративное и/или воспалительное заболевание человека. Конечно такие улучшенные модели животных представляют значительную ценность в разработке эффективных терапевтических и/или профилактических средств.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В настоящем изобретении раскрыто признание факта необходимости конструирования животных, отличных от человека, или клеток животных, отличных от человека (например, эмбриональной стволовой клетки, двигательного нейрона, полученного из эмбриональной стволовой клетки, клетки головного мозга, нейронной клетки, мышечной клетки, клетки сердца), чтобы обеспечить улучшенные системы in vivo или in vitro для идентификации и разработки новых терапевтических средств и, в некоторых вариантах осуществления, схем лечения, которые можно применять для лечения нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний. В некоторых вариантах осуществления системы in vivo или in vitro, описанные в данном документе, можно применять для идентификации и разработки новых терапевтических средств для лечения заболеваний, нарушений и/или состояний, ассоциированных с локусом C9ORF72, в частности гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов в локусе, таких как, например, нейродегенеративные нарушения. Кроме того, описанные в данном документе животные, отличные от человека, или клетки животных, отличных от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), которые содержат вставку последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов в локусе C9ORF72, являются желательными, например, для применения в идентификации и разработке терапевтических средств, целенаправленно воздействующих на гексануклеотидный повтор GGGGCC (SEQ ID NO: 1), полученные из них продукты, например, транскрибированную из них смысловую или антисмысловую РНК, продукт RAN-трансляции и/или белок с дипептидными повторами, кодируемый гексануклеотидным повтором, и т.д. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе животные, отличные от человека, и клетки животных, отличных от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), соответственно, обеспечивают улучшенные in vivo и in vitro системы (или модели) нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний (например, ALS и/или FTD).

[0007] Описанные в данном документе животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме зародышевой линии гетер о логичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидов, представляет собой последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидов, не являющуюся последовательностью грызуна (например, последовательность, не являющуюся последовательностью крысы или мыши, например, человеческую последовательность), которая содержит по меньшей мере одну копию, например повтор, гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит более одного предпочтительно непрерывного повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере три предпочтительно непрерывных повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере пять предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере приблизительно десять предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере пятнадцать предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере двадцать предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере тридцать предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере сорок предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере пятьдесят предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере шестьдесят предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере семьдесят предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере восемьдесят предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере девяносто предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная (человеческая) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере сто предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в своем геноме зародышевой линии гетерологичную (человеческую) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов.

[0008] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность (например, не являющаяся последовательностью грызуна, крысы, мыши, и/или последовательность человека), характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит гетерологичные (например, не являющиеся последовательностями грызуна, крысы, мыши, и/или последовательности человека) последовательности, которые фланкируют по меньшей мере один, например, по меньшей мере приблизительно три, по меньшей мере приблизительно пять, по меньшей мере приблизительно десять, по меньшей мере приблизительно пятнадцать, по меньшей мере приблизительно двадцать, по меньшей мере приблизительно тридцать, по меньшей мере приблизительно сорок, по меньшей мере приблизительно пятьдесят, по меньшей мере приблизительно шестьдесят, по меньшей мере приблизительно семьдесят, по меньшей мере приблизительно восемьдесят, по меньшей мере приблизительно девяносто или по меньшей мере приблизительно сто предпочтительно непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. Соответственно, гетерологичная (например, не являющаяся последовательностью грызуна, крысы, мыши, и/или последовательность человека) последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, может содержать от 5' до 3': первую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, одну или более (предпочтительно непрерывных) копий гексануклеотида, изложенного под SEQ ID NO: 1, и вторую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, идентична или фактически идентична существующей в природе геномной последовательности, содержащей первую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, один или более экземпляров гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность. Каждая существующая в природе первая и/или вторая гетерологичные гексануклеотидные фланкирующие последовательности могут независимо друг от друга иметь длину, составляющую, например, по меньшей мере 4 пары оснований, например, по меньшей мере 10 пар оснований, например по меньшей мере 20 пар оснований и т.д.

[0009] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность человека, характеризующаяся экспансией гексануклеотидов, охватывает (но необязательно охватывает) все или части экзонов 1а и/или экзона 1b гена C9orf72 человека. В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит всю или часть последовательности экзона 1а гена C9orf72 человека (изложенную под SEQ ID NO: 34) и/или вторая гетерологичная гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит всю или часть последовательности экзона 1b гена C9orf72 человека (изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит изложенную под SEQ ID NO: 36 последовательность или ее часть и/или вторая гетерологичная гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит изложенную под SEQ ID NO: 37 последовательность или ее часть.

[00010] Иллюстративная последовательность человека, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, изложена под SEQ ID NO: 2 (содержащая в направлении от 5' до 3': первую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, 3 повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37). Другая иллюстративная последовательность человека, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, изложена под SEQ ID NO: 3 (содержащая в направлении от 5' до 3': первую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, 100 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37). Соответственно, в данном документе раскрыты животные, отличные от человека, например грызуны, такие как крыса или мышь, геномы которых содержат в эндогенном локусе C9orf72 последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, вариант SEQ ID NO: 2, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3, или вариант SEQ ID NO: 3.

[00011] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 2, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), один или два непрерывных повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), более одного и менее 100 непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме (зародышевой линии) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), 36 непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, которая содержит от 5' до 3': первую гексануклеотидную фланкирующую последовательность человека, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), 92 непрерывных повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35).

[00012] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), раскрытые в данном документе, являются гетерозиготными или гомозиготными по последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащей последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 2, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), один или два непрерывных повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме (зародышевой линии) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), более одного и менее 100 непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме (зародышевой линии) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), 36 непрерывных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме (зародышевой линии) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую последовательность, которая представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, которая содержит в направлении от 5' до 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36 (или ее часть, например последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34), 92 непрерывных повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37 (или ее часть, например, последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35).

[00013] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), содержат в своем геноме (зародышевой линии) замену 5'-нетранслируемых и/или некодирующих эндогенных последовательностей, отличных от человеческих, эндогенного локуса C9orf72 гетерологичной (человеческой) последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов. В некоторых вариантах осуществления нетранслируемая и/или некодирующая последовательность, расположенная между (и необязательно охватывающая по меньшей мере часть) эндогенным экзоном 1 (например, экзоном 1а и/или 1b) и стартовым кодоном ATG эндогенного локуса C9orf72, отличного от человеческого, или ее часть, заменена гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов. Дополнительные последовательности (например, последовательности для распознавания рекомбиназой, кассета устойчивости к лекарственному средству, репортерный ген и т.д.), связанные с гетерологичной (человеческой) последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидов, также могут заменять нетранслируемую и/или некодирующую последовательность, расположенную между (и необязательно охватывающую) эндогенным экзоном 1 (например, экзоном 1а и/или экзоном 1b) и стартовым кодоном ATG эндогенного локуса C9orf72, отличного от человеческого, или ее часть.

[00014] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), раскрытые в данном документе, могут содержать гетерозиготную или гомозиготную замену эндогенной последовательности, которая (1) начинается с 5'-конца, внутри или с 3'-конца эндогенного экзона 1 и (2) заканчивается на 5'-конце эндогенного стартового кодона ATG, или ее части, гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, например, последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащей по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), раскрытые в данном документе, могут содержать гетерозиготную или гомозиготную замену эндогенной последовательности, которая (i) начинается с 5'-конца, внутри или 3'-конца эндогенного экзона 1 и (ii) заканчивается на 5'-конце эндогенного стартового кодона ATG, или ее части, гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащей в направлении от 5' к 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, которая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, по меньшей мере одну копию гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую гексануклеотидную фланкирующую последовательность человека, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), раскрытые в данном документе, могут содержать гетерозиготную или гомозиготную замену эндогенной последовательности, которая (ii) начинается с 5'-конца, внутри или 3'-конца эндогенного экзона 1 и (ii) заканчивается на 5'-конце эндогенного стартового кодона ATG, или ее части, гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащей в направлении от 5' к 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, которая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, по меньшей мере одну копию гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и вторую гексануклеотидную фланкирующую последовательность человека, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), раскрытые в данном документе, могут содержать гетерозиготную или гомозиготную замену эндогенной последовательности, которая (ii) начинается с 5'-конца, внутри или 3'-конца эндогенного экзона 1 и (ii) заканчивается на 5'-конце эндогенного стартового кодона ATG, или ее части, гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, ее вариант, SEQ ID NO: 3 или ее вариант.

[00015] B некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме (зародышевой линии) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит один или более повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, демонстрируют одну или более из следующих характеристик: (i) повышенная экспрессия транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) повышенный уровень белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любую комбинацию (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме (зародышевой линии) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит три или более повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, демонстрируют одну или более из следующих характеристик: (i) повышенная экспрессия транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенное количество очагов РНК, повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) повышенный уровень белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любой комбинации (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме (зародышевой линии) гетер о логичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере тридцать повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, демонстрируют одну или более из следующих характеристик: (i) повышенная экспрессия транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенное количество очагов РНК, содержащих повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) повышенный уровень белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любую комбинацию (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме (зародышевой линии) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит девяносто или более повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, демонстрируют одну или более из следующих характеристик: (i) повышенная экспрессия транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенное количество очагов РНК, повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) повышенный уровень белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любую комбинацию (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме (зародышевой линии) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетеро логичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере девяносто два повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, проявляют все из следующих трех характеристик: (i) повышенной экспрессии транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенного количества очагов РНК, содержащих повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ и (iii) повышенного уровня белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме (зародышевой линии) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетеро логичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит более чем девяносто повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, проявляют все из следующих трех характеристик: (i) повышенной экспрессии транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенного количества очагов РНК, содержащих повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ и (iii) повышенного уровня белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере 92 повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой, проявляют все из следующих трех характеристик: (i) повышенной экспрессии транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72 по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) повышенного количества очагов РНК, содержащих повышенное количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ и (iii) повышенного уровня белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольными животным или клеткой, содержащими локус C9orf72 дикого типа, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции.

[00016] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где одна или более из следующих характеристик животного, отличного от человека, или клетки, отличной от человеческой, фактически не отличаются по сравнению с контрольными животным, отличным от человека, или клеткой, отличной от человеческой, содержащими локус C9orf72 дикого типа: (i) сравнительное количество транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) уровень белков с дипептидными повторами, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любая комбинация (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит три повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где одна или более из следующих характеристик животного, отличного от человека, или клетки, отличной от человеческой, фактически не отличаются по сравнению с контрольными животным, отличным от человека, или клеткой, отличной от человеческой, содержащими локус C9orf72 дикого типа: (i) сравнительное количество транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) уровень белков с дипептидными повторами, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любая комбинация (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, или клетка, отличная от человеческой (например, эмбриональная стволовая клетка, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетка головного мозга, нейронная клетка, мышечная клетка, клетка сердца), описанные в данном документе, содержат в своем геноме гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит тридцать повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и где одна или более из следующих характеристик животного, отличного от человека, или клетки, отличной от человеческой, фактически не отличаются по сравнению с контрольными животным, отличным от человека, или клеткой, отличной от человеческой, содержащими локус C9orf72 дикого типа: (i) сравнительное количество транскриптов смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, например, по результатам оценки с помощью количественной ПЦР, (ii) количество очагов РНК, содержащих транскрипт смысловой и/или антисмысловой РНК C9orf72, например, по результатам оценки с помощью флуоресцентно-активированной гибридизации in situ, (iii) уровень белков с дипептидными повторами, например, по результатам оценки с помощью иммунофлуоресценции или (iv) любая комбинация (i)-(iii).

[00017] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция на основе нуклеиновой кислоты (или нацеливающая конструкция, или нацеливающий вектор), описанная в данном документе.

[00018] В некоторых вариантах осуществления конструкция на основе нуклеиновой кислоты, описанная в данном документе, содержит в направлении от 5' к 3' нацеливающее 5'-плечо, отличное от человеческого, содержащее полинуклеотид, который гомологичен 5'-части локуса C9ORF72, отличного от человеческого (например, грызуна, такого как мышь или крыса), гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую по меньшей мере одну гексануклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1, первый сайт распознавания для рекомбиназы; первый промотор, функционально связанный с селектируемым маркером, второй сайт распознавания для рекомбиназы и нацеливающее 3'-плечо, отличное от человеческого, содержащее полинуклеотид, который гомологичен 3'-части локуса C9ORF72, отличного от человеческого (например, грызуна, такого как мышь или крыса). В некоторых вариантах осуществления 5'-часть локуса C9ORF72, отличного от человеческого (например, грызуна, такого как мышь или крыса) включает геномную последовательность выше экзона 1 (например, грызуна, такого как мышь или крыса) гена C9ORF72, отличного от человеческого.

[00019] В некоторых вариантах осуществления сайты распознавания для рекомбиназы включают loxP, lox511, lox2272, lox2372, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления ген рекомбиназы включают в конструкцию, например, под контролем индуцируемого промотора. Ген рекомбиназы может быть выбран из группы, состоящей из Cre, Flp (например, Flpe, Flpo) и Dre. В некоторых определенных вариантах осуществления первый и второй сайты распознавания для рекомбиназы представляют собой сайты lox (например, loxP), а ген рекомбиназы кодирует Cre-рекомбиназу.

[00020] В некоторых вариантах осуществления первый промотор выбран из группы, состоящей из протамина (Prot; например, Prot1 или Prot5), Blimp1, Blimp1 (фрагмент в 1 т.о.), Blimp1 (фрагмент в 2 т.о.), Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, hUB1, Em7 и Рах3. В некоторых определенных вариантах осуществления первый промотор представляет собой промотор hUB1 в комбинации с промотором Em7.

[00021] В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер выбран из группы, состоящей из неомицин-фосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-дезаминазы (bsr^r), ксантин/гуанин-фосфорибозилтрансферазы (gpt) и тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk). В некоторых определенных вариантах осуществления селектируемый маркер представляет собой neo^r.

[00022] В некоторых вариантах осуществления конструкция на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, которая содержит в направлении от 5' к 3': нацеливающее 5'-плечо, отличное от человеческого (мыши), первую человеческую фланкирующую гексануклеотидную последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, три повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, вторую человеческую фланкирующую гексануклеотидную последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, кассету устойчивости к лекарственному средству, фланкированную loxP (neo^r), и нацеливающее 3'-плечо, отличное от человеческого (мыши). В некоторых вариантах осуществления конструкция на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9, которая содержит в направлении от 5' к 3': нацеливающее 5'-плечо, отличное от человеческого (мыши), первую человеческую фланкирующую гексануклеотидную последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, сто повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, вторую человеческую фланкирующую гексануклеотидную последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, кассету устойчивости к лекарственному средству, фланкированную loxP (neo^r), и нацеливающее 3'-плечо, отличное от человеческого (мыши).

[00023] В некоторых вариантах осуществления предусматривается способ получения животных, отличных от человека, или клеток животных, отличных от человеческих, геном которых содержит вставку гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72, где гетеро логичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере одну, например, по меньшей мере приблизительно 3 повтора, например, по меньшей мере приблизительно 30 повторов, например, по меньшей мере приблизительно 90 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, при этом способ предусматривает (а) введение последовательности нуклеиновой кислоты, например, конструкции на основе нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе (например, конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, или конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9), в эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, таким образом, что гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, встраивается в эндогенный локус C9ORF72, причем эта нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, который гомологичен локусу C9ORF72; (b) получение генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, из (а) и необязательно (с) получение животного, отличного от человека, с применением генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, со стадии (b). В некоторых вариантах осуществления способ получения животного, отличного от человека, описанный в данном документе, дополнительно предусматривает стадию скрещивания животного, отличного от человека, полученного на стадии (с), с созданием таким образом гомозиготного по вставке животного, отличного от человека.

[00024] В некоторых вариантах осуществления предусматривается способ получения животного, отличного от человека, геном которого содержит вставку гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, которая содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в эндогенном локусе C9ORF72, при этом способ предусматривает модифицирование генома животного, отличного от человека, таким образом, что он содержит встроенную гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72, за счет чего получают указанное животное, отличное от человека.

[00025] В некоторых вариантах осуществления предусматривается животное, отличное от человека, которое может быть получено, создано из или образовано с помощью способа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, получают с применением конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8. Такое животное, отличное от человека, содержит гетерозиготную или гомозиготную замену размером приблизительно 853 п.о. в эндогенном локусе C9orf72, начиная с эндогенного экзона 1, гетерологичной нуклеотидной последовательностью, содержащей в направлении от 5' к 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, от одного до трех повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, человеческую фланкирующую гексануклеотидную последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, и кассету устойчивости к лекарственному средству, фланкированную loxP (neo^r), или после вырезания гена neo, последовательность распознавания для рекомбиназы lox. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, получают с применением конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9. Такое животное, отличное от человека, содержит гетерозиготную или гомозиготную замену размером приблизительно 853 п.о. в эндогенном локусе C9orf72, начиная с эндогенного экзона 1, гетерологичной нуклеотидной последовательностью, содержащей в направлении от 5' к 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, от одного до ста повторов (например, 36 или 92) гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, и кассету устойчивости к лекарственному средству, фланкированную loxP (neo^r), или после удаления гена neo последовательность распознавания рекомбиназы lox. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4 (8026), гетерологичную нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5 (8027), гетерологичную нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6 (8028), или гетерологичную нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7 (8029), где гетерологичная нуклеотидная последовательность необязательно замещает приблизительно 853 п.о. нетранслируемой и/или некодирующей последовательности эндогенного локуса C9orf72, который начинается в эндогенном экзоне 1. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, получают, например, путем скрещивания животного, созданного с применением конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, с животным, созданным с применением конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9. Такие животные могут содержать и (1) гетерозиготную замену размером приблизительно 853 п.о. в эндогенном локусе C9orf72, начиная с эндогенного экзона 1, гетерологичной нуклеотидной последовательностью, содержащей в направлении от 5' к 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, от одного до трех повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, и кассету устойчивости к лекарственному средству, фланкированную loxP (neo^r), или после удаления гена neo последовательность распознавания для рекомбиназы lox и (2) гетерозиготную замену размером приблизительно 853 п.о. в эндогенном локусе C9orf72, начиная с эндогенного экзона 1, гетерологичной нуклеотидной последовательностью, содержащей в направлении от 5' к 3': первую человеческую гексануклеотидную фланкирующую последовательность человека, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36, от одного до ста повторов (например, 36 или 92) гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, человеческую фланкирующую гексануклеотидную последовательность, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, и кассету устойчивости к лекарственному средству, фланкированную loxP (neo^r), или после удаления гена neo последовательность распознавания для рекомбиназы lox.

[00026] В некоторых вариантах осуществления предусматривается выделенные клетка или ткань, отличные от человеческих, от животного, отличного от человека, описанные в данном документе или полученные с помощью способа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления выделенные клетка или ткань содержат локус C9ORF72, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой нейронную клетку или клетку нейронной зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления предусматривается иммортализованная клеточная линия, которая получена из выделенной клетки животного, отличного от человека, описанного в данном документе.

[00027] В некоторых вариантах осуществления предусматривается эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, геном которой содержит локус C9ORF72, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и получена от мыши линии 129, линии C57BL или их гибрида. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши, и мышь является гибридом линий 129 и C57BL.

[00028] В данном документе также описана система на основе коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)/CRISPR-ассоциированных генов (Cas), или один или более компонентов системы CRISPR/Cas, которые можно использовать для удаления из клетки, например, эмбриональной стволовой клетки, гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов (или ее части), встроенной в эндогенный локус C9ORF72, описанный в данном документе. Такие компоненты включают, например, белки Cas и/или направляющие РНК (gRNA), причем gRNA может включать две отдельные молекулы РНК; например, РНК-нацеливатель (например, РНК CRISPR (crRNA) и РНК-активатор (например, tracrRNA) или одиночная направляющая РНК (например, одномолекулярная gRNA (sgRNA)).

[00029] Системы CRISPR/Cas включают транс крипты и другие элементы, вовлекаемые в экспрессию или управление активностью генов Cas. Система CRISPR/Cas может представлять собой, например, систему типа I, типа II или типа III. Альтернативно система CRISPR/Cas может представлять собой систему типа V (например, подтипа V-A или подтипа V-B). Гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов (или ее часть), встроенная в эндогенный локус C9ORF72, описанная в данном документе, может быть удалена с использованием комплексов CRISPR (содержащих направляющую РНК (gRNA) в комплексе с белком Cas) для сайт-направленного расщепления нуклеиновых кислот.

[00030] Система CRISPR/Cas, описанная в данном документе может содержать белок Cas (например, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 или Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cu1966 и их гомологи или модифицированные версии) и/или одну или более направляющих РНК (gRNA), которые нацеливаются на последовательность распознавания gRNA. Система CRISPR/Cas, описанная в данном документе, может дополнительно содержать по меньшей мере одну конструкцию для экспрессии, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas (например, которая может быть функционально связана с промотором), и/или ДНК, кодирующую gRNA, описанную в данном документе.

[00031] B некоторых вариантах осуществления последовательность распознавания gRNA, например, целевая последовательность нуклеиновой кислоты, с которой будет связываться ДНК-нацеливающий сегмент gRNA при условии наличия достаточных условий для связывания, находится в SEQ ID NO: 45 или ее части. Сайт-специфическое связывание и расщепление SEQ ID NO: 45 белками Cas может происходить в местах, определяемых и (i) спариванием оснований по принципу комплементарности между gRNA и целевой ДНК, и (ii) коротким мотивом, называемым смежным с протоспейсером мотивом (РАМ), в целевой ДНК. РАМ может фланкировать последовательность распознавания направляющей РНК. Необязательно последовательность распознавания направляющей РНК может быть фланкирована на 3'-конце посредством РАМ. Альтернативно последовательность распознавания направляющей РНК может быть фланкирована на 5'-конце посредством РАМ. Например, сайт расщепления для белков Cas может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 10 или от приблизительно 2 до приблизительно 5 пар оснований (например, 3 пары оснований), расположенных выше или ниже последовательности РАМ. В некоторых случаях (например, когда используют Cas9 из S. pyogenes или близкородственный Cas9) последовательность РАМ некомплементарной нити может представлять собой 5'-N₁GG-3', где N₁ представляет собой любой нуклеотид ДНК и находится непосредственно рядом с 3' последовательности распознавания направляющей РНК некомплементарной нити целевой ДНК. Таким образом, последовательность РАМ комплементарной цепи будет представлять собой 5'-CCN₂-3', где N₂ представляет собой любой нуклеотид ДНК и находится непосредственно рядом с 5' последовательности распознавания направляющей РНК комплементарной нити целевой ДНК. В некоторых случаях N₁ и N₂ могут быть комплементарными, а пара оснований N₁-N₂ может представлять собой любую пару оснований (например, N₁=C и N₂=G; N₁=G и N₂=С; N₁=A и N₂=T или N₁=T и N₂=А). В случае Cas9, полученного из S. aureus, РАМ может представлять собой NNGRRT или NNGRR, где N может представлять собой A, G, С или Т, a R может представлять собой G или А. В некоторых случаях (например, в случае FnCpf1) последовательность РАМ может располагаться выше 5'-конца и иметь последовательность 5'-TTN-3'. В некоторых вариантах осуществления последовательность распознавания для gRNA начинается в положении 190, 196, 274, 899, 905, 1006 или 1068 SEQ ID NO: 45.

[00032] Как раскрывается в данном документе, направляющие РНК могут предусматриваться в любой форме. В некоторых вариантах осуществления gRNA может предусматриваться в форме РНК, либо в виде двух молекул (отдельная crRNA и tracrRNA), либо в виде одной молекулы (sgRNA), и необязательно в форме комплекса с белком Cas. gRNA также может предусматриваться в форме ДНК, кодирующей gRNA. В некоторых вариантах осуществления ДНК, кодирующая gRNA, может кодировать одну молекулу РНК (sgRNA) или отдельные молекулы РНК (например, отдельные crRNA и tracrRNA) (где отдельные молекулы РНК могут быть представлены в виде одной молекулы ДНК или в виде отдельных молекул ДНК, кодирующих соответственно crRNA и tracrRNA).

[00033] В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas, описанная в данном документе, содержит белок Cas9 или белок, полученный из Cas9 из системы CRISPR/Cas типа II, и/или по меньшей мере одну gRNA, где по меньшей мере одна gRNA кодируется ДНК, которая кодирует crRNA и/или tracrRNA. В некоторых вариантах осуществления ДНК, кодирующая crRNA, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из AGTACTGTGAGAGCAAGTAG (R) (SEQ ID NO: 38), GCTCTCACAGTACTCGCTGA (SEQ ID NO: 39), CCGCAGCCTGTAGCAAGCTC (SEQ ID NO: 40), CGGCCGCTAGCGCGATCGCG (SEQ ID NO: 41), ACGCCCCGCGATCGCGCTAG (R) (SEQ ID NO: 42), TGGCGAGTGGGTGAGTGAGG (SEQ ID NO: 43), GGAAGAGGCGCGGGTAGAAG (SEQ ID NO: 44), GAGTACTGTGAGAGCAAGTAG (R) (SEQ ID NO: 46), GCCGCAGCCTGTAGCAAGCTC (SEQ ID NO: 47), GCGGCCGCTAGCGCGATCGCG (SEQ ID NO: 48), GACGCCCCGCGATCGCGCTAG (R) (SEQ ID NO: 49), а также GTGGCGAGTGGGTGAGTGAGG (SEQ ID NO: 50). В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas, описанная в данном документе, содержит комбинацию из по меньшей мере семи последовательностей, кодирующих crRNA, где каждая из семи последовательностей, кодирующих crRNA, содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44. В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas 9, описанная в данном документе, содержит комбинацию из по меньшей мере семи различных последовательностей, кодирующих crRNA, где каждая из семи последовательностей, кодирующих crRNA, содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 46, 39, 47, 48, 49, 50 или 44. В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas 9, описанная в данном документе, содержит комбинацию из по меньшей мере трех различных последовательностей, кодирующих crRNA, при этом каждая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40, 43 или 44. В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas 9, описанная в данном документе, содержит комбинацию из по меньшей мере трех различных последовательностей, кодирующих crRNA, при этом каждая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 47, 50 или 44. В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas 9, описанная в данном документе, содержит комбинацию из по меньшей мере четырех различных последовательностей, кодирующих crRNA, при этом каждая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, 39, 41 или 42. В одном варианте осуществления система CRISPR/Cas 9, описанная в данном документе, содержит комбинацию из по меньшей мере четырех различных последовательностей, кодирующих crRNA, при этом каждая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 46, 39, 48 или 49.

[00034] В некоторых вариантах осуществления раскрываемая в данном документе gRNA кодируется ДНК, кодирующей tracrRNA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая tracrRNA, содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 63, 64 или 65. В некоторых вариантах осуществления gRNA, описанная в данном документе, содержит crRNA и tracrRNA. В некоторых вариантах осуществления gRNA, раскрываемая в данном документе, содержит одну или более crRNA (например, кодируемых ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49 или 50) и tracrRNA, например, ДНК, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 63, 64 или 65. В некоторых вариантах осуществления ДНК, кодирующая gRNA, может кодировать одну молекулу РНК (sgRNA) или отдельные молекулы РНК (например, отдельные crRNA и tracrRNA) (где отдельные молекулы РНК могут быть представлены в виде одной молекулы ДНК или в виде отдельных молекул ДНК, кодирующих соответственно crRNA и tracrRNA).

[00035] Целевые генетические модификации могут быть получены путем приведения в контакт клетки с белком Cas и одной или более направляющими РНК, которые гибридизуются с одной или более последовательностями распознавания направляющей РНК в пределах целевого геномного локуса. По меньшей мере одна из одной или более направляющих РНК может образовывать комплекс и может направлять белок Cas к по меньшей мере одной из одной или более последовательностей распознавания направляющей РНК, а белок Cas может расщеплять целевой геномный локус в по меньшей мере одной из одной или более последовательностей распознавания направляющей РНК. Расщепление белком Cas может создавать двухнитевой разрыв или однонитевой разрыв (например, в том случае, если белок Cas представляет собой никазу). Концевые последовательности, образующиеся вследствие двухнитевого разрыва или однонитевого разрыва, затем могут подвергаться рекомбинации.

[00036] B некоторых вариантах осуществления предусматривается зародышевая клетка, отличная от человеческой, геном которой содержит локус C9ORF72, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления зародышевая клетка, отличная от человеческой, представляет собой зародышевую клетку грызуна. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная клетка грызуна представляет собой эмбриональную клетку мыши и получена от мыши линии 129, линии C57BL или их гибрида. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная клетка грызуна представляет собой эмбриональную клетку мыши, и мышь является гибридом линий 129 и C57BL.

[00037] В некоторых вариантах осуществления предусматривается применение эмбриональной стволовой клетки или зародышевой клетки, отличных от человеческих, описываемых в данном документе, для получения генетически модифицированного животного, отличного от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка или зародышевая клетка, отличные от человеческой, представляют собой эмбриональную стволовую клетку или зародышевую клетку мыши и применяются для получения мыши, содержащей ген C9ORF72, описанный в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка или зародышевая клетка, отличные от человеческой, представляют собой эмбриональную стволовую клетку или зародышевую клетку крысы и применяются для получения крысы, содержащей ген C9ORF72, описанный в данном документе.

[00038] В некоторых вариантах осуществления предусматривается эмбрион, отличный от человеческого, содержащий, созданный из, полученный из или образованный из эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, содержащей локус C9ORF72, описанный в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион грызуна; в некоторых вариантах осуществления эмбрион мыши; в некоторых вариантах осуществления эмбрион крысы.

[00039] В некоторых вариантах осуществления предусматривается применение эмбриона, отличного от человеческого, описываемого в данном документе, для получения генетически модифицированного животного, отличного от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион мыши и применяется для получения мыши, содержащей локус C9ORF72, описанный в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион крысы и применяется для получения крысы, содержащей локус C9ORF72, описанный в данном документе.

[00040] В некоторых вариантах осуществления предусматривается модель животного, отличного от человека, с боковым амиотрофическим склерозом (ALS) или лобно-височной деменцией (FTD), при этом животное, отличное от человека, имеет эндогенный локус C9ORF72, содержащий гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, описанную в данном документе.

[00041] B некоторых вариантах осуществления предлагается модель животного, отличного от человека, с боковым амиотрофическим склерозом (ALS) или лобно-височной деменцией (FTD), которое получают путем вставки гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72.

[00042] В некоторых вариантах осуществления предложен способ идентификации кандидатного терапевтического средства для лечения нейродегенеративных заболевания, нарушения или состояния, предусматривающий (а) введение кандидатного средства животному, отличному от человека, или в клетку животного, отличного от человека (например, эмбриональную стволовую клетку, двигательный нейрон, полученный из эмбриональных стволовых клеток, клетку головного мозга, клетку коры, нейронную клетку, мышечную клетку, клетку сердца), геном которых содержит эндогенный локус C9ORF72, модифицированный, как описано в данном документе; (b) проведение одного или более анализов для определения того, оказывает ли кандидатное средство модулирующий эффект в отношении одного или более признаков, симптомов и/или состояний, ассоциированных с заболеванием, нарушением или состоянием (например, повышенная транскрипция смысловой или антисмысловой РНК C9orf72 из локуса C9orf72, увеличенные ядерные и/или цитоплазматические очаги РНК, содержащие смысловые или антисмысловые РНК C9orf72, увеличенное количество продуктов RAN-трансляции (например, белков с дипептидными повторами) и (с) идентификацию кандидатного средства, которое оказывает модулирующий эффект в отношении одного или более признаков, симптомов и/или состояний, ассоциированных с заболеванием, нарушением или состоянием, в качестве кандидатного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из нейродегенеративных заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления кандидатное средство вводят in vivo животному, отличному от человека, описанному в данном документе, и проводят один или более анализов с тканью, содержащей клетку головного мозга, клетку коры, нейронную клетку, мышечную клетку, клетку сердца или зародышевую клетку, выделенную из животного, отличного от человека, после введения. В некоторых вариантах осуществления кандидатное средство вводят в клетку (например, эмбриональную стволовую клетку, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетку головного мозга, клетку коры, нейронную клетку, мышечную клетку, клетку сердца), содержащую последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в локусе C9orf72, описанную в данном документе, и выполняют анализ in vitro. В некоторых вариантах осуществления анализ представляет собой количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) для выявления продуктов гена C9orf72, например, смысловой и антисмысловой РНК C9orf72. В некоторых вариантах осуществления qPCR можно проводить с праймером и/или зондом, имеющим нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления с помощью анализа измеряют очаги РНК, содержащие транскрипт смысловой или антисмысловой РНК C9orf72, например РНК-транскрипт последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов. В некоторых вариантах осуществления в анализе, с помощью которого измеряют очаги РНК, содержащие транскрипт смысловой или антисмысловой РНК C9orf72, например, РНК-транскрипт последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, применяют один или более зондов, имеющих нуклеотидную последовательность, изложенную под любой из SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 и/или SEQ ID NO: 84. В некоторых вариантах осуществления анализ представляет собой измерение продуктов RAN-трансляции, например, анализ представляет собой иммунофлуоресценцию, а продукты RAN-трансляции (например, белки с дипептидными повторами, например, белки с дипептидными повторами polyGA) измеряют с помощью антитела к polyGA. В некоторых вариантах осуществления с помощью анализа измеряют уровни белка C9orf72.

[00043] В некоторых вариантах осуществления предусматривается применение животного, отличного от человека, описываемого в данном документе, при изготовлении лекарственного препарата для лечения нейродегенеративных заболевания, нарушения или состояния.

[00044] В некоторых вариантах осуществления нейродегенеративные заболевание, нарушение или состояние представляют собой боковой амиотрофический склероз (ALS). В некоторых вариантах осуществления нейродегенеративные заболевание, нарушение или состояние представляют собой лобно-височную деменцию (FTD).

[00045] B различных вариантах осуществления один или более фенотипов, описанных в данном документе, сравнивают с эталоном или контролем. В некоторых вариантах осуществления эталон или контроль включает животное, отличное от человека, характеризующееся модификацией, описанной в данном документе, модификацией, отличной от модификации, описанной в данном документе, или отсутствием модификации (например, животное дикого типа, отличное от человека). Животные, отличные от человека, содержащие гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, которая содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, ее вариант, SEQ ID NO: 4, ее вариант, или SEQ ID NO: 5 или ее вариант, могут демонстрировать фенотип дикого типа, например, могут использоваться в качестве эталонного или контрольного животного, отличного от человека, в описанных в данном документе способах.

[00046] B различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гомозиготным по описанному в данном документе локусу C9orf72. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным по описанному в данном документе локусу C9orf72.

[00047] B различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, представляет собой грызуна; в некоторых вариантах осуществления - мышь; в некоторых вариантах осуществления - крысу.

[00048] Применяемые в данной заявке термины «приблизительно» и «примерно» используются как равнозначные. Предполагается, что все числа, используемые в данной заявке вместе с термином «приблизительно/примерно» или без него, охватывают любые нормальные отклонения, понятные специалисту в соответствующей области.

[00049] Другие признаки, объекты и преимущества животных, отличных от человека, клеток и способов, предусмотренных в данном документе, станут очевидны из ниже следующего подробного описания определенных вариантов осуществления. Однако следует понимать, что подробное описание, хотя и указывает на определенные варианты осуществления, приведено только в целях иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[00050] На фигуре 1А показана схематическая иллюстрация, без соблюдения масштаба, трех представленных изоформ транскрипта C9orf72 мыши (V1, V2 и V3) в верхнем прямоугольнике, а также схематическая иллюстрация, без соблюдения масштаба, стратегии нацеливания для вставки одной из двух человеческих гетерологичных последовательностей, характеризующихся экспансией гексануклеотидных повторов, охватывающей экзоны 1а и 1b гена C9orf72 человека и содержащей 3 или 100 повторов в эндогенном локусе C9orf72 мыши. На фигуре 1А в виде белых прямоугольников представлены экзоны мыши, а в виде белых с диагональными полосами прямоугольников представлены некодирующие экзоны локуса C9orf72 мыши. В виде прямоугольников с полосами по горизонтали представлены некодирующие экзоны локуса C9orf72 человека, а виде ромба представлен гексануклеотидный повтор. Создавали первый нацеливающий вектор, содержащий последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, и второй нацеливающий вектор, содержащий последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4. Первый нацеливающий вектор включает в направлении от 5' к 3': плечо гомологии мыши размером 89 т.о. выше RP23-434N2 мышиного гена 3110043021Rik и содержит SEQ ID NO: 6, человеческую последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, которая охватывает некодирующие экзоны 1а и 1b C9orf72 человека и включает промежуточный интрон, содержащий три повтора гексануклеотидной последовательности GGGGCC; селекционную кассету устойчивости к лекарственным средствам, которая содержит промотор гена убиквитина 1 человека (hUb1) и бактериального гена Em7, функционально связанный с геном устойчивости к неомицин-фосфотрансферазе (neo-r) и фланкированный сайтами loxP), и плечо гомологии мыши размером 86 т.о ниже RP23-434N2 мышиного гена 3110043021Rik, содержащее SEQ ID NO: 7. Второй нацеливающий вектор включает в направлении от 5' к 3': плечо гомологии мыши размером 89 т.о. выше от RP23-434N2 мышиного гена 3110043021Rik и содержащее SEQ ID NO: 6, последовательность человека, изложенную под SEQ ID NO: 9, которая охватывает некодирующие экзоны 1а и 1b C9orf72 человека и включает промежуточный интрон, содержащий 100 повторов гексануклеотидной последовательности GGGGCC; селекционную кассету устойчивости к лекарственным средствам, которая содержит промотор гена убиквитина 1 человека (hUb1) и бактериального гена Em7, функционально связанный с геном устойчивости к неомицин-фосфотрансферазе (neo-r) и фланкированный сайтами loxP), и плечо гомологии мыши размером 86 т.о ниже RP23-434N2 мышиного гена 3110043021Rik, содержащее SEQ ID NO: 7. После гомологичной рекомбинации с помощью первого или второго нацеливающего вектора участок генома мыши размером приблизительно 853 п.о., включая часть экзона 1 и часть интрона 1 3110043021Rik мыши, заменяют последовательностью, содержащей геномную последовательность, охватывающую экзоны 1a-1b человеческой некодирующей последовательности C9orf72. Полученные модифицированные локусы C9orf72-HRE₃ мыши до и после вырезания кассеты устойчивости к лекарственным средствам изображены на фигуре 1В. Полученные модифицированные локусы C9orf72-HRE₁₀₀ мыши до и после вырезания кассеты устойчивости к лекарственным средствам изображены на фигуре 1С. На фиг. 1В и 1С мышиные некодирующие участки представлены в виде прямоугольников с полосами по диагонали, человеческие некодирующие экзоны представлены в виде прямоугольников с полосами по горизонтали, а кодирующие экзоны мыши представлены в виде белых прямоугольников. На верхних панелях фиг. 1В и 1С также показано примерное местоположение зонда (вертикальный белый прямоугольник), используемого для блот-анализа по Саузерну (SEQ ID NO: 29).

[00051] На фигуре 2А показан результат блоттинга по Саузерну геномной ДНК, выделенной из контрольных клонов ES-клеток, клонов ES-клеток, подвергнутых целенаправленному воздействию посредством нацеливающего вектора, содержащего гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией повторов, которая содержит три повтора гексануклеотидной последовательности (8026), и после удаления кассеты устойчивости к лекарственным средствам (8027 А-С4), или клоны ES-клеток, подвергнутых целенаправленному воздействию посредством нацеливающего вектора, содержащего гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией повторов, которая содержит 100 повторов гексануклеотидной последовательности (8028), и после удаления кассеты устойчивости к лекарственным средствам (8029 А-А3, 8029 А-А6, 8029 В-А4, 8029 В-А10). На фиг. 2В показаны генотипические результаты генотипирования образцов (n=6), включая клон контрольной ES-клетки, клон 8027 А-С4, клон 8029 А-А3, клон 8029 А-А6, клон 8029 В-А4, клон 8029 В-А10 и контроли (n=7), полученные из образцов от человека, содержащих последовательность, характеризующуюся экспансией трех гексануклеотидных повторов.

[00052] На фигуре 3 показана схематическая иллюстрация, без соблюдения масштаба, гуманизированного C9orf72-HREx(где х≥1), гуманизированного участка и локуса C9orf72 мыши дикого типа (WT). На фигуре 3 также показаны примерные местоположения 5'- и 3'-праймеров (белые стрелки) и зондов (закрашенные прямоугольники), используемых в качественных ПЦР-анализах TAQMAN® А, В, G, Н и D, описанных в таблице 1, для количественного определения продуктов экспрессии генов из модифицированных локусов C9orf72-HRE (А, В, G, Н) или как из модифицированных локусов, так и из локусов C9orf72 дикого типа (D). На фигуре 3 некодирующие участки мыши представлены в виде прямоугольников с полосами по диагонали, человеческие некодирующие экзоны представлены в виде прямоугольников с полосами по горизонтали, а кодирующие экзоны мыши представлены в виде белых прямоугольников. Последовательности праймеров и зондов, изображенные на фигуре 3 и описанные в таблице 1, приведены в таблице 5.

[00053] На фигуре 4 представлены гистограммы, показывающие уровни экспрессии (определенные с помощью качественных ПЦР-анализов TAQMAN® А, В, G и Н, изображенных на фигуре 3) локуса C9orf72 (ось у) в двигательных нейронах, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN), общей ткани головного мозга или родительских эмбриональных стволовых (ES) клетках, которые являются гетерозиготными (Het) или гомозиготными (Homo) по локусу C9orf72 дикого типа (контроль) или модифицированному локусу C9orf72, содержащему три (3х), тридцать (30х) или девяносто два (92х) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, относительно клеток ESMN, клеток головного мозга или родительских ESC соответственно, которые являются гетерозиготными по модифицированному локусу C9orf72, содержащему три (3х) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. Все ESMN и родительские ES-клетки были гетерозиготными по модифицированным локусам C9orf72, а все контроли были гомозиготными по локусу C9orf72 дикого типа.

[00054] На фигурах 5А - 5С представлены гистограммы, показывающие различия в количественных значениях (Δct; ось у) продуктов гена C9orf72 (выявленных с помощью качественного ПЦР-анализа TAQMAN® А (фигура 5А), анализа В (фигура 5В) или анализа D (фигура 5С), как изображено на фигуре 3) в полученных из эмбриональных стволовых клетках двигательных нейронов (ESMN), целого головного мозга мыши или родительских эмбриональных стволовых (ES) клеток, которые являются гетерозиготными (het) или гомозиготными (homo) по локусу C9orf72 дикого типа (контроли) или по модифицированному локусу C9orf72, содержащему три (3х), тридцать (30х) или девяносто два (92х) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и количественных значениях продуктов гена GAPDH. Все ESMN и родительские ES клетки были гетерозиготными по модифицированным локусам C9orf72, а все контроли были гомозиготными по локусу C9orf72 дикого типа.

[00055] На фигуре 6 представлены гистограммы, показывающие различия в количественных значениях (Act; ось у) продуктов гена C9orf72 (выявленных с помощью качественного ПЦР-анализа TAQMAN®, как показано на фиг. 3) в тканях, выделенных из коры головного мозга, ствола головного мозга, остальной части (rem) головного мозга, спинного мозга, мышц, печени, сердца или почки мышей, гетерозиготных (het) или гомозиготных (homo) по локусу C9orf72 дикого типа (WT) или по модифицированному локусу c9orf72, содержащему три (3х) или девяносто два (92х) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и количественных значениях продуктов гена β2-микроглобулина (В2М).

[00056] На фигуре 7 показаны изображения вестерн-блоттинга (вверху), полученные после SDS-PAGE в восстанавливающих условиях лизатов двигательных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN), гомозиготных по локусу C9orf72 дикого типа (CTRL) или гетерозиготных по модифицированному локусу C9orf72, содержащему три (G₄C₂3x), тридцать (G₄C₂30x) или девяносто два (G₄C₂92x) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, при этом блоттинг проведен с использованием антител к C9orf72 (вверху) или антител к GAPDH (внизу). Также представлены гистограммы (нижняя панель) уровней белка C9orf72 в данных образцах, нормализованных по уровням белка C9orf72 в ESMN, гетерозиготных по модифицированному локусу C9orf72, содержащему три повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, а также маркеры молекулярной массы.

[00057] На фигуре 8 показано изображение вестерн-блоттинга (вверху), полученное после SDS-PAGE в восстанавливающих условиях лизатов двигательных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN), гетерозиготных по модифицированному локусу C9orf72, содержащему три (G₄C₂3x) или девяносто два (G₄C₂92x) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. Проводили блоттинг лизатов, содержащих 0 мкг, 1,25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг общих белков, с антителом к C9orf72 (показано) или антителом к GAPDH (данные не показаны). Также представлены гистограммы (внизу) уровней белка C9orf72 в этих образцах, нормализованных по уровням белка GAPDH в этих образцах, а также маркеры молекулярной массы.

[00058] На фиг. 9А и 9В представлены изображения, полученные в результате флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) двигательных нейронов, происходящих из эмбриональных стволовых клеток (ESMN), гетерозиготных по локусу C9orf72, модифицированному с тем, чтобы он содержал три (C9orf72 G₄C₂ 3х), тридцать (C9orf72 G₄C₂ 30х) или девяносто два (C9orf72 G₄C₂ 92х) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, окрашенной зондами ДНК (фигура 9А) или LNA (фигура 9В), при этом изображения показывают внутриядерные и цитоплазматические местоположения смысловых (фигура 9А) или антисмысловых (фигура 9В) транскриптов последовательности с гексануклеотидными повторами, изложенной под SEQ ID NO: 1, в ESMN. Стрелки указывают на иллюстративные окрашенные очаги РНК.

[00059] На фигуре 10 представлены изображения, полученные в результате иммунофлуоресценции двигательных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN), гетерозиготных по локусу C9orf72, модифицированному с тем, чтобы он содержал три (C9orf72 G₄C₂ 3х) или девяносто два (C9orf72 G₄C₂ 92х) повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, где на изображениях показаны внутриядерные местоположения белков с дипептидными повторами (polyGA), транслированных (посредством RAN-трансляции, механизма, отличного от AUG) из транскриптов последовательности с гексануклеотидными повторами, изложенной под SEQ ID NO: 1 в ESMN. Стрелки указывают на иллюстративные окрашенные белки с дипептидными повторами polyGA.

[00060] На фигуре 11 показано схематическое изображение, без соблюдения масштаба, локуса C90RF72 мыши размером приблизительно 1300 п.о., содержащего гетерологичную (человеческую) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую приблизительно 92 повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и которая может быть использована в качестве эталонной последовательности для получения системы CRISPR/Cas для удаления последовательности, характеризующейся экспансией. На фигуре 11 также показаны примерные местоположения (1) 92 повторов гексануклеотидной последовательности, показанные стрелками, направленными вниз, (2) начальных положений (190, 196 и 274) трех сайтов выше последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, на которую может нацеливаться gRNA, содержащая соответственно последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40, (3) начальных положений (899, 905, 1006 и 1068) четырех сайтов ниже последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, на которую может нацеливаться gRNA, содержащая соответственно последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, и (4) примерные местоположения для прямого (F-) и обратного (R-) праймеров, которые можно использовать для подтверждения удаления в выбранных клеточных клонах. Последовательность нуклеиновой кислоты эталонной последовательности, изображенной на фиг. 11, изложена под SEQ ID NO: 45.

[00061] На фигуре 12 показана иллюстративная конструкция для экспрессии размером 10718 п.о., которую можно использовать в системе CRISP/Cas. Конструкция для экспрессии содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas9 мыши «mouse opt Cas9», слитый с N-концевым сигналом внтуриядерной локализации (NLS) и С-концевым сигналом внутриядерной локализации, при этом экспрессия слитого белка находится под контролем промотора CAGG. Выше нуклеиновой кислоты расположена последовательность Козак, а ниже нуклеиновой кислоты - концевая последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpA). Также в качестве части конструкции для экспрессии показан промотор EF1, управляющий экспрессией нуклеотидной последовательности, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с геном устойчивости к пуромицину, функционально связанным с концевой последовательностью полиаденилирования SV40 (polyA SV40), точкой начала репликации (рМВ1) и геном β-лактамазы, обеспечивающим устойчивость к ампициллину (Amp). Конструкция для экспрессии обеспечивает возможность вставки ДНК, кодирующей gRNA, например, crRNA, между промотором U6 и сигналом терминации. Конструкция для экспрессии, изображенная на фиг. 4, может дополнительно содержать ниже промотора U6 и выше сигнала терминации, последовательность, кодирующую tracrRNA. Такая последовательность, кодирующая tracrRNA, расположена таким образом, что она может быть функционально связана с, например, crRNA, после ее вставки. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая tracrRNA, содержит

GTTGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCA ACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 63);

TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACT TGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 64);

GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTC CGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 65) или их части.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[00062] Настоящее изобретение не ограничено конкретными способами и условиями эксперимента, описанными в данном документе, поскольку такие способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь с целью описания конкретных вариантов осуществления и не подразумевается как ограничивающая, поскольку объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

[00063] Если не определено иное, то все термины и фразы, используемые в данном документе, имеют значения, которые данные термины и фразы приобрели в данной области техники, если в контексте, в котором используется термин или фраза, четко не указано или четко не очевидно противоположное. Хотя при практическом осуществлении или апробировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, аналогичные описанным в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны только конкретные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки.

[00064] «Введение» включает введение композиции субъекту или живой системе (например, в клетку, орган, ткань, организм или их соответствующий компонент или набор компонентов). Специалисты в данной области поймут, что путь введения может варьировать, например, в зависимости от субъекта или системы, которым будет вводиться композиция, природы композиции, цели введения и т.д. Например, в определенных вариантах осуществления введение субъекту-животному (например, человеку или грызуну) может быть бронхиальным (в том числе посредством бронхиальной инсталляции), трансбуккальным, энтеральным, внутрикожным, внутриартериальным, интрадермальным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, интравентрикулярным, чресслизистым, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, подъязычным, местным, трахеальным (в том числе посредством интратрахеальной инсталляции), трансдермальным, вагинальным и/или витреальным. В некоторых вариантах осуществления введение может подразумевать прерывистое введение доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать непрерывное введение доз (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.

[00065] «Уменьшение тяжести» включает предупреждение возникновения, ослабление или временное облегчение состояния или улучшение состояния субъекта. Уменьшение тяжести включает заболевание, нарушение или состояние (например, лучевого поражения), но не предусматривает полного их излечения или полного предупреждения.

[00066] «Примерно», используемое в отношении одного или более значений, представляющих интерес, включает значение, сходное с указанным эталонным значением. В определенных вариантах осуществления выражение «примерно» или «приблизительно» относится к диапазону значений, находящихся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше в любую сторону (большую или меньшую) от указанного эталонного значения, если не указано иное или иное не очевидно из контекста (за исключением тех случаев, когда такое число будет превышать 100% от возможного значения).

[00067] Выражение «биологически активный» означает характеристику любого средства, обладающего активностью в биологической системе in vitro или in vivo (например, в организме). Например, средство, которое в случае присутствия в организме обладает биологическим эффектом в пределах этого организма, считается биологически активным. В конкретных вариантах осуществления, в которых белок или полипептид являются биологически активными, часть этого белка или полипептида, обладающая по меньшей мере одной общей с данным белком или полипептидом биологической активностью, обычно называется «биологически активной» частью.

[00068] «Сравнимый» обозначает два или более средств, объектов, ситуаций, наборов условий и т.д., которые могут не быть идентичны друг другу, но которые являются в достаточной степени похожими для обеспечения возможности их сравнения, чтобы на основании наблюдаемых различий или сходств можно было сделать вполне обоснованные заключения. Средним специалистам в данной области из контекста будет понятно, какая степень идентичности требуется в любых заданных обстоятельствах для двух или более таких средств, объектов, ситуаций, наборов условий и т.д., чтобы они считались сравнимыми.

[00069] «Консервативный», используемый в данном документе для описания консервативной аминокислотной замены, включает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим R-группу боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом консервативная аминокислотная замена практически не будет изменять представляющие интерес функциональные свойства белка, например, способность рецептора связываться с лигандом. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, включают: алифатические боковые цепи, такие как у глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; алифатические боковые цепи с гидроксильными группами, такие как у серина и треонина; амид-содержащие боковые цепи, такие как у аспарагина и глутамина; ароматические боковые цепи, такие как у фенилаланина, тирозина и триптофана; основные боковые цепи, такие как у лизина, аргинина и гистидина; кислотные боковые цепи, такие как у аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и серосодержащие боковые цепи, такие как у цистеина и метионина. Группы консервативных аминокислотных замен включают, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке аланином, применяемую, например, в аланин-сканирующем мутагенезе. В некоторых вариантах осуществления проводят консервативную замену, которая имеет положительное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250, раскрытой в публикации Gonnet et al., 1992, Science 256:1443-1445. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, где замена имеет неотрицательное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250.

[00070] «Контроль» обозначает понятное в данной области значение «контроля», представляющего собой стандарт, с которым сравнивают результаты. Как правило, контроли используют для повышения целостности в экспериментах путем разделения переменных для того, чтобы сделать вывод об этих переменных. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой реакцию или анализ, проводимые одновременно с тестовыми реакцией или анализом для обеспечения объекта сравнения. «Контроль» также включает «контрольное животное». «Контрольное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа). В одном эксперименте используют «тест» (т.е. тестируемую переменную). Во втором эксперименте, «контрольном», тестируемую переменную не используют. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой исторический контроль (т.е. тест или анализ, проведенные ранее, или количество или результат, известные заранее). В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой или включает напечатанную или иным образом сохраненную запись. Контроль может представлять собой положительный контроль или отрицательный контроль.

[00071] «Разрушение» означает результат события гомологичной рекомбинации с молекулой ДНК (например, с эндогенной гомологичной последовательностью, такой как ген или локус гена). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к вставке, делеции, замене, замещению, миссенс-мутации или сдвигу рамки считывания в последовательности(ях) ДНК или любой их комбинации или может быть представлено такими. Вставки могут включать вставку полных генов или фрагментов генов, например, экзонов, которые могут иметь происхождение, отличное от такого происхождения для эндогенной последовательности (например, гетерологичной последовательности). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к повышению экспрессии и/или активности гена или продукта гена (например, белка, кодируемого геном). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к снижению экспрессии и/или активности гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению последовательности гена или кодируемого продукта гена (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к усечению или фрагментации гена или кодируемого продукта гена (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к удлинению гена или кодируемого продукта гена. В некоторых таких вариантах осуществления за счет разрушения может обеспечиваться сборка слитого белка. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению уровня экспрессии, но не активности гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению активности, но не уровня экспрессии гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительного влияния на уровень экспрессии гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительного влияния на активность гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительного влияния ни на уровень экспрессии, ни на активность гена или продукта гена.

[00072] «Определение», «измерение», «установление», «оценка», «анализ» и «анализирование» включают любую форму измерения и включают определение присутствия или отсутствия элемента. Эти термины включают как количественные, а также и/или качественные определения. Анализ может быть относительным или абсолютным. «Анализ на присутствие» может представлять собой определение количества чего-либо присутствующего и/или определение того, присутствует или отсутствует ли оно.

[00073] «Эндогенный локус» или «эндогенный ген» относятся к генетическому локусу, находящемуся в родительском или эталонном организме до введения разрушения, делеции, замещения, изменения или модификации, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, обнаруживаемую в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой сконструированный организм. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм, выведенный в лаборатории (дикого типа или сконструированный).

[00074] «Эндогенный промотор» означает промотор, который в естественных условиях, например в организме дикого типа, связан с эндогенным геном.

[00075] «Ген» включает последовательность ДНК в хромосоме, которая кодирует продукт (например, РНК-продукт и/или полипептидный продукт). В некоторых вариантах осуществления ген содержит кодирующую последовательность (т.е. последовательность, которая кодирует конкретный продукт). В некоторых вариантах осуществления ген содержит некодирующую последовательность. В некоторых конкретных вариантах осуществления ген может содержать как кодирующую (например, экзонную), так и некодирующую (например, интронную) последовательности. В некоторых вариантах осуществления ген может содержать одну или более регуляторных последовательностей (например, промоторы, энхансеры и т.д.)и/или интронных последовательностей, которые, например, могут контролировать или влиять на один или более аспектов экспрессии гена (например, специфичную для типа клеток экспрессию, индуцируемую экспрессию и т.д.). С целью внесения ясности отметим, что используемый в настоящей заявке термин «ген» обычно обозначает часть нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид; при этом данный термин может необязательно охватывать регуляторные последовательности, что будет понятно из контекста специалистам в данной области техники. Это определение не подразумевает исключение применения термина «ген» к единицам экспрессии, не кодирующим белок, но скорее поясняет то, что в большинстве случаев термин, используемый в данном документе, относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид.

[00076] «Гетерологичный» включает средство или объект из другого источника. Например, при использовании по отношению к полипептиду, последовательности нуклеиновой кислоты, гену или продукту гена, присутствующим в конкретной клетке или конкретном организме, данный термин разъясняет, что соответствующий полипептид, последовательность нуклеиновой кислоты, ген или продукт гена 1) был сконструирован человеком; 2) был введен в клетку или организм (или их предшественника) человеком (например, с помощью генной инженерии) и/или 3) в естественных условиях не продуцируется соответствующими клеткой или организмом (например, соответствующим типом клетки или типом организма) или не присутствует в них. «Гетерологичный» также предусматривает полипептид, последовательность нуклеиновой кислоты, ген или продукт гена, которые обычно присутствуют в конкретных нативной клетке или организме, но были модифицированы, например, за счет мутации или помещения под контроль не встречающихся в природе ассоциированных и в некоторых вариантах осуществления не являющихся эндогенными регуляторных элементов (например, промотора).

[00077] «Клетка-хозяин» включает клетку, в которую были введены нуклеиновая кислота или белок. При ознакомлении с данным изобретением специалистам в данной области будет понятно, что такие термины обозначают не только конкретную рассматриваемую клетку, но также используются для обозначения потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях вследствие влияния мутаций или окружающей среды могут происходить определенные модификации, такое потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, но по-прежнему включено в объем фразы «клетка-хозяин». В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или предусматривает прокариотическую или эукариотическую клетку. Как правило, клетка-хозяин представляет собой любую клетку, подходящую для приема и/или продуцирования гетерологичных нуклеиновой кислоты или белка, независимо от того, к какому царству живой природы относится клетка. Иллюстративные клетки включают клетки прокариот и эукариот (одноклеточных или многоклеточных), бактериальные клетки (например, штаммы Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia partoris, Pichia methanolica и т.д.), клетки растений, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, клетки насекомых, зараженные бакуловирусами, Trichoplusia ni и т.д.), клетки животных, отличных от человека, клетки человека или продукты слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, человекообразной обезьяны, хомячка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетки сетчатки, Vero, CV1, клетки почки (например, НЕК293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60 (например, BHK21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальные), CV-1, U937, 3Т3, L-клетки, клетки С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетки Сертоли, клетки BRL 3А, клетки НТ1080, клетки миеломы, опухолевой клетки и линии клеток, происходящей из вышеупомянутых клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит один или более вирусных генов, например, клетка сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6®). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или предусматривает выделенную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть ткани. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть организма.

[00078] «Идентичность» применительно к сравнению последовательностей, включает идентичность, определяемую с помощью ряда различных алгоритмов, известных в данной области, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления значения идентичности, описываемые в данном документе, определяют с применением выравнивания ClustalW v. 1.83 (медленного), в котором используются штраф за открытие гэпа 10,0, штраф за продление гэпа 0,1, а также с применением матрицы сходства Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

[00079] «Улучшение», «повышение», «исключение» или «снижение» включает указанные значения, которые сравнимы с измерением на исходном уровне, таким как измерение у того же человека (или животного) до начала лечения, описанного в данном документе, или измерением у контрольного индивидуума (или животного) или более контрольных индивидуумов (или животных) в отсутствие лечения, описанного в данном документе.

[00080] «Выделенный» означает вещество и/или объект, которые были (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми они были связаны при исходном продуцировании (будь то в природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) сконструированы, продуцированы, получены и/или произведены человеком. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были изначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства являются чистыми на приблизительно 80%, на приблизительно 85%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98%, на приблизительно 99% или более чем на приблизительно 99%. В некоторых вариантах осуществления вещество является «чистым», если оно практически не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, что будет понятно специалистам в данной области техники, вещество может по-прежнему считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с определенными другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или наполнителей (например, буфер, растворитель, вода и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или наполнителей. В качестве лишь одного примера в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, существующий в природе, считается «выделенным», если: а) он ввиду своего происхождения или источника получения не связан с некоторыми или всеми компонентами, сопровождающими его в его нативном состоянии в природе; b) он практически не содержит других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида от вида, который продуцирует их в природе; или с) он экспрессируется или иным образом связан с компонентами в клетке или другой системе экспрессии, не принадлежащей к виду, который продуцирует его в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, синтезируемый химическим путем или синтезируемый в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в природе, считается «выделенным» полипептидом. В качестве альтернативы или дополнительно в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут одной или более методикам очистки, может считаться «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов: а) с которыми он связан в природе и/или b) с которыми он был связан при исходном продуцировании.

[00081] Термин «локус» или «локусы» включает конкретное местоположение(местоположения) гена (или значимой последовательности), последовательность ДНК, последовательность, кодирующую полипептид, или положение на хромосоме генома организма. Например, «локус C9ORF72» может относиться к конкретному месторасположению гена C9ORF72, последовательности ДНК C9ORF72, к последовательности, кодирующей C9ORF72, или к положению C9ORF72 в хромосоме генома организма, которое было идентифицировано как такое, в котором находится такая последовательность. «Локус C9ORF72» может содержать регуляторный элемент гена C9ORF72, в том числе без ограничения энхансер, промотор, 5'-концевую и/или 3'-концевую UTR или их комбинацию. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в некоторых вариантах осуществления хромосомы могут содержать несколько сотен или даже несколько тысяч генов и демонстрировать физическую совместную локализацию сходных генетических локусов при сравнении разных видов. Такие генетические локусы могут быть описаны как имеющие общую синтению.

[00082] «Животное, отличное от человека» означает любое позвоночный живой организм, которое не является человеком. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой круглоротое, костную рыбу, хрящевую рыбу (например, акулу или ската), земноводное, пресмыкающееся, млекопитающее и птицу. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее, отличное от человека, представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

[00083] «Нуклеиновая кислота» включает любое соединение и/или вещество, включенное или которое может быть включено в состав олигонуклеотидной цепи. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой соединение и/или вещество, включенное или которое может быть включено в состав олигонуклеотидной цепи с помощью фосфодиэфирной связи. Как будет очевидно из контекста, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» означает отдельные остатки нуклеиновой кислоты (например, нуклеотиды и/или нуклеозиды); в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» означает олигонуклеотидную цепь, содержащую отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит РНК; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более остатков природной нуклеиновой кислоты, содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более аналогов нуклеиновой кислоты, содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты отличается от «нуклеиновой кислоты» тем, что в нем не используется фосфодиэфирный остов. Например, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой одну или более «пептидных нуклеиновых кислот», которые известны из уровня техники и имеют в остове пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей, содержит их или состоят из них, и они считаются находящимися в пределах объема настоящего изобретения. В качестве альтернативы или дополнительно в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет одну или более фосфоротиоатных и/или 5'-N-фосфорамидитных связей вместо фосфодиэфирных связей. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более природных нуклеозидов (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин), содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более аналогов нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С5-пропинилцитидин, С5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-йодуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин, 2-тиоцитидин, метилированные основания, интеркалированные основания и их комбинации), содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» содержит один или более модифицированных сахарных остатков (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) по сравнению с сахарными остатками в природных нуклеиновых кислотах. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональный продукт гена, такой как РНК или белок. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает один или более интронов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает один или более экзонов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновую кислоту» получают с помощью одного или более из выделения из природного источника, ферментативного синтеза путем полимеризации на основе комплементарной матрицы (in vivo или in vitro), воспроизведения в рекомбинантной клетке или системе и химического синтеза. В некоторых вариантах осуществления длина «нуклеиновой кислоты» составляет по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является однонитевой; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является двухнитевой. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один элемент, который кодирует полипептид или является комплементарным по отношению к последовательности, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» обладает ферментативной активностью.

[00084] «Функционально связанный» включает контактное положение, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Последовательность контроля, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, подходящих для функционирования последовательностей контроля. «Функционально связанные» последовательности включают как последовательности контроля экспрессию, смежные с представляющим интерес геном, так и последовательности контроля экспрессии, действующие в транс-положении или на некотором расстоянии с осуществлением контроля представляющего интерес гена. Термин «последовательность, контролирующая экспрессию», предусматривает полинуклеотидные последовательности, необходимые для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. «Последовательности, контролирующие экспрессию» включают соответствующие последовательности для инициации и терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козак); последовательности, повышающие стабильность белка; и при необходимости последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких последовательностей контроля отличается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие контролирующие последовательности включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательность для терминации транскрипции, тогда как у эукариот такие контролирующие последовательности обычно включают промоторы и последовательность для терминации транскрипции. Подразумевается, что термин «последовательности контроля» включает компоненты, присутствие которых является необходимым для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является благоприятным, например, лидерные последовательности и последовательности партнера по слиянию.

[00085] «Фенотип» включает признак, или класс, или набор признаков, проявляемых клеткой или организмом. В некоторых вариантах осуществления конкретный фенотип может коррелировать с конкретным аллелем или генотипом. В некоторых вариантах фенотип может быть дискретным; в некоторых вариантах фенотип может быть непрерывным.

[00086] «Физиологические условия» включает понятное в данной области значение, означающее условия, при которых клетки или организмы живут и/или размножаются. В некоторых вариантах осуществления данный термин включает условия внешней или внутренней окружающей среды, которые могут существовать в природе относительно организма или системы клеток. В некоторых вариантах осуществления физиологические условия представляют собой условия, присутствующие в пределах организма человека или животного, отличного от человека, в частности, те условия, присутствующие в месте и/или в пределах области хирургического вмешательства. Физиологические условия, как правило, включают, например, температурный диапазон, составляющий 20-40°С, атмосферное давление, составляющее 1, рН, составляющий 6-8, концентрацию глюкозы, составляющую 1-20 мМ, концентрацию кислорода при уровнях, равным атмосферным, и силу тяжести, которая встречается на земном шаре. В некоторых вариантах осуществления условия в лаборатории регулируют и/или поддерживают при физиологических условиях. В некоторых вариантах осуществления физиологические условия встречаются в организме.

[00087] «Полипептид» означает любую полимерную цепь из аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая содержит части, встречающиеся в природе отдельно друг от друга (т.е. из двух или более различных организмов, например, часть, принадлежащую человеку, и часть, отличную от человеческой). В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая является сконструированной в том смысле, что она разработана и/или получена в результате действий человека.

[00088] Термин «предупреждать» или «предупреждение» в контексте возникновения заболевания, нарушения и/или состояния, включает снижение риска развития заболевания, нарушения и/или состояния и/или задержку появления одной или более характеристик или симптомов заболевания, нарушения или состояния. Предупреждение может считаться завершенным, если начало заболевания, нарушения или состояния было отложено на предварительно определенный период времени.

[00089] «Эталон» включает стандартные или контрольные средство, животное, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение, с которыми сравнивают представляющие интерес средство, животное, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение. В некоторых вариантах осуществления эталонные средство, животное, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение тестируют и/или определяют практически одновременно с тестированием или определением представляющих интерес средства, животного, группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения. В некоторых вариантах осуществления эталонные средство, животное, группа, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение представляют собой исторический эталон, необязательно внесенный на материальный носитель. В некоторых вариантах осуществления эталон может обозначать контроль. «Эталонный» также предусматривает «эталонное животное». «Эталонное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа). Как будет понятно специалистам в данной области, эталонные средство, животное, группу, индивидуум, популяцию, образец, последовательность или значение обычно определяют или характеризуют в условиях, сравнимых с условиями, используемыми для определения или получения характеристик представляющих интерес средства, животного (например, млекопитающего), группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения.

[00090] «Ответ» включает любое полезное изменение состояния субъекта, которое происходит в результате лечения или коррелирует с ним. Такое изменение может включать стабилизацию состояния (например, предупреждение ухудшения состояния, которое могло бы иметь место при отсутствии лечения), улучшение симптомов состояния и/или улучшение перспектив лечения данного состояния и т.д. Это может относиться к ответу субъекта или к ответу нейрона. Ответ нейрона или субъекта может быть измерен в соответствии с широким спектром критериев, в том числе клинических критериев и объективных критериев. Исследование двигательной системы субъекта может включать исследование одной или более сил, сухожильных рефлексов, поверхностных рефлексов, мышечной массы, координации, мышечного тонуса, аномальных движений, стояния и походки. Методики оценки ответа включают без ограничения клиническое обследование, рефлекс растяжения (миотатический рефлекс), рефлекс Гофмана и/или тесты под давлением. Способы и рекомендации по оценке ответа на лечение обсуждаются в Brodal, A.: Neurological Anatomy in Relation to Clinical Medicine, ed. 2, New York, Oxford University Press, 1969; Medical Council of the U.K.: Aids to the Examination of the Peripheral Nervous System, Palo Alto, Calif, Pendragon House, 1978; Monrad-Krohn, G.H., Refsum, S.: The Clinical Examination of the Nervous System, ed. 12, London, H.K. Lewis & Co., 1964; and Wolf, J.K.: Segmental Neurology, A Guide to the Examination and Interpretation of Sensory and Motor Function, Baltimore, University Park Press, 1981. Точные критерии ответа могут быть выбраны любым подходящим способом при условии, что при сравнении групп нейронов и/или пациентов сравниваемые группы оценивают на основе тех же или сопоставимых критериев для определения частоты ответа. Специалист в данной области техники сможет выбрать подходящие критерии.

[00091] «Риск», что будет понятно из контекста, заболевания, нарушения и/или состояния предполагает вероятность того, что у конкретного человека разовьется заболевание, нарушение и/или состояние (например, лучевое повреждение). В некоторых вариантах осуществления риск выражается в процентах. В некоторых вариантах осуществления риск составляет от 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и до 100%. В некоторых вариантах осуществления риск выражается как риск относительно риска, связанного с эталонным образцом или группой эталонных образцов. В некоторых вариантах осуществления эталонный образец или группа эталонных образцов имеют известный риск заболевания, нарушения, состояния и/или события (например, лучевого поражения). В некоторых вариантах осуществления эталонный образец или группа эталонных образцов отобраны у индивидуумов, сопоставимых с конкретным индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления относительный риск составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше.

[00092] «Практически» обозначает качественное состояние проявления полной или практически полной меры или степени выраженности представляющих интерес характеристики или свойства. Рядовому специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если это вообще происходит, продолжаются до окончания и/или протекают до завершения или достигают или скрывают абсолютный результат. Таким образом, термин «практически» используется в данном документе для охвата потенциального отсутствия завершенности, присущей многим биологическим и химическим явлениям.

[00093] «Факт и чески гомологичный» означает сравнение аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновой кислоты. Как будет понятно специалисту в данной области техники, две последовательности обычно считаются «фактически гомологичными», если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут представлять собой идентичные остатки. В качестве альтернативы гомологичные остатки могут представлять собой неидентичные остатки с соответствующими сходными структурными и/или функциональными характеристиками. Например, специалисту в данной области техники хорошо известно, что определенные аминокислоты обычно классифицируют как «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты и/или как имеющие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замена одной аминокислоты на другую того же типа часто может считаться «гомологичной» заменой. Типичное распределение аминокислот по категориям обобщено ниже:

[00094] Из уровня техники хорошо известно, что аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты можно сравнивать с помощью любого из множества алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с гэпами и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Такие иллюстративные программы описаны в Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., and B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. В дополнение к идентификации гомологичных последовательностей упомянутые выше программы, как правило, дают представление о степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются практически гомологичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются гомологичными на протяжении рассматриваемого фрагмента из остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент предусматривает смежные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент предусматривает остатки, расположенные с промежутками вдоль полной последовательности, например, расположенные с промежутками остатки, сводимые вместе за счет складчатой конформации полипептида или его части. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[00095] «Фактически идентичный» означает сравнение аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот. Специалисту в данной области техники будет понятно, что две последовательности обычно считаются «фактически идентичными», если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Из уровня техники хорошо известно, что аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты можно сравнивать с помощью любого из множества алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с гэпами и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Такие иллюстративные программы описаны в Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. В дополнение к идентификации идентичных последовательностей упомянутые выше программы, как правило, дают представление о степени идентичности. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются практически идентичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются идентичными на протяжении рассматриваемого фрагмента из остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[00096] Выражение «нацеливающий вектор», или «нацеливающая конструкция», или «конструкция на основе нуклеиновой кислоты» включает молекулу полинуклеотида, содержащую нацеливающий участок. Нацеливающий участок содержит последовательность, которая идентична или практически идентична последовательности в целевых клетке, ткани или животном, и обеспечивает интеграцию нацеливающей конструкции в положение в пределах генома клетки, ткани или животного посредством гомологичной рекомбинации. Также предусмотрены нацеливающие участки, которые нацеливаются с помощью сайтов для распознавания сайт-специфической рекомбиназой (например, сайтов loxP или Frt). В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция, описанная в данном документе, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты или ген (например, репортерный ген, гомологичный или гетерологичный ген), представляющие определенный интерес, селектируемый маркер, контрольные и/или регуляторные последовательности, а также другие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие рекомбиназу или белок, вызывающий рекомбинацию. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция может содержать полный или неполный ген, представляющий интерес, где ген, представляющий интерес, кодирует полный или неполный полипептид, имеющий функцию, сходную с такой функцией у белка, кодируемого эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция может содержать представляющий интерес гуманизированный полный или неполный ген, где представляющий интерес гуманизированный ген кодирует полный или неполный полипептид, имеющий функцию, сходную с такой функцией у полипептида, кодируемого эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция может содержать полный или неполный репортерный ген, где репортерный ген кодирует полипептид, легко идентифицируемый и/или измеряемый с использованием методик, известных из уровня техники.

[00097] Термины «трансгенноеживотное», «трансгенное животное, отличное от человека» или «Tg⁺» означают любое не существующее в природе животное, отличное от человека, в котором одна или более клеток животного, отличного от человека, содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или ген, кодирующий представляющий интерес полный или неполный полипептид. В некоторых вариантах осуществления гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или ген вводят в клетку напрямую или опосредованно, путем введения в клетку-предшественника, путем преднамеренной генетической манипуляции, например, с помощью микроинъекции или путем инфицирования рекомбинантным вирусом. Термин «генетическая манипуляция» не включает классические методики скрещивания, а скорее относится к введению молекулы(молекул) рекомбинантной ДНК. Данная молекула может быть интегрирована в хромосому или может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК. Термин «Tg⁺» включает животных, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по гетерологичным нуклеиновой кислоте и/или гену, и/или животных, которые имеют одну или множество копий гетерологичных нуклеиновой кислоты и/или гена.

[00098] Термин «лечение», «лечить» или «осуществлять лечение» включает любое введение вещества (например, кандидатного терапевтического средства), которое частично или полностью облегчает один или более симптомов, характерных признаков и/или причинных факторов конкретного заболевания, нарушения и/или состояния, уменьшает их интенсивность, ослабляет их, подавляет их, задерживает начало их проявления, уменьшает их тяжесть и/или уменьшает частоту их возникновения. В некоторых вариантах осуществления такое лечение можно осуществлять в отношении субъекта, у которого не проявляются признаки соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или субъекта, у которого проявляются только ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния. В качестве альтернативы или в дополнение в некоторых вариантах осуществления лечение можно осуществлять в отношении субъекта, у которого проявляются один или более устойчивых признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение можно проводить в отношении субъекта, который при диагностике был определен как страдающий от соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение можно проводить в отношении субъекта, о котором известно, что он имеет один или более факторов восприимчивости, статистически коррелирующих с повышенным риском развития соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния.

[00099] «Вариант» включает объект, демонстрирующий значительную структурную идентичность с эталонным объектом, но структурно отличающийся от эталонного объекта по присутствию или уровню одного или более химических фрагментов по сравнению с эталонным объектом. Во многих вариантах осуществления «вариант» также функционально отличается от своего эталонного объекта. Как правило, следует ли считать конкретный объект «вариантом» эталонного объекта, зависит от степени его структурной идентичности с эталонным объектом. Как будет понятно специалистам в данной области, любой биологический или химический эталонный объект имеет определенные характерные структурные элементы. «Вариант» по определению представляет собой отдельный химический объект с общими одним или более такими характерными структурными элементами. В виде лишь нескольких примеров, малая молекула может иметь характерный сердцевинный структурный элемент (например, макроциклическую сердцевину) и/или один или более характерных «подвешенных» фрагментов, так что вариант малой молекулы имеет общие сердцевинный структурный элемент и характерные «подвешенные» фрагменты, но отличается другими «подвешенными» фрагментами и/или типами связей (одинарные по сравнению с двойными, Е по сравнению с Z и т.д.), присутствующими в пределах сердцевины, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из нескольких аминокислот, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве и/или способствующих осуществлению конкретной биологической функции, нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из нескольких нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве. Например, «вариант полипептида» может отличаться от эталонного полипептида вследствие одного или более различий в аминокислотной последовательности и/или одного или более различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и т.д.), присоединенных ковалентной связью к полипептидному остову. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» демонстрирует общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, составляющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В качестве альтернативы или дополнительно в некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не имеет по меньшей мере одного характерного элемента последовательности, общего с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид обладает одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления «вариант пилипептида» обладает одним или более видами биологической активности, общими с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления у «варианта пилипептида» отсутствует один или более видов биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления «вариант пилипептида» демонстрирует сниженный уровень одного или более видов биологической активности по сравнению с эталонным полипептидом. Во многих вариантах осуществления представляющий интерес полипептид считается «вариантом» исходного или эталонного полипептида, если представляющий интерес полипептид имеет аминокислотную последовательность, идентичную последовательности у исходной молекулы, за исключением небольшого количества изменений в конкретных положениях последовательности. Как правило, в варианте заменены менее 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% остатков по сравнению с исходной молекулой. В некоторых вариантах осуществления «вариант» имеет 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замену остатков по сравнению с исходной молекулой. Зачастую «вариант» имеет очень небольшое количество (например, менее 5, 4, 3, 2 или 1) замен функциональных остатков (т.е. остатков, принимающих участие в конкретном виде биологической активности). Кроме того, «вариант» обычно имеет не более 5, 4, 3, 2 или 1 добавления или делеции и зачастую не имеет добавлений или делеций по сравнению с исходной молекулой. Более того, любые добавления или делеции, как правило, охватывают менее приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6 и зачастую охватывают менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 остатков. В некоторых вариантах осуществления исходный или эталонный полипептид представляет собой полипептид, встречающийся в природе. Как будет понятно рядовым специалистам в данной области, несколько вариантов конкретного представляющего интерес полипептида обычно можно встретить в природе, особенно если представляющий интерес полипептид представляет собой полипептид возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, будет содержать вариант конструкции на основе нуклеиновой кислоты, используемой для нацеленной вставки гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов. В качестве неограничивающих примеров такие конструкции на основе нуклеиновой кислоты могут содержать первую 5'-гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность, n повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, вторую 3'-гетерологичную гексануклеотидную фланкирующую последовательность и необязательно репортерный ген устойчивости к лекарственному средству, предпочтительно фланкированный последовательностями распознавания для рекомбиназы. Как показано в примере 1, животное, полученное в результате нацеленной вставки, может содержать в эндогенном локусе вариант конструкции на основе нуклеиновой кислоты, например, где вариант содержит менее n повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и/или отсутствует ген устойчивости к лекарственному средству, см., например, фигуры 1В и 1С. Соответственно, вариант последовательности, включенный в данный документ, предусматривает последовательности, которые фактически идентичны эталонной родительской последовательности, но в которых отсутствует один или более повторов и/или ген(ы) устойчивости к лекарственным средствам.

[000100] «Вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления векторы способны к внехромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они соединены в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные управлять экспрессией функционально связанных генов, называются в данном документе «векторами экспрессии».

[000101] Термин «дикий тип» включает объект, обладающий структурой и/или активностью, обнаруживаемой в природе в «нормальном» (в противоположность мутантному, болезненному, измененному и т.д.) состоянии или окружении. Специалистам в данной области будет понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют в нескольких различных формах (например, аллелях).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[000102] Предусматриваются животные, отличные от человека, характеризующиеся вставкой гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, описанные в данном документе, являются гетерозиготными по модифицированному локусу C9ORF72, описанному в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, описанные в данном документе, содержат первый модифицированный локус C9orf72 и второй модифицированный локус C9orf72, где первый и второй локусы являются разными. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, описанные в данном документе, являются гомозиготными по модифицированному локусу C9ORF72, описанному в данном документе. В некоторых вариантах осуществления у животных, отличных от человека, описанных в данном документе, развивается ALS- и/или FTD-подобное заболевание вследствие наличия гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

[000103] Различные аспекты настоящего изобретения подробно описаны в разделах, следующих ниже. Использование разделов не подразумевает ограничения настоящего изобретения. Каждый раздел можно применять в отношении любого аспекта настоящего изобретения. В данной заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное.

C9ORF72

[000104] Боковой амиотрофический склероз (ALS), также называемый болезнью Лу Герига, является наиболее частым паралитическим нарушением, возникающим у взрослых, характеризующимся потерей верхних и/или нижних двигательных нейронов. ALS зарегистрирован у примерно 20000 человек в Соединенных Штатах, причем ежегодно возникает около 5000 новых случаев. Лобно височная деменция (FTD), изначально названная болезнью Пика в честь врача Арнольда Пика, представляет собой группу нарушений, вызванных прогрессирующей дегенерацией клеток в лобных или височных долях головного мозга. Сообщается, что FTD составляет 10-15% всех случаев деменции. Последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов между (и необязательно охватывающая) экзонами 1а и 1b, двумя некодирующими экзонами гена C90RF72 человека, была связана как с ALS, так и с FTD (DeJesus-Hernandez, М. et al., 2011, Neuron 72:245-256; Renton, A.E. et al., 2011, Neuron 72:257-268; Majounie, E. et al., 2012, Lancet Neurol. 11:323-330; Waite, A.J. et al., 2014, Neurobiol. Aging 35:1779.e5-1779.e13). Подсчитано, что экспансия гексануклеотидных повторов GGGGCC (SEQ ID NO: 1) встречается в приблизительно 50% случаев семейных и во многих случаях ALS несемейного происхождения. Она присутствует приблизительно в 25% случаев семейной FTD и в приблизительно 8% спорадических случаев.

[000105] Сообщалось о множестве патологических аспектов, связанных с последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в C9ORF72, таких как, например, повторное зависимое от длины образование очагов РНК, секвестрация специфических РНК-связывающих белков и накопление и агрегация белков с дипептидными повторами (например, рассматриваемые в Stepto, A. et al., 2014, Acta Neuropathol. 127:377-389; см. также Almeida, S. et al., 2013, Acta Neuropathol. 126:385-399; Bieniek, K.F. et al., 2014, JAMA Neurol. 71(6): 775-781; van Blitterswijk, M. et al., 2014, Mol. Neurodegen. 9:38, 10 pages). Мыши с нокин-мутацией, которые были получены для того, чтобы они содержали гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую 66 повторов гексануклеотидной последовательности (GGGGCC; SEQ ID NO: 1), характеризуются присутствием очагов РНК и дипептидных белковых агрегатов в своих нейронах. Такие мыши характеризовались потерей кортикальных нейронов и проявляли поведенческие и двигательные нарушения в возрасте 6 месяцев (Chew, J. et al., 2015, Science May 14. Pii:aaa9344). Однако механизм, посредством которого такие экспансии повторов вызывают заболевание, будь то в результате мутации с потерей или приобретением функции токсичности, остается неясным. Кроме того, вклад меньшего количества повторов в последовательности, характеризующиеся экспансией гексануклеотидных повторов, в ALS/FTD также неизвестен.

[000106] Хотя сообщалось, что C9ORF72 регулирует эндосомальный перенос (Farg, М.А. et al., 2014, Human Mol. Gen. 23 (13):3579-3595), большая часть клеточной функции C9ORF72 остается неизвестной. В действительности, C9ORF72 представляет собой ген, который кодирует неохарактеризованный белок с неизвестной функцией. Несмотря на отсутствие понимания окружения C9ORF72, было разработано несколько моделей животных, в том числе генетически сконструированных клеточных линий, для изучения ALS и/или FTD (Roberson, E.D., 2012, Ann. Neurol. 72(6):837-849; Panda, S.K. et al., 2013, Genetics 195:703-715; Suzuki, N. et al., 2013, Nature Neurosci. 16(12): 1725-1728; Xu, Z. et al., 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 110(19):7778-7783; Hukema, R.K. et al., 2014, Acta Neuropathol. Comm. 2:166, 4 pages). В другом сообщении говорится о том, что при использовании трансгенной линии мышей, содержащей гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую 80 повторов GGGGCC, функционально связанных с флуоресцентным репортером и контролируемых элементом, чувствительным к тетрациклину, без каких-либо последовательностей, окружающих C9orf72, продемонстрированы нейронные цитоплазматические включения, подобные тем, которые наблюдаются у пациентов с ALS-FTD, и это говорит о том, что повторы с экспансией самой последовательности гексануклеотида GGGGCC могут быть ответственными за заболевание (Hukema, RK et al., 2014, Acta Neuropathol. Comm. 2: 166, 4 pages). Такие мыши были применимы для установления исходного профиля экспрессии C9orf72 в клетках ЦНС и для обеспечения некоторого понимания механизма действия, связанного с экспансией повторов; однако структура конструкции может влиять на фенотип получаемого в результате трансгенного животного (см., например, Muller, U., 1999, Mech. Develop.81:3-21). Например, трансгенная линия мышей, содержащая индуцируемый повтор GGGGCC (Hukema, 2014, выше), была сконструирована без человеческой фланкирующей последовательности, очевидно, ввиду того факта, что такая окружающая последовательность, как полагают, влияет на трансляцию повторяющихся последовательностей. Таким образом, такие системы in vivo, использующие C9ORF72-опосредованную природу для терапевтического применения, являются неполными.

C9ORF72 и последовательности, характеризующиеся экспансией гексануклеотидных повторов

[000107] Мышиные варианты транскрипта C9ORF72 были описаны в данной области (например, Koppers et al., Ann Neurol (2015); 78: 426-438; Atkinson et al., Acta Neuropathologica Communications (2015) 3: 59), а также изображены на фигуре 1А. Геномная информация для трех зарегистрированных вариантов транскрипта C9ORF72 мыши также доступна на веб-сайте Ensembl под обозначениями ENSMUST00000108127 (V1), ENSMUST00000108126 (V2) и ENSMUST00000084724 (V3). Иллюстративная мРНК C9ORF72, отличная от человеческой (например, грызуна), и аминокислотные последовательности изложены в таблице 2. Для последовательностей мРНК жирным шрифтом, заключенным в круглые скобки, обозначена кодирующая последовательность, а последовательные экзоны, если они указаны, разделены чередующимися строчными и прописными буквами. Для аминокислотных последовательностей зрелые полипептидные последовательности, при их указании, выделены жирным шрифтом.

[000108] Варианты транскрипта C9ORF72 человека известны в данной области. В одном варианте транскрипта C9ORF72 человека отсутствуют множественные экзоны в центральном и 3'-кодирующем участках, а его 3'-концевой экзон выходит за пределы сайта сплайсинга, который используется в варианте 3 (см. ниже), что приводит к образованию нового 3'-нетранслируемого участка (UTR) по сравнению с вариантом 3. Этот вариант кодирует значительно более короткий полипептид, а его С-концевая аминокислота отличается от той, которая кодируется двумя другими вариантами. МРНК и аминокислотные последовательности такого варианта можно найти в GenBank под номерами доступа NM_145005.6 и NP_659442.2 соответственно и тем самым они включены в данный документ посредством ссылки. Последовательности NM_145005.6 и NP_659442.2 соответственно изложены под SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Второй вариант транскрипта C9ORF72 человека (2) отличается в 5'-нетранслируемом участке (UTR) по сравнению с вариантом 3. МРНК и аминокислотные последовательности такого варианта можно найти в GenBank под номерами доступа NM_018325.4 и NP_060795.1 соответственно и тем самым они включены в данный документ посредством ссылки. Последовательности NM_018325.4 и NP_060795.1 соответственно изложены под SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. Третий вариант человеческого транскрипта C9ORF72 (3) содержит самую длинную последовательность среди трех зарегистрированных вариантов и кодирует более длинную изоформу. МРНК и аминокислотные последовательности такого варианта можно найти в GenBank под номерами доступа NM_001256054.2 и NP_001242983.1 соответственно и тем самым они включены в данный документ посредством ссылки. Последовательности NM_001256054.2 и NP_001242983.1 соответственно изложены под SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15. Варианты 2 и 3 кодируют один и тот же белок.

[000109] Последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, как правило, представляет собой нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один экземпляр, например, один повтор гексануклеотидной последовательности GGGGCC, изложенной под SEQ ID NO: 1. С целью вставки в эндогенный локус C9orf72, отличный от человеческого, гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере одну копию (повтор) и предпочтительно более одной копии (повтора) гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, и может быть идентичной или практически идентичной последовательности геномной нуклеиновой кислоты, охватывающей (но необязательно включающей) некодирующие экзоны 1а и 1b 'открытой рамки считывания 72 хромосомы 9' человека (C9orf72) или ее части. Неограничивающие примеры гетерологичных последовательностей, характеризующихся экспансией гексануклеотидов, включают последовательности, изложенные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 (содержащие три повтора гексануклеотидной последовательности GGGGCC) и SEQ ID NO: 3 (содержащая 100 повторов гексануклеотидной последовательности GGGGCC).

Нацеливающие на C9ORF72 векторы и получение животных, отличных от человека, характеризующихся гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенной в локус C9ORF72

[000110] В данном документе представлены нацеливающие векторы или нацеливающие конструкции для получения животных, отличных от человека, характеризующихся гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидов, встроенной в эндогенный локус C9ORF72, описанный в данном документе.

А. Крупные нацеливающие векторы

[000111] В клетках, отличных от эмбрионов одноклеточной стадии, можно использовать нацеливающий вектор, который представляет собой «крупный нацеливающий вектор» или «LTVEC», который включает нацеливающие векторы, содержащие плечи гомологии, которые соответствуют и получены из последовательностей нуклеиновых кислот, более крупных, чем последовательности обычно используемые в других подходах, предназначенных для осуществления гомологичной рекомбинации в клетках. LTVEC также включают нацеливающие векторы, содержащие вставки нуклеиновых кислот, имеющие последовательности нуклеиновых кислот, более крупные по размеру, чем те, которые обычно используют в других подходах, предназначенных для осуществления гомологичной рекомбинации в клетках. Например, LTVEC делают возможным модификацию крупных локусов, в отношении которых не могут быть применены традиционные нацеливающие векторы на основе плазмиды из-за их ограничений по размеру. Например, целевой локус может представлять собой, т.е. 5'- и 3'-плечи гомологии могут соответствовать локусу клетки, на который нельзя целенаправленно воздействовать с применением традиционных способов или на который можно целенаправленно воздействовать или некорректно, или лишь со значительно низкой эффективностью в отсутствие однонитевого разрыва или двухнитевого разрыва, индуцированного нуклеазным средством (например, белком Cas).

[000112] Нацеливающий вектор включает плечи гомологии. Если нацеливающий вектор также содержит вставку нуклеиновой кислоты, то плечи гомологии могут фланкировать вставку нуклеиновой кислоты. Для простоты поиска плечи гомологии упоминаются в данном документе как 5'- и 3'- (то есть, выше и ниже по ходу транскрипции) плечи гомологии. Эта терминология относится к относительному положению плеч гомологии относительно вставки нуклеиновой кислоты в матрице экзогенной репарации. 5'- и 3'-плечи гомологии соответствуют участкам в представляющем интерес участке генома, которые соответственно упоминаются в данном документе как «целевая 5'-последовательность» и « целевая 3'-последовательность».

[000113] Плечо гомологии и целевая последовательность «соответствуют» или «являются соответствующими» друг другу, если два участка области имеют достаточный уровень идентичности последовательностей друг с другом, чтобы действовать в качестве субстратов для реакции гомологичной рекомбинации. Термин «гомология» включает последовательности ДНК, которые либо идентичны, либо обладают идентичностью последовательности с соответствующей последовательностью. Идентичность последовательности между указанной целевой последовательностью и соответствующим плечом гомологии, выявленным в матрице экзогенной репарации, может представлять любую степень идентичности последовательностей, которая обеспечивает возникновение гомологичной рекомбинации. Например, величина идентичности последовательности между плечом гомологии матрицы экзогенной репарации (или ее фрагмента) и целевой последовательностью (или ее фрагмента), может составлять по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательностей, поэтому последовательности подвергаются гомологичной рекомбинации. Соответствующий участок гомологии между плечом гомологии и соответствующей целевой последовательностью может иметь любую длину, достаточную для активации гомологичной рекомбинации. Плечи гомологии могут быть симметричными (каждое приблизительно одинакового размера в длину) или они могут быть асимметричными (одно длиннее другого).

[000114] Плечи гомологии могут соответствовать локусу, который является нативным для клетки (например, целевой локус). Альтернативно, например, они могут соответствовать участку гетерологичного или экзогенного сегмента ДНК, которая была интегрирована в геном клетки, в том числе, например, трансгены, кассеты экспрессии или гетерологичные или экзогенные участки ДНК. Альтернативно плечи гомологии нацеливающего вектора могут соответствовать участку искусственной хромосомы дрожжей (YAC), бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), искусственной хромосомы человека или любому другому сконструированному участку, содержащемуся в соответствующей клетке-хозяине. Кроме того, плечи гомологии нацеливающего вектора могут соответствовать или быть получены из участка библиотеки ВАС, космидной библиотеки или библиотеки фагов Р1 или могут быть получены из синтетической ДНК.

[000115] Примеры LTVEC включают векторы, полученные из бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), искусственной хромосомы человека или искусственной хромосомы дрожжей (YAC). Неограничивающие примеры LTVEC и способы их получения описаны, например, в патентах США №№6586251; 6596541 и 7105348; и в WO 2002/036789, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. LTVEC могут быть в линейной форме или циклической форме.

[000116] LTVEC могут быть любой длины и обычно имеют длину, составляющую по меньшей мере 10 т.о. Например, размер LTVEC может составлять от приблизительно 50 т.о. до приблизительно 500 т.о., от приблизительно 50 т.о. до приблизительно 75 т.о., от приблизительно 75 т.о. до приблизительно 100 т.о., от приблизительно 100 т.о. до приблизительно 125 т.о., от приблизительно 125 т.о. до приблизительно 150 т.о., от приблизительно 150 т.о. до приблизительно 175 т.о., от приблизительно 175 т.о. до приблизительно 200 т.о., от приблизительно 200 т.о. до приблизительно 225 т.о., от приблизительно 225 т.о. до приблизительно 250 т.о., от приблизительно 250 т.о. до приблизительно 275 т.о., от приблизительно 275 т.о. до приблизительно 300 т.о., от приблизительно 300 т.о. до приблизительно 325 т.о., от приблизительно 325 т.о. до приблизительно 350 т.о., от приблизительно 350 т.о. до приблизительно 375 т.о., от приблизительно 375 т.о. до приблизительно 400 т.о., от приблизительно 400 т.о. до приблизительно 425 т.о., от приблизительно 425 т.о. до приблизительно 450 т.о., от приблизительно 450 т.о. до приблизительно 475 т.о. или от приблизительно 475 т.о. до приблизительно 500 т.о. Альтернативно размер LTVEC может составлять по меньшей мере 10 т.о., по меньшей мере 15 т.о., по меньшей мере 20 т.о., по меньшей мере 30 т.о., по меньшей мере 40 т.о., по меньшей мере 50 т.о., по меньшей мере 60 т.о., по меньшей мере 70 т.о., по меньшей мере 80 т.о., по меньшей мере 90 т.о., по меньшей мере 100 т.о., по меньшей мере 150 т.о., по меньшей мере 200 т.о., по меньшей мере 250 т.о., по меньшей мере 300 т.о., по меньшей мере 350 т.о., по меньшей мере 400 т.о., по меньшей мере 450 т.о., по меньшей мере 500 т.о. или больше. Размер LTVEC может быть слишком большим, чтобы обеспечить возможность скрининга событий нацеливания с помощью традиционных анализов, например, посредством блоттинга по Саузерну и ПЦР длинных фрагментов (например, от 1 т.о. до 5 т.о.).

[000117] Общий размер 5'-плеча гомологии и 3'-плеча гомологии в LTVEC обычно составляет по меньшей мере 10 т.о. В качестве примера размер 5'-плеча гомологии может составлять в диапазоне от приблизительно 5 т.о. до приблизительно 150 т.о., и/или размер 3'-плеча гомологии может составлять в диапазоне от приблизительно 5 т.о. до приблизительно 150 т.о. Размер каждого плеча гомологии может составлять, например, от приблизительно 5 т.о. до приблизительно 10 т.о., от приблизительно 10 т.о. до приблизительно 20 т.о., от приблизительно 20 т.о. до приблизительно 30 т.о., от приблизительно 30 т.о. до приблизительно 40 т.о., от приблизительно 40 т.о. до приблизительно 50 т.о., от приблизительно 50 т.о. до приблизительно 60 т.о., от приблизительно 60 т.о. до приблизительно 70 т.о., от приблизительно 70 т.о. до приблизительно 80 т.о., от приблизительно 80 т.о. до приблизительно 90 т.о., от приблизительно 90 т.о. до приблизительно 100 т.о., от приблизительно 100 т.о. до приблизительно 110 т.о., от приблизительно 110 т.о. до приблизительно 120 т.о., от приблизительно 120 т.о. до приблизительно 130 т.о., от приблизительно 130 т.о. до приблизительно 140 т.о., от приблизительно 140 т.о. до приблизительно 150 т.о., от приблизительно 150 т.о. до приблизительно 160 т.о., от приблизительно 160 т.о. до приблизительно 170 т.о., от приблизительно 170 т.о. до приблизительно 180 т.о., от приблизительно 180 т.о. до приблизительно 190 т.о. или от приблизительно 190 т.о. до приблизительно 200 т.о. Общий размер 5'-плеча гомологии и 3'-плеча гомологии может составлять, например, от приблизительно 10 т.о. до приблизительно 20 т.о., от приблизительно 20 т.о. до приблизительно 30 т.о., от приблизительно 30 т.о. до приблизительно 40 т.о., от приблизительно 40 т.о. до приблизительно 50 т.о., от приблизительно 50 т.о. до приблизительно 60 т.о., от приблизительно 60 т.о. до приблизительно 70 т.о., от приблизительно 70 т.о. до приблизительно 80 т.о., от приблизительно 80 т.о. до приблизительно 90 т.о., от приблизительно 90 т.о. до приблизительно 100 т.о., от приблизительно 100 т.о. до приблизительно 110 т.о., от приблизительно 110 т.о. до приблизительно 120 т.о., от приблизительно 120 т.о. до приблизительно 130 т.о., от приблизительно 130 т.о. до приблизительно 140 т.о., от приблизительно 140 т.о. до приблизительно 150 т.о., от приблизительно 150 т.о. до приблизительно 160 т.о., от приблизительно 160 т.о. до приблизительно 170 т.о., от приблизительно 170 т.о. до приблизительно 180 т.о., от приблизительно 180 т.о. до приблизительно 190 т.о., от приблизительно 190 т.о. до приблизительно 200 т.о., от приблизительно 200 т.о. до приблизительно 250 т.о., от приблизительно 250 т.о. до приблизительно 300 т.о., от приблизительно 300 т.о. до приблизительно 350 т.о. или от приблизительно 350 т.о. до приблизительно 400 т.о. Альтернативно, размер каждого плеча гомологии может составлять по меньшей мере 5 т.о., по меньшей мере 10 т.о., по меньшей мере 15 т.о., по меньшей мере 20 т.о., по меньшей мере 30 т.о., по меньшей мере 40 т.о., по меньшей мере 50 т.о., по меньшей мере 60 т.о., по меньшей мере 70 т.о., по меньшей мере 80 т.о., по меньшей мере 90 т.о., по меньшей мере 100 т.о., по меньшей мере 110 т.о., по меньшей мере 120 т.о., по меньшей мере 130 т.о., по меньшей мере 140 т.о., по меньшей мере 150 т.о., по меньшей мере 160 т.о., по меньшей мере 170 т.о., по меньшей мере 180 т.о., по меньшей мере 190 т.о. или по меньшей мере 200 т.о. Аналогично общий размер 5-' и 3'-плеча гомологии может составлять по меньшей мере 10 т.о., по меньшей мере 15 т.о., по меньшей мере 20 т.о., по меньшей мере 30 т.о., по меньшей мере 40 т.о., по меньшей мере 50 т.о., по меньшей мере 60 т.о., по меньшей мере 70 т.о., по меньшей мере 80 т.о., по меньшей мере 90 т.о., по меньшей мере 100 т.о., по меньшей мере 110 т.о., по меньшей мере 120 т.о., по меньшей мере 130 т.о., по меньшей мере 140 т.о., по меньшей мере 150 т.о., по меньшей мере 160 т.о., по меньшей мере 170 т.о., по меньшей мере 180 т.о., по меньшей мере 190 т.о., по меньшей мере 200 т.о., по меньшей мере 250 т.о., по меньшей мере 300 т.о., по меньшей мере 350 т.о. или по меньшей мере 400 т.о.

[000118] LTVEC могут содержать вставки нуклеиновых кислот, имеющие последовательности нуклеиновых кислот, большие по размеру, чем те, которые обычно используют в других подходах, предназначенных для осуществления гомологичной рекомбинации в клетках. Например, LTVEC может содержать вставку нуклеиновой кислоты размером в диапазоне от приблизительно 1 т.о. до приблизительно 5 т.о., от приблизительно 5 т.о. до приблизительно 10 т.о., от приблизительно 10 т.о. до приблизительно 20 т.о., от приблизительно 20 т.о. до приблизительно 40 т.о., от приблизительно 40 т.о. до приблизительно 60 т.о., от приблизительно 60 т.о. до приблизительно 80 т.о., от приблизительно 80 т.о. до приблизительно 100 т.о., от приблизительно 100 т.о. до приблизительно 150 т.о., от приблизительно 150 т.о. до приблизительно 200 т.о., от приблизительно 200 т.о. до приблизительно 250 т.о., от приблизительно 250 т.о. до приблизительно 300 т.о., от приблизительно 300 т.о. до приблизительно 350 т.о., от приблизительно 350 т.о. до приблизительно 400 т.о., от приблизительно 400 т.о. до приблизительно 450 т.о., от приблизительно 450 т.о. до приблизительно 500 т.о. или больше. Альтернативно размер вставки нуклеиновой кислоты может составлять по меньшей мере 1 т.о., по меньшей мере 5 т.о., по меньшей мере 10 т.о., по меньшей мере 20 т.о., по меньшей мере 30 т.о., по меньшей мере 40 т.о., по меньшей мере 60 т.о., по меньшей мере 80 т.о., по меньшей мере 100 т.о., по меньшей мере 150 т.о., по меньшей мере 200 т.о., по меньшей мере 250 т.о., по меньшей мере 300 т.о., по меньшей мере 350 т.о., по меньшей мере 400 т.о., по меньшей мере 450 т.о. или по меньшей мере 500 т.о.

В. Конструирование крупных нацеливающих векторов

[000119] Многие из методик, используемых для конструирования нацеливающих векторов, описанных в данном документе, представляют собой стандартные методики молекулярной биологии, хорошо известные специалисту в данной области (см., например, Sambrook, J., Е. F. Fritsch and Т. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1, 2, and 3, 1989; Current Protocols in, Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Для конструирования крупных нацеливающих векторов могут быть использованы любые способы, известные в данной области.

[000120] В одном примере способ конструирования крупного нацеливающего вектора (LTVEC) предусматривает: (а) получение крупного клона геномной ДНК, содержащего представляющие интерес ген/гены или хромосомный локус/локусы, и (b) присоединение гомологичных фрагментов 1 и 2 к кассете модификации с получением LTVEC. Необязательно такие способы могут дополнительно предусматривать проверку правильности конструирования каждого LTVEC. Необязательно такие способы могут дополнительно предусматривать очистку, подготовку и линеаризацию ДНК LTVEC для введения в эукариотические клетки. Такие способы дополнительно описаны в US 2004/0018626, US 2013/0309670 и WO 2013/163394, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[000121] Гены или локусы, представляющие интерес, могут быть выбраны на основании определенных критериев, таких как подробные структурные или функциональные данные, или они могут быть выбраны в отсутствие такой подробной информации, поскольку потенциальные гены или фрагменты генов становятся прогнозируемыми за счет усилий различных проектов секвенирования генома. Для получения LTVEC отсутствует необходимость в знании полной последовательности и генной структуры представляющих интерес гена или локуса. Единственная требуемая информация о последовательности представляет собой приблизительно 80-100 нуклеотидов для получения представляющего интерес геномного клона, а также для создания гомологичных фрагментов, используемых в создании LTVEC, и для создания зондов для применения в количественном анализе модификации аллеля (МОА).

[000122] После выбора представляющих интерес гена или локуса можно получить крупный геномный клон, содержащий указанный ген или локус. Данный клон можно получить с помощью любого из нескольких способов, в том числе без ограничения, скрининга подходящих библиотек ДНК (например, ВАС, РАС, YAC или космид) посредством стандартных методик гибридизации или ПЦР или с помощью любых других способов, известных специалисту.

[000123] Гомологичные фрагменты маркируют сайты бактериальной гомологичной рекомбинации, которые используются для получения LTVEC из крупных клонированных геномных фрагментов. Гомологичные фрагменты представляют собой короткие сегменты ДНК, как правило, двухнитевые и длиной по меньшей мере 40 нуклеотидов, которые гомологичны участкам в пределах крупного клонированного геномного фрагмента, фланкирующего участок, подлежащий модификации. Гомологичные фрагменты прикрепляются к кассете для модификации, так что после гомологичной рекомбинации в бактериях кассета для модификации заменяет участок, подлежащий модификации. Методика создания нацеливающего вектора с применением бактериальной гомологичной рекомбинации может быть выполнена в различных системах (см., например, Yang et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:859-865, Muyrers et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:1555-1557; Angrand et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:e16; Narayanan et al. (1999) Gene Ther. 6:442-447; Yu, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:5978-5983, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). Одним из примеров такой технологии является клонирование ЕТ (см., например, Zhang et al. (1998) Nat. Genet. 20:123-128; Narayanan et al. (1999) Gene Ther. 6:442-447, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей) и вариации такой технологии (см., например, Yu et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:5978-5983, включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). ЕТ относится к белкам recE и recT, которые осуществляют реакцию гомологичной рекомбинации. RecE представляет собой экзонуклеазу, которая обрезает одну нить линейной двухнитевой ДНК в направлении от 5' к 3', оставляя после себя линейный двухнитевой фрагмент с 3'-однонитевым липким концом. Этот однонитевой липкий конец покрыт белком recT, который обладает активностью связывания однонитевой ДНК (ssDNA). Клонирование ЕТ проводят с использованием Е. coli, которая временно экспрессирует генные продукты Е. coli recE и recT и белок λgam бактериофага лямбда (λ). Белок λgam защищает фрагмент донорской ДНК от разрушения системой экзонуклеазы recBC и является предпочтительным для эффективного клонирования ЕТ в хозяевах recBC⁺, таких как часто используемый штамм Е. culi DH10b.

[000124] LTVEC также могут быть получены с помощью способов сборки ДНК, таких как способы сборки ДНК in vitro, в том числе сборки ДНК по Гибсона или модификации сборки ДНК по Гибсону. См., например, US 2015/0376628, US 2016/0115486, WO 2015/200334 и US 2010/0035768, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[000125] В традиционных способах сборки нуклеиновых кислот используют длительные стадии стандартного ферментативного расщепления рестрикционными ферментами, клонирования нуклеиновых кислот и лигирования нуклеиновых кислот друг с другом. Данные способы усложняются в случае сборки крупных фрагментов или векторов. Однако можно использовать преимущество пластичности целевой специфичности нуклеаз (например, направляющих РНК и нуклеаз Cas9) для превращения нуклеиновых кислот в форму, подходящую для использования в реакциях быстрой сборки. См., например, US 2015/0376628, US 2016/0115486 и US 2015/200334, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[000126] Любые представляющие интерес молекулы ДНК, имеющие перекрывающиеся последовательности, могут быть собраны с помощью таких способов, в том числе ДНК, которые существуют в природе, клонированные молекулы ДНК, синтетически полученные ДНК и так далее. Сборка двух нуклеиновых кислот включает любой способ соединения нитей двух нуклеиновых кислот. Например, сборка включает соединение расщепленных нуклеиновых кислот таким образом, что нити каждой нуклеиновой кислоты подвергаются отжигу с другой и удлинению, при этом каждая нить служит матрицей для удлинения другой.

[000127] Для сборки нуклеиновых кислот можно использовать любые in vitro или in vivo способы сборки ДНК или быстрые комбинаторные способы. Например, первая и вторая нуклеиновые кислоты, имеющие перекрывающиеся концы, могут быть объединены с помощью лигазы, экзонуклеазы, ДНК-полимераы и нуклеотидов и инкубированы при постоянной температуре, при такой как 50°С. В частности, экзонуклеаза Т5 может быть использована для удаления нуклеотидов с 5'-концов ДНК, продуцирующих комплементарные липкие концы. Затем комплементарные одноцепочечные ДНК-выступающие участки можно подвергать отжигу, ДНК-полимеразу можно использовать для заполнения бреши, a Taq ДНК-лигазу можно использовать для сшивания получающихся разрывов при 50°С. Таким образом, две нуклеиновые кислоты, имеющие общие перекрывающиеся концевые последовательности, могут быть объединены в ковалентно сшитую молекулу в одностадийной изотермической реакции. См., например, Gibson et al. (2009) Nature Methods 6(5): 343-345, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[000128] Сайт-направленные нуклеазные средства (например, направляющие РНК-направленные белки Cas) позволяют быстро и эффективно комбинировать нуклеиновые кислоты путем отбора и манипулировании с концевыми последовательностями, получаемыми посредством их эндонуклеазной активности. Например, с помощью способов сборки ДНК можно объединять первый полинуклеотид с нуклеазным средством (например, комплексом gRNA-Cas), специфичным для требуемого целевого сайта и экзонуклеазы. Целевой сайт может быть выбран таким образом, что когда нуклеаза расщепляет нуклеиновую кислоту, то полученные концы, полученные в ходе расщепления, имеют участки, комплементарные концам второй нуклеиновой кислоты, подлежащие сборке с первой нуклеиновой кислотой (например, перекрывающиеся концы). Эти комплементарные концы можно затем подвергнуть сборке с получением единой собранной нуклеиновой кислоты. Поскольку нуклеазное средство (например, комплекс gRNA-Cas) специфично для отдельного целевого сайта, способ позволяет модифицировать нуклеиновые кислоты точным сайт-направленным способом. Путем выбора нуклеазного средства (например, комплекса gRNA-Cas), специфичного для целевого сайта, за счет чего при расщеплении образуются концевые последовательности, комплементарные последовательностям второй нуклеиновой кислоты, изотермическую сборку можно использовать для сборки получаемой расщепленной нуклеиновой кислоты. Таким образом, путем выбора нуклеиновых кислот и нуклеазных средств (например, комплексов gRNA-Cas), которые приводят к образованию перекрывающихся концевых последовательностей, нуклеиновые кислоты могут быть подвергнуты сборке с помощью быстрых комбинаторных способов с получением конечной собранной нуклеиновой кислоты быстрым и эффективным способом. Альтернативно нуклеиновые кислоты, не имеющие комплементарных концов, могут быть собраны с помощью соединительных олигонуклеотидов, разработанных, чтобы содержать комплементарные концы к каждой нуклеиновой кислоте. При использовании соединительных олигонуклеотидов две или более нуклеиновых кислот могут быть последовательно собраны, за счет чего сокращается количество ненужных последовательностей в полученной собранной нуклеиновой кислоте.

[000129] Затем может быть проведена проверка на предмет того, правильно ли сконструирован LTVEC. Например, для проверки новых соединений, созданных с помощью введения донорского фрагмента в представляющий интерес ген или хромосомный локус можно применять диагностическую ПЦР. Альтернативно или дополнительно может быть проведено диагностическое расщепление рестриктазой, чтобы удостовериться, что в ходе процесса гомологичной рекомбинации бактерий в LTVEC были введены только требуемые модификации. Альтернативно или дополнительно может быть выполнено прямое секвенирование LTVEC, в частности участков, охватывающих сайт модификации, для проверки новых соединений, созданных посредством введения донорного фрагмента в представляющий интерес ген или хромосомный локус.

[000130] После очистки любого типа и дальнейшей подготовки ДНК LTVEC для введения в эукариотические клетки LTVEC предпочтительно линеаризуют таким образом, что остается модифицированный эндогенный ген или ДНК хромосомного локуса, фланкированные длинными плечами гомологии. Это может быть достигнуто путем линеаризации LTVEC, предпочтительно в основной цепи вектора, посредством любой подходящей редко-расщепляющей рестриктазы. Примеры подходящих рестриктаз включают NotI, Pad, SfiI, SrfI, Swal, FseI и так далее. Выбор рестриктазы может быть определен экспериментально (то есть путем тестирования нескольких различных кандидатных редко режущих ферментов) или, если известна последовательность LTVEC, путем анализа последовательности и выбора подходящей рестриктазы на основе анализа.

С. C9orf72-HRE-конструкции на основе нуклеиновых кислот

[000131] Последовательности ДНК можно применять для получения LTVEC для животных с нокином (например, C9ORF72-HRE). Как правило, молекулу полинуклеотида (например, вставочную нуклеиновую кислоту), содержащую последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидов, и/или селектируемый маркер, встраивают в вектор, предпочтительно ДНК-вектор, для того, чтобы реплицировать молекулу полинуклеотида в подходящей клетке-хозяине.

[000132] Молекула полинуклеотида (или вставочная нуклеиновая кислота) содержит сегмент ДНК, необходимый для интеграции в целевой локус. В некоторых вариантах осуществления вставочная нуклеиновая кислота содержит один или более полинуклеотидов, представляющих интерес. В некоторых вариантах осуществления вставочная нуклеиновая кислота содержит одну или более кассет экспрессии. В некоторых определенных вариантах осуществления кассета экспрессии содержит полинуклеотид, представляющий интерес, полинуклеотид, кодирующий селективный маркер и/или репортерный ген вместе с, в некоторых определенных вариантах осуществления, различными регуляторными компонентами, воздействующими на экспрессию. Практически любой полинуклеотид, представляющий интерес, может быть помещен во вставочную нуклеиновую кислоту и тем самым интегрирован в целевой геномный локус. Способы, раскрытые в данном документе, предусматривают по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более полинуклеотидов, представляющих интерес, подлежащих интеграции в целевой геномный локус C9ORF72.

[000133] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, содержащийся во вставочной нуклеиновой кислоте, кодирует репортер. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, кодирует селектируемый маркер.

[000134] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, фланкирован сайтами для сайт-специфической рекомбинации (например, loxP, Frt и т.д.) или содержит их. В некоторых определенных вариантах осуществления сайты для сайт-специфической рекомбинации фланкируют сегмент ДНК, кодирующий репортер, и/или сегмент ДНК, кодирующий селектируемый маркер. В данном документе описаны иллюстративные полинуклеотиды, представляющие интерес, в том числе селективные маркеры и репортерные гены, которые можно включать во вставочные нуклеиновые кислоты.

[000135] Различные способы, используемые в получении плазмид, ДНК-конструкций и/или нацеливающих векторов и трансформации организмов-хозяев, известны из уровня техники. Другие подходящие систем экспрессии, подходящие как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также общие процедуры рекомбинации см. в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.

[000136] Как описано выше, иллюстративные отличные от человеческих (например, грызуна) последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности C9ORF72 для применения в конструировании нацеливающих векторов для животных, отличных от человека, содержащих нокин, представлены в таблице 2. Другие последовательности C9ORF72, отличные от человеческих, также можно найти в базе данных GenBank. Нацеливающие векторы C9ORF72, описанные в данном документе, содержат гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, и необязательно одну или более последовательностей, кодирующих репортерный ген и/или селектируемый маркер, фланкированные последовательностями, которые идентичны или фактически гомологичны фланкирующим последовательностям целевого участка (также называемыми как «плечи гомологии») для вставки в геном трансгенного животного, отличного от человека.

[000137] В качестве одного примера исходная точка вставки может быть расположена выше (5'), внутри или ниже (3') первого экзона, например, первого некодирующего экзона для обеспечения функционального связывания вставочной нуклеиновой кислоты с эндогенной регуляторной последовательностью (например, промотором). Стратегия нацеливания для создания целевой вставки гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, представлена на фиг. 1В и фиг. 1С. Селекционная кассета устойчивости к лекарственным средствам фланкирована сайтами распознавания для рекомбиназы loxP (LP), которые обеспечивают Cre-опосредованное вырезание селекционной кассеты устойчивости к лекарственным средствам. За счет этого обеспечивается, помимо прочего, вырезание селекционной кассеты. Таким образом, перед фенотипическим анализом селекционную кассету устойчивости к лекарственным средствам можно удалить, оставив только гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, а в некоторых вариантах осуществления одну копию сайта для распознавания для рекомбиназы.

[000138] В данном документе раскрыты конструкции нуклеиновых кислот, применимые для модифицированных аллелей C9orf72 мыши, изображенных на фиг. 1В и 1С, где конструкции нуклеиновых кислот содержат последовательности, изложенные под SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 8 содержит в направлении от 5' к 3: 5'-плечо гомологии (SEQ ID NO: 20), человеческую последовательность размером 962 п.о. охватывающую и включающую часть экзона 1а и весь экзон 1b гена C9orf72 человека (SEQ ID NO: 2), кассету устойчивости к неомицину, фланкированную 1охР и содержащую ген устойчивости к неомицину под контролем промотора убиквитина 1 и/или Em7 человека (SEQ ID NO 21), а также 3'-плечо гомологии (SEQ ID NO: 22). SEQ ID NO: 9 содержит в направлении от 5' к 3': 5'-плечо гомологии (SEQ ID NO: 23), человеческую последовательность размером 1261 п.о. охватывающую и включающую часть экзона 1а и весь экзон 1b гена C9orf72 человека (SEQ ID NO: 3), кассету устойчивости к неомицину, фланкированную 1охР и содержащую ген устойчивости к неомицину под контролем промотора убиквитина 1 и/или Em7 человека (SEQ ID NO 24), а также 3'-плечо гомологии (SEQ ID NO: 25).

[000139] Как описано в данном документе, вставка гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенный локус C9orf72 может содержать замену или вставку/добавление в локус C9orf72 или его части посредством вставочной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вставочная нуклеиновая кислота содержит репортерный ген. В некоторых определенных вариантах осуществления репортерный ген располагается в функциональной связи с эндогенным промотором C9orf72. Такая модификация обеспечивает возможность экспрессии репортерного гена, контролируемой эндогенным промотором C9orf72. В качестве альтернативы репортерный ген не размещают в функциональной связи с эндогенным промотором C9orf72.

[000140] Множество репортерных генов (или детектируемых фрагментов) можно использовать в нацеливающих векторах, описанных в данном документе. Иллюстративные репортерные гены включают, например, β-галактозидазу (кодируемую геном lacZ), зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), MmGFP, синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), Emerald, CyPet, голубой флуоресцентный белок (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию. Способы, описанные в данном документе, демонстрируют конструкцию нацеливающего вектора, в которой задействовано применение репортерного гена lacZ, кодирующего β-галактозидазу, однако специалистам в данной области при ознакомлении с настоящим изобретением будет понятно, что животных, отличных от человека, описанных в данном документе, можно создавать при отсутствии репортерного гена или с любым репортерным геном, известным из уровня техники.

[000141] При необходимости кодирующий участок генетического материала или полинуклеотидной(полинуклеотидных) последовательности(последовательностей), кодирующую полный или неполный репортерный полипептид, можно модифицировать с тем, чтобы она включала ко доны, оптимизированные для экспрессии в животном, отличном от человека (см., например, патенты США №№5670356 и 5874304). Кодон-оптимизированные последовательности представляют собой синтетические последовательности и предпочтительно кодируют полипептид (или биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида, обладающий фактически такой же активностью, как и полноразмерный полипептид), идентичный кодируемому исходным полинуклеотидом, не являющимся кодон-оптимизированным. В некоторых вариантах осуществления кодирующий участок генетического материала, кодирующий полный или неполный репортерный полипептид (например, lacZ), может включать измененную последовательность для оптимизации частоты использования кодонов в отношении конкретного типа клеток (например, клетки грызуна). Например, кодоны репортерного гена, которые должны быть встроены в геном животного, отличного от человека (например, грызуна), можно оптимизировать для экспрессии в клетке животного, отличного от человека. Такая последовательность может быть описана как кодон-оптимизированная последовательность.

[000142] Предусматриваются композиции и способы получения животных, отличных от человека, которые содержат вставку, представляющую собой гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, с разрушением в эндогенном локусе C9ORF72, описанном в данном документе, в том числе композиции и способы получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, например, под контролем промотора C9ORF72, например, эндогенного промотора мыши, и регуляторной последовательности C9ORF72, например, человеческой регуляторной последовательности, например, выявленной в экзонах 1а и 1b. В некоторых вариантах осуществления также предусматриваются композиции и способы получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, под контролем эндогенного промотора и эндогенной регуляторной последовательности. Способы включают вставку нацеливающего вектора, описанного в данном документе, кодирующего гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в геном животного, отличного от человека, за счет чего некодирующая последовательность локуса C9ORF72 удаляется полностью или частично. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, содержит эндогенный локус C9ORF72, который содержит нацеливающий вектор, описанный в данном документе.

[000143] Нацеливающие векторы, описанные в данном документе, могут быть введены в ES-клетки и подвергнуты скринингу в отношении клонов ES, несущих разрушение в локусе C9orf72, что описано в Frendewey, D., et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307. В способах и композициях, раскрытых в данном документе, можно использовать множество эмбрионов-хозяев. Например, плюрипотентные и/или тотипотентные клетки, имеющие целевую генетическую модификацию, можно вводить в эмбрион на стадии развития, предшествующей моруле (например, эмбрион на стадии 8 клеток), из соответствующего организма. См., например, US 7576259, US 7659442, US 7294754 и US 2008/0078000 A1, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В других случаях донорные ES-клетки можно имплантировать в эмбрион-хозяин на стадии 2 клеток, стадии 4 клеток, стадии 8 клеток, стадии 16 клеток, стадии 32 клеток или стадии 64 клеток. Эмбрионом-хозяином также может быть бластоциста или может быть эмбрион на стадии развития, предшествующей бластоцисте, эмбрион на стадии развития, предшествующей моруле, эмбрион на стадии развития морулы, эмбрион на стадии развития неуплотненной морулы или эмбрион на стадии развития уплотненной морулы.

[000144] В некоторых вариантах осуществления можно применять способ VELOCIMOUSE® (Poueymirou, W.T. et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99) для введения положительных ES-клеток в эмбрион на стадии 8 клеток с целью создания поколения F0 гетерозиготных мышей, полностью произошедших из ES-клеток, готовых для анализа профиля экспрессии lacZ или скрещивания для получения гомозиготности. В примере 1 предусматриваются иллюстративные способы получения животных, отличных от человека, имеющих разрушенный локус C9orf72.

[000145] Способы получения трансгенных животных, отличных от человека, в том числе с помощью нокаутов и нокинов, хорошо известны в данной области (см., например, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Например, получение трансгенных грызунов может необязательно предусматривать разрушение генетических локусов эндогенного гена грызуна и введение репортерного гена в геном грызуна, в некоторых вариантах осуществления в том же местоположении, что и эндогенный ген грызуна.

[000146] Схематическая иллюстрация (без соблюдения масштаба) геномной организации C9orf72 мыши приведена на фигуре 1А (верхний прямоугольник). Иллюстративная стратегия целенаправленного воздействия для замены некодирующей последовательности эндогенного локуса C9orf72 мыши на гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, также представлена на фиг. 1А (нижний прямоугольник). Как показано, геномная ДНК, находящаяся между экзоном 1 и стартовым кодоном ATG, или ее часть, заменяется гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, и селекционной кассетой устойчивости к лекарственным средствам, фланкированной сайт-специфическими сайтами для распознавания для рекомбиназы. Нацеливающий вектор, используемый в данной стратегии, может необязательно включать последовательность, кодирующую рекомбиназу, которая функционально связана с регулируемым в процессе развития промотором, за счет чего рекомбиназа экспрессируется в недифференцированных клетках. Иллюстративные регулируемые в процессе развития промоторы, которые можно включать в нацеливающие векторы, описанные в данном документе, приведены в таблице 3. Дополнительные подходящие промоторы, которые можно использовать в нацеливающих векторах, описанных в данном документе, включают промоторы, описанные в патентах США №№8697851, 8518392 и 8354389; все из которых включены в данный документ посредством ссылки. При гомологичной рекомбинации некодирующую последовательность, размером, например, примерно 800-1000 п.о., простирающуюся от экзона 1 (или в пределах экзона 1) до экзона 2 эндогенного локуса C9orf72 мыши, заменяют последовательностью, содержащейся в нацеливающем векторе. Селекционную кассету устойчивости к лекарственным средствам можно удалять, например, необязательно посредством способа, зависимого от развития, т.е. у потомства, происходящего от мышей, клетки зародышевой линии которых содержат разрушенный локус C9orf72, описанный выше, будет утрачиваться селектируемый маркер из дифференцированных клеток в ходе развития (см., патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, все из которых включены в данный документ посредством ссылки).

D. Введение LTVEC в клетки

[000147] ДНК LTVEC может быть введена в эукариотические клетки с использованием любой стандартной методологии. «Введение» предусматривает включение в клетку нуклеиновой кислоты таким образом, что последовательность получает доступ к внутренней части клетки. Введение может быть выполнено с помощью любого способа.

[000148] Способы, представленные в данном документе, не зависят от конкретного способа введения нуклеиновой кислоты в клетку, за исключением того, что нуклеиновая кислота получает доступ во внутреннюю часть по меньшей мере одной клетки. Способы введения нуклеиновых кислот в клетки различных типов известны в данной области и включают, например, способы стабильной трансфекции, способы временной трансфекции и способы, опосредованные вирусом.

[000149] Протоколы трансфекции, а также протоколы введения нуклеиновых кислот в клетки могут варьироваться. Неограничивающие способы трансфекции включают способы химической трансфекции с использованием липосом; наночастиц; фосфата кальция (см., например, Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4, and Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company, pp. 96-97, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей полноте); дендримеров или катионных полимеров, таких как DEAE-декстран или полиэтиленимин. Способы, отличные от химических, включают электропорацию, сонопорацию и оптическую трансфекцию. Трансфекция на основе частиц включает применение генной пушки или магнитной трансфекции (см., например, Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-285, полностью включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Способы с использованием вирусов также можно применять для трансфекции.

[000150] Введение нуклеиновых кислот в клетку также может быть выполнено с помощью электропорации, внутрицитоплазматической инъекции, вирусной инфекции, аденовируса, аденоассоциированного вируса, лентивируса, ретровируса, трансфекции, липид-опосредованной трансфекции или нуклеофекции. Нуклеофекция представляет собой усовершенствованную технологию электропорации, которая обеспечивает возможность доставки субстратов нуклеиновых кислот не только в цитоплазму, но также через ядерную мембрану в ядро. Кроме того, применение нуклеофекции в раскрытых в данном документе способах обычно требует гораздо меньшего количества клеток, чем обычная электропорация (например, только приблизительно 2 миллиона по сравнению с 7 миллионами при обычной электропорации). В одном примере нуклеофекцию выполняют с применением системы LONZA^® NUCLEOFECTOR™.

[000151] Введение нуклеиновых кислот в клетку (например, эмбрион на стадии одной клетки) также может быть осуществлено путем микроинъекции. У эмбрионов на стадии одной клетки микроинъекцию можно осуществлять в материнский и/или отцовский пронуклеус или в цитоплазму. Если микроинъекцию выполняют только в один пронуклеус, то отцовский пронуклеус предпочтительнее из-за его более крупного размера. Микроинъекцию мРНК предпочтительно осуществляют в цитоплазму (например, для доставки мРНК непосредственно в аппарат трансляции), тогда как микроинъекцию белка или ДНК, кодирующую, ДНК, кодирующую белок Cas, предпочтительно осуществляют в ядро/пронуклеус. Альтернативно микроинъекцию можно осуществлять путем инъекции как в ядро/пронуклеус, так и в цитоплазму: сначала можно ввести иглу в ядро/пронуклеус и ввести первое количество, а при удалении иглы из эмбриона на стадии одной клетки можно ввести второе количество в цитоплазму. Если белок, представляющий собой нуклеазное средство, вводят в цитоплазму, то белок предпочтительно содержит сигнал внутриядерной локализации для обеспечения доставки в ядро/пронуклеус. Способы осуществления микроинъекции хорошо известны из уровня техники. См, например, Nagy et al., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:15022-15026, а также Meyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. США 109:9354-9359, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[000152] Другие способы введения нуклеиновой кислоты или белков в клетку могут включать, например, доставку с помощью вектора, опосредованную частицами доставку, опосредованную экзосомами доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку, опосредованную проникающим в клетку пептидом доставку или опосредованную имплантируемым устройством доставку.

[000153] Введение нуклеиновых кислот в клетку можно проводить один или более раз за определенный период времени. Например, введение можно выполнять по меньшей мере два раза в течение определенного периода времени, по меньшей мере три раза в течение определенного периода времени, по меньшей мере четыре раза в течение определенного периода времени, по меньшей мере пять раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере шесть раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере семь раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере восемь раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере девять раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере десять раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере одиннадцать раз, по меньшей мере двенадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере тринадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере четырнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере пятнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере шестнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере семнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере восемнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере девятнадцать раз в течение определенного периода времени или по меньшей мере двадцать раз в течение определенного периода времени.

Е. Скрининг и идентификация клеток с целевыми генетическими модификациями

[000154] Клетки, в которые LTVEC был успешно введен, могут быть отобраны путем воздействия средств для отбора на основании того, был ли встроен селектируемый маркерный ген в LTVEC. В качестве неограничивающего примера, если селектируемый маркер представляет собой ген неомицин-фосфотрансферазы (neo) (см., например, Beck et al. (1982) Gene 19:327-336, включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей), то клетки, в которые ввели LTVEC, могут быть отобраны в среде, содержащей G418; клетки, которые не имеют LTVEC, погибнут, тогда как клетки, которые получили LTVEC, выживут (см., например, Santerre, et al. (1984) Gene 30:147-156, полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей). Такие селективные маркеры могут, например, придать устойчивость к антибиотику, такому как G418, гигромицин, бластицидин, неомицин или пуромицин. Такие селективные маркеры включают неомицин-фосфотрансферазу (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазу (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазу (puro^r) и бластицидин-S-дезаминазу (bsr^r). В еще одних вариантах осуществления селективный маркер функционально связан с индуцируемым промотором, и при этом экспрессия селективного маркера является токсичной для клетки. Неограничивающие примеры таких селективных маркеров включают ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазу (gpt), гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK).

[000155] Раскрытые в данном документе способы могут дополнительно предусматривать идентифицирование клетки, имеющей модифицированный геном. Можно использовать различные способы для идентификации клеток, имеющих целевую генетическую модификацию, такую как делеция или вставка. Такие способы могут предусматривать идентификацию одной клетки, имеющей целевую генетическую модификацию в целевом локусе.

[000156] В традиционных анализах для скрининга целевых модификаций, таких как ПЦР длинных фрагментов, секвенирование по Сэнгеру или блоттинг по Саузерну, обеспечивают связывание встроенного нацеливающего вектора с целевым локусом. Например, для ПЦР-анализа длинных фрагментов один праймер может распознавать последовательность внутри встроенной ДНК, в то время как другой распознает последовательность представляющего интерес геномного участка за концами плеч гомологии нацеливающего вектора. Однако из-за крупных размеров их плеч гомологии LTVEC не позволяют проводить скрининг с помощью таких традиционных анализов. Для скрининга нацеливания LTVEC можно использовать анализы модификации аллеля (МОА), в том числе анализы потери аллеля (LOA) и приобретения аллеля (GOA) (см., например., US 2014/0178879 и Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). С помощью анализа потери аллеля (LOA) обращают стандартную логику скрининга и количественно оценивают количество копий нативного локуса, на который была направлена мутация. В подвергнутом правильному целенаправленному воздействию клеточном клоне посредством анализа LOA обнаруживают один из двух нативных аллелей (для генов, не находящихся в хромосоме X или Y), причем другой аллель разрушается в результате направленной модификации. Тот же принцип может быть использован в обратном порядке, что и в анализе приобретения аллеля (GOA), для количественной оценки количества копий встроенного нацеливающего вектора. Например, с помощью комбинированного применения анализов GOA и LOA можно выявить подвергнутый правильному нацеливанию гетерозиготный клон, который утратил одну копию нативного целевого гена и получил одну копию гена устойчивости к лекарственному средству или другого встроенного маркера.

[000157] В качестве примера количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) может использоваться в качестве способа количественной оценки аллелей, а любой способ, с помощью которого можно достоверное различать отличие между нулевой, одной и двумя копиями целевого гена или между нулевой, одной и двумя копиями вставки нуклеиновой кислоты могут быть использованы для разработки анализа МОА. Например, TAQMAN^® можно использовать для количественного определения количества копий ДНК-матрицы в образце геномной ДНК, в частности путем сравнения с эталонным геном (см., например, US 6596541, полностью включенный в данный документ посредством ссылки для всех целей). Эталонный ген количественно определяют в той же геномной ДНК, что и целевой ген(целевые гены) или локус(локусы). Поэтому выполняют две амплификации TAQMAN^® (каждую со своим соответствующим зондом). Один зонд TAQMAN^® определяет «Ct» (пороговый цикл) эталонного гена, в то время как другой зонд определяет Ct участка целевого гена(целевых генов) или локуса(локусов), который заменяют путем успешного нацеливания (т.е. анализ LOA). Ct представляет собой количество, которое соответствует количеству исходной ДНК для каждого из зондов TAQMAN^®, то есть менее многочисленная последовательность требует большего количества циклов ПЦР для достижения порогового цикла. Уменьшение вдвое количества копий матричной последовательности для реакции TAQMAN^® приведет к повышению примерно на одну единицу Ct. Реакции TAQMAN^® в клетках, где один аллель целевого гена(целевых генов) или локуса(локусов) был заменен с помощью гомологичной рекомбинации, приведут к повышению на одну Ct для целевой реакции TAQMAN^® без повышения Ct для эталонного гена по сравнению с ДНК из нецелевых клеток. Для анализа GOA можно использовать другой зонд TAQMAN^® для определения Ct вставки нуклеиновой кислоты, которая заменяет целевой ген(целевые гены) или локус(локусы) за счет эффективного целенаправленного воздействия.

[000158] Стадия скрининга может также предусматривать специфические в отношении плеч анализы, которые используются для различения правильных целевых вставок вставки нуклеиновой кислоты в целевой геномный локус от случайных трансгенных вставок вставки нуклеиновой кислоты в геномные местоположения за пределами целевого геномного локуса. Посредством специфичных в отношении плеч анализов определяют количество копий ДНК-матрицы в плечах гомологии LTVEC. См., например, US 2016/0177339, WO 2016/100819, US 2016/0145646 и WO 2016/081923, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Может быть полезным дополнить стандартные анализы LOA и GOA с целью проверки правильности целенаправленного воздействия LTVEC. Например, одних только анализов LOA и GOA может быть недостаточно, чтобы отличить подвергнутые правильному целенаправленному воздействию клоны клеток от клонов, в которых делеция целевого геномного локуса совпадает со случайной интеграцией LTVEC в какое-либо другое местоположение в геноме. Поскольку давление отбора в целевой клетке основано на селекционной кассете, случайная трансгенная интеграция LTVEC в каком-либо другом местоположении в геноме, как правило, будет включать селекционную кассету и смежные участки LTVEC, но может исключать более отдаленные участки LTVEC. Например, если часть LTVEC случайным образом интегрирована в геном, a LTVEC содержит вставку нуклеиновой кислоты длиной около 5 т.о. или больше с селекционной кассетой, смежной с 3'-плечом гомологии, в некоторых случаях 3'-плечо гомологии, а не 5'-плечо гомологии, будет трансгенно интегрировано с селекционной кассетой. Альтернативно, если селекционная кассета прилегает к 5'-плечу гомологии, в некоторых случаях 5'-плечо гомологии, но не 3'-плечо гомологии, будет трансгенно интегрировано вместе с селекционной кассетой. Например, если анализы LOA и GOA используют для оценки целевой интеграции LTVEC, а в анализе GOA используют зонды для селекционной кассеты или любого другого уникального (отличного от плеча) участка LTVEC, то гетерозиготная деления в целевом геномном локусе в комбинации со случайной трансгенной интеграцией LTVEC будет давать то же считывание, что и гетерозиготная целевая интеграция LTVEC в целевом геномном локусе. Для проверки правильности целенаправленного воздействия LTVEC можно использовать специфичные для плеча анализы в сочетании с анализами LOA и/или GOA.

[000159] Другие примеры подходящих количественных анализов включают флуоресцентно-опосредованную гибридизацию in situ (FISH), сравнительную геномную гибридизацию, изотермическую амплификацию ДНК, количественную гибридизацию с иммобилизованным зондом(иммобилизованными зондами), зонды INVADER^®, зонды TAQMAN^® Molecular Beacon или технологию использования зондов ECLIPSE™ (см., например, US 2005/0144655, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).

[000160] Секвенирование нового поколения (NGS) также можно использовать для скрининга, в частности у эмбрионов на стадии одной клетки, которые были модифицированы. Секвенирование нового поколения также может называться «NGS» или «массивное параллельное секвенирование» или «высокопроизводительное секвенирование». Такой NGS можно использовать в качестве инструмента для скрининга в дополнение к анализам МОА и анализам удерживания с целью определения точной природы направленной генетической модификации и выявления мозаицизм. Мозаицизм относится к наличию двух или более популяций клеток с разными генотипами у одного индивидуума, который развился из одной оплодотворенной яйцеклетки (то есть зиготы). В способах, раскрытых в данном документе, отсутствует необходимость проводить скрининг целевых клонов с использованием селективных маркеров. Например, к анализам МОА и NGS, описанным в данном документе, можно прибегнуть без использования селекционной кассеты.

F. Способы создания генетически модифицированных животных, отличных от человека

[000161] Генетически модифицированные животные, отличные от человека, могут быть получены с использованием различных способов, раскрытых в данном документе. Любой традиционный способ или протокол для получения генетически модифицированного организма, в том числе способы, описанные в данном документе, являются подходящими для получения такого генетически модифицированного животного, отличного от человека. Такие способы, начиная с генетического модифицирования плюрипотентной клетки, такой как эмбриональная стволовая (ES) клетка, обычно предусматривают следующее: (1) модифицирование генома плюрипотентной клетки, которая не является эмбрионом на стадии одной клетки, с применением способов, описанных в данном документе; (2) идентифицирование или отбор генетически модифицированной плюрипотентной клетки; (3) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки в эмбриона-хозяина и (4) имплантирование и вынашивание эмбриона-хозяина, содержащего генетически модифицированную плюрипотентную клетку, суррогатной матерью. Затем суррогатная мать может производить животных поколения F0, отличных от человека, содержащих целевую генетическую модификацию и способных передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию. Животных, несущих генетически модифицированный геномный локус, можно идентифицировать с помощью анализа модификации аллеля (МОА), описанного в данном документе. Донорную клетку можно вводить в эмбрион-хозяин на любой стадии, как, например, на стадии бластоцисты или стадии, предшествующей моруле (то есть стадии 4 клеток или стадии 8 клеток). Получают потомство, способное передавать генетическую модификацию через зародышевую линию. Плюрипотентная клетка может представлять собой, например, ES-клетку (например, ES-клетку грызуна, ES-клетку мыши или ES-клетку крысы), как обсуждалось в другом месте данного документа. См., например, патент США №7294754, который включен в данный документ посредством ссылки во своей полноте для всех целей.

[000162] Альтернативно такие способы, начиная с генетического модифицирования эмбриона на стадии одной клетки, обычно предусматривают следующее: (1) модифицирование генома эмбриона на стадии одной клетки, с применением описанных в данном документе способов; (2) идентифицирование или отбор генетически модифицированного эмбриона и (3) имплантирование и вынашивание генетически модифицированного эмбриона суррогатной матерью. Затем суррогатная мать может производить животных поколения F0, отличных от человека, содержащих целевую генетическую модификацию и способных передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию. Животных, несущих генетически модифицированный геномный локус, можно идентифицировать с помощью анализа модификации аллеля (МОА), описанного в данном документе.

[000163] Методики переноса ядер можно также использовать для получения млекопитающих животных, отличных от человека. Вкратце способы переноса ядер могут включать следующие стадии: (1) энуклеирование ооцита или обеспечение энуклеированного ооцита; (2) выделение или обеспечение донорных клетки или ядра, подлежащих объединению с энуклеированным ооцитом; (3) вставка клетки или ядра в энуклеированный ооцит с получением реконструированной клетки; (4) имплантирование реконструированной клетки в матку животного, отличного от человека, с получением эмбриона и (5) обеспечение возможности развития эмбриона. В таких способах ооциты обычно получают из умерщвленных животных, несмотря на то, что их также можно выделять из маточных труб и/или яичников живых животных. Перед энуклеированием ооциты можно выдерживать для созревания во множестве сред, известных специалистам в данной области. Энуклеирование ооцита можно осуществлять с помощью множества способов, известных специалистам в данной области. Вставка донорной клетки или ядра в энуклеированный ооцит с получением реконструированной клетки может быть достигнута с помощью микроинъекции донорной клетки под блестящую оболочку перед слиянием. Слияние можно индуцировать путем применения электрического импульса постоянного тока по отношению к поверхности контакта/слияния (электрослияние) при воздействии на клетки химических веществ, способствующих слиянию, таких как полиэтиленгликоль, или с использованием инактивированного вируса, такого как вирус Сендай. Реконструированную клетку можно активировать с помощью способов с использованием электричества и/или без использования электричества до, во время и/или после слияния ядерного донора и реципиентного ооцита. Способы активации предусматривают электрические импульсы, химически индуцированный шок, внедрение сперматозоида, повышение уровней двухвалентных катионов в ооците и снижение фосфорилирования клеточных белков (например, с помощью ингибиторов киназ) в ооците. Активированные реконструированные клетки или эмбрионы можно культивировать в средах, известных специалистам в данной области, а затем переносить в матку животного. См., например, US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390 и WO 2008/017234 и патент США №7612250, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[000164] Различные способы, представленные в данном документе, позволяют получать генетически модифицированное животное F0, отличное от человека, в котором клетки генетически модифицированного животного F0 содержат целевую генетическую модификацию. Признано, что в зависимости от способа, используемого для получения животного F0, количество клеток в животном F0, которые имеют целевую генетическую модификацию, будет варьироваться. Введение донорных ES-клеток в эмбрион на стадии, предшествующей моруле, из соответствующего организма (например, мышиного эмбриона на стадии 8 клеток), например, с помощью способа VELOCIMOUSE^® позволяет получать больший процент клеточной популяции животных F0, содержащих клетки, имеющие целевую генетическую модификацию. См., например, US 2014/0331340, US 2008/0078001, US 2008/0028479, US 2006/0085866 и WO 2006/044962, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Например, по меньшей мере 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеточного вклада животного F0, отличного от человека, могут содержать клеточную популяцию, имеющую целевую генетическую модификацию. Кроме того, по меньшей мере одна или более зародышевых клеток животного F0 могут иметь целевую генетическую модификацию.

[000165] Генетически модифицированное животное-основатель, отличное от человека, может быть идентифицировано на основании отсутствия в его геноме эндогенных геномных последовательностей C9ORF72, которые заменены гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, и/или присутствия (и/или экспрессии) гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, гена устойчивости к лекарственным средствам и/или репортера в тканях или клетках животного, отличного от человека. Затем трансгенного животного-основателя, отличного от человека, можно использовать для разведения дополнительных животных, отличных от человека, несущих гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, за счет чего обеспечивается создание ряда животных, отличных от человека, каждое из которых несет одну или более копий локуса C9ORF72, описанного в данном документе.

[000166] Можно также получать транс генных животных, отличных от человека, содержащих выбранные системы, которые позволяют регулировать экспрессию трансгена или управлять ею. Иллюстративные системы включают систему рекомбиназ Cre/loxP из бактериофага Р1 (см., например, Lakso, М. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6236) и систему рекомбиназ FLP/Frt из S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-1355). Таких животных можно получить путем создания «дважды» трансгенных животных, например путем спаривания двух трансгенных животных, одного, содержащего трансген, кодирующий гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, и другого, содержащего трансген, кодирующий рекомбиназу (например, рекомбиназу Cre).

[000167] Несмотря на то, что варианты осуществления с использованием вставки гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72 мыши широко обсуждаются в данном документе, также предусматриваются другие животные, отличные от человека, которые имеют разрушение в локусе C9ORF72. Такие животные, отличные от человека, включают любых животных из тех, которых можно подвергнуть генетической модификации с целью замены некодирующей последовательности локуса C9ORF72, раскрытого в данном документе, в том числе, например, млекопитающих, например, мышь, крысу, кролика, свинью, бычьих (например, корову, быка, буйвола), оленя, овцу, козу, курицу, кошку, собаку, хорька, примата (например, игрунку, макака-резуса) и т.д. Например, у тех животных, отличных от человека, у которых сложно получить подходящие генетически модифицируемые ES-клетки, для получения животного, отличного от человека, содержащего генетическую модификацию используют другие способы. Такие способы включают, например, модифицирование генома клеток, отличных от ES-клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки), и использование переноса ядер соматических клеток (SCNT) для переноса генетически модифицированного генома в подходящую клетку, например, в энуклеированный ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) животным, отличным от человека, в подходящих условиях для образования эмбриона.

[000168] Вкратце способы переноса ядер включают следующие стадии: (1) энуклеирование ооцита; (2) выделение донорных клетки или ядра, подлежащих объединению с энуклеированным ооцитом; (3) вставка клетки или ядра в энуклеированный ооцит с получением реконструированной клетки; (4) имплантирование реконструированной клетки в матку животного с получением эмбриона и (5) обеспечение возможности развития эмбриона. В таких способах ооциты обычно получают из умерщвленных животных, несмотря на то, что их также можно выделять из маточных труб и/или яичников живых животных. Перед энуклеированием ооциты можно выдерживать для созревания во множестве сред, известных специалистам в данной области. Энуклеирование ооцита можно осуществлять с помощью множества способов, известных специалистам в данной области. Вставка донорной клетки или ядра в энуклеированный ооцит с получением реконструированной клетки обычно достигается с помощью микроинъекции донорной клетки под блестящую оболочку перед слиянием. Слияние можно индуцировать путем применения электрического импульса постоянного тока по отношению к поверхности контакта/слияния (электрослияние) при воздействии на клетки химических веществ, способствующих слиянию, таких как полиэтиленгликоль, или с использованием инактивированного вируса, такого как вирус Сендай. Реконструированную клетку обычно активируют с помощью способов с использованием электричества и/или без использования электричества до, во время и/или после слияния ядерного донора и реципиентного ооцита. Способы активации предусматривают электрические импульсы, химически индуцированный шок, внедрение сперматозоида, повышение уровней двухвалентных катионов в ооците и снижение фосфорилирования клеточных белков (например, с помощью ингибиторов киназ) в ооците. Активированные реконструированные клетки или эмбрионы обычно культивируют в средах, известных специалистам в данной области, а затем переносят в матку животного. См., например, публикацию патентной заявки США №2008-0092249 А1, WO 1999/005266 А2, публикацию патентной заявки США №2004-0177390 А1, WO 2008/017234 А1 и патент США №7612250, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.

[000169] Способы модифицирования генома животного, отличного от человека (например, свиньи, коровы, грызуна, курицы и т.д.), предусматривают, например, использование нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN) или эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), для модификации генома с тем, чтобы он содержал вставку гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в локусе C9ORF72, как описано в данном документе.

[000170] В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе животное, отличное от человека, представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе животное, отличное от человека, представляет собой мелкое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, описанное в данном документе, представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, выбран из мыши, крысы и хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, выбран из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, описанное в данном документе, относится к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяки, крысы и мыши Нового света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (лазающие мыши, скальные мыши, белохвостые крысы, малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, описанный в данном документе, выбран из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь, описанная в данном документе, является представителем семейства Muridae. В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе животное, отличное от человека, представляет собой грызуна. В некоторых определенных вариантах осуществления грызун, описанный в данном документе, выбран из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе животное, отличное от человека, представляет собой мышь.

[000171] В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, который представляет собой мышь линии C57BL, выбранной из C57BL/А, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых определенных вариантах осуществления мышь, описанная в данном документе, принадлежит к линии 129, выбранной из группы, состоящей из линии 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129Х1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь, описанная в данном документе, представляет собой гибрид вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В некоторых определенных вариантах осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой гибрида вышеупомянутых линий 129 или гибрида вышеупомянутых линий BL/6. В некоторых определенных вариантах осуществления линия 129 в гибриде, описываемом в данном документе, представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой линию BALB, например линию BALB/с. В некоторых вариантах осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой гибрида линии BALB и другой вышеупомянутой линии.

[000172] В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе животное, отличное от человека, представляет собой крысу. В некоторых определенных вариантах осуществления крыса, описанная в данном документе, выбрана из крысы линии Wistar, линии LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. В некоторых определенных вариантах осуществления линия крыс, описанная в данном документе, представляет собой гибрида двух или более линий, выбранных из группы, включающей Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.

[000173] Плюрипотентная и/или тотипотентная клетка крысы может быть получены от любой линии крыс, включающей, например, линию крыс ACI, линию крыс Dark Agouti (DA), линию крыс Wistar, линию крыс LEA, линию крыс Sprague Dawley (SD) или линию крыс Fischer, такую как Fischer F344 или Fisher F6. Плюрипотентные и/или тотипотентные клетки крысы также могут быть получены из линии, происходящей из помеси двух или более линий, перечисленных выше. Например, плюрипотентная и/или тотипотентная клетка крысы может быть получена из линии DA или линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется наличием окраски «черный агути» с белыми брюхом и лапами и гаплотипа RT1^av1. Такие линии доступны из множества источников, в том числе Harlan Laboratories. Примером линии ES-клеток крысы из крысы ACI является ES-клетка крысы ACI.G1. Линия крыс Dark Agouti (DA) характеризуется наличием окраски «агути» и гаплотипа RT1^av1. Такие крысы доступны из множества источников, в том числе Charles River и Harlan Laboratories. Примерами линии ES-клеток крысы из крысы DA являются линия ES-клеток крысы DA.2В и линия ES-клеток крысы DA.2С. В некоторых случаях плюрипотентные и/или тотипотентные клетки крысы получены из инбредной линии крыс. См., например, заявку на патент США 2014/0235933 А1, поданную 20 февраля 2014 года и включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[000174] Предусматриваются животные, отличные от человека, содержащие вставку гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72. В некоторых вариантах осуществления вставка гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, не вызывает заболевание. В некоторых вариантах осуществления вставка гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, приводит в результате к одному или более фенотипам, описанным в данном документе, например, к фенотипу, ассоциированному с ALS и/или FTD. Вставка гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, может быть измерена непосредственно, например, путем определения примерного количества копий, например, повторов, гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, например, путем реакции генотипирования блоттинга по Саузерну или полимеразной цепной реакции.

Способы применения животных, отличных от человека, характеризующихся вставкой гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72

[000175] Используя животных, отличных от человека, описанных в данном документе, обеспечивают улучшенные животные модели для нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний. В частности, с помощью животных, отличных от человека, описанных в данном документе, обеспечивают улучшенные животные модели, с помощью которых воспроизводят заболевания человека, такие как, например, ALS и/или FTD, характеризующиеся симптомами поражения верхних двигательных нейронов и/или потерей нейронов, отличных от двигательных.

[000176] Животные, отличные от человека, описанные в данном документе, обеспечивают улучшенную систему in vivo и источник биологических материалов (например, клеток), которые содержат и/или экспрессируют встроенную гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72, которые являются применимыми во многих анализах. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, описанных в данном документе, можно использовать для разработки терапевтических средств, которые лечат, предупреждают и/или подавляют один или более симптомов, ассоциированных с экспрессией и/или активностью вызывающей заболевание гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов. В различных вариантах осуществления описанных в данном документе животных, отличных от человека, используют для идентификации, скрининга и/или разработки кандидатных терапевтических средств (например, антител, gRNA (содержащих РНК CRISPR и tracRNA) и siRNA и т.д.), которые связывают вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции. В различных вариантах осуществления описанных в данном документе животных, отличных от человека, используют для скрининга и разработки кандидатных терапевтических средств (например, антител, gRNA (содержащих РНК CRISPR и tracRNA) и siRNA и т.д.), которые блокируют активность вызывающих заболевание гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукта ее экспрессии, например, образующихся в результате RAN-трансляции. В различных вариантах осуществления описанных в данном документе животных, отличных от человека, используют для определения профиля связывания антагонистов и/или агонистов вызывающих заболевание гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукта ее экспрессии (транскрипта), например, образующихся в результате RAN-трансляции у животных, отличных от человека, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления описанных в данном документе животных, отличных от человека, используют для определения эпитопа или эпитопов одного или более кандидатных терапевтических антител, которые связывают вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции.

[000177] В некоторых вариантах осуществления описанных в данном документе животных, отличных от человека, используют для определения фармакокинетических профилей лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции. В различных вариантах осуществления одно или более животных, отличных от человека, описанных в данном документе, и одно или более контрольных или эталонных животных, отличных от человека, подвергают воздействию одного или более кандидатных лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции, в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/мг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или больше). Кандидатные терапевтические антитела можно дозировать посредством любого необходимого пути введения, в том числе парентерального и непарентерального пути введения. Парентеральные пути предусматривают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, интракраниальный, интраплевральный или другие пути введения. Непарентеральные пути предусматривают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, ингаляционный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. Введение также можно осуществлять посредством непрерывной инфузии, местного применения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т.п.) и/или внутривенной инъекции. У животных, отличных от человека (гуманизированных и контрольных), отбирают кровь в различные моменты времени (например, 0 ч, 6 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней или до 30 или более дней). Для определения фармакокинетических профилей вводимых лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции, могут быть выполнены различные анализы с использованием образцов, полученных от описанных в данном документе животных, отличных от человека, в том числе без ограничения, анализ общего IgG, гуморального ответа на терапевтические средства, агглютинации и т.д.

[000178] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, описанных в данном документе, используют для измерения терапевтического эффекта блокирования, модуляции и/или подавления активности вызывающих заболевание гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукта ее экспрессии, например, образующихся в результате ассоциированной с повторами трансляции без AUG (RAN) и влияния на экспрессию генов в результате клеточных изменений. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, или клетки, выделенные из него, подвергают воздействию лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или на продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции у животного, отличного от человека, и после некоторого прошедшего периода времени анализируют в отношении воздействия на процессы (или взаимодействия), зависящие от вызывающих заболевание гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов или продукта ее экспрессии, например, образующихся в результате RAN-трансляции, например, образования очагов РНК, агрегации белка из продуктов RAN-трансляции, функции двигательных нейронов и/или нейронов, отличных от двигательных и т.д.

[000179] Клетки описанных в данном документе животных, отличных от человека, можно выделять и использовать для определенных целей или их можно поддерживать в культуре в течение многих поколений. В различных вариантах осуществления клетки описанного в данном документе животного, отличного от человека, подвергают иммортализации (например, путем применения вируса) и поддерживают в культуре в течение неопределенного времени (например, в серийных культурах).

[000180] За счет описанных в данном документе животных, отличных от человека, обеспечивают систему in vivo для оценки фармакокинетических свойств и/или эффективности лекарственного средства (например, лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции). В различных вариантах осуществления лекарственное средство можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, в клетки полученные из них или имеющие такие же генетические модификации, которые описаны в данном документе, с последующим мониторингом животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека, для определения эффекта лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Фармакокинетические свойства включают без ограничения характер переработки животным лекарственного средства в различные метаболиты (или выявляемое присутствие или отсутствие одного или более метаболитов лекарственных средств, в том числе без ограничения токсичных метаболитов), период полувыведения лекарственного средства, уровни циркулирующего в крови лекарственного средства после введения (например, концентрацию лекарственного средства в сыворотке крови), гуморальный ответ на лекарственное средство (например, продуцирование антител к лекарственным средствам), всасывание и распределение лекарственного средства, путь введения, пути выведения и/или клиренс лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления мониторинг фармакокинетических и фармакодинамических свойств лекарственных средств проводят у описанных в данном документе животных, отличных от человека, или посредством их применения.

[000181] В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение эффекта в отношении фенотипа и/или генотипа животного, отличного от человека, которому вводят лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение изменяемости лекарственного средства от партии к партии. В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение различий между эффектами лекарственного средства, вводимого описанному в данном документе животному, отличному от человека, и эталонному животному, отличному от человека. В различных вариантах осуществления эталонные животные, отличные от человека, могут иметь модификацию, описанную в данном документе, например, вставку гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, не вызывающей заболевание, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа, отличного от человека).

[000182] Иллюстративные параметры, которые можно измерять у животных, отличных от человека (или в клетках, выделенных из них, и/или с их применением), для оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства включают без ограничения агглютинацию, аутофагию, деление клеток, гибель клеток, комплементзависимый гемолиз, целостность ДНК, титр антител, специфичных к лекарственному средству, метаболизм лекарственного средства, экспрессию генов, определяемую с помощью биочипов, метаболическую активность, митохондриальную активность, оксидативный стресс, фагоцитоз, биосинтез белка, распад белка, секрецию белка, реакцию на стресс, концентрацию лекарственного средства в целевой ткани, концентрацию лекарственного средства в нецелевой ткани, транскрипционную активность и им подобные. В различных вариантах осуществления описанных в данном документе животных, отличных от человека, используют для определения фармацевтически эффективной дозы лекарственного средства, (например, лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на вызывающие заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, или продукт ее экспрессии, например, образующиеся в результате RAN-трансляции).

ПРИМЕРЫ

[000183] Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники описание того, как создавать и применять способы и композиции по настоящему изобретению, и они не подразумеваются как ограничивающие объем того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Если не указано иное, температура указана в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к нему.

Пример 1. Вставка гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, в эндогенном локусе C9ORF72, отличном от человеческого

[000184] В данном примере иллюстрируется целевая вставка гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эмбриональную стволовую клетку в локус C9orf72 животного, отличного от человека, в частности грызуна. В частности, в данном примере конкретно описана замена части некодирующей последовательности локуса C9orf72 мыши гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, человека, помещенной в функциональную связь с промотором C9orf72 мыши и/или регуляторными элементами человека, например, такими, которые могут быть выявлены в экзонах 1а и/или 1b гена C9orf72 человека. Нацеливающий вектор C9orf72-HRE для встраивания гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72 мыши, получали так, как описано ранее (см., например, патент США №6586251; Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; и Adams, N.C. and N.W. Gale, in Mammalian and Avian Transgenesis-New Approaches, ed. Lois, S.Р.а.С., Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2006). Полученный модифицированный локус C9orf72 изображен на фигуре 1А, нижний прямоугольник.

[000185] Вкратце нацеливающие векторы, содержащие последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, получали с использованием клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) из мышиной библиотеки ВАС RP23 (Adams, DJ et al., 2005, Genomics 86:753-758) и вводили в гибридные F1 (129S6SvEvTac/C57BL6NTac) эмбриональные стволовые (ES) клетки с последующим культивированием в селективной среде, содержащей G418. Устойчивые к лекарственным средствам колонии отбирали через 10 дней после электропорации и проверяли на предмет правильного нацеливания, как описано ранее (Valenzuela et al., выше; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307). Целевые ES-клетки анализировали для определения примерного размера экспансий гексануклеотидных повторов, присутствующих в клонах целевых ES-клеток мыши, с помощью блот-анализа по Саузерну и/или амплификации локуса C9orf72-HRE.

[000186] В частности, проводили блот-анализ по Саузерну для определения примерного размера экспансий гексануклеотидных повторов, присутствующих в целевых C9ORF72 трансгенных ES-клетках мыши. Геномную ДНК выделяли из целевых клонов ES мыши, выращенных в отдельных лунках 96-луночного планшета с желатиновым покрытием. Как только клоны ES-клеток достигали 100% конфлюентности, клетки дважды промывали с использованием 1xPBS и лизировали в течение ночи при 37°С в 50 мкл буфера для лизиса (1 М Tris, рН 8,5, 0,5 М EDTA, 20% SDS, 5 М NaCl и 1 мг/мл протеиназы К). ДНК осаждали путем добавления 125 мкл охлажденного на льду этанола 200 мл в каждую лунку с последующей инкубацией в течение ночи при 4°С. Осажденную ДНК дважды промывали 70% этанолом, сушили на воздухе и ресуспендировали в 30 мкл 0,5х ТЕ, рН 8,0.

[000187] Экстрагированные геномные ДНК (gDNA) расщепляли с использованием HindII и ScaI в течение ночи при 37°С и разделяли по размеру в 1% агарозном геле. Агарозные гели после электрофореза денатурировали (1 М NaCl, 5% NaOH) и нейтрализовали (1,5 М NaCl, 0,5 М Tris, рН 7,5). Расщепленные gDNA затем переносили на мембраны Hybond-N (Amersham) с помощью капиллярного переноса в течение ночи.

[000188] Зонд, соответствующий фрагменту XmaI размером 252 п.о. (см. фиг. 2А), содержащийся в гуманизированном нацеливающем векторе

метили с помощью ³²P с использованием набора для мечения Prime-It II Random Primer Labeling Kit (Agilent). Денатурированный зонд разбавляли в растворе для гибридизации ExpressHyb (Takara) и инкубировали с подготовленными мембранами в течение ночи при 65°С. Авторадиографическую пленку экспонировали с блот-мембранами в течение 72 часов.

[000189] Как показано на фигуре 2В, клон ES-клеток (8027 А-С4), содержащий встроенную не вызывающую заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую три повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, получали после введения нацеливающего вектора C9orf72-HRE-3, содержащего последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4, и вырезания кассеты устойчивости к лекарственному средству. После введения нацеливающего вектора C9orf72-HRE-100, содержащего последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6, получали по меньшей мере два клона ES-клеток (8029 А-А3 и 8029 А-А6), содержащих встроенную гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, которая представляет собой вариант последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7, и содержит приблизительно 92 повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. Также получали по меньшей мере два клона ES-клеток (8029 В-А6 и 8029 В-А4), содержащих встроенную гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, которая представляет собой вариант последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7, и содержит приблизительно 30 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, после введения нацеливающего вектора C9orf72-HRE-100 (8028) и вырезания кассеты устойчивости к лекарственному средству.

[000190] Также использовали набор AmplideX PCR/СЕ C9ORF72 (Asuragen) в соответствии с инструкциями изготовителя для подтверждения количества копий гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенной в описанные эндогенные клоны C9orf72 ES-клеток. Очищенную общую геномную ДНК mESC из клона с 3Х повторов (8027 А-С4), 2 отдельных клона с 92х повторов (8029 А-А3, 8029 А-А6) и 2 отдельных клона с 30х повторов (8029 В-А4, 8029 В-А10) использовали в качестве исходной ДНК. Общая геномная ДНК F1H4 mESC служила в качестве отрицательного контроля, а очищенная в хранилище клеток Coriell геномная ДНК из клеток крови человека от пациентов с известными аллелями C9ORF72, характеризующимися экспансией гексануклеотидных повторов (образцы ND11836 (генотип HRE:8/с экспансией), ND14442 (2/с экспансией), ND6769 (13/44)) служила положительным контролем (институт медицинских исследований Кориелла). ПЦР с использованием праймеров из таблицы 4 проводили на амплификаторе ABI 9700 (Thermo Fisher). Размеры ампликонов определяли с помощью капиллярного электрофореза на ABI 3500xL GeneScan с использованием полимера РОР-7 (Thermo Fisher) и агарозных гелей NuSieve (Lonza). Маркер молекулярной массы 2-log DNA ladder (New England BioLabs) наносили на агарозные гели для сравнения, а полосы визуально анализировали с помощью красителя SYBR Gold Nucleic Acid Stain (Thermo Fisher).

[000191] Фигура 2В подтверждает наличие 3-х повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенной в эндогенный локус C9orf72 клона 8027 А-С4 ES-клеток мыши, приблизительно 30 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в гетерологичных последовательностях, характеризующихся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенных в эндогенный локус C9orf72 клонов 8029 В-А9 и 8029 В-А10 ES-клеток мыши, и приблизительно 92-х повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в гетерологичных последовательностях, характеризующихся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72 клонов 8029 А-А3 и 8029 А-А6 ES-клеток мыши.

Пример 2. Создание двигательных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток, и животных, отличных от человека, содержащих гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9ORF72 мыши

[000192] Двигательные нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток

[000193] Родительские эмбриональные стволовые клетки (ESC), гомозиготные по локусу C9orf72 дикого типа (контроль) или гетерозиготные по локусу C9orf72, генетически модифицированные посредством приблизительно 3-х повторов (C9orf72HRE₃^+/-), 30 повторов (C9orf72HRE₃₀^+/-) или 92-х повторов (C9orf72HRE₉₂^+/-) гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, культивировали в среде для эмбриональных стволовых клеток (ESM; DMEM + 15% эмбриональной бычьей сыворотки + пенициллин/стрептомиоцин + глутамин + заменимые аминокислоты + нуклеозиды + β-меркаптоэтанол + натрия пируват + LIF) в течение 2 дней, причем на протяжении данного срока среду заменяли ежедневно. Среду для ES заменяли на 7 мл среды ADFNK (Advanced DMEM/F12 + среда Neurobasal + 10% заменителя сыворотки крови Knockout + пенициллин/стрептомиоцин + глутамин + β-меркаптоэтанол) за 1 час до трипсинизации. Среду ADFNK удаляли аспирацией и ESC трипсинизировали с использованием 0,05% раствора трипсин-EDTA. Осажденные клетки ресуспендировали в 12 мл ADFNK и выращивали в течение двух дней в суспензии. Клетки культивировали в течение дополнительных 4 дней в ADFNK, дополненной ретиноевой кислотой (RA) и агонистом Smoothened для получения двигательных нейронов (ESMN). Диссоциированные двигательные нейроны высевали и обеспечивали их созревание в среде для двигательных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN; нейробазальная среда + 2% лошадиной сыворотки + В27 + глутамин + пенициллин/стрептомиоцин + β-меркаптоэтанол + 10 нг/мл GDNF, BDNF, CNTF).

[000194] Животные, отличные от человека

[000195] Использовали технологию VELOCIMOUSE® (DeChiara, Т.М. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; Dechiara, Т.М., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99), при которой подвергнутые целенаправленному воздействию ES-клетки вводили в эмбрионы мышей Swiss Webster на стадии неуплотненных 8 бластомеров для получения здоровых мышей поколения F0, произошедших полностью из ES-клеток, гетерозиготных по вставке C9orf72-HRE (3х или 100х). Ретерозиготного самца поколения F0 скрещивали с самками C57Bl6/NTac для получения гетерозигот F1, которых скрещивали между собой с получением поколения F2 C9orf72-HRE^+/+, C9orf72-HRE^+/- и мышей дикого типа для молекулярных и фенотипических анализов.

Пример 3. Анализ двигательных нейронов или тканей головного мозга, имеющих гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72

[000196] Ранее Liu et al. (2017) Cell Chem. Biol. 24:141-148 использовали количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) и цифровую капельную полимеразную цепную реакцию (ddPCR) для количественного определения количества копий транскриптов смысловой и антисмысловой РНК из локуса C9orf72, экспрессируемых клеточными линиями фибробластов человека или астроцитами человека и двигательными нейронами, полученными из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), выделенных у пациентов, страдающих ALS. Liu et al. (2017), выше, обнаружили значительно большее количество смысловых интронных, антисмысловых и смысловых транскриптов C9orf72 в фибробластах, полученных от пациента с заболеванием, по сравнению с фибробластами, полученными от здоровых пациентов. В среднем определяли три-четыре копии интронных C9orf72 и антисмысловых транскриптов и приблизительно 15-20 копий смысловых транскриптов мРНК C9orf72 на фибробласт, полученный от пациента. Liu et al. (2017) выше. Liu et al. (2017) et al., выше показывают, что, наоборот, один или менее интронных и антисмысловых транскриптов и 5-10 копий смысловых транскриптов мРНК C9orf72 выявляли в клеточных линиях фибробластов в отсутствие заболевания. Аналогично фибробластам, экспрессия интронных, антисмысловых и смысловых транскриптов C9orf72 была более высокой в астроцитах и нейронных клетках, полученных от пациентов, по сравнению с астроцитами и нейронными клетками, полученными от здорового контрольного субъекта. Liu et al. (2017) et al., выше. Рассчитывая процент клеток, которые содержат очаги РНК, среднее количество очагов на клетку и распределение различного количества очагов в клетках, а также определяя количество транскриптов C9orf72 в клетках, полученных от пациентов с заболеванием и здоровых пациентов, Liu et al. (2017) et al., выше предположили, что каждый очаг, наблюдаемый в клетке, полученной от пациента с заболеванием, представляет собой один мутантный интронный или антисмысловой транскрипт C9orf72, и кроме того, небольшое количество молекул РНК может оказывать значительное влияние на заболевание.

[000197] В этом примере стабильность размера гексануклеотидного повтора в размножающейся колонии у животных F2 подтверждали с использованием набора AmplideX PCR/СЕ C9ORF72 (Asuragen), описанного выше (данные не показаны). Кроме того, оценивали РНК-транскрипты в двигательных нейронах, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN) мыши, тканях головного мозга и родительских эмбриональных стволовых клетках, содержащих локус C9orf72 дикого типа (контроль) или генетически модифицированный локус C9orf72, который содержит три, тридцать или девяносто два повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1. Также оценивали уровни очагов РНК и белков с дипептидными повторами в ESMN, полученных из эмбриональных стволовых клеток, содержащих локус C9orf72 дикого типа (контроль) или генетически модифицированный локус C9orf72, который содержит три, тридцать или девяносто два повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.

[000198] Материалы и способы

[000199] Количественная полимеразная цепная реакция

[000200] Из каждого образца общую РНК экстрагировали и транскрибировали в обратном направлении, используя праймеры, которые фланкируют различные участки, и зонды, которые выявляют эти участки модифицированного локуса C9orf72-HRE. Выявляемые участки включают те участки, которые охватывают соединение мышиной и человеческой последовательностей, только человеческие последовательности или только последовательности мыши. QPCR для GAPDH или β2-микроглобулина проводили с использованием зондов и праймеров из общедоступных наборов.

[000201] В частности, РНК выделяли из двигательных нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESMN), родительских эмбриональных стволовых (ES) клеток, или общих тканей головного мозга, выделенных у мышей, содержащих локус C9orf72 дикого типа (WT) (контроль) или генетически модифицированный локус C9orf72, содержащий 3, 30 или 92 повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1

[000202] Общую РНК выделяли с использованием набора Direct-zol RNA Miniprep plus в соответствии с протоколом производителя (Zymo Research). Приблизительно 1 мкг общей РНК обрабатывали ДНКазой I (ThermoFisher) при 25°С в течение 15 мин. Добавляли EDTA и смесь инкубировали при 65°С в течение 10 мин. Реакции обратной транскрипции (RT) проводили с использованием набора для синтеза Maxima Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase (ThermoFisher). После обработки ДНКазой I добавляли 10 мкл смеси для RT, содержащей буфер для RT, случайные гексамерные праймеры, дНТФ, смесь Maxima Н без фермента с получением конечного объема 20 мкл. Реакционную смесь для RT инкубировали при 25°С в течение 10 мин, затем при 50°С в течение 15 мин, а затем 5 мин при 85°С для инактивации фермента. Смесь кДНК разбавляли водой до конечного объема 100 мкл.

[000203] После обратной транскрипции реакционный раствор для ПЦР восстанавливали до конечного объема 8 мкл, содержащего 3 мкл кДНК и 5 мкл смеси ПЦР, зонда и геноспецифичных праймеров. Если не указано иное, то конечные концентрации праймера и зонда соответственно составляли 0,5 мкМ и 0,25 мкМ. QPCR выполняли в системе ViiA™ 7 Real-Time PCR Detection System (ThermoFisher). Реакции ПЦР проводили в четырех повторностях при 95°С в течение 10 мин и при 95°С 3 сек, при 60°С 30 сек в течение 45 циклов в оптическом 384-луночном планшете. Последовательности праймеров и зондов и SEQ ID NO, использованные в каждом анализе (А, В, F, G, Н), представлены в таблице 5.

[000204] Вестерн-блот анализ

[000205] Дифференцированные эмбриоидные тельца (ЕВ) собирали и гомогенизировали в буфере для образцов с SDS (2% SDS, 10% глицерина, 5% β-меркаптоэтанола, 60 мМ TrisHCl, рН 6,8, бромфеноловый синий). Белковые экстракты определяли количественно с помощью анализа белка RC DC (BioRad). Экстракты (10 мкг) подвергали гель-электрофорезу в 4-20% геле SDS-PAGE (ThermoFisher) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием блока для переноса iBLOT (ThermoFisher). Иммуноблоты анализировали с помощью первичных антител к C9orf72 и GAPDH (Millipore). Связанное антитело выявляли путем инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Abcam), с последующей хемилюминесценцией с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). Сигнал выявляли с помощью авторадиографии с использованием чувствительной медицинской рентгеновской пленки Full Speed Blue (Ewen Parker XRay Corporation). Относительные уровни белка рассчитывали с помощью ImageJ.

[000206] Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и иммунофлуоресценция (IF) для выявления РНК и продуктов трансляции

[000207] Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) и иммунофлуоресценцию соответственно использовали для определения местоположения РНК, транскрибированной с последовательности с гексануклеотидными повторами, изложенной под SEQ ID NO: 1, а также транслированных с нее белков с дипептидными повторами в двигательных нейронах, полученных из эмбриональных стволовых клеток. (ESMN), полученных как описано в примере 3. Вкратце, ESMN выращивали в четырех-луночной слайд-камере (система слайд-камеры Lab-Tek II, ThermoFisher Scientific) и фиксировали с помощью 4% PFA (Electron Microscopy Sciences) в PBS. Затем клетки пермеабилизировали с помощью диэтилпирокарбоната (DEPC) PBS/0,2% Triton Х-100 (Fisher Scientific, № в каталоге ВР151) и промывали DEPC-PBS, блокировали и окрашивали LNA- или ДНК-олигонуклеотидами для выявления продуктов транскрипции РНК или антитела к polyGA для выявления продуктов RAN-трансляции, как описано ниже. После окрашивания слайды в дальнейшем инкубировали с подходящим флуоресцентным красителем, закрепляли с помощью Fluoromount G (Southern Biotech) и визуально анализировали с использованием конфокальной микроскопии.

[000208] Выявление смысловых или антисмысловых продуктов транскрипции РНК

[000209] Слайды предварительно гибридизовали с буфером, состоящим из 50% формамида (IBI Scientific, № по каталогу IB72020), DEPC 2× SSC [300 мМ хлорида натрия, 30 мМ цитрата натрия (рН 7,0)], 10% (вес/объем) декстрана сульфата (Sigma-Aldrich, № по каталогу D8960) и DEPC 50 мМ фосфата натрия (рН 7,0) в течение 30 мин при 66°С (для LNA-зондов) или 55°С (для ДНК-зондов). Затем гибридизационный буфер сливали и 400 мкл 40 нМ смеси LNA-зондов или 200 нг/мл смеси ДНК-зондов в гибридизационном буфере добавляли к каждому из слайдов и инкубировали в темноте в течение 3 часов при 66°С (для LNA-зондов) или 55°С (для ДНК-зондов). Слайды, инкубированные с LNA-зондами, споласкивали однократно в DEPC 2× SSC/0,1% Твин 20 (Fisher Scientific, № по каталогу ВР337) при комнатной температуре и три раза в DEPC 0,1× SSC при 65°С. Слайды, инкубированные с ДНК-зондами, трижды промывали 40% формамидом в 2× SSC и быстро промывали однократно в PBS. Затем слайды инкубировали с 1 мкг/мл DAPI (Molecular Probes Inc.).

[000210] Последовательности и SEQ ID NO: LNA- и ДНК-олигонуклеотидных зондов, использованных в этом примере, а также условия гибридизации зондов представлены в таблице 6 ниже.

[000211] Выявление продуктов белков с дипептидными повторами

[000212] После пермеабилизации слайды блокировали 5% нормальной ослиной сывороткой, разведенной в Tris-забуференном солевом растворе (рН 7,4) 0,2% Triton X100 (TBS-T). Слайды инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными антителами к poly-GA (Millipore), разведенными в TBS-T с 5% нормальной ослиной сыворотки. После трехкратного промывания с помощью TBS-T слайды инкубировали с видоспецифичными вторичными антителами, связанными с Alexa 488 или 555 (1:1000 в TBS-T, ThermoFisher) и DAPI (1 мкг/мл) (Molecular Probes Inc.) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 3-кратного промывания посредством TBS-T слайды закрепляли с помощью Fluoromount G (Southern Biotech) и визуально анализировали с помощью конфокальной микроскопии.

[000213] Результаты

[000214] Как показано на фиг. 4, 5 и 6, ESMN, общие ткани головного мозга и нейронов мышей, содержащие последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, изложенную под SEQ ID NO: 1, в локусе C9orf72 показали повышенную экспрессию транскриптов мРНК C9orf72. Такое увеличение, по-видимому, коррелирует с количеством гексануклеотидных повторов, присутствующих между экзонами 1а и 1b локуса C9orf72. На фигуре 6 также показано, что подобно нейронным тканям выделенным от мышей, содержащим 3 или 92 повтора гетерологичной гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в эндогенном локусе C9orf72 и ESMN, содержащим их же, экспрессия C9orf72 также повышалась в тканях, отличных от нейронных, например в мышце и сердце у мышей, содержащих 3 или 92 повтора гетерологичной гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в эндогенном локусе C9orf72. Кроме того, повышение было специфичным для гуманизированного аллеля C9orf72; у гетерозиготных мышей не выявили повышенной экспрессии аллеля C9orf72 мыши, который не содержит повторяющейся последовательности (данные не показаны).

[000215] Предварительные расчеты показывают, что ESMN или клетки головного мозга с тридцатью или девяносто двумя повторами гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, имеют примерно 17 копий мРНК C9orf72 на клетку, что согласуется с данными Liu et al. (2017) выше. Увеличенное количество повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, также напрямую коррелирует с повышением уровней белка C9orf72 (фиг. 7 и 8), ядерным и цитоплазматическим накоплением очагов смысловой и антисмысловой РНК C9orf72 (фиг. 9А и 9В), и белков с дипептидными повторами (фиг. 10). Представленные в данном документе данные указывают на то, что повышение количества повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1, в локусе C9orf72 в результате приводит к образованию клеток, проявляющих молекулярный фенотип (например, повышенную транскрипцию, накопление очагов РНК и/или повышение уровней белков с дипептидными повторами), аналогичный такому у клеток человека, выделенных у пациентов, у которых диагностирован ALS, и оправдывают применение описанных в данном документе животных, отличных от человека, в качестве модели для изучения нейродегенеративного заболевания.

Пример 4. Поведенческий анализ животных, отличных от человека, характеризующихся гетерологичной последовательностью, характеризующующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72

[000216] В этом примере описан поведенческий анализ животных, отличных от человека (например, грызунов), описанных в данном документе, в отношении ALS-подобных симптомов, таких как, например, снижение веса тела и/или существенные двигательные отклонения, возникающие в результате вставки гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72 грызуна (например, мыши), как описано в примере 1.

[000217] Фенотипические исследования мышей с вызывающей заболевание гетерологичной последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенной в эндогенный локус C9orf72, как описано выше, и/или контрольных мышей, например мышей дикого типа или мышей, имеющих гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, отличной от вызывающей заболевание, встроенную в эндогенный локус C9orf72, как описано выше, проводят через 8, 18, 37 (самки) и 57-60 недель (самцы). Вес тела измеряют один раз в две недели, а композиционный состав тела анализируют с помощью μСТ-сканирования (Dynamic 60). Для визуального анализа массы шейного отдела позвоночника используют стандартное сканирование 24. Все процедуры с животными проводили в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных компании Ридженерон Фармасьютикалс.

[000218] Оценку общей двигательной функции проводили с использованием ослепленного субъективного оценивания в баллах. Анализ двигательных нарушений проводят с помощью теста с вращающимся стержнем, теста двигательных способностей в открытом поле и тестирования на мостике. Оценка двигательных нарушений измеряется с использованием системы, разработанной Институтом разработки терапии ALS (ALSTDI, Gill A. et al., 2009, PLoS One 4:e6489). В ходе испытания на мостике испытуемые идут по освещенной стеклянной платформе, а видеокамера проводит съемку снизу. Для каждого животного регситрируют параметры, связанные с походкой, такие как характер шага, инидвидуальная скорость движения лап, продолжительность стояния в вертикальном положении и давление. Этот тест используют для фенотипирования мышей и оценки новых химических объектов в отношении их влияния на двигательную активность. CatWalk XT представляет собой систему для количественной оценки шагов и походки у крыс и мышей. Его используют для оценки двигательной способности грызунов практически в любой экспериментальной модели аномалии центральной нервной, периферической нервной, мышечной или скелетной систем.

[000219] Анализ походки CatWalk: животных помещают в начало дорожки Noldus CatWalk XT 10 с открытым пространством перед ними. Мыши самопроизвольно бегут к концу дорожки, пытаясь сбежать. Камера проводит запись, и программное обеспечение системы измеряет следы. Следы анализируют на наличие отклонений в размещении лап.

[000220] Тест открытое поле: мышей помещают в систему открытого поля Kinder Scientific и оценивают в течение 60 минут. В аппарате используются инфракрасные лучи и компьютерное программное обеспечение для расчета точных перемещений, числа посещенных квадратов X+Y, пройденного расстояния, количества событий кормления, времени, затраченного на кормление, и времени неподвижности.

[000221] Тест с вращающимся стержнем: тест с вращающимся стержнем (IITC Life Science, Вудленд Хиллс, Калифорния) измеряет время до падения мыши с вращающейся перекладины. Вращающийся стержень устанавливают в экспериментальный режим, который начинается с 1 об./мин и ускоряется до 15 об./мин в течение 180 секунд. Затем регистрируют время до падения животных в соответствии с режимом с постепенным наращиванием скорости вращения. Среднее и максимальное из трех самых продолжительных периодов времени, в течение которых животные остаются на стержне, не падая при этом, используются для оценки периода времени до падения. Животные, которым удается оставаться на стержне более 180 секунд, считаются бессимптомными.

[000222] Нарушение работы верхних двигательных нейронов проявляется в виде спастичности (то есть ригидности), повышенных рефлексов, тремора, брадикинезии и признаков Бабинского. Нарушение функции нижних двигательных нейронов проявляется в виде мышечной слабости, истощения, сжимания, скручивания и волочения ног и фасцикуляций. Бульбарные нарушения представляют собой затрудненное глотание, неотчетливое произношение и фасцикуляций языка. Общую двигательную функцию также оценивают в возрасте от 32 до 60 недель в процентах живых животных на данной неделе. Мышей взвешивают еженедельно, а оценку общей двигательной функции проводят с использованием заслепленных субъективных анализов в баллах (как описано выше). Еженедельные или двухмесячные клинические неврологические исследования проводят на двух группах мышей, изучая их двигательные нарушения, тремор и ригидность мышц задних конечностей. Для двигательных нарушений используют заслепленную неврологическую шкалу оценок от нуля (отсутствие симптомов) до четырех (мышь не может выровнять себя в течение 30 секунд после нахождения на боку), как показано в таблице 7.

[000223] Для оценки тремора и ригидности используют систему оценки в баллах от нуля (отсутствие симптомов) до трех (тяжелая). В таблице 8 изложена методология оценки в баллах, связанная с двигательными нарушениями, тремором и ригидностью животных в ходе тестирования.

[000224] В другом эксперименте мышей оценивали с использованием теста на силу захвата. Вкратце, сила захвата характеризует нервно-мышечную функцию как максимальную силу мышц передних конечностей и оценивается по захвату, приложенному мышью к сетке, соединенной с датчиком. Все полученные значения силы захвата нормализованы относительно веса тела мыши.

[000225] В другом эксперименте поясничную часть спинного мозга от контрольных мышей и мышей, содержащих вызывающую заболевание гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, в возрасте около 60 недель, отбирали для гистопатологического анализа. Общее количество двигательных нейронов в спинном мозге и среднюю площадь клеточного тела двигательных нейронов определяли как в исследуемой, так и в контрольной когортах.

[000226] Тепловую ноцицепцию контрольных мышей и исследуемых мышей, содержащих вставку вызывающей заболевание гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в возрасте 20 недель, тестировали путем размещения животных на металлической поверхности с подогревом при 48°С, 52°С или 55°С (IITC, Вудленд Хиллс, Калифорния). Измеряли задержку реакции, определяемую как время, прошедшее до тех пор, пока животное не стало облизывать заднюю лапу, как ответ на тепловой стимул. Мыши остаются на поверхности до тех пор, пока они не выполнят одно из двух ноцицептивных действий: облизывание задней лапы или встряхивание задней лапы.

Пример 5. Делеция гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, из эндогенного локуса C9ORF72, отличного от человеческого, в эмбриональной стволовой клетке, отличной от человеческой, с использованием системы CRISPR/Cas9

[000227] Потенциальные последовательности направляющей РНК (gRNA) для эталонной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов (содержащей, по меньшей мере одну, по меньшей мере приблизительно три, по меньшей мере приблизительно пять, по меньшей мере приблизительно пятнадцать, по меньшей мере приблизительно двадцать, по меньшей мере приблизительно тридцать, по меньшей мере приблизительно сорок, по меньшей мере приблизительно пятьдесят, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80 или по меньшей мере приблизительно 90 предпочтительно смежных повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1), анализировали и оценивали. ДНК, кодирующую потенциально эффективную gRNA (например, crRNA и/или tracRNA), синтезировали и помещают в конструкцию для экспрессии, которая также может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas. См., например, фигуру 12. ES-клетки, содержащие эталонную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, трансфицировали с помощью конструкции (конструкций) для экспрессии, содержащих ДНК, кодирующую gRNA и/или Cas, и ген устойчивости к лекарственным средствам. Устойчивые к лекарственным средствам клоны получают путем серийным разведении, размножали для анализа и замораживали. ДНК из каждого клона устойчивых к лекарственным средствам ES-клеток выделяли и анализировали с помощью ПЦР и визуального анализа в агарозном геле. ПЦР-продукты правильного размера экстрагировали, а затем секвенировали для подтверждения делеции целевой последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

[000228] На фигуре 11 представлено не масштабированное изображение неограничивающей иллюстративной последовательности, характеризующейся экспансией эталонных гексануклеотидных повторов, например, обнаруженной в 8029 А-А6 ES-клетках, полученных в примере 1, например, имеющих последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 45, и положения, на которые с большей вероятностью будут успешно нацеливаться gRNA. Последовательности ДНК, кодирующие crRNA, которые целенаправленно воздействуют на положения, изображенные на фигуре 11, иллюстративная последовательность для которых изложена под SEQ ID NO: 45, а SEQ ID NO: дл каждой представлены в таблице 9. Примечательно, что последовательности, изложенные под SEQ ID NO: 46-50, содержат исходный гуанин, не выявленный в эталонной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, изложенной под SEQ ID NO: 45, для оптимальной экспрессии с промотором U6.

[000229] ДНК, кодирующую crRNA, изложенную в таблице 9, получали (Integrated DNA Technologies) и встраивали в конструкцию для экспрессии в функциональной связи с ДНК, кодирующей tracrRNA (например, ДНК, содержащая последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 63). Успешное лигирование последовательностей, кодирующих crRNA, подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами для скрининга векторов, приведенными в таблице 10, а последовательности, кодирующие последовательности gRNA (crRNA и tracrRNA), подтверждали с помощью анализа последовательностей с использованием праймеров для секвенирования векторов, также изложенных в таблице 10. Конструкции для экспрессии, содержащие правильные кодирующие gRNA последовательности под контролем промотора U6, нуклеиновую кислоту, кодирующую белок cas9, и ген устойчивости к пуромицину, фигура 12, амплифицировали и очищали.

[000230] Клоны 8029 А-А6, полученные в примере 1 и содержащие последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую приблизительно 92 повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1 (например, эталонную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 45), трансфицировали с помощью различных комбинаций crRNA, изложенной в таблице 9 (с последовательностью tracrRNA), гена устойчивости к пуромицину и гена эндонуклеазы CRISPR/Cas9. В одной комбинации ES-клетки трансфицировали последовательностями, нацеливающимися на систему CRISPR/Cas9, начиная с положений 190, 196, 274, 899, 905, 1006 и 1068 SEQ ID NO: 45 (например, с помощью конструкции (конструкций) для экспрессии, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вставки белка cas9 и/или gRNA, имеющие последовательности, изложенные под SEQ ID NO: 39, 44 и 46-50. Во второй комбинации ES-клетки трансфицировали с помощью системы CRISPR/Cas9, нацеливающейся на положения 196, 1006 и 1067 SEQ ID NO: 45 (например, с помощью конструкции (конструкций) для экспрессии, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вставки белка cas9 и/или ДНК, кодирующей gRNA, содержащей последовательности изложенные под SEQ ID NO: 39, 50 и 44, соответственно). В третьей комбинации ES-клетки трансфицировали с помощью вставок gRNA, нацеливающихся на положения 196, 272 и 1005 и 1067 SEQ ID NO: 45 (например, конструкции (конструкций), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок cas9 и/или вставки gRNA, содержащие последовательности, изложенные под SEQ ID NO: 39, 47, 50 и 44 соответственно).

[000231] Устойчивые к пуромицину клоны ES получали с помощью серийного разведения, культивировали в среде (500 мл среды KO DMEM, 95 мл инактивированной нагреванием FBS, 12 мл L-глутамина, 6 мл Penn-Strep, 6 мл заменимых аминокислот, 1,2 мл В-меркаптоэталона), размножали для анализа и замораживали. ДНК из каждого клона выделяли с помощью набора DNAase Blood and Tissue Kit в соответствии с протоколом производителя (Qiagen) и анализировали с помощью ПЦР с использованием прямых и обратных праймеров для скрининга клонов, указанных в таблице 10. ПЦР-продукты визуально анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, при этом ПЦР-продукты правильного размера экстрагировали, а затем секвенировали для подтверждения делеции целевой последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

[000232] Из ста шестидесяти (160) клонов было протестировано сто клонов, и одиннадцать (11) продемонстрировали делецию последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, например, что доказывает амплифицированный ПЦР-продукт между 300 и 700 парами оснований (данные не показаны). Анализ последовательности подтвердил делецию последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов (данные не показаны). Из трех исследованных комбинаций система CRISPR/Cas, нацеливающаяся на комбинацию положений 196, 1005 и 1067 SEQ ID NO: 45, оказалась наиболее эффективной в удалении последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов; эта комбинация привела к получению десяти из одиннадцати положительных клонов. Система CRISPR/Cas, нацеливающаяся на комбинацию положений 196, 272, 1005 и 1067 SEQ ID NO: 45 обеспечила получение одного клона.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[000233] Рассмотрев описанные таким образом некоторые аспекты по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения, специалисты в данной области будут понимать, что различные изменения, модификации и улучшения будут очевидны специалистам в данной области. Подразумевается, что такие изменения, модификации и улучшения являются частью настоящего изобретения, и подразумевается, что они находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения. Соответственно, вышеприведенные описание и графические материалы представлены исключительно в качестве примера, и настоящее изобретение подробно описано в нижеследующей формуле изобретения.

[000234] Порядковые термины, такие как «первый», «второй», «третий» и т.д., используемые в формуле изобретения для модификации элемента формулы изобретения, сами по себе не означают какой-либо приоритет, первоочередность или порядок расположения одного элемента формулы изобретения перед другим или временной порядок, в котором выполняются действия способа, но используются исключительно в качестве отметок для проведения различий между одним элементом формулы изобретения, имеющим определенное название, и другим элементом, имеющим такое же название (за исключением используемого порядкового термина), для проведения различий между элементами формулы изобретения.

[000235] Формы единственного числа в описании и формуле изобретения, если четко не указано противоположное, следует понимать как охватывающие определяемые объекты в форме множественного числа. Формула изобретения или описание, в которых содержится «или» между одним или более представителями группы, считаются удовлетворенными, если один, более одного или все представители группы присутствуют в указанном продукте или способе, используются в нем или иным образом имеют отношение к нему, если не указано противоположное или иное не очевидно из контекста. Настоящее изобретение охватывает варианты осуществления, в которых только один член группы присутствует в указанном продукте или способе, используется в них или иным образом имеет отношение к ним. Настоящее изобретение также охватывает варианты осуществления, в которых более одного или все члены группы присутствуют в указанном продукте или способе, используются в них или иным образом имеют отношение к ним. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.д. из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения входят в другой пункт формулы изобретения, зависимый от того же основного пункта формулы изобретения (или, в зависимости от того, что применимо, любого другого пункта формулы изобретения), если не указано иное или если среднему специалисту в данной области не будет очевидным возникновение противоречия или несоответствия. В тех случаях, когда элементы представлены в виде перечней (например, в виде группы Маркуша или в аналогичном формате), следует понимать, что также раскрыта каждая подгруппа элементов, и любой элемент(ы) можно исключить из группы. В целом, следует понимать, что в тех случаях, когда настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения упоминаются как содержащие конкретные элементы, признаки и т.д., определенные варианты осуществления настоящего изобретения или аспекты настоящего изобретения содержат или фактически содержат такие элементы, признаки и т.д. С целью упрощения такие варианты осуществления не были в каждом случае специально прямо изложены в данном документе. Также следует понимать, что любой вариант осуществления или аспект настоящего изобретения может быть явным образом исключен из формулы изобретения независимо от упоминания конкретного исключения в настоящем описании.

[000236] Специалистам в данной области будут понятны типичные стандартные отклонения или ошибки, присущие значениям, получаемым в анализах или других процессах, описанных в данном документе.

[000237] Публикации, веб-сайты и другие ссылочные материалы, приводимые в данном документе в качестве ссылки для описания уровня техники настоящего изобретения и для предоставления дополнительной информации касательно его практической реализации, включены в данный документ посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ридженерон Фармасьютикалс Инк.

Хеслин Дэвид

Элли Роксан

Сяо Ча Чжень

Лаи Ка Ман-Венюс

Валенсуэла Дэвид М.

Го Чунгуан

Ла Круа-Фралиш Майкл Макдональд Линн

Шарма Аарти

Каджимура Даисуке

Дрогетт Густаво

Френдуей Дэвид

<120> ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕСЯ ЭКСПАНСИЕЙ

ГЕКСАНУКЛЕОТИДНЫХ ПОВТОРОВ В ЛОКУСЕ C9ORF72

<130> 017283.1366/10267WO01

<150> 62402613

<151> 2016-09-30

<150> 62452795

<151> 2017-01-31

<160> 84

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гетерологичная гексануклеотидная последовательность

<400> 1

ggggcc 6

<210> 2

<211> 964

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

gggtctagca agagcaggtg tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct 60

ctccccacta cttgctctca cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag 120

attaaccaga agaaaacaag gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca 180

ggagtcgcgc gctatgcgat cgcggggccg gggccggggc cgcgatcgcg gggcgtggtc 240

ggggcgggcc cgggggcggg cccggggcgg ggctgcggtt gcggtgcctg cgcccgcggc 300

ggcggaggcg caggcggtgg cgagtgggtg agtgaggagg cggcatcctg gcgggtggct 360

gtttggggtt cggctgccgg gaagaggcgc gggtagaagc gggggctctc ctcagagctc 420

gacgcatttt tactttccct ctcatttctc tgaccgaagc tgggtgtcgg gctttcgcct 480

ctagcgactg gtggaattgc ctgcatccgg gccccgggct tcccggcggc ggcggcggcg 540

gcggcggcgc agggacaagg gatggggatc tggcctcttc cttgctttcc cgccctcagt 600

acccgagctg tctccttccc ggggacccgc tgggagcgct gccgctgcgg gctcgagaaa 660

agggagcctc gggtactgag aggcctcgcc tgggggaagg ccggagggtg ggcggcgcgc 720

ggcttctgcg gaccaagtcg gggttcgcta ggaacccgag acggtccctg ccggcgagga 780

gatcatgcgg gatgagatgg gggtgtggag acgcctgcac aatttcagcc caagcttcta 840

gagagtggtg atgacttgca tatgagggca gcaatgcaag tcggtgtgct ccccattctg 900

tgggacatga cctggttgct tcacagctcc gagatgacac agacttgctt aaaggaagtg 960

actc 964

<210> 3

<211> 1528

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

gggtctagca agagcaggtg tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct 60

ctccccacta cttgctctca cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag 120

attaaccaga agaaaacaag gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca 180

ggagtcgcgc gctatgcgat cgccgtctcg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 240

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 300

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 360

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 420

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 480

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 540

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 600

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 660

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 720

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cgagaccctc gagggccggc 780

cgctagcgcg atcgcggggc gtggtcgggg cgggcccggg ggcgggcccg gggcggggct 840

gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag tgggtgagtg 900

aggaggcggc atcctggcgg gtggctgttt ggggttcggc tgccgggaag aggcgcgggt 960

agaagcgggg gctctcctca gagctcgacg catttttact ttccctctca tttctctgac 1020

cgaagctggg tgtcgggctt tcgcctctag cgactggtgg aattgcctgc atccgggccc 1080

cgggcttccc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcgcaggg acaagggatg gggatctggc 1140

ctcttccttg ctttcccgcc ctcagtaccc gagctgtctc cttcccgggg acccgctggg 1200

agcgctgccg ctgcgggctc gagaaaaggg agcctcgggt actgagaggc ctcgcctggg 1260

ggaaggccgg agggtgggcg gcgcgcggct tctgcggacc aagtcggggt tcgctaggaa 1320

cccgagacgg tccctgccgg cgaggagatc atgcgggatg agatgggggt gtggagacgc 1380

ctgcacaatt tcagcccaag cttctagaga gtggtgatga cttgcatatg agggcagcaa 1440

tgcaagtcgg tgtgctcccc attctgtggg acatgacctg gttgcttcac agctccgaga 1500

tgacacagac ttgcttaaag gaagtgac 1528

<210> 4

<211> 3621

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8026 вставочная нуклеиновая кислота без плечей гомологии

<400> 4

gggtctagca agagcaggtg tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct 60

ctccccacta cttgctctca cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag 120

attaaccaga agaaaacaag gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca 180

ggagtcgcgc gctatgcgat cgcggggccg gggccggggc cgcgatcgcg gggcgtggtc 240

ggggcgggcc cgggggcggg cccggggcgg ggctgcggtt gcggtgcctg cgcccgcggc 300

ggcggaggcg caggcggtgg cgagtgggtg agtgaggagg cggcatcctg gcgggtggct 360

gtttggggtt cggctgccgg gaagaggcgc gggtagaagc gggggctctc ctcagagctc 420

gacgcatttt tactttccct ctcatttctc tgaccgaagc tgggtgtcgg gctttcgcct 480

ctagcgactg gtggaattgc ctgcatccgg gccccgggct tcccggcggc ggcggcggcg 540

gcggcggcgc agggacaagg gatggggatc tggcctcttc cttgctttcc cgccctcagt 600

acccgagctg tctccttccc ggggacccgc tgggagcgct gccgctgcgg gctcgagaaa 660

agggagcctc gggtactgag aggcctcgcc tgggggaagg ccggagggtg ggcggcgcgc 720

ggcttctgcg gaccaagtcg gggttcgcta ggaacccgag acggtccctg ccggcgagga 780

gatcatgcgg gatgagatgg gggtgtggag acgcctgcac aatttcagcc caagcttcta 840

gagagtggtg atgacttgca tatgagggca gcaatgcaag tcggtgtgct ccccattctg 900

tgggacatga cctggttgct tcacagctcc gagatgacac agacttgctt aaaggaagtg 960

actcgagata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 1020

ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 1080

agggcgcagc gagcgtcctg atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg cccgctgctc 1140

ataagactcg gccttagaac cccagtatca gcagaaggac attttaggac gggacttggg 1200

tgactctagg gcactggttt tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa agtagtccct 1260

tctcggcgat tctgcggagg gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga 1320

cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt 1380

tgtggatcgc tgtgatcgtc acttggtgag tagcgggctg ctgggctggc cggggctttc 1440

gtggccgccg ggccgctcgg tgggacggaa gcgtgtggag agaccgccaa gggctgtagt 1500

ctgggtccgc gagcaaggtt gccctgaact gggggttggg gggagcgcag caaaatggcg 1560

gctgttcccg agtcttgaat ggaagacgct tgtgaggcgg gctgtgaggt cgttgaaaca 1620

aggtgggggg catggtgggc ggcaagaacc caaggtcttg aggccttcgc taatgcggga 1680

aagctcttat tcgggtgaga tgggctgggg caccatctgg ggaccctgac gtgaagtttg 1740

tcactgactg gagaactcgg tttgtcgtct gttgcggggg cggcagttat ggcggtgccg 1800

ttgggcagtg cacccgtacc tttgggagcg cgcgccctcg tcgtgtcgtg acgtcacccg 1860

ttctgttggc ttataatgca gggtggggcc acctgccggt aggtgtgcgg taggcttttc 1920

tccgtcgcag gacgcagggt tcgggcctag ggtaggctct cctgaatcga caggcgccgg 1980

acctctggtg aggggaggga taagtgaggc gtcagtttct ttggtcggtt ttatgtacct 2040

atcttcttaa gtagctgaag ctccggtttt gaactatgcg ctcggggttg gcgagtgtgt 2100

tttgtgaagt tttttaggca ccttttgaaa tgtaatcatt tgggtcaata tgtaattttc 2160

agtgttagac tagtaaattg tccgctaaat tctggccgtt tttggctttt ttgttagacg 2220

tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa 2280

ctaaaccatg ggatcggcca ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 2340

ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 2400

cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 2460

tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 2520

tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 2580

cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 2640

catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 2700

ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 2760

ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 2820

ggcgcgcatg cccgacggcg atgatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 2880

tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 2940

ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 3000

atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 3060

cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aggggatccg ctgtaagtct gcagaaattg 3120

atgatctatt aaacaataaa gatgtccact aaaatggaag tttttcctgt catactttgt 3180

taagaagggt gagaacagag tacctacatt ttgaatggaa ggattggagc tacgggggtg 3240

ggggtggggt gggattagat aaatgcctgc tctttactga aggctcttta ctattgcttt 3300

atgataatgt ttcatagttg gatatcataa tttaaacaag caaaaccaaa ttaagggcca 3360

gctcattcct cccactcatg atctatagat ctatagatct ctcgtgggat cattgttttt 3420

ctcttgattc ccactttgtg gttctaagta ctgtggtttc caaatgtgtc agtttcatag 3480

cctgaagaac gagatcagca gcctctgttc cacatacact tcattctcag tattgttttg 3540

ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat 3600

gctatacgaa gttatgctag c 3621

<210> 5

<211> 1006

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8026 вставочная нуклеиновая кислота без плечей гомологии и после

вырезания neo

<400> 5

gggtctagca agagcaggtg tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct 60

ctccccacta cttgctctca cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag 120

attaaccaga agaaaacaag gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca 180

ggagtcgcgc gctatgcgat cgcggggccg gggccggggc cgcgatcgcg gggcgtggtc 240

ggggcgggcc cgggggcggg cccggggcgg ggctgcggtt gcggtgcctg cgcccgcggc 300

ggcggaggcg caggcggtgg cgagtgggtg agtgaggagg cggcatcctg gcgggtggct 360

gtttggggtt cggctgccgg gaagaggcgc gggtagaagc gggggctctc ctcagagctc 420

gacgcatttt tactttccct ctcatttctc tgaccgaagc tgggtgtcgg gctttcgcct 480

ctagcgactg gtggaattgc ctgcatccgg gccccgggct tcccggcggc ggcggcggcg 540

gcggcggcgc agggacaagg gatggggatc tggcctcttc cttgctttcc cgccctcagt 600

acccgagctg tctccttccc ggggacccgc tgggagcgct gccgctgcgg gctcgagaaa 660

agggagcctc gggtactgag aggcctcgcc tgggggaagg ccggagggtg ggcggcgcgc 720

ggcttctgcg gaccaagtcg gggttcgcta ggaacccgag acggtccctg ccggcgagga 780

gatcatgcgg gatgagatgg gggtgtggag acgcctgcac aatttcagcc caagcttcta 840

gagagtggtg atgacttgca tatgagggca gcaatgcaag tcggtgtgct ccccattctg 900

tgggacatga cctggttgct tcacagctcc gagatgacac agacttgctt aaaggaagtg 960

actcgagata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta tgctag 1006

<210> 6

<211> 4180

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8026 вставочная нуклеиновая кислота без плеча гомологии с кассетой neo

<400> 6

ggtctagcaa gagcaggtgt gggtttagga ggtgtgtgtt tttgtttttc ccaccctctc 60

tccccactac ttgctctcac agtactcgct gagggtgaac aagaaaagac ctgataaaga 120

ttaaccagaa gaaaacaagg agggaaacaa ccgcagcctg tagcaagctc tggaactcag 180

gagtcgcgcg ctatgcgatc gccgtctcgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 240

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 300

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 360

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 420

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 480

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 540

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 600

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 660

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg 720

ggccggggcc ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc gagaccctcg agggccggcc 780

gctagcgcga tcgcggggcg tggtcggggc gggcccgggg gcgggcccgg ggcggggctg 840

cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc ggtggcgagt gggtgagtga 900

ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct gccgggaaga ggcgcgggta 960

gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt tccctctcat ttctctgacc 1020

gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga attgcctgca tccgggcccc 1080

gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga caagggatgg ggatctggcc 1140

tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc ttcccgggga cccgctggga 1200

gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta ctgagaggcc tcgcctgggg 1260

gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca agtcggggtt cgctaggaac 1320

ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga gatgggggtg tggagacgcc 1380

tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac ttgcatatga gggcagcaat 1440

gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg ttgcttcaca gctccgagat 1500

gacacagact tgcttaaagg aagtgactcg agataacttc gtataatgta tgctatacga 1560

agttatatgc atggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc cccctcctca 1620

cggcgagcgc tgccacgtca gacgaagggc gcagcgagcg tcctgatcct tccgcccgga 1680

cgctcaggac agcggcccgc tgctcataag actcggcctt agaaccccag tatcagcaga 1740

aggacatttt aggacgggac ttgggtgact ctagggcact ggttttcttt ccagagagcg 1800

gaacaggcga ggaaaagtag tcccttctcg gcgattctgc ggagggatct ccgtggggcg 1860

gtgaacgccg atgattatat aaggacgcgc cgggtgtggc acagctagtt ccgtcgcagc 1920

cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg atcgctgtga tcgtcacttg gtgagtagcg 1980

ggctgctggg ctggccgggg ctttcgtggc cgccgggccg ctcggtggga cggaagcgtg 2040

tggagagacc gccaagggct gtagtctggg tccgcgagca aggttgccct gaactggggg 2100

ttggggggag cgcagcaaaa tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtga 2160

ggcgggctgt gaggtcgttg aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg 2220

tcttgaggcc ttcgctaatg cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca 2280

tctggggacc ctgacgtgaa gtttgtcact gactggagaa ctcggtttgt cgtctgttgc 2340

gggggcggca gttatggcgg tgccgttggg cagtgcaccc gtacctttgg gagcgcgcgc 2400

cctcgtcgtg tcgtgacgtc acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg 2460

ccggtaggtg tgcggtaggc ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag 2520

gctctcctga atcgacaggc gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag 2580

tttctttggt cggttttatg tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact 2640

atgcgctcgg ggttggcgag tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa 2700

tcatttgggt caatatgtaa ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc taaattctgg 2760

ccgtttttgg cttttttgtt agacgtgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca 2820

tagtataata cgacaaggtg aggaactaaa ccatgggatc ggccattgaa caagatggat 2880

tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac 2940

agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc 3000

tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc 3060

tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 3120

cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc 3180

ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 3240

atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 3300

ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 3360

cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgatgat ctcgtcgtga 3420

cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca 3480

tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg 3540

atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 3600

ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagggg 3660

atccgctgta agtctgcaga aattgatgat ctattaaaca ataaagatgt ccactaaaat 3720

ggaagttttt cctgtcatac tttgttaaga agggtgagaa cagagtacct acattttgaa 3780

tggaaggatt ggagctacgg gggtgggggt ggggtgggat tagataaatg cctgctcttt 3840

actgaaggct ctttactatt gctttatgat aatgtttcat agttggatat cataatttaa 3900

acaagcaaaa ccaaattaag ggccagctca ttcctcccac tcatgatcta tagatctata 3960

gatctctcgt gggatcattg tttttctctt gattcccact ttgtggttct aagtactgtg 4020

gtttccaaat gtgtcagttt catagcctga agaacgagat cagcagcctc tgttccacat 4080

acacttcatt ctcagtattg ttttgccaag ttctaattcc atcagacctc gacctgcagc 4140

ccctagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 4180

<210> 7

<211> 1566

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8028 вставочная нуклеиновая кислота с сайтом lox после вырезания

neo и без плечей гомологии

<400> 7

gggtctagca agagcaggtg tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct 60

ctccccacta cttgctctca cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag 120

attaaccaga agaaaacaag gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca 180

ggagtcgcgc gctatgcgat cgccgtctcg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 240

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 300

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 360

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 420

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 480

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 540

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 600

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 660

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg 720

gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cgagaccctc gagggccggc 780

cgctagcgcg atcgcggggc gtggtcgggg cgggcccggg ggcgggcccg gggcggggct 840

gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag tgggtgagtg 900

aggaggcggc atcctggcgg gtggctgttt ggggttcggc tgccgggaag aggcgcgggt 960

agaagcgggg gctctcctca gagctcgacg catttttact ttccctctca tttctctgac 1020

cgaagctggg tgtcgggctt tcgcctctag cgactggtgg aattgcctgc atccgggccc 1080

cgggcttccc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcgcaggg acaagggatg gggatctggc 1140

ctcttccttg ctttcccgcc ctcagtaccc gagctgtctc cttcccgggg acccgctggg 1200

agcgctgccg ctgcgggctc gagaaaaggg agcctcgggt actgagaggc ctcgcctggg 1260

ggaaggccgg agggtgggcg gcgcgcggct tctgcggacc aagtcggggt tcgctaggaa 1320

cccgagacgg tccctgccgg cgaggagatc atgcgggatg agatgggggt gtggagacgc 1380

ctgcacaatt tcagcccaag cttctagaga gtggtgatga cttgcatatg agggcagcaa 1440

tgcaagtcgg tgtgctcccc attctgtggg acatgacctg gttgcttcac agctccgaga 1500

tgacacagac ttgcttaaag gaagtgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg 1560

aagtta 1566

<210> 8

<211> 3821

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8026 нацеливающая нуклеиновая кислота с плечами гомологии и кассетой neo

<400> 8

gaaccgcggc gcgtcaagca gagacgagtt ccgcccacgt gaaagatggc gtttgtagtg 60

acagccatcc caattgccct ttccttctag gtggaaagtg gggtctagca agagcaggtg 120

tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct ctccccacta cttgctctca 180

cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag attaaccaga agaaaacaag 240

gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca ggagtcgcgc gctatgcgat 300

cgcggggccg gggccggggc cgcgatcgcg gggcgtggtc ggggcgggcc cgggggcggg 360

cccggggcgg ggctgcggtt gcggtgcctg cgcccgcggc ggcggaggcg caggcggtgg 420

cgagtgggtg agtgaggagg cggcatcctg gcgggtggct gtttggggtt cggctgccgg 480

gaagaggcgc gggtagaagc gggggctctc ctcagagctc gacgcatttt tactttccct 540

ctcatttctc tgaccgaagc tgggtgtcgg gctttcgcct ctagcgactg gtggaattgc 600

ctgcatccgg gccccgggct tcccggcggc ggcggcggcg gcggcggcgc agggacaagg 660

gatggggatc tggcctcttc cttgctttcc cgccctcagt acccgagctg tctccttccc 720

ggggacccgc tgggagcgct gccgctgcgg gctcgagaaa agggagcctc gggtactgag 780

aggcctcgcc tgggggaagg ccggagggtg ggcggcgcgc ggcttctgcg gaccaagtcg 840

gggttcgcta ggaacccgag acggtccctg ccggcgagga gatcatgcgg gatgagatgg 900

gggtgtggag acgcctgcac aatttcagcc caagcttcta gagagtggtg atgacttgca 960

tatgagggca gcaatgcaag tcggtgtgct ccccattctg tgggacatga cctggttgct 1020

tcacagctcc gagatgacac agacttgctt aaaggaagtg actcgagata acttcgtata 1080

atgtatgcta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg ggttttggcg cctcccgcgg 1140

gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga agggcgcagc gagcgtcctg 1200

atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg cccgctgctc ataagactcg gccttagaac 1260

cccagtatca gcagaaggac attttaggac gggacttggg tgactctagg gcactggttt 1320

tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa agtagtccct tctcggcgat tctgcggagg 1380

gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga cgcgccgggt gtggcacagc 1440

tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt tgtggatcgc tgtgatcgtc 1500

acttggtgag tagcgggctg ctgggctggc cggggctttc gtggccgccg ggccgctcgg 1560

tgggacggaa gcgtgtggag agaccgccaa gggctgtagt ctgggtccgc gagcaaggtt 1620

gccctgaact gggggttggg gggagcgcag caaaatggcg gctgttcccg agtcttgaat 1680

ggaagacgct tgtgaggcgg gctgtgaggt cgttgaaaca aggtgggggg catggtgggc 1740

ggcaagaacc caaggtcttg aggccttcgc taatgcggga aagctcttat tcgggtgaga 1800

tgggctgggg caccatctgg ggaccctgac gtgaagtttg tcactgactg gagaactcgg 1860

tttgtcgtct gttgcggggg cggcagttat ggcggtgccg ttgggcagtg cacccgtacc 1920

tttgggagcg cgcgccctcg tcgtgtcgtg acgtcacccg ttctgttggc ttataatgca 1980

gggtggggcc acctgccggt aggtgtgcgg taggcttttc tccgtcgcag gacgcagggt 2040

tcgggcctag ggtaggctct cctgaatcga caggcgccgg acctctggtg aggggaggga 2100

taagtgaggc gtcagtttct ttggtcggtt ttatgtacct atcttcttaa gtagctgaag 2160

ctccggtttt gaactatgcg ctcggggttg gcgagtgtgt tttgtgaagt tttttaggca 2220

ccttttgaaa tgtaatcatt tgggtcaata tgtaattttc agtgttagac tagtaaattg 2280

tccgctaaat tctggccgtt tttggctttt ttgttagacg tgttgacaat taatcatcgg 2340

catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg ggatcggcca 2400

ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 2460

atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 2520

aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg 2580

acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 2640

acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 2700

tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 2760

ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 2820

agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 2880

atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg 2940

atgatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 3000

gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 3060

cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 3120

tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 3180

agttcttctg aggggatccg ctgtaagtct gcagaaattg atgatctatt aaacaataaa 3240

gatgtccact aaaatggaag tttttcctgt catactttgt taagaagggt gagaacagag 3300

tacctacatt ttgaatggaa ggattggagc tacgggggtg ggggtggggt gggattagat 3360

aaatgcctgc tctttactga aggctcttta ctattgcttt atgataatgt ttcatagttg 3420

gatatcataa tttaaacaag caaaaccaaa ttaagggcca gctcattcct cccactcatg 3480

atctatagat ctatagatct ctcgtgggat cattgttttt ctcttgattc ccactttgtg 3540

gttctaagta ctgtggtttc caaatgtgtc agtttcatag cctgaagaac gagatcagca 3600

gcctctgttc cacatacact tcattctcag tattgttttg ccaagttcta attccatcag 3660

acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgctag 3720

cattgtgact tgggcatcac ttgactgatg gtaatcagtt gcagagagag aagtgcactg 3780

attaagtctg tccacacagg gtctgtctgg ccaggagtgc a 3821

<210> 9

<211> 4387

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 8026 вставочная нуклеиновая кислота с плечами гомологии,

гексануклеотидным(и) повтором(ами) и кассетой neo

<400> 9

gaaccgcggc gcgtcaagca gagacgagtt ccgcccacgt gaaagatggc gtttgtagtg 60

acagccatcc caattgccct ttccttctag gtggaaagtg gggtctagca agagcaggtg 120

tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct ctccccacta cttgctctca 180

cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag attaaccaga agaaaacaag 240

gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca ggagtcgcgc gctatgcgat 300

cgccgtctcg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 360

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 420

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 480

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 540

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 600

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 660

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 720

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 780

gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg 840

gccggggccg gggccggggc cgagaccctc gagggccggc cgctagcgcg atcgcggggc 900

gtggtcgggg cgggcccggg ggcgggcccg gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc 960

cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag tgggtgagtg aggaggcggc atcctggcgg 1020

gtggctgttt ggggttcggc tgccgggaag aggcgcgggt agaagcgggg gctctcctca 1080

gagctcgacg catttttact ttccctctca tttctctgac cgaagctggg tgtcgggctt 1140

tcgcctctag cgactggtgg aattgcctgc atccgggccc cgggcttccc ggcggcggcg 1200

gcggcggcgg cggcgcaggg acaagggatg gggatctggc ctcttccttg ctttcccgcc 1260

ctcagtaccc gagctgtctc cttcccgggg acccgctggg agcgctgccg ctgcgggctc 1320

gagaaaaggg agcctcgggt actgagaggc ctcgcctggg ggaaggccgg agggtgggcg 1380

gcgcgcggct tctgcggacc aagtcggggt tcgctaggaa cccgagacgg tccctgccgg 1440

cgaggagatc atgcgggatg agatgggggt gtggagacgc ctgcacaatt tcagcccaag 1500

cttctagaga gtggtgatga cttgcatatg agggcagcaa tgcaagtcgg tgtgctcccc 1560

attctgtggg acatgacctg gttgcttcac agctccgaga tgacacagac ttgcttaaag 1620

gaagtgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg catggcctcc 1680

gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 1740

agacgaaggg cgcagcgagc gtcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 1800

ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 1860

cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 1920

gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 1980

taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 2040

cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagtagc gggctgctgg gctggccggg 2100

gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 2160

tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcagcaaa 2220

atggcggctg ttcccgagtc ttgaatggaa gacgcttgtg aggcgggctg tgaggtcgtt 2280

gaaacaaggt ggggggcatg gtgggcggca agaacccaag gtcttgaggc cttcgctaat 2340

gcgggaaagc tcttattcgg gtgagatggg ctggggcacc atctggggac cctgacgtga 2400

agtttgtcac tgactggaga actcggtttg tcgtctgttg cgggggcggc agttatggcg 2460

gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg ccctcgtcgt gtcgtgacgt 2520

cacccgttct gttggcttat aatgcagggt ggggccacct gccggtaggt gtgcggtagg 2580

cttttctccg tcgcaggacg cagggttcgg gcctagggta ggctctcctg aatcgacagg 2640

cgccggacct ctggtgaggg gagggataag tgaggcgtca gtttctttgg tcggttttat 2700

gtacctatct tcttaagtag ctgaagctcc ggttttgaac tatgcgctcg gggttggcga 2760

gtgtgttttg tgaagttttt taggcacctt ttgaaatgta atcatttggg tcaatatgta 2820

attttcagtg ttagactagt aaattgtccg ctaaattctg gccgtttttg gcttttttgt 2880

tagacgtgtt gacaattaat catcggcata gtatatcggc atagtataat acgacaaggt 2940

gaggaactaa accatgggat cggccattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 3000

cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 3060

tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 3120

gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 3180

gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 3240

attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 3300

atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 3360

cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 3420

cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 3480

gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgatga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 3540

gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 3600

tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 3660

cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 3720

catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaggg gatccgctgt aagtctgcag 3780

aaattgatga tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt tcctgtcata 3840

ctttgttaag aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat tggagctacg 3900

ggggtggggg tggggtggga ttagataaat gcctgctctt tactgaaggc tctttactat 3960

tgctttatga taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa accaaattaa 4020

gggccagctc attcctccca ctcatgatct atagatctat agatctctcg tgggatcatt 4080

gtttttctct tgattcccac tttgtggttc taagtactgt ggtttccaaa tgtgtcagtt 4140

tcatagcctg aagaacgaga tcagcagcct ctgttccaca tacacttcat tctcagtatt 4200

gttttgccaa gttctaattc catcagacct cgacctgcag cccctagata acttcgtata 4260

atgtatgcta tacgaagtta tgctagcatt gtgacttggg catcacttga ctgatggtaa 4320

tcagttgcag agagagaagt gcactgatta agtctgtcca cacagggtct gtctggccag 4380

gagtgca 4387

<210> 10

<211> 1957

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc 120

agtgatgtcg actctttgcc caccgccatc tccagctgtt gccaagacag agattgcttt 180

aagtggcaaa tcacctttat tagcagctac ttttgcttac tgggacaata ttcttggtcc 240

tagagtaagg cacatttggg ctccaaagac agaacaggta cttctcagtg atggagaaat 300

aacttttctt gccaaccaca ctctaaatgg agaaatcctt cgaaatgcag agagtggtgc 360

tatagatgta aagttttttg tcttgtctga aaagggagtg attattgttt cattaatctt 420

tgatggaaac tggaatgggg atcgcagcac atatggacta tcaattatac ttccacagac 480

agaacttagt ttctacctcc cacttcatag agtgtgtgtt gatagattaa cacatataat 540

ccggaaagga agaatatgga tgcataagga aagacaagaa aatgtccaga agattatctt 600

agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg tcagagtatt attccaatgc ttactggaga 660

agtgattcct gtaatggaac tgctttcatc tatgaaatca cacagtgttc ctgaagaaat 720

agatatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagctgtc atgaaggctt 780

tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaagctggat gaagcagata ccatcttatg 840

ctcacctatg acaagatttg gaagaaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta 900

gggacattac gtatttgaac tgttgcttaa atttgtgtta tttttcactc attatatttc 960

tatatatatt tggtgttatt ccatttgcta tttaaagaaa ccgagtttcc atcccagaca 1020

agaaatcatg gccccttgct tgattctggt ttcttgtttt acttctcatt aaagctaaca 1080

gaatcctttc atattaagtt gtactgtaga tgaacttaag ttatttaggc gtagaacaaa 1140

attattcata tttatactga tctttttcca tccagcagtg gagtttagta cttaagagtt 1200

tgtgccctta aaccagactc cctggattaa tgctgtgtac ccgtgggcaa ggtgcctgaa 1260

ttctctatac acctatttcc tcatctgtaa aatggcaata atagtaatag tacctaatgt 1320

gtagggttgt tataagcatt gagtaagata aataatataa agcacttaga acagtgcctg 1380

gaacataaaa acacttaata atagctcata gctaacattt cctatttaca tttcttctag 1440

aaatagccag tatttgttga gtgcctacat gttagttcct ttactagttg ctttacatgt 1500

attatcttat attctgtttt aaagtttctt cacagttaca gattttcatg aaattttact 1560

tttaataaaa gagaagtaaa agtataaagt attcactttt atgttcacag tcttttcctt 1620

taggctcatg atggagtatc agaggcatga gtgtgtttaa cctaagagcc ttaatggctt 1680

gaatcagaag cactttagtc ctgtatctgt tcagtgtcag cctttcatac atcattttaa 1740

atcccatttg actttaagta agtcacttaa tctctctaca tgtcaatttc ttcagctata 1800

aaatgatggt atttcaataa ataaatacat taattaaatg atattatact gactaattgg 1860

gctgttttaa ggctcaataa gaaaatttct gtgaaaggtc tctagaaaat gtaggttcct 1920

atacaaataa aagataacat tgtgcttata aaaaaaa 1957

<210> 11

<211> 222

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys

35 40 45

Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn

50 55 60

His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile

65 70 75 80

Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser

85 90 95

Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu

100 105 110

Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His

115 120 125

Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile

130 135 140

Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu

145 150 155 160

Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu

165 170 175

Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser

180 185 190

His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp

195 200 205

Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Lys

210 215 220

<210> 12

<211> 3261

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 12

gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag 60

tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtgatg tcgactcttt 120

gcccaccgcc atctccagct gttgccaaga cagagattgc tttaagtggc aaatcacctt 180

tattagcagc tacttttgct tactgggaca atattcttgg tcctagagta aggcacattt 240

gggctccaaa gacagaacag gtacttctca gtgatggaga aataactttt cttgccaacc 300

acactctaaa tggagaaatc cttcgaaatg cagagagtgg tgctatagat gtaaagtttt 360

ttgtcttgtc tgaaaaggga gtgattattg tttcattaat ctttgatgga aactggaatg 420

gggatcgcag cacatatgga ctatcaatta tacttccaca gacagaactt agtttctacc 480

tcccacttca tagagtgtgt gttgatagat taacacatat aatccggaaa ggaagaatat 540

ggatgcataa ggaaagacaa gaaaatgtcc agaagattat cttagaaggc acagagagaa 600

tggaagatca gggtcagagt attattccaa tgcttactgg agaagtgatt cctgtaatgg 660

aactgctttc atctatgaaa tcacacagtg ttcctgaaga aatagatata gctgatacag 720

tactcaatga tgatgatatt ggtgacagct gtcatgaagg ctttcttctc aatgccatca 780

gctcacactt gcaaacctgt ggctgttccg ttgtagtagg tagcagtgca gagaaagtaa 840

ataagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa tgctccaggt 900

tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa ggcctgctaa 960

aggattcaac tggaagcttt gtgctgcctt tccggcaagt catgtatgct ccatatccca 1020

ccacacacat agatgtggat gtcaatactg tgaagcagat gccaccctgt catgaacata 1080

tttataatca gcgtagatac atgagatccg agctgacagc cttctggaga gccacttcag 1140

aagaagacat ggctcaggat acgatcatct acactgacga aagctttact cctgatttga 1200

atatttttca agatgtctta cacagagaca ctctagtgaa agccttcctg gatcaggtct 1260

ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc 1320

ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgcag aagggaaaaa 1380

agccctttaa atctcttcgg aacctgaaga tagaccttga tttaacagca gagggcgatc 1440

ttaacataat aatggctctg gctgagaaaa ttaaaccagg cctacactct tttatctttg 1500

gaagaccttt ctacactagt gtgcaagaac gagatgttct aatgactttt taaatgtgta 1560

acttaataag cctattccat cacaatcatg atcgctggta aagtagctca gtggtgtggg 1620

gaaacgttcc cctggatcat actccagaat tctgctctca gcaattgcag ttaagtaagt 1680

tacactacag ttctcacaag agcctgtgag gggatgtcag gtgcatcatt acattgggtg 1740

tctcttttcc tagatttatg cttttgggat acagacctat gtttacaata taataaatat 1800

tattgctatc ttttaaagat ataataatag gatgtaaact tgaccacaac tactgttttt 1860

ttgaaataca tgattcatgg tttacatgtg tcaaggtgaa atctgagttg gcttttacag 1920

atagttgact ttctatcttt tggcattctt tggtgtgtag aattactgta atacttctgc 1980

aatcaactga aaactagagc ctttaaatga tttcaattcc acagaaagaa agtgagcttg 2040

aacataggat gagctttaga aagaaaattg atcaagcaga tgtttaattg gaattgatta 2100

ttagatccta ctttgtggat ttagtccctg ggattcagtc tgtagaaatg tctaatagtt 2160

ctctatagtc cttgttcctg gtgaaccaca gttagggtgt tttgtttatt ttattgttct 2220

tgctattgtt gatattctat gtagttgagc tctgtaaaag gaaattgtat tttatgtttt 2280

agtaattgtt gccaactttt taaattaatt ttcattattt ttgagccaaa ttgaaatgtg 2340

cacctcctgt gccttttttc tccttagaaa atctaattac ttggaacaag ttcagatttc 2400

actggtcagt cattttcatc ttgttttctt cttgctaagt cttaccatgt acctgctttg 2460

gcaatcattg caactctgag attataaaat gccttagaga atatactaac taataagatc 2520

tttttttcag aaacagaaaa tagttccttg agtacttcct tcttgcattt ctgcctatgt 2580

ttttgaagtt gttgctgttt gcctgcaata ggctataagg aatagcagga gaaattttac 2640

tgaagtgctg ttttcctagg tgctactttg gcagagctaa gttatctttt gttttcttaa 2700

tgcgtttgga ccattttgct ggctataaaa taactgatta atataattct aacacaatgt 2760

tgacattgta gttacacaaa cacaaataaa tattttattt aaaattctgg aagtaatata 2820

aaagggaaaa tatatttata agaaagggat aaaggtaata gagcccttct gccccccacc 2880

caccaaattt acacaacaaa atgacatgtt cgaatgtgaa aggtcataat agctttccca 2940

tcatgaatca gaaagatgtg gacagcttga tgttttagac aaccactgaa ctagatgact 3000

gttgtactgt agctcagtca tttaaaaaat atataaatac taccttgtag tgtcccatac 3060

tgtgtttttt acatggtaga ttcttattta agtgctaact ggttattttc tttggctggt 3120

ttattgtact gttatacaga atgtaagttg tacagtgaaa taagttatta aagcatgtgt 3180

aaacattgtt atatatcttt tctcctaaat ggagaatttt gaataaaata tatttgaaat 3240

tttaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3261

<210> 13

<211> 481

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys

35 40 45

Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn

50 55 60

His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile

65 70 75 80

Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser

85 90 95

Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu

100 105 110

Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His

115 120 125

Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile

130 135 140

Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu

145 150 155 160

Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu

165 170 175

Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser

180 185 190

His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp

195 200 205

Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile

210 215 220

Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr

245 250 255

Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe

260 265 270

Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ser Thr

275 280 285

Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro

290 295 300

Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro

305 310 315 320

Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu

325 330 335

Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr

340 345 350

Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln

355 360 365

Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val

370 375 380

Phe Gln Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln

385 390 395 400

Phe Leu Leu Val Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile

405 410 415

Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn

420 425 430

Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile

435 440 445

Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe

450 455 460

Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr

465 470 475 480

Phe

<210> 14

<211> 3356

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 14

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120

ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180

atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 240

caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 300

ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 360

tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 420

aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 480

tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 540

aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 600

tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggaaa gacaagaaaa 660

tgtccagaag attatcttag aaggcacaga gagaatggaa gatcagggtc agagtattat 720

tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 780

cagtgttcct gaagaaatag atatagctga tacagtactc aatgatgatg atattggtga 840

cagctgtcat gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacttgcaaa cctgtggctg 900

ttccgttgta gtaggtagca gtgcagagaa agtaaataag atagtcagaa cattatgcct 960

ttttctgact ccagcagaga gaaaatgctc caggttatgt gaagcagaat catcatttaa 1020

atatgagtca gggctctttg tacaaggcct gctaaaggat tcaactggaa gctttgtgct 1080

gcctttccgg caagtcatgt atgctccata tcccaccaca cacatagatg tggatgtcaa 1140

tactgtgaag cagatgccac cctgtcatga acatatttat aatcagcgta gatacatgag 1200

atccgagctg acagccttct ggagagccac ttcagaagaa gacatggctc aggatacgat 1260

catctacact gacgaaagct ttactcctga tttgaatatt tttcaagatg tcttacacag 1320

agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtctttcag ctgaaacctg gcttatctct 1380

cagaagtact ttccttgcac agtttctact tgtccttcac agaaaagcct tgacactaat 1440

aaaatatata gaagacgata cgcagaaggg aaaaaagccc tttaaatctc ttcggaacct 1500

gaagatagac cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg ctctggctga 1560

gaaaattaaa ccaggcctac actcttttat ctttggaaga cctttctaca ctagtgtgca 1620

agaacgagat gttctaatga ctttttaaat gtgtaactta ataagcctat tccatcacaa 1680

tcatgatcgc tggtaaagta gctcagtggt gtggggaaac gttcccctgg atcatactcc 1740

agaattctgc tctcagcaat tgcagttaag taagttacac tacagttctc acaagagcct 1800

gtgaggggat gtcaggtgca tcattacatt gggtgtctct tttcctagat ttatgctttt 1860

gggatacaga cctatgttta caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat 1920

aataggatgt aaacttgacc acaactactg tttttttgaa atacatgatt catggtttac 1980

atgtgtcaag gtgaaatctg agttggcttt tacagatagt tgactttcta tcttttggca 2040

ttctttggtg tgtagaatta ctgtaatact tctgcaatca actgaaaact agagccttta 2100

aatgatttca attccacaga aagaaagtga gcttgaacat aggatgagct ttagaaagaa 2160

aattgatcaa gcagatgttt aattggaatt gattattaga tcctactttg tggatttagt 2220

ccctgggatt cagtctgtag aaatgtctaa tagttctcta tagtccttgt tcctggtgaa 2280

ccacagttag ggtgttttgt ttattttatt gttcttgcta ttgttgatat tctatgtagt 2340

tgagctctgt aaaaggaaat tgtattttat gttttagtaa ttgttgccaa ctttttaaat 2400

taattttcat tatttttgag ccaaattgaa atgtgcacct cctgtgcctt ttttctcctt 2460

agaaaatcta attacttgga acaagttcag atttcactgg tcagtcattt tcatcttgtt 2520

ttcttcttgc taagtcttac catgtacctg ctttggcaat cattgcaact ctgagattat 2580

aaaatgcctt agagaatata ctaactaata agatcttttt ttcagaaaca gaaaatagtt 2640

ccttgagtac ttccttcttg catttctgcc tatgtttttg aagttgttgc tgtttgcctg 2700

caataggcta taaggaatag caggagaaat tttactgaag tgctgttttc ctaggtgcta 2760

ctttggcaga gctaagttat cttttgtttt cttaatgcgt ttggaccatt ttgctggcta 2820

taaaataact gattaatata attctaacac aatgttgaca ttgtagttac acaaacacaa 2880

ataaatattt tatttaaaat tctggaagta atataaaagg gaaaatatat ttataagaaa 2940

gggataaagg taatagagcc cttctgcccc ccacccacca aatttacaca acaaaatgac 3000

atgttcgaat gtgaaaggtc ataatagctt tcccatcatg aatcagaaag atgtggacag 3060

cttgatgttt tagacaacca ctgaactaga tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa 3120

aaaatatata aatactacct tgtagtgtcc catactgtgt tttttacatg gtagattctt 3180

atttaagtgc taactggtta ttttctttgg ctggtttatt gtactgttat acagaatgta 3240

agttgtacag tgaaataagt tattaaagca tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc 3300

taaatggaga attttgaata aaatatattt gaaattttaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3356

<210> 15

<211> 481

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 15

Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys

35 40 45

Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn

50 55 60

His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile

65 70 75 80

Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser

85 90 95

Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu

100 105 110

Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His

115 120 125

Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile

130 135 140

Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu

145 150 155 160

Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu

165 170 175

Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser

180 185 190

His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp

195 200 205

Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile

210 215 220

Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr

245 250 255

Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe

260 265 270

Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ser Thr

275 280 285

Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro

290 295 300

Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro

305 310 315 320

Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu

325 330 335

Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr

340 345 350

Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln

355 360 365

Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val

370 375 380

Phe Gln Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln

385 390 395 400

Phe Leu Leu Val Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile

405 410 415

Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn

420 425 430

Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile

435 440 445

Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe

450 455 460

Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr

465 470 475 480

Phe

<210> 16

<211> 3198

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 16

gtgtccgggg cggggcggtc ccggggcggg gcccggagcg ggctgcggtt gcggtccctg 60

cgccggcggt gaaggcgcag cagcggcgag tggctattgc aagcgttcgg ataatgtgag 120

acctggaatg cagtgagacc tgggatgcag ggatgtcgac tatctgcccc ccaccatctc 180

ctgctgttgc caagacagag attgctttaa gtggtgaatc acccttgttg gcggctacct 240

ttgcttactg ggataatatt cttggtccta gagtaaggca tatttgggct ccaaagacag 300

accaagtgct tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag 360

aaattcttcg aaatgcagag agtggggcta tagatgtaaa attttttgtc ttatctgaaa 420

aaggggtaat tattgtttca ttaatcttcg acggaaactg gaatggagat cggagcactt 480

atggactatc aattatactg ccgcagacag agctgagctt ctacctccca cttcacagag 540

tgtgtgttga caggctaaca cacattattc gaaaaggaag aatatggatg cataaggaaa 600

gacaagaaaa tgtccagaaa attgtcttgg aaggcacaga gaggatggaa gatcagggtc 660

agagtatcat tcccatgctt actggggaag tcattcctgt aatggagctg cttgcatcta 720

tgaaatccca cagtgttcct gaagacattg atatagctga tacagtgctc aatgatgatg 780

acattggtga cagctgtcac gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacctgcaga 840

cctgtggctg ttccgttgta gttggcagca gtgcagagaa agtaaataag atagtaagaa 900

cgctgtgcct ttttctgaca ccagcagaga ggaaatgctc caggctgtgt gaagcagaat 960

cgtcctttaa gtacgaatcg ggactctttg tgcaaggctt gctaaaggat gcaacaggca 1020

gttttgtcct acccttccgg caagttatgt atgccccgta ccccaccacg cacattgatg 1080

tggatgtcaa cactgtcaag cagatgccac cgtgtcatga acatatttat aatcaacgca 1140

gatacatgag gtcagagctg acagccttct ggagggcaac ttcagaagag gacatggcgc 1200

aggacaccat catctacaca gatgagagct tcactcctga tttgaatatt ttccaagatg 1260

tcttacacag agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtcttccat ttgaagcctg 1320

gcctgtctct caggagtact ttccttgcac agttcctcct cattcttcac agaaaagcct 1380

tgacactaat caagtacatc gaggatgata cgcagaaggg gaaaaagccc tttaagtctc 1440

ttcggaacct gaagatagat cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg 1500

ctctagctga gaaaattaag ccaggcctac actctttcat ctttgggaga cctttctaca 1560

ctagtgtaca agaacgtgat gttctaatga ccttttgacc gtgtggtttg ctgtgtctgt 1620

ctcttcacag tcacacctgc tgttacagtg tctcagcagt gtgtgggcac atccttcctc 1680

ccgagtcctg ctgcaggaca gggtacacta cacttgtcag tagaagtctg tacctgatgt 1740

caggtgcatc gttacagtga atgactcttc ctagaataga tgtactcttt tagggcctta 1800

tgtttacaat tatcctaagt actattgctg tcttttaaag atatgaatga tggaatatac 1860

acttgaccat aactgctgat tggttttttg ttttgttttg tttgttttct tggaaactta 1920

tgattcctgg tttacatgta ccacactgaa accctcgtta gctttacaga taaagtgtga 1980

gttgacttcc tgcccctctg tgttctgtgg tatgtccgat tacttctgcc acagctaaac 2040

attagagcat ttaaagtttg cagttcctca gaaaggaact tagtctgact acagattagt 2100

tcttgagaga agacactgat agggcagagc tgtaggtgaa atcagttgtt agcccttcct 2160

ttatagacgt agtccttcag attcggtctg tacagaaatg ccgaggggtc atgcatgggc 2220

cctgagtatc gtgacctgtg acaagttttt tgttggttta ttgtagttct gtcaaagaaa 2280

gtggcatttg tttttataat tgttgccaac ttttaaggtt aattttcatt atttttgagc 2340

cgaattaaaa tgcgcacctc ctgtgccttt cccaatcttg gaaaatataa tttcttggca 2400

gagggtcaga tttcagggcc cagtcacttt catctgacca ccctttgcac ggctgccgtg 2460

tgcctggctt agattagaag tccttgttaa gtatgtcaga gtacattcgc tgataagatc 2520

tttgaagagc agggaagcgt cttgcctctt tcctttggtt tctgcctgta ctctggtgtt 2580

tcccgtgtca cctgcatcat aggaacagca gagaaatctg acccagtgct atttttctag 2640

gtgctactat ggcaaactca agtggtctgt ttctgttcct gtaacgttcg actatctcgc 2700

tagctgtgaa gtactgatta gtggagttct gtgcaacagc agtgtaggag tatacacaaa 2760

cacaaatatg tgtttctatt taaaactgtg gacttagcat aaaaagggag aatatattta 2820

ttttttacaa aagggataaa aatgggcccc gttcctcacc caccagattt agcgagaaaa 2880

agctttctat tctgaaaggt cacggtggct ttggcattac aaatcagaac aacacacact 2940

gaccatgatg gcttgtgaac taactgcaag gcactccgtc atggtaagcg agtaggtccc 3000

acctcctagt gtgccgctca ttgctttaca cagtagaatc ttatttgagt gctaattgtt 3060

gtctttgctg ctttactgtg ttgttataga aaatgtaagc tgtacagtga ataagttatt 3120

gaagcatgtg taaacactgt tatatatctt ttctcctaga tggggaattt tgaataaaat 3180

acctttgaaa ttctgtgt 3198

<210> 17

<211> 481

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 17

Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys

35 40 45

Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn

50 55 60

His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile

65 70 75 80

Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser

85 90 95

Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu

100 105 110

Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His

115 120 125

Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile

130 135 140

Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val Leu Glu

145 150 155 160

Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu

165 170 175

Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met Lys Ser

180 185 190

His Ser Val Pro Glu Asp Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp

195 200 205

Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile

210 215 220

Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr

245 250 255

Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe

260 265 270

Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ala Thr

275 280 285

Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro

290 295 300

Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro

305 310 315 320

Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu

325 330 335

Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr

340 345 350

Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln

355 360 365

Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val

370 375 380

Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln

385 390 395 400

Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile

405 410 415

Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn

420 425 430

Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile

435 440 445

Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe

450 455 460

Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr

465 470 475 480

Phe

<210> 18

<211> 3435

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

cgtttgtagt gtcagccatc ccaattgcct gttccttctc tgtgggagtg gtgtctagac 60

agtccaggca gggtatgcta ggcaggtgcg ttttggttgc ctcagatcgc aacttgactc 120

cataacggtg accaaagaca aaagaaggaa accagattaa aaagaaccgg acacagaccc 180

ctgcagaatc tggagcggcc gtggttgggg gcggggctac gacggggcgg actcgggggc 240

gtgggagggc ggggccgggg cggggcccgg agccggctgc ggttgcggtc cctgcgccgg 300

cggtgaaggc gcagcggcgg cgagtggcta ttgcaagcgt ttggataatg tgagacctgg 360

gatgcaggga tgtcgactat ctgcccccca ccatctcctg ctgttgccaa gacagagatt 420

gctttaagtg gtgaatcacc cttgttggcg gctacctttg cttactggga taatattctt 480

ggtcctagag taaggcacat ttgggctcca aagacagacc aagtactcct cagtgatgga 540

gaaatcactt ttcttgccaa ccacactctg aatggagaaa ttcttcggaa tgcggagagt 600

ggggcaatag atgtaaagtt ttttgtctta tctgaaaagg gcgtcattat tgtttcatta 660

atcttcgacg ggaactggaa cggagatcgg agcacttacg gactatcaat tatactgccg 720

cagacggagc tgagtttcta cctcccactg cacagagtgt gtgttgacag gctaacgcac 780

atcattcgaa aaggaaggat atggatgcac aaggaaagac aagaaaatgt ccagaaaatt 840

gtcttggaag gcaccgagag gatggaagat cagggtcaga gtatcatccc tatgcttact 900

ggggaggtca tccctgtgat ggagctgctt gcgtctatga gatcacacag tgttcctgaa 960

gacctcgata tagctgatac agtactcaat gatgatgaca ttggtgacag ctgtcatgaa 1020

ggctttcttc tcaatgccat cagctcacat ctgcagacct gcggctgttc tgtggtggta 1080

ggcagcagtg cagagaaagt aaataagata gtaagaacac tgtgcctttt tctgacacca 1140

gcagagagga agtgctccag gctgtgtgaa gccgaatcgt cctttaaata cgaatctgga 1200

ctctttgtac aaggcttgct aaaggatgcg actggcagtt ttgtactacc tttccggcaa 1260

gttatgtatg ccccttatcc caccacacac atcgatgtgg atgtcaacac tgtcaagcag 1320

atgccaccgt gtcatgaaca tatttataat caacgcagat acatgaggtc agagctgaca 1380

gccttctgga gggcaacttc agaagaggac atggctcagg acaccatcat ctacacagat 1440

gagagcttca ctcctgattt gaatattttc caagatgtct tacacagaga cactctagtg 1500

aaagcctttc tggatcaggt cttccatttg aagcctggcc tgtctctcag gagtactttc 1560

cttgcacagt tcctcctcat tcttcacaga aaagccttga cactaatcaa gtacatagag 1620

gatgacacgc agaaggggaa aaagcccttt aagtctcttc ggaacctgaa gatagatctt 1680

gatttaacag cagagggcga ccttaacata ataatggctc tagctgagaa aattaagcca 1740

ggcctacact ctttcatctt cgggagacct ttctacacta gtgtccaaga acgtgatgtt 1800

ctaatgactt tttaaacatg tggtttgctc cgtgtgtctc atgacagtca cacttgctgt 1860

tacagtgtct cagcgctttg gacacatcct tcctccaggg tcctgccgca ggacacgtta 1920

cactacactt gtcagtagag gtctgtacca gatgtcaggt acatcgttgt agtgaatgtc 1980

tcttttccta gactagatgt accctcgtag ggacttatgt ttacaaccct cctaagtact 2040

agtgctgtct tgtaaggata cgaatgaagg gatgtaaact tcaccacaac tgctggttgg 2100

ttttgttgtt tttgtttttt gaaacttata attcatggtt tacatgcatc acactgaaac 2160

cctagttagc tttttacagg taagctgtga gttgactgcc tgtccctgtg ttctctggcc 2220

tgtacgatct gtggcgtgta ggatcacttt tgcaacaact aaaaactaaa gcactttgtt 2280

tgcagttcta cagaaagcaa cttagtctgt ctgcagattc gtttttgaaa gaagacatga 2340

gaaagcggag ttttaggtga agtcagttgt tggatcttcc tttatagact tagtccttta 2400

gatgtggtct gtatagacat gcccaaccat catgcatggg cactgaatat cgtgaactgt 2460

ggtatgcttt ttgttggttt attgtacttc tgtcaaagaa agtggcattg gtttttataa 2520

ttgttgccaa gttttaaggt taattttcat tatttttgag ccaaattaaa atgtgcacct 2580

cctgtgcctt tcccaatctt ggaaaatata atttcttggc agaaggtcag atttcagggc 2640

ccagtcactt tcgtctgact tccctttgca cagtccgcca tgggcctggc ttagaagttc 2700

ttgtaaacta tgccagagag tacattcgct gataaaatct tctttgcaga gcaggagagc 2760

ttcttgcctc tttcctttca tttctgcctg gactttggtg ttctccacgt tccctgcatc 2820

ctaaggacag caggagaact ctgaccccag tgctatttct ctaggtgcta ttgtggcaaa 2880

ctcaagcggt ccgtctctgt ccctgtaacg ttcgtacctt gctggctgtg aagtactgac 2940

tggtaaagct ccgtgctaca gcagtgtagg gtatacacaa acacaagtaa gtgttttatt 3000

taaaactgtg gacttagcat aaaaagggag actatattta ttttttacaa aagggataaa 3060

aatggaaccc tttcctcacc caccagattt agtcagaaaa aaacattcta ttctgaaagg 3120

tcacagtggt tttgacatga cacatcagaa caacgcacac tgtccatgat ggcttatgaa 3180

ctccaagtca ctccatcatg gtaaatgggt agatccctcc ttctagtgtg ccacaccatt 3240

gcttcccaca gtagaatctt atttaagtgc taagtgttgt ctctgctggt ttactctgtt 3300

gttttagaga atgtaagttg tatagtgaat aagttattga agcatgtgta aacactgtta 3360

tacatctttt ctcctagatg gggaatttgg aataaaatac ctttaaaatt caaaaaaaaa 3420

aaaaaaaaaa aaaaa 3435

<210> 19

<211> 481

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 19

Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys

35 40 45

Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn

50 55 60

His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile

65 70 75 80

Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser

85 90 95

Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu

100 105 110

Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His

115 120 125

Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile

130 135 140

Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val Leu Glu

145 150 155 160

Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu

165 170 175

Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met Arg Ser

180 185 190

His Ser Val Pro Glu Asp Leu Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp

195 200 205

Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile

210 215 220

Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr

245 250 255

Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe

260 265 270

Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ala Thr

275 280 285

Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro

290 295 300

Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro

305 310 315 320

Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu

325 330 335

Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr

340 345 350

Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln

355 360 365

Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val

370 375 380

Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln

385 390 395 400

Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile

405 410 415

Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn

420 425 430

Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile

435 440 445

Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe

450 455 460

Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr

465 470 475 480

Phe

<210> 20

<211> 100

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 20

gaaccgcggc gcgtcaagca gagacgagtt ccgcccacgt gaaagatggc gtttgtagtg 60

acagccatcc caattgccct ttccttctag gtggaaagtg 100

<210> 21

<211> 2648

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кассета neo, фланкированная loxP, с 8026 и сайтами lox

<400> 21

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgcat ggcctccgcg ccgggttttg 60

gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc 120

agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac 180

tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct 240

agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc 300

gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg 360

ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat 420

cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg 480

ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc 540

cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cagcaaaatg gcggctgttc 600

ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga ggtcgttgaa acaaggtggg 660

gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt cgctaatgcg ggaaagctct 720

tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga 780

ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca 840

gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt 900

ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg 960

caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg 1020

gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg gttttatgta cctatcttct 1080

taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga 1140

agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta 1200

gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag acgtgttgac 1260

aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc 1320

atgggatcgg ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 1380

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 1440

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 1500

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 1560

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 1620

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 1680

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 1740

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 1800

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 1860

atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 1920

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 1980

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 2040

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 2100

cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat ccgctgtaag tctgcagaaa ttgatgatct 2160

attaaacaat aaagatgtcc actaaaatgg aagtttttcc tgtcatactt tgttaagaag 2220

ggtgagaaca gagtacctac attttgaatg gaaggattgg agctacgggg gtgggggtgg 2280

ggtgggatta gataaatgcc tgctctttac tgaaggctct ttactattgc tttatgataa 2340

tgtttcatag ttggatatca taatttaaac aagcaaaacc aaattaaggg ccagctcatt 2400

cctcccactc atgatctata gatctataga tctctcgtgg gatcattgtt tttctcttga 2460

ttcccacttt gtggttctaa gtactgtggt ttccaaatgt gtcagtttca tagcctgaag 2520

aacgagatca gcagcctctg ttccacatac acttcattct cagtattgtt ttgccaagtt 2580

ctaattccat cagacctcga cctgcagccc ctagataact tcgtataatg tatgctatac 2640

gaagttat 2648

<210> 22

<211> 100

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 22

attgtgactt gggcatcact tgactgatgg taatcagttg cagagagaga agtgcactga 60

ttaagtctgt ccacacaggg tctgtctggc caggagtgca 100

<210> 23

<211> 100

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 23

gaaccgcggc gcgtcaagca gagacgagtt ccgcccacgt gaaagatggc gtttgtagtg 60

acagccatcc caattgccct ttccttctag gtggaaagtg 100

<210> 24

<211> 2648

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кассета, фланкированная loxP, c 8028 и сайтами lox

<400> 24

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgcat ggcctccgcg ccgggttttg 60

gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc 120

agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac 180

tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct 240

agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc 300

gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg 360

ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat 420

cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg 480

ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc 540

cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cagcaaaatg gcggctgttc 600

ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga ggtcgttgaa acaaggtggg 660

gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt cgctaatgcg ggaaagctct 720

tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga 780

ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca 840

gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt 900

ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg 960

caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg 1020

gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg gttttatgta cctatcttct 1080

taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga 1140

agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta 1200

gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag acgtgttgac 1260

aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc 1320

atgggatcgg ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 1380

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 1440

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 1500

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 1560

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 1620

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 1680

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 1740

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 1800

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 1860

atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 1920

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 1980

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 2040

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 2100

cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat ccgctgtaag tctgcagaaa ttgatgatct 2160

attaaacaat aaagatgtcc actaaaatgg aagtttttcc tgtcatactt tgttaagaag 2220

ggtgagaaca gagtacctac attttgaatg gaaggattgg agctacgggg gtgggggtgg 2280

ggtgggatta gataaatgcc tgctctttac tgaaggctct ttactattgc tttatgataa 2340

tgtttcatag ttggatatca taatttaaac aagcaaaacc aaattaaggg ccagctcatt 2400

cctcccactc atgatctata gatctataga tctctcgtgg gatcattgtt tttctcttga 2460

ttcccacttt gtggttctaa gtactgtggt ttccaaatgt gtcagtttca tagcctgaag 2520

aacgagatca gcagcctctg ttccacatac acttcattct cagtattgtt ttgccaagtt 2580

ctaattccat cagacctcga cctgcagccc ctagataact tcgtataatg tatgctatac 2640

gaagttat 2648

<210> 25

<211> 100

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 25

attgtgactt gggcatcact tgactgatgg taatcagttg cagagagaga agtgcactga 60

ttaagtctgt ccacacaggg tctgtctggc caggagtgca 100

<210> 26

<211> 680

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 26

ccagtagcag cacccacgtc caccttctgt ctagtaatgt ccaacacctc cctcagtcca 60

aacactgctc tgcatccatg tggctcccat ttatacctga agcacttgat ggggcctcaa 120

tgttttacta gagcccaccc ccctgcaact ctgagaccct ctggatttgt ctgtcagtgc 180

ctcactgggg cgttggataa tttcttaaaa ggtcaagttc cctcagcagc attctctgag 240

cagtctgaag atgtgtgctt ttcacagttc aaatccatgt ggctgtttca cccacctgcc 300

tggccttggg ttatctatca ggacctagcc tagaagcagg tgtgtggcac ttaacaccta 360

agctgagtga ctaactgaac actcaagtgg atgccatctt tgtcacttct tgactgtgac 420

acaagcaact cctgatgcca aagccctgcc cacccctctc atgcccatat ttggacatgg 480

tacaggtcct cactggccat ggtctgtgag gtcctggtcc tctttgactt cataattcct 540

aggggccact agtatctata agaggaagag ggtgctggct cccaggccac agcccacaaa 600

attccacctg ctcacaggtt ggctggctcg acccaggtgg tgtcccctgc tctgagccag 660

ctcccggcca agccagcacc 680

<210> 27

<211> 1052

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 27

tgccatcatc acaggatgtc cttccttctc cagaagacag actggggctg aaggaaaagc 60

cggccaggct cagaacgagc cccactaatt actgcctcca acagctttcc actcactgcc 120

cccagcccaa catccccttt ttaactggga agcattccta ctctccattg tacgcacacg 180

ctcggaagcc tggctgtggg tttgggcatg agaggcaggg acaacaaaac cagtatatat 240

gattataact ttttcctgtt tccctatttc caaatggtcg aaaggaggaa gttaggtcta 300

cctaagctga atgtattcag ttagcaggag aaatgaaatc ctatacgttt aatactagag 360

gagaaccgcc ttagaatatt tatttcattg gcaatgactc caggactaca cagcgaaatt 420

gtattgcatg tgctgccaaa atactttagc tctttccttc gaagtacgtc ggatcctgta 480

attgagacac cgagtttagg tgactagggt tttcttttga ggaggagtcc cccaccccgc 540

cccgctctgc cgcgacagga agctagcgat ccggaggact tagaatacaa tcgtagtgtg 600

ggtaaacatg gagggcaagc gcctgcaaag ggaagtaaga agattcccag tccttgttga 660

aatccatttg caaacagagg aagctgccgc gggtcgcagt cggtgggggg aagccctgaa 720

ccccacgctg cacggctggg ctggccaggt gcggccacgc ccccatcgcg gcggctggta 780

ggagtgaatc agaccgtcag tattggtaaa gaagtctgcg gcagggcagg gagggggaag 840

agtagtcagt cgctcgctca ctcgctcgct cgcacagaca ctgctgcagt gacactcggc 900

cctccagtgt cgcggagacg caagagcagc gcgcagcacc tgtccgcccg gagcgagccc 960

ggcccgcggc cgtagaaaag gagggaccgc cgaggtgcgc gtcagtactg ctcagcccgg 1020

cagggacgcg ggaggatgtg gactgggtgg ac 1052

<210> 28

<211> 2008

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 28

gtggtgctga ctcagcatcg gttaataaac cctctgcagg aggctggatt tcttttgttt 60

aattatcact tggacctttc tgagaactct taagaattgt tcattcgggt ttttttgttt 120

tgttttggtt tggttttttt gggttttttt tttttttttt tttttggttt ttggagacag 180

ggtttctctg tatatagccc tggcacaaga gcaagctaac agcctgtttc ttcttggtgc 240

tagcgccccc tctggcagaa aatgaaataa caggtggacc tacaaccccc cccccccccc 300

ccagtgtatt ctactcttgt ccccggtata aatttgattg ttccgaacta cataaattgt 360

agaaggattt tttagatgca catatcattt tctgtgatac cttccacaca cccctccccc 420

ccaaaaaaat ttttctggga aagtttcttg aaaggaaaac agaagaacaa gcctgtcttt 480

atgattgagt tgggcttttg ttttgctgtg tttcatttct tcctgtaaac aaatactcaa 540

atgtccactt cattgtatga ctaagttggt atcattaggt tgggtctggg tgtgtgaatg 600

tgggtgtgga tctggatgtg ggtgggtgtg tatgccccgt gtgtttagaa tactagaaaa 660

gataccacat cgtaaacttt tgggagagat gatttttaaa aatgggggtg ggggtgaggg 720

gaacctgcga tgaggcaagc aagataaggg gaagacttga gtttctgtga tctaaaaagt 780

cgctgtgatg ggatgctggc tataaatggg cccttagcag cattgtttct gtgaattgga 840

ggatccctgc tgaaggcaaa agaccattga aggaagtacc gcatctggtt tgttttgtaa 900

tgagaagcag gaatgcaagg tccacgctct taataataaa caaacaggac attgtatgcc 960

atcatcacag gatgtccttc cttctccaga agacagactg gggctgaagg aaaagccggc 1020

caggctcaga acgagcccca ctaattactg cctccaacag ctttccactc actgccccca 1080

gcccaacatc ccctttttaa ctgggaagca ttcctactct ccattgtacg cacacgctcg 1140

gaagcctggc tgtgggtttg ggcatgagag gcagggacaa caaaaccagt atatatgatt 1200

ataacttttt cctgtttccc tatttccaaa tggtcgaaag gaggaagtta ggtctaccta 1260

agctgaatgt attcagttag caggagaaat gaaatcctat acgtttaata ctagaggaga 1320

accgccttag aatatttatt tcattggcaa tgactccagg actacacagc gaaattgtat 1380

tgcatgtgct gccaaaatac tttagctctt tccttcgaag tacgtcggat cctgtaattg 1440

agacaccgag tttaggtgac tagggttttc ttttgaggag gagtccccca ccccgccccg 1500

ctctgccgcg acaggaagct agcgatccgg aggacttaga atacaatcgt agtgtgggta 1560

aacatggagg gcaagcgcct gcaaagggaa gtaagaagat tcccagtcct tgttgaaatc 1620

catttgcaaa cagaggaagc tgccgcgggt cgcagtcggt ggggggaagc cctgaacccc 1680

acgctgcacg gctgggctgg ccaggtgcgg ccacgccccc atcgcggcgg ctggtaggag 1740

tgaatcagac cgtcagtatt ggtaaagaag tctgcggcag ggcagggagg gggaagagta 1800

gtcagtcgct cgctcactcg ctcgctcgca cagacactgc tgcagtgaca ctcggccctc 1860

cagtgtcgcg gagacgcaag agcagcgcgc agcacctgtc cgcccggagc gagcccggcc 1920

cgcggccgta gaaaaggagg gaccgccgag gtgcgcgtca gtactgctca gcccggcagg 1980

gacgcgggag gatgtggact gggtggac 2008

<210> 29

<211> 252

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд для блоттинга по Саузерну

<400> 29

ccggggcggg gctgcggttg cggtgcctgc gcccgcggcg gcggaggcgc aggcggtggc 60

gagtgggtga gtgaggaggc ggcatcctgg cgggtggctg tttggggttc ggctgccggg 120

aagaggcgcg ggtagaagcg ggggctctcc tcagagctcg acgcattttt actttccctc 180

tcatttctct gaccgaagct gggtgtcggg ctttcgcctc tagcgactgg tggaattgcc 240

tgcatccggg cc 252

<210> 30

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Asuragen 2-прямой праймер

<400> 30

tgcgcctccg ccgccgcggg cgcaggcacc gcaaccgca 39

<210> 31

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Asuragen 2-обратный праймер

<400> 31

cgcagcctgt agcaagctct ggaactcagg agtcg 35

<210> 32

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Asuragen 3-прямой праймер

<400> 32

atgcaggcaa ttccaccagt cgctagaggc gaaagc 36

<210> 33

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Asuragen 3-обратный праймер

<400> 33

taaccagaag aaaacaagga gggaaacaac cgcagcctgt 40

<210> 34

<211> 158

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 34

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120

ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggag 158

<210> 35

<211> 487

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 35

tatctccgga gcatttggat aatgtgacag ttggaatgca gtgatgtcga ctctttgccc 60

accgccatct ccagctgttg ccaagacaga gattgcttta agtggcaaat cacctttatt 120

agcagctact tttgcttact gggacaatat tcttggtcct agagtaaggc acatttgggc 180

tccaaagaca gaacaggtac ttctcagtga tggagaaata acttttcttg ccaaccacac 240

tctaaatgga gaaatccttc gaaatgcaga gagtggtgct atagatgtaa agttttttgt 300

cttgtctgaa aagggagtga ttattgtttc attaatcttt gatggaaact ggaatgggga 360

tcgcagcaca tatggactat caattatact tccacagaca gaacttagtt tctacctccc 420

acttcataga gtgtgtgttg atagattaac acatataatc cggaaaggaa gaatatggat 480

gcataag 487

<210> 36

<211> 198

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 36

gggtctagca agagcaggtg tgggtttagg aggtgtgtgt ttttgttttt cccaccctct 60

ctccccacta cttgctctca cagtactcgc tgagggtgaa caagaaaaga cctgataaag 120

attaaccaga agaaaacaag gagggaaaca accgcagcct gtagcaagct ctggaactca 180

ggagtcgcgc gctatgcg 198

<210> 37

<211> 118

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 37

gcgatcgcgg ggcgtggtcg gggcgggccc gggggcgggc ccggggcggg gctgcggttg 60

cggtgcctgc gcccgcggcg gcggaggcgc aggcggtggc gagtgggtga gtgaggag 118

<210> 38

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 38

agtactgtga gagcaagtag 20

<210> 39

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 39

gctctcacag tactcgctga 20

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 40

ccgcagcctg tagcaagctc 20

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 41

cggccgctag cgcgatcgcg 20

<210> 42

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 42

acgccccgcg atcgcgctag 20

<210> 43

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 43

tggcgagtgg gtgagtgagg 20

<210> 44

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 44

ggaagaggcg cgggtagaag 20

<210> 45

<211> 1302

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 45

gaacttacgg agtcccacga gggaaccgcg gcgcgtcaag cagagacgag ttccgcccac 60

gtgaaagatg gcgtttgtag tgacagccat cccaattgcc ctttccttct aggtggaaag 120

tggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct 180

ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa 240

agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact 300

caggagtcgc gcgctatgcg atcgccgtct cggggccggg gccggggccg gggccggggc 360

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 420

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 480

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 540

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 600

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 660

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 720

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 780

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccggggccg gggccggggc 840

cggggccggg gccggggccg gggccggggc cggggccggg gccgagaccc tcgagggccg 900

gccgctagcg cgatcgcggg gcgtggtcgg ggcgggcccg ggggcgggcc cggggcgggg 960

ctgcggttgc ggtgcctgcg cccgcggcgg cggaggcgca ggcggtgcga gtgggtgagt 1020

gaggaggcgg catcctggcg ggtggctgtt tggggttcgg ctgccgggaa gaggcgcggg 1080

tagaagcggg ggctctcctc agagctcgac gcatttttac tttccctctc atttctctga 1140

ccgaagctgg gtgtcgggct ttcgcctcta gcgactggtg gaattgcctg catccgggcc 1200

ccgggcttcc cggcggcggc ggcggcggcg gcggcgcagg gacaagggat ggggatctgg 1260

cctcttcctt gctttcccgc cctcagtacc cgagctgtct cc 1302

<210> 46

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 46

gagtactgtg agagcaagta g 21

<210> 47

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 47

gccgcagcct gtagcaagct c 21

<210> 48

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 48

gcggccgcta gcgcgatcgc g 21

<210> 49

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 49

gacgccccgc gatcgcgcta g 21

<210> 50

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 50

gtggcgagtg ggtgagtgag g 21

<210> 51

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 51

acaccgctct cacagtactc gctgag 26

<210> 52

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 52

acaccgccgc agcctgtagc aagctcg 27

<210> 53

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 53

acaccgagta ctgtgagagc aagtagg 27

<210> 54

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 54

acaccgacgc cccgcgatcg cgctagg 27

<210> 55

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 55

acaccgcggc cgctagcgcg atcgcgg 27

<210> 56

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 56

acaccgtggc gagtgggtga gtgaggg 27

<210> 57

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 57

acaccggaag aggcgcgggt agaagg 26

<210> 58

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 58

gacgcgttaa tgccaacttt 20

<210> 59

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 59

gagggcctat ttcccatgat 20

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 60

gacgcgttaa tgccaacttt 20

<210> 61

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 61

gaacttacgg agtcccacga 20

<210> 62

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 62

ggagacagct cgggtactga 20

<210> 63

<211> 82

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 63

gttggaacca ttcaaaacag catagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 60

aaaagtggca ccgagtcggt gc 82

<210> 64

<211> 76

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 64

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 65

<211> 86

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 65

gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 86

<210> 66

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 66

catcccaatt gccctttcc 19

<210> 67

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 67

cccacacctg ctcttgctag a 21

<210> 68

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 68

tctaggtgga aagtggg 17

<210> 69

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 69

gagcaggtgt gggtttagga 20

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 70

ccaggtctca ctgcattcca 20

<210> 71

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 71

attgcaagcg ttcggataat gtgaga 26

<210> 72

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 72

gctgtcacga aggctttctt c 21

<210> 73

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 73

gcactgctgc caactacaac 20

<210> 74

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 74

tcaatgccat cagctcacac ctgc 24

<210> 75

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 75

aagaggcgcg ggtagaa 17

<210> 76

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 76

cagcttcggt cagagaaatg ag 22

<210> 77

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 77

ctctcctcag agctcgacgc attt 24

<210> 78

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 78

ctgcacaatt tcagcccaag 20

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 79

caggtcatgt cccacagaat 20

<210> 80

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 80

catatgaggg cagcaatgca agtc 24

<210> 81

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LNA-зонд для смысловой РНК G4C2

<220>

<221> TYE563

<222> (1)..(1)

<400> 81

ccccggcccc ggcccc 16

<210> 82

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LNA-зонд для антисмысловой РНК G4C2

<220>

<221> TYE563

<222> (1)..(1)

<400> 82

ggggccgggg ccggggggcc cc 22

<210> 83

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК-зонд для смысловой РНК G4C2

<220>

<221> Cy3

<222> (18)..(18)

<400> 83

ccccggcccc ggccccgg 18

<210> 84

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК-зонд для антисмысловой РНК G4C2

<220>

<221> Cy3

<222> (17)..(17)

<400> 84

ggggccgggg ccggggc 17

<---

1. Грызун для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащий последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где грызун представляет собой крысу или мышь.

2. Грызун по п. 1, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере тридцать повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.

3. Грызун по п. 1, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере 90 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.

4. Грызун по п. 1, где грызун характеризуется (i) повышенной экспрессией транскриптов C9orƒ72 по сравнению с грызуном, содержащим локус C9orƒ72 дикого типа, (ii) повышенным количеством очагов РНК по сравнению с грызуном, содержащим локус C9orƒ72 дикого типа, (iii) повышенным уровнем белков с дипептидными повторами по сравнению с грызуном, содержащим локус C9orƒ72 дикого типа, или (iv) любой комбинацией (i)-(iii).

5. Грызун по п. 1, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит в направлении от 5' к 3': первую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, непрерывные повторы гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, и вторую гексануклеотидную фланкирующую последовательность,

где по меньшей мере часть некодирующей последовательности, охватывающей экзон 1 и стартовый кодон ATG эндогенного локуса C9orƒ72, заменена последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

6. Грызун по п. 5, где первая гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:36, а вторая гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:37.

7. Грызун по п. 1, где грызун представляет собой мышь.

8. Грызун по п. 7, где грызун представляет собой мышь, где эндогенный локус C9orƒ72 содержит в направлении от 5' к 3':

(i) последовательность C9orƒ72 мыши, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:23,

(ii) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией повторов, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, или ее варианты,

(iii) последовательность C9orƒ72 мыши, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:25, и

(iv) кодирующие экзоны C9orƒ72 мыши, и

где мышь проявляет все из следующих трех характеристик: (i) повышенную экспрессию транскриптов C9orƒ72 по сравнению с мышью, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, (ii) повышенное количество очагов РНК по сравнению с мышью, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, и (iii) повышенный уровень белков с дипептидными повторами по сравнению с мышью, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа.

9. Грызун по п. 1, где грызун является гомозиготным по последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

10. Грызун по п. 1, где грызун является гетерозиготным по последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

11. Грызун по п. 10, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, представляет собой первую последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, где грызун также является гетерозиготным по второй последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, и где первая последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит количество повторов, отличное от второй последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

12. Грызун по п. 11, где первая последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит от одного до трех повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, а вторая последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит от четырех до ста повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.

13. Клетка грызуна для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащая последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где клетка грызуна представляет собой клетку крысы или клетку мыши.

14. Клетка грызуна для получения грызуна для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащая последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где клетка грызуна представляет собой клетку крысы или клетку мыши.

15. Эмбриональная стволовая клетка грызуна для разработки новых терапевтических средств для лечения заболеваний, ассоциированных с локусом C9orƒ72, в геноме которой содержится последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку крысы или эмбриональную стволовую клетку мыши.

16. Иммортализованная клеточная линия для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащая последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где иммортализованная клеточная линия получена из эмбриональной стволовой клетки по п. 15.

17. Иммортализованная клеточная линия для получения грызуна для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащая последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где иммортализованная клеточная линия получена из эмбриональной стволовой клетки по п. 15.

18. Эмбрион грызуна для получения грызуна для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащий последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где эмбрион грызуна получен из эмбриональной стволовой клетки по п. 15 и где эмбрион грызуна представляет собой эмбрион крысы или эмбрион мыши.

19. Способ получения грызуна, в геноме которого содержится гексануклеотидная последовательность, при этом способ предусматривает

модифицирование генома грызуна для содержания последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72 и в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, и

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где грызун представляет собой крысу или мышь.

20. Способ по п. 19, где модифицирование обеспечивается за счет способа, предусматривающего

(a) введение в эмбриональную стволовую клетку крысы или мыши конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей вставочную нуклеиновую кислоту, где вставочная нуклеиновая кислота содержит в направлении от 5' к 3' (i) 5'-плечо гомологии, которое гомологично целевой 5'-последовательности локуса C9orƒ72, (ii) последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, и (iii) 3'-плечо гомологии, которое гомологично целевой 5'-последовательности локуса C9orƒ72;

(b) получение генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки крысы или мыши из (а) и

(c) создание крысы или мыши с применением генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки крысы или мыши из (b).

21. Способ по п. 20, где вставочная нуклеиновая кислота дополнительно содержит между 5'- и 3'-плечами гомологии один или более генов, кодирующих один или более селективных маркеров.

22. Способ по п. 20, где вставочная нуклеиновая кислота дополнительно содержит один или более сайтов для сайт-специфической рекомбинации между 5'- и 3'-плечами гомологии.

23. Способ по п. 22, где вставочная нуклеиновая кислота дополнительно содержит между 5'- и 3'-плечами гомологии ген рекомбиназы и ген селективного маркера, фланкированные сайтами распознавания для рекомбиназы, при этом сайты распознавания для рекомбиназы ориентированы для направленного вырезания.

24. Способ по п. 20, где 5'-плечо гомологии идентично или фактически идентично экзону 1 эндогенного локуса C9orƒ72 или его части.

25. Способ по п. 20, где 5'-плечо гомологии содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:23.

26. Способ по п. 20, где 3'-плечо гомологии идентично или фактически идентично по меньшей мере части интрона 1 эндогенного локуса C9orƒ72.

27. Способ по п. 26, где 3'-плечо гомологии содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:25.

28. Способ по п. 20, где вставочная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4.

29. Способ по п. 20, где вставочная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:6.

30. Способ по п. 20, дополнительно предусматривающий стадию скрещивания грызуна, полученного на стадии (с), с тем, чтобы получить грызуна, гомозиготного по вставке.

31. Способ по п. 19, где грызун представляет собой мышь.

32. Грызун для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, которого получают с помощью способа по п. 19, содержащий последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где грызун представляет собой крысу или мышь.

33. Способ идентификации кандидатного терапевтического средства для лечения заболевания или состояния, ассоциированных с наличием последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, при этом способ предусматривает

(a) введение кандидатного средства грызуну или в клетку грызуна, содержащие последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где грызун или клетка грызуна характеризуются (i) повышенной экспрессией транскриптов C9orƒ72 по сравнению с грызуном или клеткой грызуна, содержащими локус C9orƒ72 дикого типа, (ii) повышенным количеством очагов РНК по сравнению с грызуном или клеткой грызуна, содержащими локус C9orƒ72 дикого типа, (iii) повышенным уровнем белков с дипептидными повторами по сравнению с грызуном или клеткой грызуна, содержащими локус C9orƒ72 дикого типа, или (iv) любой комбинацией (i)-(iii);

(b) проведение одного или более анализов для измерения уровня продукта гена C9orƒ72, экспрессируемого грызуном или полученной из него клеткой грызуна, где продукт гена C9orƒ72 выбран из группы, состоящей из смысловой РНК C9orƒ72, антисмысловой РНК C9orƒ72, очагов РНК, содержащих смысловую или антисмысловую РНК C9orƒ72, и белков с дипептидными повторами; и

(c) идентификацию кандидатного средства, которое снижает уровень продукта гена C9orƒ72, выбранного из группы, состоящей из смысловой РНК C9orƒ72, антисмысловой РНК C9orƒ72, очагов РНК, содержащих смысловую или антисмысловую РНК C9orƒ72, и белков с дипептидными повторами, экспрессируемого грызуном или клеткой грызуна, в качестве кандидатного терапевтического средства,

где грызун представляет собой крысу или мышь или где клетка грызуна представляет собой клетку крысы или клетку мыши.

34. Способ по п. 33, где кандидатное средство вводят in vivo грызуну или в клетку грызуна и при этом необязательно проводят in vitro анализ ткани, выделенной из грызуна или клетки грызуна, после введения кандидатного средства.

35. Способ по п. 33, где кандидатное средство вводят in vitro в двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки грызуна.

36. Способ по п. 33, где анализ представляет собой количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) для выявления продуктов гена C9orƒ72.

37. Способ по п. 36, где qPCR выполняют с праймером и/или зондом, имеющими нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80 или любой их комбинацией.

38. Способ по п. 33, где анализ представляет собой измерение очагов РНК, содержащих транскрипты смысловой или антисмысловой РНК C9orƒ72.

39. Способ по п. 38, где анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию in situ с применением одного или более зондов, имеющих нуклеотидную последовательность, изложенную под любой из SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 и/или SEQ ID NO:84.

40. Способ по п. 33, где анализ представляет собой измерение белков с дипептидными повторами polyGA.

41. Способ по любому из пп. 33-40, где кандидатное средство выбрано из группы, состоящей из антитела, gRNA и siRNA.

42. Грызун по п. 5, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, или ее варианты.

43. Клетка грызуна по п. 13, где клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетку головного мозга, клетку коры, нейронную клетку, мышечную клетку, клетку сердца или зародышевую клетку.

44. Клетка грызуна по п. 13, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере тридцать повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.

45. Клетка грызуна по п. 13, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере 90 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.

46. Клетка грызуна по п. 13, где клетка грызуна характеризуется (i) повышенной экспрессией транскриптов C9orƒ72 по сравнению с клеткой грызуна, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, (ii) повышенным количеством очагов РНК по сравнению с клеткой грызуна, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, (iii) повышенным уровнем белков с дипептидными повторами по сравнению с клеткой грызуна, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, или (iv) любой комбинацией (i)-(iii).

47. Клетка грызуна по п. 13, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит в направлении от 5' к 3': первую гексануклеотидную фланкирующую последовательность, непрерывные повторы гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, и вторую гексануклеотидную фланкирующую последовательность,

где по меньшей мере часть некодирующей последовательности, охватывающей экзон 1 и стартовый кодон ATG эндогенного локуса C9orƒ72, заменена последовательностью, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.

48. Клетка грызуна по п. 46, где первая гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:36, а вторая гексануклеотидная фланкирующая последовательность содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:37.

49. Клетка грызуна по п. 13, где клетка грызуна представляет собой клетку мыши.

50. Клетка грызуна по п. 13, где клетка грызуна представляет собой клетку мыши, где эндогенный локус C9orƒ72 содержит в направлении от 5' к 3':

(i) последовательность C9orƒ72 мыши, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:23,

(ii) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией повторов, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, или ее варианты,

(iii) последовательность C9orƒ72 мыши, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:25, и

(iv) кодирующие экзоны C9orƒ72 мыши, и

где клетка мыши проявляет все из следующих трех характеристик: (i) повышенную экспрессию транскриптов C9orƒ72 по сравнению с мышью, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, (ii) повышенное количество очагов РНК по сравнению с мышью, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа, и (iii) повышенный уровень белков с дипептидными повторами по сравнению с мышью, содержащей локус C9orƒ72 дикого типа.

51. Клетка грызуна по п. 46, где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, или ее варианты.

52. Двигательный нейрон для разработки новых терапевтических средств для лечения нарушений у человека, ассоциированных с локусом C9orƒ72, содержащий последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orƒ72,

где последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов,

(i) содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1,

(ii) находится в функциональной связи с эндогенной регуляторной последовательностью C9orƒ72 и

(iii) экспрессируется с эндогенного промотора C9orƒ72, и

где двигательный нейрон получен из эмбриональной стволовой клетки по п. 15.