Композиции и способы для лечения диабета 1 типа

Группа изобретений относится к лечению сахарного диабета 1-го типа (T1D). Предложена молочнокислая бактерия (LAB) для лечения T1D посредством доставки в слизистую оболочку полипептида интерлейкина-2 (IL-2) и полипептида T1D-специфического антигена, где указанная LAB содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид IL-2, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид T1D-специфического антигена. При этом указанная LAB способна продуцировать указанный полипептид IL-2 и указанный полипептид T1D-специфического антигена. При этом указанный полипептид T1D-специфического антигена представляет собой: проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), инсулинома-ассоциированный белок 2 (IA-2), каталитическую субъединицу связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), транспортер цинка 8 (ZnT8), хромогранин A, (препро) островковый амилоидный полипептид (ppIAPP), периферин или цитруллинированный глюкозорегулируемый белок (GRP). Предложена также композиция для лечения T1D посредством доставки в слизистую оболочку полипептида IL-2 и полипептида T1D-специфического антигена, содержащая в эффективном количестве (а) первую LAB, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид IL-2 и способную продуцировать указанный полипептид IL-2, и (б) вторую LAB, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид T1D-специфического антигена и способную продуцировать указанный полипептид T1D-специфического антигена. Указанные LAB или композиция используются в составе фармацевтической композиции, а также применяются в способе лечения T1D у нуждающегося в этом субъекта-млекопитающего. Группа изобретений обеспечивает стимуляцию и активацию Treg клеток. 5 н. и 35 з. п. ф-лы, 23 ил., 5 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/278,493, поданной 14 января 2016 года, и предварительной заявке на патент США №62/350,472, поданной 15 июня 2016 года, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и таким образом полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Упомянутая копия в формате ASCII, созданная 10 января 2017 года, названа 205350-0030-00-WO-549987_SL.txt и имеет размер 189 854 байта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Приблизительно 10-15 миллионов человек страдают от сахарного диабета 1-го типа (T1D), который представляет собой наиболее распространенное метаболическое расстройство в младенчестве и подростковом возрасте, затрагивающее 112000 детей в возрасте до 16 лет только в Европе. T1D возникает вследствие прогрессирующего иммунно-опосредованного разрушения островковых бета-клеток поджелудочной железы, продуцирующих инсулин ("бета-клеток"), у генетически предрасположенных лиц, приводящего к хронической гипергликемии, которая вызывает микро- и макрососудистые осложнения. См., например, van Belle, T.L. et al., Physiol. Rev. 2011, 91(1): 79-118. В то время как для некоторых аутоиммунных заболеваний доступны различные варианты терапии, в настоящее время не существует одобренных вариантов терапии T1D. Пациентам с T1D требуется пожизненное введение инсулина. Более того, долгосрочная терапия требует многопрофильного подхода, включающего врачей, медсестер, диетологов и других специалистов.

[004] Единственной терапевтической стратегией при аутоиммунных заболеваниях, как в контексте краткосрочной терапии, так и при длительных схемах лечения, является блокирование аутореактивных эффекторных Т-клеток с применением генерализованной иммуносупрессии. Полагают, что активация или экспансия регуляторных Т-клеток (Treg) способна восстанавливать баланс между эффекторными Т-клетками и Treg-клетками и может обеспечить достижение той же цели без токсичности, ассоциированной с иммуносупрессией.

[005] Интерлейкин-2 ("IL-2") имеет ключевые функции в иммунной системе, в первую очередь, благодаря своему прямому воздействию на Т-клетки. В тимусе, где Т-клетки созревают, он предотвращает развитие аутоиммунных заболеваний, способствуя дифференцировке некоторых незрелых Т-клеток в регуляторные Т-клетки, которые подавляют другие Т-клетки, которые в противном случае были бы примированы для атаки на здоровые клетки в организме. При более высоких концентрациях IL-2 также способствует дифференцировке Т-клеток в эффекторные Т-клетки и в Т-клетки памяти, в случае, когда исходная Т-клетка также стимулируется антигеном, тем самым помогая организму бороться с инфекциями.

[006] Первоначально нативный IL-2 был идентифиуцирован как фактор роста лимфоцитов и сочтен в первую очередь способствующим эффекторному ответу Т-клеток in vivo, таким образом был разработан рекомбинантный IL-2 для лечения состояний, требующих стимуляции эффекторных Т-клеток, а именно, рака и инфекционных заболеваний. Однако было показано, что IL-2 отвечает за дифференциацию, выживание и функционирование эффекторных Т-клеток, поскольку у нокаутных по IL-2 мышей развивается аутоиммунное заболевание, опосредованное Т-клетками. Известно, что IL-2 является цитокином, критичным для развития, экспансии, выживания и периферической активности Treg-клеток. Дефицит продуцирования IL-2 или отсутствие ответа на IL-2 приводит к утрате функций Treg-клеток и повышению аутоиммунитета. Treg-клетки конститутивно экспрессируют тримерный высокоаффинный рецептор к IL-2 (IL-2Rαβγ) с более высокими уровнями, чем эффекторные Т-клетки CD4+ и CD8+, NK-клетки и эозинофилы. Стимулирование передачи сигналов STAT5a в Treg-клетках происходит при более низких дозах IL-2, чем в эффекторных Т-клетках. Следовательно, IL-2 в низких дозах, по-видимому, стимулирует предпочтительную активацию Treg-клеток и способствует их выживанию in vivo. См., например, Yu, A., et al., Diabetes 2015, 64: 2172-2183.

[007] В клинических исследованиях введение IL-2 вызывало иммунологические изменения, но не меняло параметров метаболизма глюкозы. См., например, Hartemann A. et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013; 1:295-305; и Rosenzwajg M. et a., J Autoimmun. 2015; 58:48-58.

[008] Фармацевтические препараты IL-2 вводят путем инъекции. Хотя пероральная доставка кажется перспективной, например, в силу простоты введения, деградация в желудочно-кишечном тракте и низкий уровень абсорбции обычно делают этот путь неэффективным для доставки полипептидов. Для препаратов, основанных на полипептидах, также исследуются альтернативные способы применения, например, назальное, ректальное, легочное и глазное применение.

[009] Для доставки терапевтических молекул в ткани слизистой оболочки использовались генетически модифицированные бактерии. См., например, Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; и Robert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11.

[0010] Было показано, что кишечное введение антигенов, участвующих в бета-клеточном аутоиммунитете, с помощью генетически модифицированного штамма Lactococcus lactis, угнетает T1D у NOD-мышей посредством стимуляции Foxp3+ Treg-клеток. Пероральное введение генетически измененного штамма Lactococcus lactis направляет проинсулин (PINS) человека совместно с IL-10 человека в слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и в сочетании с системным антителом против CD3 в низкой дозе восстанавливает долгосрочную толерантность иммунной системы почти у 60% NOD мышей с впервые выявленным диабетом. См., например, Robert, S. et a.l., Diabetes 2014, 63: 2876-2887; и Takiishi, Т. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725. Однако переход к клиническому применению такой антигенспецифической комбинированной терапии, включающей дополнительные иммуномодуляторы, такие как антитела против CD3, затрудняется, например, тем, что Fc-модифицированные антитела против CD3 человека не были одобрены регулирующими организациями для лечения T1D.

[0011] В данной области техники существует потребность в эффективных, направленных и контролируемых способах лечения T1D, без побочных действий и системной токсичности. Такие стратегии должны облегчать введение, повышать безопасность и в идеале улучшать эффективность и снижать терапевтически эффективные дозы. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих потребностей.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПУТЕМ ССЫЛКИ

[0012] Все публикации, патенты и патентные заявки в данном документе включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была специально и индивидуально указана как включенная посредством ссылки. В случае противоречия между термином в настоящей заявке и термином в источнике, включенном посредством ссылки, термин в настоящей заявке имеет преимущественную силу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] Соответственно, предложены композиции и способы, включающие живые молочнокислые бактерии (LAB), например, генетически модифицированные штаммы Lactococcus lactis (LL), в качестве средств доставки в слизистую оболочку IL-2 в низкой дозе, например, в комбинации с TlD-специфическими аутоантигенами, такими как проинсулин (PINS). Указанные LAB генетически модифицированы для экспрессии биоактивных полипептидов, вызывающих биологические реакции, которые, в свою очередь, блокируют дальнейшее аутоиммунное разрушение бета-клеток поджелудочной железы. Такая стратегия может способствовать регрессии сформировавшегося T1D, например, у субъектов с достаточной остаточной функцией бета-клеток и, таким образом, обеспечивать "истинное" лечение аутоиммунного диабета. Такие композиции можно вводить перорально, например, в форме фармацевтического препарата с энтеросолюбильным покрытием, который транспортирует бактерии в желудочно-кишечный тракт, например, в нижнюю часть желудочно-кишечного тракта (например, дистальные отделы толстой кишки), где они будут секретировать подходящую низкую дозу IL-2, в некоторых случаях - в комбинации с TlD-специфическим антигеном (например, PINS).

[0014] Предлагаемая композиция содержит ферментирующую молочную кислоту бактерию (LAB), содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид интерлейкина-2 (IL-2), и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид специфического антигена диабета 1-го типа (T1D). В качестве альтернативы, предлагаемая композиция содержит первую LAB, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид интерлейкина-2 (IL-2), и вторую LAB, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид специфического антигена диабета 1-го типа (T1D). Эта композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Указанная LAB может быть адаптирована для доставки в слизистую оболочку IL-2 в низкой дозе при введении субъекту-млекопитающему.

[0015] В одном аспекте указанная LAB может быть выбрана из группы, состоящей изо: вида Lactococcus, вида Lactobacillus, вида Bifidobacterium, вида Streptococcus и вида Enterococcus. Указанная LAB может представлять собой вид Lactococcus. Например, указанная LAB может представлять собой Lactococcus lactis. В качестве альтернативы, указанная LAB может быть выбрана из группы, состоящей из: Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviarius subsp. arqffinosus, Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillu sparacasei subsp. tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei subsp. camosus, Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius subsp. salicinius, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis subsp.mali, Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis, Lactobacillus zeae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pallens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureasiticus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum, Enterococcus xiangfangensis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus tigurinus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridans и Streptococcus zooepidemicus.

[0016] В другом аспекте указанный T1D-специфический антиген может быть выбран из группы, состоящей из следующего: проинсулин (PINS), декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD65), инсулинома-ассоциированный белок 2 (IA-2), каталитическая субъединица связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), транспортер цинка 8 (ZnT8), хромогранин А, (препро) островковый амилоидный полипептид (ppIAPP), периферии и цитруллинированный глюкозо-регулируемый белок (GRP). Например, указанный T1D-специфический антиген может представлять собой PINS.

[0017] В другом аспекте LAB может содержать указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IL-2, и указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена. В качестве альтернативы, первая LAB может содержать указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IL-2, а вторая LAB может содержать указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, может быть интегрирована в хромосому указанной LAB. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена, может быть интегрирована в хромосому указанной LAB или может присутствовать на плазмиде, содержащейся в указанной LAB. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена, может быть интегрирована в хромосому указанной LAB. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена, может быть частью полицистронной единицы экспрессии, регулируемой одним и тем же промотором.

[0018] В еще одном аспекте указанный IL-2 может представлять собой мембраносвязанную форму IL-2 или растворимую форму IL-2. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, может кодировать вариант полипептида IL-2. Указанный вариант полипептида IL-2 может иметь уменьшенную активность IL-2 или повышенную активность IL-2 по сравнению с соответствующим полипептидом IL-2 дикого типа. Указанный вариант полипептида IL-2 может быть выбран из группы, состоящей из: алдеслейкина, тецелейкина и биолейкина. Например, указанный вариант полипептида IL-2 содержит:

(a) первую аминокислотную замену по сравнению со зрелым IL-2 дикого типа, выбранную из группы, состоящей из L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K; или

(b) вторую аминокислотную замену по сравнению со зрелым IL-2 дикого типа, выбранную из группы, состоящей из F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R и F42K; или

(c) третью аминокислотную замену по сравнению со зрелым IL-2 дикого типа, выбранную из группы, состоящей из Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K; или

(d) их сочетание.

[0019] Предложенная композиция может содержать Lactococcus lactis, где указанная Lactococcus lactis содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IL-2, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую PINS, и где указанная Lactococcus lactis адаптирована для доставки в слизистую оболочку IL-2 в низкой дозе при введении субъекту-млекопитающему. Указанная доставка низкой дозы IL-2 может составлять от приблизительно 0,01 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 5,4 млн. МЕ/сут/субъекта; от приблизительно 0,02 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3,0 млн. МЕ/сут/субъекта; от приблизительно 0,1 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3,0 млн. МЕ/сут/субъекта; или от приблизительно 0,2 млн. МЕ/сут/субъекта до 2,0 млн. МЕ/сут/субъекта.

[0020] Также предлагается применение данной композиции для лечения T1D у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в этом. Предложенный способ лечения сахарного диабета 1-го типа (T1D) включает введение нуждающемуся в этом субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества данной композиции.

[0021] В одном аспекте при данном способе лечения T1D указанному субъекту не вводят антитело против CD3. В качестве альтернативы, данный способ лечения T1D дополнительно включает введение указанному субъекту антитела против CD3. Указанное антитело против CD3 можно вводить в низкой дозе одновременно с указанной композицией указанному субъекту. Указанное антитело против CD3 можно вводить указанному субъекту внутривенно.

[0022] В другом аспекте у указанного субъекта может присутствовать остаточная функция бета-клеток. У указанного субъекта может присутствовать недавно выявленный T1D. Указанный субъект может иметь концентрацию С-пептида в крови или моче, указывающую на остаточную функцию бета-клеток. Указанный субъект может быть пациентом-человеком, имеющим концентрацию в крови натощак С-пептида менее приблизительно 1 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 0,2 нмоль/л; или стимулированную концентрацию С-пептида в крови менее приблизительно 4 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 0,5 нмоль/л. T1D у указанного субъекта может быть диагностирован в течение 12 месяцев до введения указанной композиции.

[0023] В следующем аспекте указанную композицию можно вводить указанному субъекту в слизистую оболочку. Указанную композицию можно вводить указанному субъекту в жидкой форме. Указанную композицию можно вводить указанному субъекту в виде пищевого продукта, пищевой добавки или суппозитория. Указанную композицию можно вводить в виде единичной лекарственной формы, содержащей от приблизительно 1×10⁴ до приблизительно 1×10¹²; от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹²; или от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ). Указанная единичная дозированная форма может быть выбрана из группы, состоящей из: капсулы, таблетки, гранулы, суппозитория и дозированного аэрозоля. Указанная композиция может быть в форме сухого порошка или в прессованном варианте.

[0024] Кроме того, предложен генетически модифицированный микроорганизм, содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IL-2; и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена. Например, указанный микроорганизм может представлять собой LAB. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-2 и/или полипептид T1D-специфического антигена, может быть стабильно интегрирована в хромосому этого микроорганизма.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0025] Фиг. 1: нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 46), кодирующая гибрид лидера секреции usp45 (SSusp45) и гена hIL-2, кодирующего интерлейкин-2 человека (hIL-2, UniProt: Р60568, аа 21-153), ниже экспрессируемого на высоком уровне гена фосфопирувата гидратазы (eno; Gene ID: 4797432; локализация: NC_009004.1 (606184..607485)), содержащая межгенную область, предшествующую экспрессированному на высоком уровне гену L30 рибосомного белка MG1363 50S L. lactis (rpmD; Gene ID: 4797873; локализация: NC_009004.1 (2316732..2316911, комплемент)) между еnо и SSusp45.

[0026] Фиг. 2: схематическое представление генетических локусов LL-IL-2 (ΔthyA, trePTS (ΔtrePP), otsB, ΔptcC и eno >> hIL-2) с межгенными областями и размерами продуктов амплификации ПЦР (пар нуклеотидов, п.н.).

[0027] Фиг. 3: пример плазмиды-носителя с основной цепью, состоящей из фрагмента pORI19, к которому был добавлен модуль экспрессии PhllA>>β-глюкуронидаза (uidA; Gene ID: 946149); карго-области (область встраивания), содержащей pins ниже от gapB, сцепленной межгенной областью rpmD, фланкированной кроссоверными (ХО) областями, расположенными в позициях 5'и 3' от eno>>hil-2; а также маркера отбора с помощью эритромицина: устойчивый к эритромицину ген 23S РНК метилазы (еrmС).

[0028] Фиг. 4: анализ в агарозном 1,2% геле фрагментов ПЦР, полученных из LL-IL-2.

[0029] Фиг. 5: вестерн-блоттинг, демонстрирующий присутствие hIL-2 в супернатантах культуры LL-IL-2.

[0030] Фиг. 6: нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 57), кодирующая слияние лидера секреции usp45 (SSusp45), с геном pins, кодирующим проинсулин человека (PINS; UniProt: Р01308, аа 25-110), ниже экспрессируемого на высоком уровне гена глицеральдегида 3-фосфатдегидрогеназы (gapB; Gene ID: 4797877; локализация: NC_009004.1 (2492509..2493519, комплемент)), содержащая межгенную область, предшествующую экспрессированному на высоком уровне гену L30 рибосомного белка L. lactis MG1363 50S (rpmD; Gene ID: 4797873; локализация: NC_009004.1 (2316732..2316911, комплемент), см., например, Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003; 21(7):785-789) между gapB и pins.

[0031] Фиг. 7: схематическое представление соответствующих генетических локусов LL-PINS/IL-2: ΔthyA, trePTS (ΔtrePP), otsB, ptcC-, gapB>>pins и eno>>hil-2 с указанием соответствующих сайтов связывания олигонуклеотидов, сайта рестрикции EcoRI, (/усеченных/) генетических признаков, межгенных областей (IR), размеров продуктов амплификации ПЦР (п.н.).

[0032] Фиг. 8: пример плазмиды-носителя с основной цепью, которая состоит из фрагмента pORI19, к которому добавлен модуль экспрессии PhllA>>β-глюкуронидазы (uidA; Gene ID: 946149); карго-области, содержащей pins ниже gapB, сцепленной межгенной областью rpmD, и фланкированной кроссоверными (ХО) областями, расположенными в позициях 5' и 3' от gapB>>pins; а также маркера отбора с помощью эритромицина: устойчивый к эритромицину ген 23S РНК метилазы (ermC).

[0033] Фиг. 9: анализ в агарозном 1,2% геле фрагментов ПЦР, полученных из LL-PINS/IL-2.

[0034] Фиг. 10А и 10В результаты вестерн-блоттинга, показывающие (1) присутствие PINS (черная стрелка) в супернатантах культуры LL-Pins/IL-2, (Фиг. 10А) и (2) присутствие hIL-2 (незаштрихованная стрелка) в супернатантах культуры LL-PINS/IL-2(Фиг. 10В).

[0035] Фиг. 11: стабильная регрессия гипергликемии у NOD-мышей с впервые выявленным диабетом при примере антигенспецифической терапии в соответствии с настоящим изобретением. NOD-мыши с впервые выявленным диабетом получали лечение, описанное в настоящей заявке, например, в Примере 3, и концентрации глюкозы в крови наблюдали в течение 14 недель после начала лечения. Показан процент мышей, сохранявших диабетический статус при лечении доставкой в слизистую оболочку LL-PINS или доставкой в слизистую оболочку LL-PINS+LL-IL-2.

[0036] Фиг. 12: эффективность примера антигенспецифической терапии в соответствии с настоящим изобретением у мышей с недавно выявленным диабетом с начальной концентрацией глюкозы в крови более или менее 350 мг/дл. Показан процент мышей, сохранявших диабетический статус при лечении с помощью доставки в слизистую оболочку LL-PINS+LL-IL-2, описанной в настоящей заявке, например, в Примере 3.

[0037] Фиг. 13: сравнение биологической активности LL-IL-2 с рекомбинантным IL-2 человека (rhIL-2).

[0038] Фиг. 14А и 14В: концентрации живых бактерий (Фиг. 14А: КОЕ/ткань, Фиг. 14В: КОЕ/г соответственно) в разных тканях ЖКТ в разные моменты времени после введения однократной дозы (10¹⁰ КОЕ) LL-IL-2 у не страдающих ожирением мышей с диабетом. Все столбики представляют среднее значение от 3 мышей (n=3). SIP=проксимальная тонкая кишка; SID = дистальная тонкая кишка; CAE = слепая кишка; СОР = проксимальная толстая кишка; COD = дистальная толстая кишка.

[0039] Фиг. 15: структура плазмиды pAGX0053. Основная цепь плазмиды содержит фрагмент pT1NX, к которому добавлен модуль экспрессии PthyA>>SSusp45::hpins. PthyA, промотор гена тимидилатсинтазы. EmR: маркер отбора с помощью эритромицина; repD, герЕ: гены репликации.

[0040] Фиг. 16: вестерн-блоттинг, показывающий наличие полноразмерного, полученного из плазмиды, PINS в супернатантах культуры LL-PINS.

[0041] Фиг. 17: частоты ремиссии диабета у NOD-мышей с впервые выявленным диабетом, получавших различные рекомбинантные бактерии. Результаты показывают, что доставленный в слизистую оболочку LL-IL-2 (например, введение в низкой дозе IL-2), в некоторых случаях - в сочетании с примером T1D-специфического антигена (то есть PINS) в соответствии с настоящим изобретением стимулирует ремиссию диабета и вызывает стабильную регрессию гипергликемии у NOD-мышей с впервые выявленным диабетом. Мыши получали лечение в течение 6 недель, как описано в настоящей заявке, и измеряли концентрации глюкозы в крови, включая 14 недель после начала лечения. Показан процент мышей, у которых оставался диабет (логранговый критерий Мантеля-Кокса; ** p<0,01).

[0042] Фиг. 18: частоты ремиссии диабета в зависимости от начальных концентраций глюкозы в крови. Результаты показывают, что начальные концентрации глюкозы в крови способны прогнозировать успех терапии у мышей. Мышей с недавно выявленным диабетом стратифицировали исходя из начального (до лечения) уровня глюкозы в крови ниже или выше 350 мг/дл. Полученные результаты показывают, что доставка в слизистую оболочку LL-IL-2, в некоторых случаях - в сочетании с примером антигенспецифической терапии (например, PINS), в соответствии с настоящим изобретением особенно эффективна у мышей с недавно выявленным диабетом с начальной концентрацией глюкозы в крови ниже 350 мг/дл. Показан процент мышей, которые имели диабет при лечении LL-IL-2 или LL-PINS+LL-IL-2, описанным в настоящей заявке. Следует отметить, что 6 мышей, получавших только LL-IL-2 и имеющих уровень глюкозы ниже 350 мг/дл, обозначенные как "LL-IL2<350 (n=9)", были умерщвлены после 6 недель лечения, а 3 мышей наблюдали в течение всего 14-недельного периода. Точка данных для LL-IL-2>350 (n=6) (сплошной треугольник) скрыта за точкой данных для не получавших лечения Untreated>350 (n=16) (сплошной квадрат). Все получавшие лечение LL-IL-2 мыши с концентрацией глюкозы >350 мг/дл, все еще имели диабет после 6 недель лечения и после 14-недельного периода наблюдения (логранговый критерий Мантеля-Кокса; **** p<0,0001).

[0043] Фиг. 19: оценка степени инсулита в островковых бета-клетках у NOD мышей с диабетом. Полученные результаты показывают, что доставленный в слизистую оболочку LL-IL-2 (например, введение IL-2 в низкой дозе), в некоторых случаях - в сочетании с примером антигенспецифической терапии в соответствии с настоящим изобретением (например, LL-PINS+LL-IL-2) не только предотвращал ухудшение инсулита (обычно наблюдаемое при прогрессировании к длительному диабету при отсутствии лечения), но и снижал инсулит островковых бета-клеток по сравнению с мышами с недавно выявленным диабетом и не получавшими лечения мышами с длительным диабетом (например, уменьшает инсулит до степени, сравнимой с инсулитом, обнаруженным у "нормогликемических" NOD-мышей с длительным диабетом). После лечения степень тяжелого инсулита изменилась в сторону улучшения, по сравнению с не получавшими лечения мышами с длительным диабетом. Процент бета-клеток без инсулита резко возрос по сравнению с мышами с недавно выявленным диабетом и не получавшими лечения мышами с длительным диабетом. У значительного процента островков мягкий инсулит изменился в сторону улучшения до "пери-инсулита" или "отсутствия инсулита". Неожиданно это значительное снижение степени инсулита наблюдалось у всех получавших лечение мышей с недавно выявленным диабетом (с ремиссией и без ремиссии - классифицированных как "излеченные" и "неизлеченные").

[0044] Фиг. 20: Измеренные не натощак концентрации С-пептида в плазме NOD мышей с диабетом. Полученные результаты показывают, что IL-2 в низкой дозе с проинсулином или без проинсулина сохраняет функцию бета-клеток у NOD мышей с диабетом. После 6 недель лечения LL-IL-2, в некоторых случаях - в сочетании с примером антигенспецифической терапии в соответствии с настоящим изобретением (например, LL-PINS+LL-IL-2) концентрации С-пептида в плазме у мышей с недавно выявленным диабетом, показавших ремиссию (классифицированных как "излеченные") увеличивались по сравнению с мышами с недавно выявленным диабетом и не получавшими лечения мышами с длительным диабетом (Т-критерий Манна-Уитни, * p<0,05). Концентрации С-пептида в плазме получавших лечение, но "неизлеченных" мышей не были обнаружены (ND), свидетельствуя, что у таких мышей активные бета-клетки могут практически отсутствовать. Уровни С-пептида, измеренные у 3 из 4 проанализированных не получавших лечения мышей с длительным диабетом, также не были обнаружены.

[0045] Фиг. 21: Экспансия регуляторных foxp3+CTLA4+ Т-клеток в разных субпопуляциях иммунных клеток, локально (т.е. брыжеечные дренирующие лимфатические узлы, MLN), системно (т.е. селезенка и кровь) и в целевом органе (то есть лимфатические узлы поджелудочной железы) NOD мышей с диабетом, измеренная с помощью проточной цитометрией после 6 недель лечения. Результаты показывают, что доставленный в слизистую оболочку LL-IL-2, в некоторых случаях - в сочетании с примером антигенспецифической терапии в соответствии с настоящим изобретением (например, LL-PINS+LL-IL-2) повышает количество foxp3+CTLA4+ регуляторных Т-клеток в LN поджелудочной железы по сравнению с мышами с недавно выявленным диабетом. Неожиданно повышение в LN поджелудочной железы наблюдалось у мышей с ремиссией ("излеченных") и у мышей без ремиссии ("неизлеченных") мышей (Т-критерий Манна-Уитни, * p<0,05, ** p<0,01, ** * p<0,001).

[0046] Фиг. 22А и 22В: концентрации глюкозы в крови (мг/дл) у мышей с недавно выявленным диабетом, получавших только LL-IL-2 (Фиг. 22А) и получавших LL-IL-2+LL-INS (Фиг. 22В).

[0047] Фиг. 23: частота ремиссии диабета в зависимости от начальных концентраций глюкозы в крови до 350 мг/дл при начале исследования. Мышей распределяли в 5 экспериментальных групп лечения: контрольная группа не получавших лечения, LL-PINS, LL-IL2, смесь LL-PINS+LL-IL2 и смесь LL-PINS+LL-IL2 в сочетании с системным иммуномодулирующим анти-CD3, как описано в Примере 9. Показан процент мышей, сохранявших диабетический статус в различные моменты времени после лечения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0048] Сокращения и аббревиатуры, используемые в настоящей заявке, могут включать:

BD	Бектон Дикинсон (Becton Dickinson)
BSA	бычий сывороточный альбумин
CAE	слепая кишка
CDS	кодирующая последовательность
КОЕ	колониеобразующие единицы
COD или DCO	дистальный отдел толстой кишки
СОР или РСО	проксимальный отдел толстой кишки
DCO	дистальный отдел толстой кишки
ЭДТА	этилендиаминтетрауксусная кислота
ИФА	иммуноферментный анализ
FACS	сортировка клеток с активированной флуоресценцией
FCS	эмбриональная телячья сыворотка
FOS	фруктоолигосахариды
GAD65	декарбоксилаза глутаминовой кислоты
GRP	цитруллинированный глюкозо-регулируемый белок
GUS	глюкуронидаза
HRP	пероксидаза хрена
IA-2	инсулинома-ассоциированный белок 2
IAA	инсулиновые аутоантитела
IC	определение содержания инсулина
IGRP	каталитическая субъединица связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы
IL-2	интерлейкин-2
INS	инсулин
ME	международная единица
LAB	молочнокислая бактерия/бактерии
LL	Lactococcus lactis
LLOQ	предел количественного определения
масло МСТ	триглицеридное масло с цепочками средней длины
MLN	брыжеечные лимфатические узлы
ММТТ	тест на переносимость смешанной пищи
МТТ	3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид
MWM	маркер молекулярной массы
NCBI	Национальный центр биотехнологической информации
NIBSC	Национальный институт биологических стандартов и контроля
NK-клетки	естественные клетки-киллеры
NOD-мыши	не страдающие ожирением мыши с диабетом
PBS	физиологический раствор с фосфатным буфером
ПЦР	полимеразная цепная реакция
PFA	параформальдегид
PESTS	проинсулин
PLN	поджелудочные дренирующие лимфатические узлы
ppIAPP	(препро) островковый-амилоидный полипептид
PTPRN	протеинтирозинфосфатаза, рецептор типа N
PTS	система фосфотрансферазы
RIA	радиоиммуноанализ (RJA)
SID/DSI	дистальный отдел тонкой кишки
SIP/PSI	проксимальный отдел тонкой кишки
SPL	селезенка
T1D	сахарный диабет 1-го типа
TSLP	тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP)
ВОЗ	Всемирная организация здравоохранения
ХО	кроссинговер
ZnT8	транспортер цинка 8

[0049] В настоящей заявке предложены композиции и способы для лечения T1D, для стимулирования Treg и/или для восстановления толерантности к T1D-специфическим антигенам (то есть аутоантигенам) у субъекта.

[0050] В настоящей заявке представлены композиции, содержащие (1) LAB, содержащую ген интерлейкина-2 (IL-2) и ген T1D-специфического антигена, или (2) первую LAB, содержащую ген интерлейкина-2 (IL-2), и вторую LAB, содержащую T1D-специфический антиген. В некоторых примерах LAB экспрессирует ген IL-2 и/или ген T1D-специфического антигена для продуцирования IL-2 и T1D-специфического антигена (например, PINS). В некоторых вариантах реализации эти композиции представляют собой фармацевтические композиции, содержащие LAB и фармацевтически приемлемый носитель. Примеры носителей описаны в настоящей заявке. В некоторых примерах фармацевтическая композиция адаптирована для доставки композиции субъекту в слизистую оболочку.

[0051] Предложены способы для лечения T1D у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в этом. Эти способы включают введение (например, в слизистую оболочку) субъекту композиции в соответствии с настоящим изобретением. Примеры способов включают: введение субъекту терапевтически эффективного количества LAB, способных экспрессировать IL-2 и T1D-специфический антиген (например, PINS).

[0052] Неожиданно было обнаружено, что особенно хорошо реагируют на способы терапии, описанные в настоящей заявке, субъекты со значительной остаточной функцией бета-клеток. Поэтому, в некоторых вариантах реализации у субъекта-млекопитающего в описанных в настоящей заявке способах T1D был диагностирован недавно и/или указанный субъект имеет недавно возникший T1D. В некоторых примерах T1D мог быть диагностирован у субъекта в течение предыдущих 12 месяцев, предыдущих 24 месяцев или предыдущих 36 месяцев до введения композиции, содержащей LAB, описанной в настоящей заявке.

[0053] В некоторых примерах в описанных в настоящей заявке способах IL-2 и антигенные полипептиды доставляют в слизистую оболочку. Такой подход может обеспечить доставку концентраций IL-2 в низкой дозе, которые даже ниже, чем требуются для системного введения в низкой дозе. Таким образом можно избежать побочных токсических эффектов, ассоциированных с системной доставкой IL-2.

Определения

[0054] Используемые в настоящей заявке единственные формы включают ссылки на множественные формы, если контекст явно не диктует иное. Например, термин "клетка" включает в себя множество клеток, включая их смеси. Аналогичным образом, применение "соединения" для лечения или приготовления лекарственных средств, описанное в настоящей заявке, предполагает применение одного или нескольких соединений для такого лечения или приготовления, если контекст явно не диктует иное.

[0055] Используемый в настоящей заявке термин "содержащий" означает, что композиции и способы включают в себя указанные элементы, но не исключают других. "Состоящий по существу из" при применении для определения композиций и способов означает исключение других элементов любого существенного значения для данной комбинации. Таким образом, композиция, состоящая по существу из элементов, в соответствии с определением в настоящей заявке, не будет исключать следовые примеси, обусловленные способом выделения и очистки, и фармацевтически приемлемые носители, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером, консерванты и тому подобное. "Состоящий из" подразумевает исключение любого другого компонента в виде более чем следовых количеств других ингредиентов и существенных этапов способа для введения описанных в настоящей заявке композиций. Варианты реализации, определенные каждым из этих связующих терминов, входят в объем настоящего изобретения.

[0056] Используемый в настоящей заявке термин "экспрессирующий" ген или полипептид или "продуцирующий" полипептид (например, полипептид IL-2 или полипептид T1D-специфического антигена) также включает "способный экспрессировать" и "способный продуцировать", соответственно. Например, микроорганизм, который содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, может в достаточных условиях (например, достаточной гидратации и/или в присутствии питательных веществ) продуцировать полипептид, кодируемый этой экзогенной нуклеиновой кислотой). Однако этот микроорганизм может не всегда активно продуцировать данный кодируемый полипептид. Такую LAB (например, Lactococcus lactis) можно высушить (например, лиофилизировать), и в этом состоянии ее можно считать бездействующей (то есть не продуцирующей активно полипептид). Однако, как только LAB попадет в достаточные условия, например, будет введена субъекту и высвобождена (например, в желудочно-кишечный тракт субъекта), она может начать продуцировать полипептид. Таким образом, LAB, "экспрессирующая" ген или полипептид или "продуцирующая" полипептид по настоящему изобретению, включает LAB в ее "бездействующем" состоянии.

[0057] Термин "приблизительно" в отношении упоминаемого числового значения и его грамматические эквиваленты, используемые в настоящей заявке, могут включать в себя само это упоминаемое числовое значение и диапазон значений плюс или минус 10% от этого упоминаемого числового значения. Например, термин "приблизительно 10" включает в себя 10 и любые величины от 9 до 11 включительно. В некоторых случаях термин "приблизительно" относительно упоминаемого числового значения также может включать диапазон значений плюс или минус 10% 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от этого упоминаемого числового значения.

[0058] "Ген IL-2" обозначает ген интерлейкина-2, кодирующий "полипептид IL-2". Термин "ген IL-2" включает "варианты гена IL-2", кодирующие "варианты полипептида IL-2".

[0059] Термин "IL-2" или "полипептид IL-2" обозначает функциональный, например, полноразмерный полипептид интерлейкина-2 (например, полипептид человека IL-2), включая мембраносвязанные формы и растворимые формы, а также "варианты полипептида IL-2".

[0060] "Вариант IL-2" или "вариант полипептида IL-2" обозначает модифицированный (например, усеченный или мутантный), но функциональный полипептид IL-2, например, усеченную или мутантную версию IL-2 человека. Термин "вариант полипептида IL-2" включает полипептиды IL-2 с повышенной активностью или пониженной активностью по сравнению с соответствующим полипептидом IL-2 дикого типа. "Вариант полипептида IL-2" сохраняет по меньшей мере некоторую активность IL-2.

T1D-специфический антиген

[0061] Термины "T1D-специфический аутоантиген", "T1D-специфический антиген", "специфический для заболевания антиген", "собственный антиген", "аутоантиген" или "антиген" используются в настоящей заявке взаимозаменяемо. Эти термины используются в настоящей заявке в соответствии с принятым в данной области техники значением терминов собственный антиген или аутоантиген и обычно относятся к полипептиду/белку, происходящему из собственного организма субъекта (продуцируемого собственным организмом субъекта), где антиген распознается собственной иммунной системой субъекта и обычно порождает антитела против такого антигена. Аутоиммунные заболевания обычно ассоциированы с определенными специфическими для заболевания аутоантигенами. При T1D иммунная система субъекта может продуцировать антитела против по меньшей мере одного антигена, ассоциированного с процессом разрушения бета-клеток. Такие аутоантигены включают проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), инсулинома-ассоциированный белок 2 (IA-2), каталитической субъединицы связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы (IGRP) и транспортер цинка (ZnT) 8. Клинический T1D может быть дополнительно ассоциирован с дополнительными целевыми молекулами-кандидатами, экспрессируемыми бета-клетками, такими как хромогранин А, (препро) островковый-амилоидный полипептид (ppIAPP), периферии и цитруллинированный глюкозо-регулируемый белок (GRP).

[0062] Термин "ген T1D-специфического антигена" обозначает ген, кодирующий вышеупомянутый "T1D-специфический антиген". Термин "ген T1D-специфического антигена" включает "варианты гена T1D-специфического антигена", кодирующие "варианты полипептида T1D-специфического антигена".

[0063] Термин " полипептид T1D-специфического антигена " обозначает функциональный, например, полноразмерный, полипептид, а также "варианты полипептида T1D-специфического антигена", которые могут иметь повышенную активность или пониженную активность по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа.

[0064] Термин "вариант T1D-специфического антигена" или "вариант полипептида T1D-специфического антигена" обозначает модифицированный (например, усеченный или мутантный), но функциональный полипептид, например, усеченную или мутантную версию PINS человека. Термин "вариант полипептида" включает полипептиды с повышенной активностью или пониженной активностью по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа. "Вариант полипептида" сохраняет по меньшей мере некоторую биологическую активность (функциональный полипептид). Примеры вариантов GAD65 и IA-2 включают их укороченные версии (например, GAD65_370-575 и IA-2_635-979 соответственно, по сравнению с полипептидами с номерами доступа NCBI NP_000809.1 (SEQ ID NO: 7) и NP_002837.1 (SEQ ID NO: 9, соответственно), сохраняющие антигенные свойства, и поэтому применимые в композициях и способах согласно настоящему изобретению, например, при стимуляции Treg и индуцировании толерантности у субъекта. Как правило, укороченные или усеченные версии T1D-специфического антигена эффективно экспрессируются и секретируются LAB (например, Lactococcus lactis).

[0065] Термин "функционально связанный" обозначает взаимное расположение, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Регуляторная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с такими регуляторными последовательностями.

Субъект

[0066] "Субъект" представляет собой организм, который может получить пользу от введения композиции согласно настоящему изобретению, например, согласно способам согласно настоящему изобретению. Субъектом может быть млекопитающее ("субъект- млекопитающее"). Примеры субъектов-млекопитающих включают людей, сельскохозяйственных животных (таких как коровы, свиньи, лошади, овцы, козы), домашних животных (например, собаки, кошки и кролики), а также других животных, таких как мыши, крысы и приматы. В некоторых примерах субъектом-млекопитающим является пациент, представляющий собой человека.

IL-2 в низкой дозе

[0067] Термин "IL-2 в низкой дозе" обозначает дозу или концентрацию полипептида IL-2, которая может способствовать повышению компетентности и стабильности популяций регуляторных клеток Т (Treg) и/или способствует развитию наивных CD4+ Т-клеток в Treg-клетки у соответствующего субъекта, но которая ниже пороговой дозы/концентрации, которая стимулирует дифференцировку наивных Т-клеток в эффекторные Т-клетки и/или Т-клетки памяти у субъекта. Было показано, что клетки Treg имеют пороговое значение активации для IL-2 в 10-20 раз ниже, чем эффекторные Т-клетки, например, при измерении методом фосфорилирования STAT5 (pSTAT5). В звеньях сигнальных каскадов, расположенных после pSTAT5, активация многочисленных генов, важных для функционирования клеток, требует доз IL-2, которые для клеток Treg в 100 раз ниже, чем для эффекторных Т-клеток (см., например, Yu, A., et al., Diabetes 2015, 64: 2172-2183). Однако применительно к известным схемам лечения у людей минимальная доза IL-2, необходимая для стимуляции клеток Treg, установлена не была.

[0068] В некоторых вариантах реализации, например, в контексте лечения человека, "IL-2 в низкой дозе" обычно обозначает дозу полипептида IL-2 или варианта полипептида IL-2, которая может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 5,4 млн. МЕ/сут/субъекта. Низкая доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,01 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3,0 млн. МЕ/сут/ субъекта. Низкая доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,02 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,03 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,04 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,05 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,06 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,07 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,08 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,09 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,1 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,2 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,3 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,4 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,5 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,6 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,7 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,8 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, от приблизительно 0,9 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта, или от приблизительно 1,0 млн. МЕ/сут/субъекта до 3 млн. МЕ/сут/субъекта. Низкая доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,02 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 2,5 млн. МЕ/сут/субъекта. Низкая доза также может быть в диапазоне от приблизительно 0,05 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 2,0 млн. МЕ/сут/ субъекта. Низкая доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,1 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 1,5 млн. МЕ/сут/ субъекта. В других вариантах реализации низкая доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,3 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 1,0 млн. МЕ/сут/ субъекта. Низкая доза может быть в диапазоне от 0,5 млн. МЕ/сут/субъекта до приблизительно 1,0 млн. МЕ/сут/субъекта.

[0069] Термин "международная единица" (ME) используется в настоящей заявке в соответствии с его принятым в данной области техники значением и представляет собой количество вещества (например, полипептида). Масса или объем, составляющие одну международную единицу, варьируют в зависимости от того, какое вещество измеряется. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет характеристики единиц для биоактивных полипептидов. Например, 1 ME IL-2 человека эквивалентна приблизительно 73 пг биоактивного полипептида (международный стандарт ВОЗ, NIBSC 86/500).

Анти-CD3 в низкой дозе

[0070] Термин "анти-CD3 в низкой дозе (низкодозовое)" обозначает совокупную дозу или концентрацию антитела против CD3, которая ниже стандартной дозы антитела против CD3 или одобренной регулятором дозы антитела против CD3 у людей для лечения таких заболеваний, как T1D или рак. Например, у людей терапия анти-CD3 в низкой дозе может включать дозу менее 50 мг (суммарно) антитела против CD3 у одного человека. Например, низкая доза анти-CD3 может включать от приблизительно 1 мг до приблизительно 50 мг; от приблизительно 5 мг до приблизительно 40 мг; от приблизительно 10 мг до приблизительно 30 мг; от приблизительно 15 мг до приблизительно 25 мг; от приблизительно 20 мг до приблизительно 30 мг; от приблизительно 15 мг до приблизительно 20 мг или от приблизительно 30 мг до приблизительно 35 мг совокупного лечения анти-CD антителом. Анти-CD3 в низкой дозе может включать менее приблизительно 50 мг; приблизительно 45 мг; приблизительно 40 мг; приблизительно 35 мг; приблизительно 30 мг; приблизительно 25 мг; приблизительно 20 мг; приблизительно 15 мг; приблизительно 10 мг; или приблизительно 5 мг совокупного лечения антителом против CD.

[0071] Например, в некоторых случаях совокупная доза антитела против CD3, назначаемая людям, может составлять приблизительно 34 мг или приблизительно 17 мг, вводимых в течение определенных периодов времени, например, в течение 14 дней. Это означает, что в течение 14-дневного периода вводят приблизительно 2,43 мг или 1,21 мг антитела против CD3.

[0072] Лечение анти-CD3 в низкой дозе может также содержать дозу приблизительно 80%; приблизительно 70%; приблизительно 60%; приблизительно 50%; приблизительно 40%; приблизительно 30%; приблизительно 20%; приблизительно 10%; приблизительно 5%; приблизительно 2%; приблизительно 1%; от приблизительно 80% до приблизительно 70%; от приблизительно 70% до 60%; от приблизительно 60% до 50%; от приблизительно 50% до 25%; от приблизительно 40% до 15%; или от приблизительно 30% до 5% от одобренной регулятором дозы антитела против CD3 для лечения T1D или рака.

[0073] У других млекопитающих, таких как мыши, "анти-CD3 в низкой дозе (низкодозовое)" может относиться к дозе менее приблизительно 5 мкг; 2,5 мкг; или 1 мкг. Например, для лечения мышей можно использовать приблизительно 5 мкг. В некоторых случаях для лечения мышей можно использовать приблизительно 2,5 мкг. В других случаях для лечения мышей можно использовать 1 мкг. Общая доза для мышей может составлять 12,5 мкг или 6 мкг анти-CD3.

[0074] Анти-CD3 можно вводить по меньшей мере один раз в сутки до 5 раз в сутки. Например, один раз в сутки, 2 раза в сутки, или 3 раза в сутки, пока не превышена суммарная доза. Например, если запланированная доза составляет 2,43 мг/сут, а введение происходит два раза в сутки, то можно вводить 1,215 мг на дозу.

[0075] Для реализации схемы анти-CD3 в низкой дозе, дозы можно вводить по меньшей мере один раз в сутки без перерыва в течение по меньшей мере 3 дней; 4 дней; 5 дней; 6 дней; 7 дней; 8 дней; 9 дней; 10 дней; 11 дней; 12 дней; 13 дней; 14 дней; 15 дней; 16 дней; 17 дней, 18 дней; 19 дней; 20 дней; 30 дней; или 40 дней, пока не превышена совокупная доза. Например, если назначена схема дозирования 34 мг анти-CD3 (анти-CD3 в низкой дозе) в течение 14 дней, субъекту можно вводить приблизительно 2,43 мг/сут. В некоторых случаях анти-CD в низкой дозе можно вводить по меньшей мере один раз в сутки без перерыва в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 6 месяцев, 1 года или более.

[0076] Анти-CD3 в низкой дозе можно вводить внутривенно одновременно с введением композиции, описанной в настоящей заявке. В некоторых случаях анти-CD3 в низкой дозе можно вводить через 1 день; 2 дня; 3 дня; 4 дня; 5 дней; 6 дней; 7 дней; 2 недели; 3 недели; или через 1 месяц после первого введения композиции, описанной в настоящей заявке. Кроме того, в некоторых случаях анти-CD3 в низкой дозе можно вводить через 1 день; 2 дня; 3 дня; 4 дня; 5 дней; 6 дней; 7 дней; 2 недели; 3 недели; или за 1 месяц до первого введения композиции, описанной в настоящей заявке.

[0077] В некоторых случаях стандартная доза антитела против CD3 или одобренная регулятором доза антитела против CD3 у людей для лечения таких заболеваний, как T1D и рак, может быть введена пациентам до или после введения композиций, описанных в настоящей заявке.

[0078] В некоторых вариантах реализации антителом против CD3 может быть теплизумаб.

Субпопуляции пациентов

[0079] У субъекта, подвергнутого лечению с применением описанных в настоящей заявке способов, может присутствовать значимая (например, измеримая) остаточная функция бета-клеток. В таких обстоятельствах у субъекта может сохраняться ремиссия болезни, даже после прерывания или полного прекращения лечения. У пациентов с недавно диагностированным заболеванием часто на момент постановки диагноза сохраняется определенное минимальное количество островковых бета-клеток поджелудочной железы (бета-клетки), так что такие пациенты могут быть способны продуцировать определенное минимальное количество эндогенного инсулина. В такой популяции пациентов лечение композициями и способами согласно настоящему изобретению (например, IL-2 в низкой дозе и PINS-терапия) может быть особенно перспективным. Способы лечения, описанные в настоящей заявке, могут предотвратить дальнейшее разрушение бета-клеток и, таким образом, вызвать ремиссию болезни. Было обнаружено, что начальная масса бета-клеток может влиять на эффективность лечения. Например, у 57% NOD мышей с недавно выявленным диабетом, получавших композиции согласно настоящему изобретению, и с концентрацией глюкозы в крови приблизительно 350 мг/дл или менее при начале лечения удавалось добиться регрессии диабета. Регрессия болезни была достигнута только у 22% мышей с начальной концентрацией глюкозы более 350 мг/дл. Кроме того, у мышей с недавно выявленным диабетом регрессия болезни оставалась стабильной после прекращения лечения, показывая, что способы настоящего изобретения (включая доставку в слизистую оболочку биоактивных полипептидов) могут эффективно корректировать гипергликемию и восстанавливать долгосрочную толерантность к бета-клеткам. Однако, в случае если бета-клетки субъекта уничтожены, такой субъект может больше не получать пользы от описанного лечения таким же образом.

Лечение

[0080] Используемый в настоящей заявке термин "лечение", «лечить» и т.п. обозначают уменьшение интенсивности или облегчение характерных симптомов или проявлений заболевания или состояния, например T1D. Например, лечение T1D может привести к восстановлению или стимуляции антигенспецифической иммунной толерантности у субъекта. В других примерах лечение означает купирование аутоиммунного диабета или регрессию аутоиммунного диабета. Например, лечение может привести к сохранению оставшейся массы бета-клеток. В других примерах лечение T1D приводит к увеличению количества или активации Treg-клеток. В других примерах лечение может увеличивать популяцию антигенспецифических Treg-клеток (например, в тимусе) и/или стимулировать миграцию Treg-клеток в периферическую кровь. В других примерах лечение включает в себя улучшение по меньшей мере одного из клинических маркеров субъекта (пациента-человека). Например, лечение может повышать уровень С-пептида в крови и/или моче. В других примерах лечение может снизить уровень глюкозы в крови субъекта (например, пациента-человека) (например, в ответ на прием пищи или уровень глюкозы натощак); уменьшить количество инъецированного инсулина, необходимое для поддержания соответствующих уровней глюкозы в крови у субъекта, снизить уровни связанного с диабетом анти-антитела у субъекта и/или увеличить/сохранить уровни С-пептида (например, после перорального теста толерантности к глюкозе). Лечение может обозначать непрерывное/хроническое лечение или лечение, при котором у субъекта нет клинических симптомов данного заболевания или состояния в течение значительного периода времени (например, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 год, по меньшей мере 2 года, по меньшей мере 3 года, по меньшей мере 4 лет или по меньшей мере 5 лет), после прекращения лечения.

[0081] Эти термины, используемые в настоящей заявке, также охватывают предотвращение или задержку начала заболевания или состояния или симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием, включая снижение тяжести заболевания или состояния или ассоциированных с ним симптомов до начала явного поражения данной болезнью или состоянием. Такое предотвращение или снижение тяжести до начала явного поражения подразумевает введение описанного в настоящей заявке соединения или композиции пациенту, который на момент этого введения не имеет явного поражения этой болезнью или состоянием. "Предотвращение" также включает предотвращение рецидива или обострения заболевания или состояния или ассоциированных с ними симптомов, например, после периода улучшения.

Терапевтически эффективное количество

[0082] Используемый в настоящей заявке термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество непатогенного микроорганизма или композиции согласно настоящему изобретению, которые будут вызывать желаемый терапевтический эффект или реакцию при введении в соответствии с желаемой схемой лечения. Данные соединения или композиции обычно поставляются в единичной дозированной форме, например, таблетке или капсуле, которая содержит количество активного компонента, эквивалентов терапевтически эффективному количеству при введении один раз или несколько раз в сутки.

[0083] Специалисту в данной области техники понятно, что терапевтически эффективное количество рекомбинантного микроорганизма, которое требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта (например, для эффективного лечения T1D), будет варьироваться, например, в зависимости от характера полипептида IL-2, экспрессируемого данным микроорганизмом, характера антигенного полипептида, экспрессируемого LAB, способа введения, а также возраста, массы и других характеристик реципиента.

Недавно выявленный T1D

[0084] В некоторых вариантах реализации у субъекта имеется недавно выявленный T1D. Термин "недавно выявленный T1D", "впервые выявленный T1D" или "недавно выявленная болезнь" обозначает состояние субъекта (например, пациента-человека), у которого недавно был диагностирован T1D (например, в течение приблизительно 3 предшествующих месяцев, в течение приблизительно шести предшествующих месяцев, в течение приблизительно 9 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 12 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 15 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 18 предшествующих месяцев, в течение приблизительно предшествующих 24 месяцев, в течение приблизительно 30 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 36 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 42 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 48 предшествующих месяцев, в течение приблизительно 54 предшествующих месяцев или в течение приблизительно 60 предшествующих месяцев).

[0085] У людей снижение функции бета-клеток, которое происходит до и после постановки диагноза T1D, может быть измерено с применением диагностических соединений-маркеров. Например, С-пептид продуцируется в равных количествах с инсулином (во время ферментативного расщепления про-инсулина) и поэтому может быть использован в качестве меры эндогенной секреции инсулина (в том числе у пациентов, получающих лечение инсулином). С-пептид ранее уже использовался в клиническом ведении пациентов с диабетом, а системы анализа для измерения уровня С-пептида известны специалистам в данной области. См., например, Jones A.G. and Hattersley A.T., Diabetic Medicine 2013, 30: 803-817; Little RR et al., Clin. Chem. 2008, 54: 1023-1026; Wiedmeyer et al., Clin. Chem. 2007, 53: 784-787.

[0086] Уровни С-пептида могут быть измерены в нмоль/л (где 1 нмоль/л составляет 1000 пмоль/л и эквивалентен приблизительно 3 нг/мл). С-пептид может быть измерен в крови или моче субъекта. Уровни С-пептида в крови могут быть определены у пациентов, находящихся в состоянии не натощак (С-пептид в произвольный момент), у субъектов в состоянии натощак (С-пептид натощак) или у субъектов, стимулированных диетическим стимулятором, таким как сбалансированная жидкая питательная смесь или глюкагон (стимулированный С-пептид). С-пептид в моче может быть измерен как общее количество С-пептида, секретируемого субъектом в течение 24 часов. Часто С-пептид, содержащийся в моче, измеряется как соотношение между С-пептидом и креатинином.

[0087] В некоторых вариантах реализации субъект (например, человек) перед введением композиции согласно настоящему изобретению (например, субъект с недавно выявленным T1D) имеет концентрацию С-пептида в крови натощак менее приблизительно 1 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 0,5 нмоль/л, по меньшей мере приблизительно 0,4 нмоль/л, по меньшей мере приблизительно 0,3 нмоль/л или по меньшей мере приблизительно 0,2 нмоль/л. В других вариантах реализации субъект (например, человек) имеет стимулированную концентрацию С-пептида в крови менее приблизительно 4 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 1 нмоль/л, по меньшей мере приблизительно 0,9 нмоль/л, по меньшей мере приблизительно 0,8 нмоль/л, по меньшей мере приблизительно 0,7 нмоль/л, по меньшей мере приблизительно 0,6 нмоль/л или по меньшей мере приблизительно 0,5 нмоль/л. В других вариантах реализации субъект (например, человек) с недавно выявленным T1D имеет соотношение С-пептид : креатинин в моче после приема пищи (нмоль/ммоль) менее 4, но по меньшей мере приблизительно 1, по меньшей мере приблизительно 0,9, по меньшей мере приблизительно 0,8, по меньшей мере приблизительно 0,7, по меньшей мере приблизительно 0,6, по меньшей мере приблизительно 0,5, по меньшей мере приблизительно 0,4 или по меньшей мере приблизительно 0,3.

[0088] В других вариантах реализации субъект с недавно выявленным T1D (например, пациент-человек) может быть определен путем измерения аутоантител к инсулину (IAA) в сыворотке или крови субъекта. В некоторых примерах субъекты дают положительный результат теста на IAA. Концентрация IAA в сыворотке также может использоваться для измерения прогрессирования заболевания или прогресса в лечении. Способы измерения аутоантител к инсулину были описаны ранее. См., например, Demeester et al., Diabetes Care 2015, 38(4): 644-651.

Слизистая оболочка

[0089] Термин "слизистая оболочка" или "мембрана слизистой оболочки" используется в настоящей заявке в соответствии с его принятым в данной области техники значением. "Слизистой оболочкой" может быть любая слизистая оболочка, находящаяся в организме, такая как слизистая оболочка полости рта, слизистая оболочка прямой кишки, слизистая оболочка желудка, слизистая оболочка кишечника, слизистая оболочка уретры, слизистая оболочка влагалища, слизистая оболочка глаз, слизистая оболочка щеки, бронхиальная или легочная слизистая оболочка и слизистая оболочка носа или обонятельной области.

[0090] Используемый в настоящей заявке термин "доставка в слизистую оболочку" используется в соответствии с его принятым в данной области техники значением, то есть подразумевает доставку к слизистой оболочке, например, посредством приведения в контакт композиции по настоящему изобретения со слизистой оболочкой. Пероральная доставка в слизистую оболочку включает трансбуккальные, сублингвальные и десневые пути доставки. Соответственно, в некоторых вариантах реализации "доставка в слизистую оболочку" включает желудочную доставку, кишечную доставку, ректальную доставку, трансбуккальную доставку, пульмональную доставку, внутриглазную доставку, назальную доставку, вагинальную доставку и пероральную доставку.

[0091] Термин "мукозная толерантность (mucosal tolerance)" относится к ингибированию специфической иммунной реакции на антиген у субъекта-млекопитающего (например, человека), после того как субъект взаимодействовал с указанным антигеном посредством слизистой оболочки. Как правило, указанная мукозная толерантность является системной толерантностью. Низкодозовая пероральная толерантность - это пероральная толерантность, вызванная низкими дозами антигенов, которая характеризуется активным иммунным подавлением, опосредованным чувствительными к циклофосфамиду регуляторными Т-клетками, которые могут передавать толерантность ранее не подвергавшимся воздействию хозяевам. Высокодозовая пероральная толерантность - это пероральная толерантность, вызванная высокими дозами антигенов, она нечувствительна к циклофосфамиду и приводит к стимуляции гипореактивности Т-клеток посредством анергии и/или уничтожению антигенспецифических Т-клеток. Разница в чувствительности к циклофосфамиду может служить для выявления различия между низкодозовой и высокодозовой толерантностью. Strobel et al., Immunology 1983, 49:451-456. Примером пероральной толерантности является низкодозовая пероральной толерантность, описанная в работе Mayer and Shao, Nature Rev. Immunol. 2004, 4:407-419.

Иммуномодулирующее соединение

[0092] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение предлагает способы лечения T1D, при которых субъект не получает одновременно дополнительного иммуномодулирующего соединения (то есть в дополнение к IL-2). Таким образом, субъекту вводят только T1D-специфический антиген и IL-2.

[0093] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение предлагает способы лечения T1D, при которых субъект одновременно получает дополнительное иммуномодулирующее соединение. Таким образом, субъекту вводят T1D-специфический антиген, IL-2 и дополнительное иммуномодулирующее соединение.

[0094] Термины "иммуномодулирующее соединение" или "иммуномодулятор" используются в настоящей заявке в соответствии с их принятым в данной области техники значениям. Иммуномодулирующим соединением может быть любое иммуномодулирующее соединение, известное специалисту в данной области. Специалист в данной области техники может предпочесть включать или не включать иммуномодулирующее соединение в описанное в настоящей заявке лечение. Решение о включении иммуномодулирующего соединения в схему лечения может быть определено по результатам описанного в настоящей заявке лечения, генетических и/или физиологических характеристик субъекта, среди прочих факторов.

[0095] В некоторых вариантах реализации иммуномодулирующее соединение представляет собой толерогенное соединение. Стимуляция толерантности может быть получена, например, путем стимулирования регуляторных Т-клеток или косвенным способом, например, путем активации незрелых дендритных клеток для получения толерантных дендритных клеток и/или ингибирования Th2-иммунного ответа, стимулирующего экспрессию факторов "ко-стимуляции" на зрелых дендритных клетках. Иммуномодулирующие и иммуносупрессивные соединения известны специалисту в данной области техники и включают, среди прочего, бактериальные метаболиты, такие как спергуалин, метаболиты грибов и стрептомицетов, такие как такролимус или циклоспорин, иммуносупрессивные цитокины, такие как IL- 4, IL-10, IFNα, TGFβ (в качестве селективного адъюванта для регуляторных Т-клеток) Flt3L, TSLP и Rank-L (в качестве селективных толерогенных индукторов DC (дендритных клеток)), антитела и/или антагонисты, такие как анти-CD40b, анти-CD25, анти-CD20, анти-IgE, анти-CD3 и белки, пептиды или слитые белки, такие как слитый белок-агонист CTL-41 g или CTLA-4. В некоторых вариантах реализации иммуномодулирующее соединение представляет собой иммуносупрессивное соединение. Иммуносупрессивное соединение может быть иммуносупрессивным цитокином или антителом. В других вариантах реализации иммуносупрессивный цитокин представляет собой усиливающий толерантность цитокин или антитело. Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин "иммуномодулирующее соединение" также включает их функциональные гомологи. Функциональный гомолог представляет собой молекулу, имеющую, по существу, ту же или аналогичную функцию для целевого предназначения, но может отличаться структурно. В некоторых примерах иммуномодулирующее соединение представляет собой анти-CD3 или его функциональный гомолог.

LAB

[0096] В настоящем изобретении предложено применение генетически модифицированных молочнокислых бактерий (LAB). Штамм LAB может представлять собой виды Lactococcus, виды Lactobacillus, виды Bifidobacterium, виды Streptococcus или виды Enterococcus.

[0097] Используемый в настоящей заявке термин Lactococcus или Lactobacillus не ограничивается конкретным видом или подвидом, но подразумевает включение любого из видов или подвидов Lactococcus или Lactobacillus. Примеры видов Lactococcus включают Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum и Lactococcus raffinolactis. В некоторых примерах Lactococcus lactis представляет собой Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae или Lactococcus lactis subsp. lactis.

[0098] Примеры видов Lactobacillus включают Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus, Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus par alimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei subsp. camosus, Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius subsp.salicinius, Lactobacillus salivarius subsp.salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali, Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis, Lactobacillus zeae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium infantis. В некоторых примерах LAB представляет собой Lactococcus lactis (LL).

[0099] В других примерах бактерия выбрана из группы, состоящей из Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pollens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus rqffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureasiticus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum и Enterococcus xiangfangensis,

[00100] В других примерах бактерия выбрана из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus tigurinus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridans и Streptococcus zooepidemicus.

[00101] В качестве примера штаммом LAB может быть Lactococcus lactis или любой из его подвидов, включая Lactococcus lactis subsp.cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis и Lactococcus lactis subsp. lactis. В другом аспекте штамм LAB может представлять собой биологически ограниченную из соображений безопасности систему, такую как бесплазмидный штамм MG1363 Lactococcus lactis, утративший способность к нормальному росту и производству кислоты в молоке, как описано в работе Gasson, M.J. (1983) J. Bacterid. 154:1-9; или ауксотрофные по треонину и пиримидину производные штаммы L. lactis, как описано в работе Sorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258; и Glenting et al. (2002) 68:5051-5056.

[00102] Рекомбинантная бактериальная система векторов-хозяев может быть биологически ограниченной из соображений безопасности системой. Биологическое ограничение из соображений безопасности известно специалистам в данной области техники и может быть реализовано путем введения ауксотрофной мутации, например, суицидной ауксотрофной мутации, такой как мутация ThyA, или ее эквивалентов. В качестве альтернативы, биологическое ограничение может быть реализовано на уровне плазмиды, несущей ген, кодирующий полипептид IL-2 или вариант IL-2, например, с применением нестабильной эписомальной конструкции, которая утрачивается через несколько поколений. При необходимости, для обеспечения высокого уровня ограничения можно объединить несколько уровней ограничения, таких как нестабильность плазмид и ауксотрофия.

Конструкции

[00103] Согласно настоящей заявке, LAB доставляет полипептид IL-2 и T1D-специфический антиген к целевой области, то есть, к слизистой оболочке. Например, LAB экспрессирует полипептид IL-2, после чего полипептид IL-2 экспонируется на поверхности клетки (если используется мембраносвязанная форма IL-2) или секретируется (если используется секретируемая форма IL-2). Следовательно, в частном варианте реализации, LAB, такая как L. lactis, содержит вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид IL-2 и T1D-специфический антиген, внутриклеточно. Например, эти полипептиды экспонируются на поверхности клетки в условиях, присутствующих в целевой слизистой оболочке, например, в желудочно-кишечном тракте. LAB может содержать векторы экспрессии, способные экспрессировать полипептид IL-2 внутриклеточно, так что полипептид IL-2 экспонируется на поверхности клетки в степени, достаточной для обеспечения IL-2 в низкой дозе, эффективного для лечения T1D у реципиента. При применении штаммов LAB, экспрессирующих более значительные количества полипептида IL-2 и T1D-специфического антигена, для лечения T1D могут потребоваться менее частые и более низкие дозы LAB. Таким образом, специалист в данной области техники может регулировать количество штамма LAB, чтобы обеспечить доставку желаемого количества полипептида IL-2 и T1D-специфического антигена.

[00104] Обычно система экспрессии будет содержать генетическую конструкцию, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид IL-2 и/или полипептид TD1-специфического антигена, обычно функционально связанный с промотором, способным направлять экспрессию этой последовательности (последовательностей) в микроорганизме-хозяине. Соответственно, экспрессируемый полипептид IL-2 и T1D-антиген могут быть кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, которая адаптирована к использованию предпочтительных кодонов хозяином. Эта конструкция может дополнительно содержать (все) другие подходящие элементы, включая энхансеры, последовательности инициации транскрипции, сигнальные последовательности, репортерные гены, последовательности терминации транскрипции и т.д., функциональные в выбранном хозяине, что известно специалисту в данной области.

[00105] Такая конструкция обычно выполнена в форме, подходящей для трансформации хозяина и/или в форме, которая может стабильно поддерживаться в хозяине, например, вектор, плазмида или минихромосома. Подходящие векторы, содержащие нуклеиновую кислоту для введения в штаммы LAB, например, L. lactis, могут быть выбраны или сконструированы, и содержат соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные фрагменты, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности сообразно обстоятельствам. Векторами могут быть плазмиды, вирусные векторы, например, фаг или фагмида в зависимости от ситуации. Более подробную информацию можно найти, например, в работе Molecular Cloning: а Laboratory Manual 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[00106] Многие известные методики и протоколы для манипулирования нуклеиновой кислотой, например, для получения конструкций нуклеиновых кислот, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов и анализа белков, подробно описаны в Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992. В одном варианте реализации кодирующая последовательность для полипептида IL-2 может содержаться в опероне, то есть в конструкции нуклеиновой кислоты для полицистронной экспрессии. В опероне транскрипция с промотора обеспечивает мРНК, содержащую более чем одну кодирующую последовательность, каждая из которых имеет свой собственный надлежаще расположенный сайт связывания рибосомы против хода транскрипции. Таким образом, из одной мРНК может быть транслирован более чем один полипептид. Применение оперона позволяет координировать экспрессию полипептида IL-2 и полипептида T1D-специфического антигена. Полицистронные системы экспрессии в бактериальных клетках-хозяевах описаны, например, в заявке на патент США №2014/0105863.

[00107] Для получения стабильно трансфицированных штаммов LAB, ген, кодирующий полипептид IL-2, и/или ген T1D-специфического антигена, можно интегрировать в геном LAB-хозяина. Способы создания стабильно трансфицированных штаммов LAB известны в данной области. Например, полипептид IL-2 и/или ген T1D-специфического антигена могут быть клонированы в геном хозяина посредством гомологичной рекомбинации. Как правило, незаменимый ген хозяина разрушается в результате гомологичной рекомбинации, например, делеции гена, одной или более аминокислотных замен, приводящих к неактивной форме белка, кодируемого незаменимым геном, или мутации со сдвигом рамки, приводящей к усеченной форме белка, кодируемого незаменимым геном. В одном варианте реализации незаменимым геном является ген thyA. Пример методики описан в WO 02/090551. Выбор трансформирующей плазмиды особо не ограничен, при условии, что она не дополняет разрушенный незаменимый ген, например, ген thyA. Плазмида может быть самореплицирующейся, обычно несущей один или несколько целевых генов и один или несколько маркеров устойчивости, или плазмида может быть интегративной плазмидой. В последнем случае сама интегративная плазмида может быть использована для разрушения незаменимого гена путем интеграции в локусе незаменимого гена, например, сайта thyA, в результате чего функция незаменимого гена, например, гена thyA, нарушается. Как правило, незаменимый ген, такой как ген thyA, заменяется двойной гомологичной рекомбинацией с помощью кассеты, содержащей целевой ген или гены, фланкированные целевыми последовательностями, которые нацелены на инсерцию в незаменимый ген, такой как целевой сайт thyA. Понятно, что эти целевые последовательности являются достаточно длинными и достаточно гомологичными, чтобы обеспечить интеграцию рассматриваемого гена в целевой сайт.

[00108] Генетическая конструкция, кодирующая полипептид IL-2 и/или T1D-специфический антиген, может, таким образом, присутствовать в клетке-хозяине вне хромосомы, обычно автономно реплицируясь с использованием собственной точки начала репликации или может быть интегрирована в геномную ДНК LAB, например, хромосому Lactococcus. В последнем случае может быть интегрирована одна или несколько копий нуклеиновой кислоты; интеграция может происходить в случайном участке хромосомы или, как описано выше, на ее заранее пределенном участке, например, в локусе thyA бактерии Lactococcus, например, Lactococcus lactis.

[00109] Следовательно, генетическая конструкция, кодирующая полипептид IL-2 и/или T1D-специфический антиген, может дополнительно содержать последовательности, сконфигурированные для реализации инсерции данной генетической конструкции в геном, например, хромосому, клетки LAB-хозяина.

[00110] В одном из примеров, инсерции генетической конструкции в конкретные участки в пределах генома, например, хромосому, клетки-хозяина LAB может способствовать гомологичная рекомбинация. Например, описанные в настоящей заявке генетические конструкции могут содержать одну или несколько областей гомологии с указанным сайтом интеграции в геноме, например, хромосоме, клетки-хозяина LAB. Последовательность в указанном сайте генома, например, хромосомы, может быть естественной, то есть, встречающейся в природе, или может быть экзогенной последовательностью, введенной ранее методами генной инженерии.

[00111] Например, область (области) гомологии может составлять по меньшей мере 50 п.н., 100 п.н., 200 п.н., 300 п.н., 400 п.н., 500 п.н., 600 п.н. 700 п.н., 800 п.н., 900 п.н., 1000 п.н. или более.

[00112] В одном из примеров могут быть включены две области гомологии, каждая из которых фланкирует каждую сторону соответствующих единиц экспрессии, присутствующих в описанных в настоящей заявке генетических конструкциях. Такая конфигурация может эффективно обеспечивать инсерцию соответствующих последовательностей, то есть, по меньшей мере тех, которые кодируют и осуществляют экспрессию целевого антигена, в клетки-хозяева. Способы выполнения гомологичной рекомбинации, особенно у бактериальных хозяев, и выбор рекомбинантов, как правило, известны в данной области.

[00113] Способы трансформации штаммов LAB известны специалисту в данной области; например, это трансформация протопластов и электропорация.

[00114] Высокая степень экспрессии может быть достигнута при применении гомологичной экспрессии и/или сигналов секреции на векторах экспрессии, присутствующих в LAB, например, L. lactis. Сигналы экспрессии известны специалисту в данной области техники. Вектор экспрессии может быть оптимизирован для экспрессии в зависимости от LAB, например, L. lactis, в которую он включен. Например, известны специфические векторы экспрессии, которые обеспечивают достаточные уровни экспрессии в Lactococcus, Lactobacillus lactis, casei и plantarum. Кроме того, известны системы, которые были разработаны для экспрессии гетерологичных антигенов в непатогенной, не колонизирующей, неинвазивной пищевой бактерии Lactococcus lactis (например, патент Великобритании GB 2278358 B). Пример конструкции содержит многокопийный вектор экспрессии, описанный в PCT/NL95/00135 (WO 96/32487), в котором указана нуклеотидная последовательность, кодирующая IL-2-полипептид и T1D-специфический антиген. Такая конструкция может быть подходящей для экспрессии целевого антигена в молочнокислой бактерии, в частности в Lactobacillus, при высоком уровне экспрессии, а также может быть успешно использована для направления экспрессированного продукта на поверхность бактериальной клетки. Такие конструкции (например, PCT/NL95/00135) могут характеризоваться тем, что последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид IL-2 и/или TlD-специфический антиген, предшествует 5'-нетранслируемая последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере минимальную последовательность, необходимую для распознавания рибосом и стабилизации РНК. За этим может следовать кодон инициации трансляции, за которым может (непосредственно) следовать фрагмент по меньшей мере пяти ко донов 5-концевой части транслируемой последовательности нуклеиновой кислоты гена молочнокислой бактерии или структурного или функционального эквивалента этого фрагмента. Этот фрагмент также может контролироваться промотором. Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способ, позволяющий регулировать на высоком уровне экспрессию гетерологичных генов в хозяине и сцепление экспрессии с секрецией. В другом варианте реализации РНК-полимеразу Т7-бактериофага и ее опосредованный промотор используют для создания мощной системы экспрессии в соответствии с WO 93/17117. В одном варианте реализации плазмида экспрессии может быть получена из pTl NX.

[00115] Используемый в настоящей заявке промотор обычно конститутивно экспрессируется в бактерии. Применение конститутивного промотора позволяет избежать необходимости обеспечения индуктора или другого регулятивного сигнала для реализации экспрессии. Как правило, промотор регулирует экспрессию на уровне, при котором бактериальная клетка-хозяин остается жизнеспособной, то есть сохраняет некоторую метаболическую активность, даже если рост не поддерживается. Благодаря этому такая экспрессия может быть на низком уровне. Например, когда продукт экспрессии накапливается внутриклеточно, уровень экспрессии может приводить к накоплению продукта экспрессии в количестве менее 10% клеточного белка, в некоторых случаях - приблизительно 5% или менее приблизительно 5%, например, приблизительно 1-3%. Промотор может быть гомологичен используемой бактерии, то есть встречаться в этой бактерии в природе. Например, лактококковый промотор может быть использован в Lactococcus. Примером промотора для применения в Lactococcus lactis (или других лактококках) является "Р1", полученный из хромосомы Lactococcus lactis (Waterfield NR et al., Gene 1995, 165(1):9-15). Другим примером промотора является промотор usp45. Другие подходящие промоторы описаны в патенте США №8,759,088 и в заявке на патент США №2014/0105863.

[00116] Конструкция или конструкции нуклеиновой кислоты могут содержать секреторную сигнальную последовательность. Таким образом, в некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая IL-2 и/или T1D-специфический антиген, может обеспечивать секрецию полипептидов, например, посредством надлежащего сцепления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид). Способность бактерии, несущей нуклеиновую кислоту, секретировать антиген, может быть протестирована in vitro в условиях культивирования, поддерживающих жизнеспособность организма. Примеры секреторных сигнальных последовательностей включают последовательности, активные в штаммах LAB. Такие последовательности могут включать лидер секреции α-амилазы Bacillus amyloliquetaciens или лидер секреции фермента стафилокиназы, секретируемого некоторыми штаммами Staphylococcus, который, как известно, функционирует как в грамположительных, так и в грамотрицательных хозяевах (Rapoport, Current Opinion in Biotechnology 1990, 1: 21-27), или лидерные последовательности из множества других ферментов Bacillus или белков S-слоев (см. стр. 341-344 Harwood and Cutting, "Molecular Biological Methods for Bacillus," John Wiley & Co. 1990). В одном варианте реализации указанный сигнал секреции получают из usp45 (Van Asseldonk et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 240:428-434). В некоторых вариантах реализации полипептид IL-2 или вариант IL-2 могут быть секретированы конститутивно.

Полипептиды IL-2

[00117] Примеры полипептидов IL-2 включают IL-2 человека дикого типа в мембраносвязанной или секретируемой форме, и любой вариант полипептида IL-2, например полипептиды, имеющие идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 98% с последовательностью IL-2 дикого типа или соответствующего зрелого полипептида IL-2. Пример аминокислотной последовательности IL-2 человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 1, тогда как пример последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-2, представлен в SEQ ID NO: 2. Зрелый IL-2 человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 3.

[00118] Сигнальный пептид для IL-2 (SEQ ID NO: 4) подчеркнут и представляет собой аминокислоты 1-20 из SEQ ID NO: 1. Сигнальный пептид IL-2 может быть замещен бактериальной секреторной сигнальной последовательностью (например, SSusp45), описанной в настоящей заявке. Пример нуклеотидной последовательности согласно этому варианту реализации представлен в SEQ ID NO: 5.

[00119] Термин "вариант IL-2" включает полипептиды IL-2, характеризующиеся инсерциями, делециями, заменами и/или модификациями аминокислот в одном или нескольких сайтах нативной полипептидной цепи IL-2. В соответствии с этим определением любые такие инсерции, делеции, замены и модификации приводят к варианту полипептида IL-2, сохраняющему по меньшей мере некоторую активность связывания с IL-2RP. Примеры вариантов включают полипептиды с заменами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот. Варианты IL-2 могут иметь консервативные модификации и замены в других положениях IL-2 (то есть такие, которые оказывают минимальное влияние на вторичную или третичную структуру варианта полипептида). Такие консервативные замены включают замены, которые описаны в Dayhoff The Atlas of Protein Sequence and Structure 5' (1978) и Argos EMBOJ., 8:779-785 (1989). Например, аминокислоты, принадлежащие к одной из следующих групп, представляют собой консервативные изменения: Группа I: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; Группа II: cys, ser, tyr, thr; Группа III: val, ile, leu, met, ala, phe; Группа IV: lys, arg, his; Группа V: phe, tyr, tip, his; и Группа VI: asp, glu.

[00120] В некоторых примерах IL-2 представляет собой вариант, описанный в патенте США №4518584, в котором цистеин, обычно встречающийся в положении 125 дикого типа или нативной молекулы, был заменен нейтральной аминокислотой, такой как серии или аланин. В качестве альтернативы или дополнительно вариант IL-2 может быть таким, как описано в заявке США №06/810,656, поданной 17 декабря 1985 г., в которой метионин, обычно встречающийся в положении 104 дикого типа или нативной молекулы, был заменен на нейтральную аминокислоту, такую как аланин. В некоторых примерах у варианта IL-2 могут быть удалены одна или несколько из первых пяти N-концевых аминокислот нативного IL 2. Также были получены мутанты IL-2 с уменьшенной аффинностью связывания с CD 122 (для достижения более низкой токсичности IL-2), например, BAY 50-4798 (содержащий мутацию N88R IL 2).

[00121] Другие формы IL-2, которые могут быть использованы, включают варианты последовательности IL-2, такие как варианты, присутствующие в алдеслейкине или пролейкине (Prometheus Laboratories), тецелейкине (Roche), биолейкине (Glaxo), а также варианты, описанные в Taniguchi etal., Nature 1983, 302(5906):305-10 и Devos et al, Nucleic Acids Res. 1983, 11(13): 4307-23; Европейские патентные заявки №№. 91,539 и 88,195; Патент США №. 4,518,584; публикация патента США №2012/0244112; Патент США №. 7,569,215; Патент США №. 5,229,109; публикация патента США №2006/0269515; публикация патента ЕР №. ЕР 1730184 А2; и публикация РСТ WO 2005/086751.

[00122] В некоторых вариантах реализации вариант IL-2 имеет пониженную способность связываться с высокоаффинным рецептором IL-2, но сохраняет сродство варианта IL-2 для связывания рецептора IL-2 со средней аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В некоторых вариантах реализации зрелый полипептид IL-2 характеризуется одной, двумя или тремя аминокислотными заменами, например, когда замещенные аминокислотные остатки выбраны из L72, F42 и Y45. В некоторых вариантах реализации вариант IL-2 характеризуется заменой L72, например, содержит первую аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Вариант IL-2 может быть охарактеризован заменой F42, например, содержит вторую аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R и F42K. В других вариантах реализации вариант IL-2 характеризуется заменой Y45, например, содержит третью аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. Вариант IL-2 настоящего изобретения может содержать любую комбинацию вышеуказанных первой, второй и третьей аминокислотных замен.

[00123] Варианты IL-2, описанные в настоящей заявке, могут быть приблизительно на 75%, приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98% или приблизительно на 99% идентичными с соответствующим IL-2 дикого типа, при условии, что такой вариант полипептида IL-2 сохраняет некоторую активность IL-2 (функциональный полипептид).

[00124] Процент идентичности полипептидных последовательностей может быть рассчитан с применением коммерчески доступных алгоритмов, которые сравнивают эталонную последовательность (например, SEQ ID NO: 1 настоящего изобретения) с искомой последовательностью.

[00125] Специалисту в данной области техники будет понятно, что оптимальное количество IL-2, которое должно быть доставлено субъекту с применением способов настоящего изобретения, варьирует, например, в зависимости от LAB, экспрессирующей полипептид IL-2, и например, эффективности промотора, используемого в генетической конструкции. Обычно LAB можно вводить в количестве, эквивалентном конкретному количеству экспрессированного полипептида IL-2, или в количестве, которое обеспечивает желаемый ФК-профиль для соответствующего полипептида IL-2 у соответствующего субъекта. В качестве примера ежедневные дозы полипептида IL-2 составляют от приблизительно 10 фг до приблизительно 100 мкг активного полипептида в сутки. Другие диапазоны доз в качестве примера составляют от приблизительно 1 пг до приблизительно 100 мкг в сутки; или от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мкг в сутки.

[00126] Приведенные выше дозы могут быть реализованы путем введения субъекту эффективных количеств микроорганизма в сутки, причем этот микроорганизм адаптирован для экспрессии достаточного количества IL-2 для достижения желаемой дозы, такой как вышеуказанные. LAB, секретирующая полипептид IL-2, может быть доставлена в дозе от приблизительно 10⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) до приблизительно 10¹² КОЕ в сутки, в частности от приблизительно 10⁶ КОЕ до приблизительно 10¹² КОЕ в сутки, более конкретно, от приблизительно 10⁹ КОЕ до приблизительно 10¹² КОЕ в сутки. Количество секретируемого полипептида IL-2 в КОЕ может быть определено, например, в соответствии со способами, описанными в работе Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355, или с помощью ИФА. Например, LAB может секретировать по меньшей мере от 1 нг до 1 мкг активного полипептида на 10⁹ КОЕ. На основании этого специалист может вычислить диапазон количества полипептида IL-2, секретируемого при других дозах в КОЕ.

[00127] Каждая из вышеуказанных доз/диапазонов доз может вводиться в рамках любой схемы дозирования, описанной в настоящей заявке. Ежедневную дозу можно вводить в виде 1, 2, 3, 4, 5 или 6 порций в течение суток. Кроме того, ежедневные дозы можно вводить в течение любого количества дней с любым количеством периодов отдыха между периодами введения. Например, субъекту можно вводить микроорганизм в дозе, эквивалентной приблизительно от 0,1 млн. ME до приблизительно 3 млн. МЕ/сут или через день, в течение периода, составляющего по меньшей мере приблизительно 1 неделю, по меньшей мере приблизительно 2 недели по меньшей мере приблизительно 3 недели по меньшей мере приблизительно 4 недели, по крайней мере, приблизительно 5 недель или, по крайней мере, приблизительно 6 недель. В некоторых примерах субъекту вводят LAB в дозе, эквивалентной приблизительно от 0,1 до приблизительно 5 млн. МЕ/сут, или от приблизительно 0,3 до приблизительно 3 млн. ME, например, в течение приблизительно 5 дней, приблизительно 7 дней или приблизительно 14 дней. В качестве примера дозы описаны, например, в Hartemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1(4): 295-305.

Полипептиды T1D-специфичного антигена

[00128] LAB по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один специфический для заболевания (то есть T1D-специфический) ген аутоантигена и может экспрессировать такой ген в условиях, достаточных для экспрессии. В качестве примера T1D-специфичные антигены включают островковые антигены, ассоциированные с процессом разрушения бета-клеток. Примеры включают среди прочего: проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), инсулинома-ассоциированный белок 2 (IA-2), каталитическую субъединицу связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы (IGRP) и транспортер цинка 8 (ZnT8). Другие примеры включают молекулы, экспрессируемые бета-клетками, такие как хромогранин А, (препро) островковый амилоидный полипептид (ppIAPP), периферии и цитруллинированный глюкозо-регулируемый белок (GRP).

[00129] Примеры полипептидов PINS включают PINS человека дикого типа и полипептиды, имеющие идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96% %, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью с таким PINS человека дикого типа. В качестве примера аминокислотная последовательность PINS человека дикого типа представлена SEQ ID NO: 6, тогда как пример кодирующей последовательности, кодирующей PINS, представлен в SEQ ID NO: 7 (см. CDS, содержащуюся под номером доступа NM_000207.2).

[00130] Дополнительные примеры нуклеотидных последовательностей PINS представлены кодирующими последовательностями под номерами доступа NCBI AY899304 (полная CDS, альтернативно сплайсированная, SEQ ID NO: 8); NM_000207 (вариант транскрипта 1, SEQ ID NO: 9); NM 001185097 (вариант транскрипта 2, SEQ ID NO: 10); NM_001185098 (вариант транскрипта 3, SEQ ID NO: 11); NM_001291897 (вариант транскрипта 4, SEQ ID NO: 12) и их частичные функциональные последовательности. Типичные аминокислотные последовательности PINS включают последовательности, которые кодируются любой из вышеуказанных нуклеотидных последовательностей PINS.

[00131] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90 или по меньшей мере приблизительно 100 последовательных аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью с SEQ ID NO: 6.

[00132] Дополнительные полипептиды PINS описаны, например, в базе UniProtKB-Р01308 и находящихся там ссылках. В некоторых примерах полипептид PINS представлен аминокислотными остатками 25-110 (нумерация согласно SEQ ID NO: 6).

[00133] Примеры полипептидов GAP (например, GAD65) включают GAD65 человека дикого типа и полипептиды, имеющие идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью такого GAD65 дикого типа. Пример аминокислотной последовательности GAD65 человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 13, тогда как пример последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей GAD65, представлен в SEQ ID NO: 14 (см., например, CDS под номером доступа М81882.1).

[00134] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 400 или по меньшей мере приблизительно 500 последовательных аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью в SEQ ID NO: 13.

[00135] Другие примеры последовательности глутаматдекарбоксилазы (например, GAD65) описаны, например, в UniProtKB-Q05329 и находящихся там ссылках. В одном из примеров полипептид GAD представляет собой укороченный вариант, содержащий менее приблизительно 500, менее приблизительно 400 или менее приблизительно 300 аминокислот дикого типа. В качестве примера полипептидные фрагменты (укороченные варианты GAD65) описаны, например, в работе Robert et al., Benef. Microbes 2015, 6(4): 591-601. В некоторых примерах укороченные варианты GAD эффективно экспрессируются и секретируются LAB (то есть, Lactococcus lactis). Примером укороченного варианта GAD является GAD65370-575 (нумерация аминокислот согласно последовательности с номером доступа NCBI NP_000809.1, то есть, SEQ ID NO: 13).

[00136] Другие примеры нуклеотидных последовательностей GAD представлены последовательностями со следующими номерами доступа NCBI: М81882 (GAD65; SEQ ID NO: 15); М81883 (GAD67; SEQ ID NO: 16); NM_000818 (вариант GAD2 1, SEQ ID NO: 17); и NM_001134366 (вариант GAD2 2; SEQ ID NO: 18); и открытые рамки считывания (CDS), содержащиеся там. Примеры аминокислотных последовательностей включают последовательности, кодируемые вышеуказанными нуклеотидными последовательностями под номером доступа М81882, М81883, NM 001134366 и NM_000818.

[00137] Примеры полипептидов IA-2 включают IA-2 человека дикого типа и полипептиды с идентичностью по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью с таким IA-2 дикого типа. Пример аминокислотной последовательности IA-2 человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 19, тогда как пример нуклеотидной последовательности, кодирующей IA-2, представлен в SEQ ID NO: 20 (см., например, открытую рамку считывания последовательности под номером доступа NM_002846.3).

[00138] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 400, по меньшей мере приблизительно 500, по меньшей мере приблизительно 600 или по меньшей мере приблизительно 800 последовательных аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидную последовательность, кодирующая полипептид, идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью в SEQ ID NO: 19.

[00139] Примеры нуклеотидных последовательностей IA-2 представлены под номерами доступа NCBI NM_002846 (IA-2 человека или протеинтирозинфосфатаза, рецептор типа N (PTPRN), вариант транскрипта 1, SEQ ID NO: 21); NM 001199763 (IA-2 человека или протеинтирозинфосфатаза, рецептор типа N (PTPRN), вариант транскрипта 2, SEQ ID NO: 22); NM_001199764 (IA-2 человека или протеинтирозинфосфатаза, рецептор типа N (PTPRN), вариант транскрипта 3, SEQ ID NO: 23). Примеры аминокислотных последовательностей IA-2 включают последовательности, кодированные вышеуказанными нуклеотидными последовательностями.

[00140] Другие примеры последовательности IA-2 описаны, например, в UniProtKB-Q16849 и находящихся там ссылках. В одном из примеров полипептид IA-2 может быть укороченным вариантом, содержащим менее приблизительно 700, менее приблизительно 600, менее приблизительно 500 или менее приблизительно 400 аминокислот дикого типа. В качестве примера полипептидные фрагменты (укороченные варианты IA-2) описаны, например, в работе Robert et al., Benef. Microbes 2015, 6(4): 591-601. В некоторых примерах укороченные варианты IA-2 могут эффективно экспрессироваться и секретироваться LAB (то есть Lactococcus lactis). В одном примере укороченный вариант IA-2 представляет собой IA-2б35-979 (нумерация аминокислот относительно последовательности с номером доступа NCBI NP_002837.1, т.е., SEQ ID NO: 19).

[00141] Примеры полипептидов IGRP включают IGRP человека дикого типа и полипептиды, имеющие идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью с таким IGRP дикого типа. Пример аминокислотной последовательности IGRP человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 24, тогда как пример кодирующей нуклеиновой кислоты, кодирующей IGRP, представлен в SEQ ID NO: 25 (см. открытую рамку считывания последовательности под номером доступа NCBI ВС113376.1).

[00142] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200 или по меньшей мере 300 аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 24.

[00143] Дополнительные примеры нуклеотидных последовательностей представлены под следующими номерами доступа NCBI: NM_021176 (G6PC2, вариант транскрипта 1, SEQ Ш NO: 26); NM_001081686 (глюкоза-6-фосфатаза человека, каталитическая, 2, (G6PC2) вариант транскрипта 2, SEQ ID NO: 27); и NM_001270397 (G6PC, вариант транскрипта 2, SEQ ID NO: 28). Примеры аминокислотных последовательностей IGRP включают последовательности, кодируемые вышеуказанными нуклеотидными последовательностями.

[00144] Другие примеры последовательностей описаны, например, в UniProtKB -Q9NQR9 и в находящихся там ссылках, а также в работах Arden et al, Diabetes 1999; 48(3):531-542; Martin et al., J. Biol. Chem. 2001; 276(27):25197-207; и Dogra et al., Diabetologia 2006; 49(5):953-7. В некоторых примерах полипептид IGRP представляет собой укороченный вариант, содержащий менее приблизительно 300, менее приблизительно 200, менее приблизительно 100 или менее приблизительно 50 аминокислот дикого типа. В некоторых примерах укороченные варианты IGRP выбирают так, чтобы они эффективно экспрессировались и секретировались LAB (т.е., Lactococcus lactis).

[00145] Примеры полипептидов ZnT8 включают ZnT8 человека дикого типа и полипептиды, имеющие идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью такого ZnT8 дикого типа. Пример аминокислотной последовательности ZnT8 человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 29, тогда как пример последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ZnT8, представлен в SEQ ID NO: 30 (см., например, открытую рамку считывания, содержащуюся в последовательности под номером доступа NCBI NM_173851.2).

[00146] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 300 аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 29.

[00147] Другие примеры нуклеотидных последовательностей ZnT8 представлены следующими номерами доступа NCBI AY212919.1 (транспортер цинка 8 человека, полная CDS, SEQ ID NO: 31); NM_173851.2 транспортер цинка 8 человека, вариант транскрипта 1, SEQ ID NO: 32); NM_001172814.1 (транспортер цинка 8 человека, вариант транскрипта 2, SEQ ID NO: 33); NM_001172811.1 (транспортер цинка 8 человека, вариант транскрипта 3, SEQ ID NO: 34); NM_001172813.1 (транспортер цинка 8 человека, вариант транскрипта 4, SEQ ID NO: 35); NM_001172815.2 (транспортер цинка 8 человека, вариант транскрипта 5, SEQ ID NO: 36) и их частичными последовательностями. Примеры аминокислотных последовательностей ZnT8 включают последовательности, которые кодируются вышеуказанными нуклеотидными последовательностями.

[00148] Другие примеры последовательностей описаны, например, в UniProtKB-Q8IWU4 и находящихся там ссылках. В некоторых примерах полипептид ZnT8 представляет собой укороченный вариант, содержащий менее приблизительно 300, менее приблизительно 200 или менее приблизительно 100 аминокислот дикого типа. В некоторых примерах укороченные варианты ZnT8 выбирают так, чтобы они эффективно экспрессировались и секретировались штаммом LAB (т.е., Lactococcus lactis).

[00149] Примеры полипептидов ppIAPP включают ppIAPP человека дикого типа и полипептиды, имеющие идентичность последовательности по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или, по меньшей мере приблизительно на 99% с таким ppIAPP дикого типа. Пример аминокислотной последовательности ppIAPP человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 37, тогда как пример нуклеотидной последовательности, кодирующая ppIAPP, представлен в SEQ ID NO: 38 (см., например, открытую рамку считывания с номером доступа NCBI NM_000415.2).

[00150] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 300 аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с SEQ ID NO: 37.

[00151] Другие примеры полипептидных последовательностей ppIAPP раскрыты, например, в UniProtKB-P10997 и находящихся там ссылках. В некоторых примерах полипептид ppIAPP может быть укороченным вариантом, содержащим менее приблизительно 80, менее приблизительно 60, менее приблизительно 40 или менее приблизительно 20 аминокислот дикого типа. В некоторых примерах укороченные варианты ppIAPP выбирают так, чтобы они были эффективно экспрессировались и секретировались штаммом LAB (то есть, Lactococcus lactis).

[00152] Примеры полипептидов периферина включают периферии человека дикого типа и полипептиды, имеющие идентичность последовательности по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с таким диким типом. Пример аминокислотной последовательности периферина человека дикого типа представлена SEQ ID NO: 39, тогда как пример нуклеотидной последовательности, кодирующей периферии, представлен в SEQ ID NO: 40 (см., например, открытую рамку считывания номера доступа NCBI NM_006262.3).

[00153] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленная SEQ ID NO: 39, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300 или по меньшей мере приблизительно 400 последовательных аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с SEQ ID NO: 39.

[00154] Другие примеры последовательности периферина раскрыты, например, в UniProtKB-P41219 и находящихся там ссылках. В некоторых примерах полипептид периферина представляет собой укороченный вариант, содержащий менее приблизительно 400, менее приблизительно 300, менее приблизительно 200 или менее приблизительно 100 аминокислот дикого типа. В некоторых примерах укороченные варианты периферии выбирают так, чтобы они эффективно экспрессировались и секретировались штаммом LAB (т.е., Lactococcus lactis).

[00155] Другие примеры нуклеотидных последовательностей представлены под номерами доступа NCBI NM_006262.3 (периферии человека, PRPH, SEQ ID NO: 41); ХМ_005269025.1 (предсказанный периферии человека, вариант транскрипта XI, SEQ ID NO: 42); XR_944623.1 (предсказанный периферии человека, вариант транскрипта Х2, SEQ ID NO: 43) и их частичные последовательности. Примеры аминокислотных последовательностей периферина включают последовательности, которые кодируются вышеуказанными нуклеотидными последовательностями.

[00156] Примеры полипептидов GRP включают GRP78/BiP человека дикого типа и полипептиды, имеющие по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с таким GRP дикого типа. Пример аминокислотной последовательности GRP человека дикого типа представлен в SEQ ID NO: 44, тогда как пример нуклеотидной последовательности, кодирующей GRP, представлен в SEQ ID NO: 45 (см., например, открытую рамку считывания под номером доступа NCBI X87949.1).

[00157] Может быть использована любая нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную аминокислотную последовательность, представленная SEQ ID NO: 44, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 400 или по меньшей мере приблизительно 500 последовательных аминокислот указанной последовательности, или любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% с SEQ ID NO: 44.

[00158] Другие примеры последовательностей периферина раскрыты, например, в UniProtKB-P11021 и находящихся там ссылках. В некоторых примерах полипептид GRP представляет собой укороченный вариант, содержащий менее приблизительно 500, менее приблизительно 400, менее приблизительно 300 или менее приблизительно 200 аминокислот дикого типа. В некоторых примерах укороченные варианты GRP выбирают так, чтобы они эффективно экспрессировались и секретировались штаммом LAB (то есть, Lactococcus lactis).

[00159] Специалисту в данной области техники понятно, что оптимальное количество аутоантигена, которое должно быть доставлено субъекту с применением способов настоящего изобретения, варьирует, например, в зависимости от типа антигена, микроорганизма, экспрессирующего этот антиген, и генетической конструкции, например, эффективности промотора, используемого в генетической конструкции. Как правило, микроорганизм вводят в количестве, эквивалентном конкретному количеству экспрессированного антигена, или в количестве, которое обеспечивает желаемый ФК-профиль для соответствующего полипептидного антигена у соответствующего субъекта. Примеры ежедневных доз антигена составляют от приблизительно 10 фг до приблизительно 100 мкг активного полипептида в сутки. Другие диапазоны доз в качестве примера составляют от приблизительно 1 пг до приблизительно 100 мкг в сутки; или от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мкг в сутки.

[00160] Приведенные выше дозы антигена могут быть реализованы путем введения субъекту эффективных количеств LAB в сутки, причем LAB адаптирована для экспрессии достаточного количества биоактивного полипептида для реализации желаемой дозы, такой как вышеуказанные. LAB, секретирующая антигенный полипептид, может быть доставлена в дозе от приблизительно 10⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) до приблизительно 10¹² КОЕ в сутки, в частности от приблизительно 10⁶ КОЕ до приблизительно 10¹² КОЕ в сутки, или от приблизительно 10⁹ КОЕ до приблизительно 10¹² КОЕ в сутки.

[00161] Количество секретируемого антигенного полипептида в КОЕ может быть определено, например, в соответствии со способами, описанными в работе Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355, или с помощью ИФА. Например, LAB может секретировать по меньшей мере от 1 нг до 1 мкг активного полипептида на 10⁹ КОЕ. На основании этого специалист может вычислить диапазон количества антигенного полипептида, секретируемого при других дозах в КОЕ.

[00162] Каждая из вышеуказанных доз/диапазонов доз можно вводить в рамках любой схемы дозирования, описанной в настоящей заявке. Ежедневную дозу можно вводить в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 порций в течение суток. Кроме того, суточные дозы можно вводить в течение любого количества дней с любым количеством периодов отдыха между периодами введения. Например, дозу, эквивалентную приблизительно от 0,1 млн. ME до приблизительно 3 млн. МЕ/сут/субъекта можно вводить через день, в течение периода, составляющего в общей сложности 6 недель.

Составы и схемы

[00163] В способах, описанных в настоящей заявке, IL-2 и T1D могут экспрессироваться одной и той же LAB или разными LAB. Когда два полипептида экспрессируются различными микроорганизмами, их можно вводить субъекту в одном и том же (например, комбинированном) составе или вводить в виде отдельных (например, разных) составов. Отдельные составы можно вводить одновременно или в разные моменты времени. Например, продуцирующие IL-2 и T1D-специфический антиген микроорганизмы в их соответствующих составах можно вводить субъекту одновременно или последовательно, например, с периодом отдыха между введениями.

[00164] Штаммы LAB, продуцирующие IL-2 и T1D-специфический антиген, можно вводить одновременно. В некоторых примерах микроорганизм, продуцирующий IL-2, и микроорганизм, продуцирующий T1D-специфический антиген, могут быть включены в один и тот же фармацевтический состав или в несколько фармацевтических составов, принимаемых в одно и то же время. В примерах вариантах реализации два биоактивных полипептида доставляют субъекту с использованием одного штамма LAB, продуцирующего как IL-2, так и T1D-специфический антиген.

[00165] В некоторых вариантах реализации композицию, описанную в настоящей заявке, будут вводить один, два, три, четыре, пять или шесть раз в сутки, например, с использованием перорального состава. В некоторых вариантах реализации штаммы LAB вводят каждый день, через день, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или четыре раза в неделю. В других вариантах лечение проводят один раз в две недели. В других вариантах лечение проводят один раз в три недели. В других вариантах лечение проводят один раз в месяц.

[00166] Продолжительность цикла лечения для данного способа может составлять, например, от 7 дней до времени жизни субъекта, в зависимости от того, сколько необходимо для лечения или регрессии T1D или предотвращения рецидива. Цикл лечения может длиться от 30 дней до 2 лет. В других вариантах реализации цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 1,5 лет. В других вариантах реализации цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 1 года. В других вариантах реализации цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 11 месяцев. В других вариантах реализации цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 10 месяцев. В других вариантах реализации цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 9 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 8 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 7 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 6 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 5 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 4 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 3 месяцев. Цикл лечения у субъекта может длиться от 30 дней до 2 месяцев.

[00167] Ежедневные поддерживающие дозы можно вводить в течение периода, клинически подходящего для субъекта, например, от 1 дня до нескольких лет (например, в течение всего оставшегося времени жизни субъекта); например, от приблизительно (2, 3 или 5 дней, 1 или 2 недели или 1 месяц) и выше и/или, например, до приблизительно (5 лет, 1 год, 6 месяцев, 1 месяц, 1 неделя или 3 или 5 дней). Типичным является введение ежедневной поддерживающей дозы в течение от приблизительно 3 до приблизительно 5 дней или от приблизительно 1 недели до приблизительно 1 года. Вместе с тем, унифицированные дозы в некоторых случаях - могут вводиться от двух раз в сутки до одного раза в две недели до тех пор, пока не будет наблюдаться терапевтический эффект.

[00168] Штаммы LAB, продуцирующие полипептид IL-2 и антигенный полипептид, могут быть доставлены в виде моно- или комбинированной терапии для лечения T1D. В некоторых вариантах реализации композиции настоящего изобретения включают в себя дополнительные терапевтически активные агенты. В некоторых вариантах реализации лечение субъекта не включает другие активные компоненты, например, не включает дополнительные иммуномодулирующие вещества, такие как антитела (например, против CD3). Таким образом, в некоторых примерах фармацевтические композиции настоящего изобретения состоят существенным образом (по существу) из LAB, описанных в настоящей заявке (экспрессирующих терапевтические IL-2 и антигенные полипептиды) и фармацевтически приемлемого носителя.

Фармацевтические композиции и носители

[00169] Описанные в настоящей заявке штаммы LAB (например, L. lactis) можно вводить в чистой форме, в сочетании с другими активными ингредиентами и/или в сочетании с фармацевтически приемлемыми (то есть нетоксичными) вспомогательными веществами или носителями. Термин "фармацевтически приемлемый" используется в настоящей заявке в соответствии с его принятым в настоящей области техники значением и обозначает носители, которые совместимы с другими ингредиентами фармацевтической композиции и не являются вредными для реципиента.

[00170] Композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть получены в любой известной или иным образом эффективной дозе или форме продукта, пригодной для применения при обеспечении системной доставки штаммов LAB (например, L. lactis) в слизистую оболочку, включая фармацевтические композиции и лекарственные формы, а также формы пищевых продуктов.

[00171] В некоторых вариантах реализации состав представляет собой пероральный состав или фармацевтическую композицию. В некоторых примерах в соответствии с этим вариантом реализации состав или фармацевтическая композиция содержит штаммы LAB в форме сухого порошка (например, в лиофилизированной форме) или в прессованной форме, в некоторых случаях - в сочетании с другими сухими носителями. Пероральные составы обычно включают в себя инертный носитель-разбавитель или съедобный носитель.

[00172] В некоторых примерах эта пероральная композиция содержит покрытие или использует стратегию капсулирования, которая облегчает доставку композиции в кишечный тракт и/или позволяет высвобождать и гидратировать микроорганизм в кишечном тракте (например, в подвздошной кишке, тонкой кишке или толстой кишке). Как только LAB высвобождается из состава и достаточно гидратируется, она начинает экспрессировать биоактивный полипептид, который затем высвобождается в окружающую среду или экспрессируется на поверхности микроорганизма. Такие стратегии покрытия и инкапсуляции (то есть стратегии с задержкой высвобождения) известны специалистам в данной области техники. См., например, патент США 5972685; WO 2000/18377; и WO 2000/22909.

[00173] Предложена фармацевтическая композиция, которая может содержать штаммы LAB в лиофилизированной или сублимированной форме, в некоторых случаях - в сочетании с другими компонентами, такими как декстраны, глутамат натрия и полиолы. Примеры лиофилизированных композиций описаны, например, в патентной публикации США. №2012/0039853. Примеры составов включают лиофилизированные бактерии (например, терапевтически эффективное количество бактерий) и фармацевтически приемлемый носитель. Лиофилизированные бактерии могут быть приготовлены в виде капсул, таблеток, гранулятов и порошков, каждое из которых можно вводить перорально. В качестве альтернативы, лиофилизированные бактерии могут быть приготовлены в виде водных суспензий в подходящих средах, или лиофилизированные бактерии могут быть суспендированы в подходящей среде, такой как напиток, непосредственно перед использованием.

[00174] Для перорального введения состав может быть гастрорезистентной пероральной лекарственной формой. Например, пероральная дозированная форма (включая капсулы, таблетки, гранулы, микрогранулы, грануляты и тому подобное) может быть покрыта тонким слоем вспомогательного вещества (обычно полимеров, целлюлозных производных и/или липофильных материалов), который противостоит растворению или разрушению в желудке, но не в кишечнике, что позволяет обеспечить беспрепятственный транзит через желудок, с последующей дезинтеграцией, растворением и абсорбцией в кишечнике (например, в тонкой кишке или толстой кишке).

[00175] В некоторых примерах пероральные составы могут включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение, замедленное высвобождение или пролонгированное высвобождение микроорганизма и, таким образом, обеспечивают контролируемое высвобождение нужного белка, кодируемого в нем. Эти лекарственные формы (например, таблетки или капсулы) типично содержат обычные и хорошо известные вспомогательные вещества, такие как липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые и способные к набуханию вспомогательные вещества. Составы с контролируемым высвобождением могут также использоваться для любых других участков доставки, включая кишечную, толстокишечную, биоадгезионную или сублингвальную доставку (т.е. дентальную доставку в слизистую оболочку) и бронхиальную доставку. Когда композиции, описанные в настоящей заявке, должны вводиться ректально или вагинально, фармацевтические составы могут включать суппозитории и кремы. В этом случае клетки-хозяева суспендируют в смеси обычных вспомогательных веществ, включая липиды. Каждый из вышеупомянутых составов хорошо известен в данной области техники и описан, например, в следующих ссылках: Hansel et al. (1990, pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, novel drug delivery SYSTEM, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, novel DRUG delivery, J. Wiley & Sons); Cazzaniga et al., (1994, Int. J. Pharm. 108(1): 77-83).

[00176] Оральные составы и композиции, описанные в настоящей заявке, могут дополнительно включать соединения, которые способны интенсифицировать доставку в слизистую оболочку и/или поглощение слизистой оболочкой биоактивных полипептидов, экспрессированных LAB. Составы/композиции, описанные в настоящей заявке, могут также включать соединения, которые повышают жизнеспособность микроорганизма в составе и/или после высвобождения.

[00177] LAB, описанная в настоящей заявке, может быть суспендирована в фармацевтическом составе для введения человеку или животному, с заболеванием, подлежащим лечению. Такие фармацевтические составы включают среди прочего живую LAB и среду, пригодную для введения. LAB может быть лиофилизирована в присутствии обычных вспомогательных веществ, таких как лактоза, другие сахара, щелочной и/или щелочноземельный стеарат, карбонат и/или сульфат (например, стеарат магния, карбонат натрия и сульфат натрия), каолин, диоксид кремния, ароматические и вкусовые добавки. Бактерии, таким образом лиофилизированные, могут быть приготовлены в виде капсул, таблеток, гранулятов и порошков (например, порошка для полоскания рта), каждое из которых может вводиться пероральным путем. В качестве альтернативы, штаммы LAB могут быть приготовлены в виде водных суспензий в подходящих средах или лиофилизированные бактерии могут быть суспендированы в подходящей среде непосредственно перед использованием, причем такая среда включает в себя вспомогательные вещества, упомянутые в настоящей заявке, и другие вспомогательные вещества, такие как глюкоза, глицин и сахаринат натрия.

[00178] В некоторых примерах LAB локально доставляют в желудочно-кишечный тракт субъекта с применением любого подходящего способа. Например, для улучшения доставки в кишечник может использоваться система доставки в виде микросфер. Системы доставки микросфер включают микрочастицы с покрытием, обеспечивающим локализованное высвобождение в желудочно-кишечный тракт субъекта (например, составы с контролируемым высвобождением, такие как составы с энтеросолюбильным покрытием и составы для абсорбции в толстой кишке).

[00179] Для перорального введения могут быть приготовлены гастрорезистентные пероральные лекарственные формы, которые могут также включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение штаммов LAB, и, таким образом, обеспечивают контролируемое высвобождение требуемого белка, кодируемого в LAB, в разных участках пищеварения (например, IL-2). Например, пероральная дозированная форма (включая капсулы, таблетки, гранулы, грануляты, порошки) может быть покрыта тонким слоем вспомогательного вещества (например, полимеров, целлюлозных производных и/или липофильных материалов), который противостоит растворению или разрушению в желудке, но не в кишечнике, что позволяет обеспечить транзит через желудок в пользу дезинтеграции, растворения и абсорбции в кишечнике.

[00180] Пероральная лекарственная форма может быть разработана так, чтобы обеспечивать медленное высвобождение штаммов LAB и продуцируемых экзогенных белков, например, таблетки или капсулы с контролируемым высвобождением, замедленным высвобождением, пролонгированным высвобождением, замедленным действием. Эти лекарственные формы обычно содержат обычные и хорошо известные вспомогательные вещества, такие как липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые и способные к набуханию вспомогательные вещества. Такие составы описаны, например, в следующих ссылках: Hansel et al., pharmaceutical dosage FORMS AND DRUG delivery systems, 5th edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker; Prescott et al., novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; и Cazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108(1):77-83 (1994).

[00181] Фармацевтическая лекарственная форма (например, капсула) обычно покрыта рН-зависимыми полимерами Eudragit® для получения устойчивости к желудочному соку и для целевой доставки в терминальном отделе подвздошной кишки и толстой кишке, где полимеры растворяются при рН 6,5. Используя другие полимеры Eudragit® или различное соотношение между этими полимерами, профиль отсроченного высвобождения можно регулировать, чтобы высвободить бактерии, например, в двенадцатиперстной кишке или тощей кишке.

[00182] Фармацевтические композиции обычно содержат по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Неограничивающие примеры подходящих вспомогательных веществ, разбавителей и носителей включают консерванты, неорганические соли, кислоты, основания, буферы, питательные вещества, витамины, наполнители и сухие разбавители, такие как крахмал, сахара, маннит и производные диоксида кремния; связывающие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпиролидон; увлажняющие агенты, такие как глицерин/дезинтегрирующие агенты, такие как карбонат кальция и бикарбонат натрия; агенты для замедления растворения, такие как парафин; ускорители резорбции, такие как соединения четвертичного аммония; поверхностно-активные вещества, такие как ацетиловый спирт, моностеарат глицерина; адсорбционные носители, такие как каолин и бентонит; носители, такие как пропиленгликоль и этиловый спирт, и смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния, и твердые полиэтиленгликоли.

[00183] В состав композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные материалы. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и тому подобное могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений сходного характера: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, диспергирующий агент, такой как альгиновая кислота, Примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусо-ароматическая добавка, такая как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Когда единичная дозированная форма представляет собой капсулу, она может содержать, помимо материала вышеуказанного типа, жидкий носитель, такой как нелетучее масло. Кроме того, единичные дозированные формы могут содержать различные другие материалы, модифицирующие физическую форму единицы дозировки, например, покрытия из сахара, шеллака или кишечнорастворимых агентов. Кроме того, сироп может содержать, помимо активных соединений, сахарозу в качестве подсластителя и некоторые консерванты, красители, красители и ароматизаторы. Понятно, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя определяется количеством активного ингредиента, с которым он должен быть скомбинирован, способом введения и другими хорошо известными переменными. Носитель (-и) должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами этого состава и не вредным для его реципиента.

[00184] Альтернативные препараты для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются диметилсульфоксид, спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, буферные среды и физиологический раствор. Внутривенные носители включают жидкие и питательные пополняющие вещества, пополнители электролитов, например, основанные на декстрозе Рингера и тому подобное. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное. Для этих способов доставки возможны различные жидкие составы, в том числе солевые, спиртовые, ДМСО-содержащие и водные растворы.

[00185] Пероральные водные составы включают вспомогательные вещества, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и/или тому подобное фармацевтической степени чистоты. Эти композиции могут иметь форму растворов, таких как жидкости для промывания и полоскания рта, дополнительно содержащие водный носитель, такой как, например, вода, спиртовые/водные растворы, солевые растворы, парентеральные носители, такие как хлорид натрия, декстроза Рингера и тому подобное.

[00186] Водные составы для полоскания рта хорошо известны специалистам в данной области техники. Составы, относящиеся к жидкостям для промывания и полоскания рта, подробно обсуждаются, например, в патенте США 6,387,352, патенте США 6,348,187, патенте США 6,171,611, патенте США 6,165,494, патенте США 6,117,417, патенте США 5,993,785, патенте США 5,695,746, патенте США 5,470,561, патенте США 4,919,918, заявке на патент США №2004/0076590, заявке на патент США №2003/0152530 и заявке на патент США №2002/0044910.

[00187] В составах настоящего изобретения могут присутствовать другие добавки, таких как ароматизаторы, подслащивающие или окрашивающие агенты или консерванты. Примерами подходящих ароматизаторов являются мятная субстанция, например, из мяты перечной или мяты кудрявой, корица, эвкалипт, цитрус, кассии, анис и ментол. В некоторых случаях в пероральных композициях присутствуют ароматизирующие агенты в количестве от 0 до 3%; в некоторых случаях - до 2%, например, до 0,5%, в некоторых случаях - 0,2%, в случае жидких композиций.

[00188] Подсластители включают искусственные или натуральные подслащивающие агенты, такие как сахарин натрия, сахароза, глюкоза, сахарин, декстроза, левулоза, лактоза, маннит, сорбит, фруктоза, мальтоза, ксилит, тауматин, аспартам, D-триптофан, дигидрохалконы, ацесульфам, и любые их комбинации, которые могут присутствовать в количестве от 0 до 2%, в некоторых случаях - до 1% мас./мас., например от 0,05 до 0,3% мас./мас. пероральной композиции.

[00189] Красящие агенты представляют собой подходящие природные или синтетические красители, такие как диоксид титана или CI 42090, или их смеси. Красители могут присутствовать в композициях в количестве от 0 до 3%; в некоторых случаях - до 0,1%, например, до 0,05%, в некоторых случаях - приблизительно 0,005-0,0005%, в случае жидких композиций. Из обычных консервантов обычно используют бензоат натрия в концентрациях, существенно недостаточных для изменения рН композиции, в противном случае может потребоваться корректировка количества буферного агента, для достижения требуемого значения рН.

[00190] Другие необязательные ингредиенты включают увлажнители, поверхностно-активные вещества (неионные, катионные или амфотерные), загустители, камеди и связующие вещества. Увлажнитель добавляет объем к составу и сохраняет влагу в композиции для чистки зубов. Кроме того, увлажнитель помогает предотвратить деградацию микроорганизмов при хранении этого состава. Он также помогает поддерживать фазовую стабильность и обеспечивает способ создания прозрачного или полупрозрачного средства для чистки зубов.

[00191] Подходящие увлажнители включают глицерин, ксилит, глицерин и гликоли, такие как пропиленгликоль, которые могут присутствовать в количестве до 50% мас./мас. для каждого, но суммарное количество увлажнителя может составлять не более приблизительно 60-80% мас./мас. от композиции. Например, жидкие композиции могут содержать до приблизительно 30% глицерина плюс до приблизительно 5%, в некоторых случаях - приблизительно 2% мас./мас. ксилита. Поверхностно-активные вещества могут быть не анионными и могут включать полисорбат 20 или кокоамидобетаин или тому подобное в количестве до приблизительно 6%, в некоторых случаях - приблизительно 1,5-3%, мас./мас. от композиции.

[00192] Когда пероральные композиции, описанные в настоящей заявке, находятся в жидкой форме, указанные композиции обычно могут включать пленкообразующий агент в количестве до приблизительно 3% мас./мас. от пероральной композиции, например, в диапазоне от 0 до 0,1%, в некоторых случаях - приблизительно 0,001-0,01%, например приблизительно 0,005% мас./мас. от пероральной композиции. Подходящие пленкообразователи включают (в дополнение к гиалуронату натрия) те, которые продаются под торговым наименованием Гантрез (Gantrez)™.

[00193] Жидкие питательные составы для перорального или энтерального введения могут содержать одно или несколько питательных веществ, таких как жиры, углеводы, белки, витамины и минералы. Известны многие различные источники и типы углеводов, липидов, белков, минералов и витаминов, которые могут быть использованы в описанных в настоящей заявке вариантах реализации жидких питательных составов при условии, что такие питательные вещества совместимы с добавленными ингредиентами в выбранном составе, являются безопасными и эффективными для их целевого применения и не ухудшают по иным причинам характеристики продукта.

[00194] Эти питательные жидкости обычно приготовлены с достаточной вязкостью, текучестью или другими физическими или химическими характеристиками, чтобы обеспечить более эффективное и смягчающее обволакивание слизистой оболочки при выпивании или введении питательной жидкости. Эти питательные варианты реализации также могут представлять собой сбалансированный источник питания, подходящий для удовлетворения исключительных, первичных или дополнительных потребностей в питании данного лица. Неограничивающие примеры подходящих питательных жидкостей описаны, например, в патенте США 5700782; патенте США 5869118; и в патенте США 5223285.

[00195] Пищевые белки, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут быть гидролизованы, частично гидролизованы или не гидролизованы и могут быть получены из любого известного или иного подходящего источника, такого как молоко (например, казеин, сыворотка), животные (например, мясо, рыба), зерновые (например, рис, кукуруза), растительное сырье (например, соя) или их комбинации.

[00196] Жиры или липиды, пригодные для применения в питательных жидкостях, включают, среди прочего, кокосовое масло, соевое масло, кукурузное масло, оливковое масло, сафлоровое масло, высокоолеиновое сафлоровое масло, масло МСТ (триглицериды с цепочками средней длины), подсолнечное масло, высокоолеиновое подсолнечное масло, структурированные триглицериды, пальмовые и пальмоядровые масла, пальмовый олеин, масло канолы, морские масла, хлопковые масла и их комбинации. Углеводы, пригодные для применения в питательных жидкостях, могут быть простыми или сложными, лактозосодержащими или не содержащими лактозу или их комбинациями. Неограничивающие примеры подходящих углеводов включают в себя гидролизованный кукурузный крахмал, мальтодекстрин, глюкозные полимеры, сахарозу, кукурузный сироп, сухую кукурузную патоку, углеводы, произведенные из риса, глюкозу, фруктозу, лактозу, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы и неусваиваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (FOS) и их комбинации.

[00197] Питательные жидкости, описанные в настоящей заявке, могут дополнительно содержать любой из набора витаминов, неограничивающие примеры которых включают витамин А, витамин D, витамин Е, витамин К, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, витамин В 12, ниацин, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин, витамин С, холин, инозит, соли и их производные и их комбинации.

[00198] Питательные жидкости, описанные в настоящей заявке, могут дополнительно содержать любой из набора минералов, известных или иных подходящих для наших целей пациентам с риском T1D или страдающим от него, неограничивающие примеры которых включают кальций, фосфор, магниевое железо, селен, марганец, медь, йод, натрий, калий, хлорид и их комбинации.

[00199] Препараты штаммов LAB, описанных в настоящей заявке, также могут быть изготовлены в виде эликсиров или растворов для удобного перорального или ректального введения или в виде растворов, подходящих для парентерального введения, например, внутримышечным, подкожным или внутривенным способами. Кроме того, нуклеозидные производные также хорошо подходят для состава в виде лекарственных форм замедленного или пролонгированного высвобождения, включая лекарственные формы, которые высвобождают активный ингредиент только или в некоторых случаях в определенной части кишечного тракта, в некоторых случаях - в течение замедленного или пролонгированного периода времени для дальнейшего повышения эффективности. Покрытия, оболочки и защитные матрицы в таких дозированных формах могут быть изготовлены, например, из полимерных веществ или восков, хорошо известных в фармацевтической области.

[00200] Композиции, описанные в настоящей заявке, могут включать фармацевтические лекарственные формы, такие как лепешки для рассасывания, троше или пастилки. Они обычно представляют собой твердые продукты дисковидной формы, содержащие активный ингредиент в подходящей ароматизированной основе. Основой может быть твердый сахарный леденец, глицериновый желатин или комбинация сахара с достаточным количеством клейкого вещества, чтобы придать ему форму. Троше размещаются во рту, где они медленно растворяются, освобождая активный ингредиент для непосредственного контакта со слизистой оболочкой.

[00201] Варианты реализации в виде троше могут быть приготовлены, например, путем медленного добавления воды к смеси порошкообразного активного вещества, порошкообразного сахара и камеди до образования податливой массы. Для придания массе достаточной адгезии можно использовать 7% порошок гуммиарабика. Массу раскатывают, и вырезают из сплющенной массы отдельные троше, либо массу можно раскатать в цилиндр и поделить. Каждую отрезанную или отделенную часть формируют и дают высохнуть, получая лекарственную форму в виде троше.

[00202] Если активный ингредиент является термолабильным, его препарат можно изготовить в виде лепешек для рассасывания, путем прессования. Например, стадию гранулирования выполняют способом, аналогичным способу, используемому для любой прессованной таблетки. Лепешку изготавливают с использованием оборудования высокой компрессии, чтобы получить таблетку, более твердую, чем обычно, так как желательно, чтобы эта лекарственная форма медленно растворялась или распадалась во рту. Ингредиенты обычно выбирают для получения характеристик медленной растворимости.

[00203] В одном из примеров составов штаммы LAB могут быть включены в биоадгезивный носитель, содержащий предварительно желатинизированный крахмал и поперечно-сшитую поли(акриловую кислоту), для получения биоадгезивной таблетки и биоадгезивного геля, пригодного для трансбуккального применения (то есть с длительной биоадгезией и замедленной доставкой лекарства).

[00204] Порошковая смесь штаммов LAB, биоадгезивных полимеров (прежелатинизированный крахмал и поперечно-сшитая поли (акриловая кислота), совместно обработанных сушкой распылением), стеарилфумарат натрия (смазывающее вещество) и диоксид кремния (скользящее вещество), могут быть переработаны в таблетки (вес: 100 мг, диаметр: 7 мм). Способы изготовления этих таблеток хорошо известны специалисту в данной области техники и были описаны ранее для успешной разработки биоадгезивных таблеток, содержащих различные лекарственные средства (миконазол, тестостерон, фторид, ципрофлоксацин) (Bruschi M. L. and de Freitas О., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31: 293-310).

[00205] Для оптимизации состава можно варьировать содержание лекарственного средства в таблетках и соотношение между крахмалом и поли (акриловой кислотой). Исходя из предыдущих исследований, максимальное содержание лекарственного средства в совместно обработанном биоадгезивом носителе составляет приблизительно 60% (мас./мас.), а соотношение крахмала/поли (акриловой кислоты) может варьироваться от 75/25 до 95/5 (мас./мас.). Во время оптимизационного исследования биоадгезивные свойства таблеток и высвобождение лекарственного средства из таблеток являются основными параметрами, а стандартные свойства таблеток (твердость, истираемость) - вторичными критериями оценки.

[00206] Штаммы LAB могут быть включены в водную дисперсию прежелатинизированного крахмала и поперечно-сшитой поли (акриловой кислоты). Эту полимерную дисперсию готовят по стандартной методике с использованием смесителя с высоким усилием сдвига.

[00207] Аналогично таблетке, для геля может потребоваться оптимизировать содержание лекарственного средства и соотношение крахмал/поли (акриловая кислота), чтобы получить гель, имеющий оптимальную адгезию к слизистой оболочке пищевода. Для геля концентрация полимеров в дисперсии является дополнительной переменной, поскольку она определяет вязкость геля, следовательно, его мукоадгезивные свойства.

[00208] Модель для скрининга биоадгезивных свойств полимерных дисперсий относительно слизистой оболочки пищевода была подробно описана в Batchelor et al. (Int. J. Pharm., 238: 123- 32, 2002).

[00209] Другие пути и формы введения лекарства включают пищевые продукты, содержащие живые штаммы LAB. В некоторых примерах биоактивные штаммы LAB, экспрессирующие полипептид, могут быть включены в молочный продукт.

[00210] Фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть изготовлены любым известным или иным эффективным способом для приготовления или производства выбранной лекарственной формы. Например, штаммы LAB могут быть приготовлены в виде состава вместе с обычными, например, фармацевтически приемлемыми носителями, такими как вспомогательные вещества и разбавители, сформированные в пероральные таблетки, капсулы, спреи, лепешки, обработанные субстраты (например, пероральные или местные тампоны, ватные диски или одноразовые, неперевариваемые субстраты, обработанные описанными в настоящей заявке композициями); пероральные жидкости (например, суспензии, растворы, эмульсии), порошки, суппозитории или любую другую подходящую лекарственную форму. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение предлагает способ производства фармацевтической композиции. В качестве примера способы включают в себя: приведение в контакт штаммов LAB (например, L. lactis), содержащих ген IL-2 и ген T1D-специфического антигена (или способных экспрессировать IL-2 и T1D-специфический антиген) с фармацевтически приемлемым носителем, таким образом формируя фармацевтическую композицию. В некоторых примерах такой способ может дополнительно включать: выращивание штамма LAB в среде. Способ может дополнительно включать лиофилизацию жидкости, содержащей микроорганизм, причем эта жидкость в некоторых случаях включает фармацевтически приемлемый носитель.

Единичные лекарственные формы

[00211] Настоящее изобретение дополнительно предлагает единичные лекарственные формы, содержащие определенное количество штамма LAB, в некоторых случаях - в комбинации с пищевым или фармацевтически приемлемым носителем, в которых штамм LAB содержит: ген интерлейкина-2 (IL-2); и ген специфического антигена сахарного диабета 1-го типа (T1D). В качестве примера единичные лекарственные формы содержат от приблизительно 1×10³ до приблизительно 1×10¹⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis). В качестве примера другие единичные лекарственные формы содержат от приблизительно 1×10⁴ до приблизительно 1×10¹³ колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis) или от приблизительно 1×10⁴ до приблизительно 1×10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis). В других вариантах реализации единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) или от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis). В других вариантах реализации единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) или от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis). В других вариантах реализации единичная дозированная форма содержит от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹¹ колониеобразующих единиц (КОЕ) или от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis). В других вариантах реализации единичная дозированная форма содержит от приблизительно 1×10¹⁰ приблизительно 1×10¹¹ колониеобразующих единиц (КОЕ) или от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis).

[00212] В других вариантах реализации единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) или от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 100×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) LAB (например, L. lactis).

[00213] Такая единичная лекарственная форма может иметь любое физическое состояние или геометрическую форму. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма может быть адаптирована для перорального введения. В некоторых примерах в соответствии с этими вариантами реализации единичная лекарственная форма может быть в форме капсулы, таблетки или гранулы. Примеры капсул включают капсулы, заполненные микрогранулами. В некоторых вариантах реализации LAB (например, L. lactis), содержащаяся в лекарственной форме, находится в форме сухого порошка. Например, LAB находится в лиофилизированной порошкообразной форме, которая в некоторых случаях спрессована и покрыта оболочкой.

ПРИМЕРЫ

[00214] Следующие примеры приведены для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые типичные варианты реализации и аспект настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего описания или формулы изобретения.

Пример 1. Конструирование Lactococcus lactis, секретирующей hIL-2 (LL-IL-2)

[00215] Был сконструирован штамм Lactococcus lactis, способный секретировать IL-2 человека (LL-IL-2) по сравнению с Lactococcus lactis MG1363 (родительский штамм). См., например, Gasson MJ, J. Bacterial. 1983, 154(1):1-9. В LL-IL-2 в геном бактерий были внесены следующие модификации:

[00216] (а) Ген тимидилатсинтазы (thyA; Gene ID: 4798358; локализация: NC_009004.1 (930251..931090)) был удален, чтобы обеспечить защиту от распространения бактерии.

[00217] (b) Ген трегалозо-6-фосфатфосфорилазы (trePP; Gene ID: 4797140; локализация: NC_009004.1 (449195..451504)) был удален, чтобы обеспечить накопление экзогенной трегалозы.

[00218] (с) Ген трегалозо-6-фосфатфосфатазы (otsB; Gene ID: 1036914, метка локуса с2311) был помещен ниже не идентифицированного гена секретируемого белка 45 кДа (usp45; Gene ID: 4797218; локализация: NC_009004.1 (2462440..2463 825, комплемент)) для облегчения превращения трегалозо-6-фосфата в трегалозу.

[00219] (d) Был добавлен конститутивный промотор гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; Gene ID: 4797353; локализация: NC_009004.1 (490275..490550)) перед предполагаемыми генами фосфотрансферазы в опероне трегалозы (trePTS; ptsI и ptsII; LLMG_RS02300 и LLMG_RS02305; Gene ID: 4797778; локализация: NC_009004.1 (446937..447422) и Gene ID: 4797093; локализация: NC_009004.1 (447563..449128), соответственно) для усиления поглощения трегалозы.

[00220] (е) Ген, кодирующий целлобиоза-специфический компонент IIC системы PTS (Gene ID: 4796893; локализация: NC_009004.1 (430271..431608)), ptcC, был удален для увеличения удерживания трегалозы.

[00221] (f) Ген, кодирующий слияние лидера секреции usp45 (Ssusp45) с геном hIL-2, кодирующим интерлейкин-2 человека (hIL-2, UniProt: P60568, аа 21-153), был помещен ниже гена фосфопирувата гидратазы (eno; Gene ID: 4797432; локализация:

NC_009004.1 (606184..607485)), чтобы обеспечить экспрессию и секрецию hIL-2. Единица экспрессии hIl-2 была транскрипционно и трансляционно сцеплена с eno посредством межгенной области, предшествующей экспрессированному на высоком уровне гену L30 рибосомного белка L. lactis MG1363 50S (rpmD; Gene ID: 4797873; локализация: NC_009004.1 (2316732..2316911), комплемент)). Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей вышеуказанное слияние Ssusp45 и hIL-2 ниже от enoA, сцепленное посредством rpmD, показан на Фиг. 1 (SEQ ID NO: 46).

[00222] На Фиг. 2 представлен схематический обзор описанных выше генетических локусов.

[00223] Эти эксперименты также включают контрольный штамм (LL-Control) с генетическими признаками, сравнимыми с LL-IL-2, за исключением того, что контрольный штамм не содержит конструкций для экспрессии IL-2. Генетические признаки штаммов LL-IL-2 и LL-Control приведены в Таблице 1 ниже.

[00224] Исходя из Таблицы 1, экспрессия trePTS (на опероне трегалозы) может быть такой же, как у дикого типа (wt), или управляться промотором hllA (PhllA » PTS); trePP может быть wt или удален (Δ); ptcC может быть wt или Δ; otsB может отсутствовать (-) или локализован ниже и экпрессироваться из usp45 (usp45 >> otsB); thyA может быть wt или Δ; локус eno может быть wt (-) или содержать hIL-2. Все локусы gapB являются wt, в отличие от LL-PINS/IL-2, который несет в себе gapB >> pins, как описано в настоящей заявке ниже.

[00225] Генетические модификации выполняли с применением двойной гомологичной рекомбинации на 5'- и 3'-конце этих генетических признаков. Аналогичный способ описан для конструкции L. lactis Thy12 (см., например, Steidler L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7):785-789), с той разницей, что плазмида-помощник pVE6007 не использовалась. Процедура включала отбор с применением эритромицина в качестве промежуточной стадии, с последующим удалением маркера отбора с помощью эритромицина. В результате LL-IL-2 практически не имеет остаточной резистентности к эритромицину.

Плазмиды-носители

[00226] Способ модификации использует плазмиды-носители, полученные из условно нерепликативного pORI19. См., например. Law J., et al., J. Bacterial. 1995; 177(24):7011-7018. Эта дефицитная по гену репликационного белка А, (repA)-плазмида, как и все ее repA- производные, не может реплицироваться в repA-L. lactis. Штамм L. lactis LL108 repA+ (см. Sanders et al., J. Bacterial. 1995, 177(18):5254-5260) был использован в качестве хозяина конструкции. Плазмиды-носители были сконструированы таким образом, что кроссоверные (ХО) области до 1 т.п.н., идентичные областям, которые фланкируют последовательность дикого типа на бактериальной хромосоме, расположены в позициях 5' и 3' переносимой плазмидами модификации. В качестве примера плазмиды используются для инсерции hIL-2 ниже от eno таким образом, что они сцеплены посредством межгенной области rpmD. Все конструкции плазмид была выполнены с применением стандартных молекулярно-биологических способов.

Хромосомные модификации

[00227] Производные плазмиды pORI19 несут маркер отбора с помощью эритромицина (ermC, ген 23S РНК-метилазы, ген ID: 1263245) и не могут реплицироваться в MG1363 или любом из его производных. После введения такой плазмиды в MG1363 к культуре применяли отбор с помощью эритромицина.

Резистентные колонии отбирали на чашках с твердым агаром, содержащих эритромицин. Из-за неспособности к репликации плазмид-носителей бактерии, резистентные к эритромицину, могут появляться только после первой гомологичной рекомбинации либо на 5'-, либо на 3'-сайте-мишени. Гомологичная рекомбинация может быть далее верифицирована посредством ПЦР.

[00228] Отбор с помощью эритромицина позволил вырезать плазмиду-носитель из бактериальной хромосомы с помощью второй гомологичной рекомбинации на 5'-, либо на 3'-сайте-мишени. Для некоторых чувствительных к эритромицину потомков вторая гомологичная рекомбинация может происходить на другом сайте-мишени по сравнению с первой гомологичной рекомбинацией. Это событие заменяет на бактериальной хромосоме дикий тип мутантом и может быть идентифицировано с помощью ПЦР. Соответствующее субкультивирование быстро уничтожит все остатки плазмид-носителей.

[00229] Наличие гена β-глюкуронидазы (uidA, Gene ID: 946149) в плазмидах-носителях, где он размножается вместе с ermC, позволяет идентифицировать чувствительные к эритромицину и резистентные к эритромицину колонии. Например, бактериальные суспензии высевали на чашки с твердым агаром, содержащие 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновую кислоту (X-Gluc). Экспрессирующие глюкуронидазу (GUS), (и, следовательно, резистентные к эритромицину) клоны будет выглядеть синими при превращения X-Gluc в нерастворимый синий продукт реакции дихлордибромдиниго, тогда как чувствительные к эритромицину клоны также потеряли ген uidA и, следовательно, останутся белыми. Идентификация синих и белых клонов на соответствующих этапах в описанном выше процессе значительно облегчила этот подход.

Анализ ПЦР

[00230] Колонии, демонстрирующие соответствующую гомологичную рекомбинацию на 3'-, либо в 5'-сайте-мишени, анализировали с помощью ПЦР. Фрагменты ДНК очищали с использованием набора для очистки PCR Qiagen MinElute. Полученные последовательности ДНК были идентичны предсказанным. На Фиг. 4 показан 1,2% агарозный гель, содержащий ПЦР-фрагменты, полученные с использованием олигонуклеотидов, перечисленных в Таблице 2, ДНК-полимеразы Herculase II Fusion DNA polymerase (Agilent Technologies, №600677) и соответствующих температурных циклов 50/120/30. Полученные результаты показали наличие целевых генетических признаков в LL-IL-2.

[00231] На Фиг. 4, маркеры молекулярной массы (MWM; маркер длины ДНК Invitrogen 10488-85 TrackIt 1 kb plus DNA Ladder) обозначают пары оснований: 100, 200, 300, 400, 500, 650, 850, 1000, 1650, 2000, 3000, 4000, 5000 и выше. Ожидаемые размеры фрагментов ДНК также указаны в парах оснований.

[00232] Далее секвенировали бактериальный геном LL-IL-2. Экспериментально определенные последовательности ДНК всех генетических признаков в LL-IL-2, которые отличаются от таковых родительского штамма MG1363, оказались идентичными, как и ожидалось.

Экспрессия hIL-2

[00233] Экспрессию hIL-2 с помощью LL-IL-2 измеряли методами ИФА и вестерн-блоттинга. В эксперименте ИФА (с использованием huIL-2 № DY202, R&D Systems) измерения выявили 47,1 нг/мл hIL-2 в культуральном супернатанте, тогда как контрольный штамм не продуцировал hIL-2.

[00234] На Фиг. 5 представлен результат вестерн-блоттинга, показывающий присутствие hIL-2 в супернатанте культуры LL-IL-2. Вестерн-блоттинг проводили с использованием антитела козы против IL-2 человека (1/1000 AF-202-NA, R&D Systems) в качестве первого антитела, с инкубацией с антителом кролика против антитела козы - АР (1/1000 №6160-04, Southern Biotech) в качестве идентифицирующего антитела и последующим окрашиванием NBT/BCIP (таблетки NBT/BCIP, Roche, №11697471001). Эквиваленты 1 мл бактериальных культур LL-IL-2 и контрольных штаммов загружали в белковый гель. Предварительно окрашенный стандарт SeeBlue® Plus2 Invitrogen использовали в качестве маркера молекулярной массы (MWM). Полученные данные показывают, что LL-IL-2 секретирует полноразмерный hIL-2 (то есть, такой же, как кодируемый SEQ ID NO: 46).

[00235] Бактерии культивировали в среде GM17, которая представляет собой бульон Ml 7 (Oxoid, № СМ0817) с добавкой 0,5% глюкозы, или в среде GM17T- (GM17 с добавкой 200 мкМ тимидина).

Пример 2. Lactococcus lactis, секретирующий PINS и hIL-2 (LL-PINS/IL-2)

[00236] Описаны конструирование и отбор штамма LL-PINS/IL-2, производного Lactococcus lactis (L. lactis) MG1363. LL-PINS/IL-2 включает следующие генетические признаки: (а) ген тимидилатсинтазы (thyA; Gene ID: 4798358; локализация: NC_009004.1 (930251..931090)) был удален, чтобы обеспечить защиту окружающей среды от распространения бактерии; (b) ген трегалозо-6-фосфатфосфорилазы (trePP; Gene ID: 4797140; локализация: NC_009004.1 (449195..451504)) был удален, чтобы обеспечить накопление экзогенно добавленной трегалозы; (с) ген трегалозо-6-фосфатфосфатазы (otsB; Gene ID: 1036914, метка локуса с2311) был помещен ниже неидентифицированного гена секретируемого белка 45 кДа (usp45; Gene ID: 4797218; локализация: NC_009004.1 (2462440..2463825, комплемент)) для облегчения превращения трегалозо-6-фосфата в трегалозу; (d) единица экспрессии otsB была транскрипционно и трансляционно сцеплена с gapB, посредством межгенной области, предшествующей экспрессированному на высоком уровне гену рибосомного белка L. lactis MG1363 50S (rpmD; Gene ID: 4797873; локализация: NC_009004.1 (2316732..2316911), комплемент)); (е) конститутивный промотор гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; Gene ID: 4797353; локализация: NC_009004.1 (490275..4905 50)) предшествует предполагаемым генам фосфотрансферазы в опероне трегалозы (trePTS; ptsI и ptsII; LLMG_RS02300 и LLMG_RS02305; Gene ID: 4797778; локализация: NC_009004.1 (446937..447422) и Gene ID: 4797093; локализация: NC_009004.1 (447563..449128) соответственно) для усиления поглощения трегалозы; (f) ген, кодирующий целлобиоза-специфический компонент IIC системы PTS (Gene ID: 4796893; локализация: NC_009004.1 (430271..431608)), ptcC, был разрушен (tga в положении кодона 30 из 446, tga30) для обеспечения удерживания трегалозы после накопления; (g) ген, кодирующий слияние лидера секреции usp45 (Ssusp45) с геном PINS, кодирующим проинсулин человека (PINS; UniProt: P01308, аа 25-110) помещен ниже от гена глицеральдегида 3-фосфатдегидрогеназы (gapB; Gene ID: 4797877; локализация: NC_009004.1 (2492509..2493519, комплемент)), чтобы обеспечить экспрессию и секрецию проинсулина; (h) единица экспрессии PINS была транскрипционно и трансляционно сцеплена с gapB посредством межгенной области, предшествующей экспрессированному на высоком уровне гену рибосомного белка L. lactis MG1363 50S (rpmD; Gene ID: 4797873; локализация: NC_009004.1 (2316732..2316911, дополнение)); и (i) ген, кодирующий слияние лидера секреции usp45 (Ssusp45) с геном hIL-2, кодирующим интерлейкин-2 человека (hIL-2, UniProt: Р60568, аа 21-153), был помещен ниже гена фосфопирувата гидратазы (eno; Gene ID: 4797432; локализация: NC_009004.1 (606184..607485)), чтобы обеспечить экспрессию и секрецию hIL-2. Единица экспрессии hIl-2 была транскрипционно и трансляционно сцеплена с eno посредством межгенной области, предшествующей экспрессированному на высоком уровне гену L30 рибосомного белка L. lactis MG1363 50S (rpmD; Gene ID: 4797873; локализация: NC_009004.1 (2316732..2316911, комплемент)).

[00237] Все генетические признаки LL-PINS/IL-2 находятся на бактериальной хромосоме. Генетический фон этого штамма обеспечивает: конститутивную секрецию PINS и hIL-2; строгую зависимость от экзогенно добавленного тимидина для роста и выживания; и способность накапливать и удерживать трегалозу для устойчивости против, например, лизиса под действием желчных кислот.

[00238] Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей вышеуказанное слияние SSusp45 и PINS ниже гена gapB, сцепленное межгенной областью rpmD, изображена на Фиг. 6 (SEQ ID NO: 57). На Фиг. 7 представлен схематический обзор описанных выше генетических локусов. Генетические признаки вводили в бактериальный геном, как описано в Примере 1. Бактериальные штаммы выращивали и анализировали, как описано в Примере 1 выше. Олигонуклеотиды, используемые при конструировании и анализе LL-PINS/IL-2, приведены в Таблице 3 ниже.

[00239] На Фиг. 9 представлен анализ на 1,2% агарозном геле фрагментов ПЦР из LL-PINS/IL-2, указывающий на наличие целевых генетических признаков: trePTS, ptcC-, eno >> hil-2, otsB, gapB >> pins. На Фиг. 9, маркеры молекулярной массы (MWM; маркер длины ДНК Invitrogen 10488-85 Trackit 1 kb plus DNA Ladder) обозначают пары оснований: 100, 200, 300, 400, 500, 650, 850, 1000, 1650, 2000, 3000, 4000, 5000 и выше. Ожидаемые размеры фрагментов ДНК также указаны в парах оснований.

[00240] Далее секвенировали бактериальный геном LL-PINS/IL-2 Экспериментально определенные последовательности ДНК всех генетических признаков в LL-PINS/IL-2, которые отличаются от таковых родительского штамма MG1363, оказались идентичными предсказанным.

[00241] Способы гомологичной рекомбинации включали плазмиды-носители, полученные из условно нерепликативного pORI19, описанного выше. Плазмиды-носители были сконструированы таким образом, что кроссоверные (ХО) области до 1 т.п.н., идентичные областям, которые фланкируют последовательность дикого типа на бактериальной хромосоме, расположены в позициях 5' и 3' переносимой плазмидой модификации. Примером плазмиды-носителя является pAGX1145, схема которой показана на Фиг. 8. Эту плазмиду используют для инсерции PINS ниже от gapB таким образом, что они сцеплены посредством межгенной области rpmD. Аналогичную плазмиду pAGX1372 (см. Приложение: pAGX1372.gbk) используют для инсерции hil-2 ниже eno. Конструирование всех плазмид было выполнено с применением стандартных молекулярно-биологических способов.

Экспрессия PINS и hIL-2

[00242] Экспрессию PINS и hIL-2 штаммом LL-PINS/IL-2 измеряли с использованием ИФА и вестерн-блоттинга. Культуральные супернатанты из LL-PINS/IL-2 содержали 0,6 нг/мл PINS и 28,2 нг/мл hIL-2, тогда как контрольный штамм (LL-Control) не продуцировал никаких полипептидов. В качестве положительного контроля использовали бактериальный штамм MG 1363, экспрессирующий PINS из плазмидного вектора (LL-PINS). Содержимое PINS в супернатантах определяли с использованием набора кат. №10-1118-01 Mercodia, а содержание hIL-2 определяли с использованием huIL-2 № DY202, R&D Systems.

[00243] На Фиг. 10 представлен вестерн-блоттинг, показывающий присутствие PINS и hIL-2 в супернатанте культуры LL-PINS/IL-2. Эквиваленты 1 мл бактериальных культур загружали в белковый гель. Вестерн-блоттинг проводили с использованием поликлональных антител козы против инсулина В (N-20: sc-7838, Santa Cruz) и антитела козы против 1b-2 человека (1/1000 AF-202-NA, R&D Systems) в качестве первых антител к PINS и hIL-2 соответственно, с инкубацией с антителом кролика против антител козы - АР (1/1000 №6160-04, Southern Biotech) и последующим окрашиванием NBT/BCIP (таблетки NBT/BCIP, Roche, №11 697 471 001). Предварительно окрашенный стандарт SeeBlue® Plus2 Invitrogen использовали в качестве маркера молекулярной массы (MWM). Полученные данные показывают, что LL-PINS/IL-2 секретирует полноразмерный PINS и hIL-2.

[00244] Бактерии культивировали в среде GM17, представляющей собой бульон M17 (Oxoid, № СМ0817) с добавкой 0,5% глюкозы, или в среде GM17T (GM17 с добавкой 200 мкМ тимидина).

Пример 3. Фармакодинамические исследования для изучения влияния двух бактериальных штаммов на прогрессирование диабета, Lactococcus lactis (LL), секретирующей проинсулин (LL-PINS) и hIL-2 (LL-IL-2)

[00245] Бактерии культивировали согласно описанию в работе Takiishi, Т. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725.

[00246] Например, одиночные колонии соответствующего L. lactis инокулировали в среде GM17T (М17, Oxoid, Хемпшир, Великобритания, добавляли 0,5% глюкозы, 200 мкМ тимидина) и выращивали в течение ночи до насыщения. Разбавление этой 1/25 культуры предварительно выращивали в течение 3 часов в GM17T. Бактерии собирали центрифугированием и дополнительно инкубировали в течение 3 часов в буферной культуральной среде (1 × соли ВМ9, 0,5% казитон (Difco, BD Biosciences), 0,5% глюкозы, 25 NaHCO₃, 25 mM Na₂CO₃, 2 mM MgSO₄, 0,1 μМ CaCl₂ ((среда ВМ9) (Schotte, et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 27(10):761-765) с добавкой 200 мкМ тимидина) (ВМ9Т). Бактерии удаляли центрифугированием и образцы супернатантов брали для анализа с помощью вестерн-блоттинга и ИФА. Для вестерн-блоттинга белки получали из неочищенных супернатантов ВМ9Т L. lactis путем осаждения диоксихолатом/ТСА (трихлоруксусная кислота)/ацетоном и растворяли в буфере для образцов SDS-PAGE. Осадок бактериальных клеток разрушали для получения внутриклеточных фракций. Культуральные супернатанты (эквивалентные 1 мл культуры) и внутриклеточные (эквивалентные 50 мкл культуры) белковые фракции разделяли с помощью SDS-12% PAGE, проводили иммуноблоттинг и проявляли антителом козы против hIL-2, а затем детектировали с помощью антитела кролика против антител козы и NBT/BCIP.

[00247] Исходные растворы всех штаммов сохраняют при -20°С в 50% глицерина в среде GM17. Бактерии культивируют в среде GM17, то есть М17 (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган) с добавкой 0,5% глюкозы.

[00248] В экспериментальной установке использовали NOD мышей с впервые выявленным диабетом при положительной глюкозурии и двух последовательных измерениях уровня глюкозы в крови, превышающие 200 мг/дл. Мыши были распределены на три экспериментальные группы лечения: (1) не получавшие лечения контрольные мыши, (2) мыши, получавшие LL-PINS и (3) мыши, получавшие комбинацию LL-PINS и LL-IL-2 в течение 6 недель.

[00249] Этот эксперимент включал два разных штамма LL. Один штамм конститутивно экспрессирует PINS, а другой штамм конститутивно экспрессирует IL-2. Мышам вводили LL в дозе 2×10⁹ КОЕ перорально через желудочный зонд 5 раз в неделю в течение шести (6) недель.

[00250] Мышей наблюдали в течение 42 дней (до прекращения терапии), либо 100 дней (8 недель после прекращения терапии). Помимо первоначального наблюдения на ремиссию болезни в течение 100 дней, дополнительных мышей (не получавших лечения и получавших LL-PINS + LL-IL-2) подвергали эвтаназии через 42 дня после начала лечения, и использовали их периферическую кровь и другие органы для дальнейшего анализа. Образцы сыворотки для измерения аутоантител к инсулину (IAA), воспалительных цитокинов и стимулированного глюкозой С-пептида собирали перед лечением и после прекращения терапии (день 42). Во всех экспериментальных группах (как с ремиссией болезни, так и без ремиссии) оценивали периферическую иммунную систему (фенотип и функция). Также отбирали образцы поджелудочной железы для гистологии (инсулит) и определения содержания инсулина (1C) на момент прекращения терапии (день 42).

Оценка T1D и инсулита

[00251] NOD-мышей подвергали скринингу на возникновение диабета оценкой концентрации глюкозы в моче (Clinistix, Bayer Diagnostics) и венозной крови (Accu-Chek® Aviva, Roche Diagnostics). Измерения уровня глюкозы в крови не натощак выполняли между 8 и 11 часами утра. Мышей классифицировали как имеющих диабет при наличии положительной гликозурии и двух последовательных измерений уровня глюкозы в крови, превышающих 200 мг/дл. Ремиссию диабета определяли как отсутствие гликозурии и величин гликемии <250 мг/дл в течение двух дней подряд.

[00252] Образцы поджелудочной железы фиксировали в растворе формальдегида и обрабатывали для заливки в парафин. Срезы толщиной 7 миллиметров окрашивали гематоксилином/эозином, и оценивали микроскопически степень инсулита. Повреждения островков оценивали следующим образом: 0: отсутствие инфильтрации; 1: пери-инсулит; 2: островки с инфильтрацией лимфоцитов на площади менее 50%; 3: островки с инфильтрацией лимфоцитов на площади более 50%; 4: островки полностью разрушены.

Обнаружение ауто-антител

[00253] Наличие IAA в сыворотке измеряли при начале заболевания и при прекращении терапии (день 42) с помощью анализа RIA. Было проверено, способна ли вакцинация LL-PINS + LL-IL-2 корректировать гипергликемию (ремиссию болезни) и поддерживать нормогликемию у NOD-мышей с впервые выявленным диабетом. Концентрации глюкозы в крови наблюдали в течение 14 недель после начала лечения.

Результаты - ремиссия заболевания

[00254] На Фиг. 11 показан процент мышей, которые после лечения сохраняли диабетический статус. После развития у NOD-мышей гипергликемии (2 дня подряд концентрации глюкозы в крови >200 мг/дл), они обычно прогрессировали до тяжелой гипергликемии с минимальными спонтанными ремиссиями, и большинство умирали в течение 3-6 недель (n=27).

[00255] Монотерапия инокуляцией LL-PINS (2×10⁹ КОЕ/сутки, 5 дней в неделю в течение 6 недель, n=8) корректировала гипергликемию у 15% мышей. Примечательно, что 43% мышей с впервые выявленным диабетом (n=45), получавших комбинацию LL-PINS и LL-IL-2, быстро восстанавливали нормогликемию. Терапия LL-PINS + LL-IL-2 вызывала стабильную и постоянную ремиссию диабета, поскольку у излеченных мышей нормогликемия поддерживалась в течение дополнительного периода наблюдения 8 недель после прекращения терапии,

[00256] Клиническая эффективность терапии LL-PINS и LL-IL-2 явно зависит от концентрации глюкозы в крови на момент начала лечения. NOD-мышей с недавно выявленным диабетом стратифицировали исходя из исходных концентраций глюкозы в крови - ниже или выше 350 мг/дл. Терапия LL-PINS plus LL-IL-2 не только излечила 57% мышей с начальной гликемией ниже 350 мг/дл, но и 22% мышей с исходной гликемией выше 350 мг/дл (Фиг. 12). Эти данные впервые демонстрируют, что доставка в слизистую оболочку PINS с IL-2 рекомбинантными бактериями L. lactis эффективно корректирует гипергликемию и восстанавливает иммунную толерантность к β-клеткам у NOD мышей с манифестным недавно выявленным T1D.

[00257] Во всех кривых выживаемости Каплана-Мейера статистическую значимость между группами определяли с учетом логрангового критерия Мантеля-Кокса (*: р<0,05).

Пример 4. hIL-2, секретируемый L. lactis (LL-IL-2), обладает биологической активностью, сравнимой с рекомбинантным hIL-2

[00258] Этот эксперимент включал описанный в настоящей заявке штамм Lactococcus lactis, экспрессирующий IL-2 человека (LL-IL-2) (см., например, Пример 1), и контрольный штамм.

[00259] Биоактивность LL-IL-2 измеряли исходя из IL-2-зависимой выживаемости/пролиферации клеточной линии мышиных Т-лимфоцитов НТ2 клона А5Е. Клетки НТ2 трижды промывали средой без IL-2 и высевали с плотностью 4×10³ клеток/96 лунок. Серию последовательных разбавлений рекомбинантного hIL-2 (например, № 202-IL-010, R&D systems) или супернатант из LL-IL-2 и контрольный штамм добавляли к высеянным клеткам и инкубировали в течение 24 часов при 37°С, 5% CO₂ и высокой влажности. Жизнеспособность клеток измеряли с применением метода CellTiter96®AQouous One Solution (Promega № G3582). В каждую лунку добавляли 20 мкл раствора МТТ и после инкубационного периода 4 часа при 37°С, 5% CO₂ и высокой влажности, планшеты считывали при длине волны 490 нм с использованием 700 нм в качестве эталона. Рекомбинантный hIL-2 (R&D Systems) и hIL-2, полученные из LL-IL-2, показывают сопоставимые дозозависимые ответы, тогда как супернатант контрольного штамма L. lactis был неактивен. Результаты показаны на Фиг. 13.

Пример 5. LL-IL-2 доставляет низкие дозы hIL-2 в желудочно-кишечный тракт не страдающих ожирением мышей с диабетом после перорального введения

[00260] Этот эксперимент включал штамм Lactococcus lactis, экспрессирующий IL-2 человека (LL-IL-2), описанный в настоящей заявке, например, в Примере 1.

Живые бактерии

[00261] Концентрации живых бактерий (КОЕ/ткань и КОЕ/г) в разных тканях ЖКТ измеряли в разные моменты времени после однократного введения 10¹⁰ КОЕ LL-IL-2 через пероральный желудочный зонд. Результаты показаны на Фиг. 14А и 14В соответственно, в которых каждый столбик представляет собой среднее значение от 3 мышей (n=3). Исходя из Фиг. 14А (КОЕ/ткань), значимые количества бактерий LL-IL-2 были обнаружены в слепой кишке (САЕ), проксимальной толстой кишке (СОР) и дистальной толстой кишке (COD) спустя 2, 4, 6 и 8 часов. Концентрация бактерий в тонком кишечнике оказалась ниже 10⁶ КОЕ/ткань. Исходя из Фиг. 14В (КОЕ/г), концентрации бактерий LL-IL-2 были обнаружены в проксимальной тонкой кишке (SIP), дистальной тонкой кишке (SID), слепой кишке (САЕ), проксимальной толстой кишке (СОР) и дистальной толстой кишке (COD) спустя 2, 4, 6 и 8 часов, соответственно. В крови бактерий обнаружено не было.

Белок hIL-2

[00262] Концентрации белка hIL-2 (пг/ткань и пг/г) в разных тканях ЖКТ измеряли после введения однократной дозы бактерий LL-IL-2 (10¹⁰ КОЕ). Концентрации белка hIL-2 были обнаружены в слепой кишке (САЕ), проксимальной толстой кишке (СОР) и дистальной толстой кишке (COD) через 2 и 4 часа. Концентрация белка hIL-2 в тонком кишечнике оказалась ниже предела количественной оценки (LLOQ=10 пг/мл). В кровотоке тестируемых мышей белок hIL-2 обнаружен не был. Измеренные концентрации белка hIL-2 приведены в Таблице 4 и Таблице 5 ниже.

[00263] После умерщвления каждую ткань (SIP, SID, САЕ, СОР или COD) целиком взвешивали и гомогенизировали. Образец гомогената использовали для высевания на планшет (для определения КОЕ) и для ИФА (для определения hIL-2). "Суммарная ткань" в этом контексте означает, что концентрацию бактерий или белка, определенную в образце гомогената, пересчитывали в массу всей ткани.

САЕ = слепая кишка; СОР = проксимальная толстая кишка; COD = дистальная толстая кишка; LLOQ = 10 пг/мл

САЕ = слепая кишка; СОР = проксимальная толстая кишка; COD = дистальная толстая кишка; LLOQ = 10 пг/мл

[00264] Жизнеспособные L. lactis были обнаружены по всему ЖКТ, причем большинство бактерий находилось в проксимальной и дистальной части толстой кишки и в слепой кишке. Концентрация бактерий здесь была в 1000 раз выше, чем в дистальной и проксимальной части тонкой кишки. Это может быть объяснено большим количеством слизи и низкой перистальтикой в этих частях кишечника, приблизительно 50% вводимого L. lactis можно было выделить из дистальных частей толстой кишки через 2 часа после введения. Этот вывод является неожиданным, поскольку ранее сообщалось, что только приблизительно 10-30% перорально вводимого L. lactis выживают при прохождении двенадцатиперстной кишки (Drouault S, et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(11): 4881-6). Было сделано предположение, что инокуляция бактерий с помощью инокуляционного буфера ВМ9 способна защитить бактерии (по крайней мере частично) от условий ЖКТ.

[00265] Согласно оценке, после дозирования приблизительно 10¹⁰ КОЕ LL-IL-2 в ткань доставляется приблизительно 90 мкг IL-2, что соответствует приблизительно 1,2 ME IL-2 (принимая 1 ME=73 пг).

Пример 6. Фармакодинамические и механистические исследования для изучения влияния клинического штамма Lactococcus lactis (LL), секретирующего как проинсулин (PINS), так и hIL-2

[00266] Этот эксперимент включает штамм Lactococcus lactis, экспрессирующий как PINS, так и IL-2 (LL-PINS/IL-2), описанный в настоящей заявке (см., например, Пример 2). Бактерии можно культивировать, как описано выше. См. Takiishi, Т. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5); 1717-1725. У NOD-мышей можно проводить скрининг, лечение и анализ, как описано в Примере 3 выше. Мышам можно вводить бактерии, например, в дозе 2×10⁹ КОЕ через желудочный зонд 5 раз в неделю в течение шести (6) недель.

Фенотипический анализ местной и периферической иммунной системы

[00267] Периферические органы (т.е. кровь, брыжеечные и поджелудочные лимфатические узлы и поджелудочная железа) можно извлечь при прекращении терапии (например, на 42-й день) и фенотипически исследовать, например, методом проточного цитометрического анализа на канонические и неканонические маркеры Treg (CD3, CD4, CD25, Foxp3, CD39, CD49b, LAG-3 и CD73). Например, совместная экспрессия CD49b и LAG-3 позволяет характеризовать высокосупрессивные Тг1-клетки, продуцирующие IL-10 (см., например, Gagliani, N. et al., Nat. Med. 2013, 19(6): 739-746), в то время как Treg, экспрессирующие как эктоферменты CD39, так и CD73, производят высокие концентрации аденозина, который считается одним из механизмов супрессии, присущих Treg. См., например, Antonioli, L., et al., Trends Mol. Med. 2013, 19(6): 355-367.

[00268] Для окрашивания внутриклеточных цитокинов иммунные клетки можно повторно стимулировать, например, 1 мкг/мл фосфор-миристиновой кислоты (РМА, Sigma-Aldrich) и 0,5 мкг/мл иономицина (Sigma-Aldrich) в течение 4 часов в присутствии 1 мкл/мл GolgiPlug™ (BD). После окрашивания поверхности клеток можно проводить внутриклеточное окрашивание, например, с использованием набора Cytofix/Cytoperm™ (BD) (то есть CD3, CD4, CD8, IL-2, IL-4, IL-17 и IFN-y).

[00269] Для обнаружения pSTAT-5 клеточные суспензии можно быстро фиксировать после умерщвления или после культивирования in vitro, например, в 10 объемах раствора PBS 1,5% формальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре. Клетки можно промыть, например, в растворе PBS, содержащем 0,2% BSA, и пермеабилизировать, например, 100% метанолом в течение 10 минут на льду. Клетки можно дополнительно промыть, например, PBS 0,2% BSA, и затем инкубировать с фосфоспецифическим антителом в сочетании с интересующими антителами (например, анти-CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, CD44, CD122), например, в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. В некоторых случаях можно добавлять антитело против Ki67 вместе с антителом против Foxp3. Отрицательный порог для pSTAT5 можно определить на нестимулированных клетках или на клетках, окрашенных всеми флуоресцентными антителами минус pSTAT5.

[00270] Многопараметрический анализ может быть выполнен, например, с использованием приборов FACS Gallios (Beckman Coulter), FACS Canto II (Becton Dickinson (BD)) или FACS Fortessa (BD), а результаты проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo® (Tree Star). Мертвые клетки (селективное окрашивания живых и мертвых клеток красителем желтый 405) и дублеты могут быть исключены из всех анализов.

Анализ in vitro поликлональной супрессии и детектирование IFN-γ

[00271] Супрессирующую функцию периферических Treg, выделенных из селезенки и лимфатических узлов (в идеале - выделенных из hCD2.Foxp3 NOD-мышей), можно оценить, например, в описанном анализе поликлональной супрессии in vitro. См., например, Takiishi, Т., et al., J Clin. Invest. 2012. 122(5):1717-1725. IFN-γ измеряют в бесклеточных супернатантах.

Результаты

[00272] Ожидается, что лечение LL-PINS/IL-2 будет стимулировать и рекрутировать Treg и показывать биологическую активность, сравнимую с лечением LL-IL-2+LL-PINS, описанным в настоящей заявке, например, в Примерах 3 и 8.

Пример 7. Конструирование Lactococcus lactis, секретирующей проинсулин (LL-PINS)

[00273] Последовательность ДНК, кодирующую проинсулин (hpins) человека, получали из GenBank (номер доступа NM_00207.2). Последовательность ДНК hpins удлиняли на 3'-конце стоп-кодоном ТАА и сайтом рестрикции SpeI. ДНК-фрагмент синтезировали с помощью ПЦР-сборки 40-мерных олигонуклеотидов (от OAGX0362 до oAGX0377) и ДНК-полимеразы Accu Prime для амплификации. Амплифицированный фрагмент сливали с сигналом секреции usp45 (SSusp45), ниже промотора thyA лактококка (PthyA), который был удлинен на 5'-конце сайтом рестрикции EcoRI. Амплифицированный продукт, имеющий 5' EcoRI-конец и 3' SpeI-конец, вставляли между сайтами рестрикции EcoRI и SpeI плазмиды pTINX (номер доступа GenBank НМ 585371.1) и лигировали. Лигирование вводили в L. lactis MG1363 путем электропорации, и колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР-анализа. Полученную плазмиду обозначали pAGX0053 (Фиг. 15).

[00274] Из MG1363 [pAGX0053] был изготовлен фрагмент ПЦР, содержащий модуль экспрессии PthyA >> SSusp45::hpins, с использованием OAGX0169 и OAGX0170. После очистки этого фрагмента было подтверждено, что последовательность ДНК штамма MG1363 [pAGX0053] идентична предсказанной последовательности. Конструирование плазмиды проводили с применением стандартных молекулярно-биологических способов.

[00275] Экспрессию PINS тестировали на супернатанте культуры (SN) из [MG1363] pAGX0053 методом ИФА и вестерн-блоттингом, MG1363 [pAGX0053] секретирует 2,47 нг/мл PINS, по данным Pro-Insulin Elisa (Mercodia №10-1118-01). Образцы неочищенного SN готовили для вестерн-блоттинга. Эквиваленты 1 мл бактериальной культуры [MG1363] pAGX0053 и контрольных штаммов MG1363 [pTINX] и SAGX0037 загружали на белковый гель. Образцы инкубировали с поликлональным антителом козы против инсулина В (Santa Cruz N-20: sc-7838, 1/500). Детектирование проводили путем инкубации с антителом кролика против антител козы АР (Southern Biotech №6160-04, 1/1000) и последующим окрашиванием NBT/BCIP (таблетки Roche NBT/BCIP №11 697 471 001, согласно инструкциям изготовителя). Предварительно окрашенный стандарт Invitrogen SeeBlue® Plus-2 использовали в качестве маркера молекулярной массы (MWM). Данные представлены на Фиг. 16, показывающий секрецию полноразмерного PINS LL-PINS.

[00276] Штаммы Lactococcus lactis, содержащие экзогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие T1D-специфические антигены, отличные от PINS, такие как GAD65, IA-2, IGRP, ZnT8, ppIAPP, периферии, хромогранин А и GRP, могут быть получены в соответствии с вышеописанной процедурой с применением соответствующих нуклеиновых кислот вместо hpins.

Пример 8. Фармакокинетическое профилирование LL-IL-2, перорально вводимого отдельно по сравнению с LL-PINS+LL-IL-2

Бактериальная культура

[00277] Бактерии культивировали, как описано ранее у Takiishi, Т. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725. Например, LL-pT1NX и LL-PINS культивировали в среде GM17TE (бульон М17 с добавлением 0,5% глюкозы, 200 мкМ тимидина и 5 мкг/мл эритромицина). LL-IL-2 культивировали в среде GM17T (бульон М17 с добавлением 0,5% глюкозы и 200 мкМ тимидина). Исходные суспензии штаммов LL хранили при -80°С в глицерине. Остатки суспензии разбавляли 1/1000 в среде роста (GM17TE или GM17T соответственно) и инкубировали в течение 16 часов при 30°С, достигая плотности насыщения 2×10⁹ КОЕ/мл. Бактерии собирали центрифугированием в течение 10 минут при 4°С и 2900 об/мин и концентрировали 10-кратно в среде ВМ9Т (соли 5 × М9, 10% казитон, 10% глюкоза, 0,5 М NaHCO₃, 0,5 М Na2COs, 1 M MgCl₂, 100М CaCl₂ и 100 мМ тимидина) для внутрижелудочных инокуляций. Лечение состояло из 100 мкл этой суспензии для LL-pT1NX, LL-PINS и LL-IL-2. Комбинацию LL-PINS+LL-IL-2 получали смешиванием равных частей суспензий LL-PINS и LL-IL-2. Затем лечение состояло из 200 мкл этой суспензии.

График введения и дозировка

[00278] NOD-мыши с впервые выявленным диабетом (2 измерения подряд уровня глюкозы в крови более 200 мг/дл и положительная глюкозурия) получали 2×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) живых генетически модифицированных бактерий Lactococcus lactis 5 раз в неделю (в будние дни) в течение 6 недель. Мыши в группе лечения LL-PINS+LL-IL-2 получали 2×10⁹ КОЕ LL-PINS и 2×10⁹ КОЕ LL-IL-2. Мыши в контрольной группе 1 не получали никакого лечения, а мыши в контрольной группе 2 получали бактерии, несущие пустой вектор (LL-pT1NX). После 6-недельного периода лечения некоторые мыши были зарезервированы для дальнейшего анализа через 14 недель после начала лечения.

[00279] Нормогликемические NOD-мыши (возраст 22 недели) получали одну дозу 2×10⁹ КОЕ LL-IL-2. Через два, четыре, шесть или восемь часов после введения дозы мышей подвергали эвтаназии и собирали цельную кровь и сыворотку. Проксимальную тонкую кишку (PSI), дистальную тонкую кишку (DSI), слепую кишку (САЕ), Проксимальную толстую кишку (РСО) и дистальную толстую кишку (DCO) забирали в буфере для гомогенизации (10 × соли М9, 0,5 М NaHCO3, 0,5 М Na2CO3, 10% бычий сывороточный альбумин, дистиллированная вода) при концентрации 100 мг/мл и механически диссоциировали. Гомогенаты тканей кишечника и цельной крови высевали в последовательных разведениях на планшетах GM17 для количественной оценки выделения бактерий. Концентрацию IL-2 в сыворотке и гомогенатах измеряли с помощью ИФА.

Забор органов

[00280] Через шесть недель после начала лечения мышей подвергали эвтаназии с помощью CO₂. Кровь забирали путем сердечной пункции гепаринизированной иглой. Кровь разделяли на аликвоты (200 мкл) для переработки в отдельные клетки для проточной цитометрии и для разделения плазмы (центрифугировали в течение 10 мин при 2000 g при комнатной температуре). Поджелудочные железы забирали для гистологического анализа и хранили в 5% параформальдегиде (PFA). Следующие лимфоидные органы извлекали для анализа проточной цитометрией; селезенку (SPL), брыжеечные лимфатические узлы (MLN) и лимфоузлы поджелудочной железы (PLN).

Гистология поджелудочной железы и градация инсулита

[00281] Из поджелудочных желез, фиксированных с помощью PFA и залитых в парафин, готовили срезы толщиной 6 мкм, забранные на расстоянии 100 мкм, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Парафин удаляли с использованием ксилола с последующей дегидратацией растворами этанола 100%-90%-70%-50%. Срезы регидратировали водопроводной водой и дистиллированной водой. Срезы окрашивали в течение 3 минут в гематоксилин и промывали водопроводной водой. Срезы кратковременно промывали в кислом этаноле 3 раза, а затем тщательно промывали водопроводной водой. Образцы помещали в насыщенный водный Li₂CO₃ и промывали в водопроводной воде. Затем образцы помещали в раствор эозина Y (0,5% водный раствор) и промывали в водопроводной воде. Срезы дегидратировали 50% этанолом, 70% этанолом, 90% этанолом, дважды 100% этанолом и дважды ксилолом в течение 10 секунд на каждой стадии. Препараты накрывали покровным стеклом, и наблюдали островки под световым микроскопом при 20× или 40× увеличении и сортировали по виду. Инфильтрацию островков оценивали следующим образом: 0 - отсутствие инфильтрации; 1 - пери-инсулит; 2 - островки с инфильтрацией на менее 50% площади; 3 - островки с инфильтрацией на более 50% площади; 4 - полностью разрушенные островки/тяжелый инсулит.

ИФА для определения С-пептида

[00282] Для определения уровней С-пептида в плазме использовали серийно производимый набор ИФА для определения С-пептида крысы/мыши (EZRMCP2-21K, EMD Millipore, Сент-Чарльз, Миссури). В кратком изложении, 96-луночный планшет три раза промывали 1 × HRP промывочным буфером (50 мМ Трис-солевой буфер, содержащий Tween-20, разбавленный 1:10 дистиллированной водой). Матричный раствор (сывороточная матрица, содержащая 0,008% азида натрия) добавляли в лунки с холостым раствором, стандартом и образцами контроля качества. Затем во все лунки добавляли буфер для анализа (0,05 М фосфосалина, 0,025 М этилен-диамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,08% азида натрия, 1% альбумина бычьей сыворотки (БСА), рН 7,4). Стандарты и образцы контроля качества, содержащие известные уровни С-пептида крысы, добавляли в соответствующие лунки и добавляли неразбавленную плазму мыши. Добавляли смесь раствора антитела (смесь 1:1 предварительно титрованного иммобилизованного и биотинилированного детектирующего антитела к С-пептиду) и инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 2 часов на шейкере для микротитрационного планшета, установленном на умеренную скорость. Лунки промывали 3 раза 1 × HRP-промывочным буфером, и в каждую лунку добавляли раствор фермента (предварительно титрованный комплекс стрептавидина с пероксидазой хрена) для конъюгации пероксидазы хрена с иммобилизованными биотинилированными антителами. Планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере для микротитрационного планшета, установленном на умеренную скорость. Лунки тщательно промывали 1 × HRP промывочным буфером. В каждую лунку добавляли раствор субстрата, содержащий 3,3,5,5'-тетраметилбензидин, и планшет встряхивали на шейкере 15 минут. Активность фермента останавливали стоп-раствором (0,3 М HCl) и измеряли оптическую плотность при 450 нм в течение 5 минут на спектрофотометре VICTOR (Perkin Elmer).

Выделение лимфоцитов из лимфоидных органов

[00283] Органы извлекали и помещали в ледяную промывочную среду (среда RPMI 1640 (Life Technologies/Invitrogen), с добавлением 4,5% антибиотиков (сульфат G418) и 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Органы протирали через 70 мкм сито с промывочной средой. Клетки осаждали центрифугированием. Для селезенки добавляли NH4C1 на 3 минуты при 37°С с последующей промывкой PBS. Клетки ресуспендировали в 150 мкл FACS-буфера (1 × PBS, 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА). Для окрашивания использовали следующие меченные флуоресцином антитела: CD3-PerCP-Cy5.5 (145-2С11), CD4-APC-H7 (GK1.5, BD), CD8α-eFluor450 (53-6.7), CD25-PE-Cy7 (PC61.5), CTLA4-PE (UC10-489), Foxp3-APC (FJK-165). Все антитела были получены от eBioscience, если не указано иное. Использовали антимышиный CD16/CD32 (93, eBioscience) для блокирования рецепторов Fc-γ II и III для уменьшения неспецифического связывания меченных флуоресцином антител. Для окрашивания мертвых клеток использовали желтый краситель Zombie Yellow Fixable Viability Dye (BioLegend) согласно спецификациям производителя.

Окрашивание клеток Treg

[00284] Клетки перед окрашиванием промывали 1 × PBS. Приблизительно 1×10⁹ клеток осаждали в 96-луночный планшет и ресуспендировали в 50 мкл красителя Zombie Yellow Fixable Viability Dye, разбавленного 1/500 в 1 × PBS. Клетки инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут. Затем клетки промывали 200 мкл FACS-буфера и инкубировали с антителами против внеклеточных эпитопов, разбавленными в буфере FACS, в темноте в течение 30 минут при 4°С. Клетки промывали 200 мкл FACS-буфера. Клетки фиксировали и пермеабилизировали в растворе для фиксации/пермеабилизация (Foxp3/String Buffer Set, eBioscience) в течение 30 минут при комнатной температуре. Антитела против внутриклеточных эпитопов разбавляли в 1 × пермеабилизационном буфере и инкубировали с клетками в темноте в течение 30 минут при 4°С. Клетки промывали и ресуспендировали в FACS-буфере и фильтровали для регистрации данных. Следующие антитела использовали в следующих разведениях: CD3 (PerCP-Су5.5; 1/100); CD25 (РЕ-Су7; 1/625); CD4 (АРС-Н7; 1/160); CD8a (eFluor450; 1/300); CTLA4 (РЕ; 1/200); Foxp3 (APC 1/200).

Проточная цитометрия

[00285] Данные проточной цитометрии получали на установке BD Canto II с программным обеспечением FACSDiva и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo® (TreeStar). Для калибровки использовали микросферы UltraComp eBeads™ (eBioscience).

Статистический анализ

[00286] Статистический анализ проводили с применением программного обеспечения GraphPad Prism 6.

Результаты

[00287] Результаты в целом указывают на то, что (a) IL2 в низкой дозе (вводимый в слизистую оболочку посредством LL-IL-2) с проинсулином или без проинсулина в качестве аутоантигена (например, вводимого в виде LL-PINS) способен безопасно вызывать регрессию недавно выявленного диабета у мышей, (b) стимуляция и активация Treg (CD4+CD25+ Foxp3+CTLA4+) являются возможными механизмами действия терапии LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS, и (с) исходные концентрации глюкозы в крови являются прогностическим фактором для терапевтического успеха у мышей.

Доставка в слизистую оболочку LL-IL-2 вызывает длительную ремиссию диабета у NOD-мышей

[00288] Диагноз диабета ставили при результате глюкозы в крови у мышей более 200 мг/дл в течение двух дней подряд, в сочетании с положительной глюкозурией. Успех лечения ("ремиссия") определялся как наличие двух подряд результатов измерения уровня глюкозы в крови ниже 200 мг/дл и полного отсутствия положительной глюкозурии.

[00289] Не получавшие лечения NOD-мыши с диабетом сохраняли гипергликемию и были подвергнуты эвтаназии, когда они теряли более 20% от своей первоначальной массы тела. Лечение LL-pT1NX не восстанавливало нормогликемию у мышей с диабетом. Доставка в слизистую оболочку LL-PINS вызвала регрессию диабета у 12% мышей с недавно выявленным диабетом. Неожиданно, после 6 недель применения, введение одного LL-IL-2 вызывало регрессию диабета (т.е. приводило к восстановленной нормогликемии) у приблизительно 27% мышей с недавно выявленным диабетом. Комбинированная терапия, состоящая из доставки в слизистую оболочку LL-IL-2 в сочетании с LL-PINS (LL-IL-2+LL-PINS), восстановила нормогликемию после диабета у приблизительно 30% мышей. LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS вызывали долговременную ремиссию диабета в течение по меньшей мере 8 дополнительных недель после завершения лечения. По сравнению с терапией одним LL-IL-2, комбинированная терапия LL-IL-2+LL-PINS способна ускорить регрессию диабета. Результаты показаны на Фиг. 17.

Концентрация глюкозы в крови в начале терапии влияет на терапевтический успех

[00290] Терапия LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS в течение 6 недель приводила к регрессии диабета у приблизительно 45% и приблизительно 50% соответственно, у мышей с начальными уровнями глюкозы в крови ниже 350 мг/дл. Для сравнения, только приблизительно 8% мышей с начальными уровнями глюкозы в крови выше 350 мг/дл достигли ремиссии. Эти результаты показывают, что остаточная масса бета-клеток при начале лечения может позволить прогнозировать терапевтический успех. Эти результаты показаны на Фиг. 18. На Фиг. 22А и 22В показаны концентрации глюкозы в крови (мг/дл) у мышей с недавно выявленным диабетом, получавших только LL-IL-2 (Фиг. 22А) и LL-IL-2+LL-PINS (Фиг. 22В), в период лечения и в период наблюдения.

Доставка в слизистую оболочку LL-IL-2 сохраняет массу функциональных бета-клеток

[00291] Показатель С-пептида в плазме способен отражать содержание инсулина поджелудочной железы (см., например, Suarez-Pinzon WL et al., Combination therapy with glucagon-like peptide-1 and gastrin restores normoglycemia in diabetic NOD mice. Diabetes 2008; 57:3281-8.). Уровни С-пептида у мышей, получавших и излеченных LL-IL-2 (113,23±28,16 пМ, n=3) и LL-IL-2+LL-PINS (167,63±64,38 пмоль, n=9), составляли 19%, а 28% от значений С-пептида, измеренных у нормогликемических мышей NOD (602,93±293,43 пМ, n=6) и приблизительно в два раза выше, чем значения, обнаруженные у не получавших лечения NOD-мышей с длительным диабетом (n=4; 58,23±100,86 мМ). Уровни С-пептида могут быть мерой количества эндогенного инсулина, произведенного оставшимися островками. Когда у NOD мышей возникает диабет, уровни С-пептида падают, а у не получавших лечения мышей с длительным диабетом уровни С-пептида должны быть очень низкими или не обнаружимыми. Это фактически и наблюдалось у 3 из 4 проанализированных мышей. Только у одной мыши были обнаружимые уровни С-пептида. Это наблюдение свидетельствует, что функциональные бета-клетки все еще присутствуют при диагнозе диабета и сохраняются терапией. Мыши, получавшие LL-IL-2+LL-PINS и проявляющие диабетическую ремиссию, имели статистически достоверно более высокие уровни С-пептида по сравнению с мышами с недавно выявленным диабетом (р<0,05). У неизлеченных мышей были необнаружимые значения С-пептида, сходные с теми, что наблюдались у большинства мышей с длительным диабетом. Эти результаты показывают, что у животных с недавно выявленным диабетом осталась какая-то функция бета-клеток. Излеченные мыши имели уровни С-пептида, сравнимые с уровнем, обнаруженным у мышей с недавно выявленным диабетом. Неизлеченные животные утратили функцию бета-клеток, что проявляется в не обнаружимых уровнях С-пептида. Эти результаты показаны на Фиг. 19.

Доставка в слизистую оболочку LL-IL-2 замедляет прогрессирование инсулита

[00292] Гистологический анализ поджелудочной железы после начала диабета выявил островки поджелудочной железы, сильно инфильтрированные лейкоцитами, и лишь немногие островков с сохранившимися бета-клетками. LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS останавливали инсулит (т.е. предотвращали его ухудшение). Ухудшение инсулита обычно наблюдается при прогрессировании от недавно возникшего к давнему диабету. Неожиданно, оба препарата улучшили степень инсулита по сравнению с инсулитом, обнаруженным у нормогликемических NOD мышей с длительным диабетом. Хотя на процент островков с тяжелым инсулитом существенного влияния не было, оба препарата кардинально увеличили площадь, свободную от инсулита. Еще более неожиданно это улучшение наблюдалось и у животных, не достигших нормогликемии ("не излеченных" животных). Результаты показаны на Фиг. 20.

[00293] Окрашивание гематоксилином и эозином не позволило определить, какие именно иммунные клетки проникают в поджелудочную железу, то есть эффекторные Т-клетки (Teff) или клетки Treg.

Доставка в слизистую оболочку LL-IL-2 стимулирует экспансию CD4+Foxp3+CTLA4+Treg-клеток

[00294] Влияние LL-IL-2 на разные субпопуляции иммунных клеток, как локально (то есть в MLN), системно (то есть в селезенке и крови), так и в целевом органе (то есть в PLN) измеряли с применением проточного цитометрического анализа. Поскольку в низкой дозе IL-2, вводимый систематически, способен стимулировать экспрессию белков, ассоциированных с клетками Treg, включая Foxp3, CD25 и CTLA4, определяли относительные количества CD4+, CD8+ и CD4+ Foxp3+ клеток или их статус активации (CD44, CD62L).

[00295] Были оценены популяции CD4+ и CD8+ Т-клеток среди живых CD3+ Т-клеток. Небольшое снижение CD4+ Т-клеток в MLN было обнаружено при терапии LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS у неизлеченных мышей по сравнению с излеченными животными (р=0,044 и р=0,068 соответственно). В исследованных периферических органах (то есть крови и селезенке) и органе-мишени (то есть PLN) статистически значимых изменений в количестве этих лейкоцитов не наблюдалось. Различия в количествах CD4+ Т-клеток были ограничены участками, локально подверженными воздействию LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS. И наоборот, популяция CD8+ Т-клеток была увеличена в MLN не излеченных терапией LL-IL-2+LL-PINS мышей, по сравнению с вылеченными мышами (р=0,012). Эта тенденция также присутствовала при терапии LL-IL-2. Кроме того, получавшие LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS неизлеченные мыши имели значительно более высокие уровни CD8+ Т-клеток в селезенке (р=0,025 и р=0,011 соответственно) по сравнению с NOD-мышами с впервые выявленным диабетом. Это системное изменение могло быть следствием прогрессирования заболевания, а не терапии, содержащей L. lactis.

[00296] Присутствие клеток Treg оценивали также с использованием проточной цитометрии. Через 6 недель после начала терапии PLN мышей, излеченных LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS, показывали тенденцию к увеличению количества Foxp3+CTLA-4+Treg-клеток по сравнению с мышами с впервые выявленным диабетом (в обеих группах приблизительно 17% по сравнению с приблизительно 10% у мышей с впервые выявленным диабетом). Эта тенденция наблюдалась также у получавших LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS неизлеченных мышей (приблизительно 14% и приблизительно 17% соответственно).

[00297] В селезенке у неизлеченных мышей наблюдалось уменьшение этого компартмента клеток Treg по сравнению с излеченными мышами и по сравнению с получавшими лечения мышами с впервые выявленным диабетом. В крови оба вида терапии стимулировали тенденцию к увеличению циркулирующих Foxp3+CTLA-4+Treg-клеток по сравнению с мышами с впервые выявленным диабетом. Опять же, это увеличение не зависело от результата терапии и у неизлеченных мышей, получавших LL-IL-2+LL-PINS, это увеличение было значительным (р=0,009). В MLN у не излеченных LL-IL-2+LL-PINS мышей также наблюдались значительно более высокие количества Foxp3+CTLA4+Treg-клеток по сравнению с мышами с впервые выявленным диабетом (р=0,002). Вышеуказанные результаты проиллюстрированы на Фиг. 21.

[00298] Компартмент Treg клеток дополнительно определяли измеряя экспрессию CD25. Значительное количество Foxp3+CTLA4+Treg-клеток не экспрессировали CD25 (CD25-), но терапия LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS по-прежнему вызывала изменения в этой популяции. CD25-Foxp3+CTLA-4+Treg-клетки были относительно многочисленны в крови и повышены у не излеченных LL-IL-2+LL-PINS мышей (р=0,004) и у излеченных LL-IL-2 мышей. В селезенке тенденция к уменьшению этой популяции наблюдалась у получавших LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS не излеченных мышей по сравнению с вылеченными мышами (р=0,06 и р=0,06 соответственно). В брыжеечных лимфатических узлах наблюдалось мало влияния LL-IL-2 или LL-IL-2+LL-PINS на CD25-Foxp3+CTLA-4+Treg-клетки. В целевых лимфатических узлах (то есть, PLN) эта популяция Treg-клеток была увеличена у излеченных LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS мышей по сравнению с мышами с впервые выявленным диабетом.

[00299] Наблюдались следующие тенденции для CD25+ клеток: в MLN клетки CD25+Foxp3+CTLA-4+Treg были повышены у не излеченных мышей, получавших LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS, по сравнению с мышами с впервые выявленным диабетом (12% и 14% против 7% соответственно). Это было статистически значимо в последней группе (р=0,001). В PLN наблюдалась заметная тенденция к увеличению этой популяции в группах, получавших LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS.

[00300] Картина распределения Foxp3+CTLA-4+Treg-клеток, наблюдаемая в крови и селезенке, была сходной при дальнейшей классификации, основанной на экспрессии CD25. В локальных и целевых лимфатических узлах (т.е. MLN и PLN) повышение Foxp3+CTLA-4+Treg-клеток наблюдалось после обоих видов терапии, LL-IL-2 и LL-PINS+IL-2, что было в значительной степени обусловлено компартментом CD25+ Treg-клеток.

[00301] Размер селезенки у NOD мышей с впервые выявленным диабетом, получавших LL-PINS+IL-2, оценивали в общей сложности в течение 6 недель (n=3). Никакой спленомегалии не наблюдалось. Лечение LL-IL-2, как и LL-IL-2+LL-PINS было безопасным и хорошо переносилось.

Заключение

[00302] Терапия LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS является безопасной, хорошо переносимой и стимулирует ремиссию диабета у NOD мышей с впервые выявленным диабетом. Оба вида терапии обладают полезными метаболическими и иммунными эффектами. Неожиданно, некоторый эффект присутствует и у не излеченных мышей, что указывает на потенциальную выгоду для субъектов, которые не достигли нормогликемии в ходе экспериментов, или для которых лечение происходит слишком поздно, поскольку на момент начала лечения оставшаяся масса бета-клеток была ниже определенного порогового значения (у NOD-мышей процесс потери бета-клеток идет быстрее по сравнению с людьми). Таким образом, иммунный эффект возможно наблюдался у всех получавших лечение животных, но этот эффект транслировался в определенный терапевтический эффект только у животных, имеющих достаточную массу бета-клеток, оставшихся на момент начала лечения.

[00303] Препараты LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS останавливали прогрессирование инсулита, возможно, посредством механизма, включающего экспансию Treg-клеток. Различия в проценте Foxp3+CTLA4+ Treg-клеток между получавшими и не получавшими лечение мышами с впервые выявленным диабетом были обнаружены в PLN после терапии LL-IL-2 и LL-IL-2+LL-PINS. Увеличение числа клеток Treg, стимулированное этими препаратами, может быть результатом улучшения выживаемости Treg-клеток (см., например. Tang Q, Bluestone JA. Nat. Immunol. 2008; 9(3):239-244). В качестве альтернативы, увеличенное количество клеток Treg может быть результатом преобразования эффекторных Т-клеток (Teff) в стимулированные Treg-клетки (Zheng Y, Rudensky AY. Nat. Immunol. 2007; 8(5): 457-462), или увеличением рекрутинга Treg-клеток в PLN (Grinberg-Bleyer Y. et al., J. Exp. Med. 2010; 207(9): 1871-1878).

Пример 9. Эффект введения антитела против CD3 на частоту ремиссии диабета

[00304] Было проведено исследование по подбору дозы антитела против CD3 у мышей. Мышам с начальным уровнем глюкозы в крови более 200 мг/дл вводили 2,5 мкг/сут; 5 мкг/сут; 10 мкг/сут; 25 мкг/сут; или 50 мкг/сут антитела против CD3 (теплизумаб) путем в/в инъекций. Дозировки 25 мкг/сут или 50 мкг/сут проявляли некоторую токсичность. Лечение проводили в течение 5-дневного периода, т.е. совокупная доза антитела против CD3 составляла 12,5 мкг; 25 мкг; 50 мкг; 125 мкг; или 250 мкг. В группе лечения, получавшей 10 мкг/сут, максимальный процент ремиссии составлял приблизительно 50%. Однако, чтобы уменьшить токсичность в течение более длительного периода лечения, была выбрана доза 2,5 мкг/сут (12,5 мкг суммарно), которая считается субтерапевтической дозой (низкодозовое лечение). Введение 2,5 мкг/сут антитела против CD3 было менее эффективным, чем при более высокой дозе 10 мкг/сут, и приводила к стимуляции ремиссии у приблизительно 20%.

[00305] Как и в Примере 8, LL-PINS, LL-IL2, LL-PINS+LL-IL2 вводили путем внутрижелудочной инокуляции (2×10⁹ КОЕ/д), 5 раз в неделю в течение 6 недель мышам с впервые выявленным диабетом. Кроме того, в течение 5 дней подряд внутримышечно вводили (2,5 мкг/сут) моноклональное антитело хомяка против CD3 мыши (mAb) (145-2C11, BioXCell, Нью-Гемпшир, США) мышам, получавшим инокуляцию LL-PINS+LL-IL2. У всех исследуемых мышей с впервые выявленным диабетом начальная концентрация глюкозы в крови была ниже 350 мг/дл. Массу и гликемию измеряли 3 раза в неделю. Ремиссия диабета определялась как отсутствие гликозурии и величина гликемии <200 мг/дл в течение двух дней подряд.

[00306] Как показано на Фиг. 23, лечение LL-PINS (n=5), LL-IL2 (n=13) и смесью LL-PINS+LL-IL2 (n=31) корректировало гипергликемию у 20%, 30,8% и 45,2% мышей, соответственно. Среди мышей с впервые выявленным диабетом (n=3), получавших комбинацию LL-PINS+LL-IL2 и анти-CD3, нормогликемия восстановилась у 66,7% мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что дополнительное иммуномодулирующее вещество, например, антитело против CD3, улучшает исход терапии LL-IL-2+LL-PINS у субъектов с более низкой начальной концентрацией глюкозы в крови.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИНТРЕКСОН АКТОБИОТИКС Н.В.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА 1 ТИПА

<130> 205350-0030-00-WO-549987

<140>

<141>

<150> 62/350,472

<151> 2016-06-15

<150> 62/278,493

<151> 2016-01-14

<160> 61

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 2

<211> 462

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(459)

<400> 2

atg tac agg atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt 48

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

gtc aca aac agt gct cca act tca tca tca act aaa aaa act caa ttg 96

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

caa ctt gaa cac ttg ctt ttg gat ctt caa atg atc ttg aac ggt atc 144

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

aac aac tac aaa aac cca aaa ctt act cgt atg ttg act ttt aaa ttt 192

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

tac atg cca aaa aaa gct act gaa ctt aaa cac ttg caa tgt ctt gaa 240

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

gaa gaa ttg aaa cca ctt gaa gaa gtt ttg aac ctt gct caa tca aaa 288

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

aac ttt cac ttg cgt cca cgt gat ctt atc tca aac atc aac gtt atc 336

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

gtt ttg gaa ctt aaa ggt tca gaa act act ttt atg tgt gaa tac gct 384

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

gat gaa act gct act atc gtt gaa ttt ttg aac cgt tgg atc act ttt 432

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

tgt caa tca atc atc tca act ttg act taa 462

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 3

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 4

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 5

<211> 483

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

полинуклеотид"

<400> 5

atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60

ccgttgtcag gtgtttacgc cgctccaact tcatcatcaa ctaaaaaaac tcaattgcaa 120

cttgaacact tgcttttgga tcttcaaatg atcttgaacg gtatcaacaa ctacaaaaac 180

ccaaaactta ctcgtatgtt gacttttaaa ttttacatgc caaaaaaagc tactgaactt 240

aaacacttgc aatgtcttga agaagaattg aaaccacttg aagaagtttt gaaccttgct 300

caatcaaaaa actttcactt gcgtccacgt gatcttatct caaacatcaa cgttatcgtt 360

ttggaactta aaggttcaga aactactttt atgtgtgaat acgctgatga aactgctact 420

atcgttgaat ttttgaaccg ttggatcact ttttgtcaat caatcatctc aactttgact 480

taa 483

<210> 6

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly

20 25 30

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

35 40 45

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly

50 55 60

Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu

65 70 75 80

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys

85 90 95

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105 110

<210> 7

<211> 333

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(330)

<400> 7

atg gcc ctg tgg atg cgc ctc ctg ccc ctg ctg gcg ctg ctg gcc ctc 48

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

tgg gga cct gac cca gcc gca gcc ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc 96

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly

20 25 30

tca cac ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc 144

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

35 40 45

ttc tac aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg ggg 192

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly

50 55 60

cag gtg gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc ttg 240

Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu

65 70 75 80

gcc ctg gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc tgt 288

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys

85 90 95

acc agc atc tgc tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac tag 333

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105 110

<210> 8

<211> 396

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt tgcgtcagat cactgtcctt ctgccatggc 60

cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc 120

cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt 180

gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca 240

ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct 300

ggaggggtcc ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct 360

ctaccagctg gagaactact gcaactagac gcagcc 396

<210> 9

<211> 469

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 9

agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc agatcactgt ccttctgcca 60

tggccctgtg gatgcgcctc ctgcccctgc tggcgctgct ggccctctgg ggacctgacc 120

cagccgcagc ctttgtgaac caacacctgt gcggctcaca cctggtggaa gctctctacc 180

tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaagac ccgccgggag gcagaggacc 240

tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc aggcagcctg cagcccttgg 300

ccctggaggg gtccctgcag aagcgtggca ttgtggaaca atgctgtacc agcatctgct 360

ccctctacca gctggagaac tactgcaact agacgcagcc cgcaggcagc cccacacccg 420

ccgcctcctg caccgagaga gatggaataa agcccttgaa ccagcaaaa 469

<210> 10

<211> 495

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60

tgcgtcagat cactgtcctt ctgccatggc cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc 120

gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg 180

ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc 240

caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc 300

tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagaagc gtggcattgt 360

ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg gagaactact gcaactagac 420

gcagcccgca ggcagcccca cacccgccgc ctcctgcacc gagagagatg gaataaagcc 480

cttgaaccag caaaa 495

<210> 11

<211> 648

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 11

agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60

tgcgtcaggt gggctcagga ttccagggtg gctggacccc aggccccagc tctgcagcag 120

ggaggacgtg gctgggctcg tgaagcatgt gggggtgagc ccaggggccc caaggcaggg 180

cacctggcct tcagcctgcc tcagccctgc ctgtctccca gatcactgtc cttctgccat 240

ggccctgtgg atgcgcctcc tgcccctgct ggcgctgctg gccctctggg gacctgaccc 300

agccgcagcc tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct 360

agtgtgcggg gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct 420

gcaggtgggg caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc 480

cctggagggg tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc 540

cctctaccag ctggagaact actgcaacta gacgcagccc gcaggcagcc ccacacccgc 600

cgcctcctgc accgagagag atggaataaa gcccttgaac cagcaaaa 648

<210> 12

<211> 529

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 12

agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60

tgcgtcaggt gggctcagga ttccagggtg gctggacccc agatcactgt ccttctgcca 120

tggccctgtg gatgcgcctc ctgcccctgc tggcgctgct ggccctctgg ggacctgacc 180

cagccgcagc ctttgtgaac caacacctgt gcggctcaca cctggtggaa gctctctacc 240

tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaagac ccgccgggag gcagaggacc 300

tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc aggcagcctg cagcccttgg 360

ccctggaggg gtccctgcag aagcgtggca ttgtggaaca atgctgtacc agcatctgct 420

ccctctacca gctggagaac tactgcaact agacgcagcc cgcaggcagc cccacacccg 480

ccgcctcctg caccgagaga gatggaataa agcccttgaa ccagcaaaa 529

<210> 13

<211> 585

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Ser Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Gln Pro Pro

50 55 60

Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Ala Cys Ala Cys Asp Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

Ser Cys Ser Lys Val Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe

245 250 255

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg

260 265 270

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys

290 295 300

Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

Asn Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Phe Glu Ala His Val Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Pro Ser

500 505 510

Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys

515 520 525

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 14

<211> 1758

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(1755)

<400> 14

atg gca tct ccg ggc tct ggc ttt tgg tct ttc ggg tcg gaa gat ggc 48

Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

tct ggg gat tcc gag aat ccc ggc aca gcg cga gcc tgg tgc caa gtg 96

Ser Gly Asp Ser Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

gct cag aag ttc acg ggc ggc atc gga aac aaa ctg tgc gcc ctg ctc 144

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

tac gga gac gcc gag aag ccg gcg gag agc ggc ggg agc caa ccc ccg 192

Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Gln Pro Pro

50 55 60

cgg gcc gcc gcc cgg aag gcc gcc tgc gcc tgc gac cag aag ccc tgc 240

Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Ala Cys Ala Cys Asp Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

agc tgc tcc aaa gtg gat gtc aac tac gcg ttt ctc cat gca aca gac 288

Ser Cys Ser Lys Val Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

ctg ctg ccg gcg tgt gat gga gaa agg ccc act ttg gcg ttt ctg caa 336

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

gat gtt atg aac att tta ctt cag tat gtg gtg aaa agt ttc gat aga 384

Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

tca acc aaa gtg att gat ttc cat tat cct aat gag ctt ctc caa gaa 432

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

tat aat tgg gaa ttg gca gac caa cca caa aat ttg gag gaa att ttg 480

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

atg cat tgc caa aca act cta aaa tat gca att aaa aca ggg cat cct 528

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

aga tac ttc aat caa ctt tct act ggt ttg gat atg gtt gga tta gca 576

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

gca gac tgg ctg aca tca aca gca aat act aac atg ttc acc tat gaa 624

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

att gct cca gta ttt gtg ctt ttg gaa tat gtc aca cta aag aaa atg 672

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

aga gaa atc att ggc tgg cca ggg ggc tct ggc gat ggg ata ttt tct 720

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

ccc ggt ggc gcc ata tct aac atg tat gcc atg atg atc gca cgc ttt 768

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe

245 250 255

aag atg ttc cca gaa gtc aag gag aaa gga atg gct gct ctt ccc agg 816

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg

260 265 270

ctc att gcc ttc acg tct gaa cat agt cat ttt tct ctc aag aag gga 864

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

gct gca gcc tta ggg att gga aca gac agc gtg att ctg att aaa tgt 912

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys

290 295 300

gat gag aga ggg aaa atg att cca tct gat ctt gaa aga agg att ctt 960

Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

gaa gcc aaa cag aaa ggg ttt gtt cct ttc ctc gtg agt gcc aca gct 1008

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

gga acc acc gtg tac gga gca ttt gac ccc ctc tta gct gtc gct gac 1056

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

att tgc aaa aag tat aag atc tgg atg cat gtg gat gca gct tgg ggt 1104

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

ggg gga tta ctg atg tcc cga aaa cac aag tgg aaa ctg agt ggc gtg 1152

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

gag agg gcc aac tct gtg acg tgg aat cca cac aag atg atg gga gtc 1200

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

cct ttg cag tgc tct gct ctc ctg gtt aga gaa gag gga ttg atg cag 1248

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

aat tgc aac caa atg cat gcc tcc tac ctc ttt cag caa gat aaa cat 1296

Asn Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

tat gac ctg tcc tat gac act gga gac aag gcc tta cag tgc gga cgc 1344

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

cac gtt gat gtt ttt aaa cta tgg ctg atg tgg agg gca aag ggg act 1392

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

acc ggg ttt gaa gcg cat gtt gat aaa tgt ttg gag ttg gca gag tat 1440

Thr Gly Phe Glu Ala His Val Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

tta tac aac atc ata aaa aac cga gaa gga tat gag atg gtg ttt gat 1488

Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

ggg aag cct cag cac aca aat gtc tgc ttc tgg tac att cct cca agc 1536

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Pro Ser

500 505 510

ttg cgt act ctg gaa gac aat gaa gag aga atg agt cgc ctc tcg aag 1584

Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys

515 520 525

gtg gct cca gtg att aaa gcc aga atg atg gag tat gga acc aca atg 1632

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

gtc agc tac caa ccc ttg gga gac aag gtc aat ttc ttc cgc atg gtc 1680

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

atc tca aac cca gcg gca act cac caa gac att gac ttc ctg att gaa 1728

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

gaa ata gaa cgc ctt gga caa gat tta taa 1758

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 15

<211> 2400

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 15

agctcgcccg cagctcgcac tcgcaggcga cctgctccag tctccaaagc cgatggcatc 60

tccgggctct ggcttttggt ctttcgggtc ggaagatggc tctggggatt ccgagaatcc 120

cggcacagcg cgagcctggt gccaagtggc tcagaagttc acgggcggca tcggaaacaa 180

actgtgcgcc ctgctctacg gagacgccga gaagccggcg gagagcggcg ggagccaacc 240

cccgcgggcc gccgcccgga aggccgcctg cgcctgcgac cagaagccct gcagctgctc 300

caaagtggat gtcaactacg cgtttctcca tgcaacagac ctgctgccgg cgtgtgatgg 360

agaaaggccc actttggcgt ttctgcaaga tgttatgaac attttacttc agtatgtggt 420

gaaaagtttc gatagatcaa ccaaagtgat tgatttccat tatcctaatg agcttctcca 480

agaatataat tgggaattgg cagaccaacc acaaaatttg gaggaaattt tgatgcattg 540

ccaaacaact ctaaaatatg caattaaaac agggcatcct agatacttca atcaactttc 600

tactggtttg gatatggttg gattagcagc agactggctg acatcaacag caaatactaa 660

catgttcacc tatgaaattg ctccagtatt tgtgcttttg gaatatgtca cactaaagaa 720

aatgagagaa atcattggct ggccaggggg ctctggcgat gggatatttt ctcccggtgg 780

cgccatatct aacatgtatg ccatgatgat cgcacgcttt aagatgttcc cagaagtcaa 840

ggagaaagga atggctgctc ttcccaggct cattgccttc acgtctgaac atagtcattt 900

ttctctcaag aagggagctg cagccttagg gattggaaca gacagcgtga ttctgattaa 960

atgtgatgag agagggaaaa tgattccatc tgatcttgaa agaaggattc ttgaagccaa 1020

acagaaaggg tttgttcctt tcctcgtgag tgccacagct ggaaccaccg tgtacggagc 1080

atttgacccc ctcttagctg tcgctgacat ttgcaaaaag tataagatct ggatgcatgt 1140

ggatgcagct tggggtgggg gattactgat gtcccgaaaa cacaagtgga aactgagtgg 1200

cgtggagagg gccaactctg tgacgtggaa tccacacaag atgatgggag tccctttgca 1260

gtgctctgct ctcctggtta gagaagaggg attgatgcag aattgcaacc aaatgcatgc 1320

ctcctacctc tttcagcaag ataaacatta tgacctgtcc tatgacactg gagacaaggc 1380

cttacagtgc ggacgccacg ttgatgtttt taaactatgg ctgatgtgga gggcaaaggg 1440

gactaccggg tttgaagcgc atgttgataa atgtttggag ttggcagagt atttatacaa 1500

catcataaaa aaccgagaag gatatgagat ggtgtttgat gggaagcctc agcacacaaa 1560

tgtctgcttc tggtacattc ctccaagctt gcgtactctg gaagacaatg aagagagaat 1620

gagtcgcctc tcgaaggtgg ctccagtgat taaagccaga atgatggagt atggaaccac 1680

aatggtcagc taccaaccct tgggagacaa ggtcaatttc ttccgcatgg tcatctcaaa 1740

cccagcggca actcaccaag acattgactt cctgattgaa gaaatagaac gccttggaca 1800

agatttataa taaccttgct caccaagctg ttccacttct ctaggtagac aattaagttg 1860

tcacaaactg tgtgaatgta tttgtagttt gttccaaagt aaatctattt ctatattgtg 1920

gtgtcaaagt agagtttaaa aattaaacaa aaaagacatt gctcctttta aaagtccttt 1980

cttaagttta gaatacctct ctaagaattc gtgacaaaag gctatgttct aatcaataag 2040

gaaaagctta aaattgttat aaatacttcc cttactttta atatagtgtg caaagcaaac 2100

tttattttca cttcagacta gtaggactga atagtgccaa attgcccctg aatcataaaa 2160

ggttctttgg ggtgcagtaa aaaggacaaa gtaaatataa aatatatgtt gacaataaaa 2220

actcttgcct ttttcatagt attagaaaaa aatttctaat ttacctatag caacatttca 2280

aatgtattta aatacatata attttacaaa aggaaaatat atatattaaa aaagatatcc 2340

tattttgtaa catatagatt tttattttat ataggttata caaactgcgg gggcggaatt 2400

<210> 16

<211> 3610

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 16

gaattcttcg taggaattat cttttccctc ctctcacccg acagcctgcc tatttccaaa 60

ggaaaaaaaa aaagcgtgtt gagtacgttc tggattactc ataagacctt ttttttttcc 120

ttccgggcgc aaaaccgtga gctggattta taatcgccct ataaagctcc agaggcggtc 180

aggcacctgc agaggagccc cgccgctccg ccgactagct gcccccgcga gcaacggcct 240

cgtgatttcc ccgccgatcc ggtccccgcc tccccactct gcccccgcct accccggagc 300

cgtgcagccg cctctccgaa tctctctctt ctcctggcgc tcgcgtgcga gagggaacta 360

gcgagaacga ggaagcagct ggaggtgacg ccgggcagat tacgcctgtc agggccgagc 420

cgagcggatc gctgggcgct gtgcagagga aaggcgggag tgcccggctc gctgtcgcag 480

agccgagcct gtttctgcgc cggaccagtc gaggactctg gacagtagag gccccgggac 540

gaccgagctg atggcgtctt cgaccccatc ttcgtccgca acctcctcga acgcgggagc 600

ggaccccaat accactaacc tgcgccccac aacgtacgat acctggtgcg gcgtggccca 660

tggatgcacc agaaaactgg ggctcaagat ctgcggcttc ttgcaaagga ccaacagcct 720

ggaagagaag agtcgccttg tgagtgcctt cagggagagg caatcctcca agaacctgct 780

ttcctgtgaa aacagcgacc gggatgcccg cttccggcgc acagagactg acttctctaa 840

tctgtttgct agagatctgc ttccggctaa gaacggtgag gagcaaaccg tgcaattcct 900

cctggaagtg gtggacatac tcctcaacta tgtccgcaag acatttgatc gctccaccaa 960

ggtgctggac tttcatcacc cacaccagtt gctggaaggc atggagggct tcaacttgga 1020

gctctctgac caccccgagt ccctggagca gatcctggtt gactgcagag acaccttgaa 1080

gtatggggtt cgcacaggtc atcctcgatt tttcaaccag ctctccactg gattggatat 1140

tattggccta gctggagaat ggctgacatc aacggccaat accaacatgt ttacatatga 1200

aattgcacca gtgtttgtcc tcatggaaca aataacactt aagaagatga gagagatagt 1260

tggatggtca agtaaagatg gtgatgggat attttctcct gggggcgcca tatccaacat 1320

gtacagcatc atggctgctc gctacaagta cttcccggaa gttaagacaa agggcatggc 1380

ggctgtgcct aaactggtcc tcttcacctc agaacagagt cactattcca taaagaaagc 1440

tggggctgca cttggctttg gaactgacaa tgtgattttg ataaagtgca atgaaagggg 1500

gaaaataatt ccagctgatt ttgaggcaaa aattcttgaa gccaaacaga agggatatgt 1560

tcccttttat gtcaatgcaa ctgctggcac gactgtttat ggagcttttg atccgataca 1620

agagattgca gatatatgtg agaaatataa cctttggttg catgtcgatg ctgcctgggg 1680

aggtgggctg ctcatgtcca ggaagcaccg ccataaactc aacggcatag aaagggccaa 1740

ctcagtcacc tggaaccctc acaagatgat gggcgtgctg ttgcagtgct ctgccattct 1800

cgtcaaggaa aagggtatac tccaaggatg caaccagatg tgtgcaggat atctcttcca 1860

gccagacaag cagtatgatg tctcctacga caccggggac aaggcaattc agtgtggccg 1920

ccacgtggat atcttcaagt tctggctgat gtggaaagca aagggcacag tgggatttga 1980

aaaccagatc aacaaatgcc tggaactggc tgaatacctc tatgccaaga ttaaaaacag 2040

agaagaattt gagatggttt tcaatggcga gcctgagcac acaaacgtct gtttttggta 2100

tattccacaa agcctcaggg gtgtgccaga cagccctcaa cgacgggaaa agctacacaa 2160

ggtggctcca aaaatcaaag ccctgatgat ggagtcaggt acgaccatgg ttggctacca 2220

gccccaaggg gacaaggcca acttcttccg gatggtcatc tccaacccag ccgctaccca 2280

gtctgacatt gacttcctca ttgaggagat agaaagactg ggccaggatc tgtaatcatc 2340

cttcgcagaa catgagttta tgggaatgcc ttttccctct ggcactccag aacaaacctc 2400

tatatgttgc tgaaacacac aggccatttc attgagggaa aacataatat cttgaagaat 2460

attgttaaaa ccttacttaa agcttgtttg ttctagttag caggaaatag tgttcttttt 2520

aaaaagttgc acattaggaa cagagtatat atgtacagtt atacatacct ctctctatat 2580

atacatgtat agtgagtgtg gcttagtaat agatcacggc atgtttcccg ctccaagaga 2640

attcacttta ccttcagcag ttaccgagga gctaaacatg ctgccaacca gcttgtccaa 2700

caactccagg aaaactgttt ttcaaaacgc catgtcctag gggccaaggg aaatgctgtt 2760

ggtgagaatc gacctcactg tcagcgtttc tccacctgaa gtgatgatgg atgagaaaaa 2820

acaccaccaa atgacaagtc acaccctccc cattagtatc ctgttagggg aaaatagtag 2880

cagagtcatt gttacaggtg tactatggct gtattttaga gattaatttg tgtagattgt 2940

gtaaattcct gttgtctgac cttggtggtg ggaggggaga ctatgtgtca tgatttcaat 3000

gattgtttaa ttgtaggtca atgaaatatt tgcttattta tattcagaga tgtaccatgt 3060

taaagaggcg tcttgtattt tcttcccatt tgtaatgtat cttatttata tatgaagtaa 3120

gttctgaaaa ctgtttatgg tattttcgtg catttgtgag ccaaagagaa aagattaaaa 3180

ttagtgagat ttgtatttat attagagtgc ccttaaaata atgatttaag cattttactg 3240

tctgtaagag aattctaaga ttgtacatga cataagttat agtaatcatg gcaaatcctg 3300

ttacttaaat agcatctgct cttctcttac gctctctgtc tggctgtacg tctggtgttc 3360

tcaatgcttt tctagcaact gttggataat aactagatct cctgtaattt tgtagtagtt 3420

gatgaccaat ctctgtgact cgcttagctg aaacctaagg caacatttcc gaagaccttc 3480

tgaagatctc agataaagtg accaggctca caactgtttt tgaagaaggg aaattcacac 3540

tgtgcgtttt gagtatgcaa gaagaatata aataaataaa atatctcatg gagattgaca 3600

aaaaaaaaaa 3610

<210> 17

<211> 2824

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 17

gcggccgccc gcacttcccg cctctggctc gcccgaggac gcgctggcac gcctcccacc 60

ccctcactct gactccagct ggcgtgcatg gtctgcctcg catcctcacg actcagctcc 120

ctccctctct cgtgtttttt tcctccgccg ccccctcatt catccccact gggctccctt 180

tccctcaaat gctctggggc tctccgcgct ttcctgagtc cgggctccga ggacccttag 240

gtagtcccgg tctcttttaa agctccccgg cttccaaagg gttgccacgt ccctaaaccc 300

tgtctccagc tcgcatacac acacgcacag acacgcacgt tttctgttcc tgcgtgacac 360

ccgccctcgc cgctcggccc cgccggtccc cgcgcggtgc cctcctcccg ccacacgggc 420

acgcacgcgc gcgcagggcc aagcccgagg cagctcgccc gcagctcgca ctcgcaggcg 480

acctgctcca gtctccaaag ccgatggcat ctccgggctc tggcttttgg tctttcgggt 540

cggaagatgg ctctggggat tccgagaatc ccggcacagc gcgagcctgg tgccaagtgg 600

ctcagaagtt cacgggcggc atcggaaaca aactgtgcgc cctgctctac ggagacgccg 660

agaagccggc ggagagcggc gggagccaac ccccgcgggc cgccgcccgg aaggccgcct 720

gcgcctgcga ccagaagccc tgcagctgct ccaaagtgga tgtcaactac gcgtttctcc 780

atgcaacaga cctgctgccg gcgtgtgatg gagaaaggcc cactttggcg tttctgcaag 840

atgttatgaa cattttactt cagtatgtgg tgaaaagttt cgatagatca accaaagtga 900

ttgatttcca ttatcctaat gagcttctcc aagaatataa ttgggaattg gcagaccaac 960

cacaaaattt ggaggaaatt ttgatgcatt gccaaacaac tctaaaatat gcaattaaaa 1020

cagggcatcc tagatacttc aatcaacttt ctactggttt ggatatggtt ggattagcag 1080

cagactggct gacatcaaca gcaaatacta acatgttcac ctatgaaatt gctccagtat 1140

ttgtgctttt ggaatatgtc acactaaaga aaatgagaga aatcattggc tggccagggg 1200

gctctggcga tgggatattt tctcccggtg gcgccatatc taacatgtat gccatgatga 1260

tcgcacgctt taagatgttc ccagaagtca aggagaaagg aatggctgct cttcccaggc 1320

tcattgcctt cacgtctgaa catagtcatt tttctctcaa gaagggagct gcagccttag 1380

ggattggaac agacagcgtg attctgatta aatgtgatga gagagggaaa atgattccat 1440

ctgatcttga aagaaggatt cttgaagcca aacagaaagg gtttgttcct ttcctcgtga 1500

gtgccacagc tggaaccacc gtgtacggag catttgaccc cctcttagct gtcgctgaca 1560

tttgcaaaaa gtataagatc tggatgcatg tggatgcagc ttggggtggg ggattactga 1620

tgtcccgaaa acacaagtgg aaactgagtg gcgtggagag ggccaactct gtgacgtgga 1680

atccacacaa gatgatggga gtccctttgc agtgctctgc tctcctggtt agagaagagg 1740

gattgatgca gaattgcaac caaatgcatg cctcctacct ctttcagcaa gataaacatt 1800

atgacctgtc ctatgacact ggagacaagg ccttacagtg cggacgccac gttgatgttt 1860

ttaaactatg gctgatgtgg agggcaaagg ggactaccgg gtttgaagcg catgttgata 1920

aatgtttgga gttggcagag tatttataca acatcataaa aaaccgagaa ggatatgaga 1980

tggtgtttga tgggaagcct cagcacacaa atgtctgctt ctggtacatt cctccaagct 2040

tgcgtactct ggaagacaat gaagagagaa tgagtcgcct ctcgaaggtg gctccagtga 2100

ttaaagccag aatgatggag tatggaacca caatggtcag ctaccaaccc ttgggagaca 2160

aggtcaattt cttccgcatg gtcatctcaa acccagcggc aactcaccaa gacattgact 2220

tcctgattga agaaatagaa cgccttggac aagatttata ataaccttgc tcaccaagct 2280

gttccacttc tctagagaac atgccctcag ctaagccccc tactgagaaa cttcctttga 2340

gaattgtgcg acttcacaaa atgcaaggtg aacaccactt tgtctctgag aacagacgtt 2400

accaattatg gagtgtcacc agctgccaaa atcgtaggtg ttggctctgc tggtcactgg 2460

agtagttgct actcttcaga atatggacaa agaaggcaca ggtgtaaata tagtagcagg 2520

atgaggaacc tcaaactggg tatcattttg cacgtgctct tctgttctca aatgctaaat 2580

gcaaacactg tgtatttatt agttaggtgt gccaaactac cgttcccaaa ttggtgtttc 2640

tgaatgacat caacattccc ccaacattac tccattacta aagacagaaa aaaataaaaa 2700

cataaaatat acaaacatgt ggcaacctgt tcttcctacc aaatataaac ttgtgtatga 2760

tccaagtatt ttatctgtgt tgtctctcta aacccaaata aatgtgtaaa tgtggacaca 2820

tctc 2824

<210> 18

<211> 2419

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 18

gcggccgccc gcacttcccg cctctggctc gcccgaggac gcgctggcac gcctcccacc 60

ccctcactct gactccagct ggcgtgcatg gtctgcctcg catcctcacg actcagctcc 120

ctccctctct cgtgtttttt tcctccgccg ccccctcatt catccccact gggctccctt 180

tccctcaaat gctctggggc tctccgcgct ttcctgagtc cgggctccga ggacccttag 240

gtagtcccgg tctcttttaa agctccccgg cttccaaagg gttgccacgt ccctaaaccc 300

tgtctccagc tcgcatacac acacgcacag acacgcacgt tttctgttcc tgcgtgacac 360

ccgccctcgc cgctcggccc cgccggtccc cgcgcggtgc cctcctcccg ccacacgggc 420

acgcacgcgc gcgcagggcc aagcccgagg cagctcgccc gcagctcgca ctcgcaggcg 480

acctgctcca gtctccaaag ccgatggcat ctccgggctc tggcttttgg tctttcgggt 540

cggaagatgg ctctggggat tccgagaatc ccggcacagc gcgagcctgg tgccaagtgg 600

ctcagaagtt cacgggcggc atcggaaaca aactgtgcgc cctgctctac ggagacgccg 660

agaagccggc ggagagcggc gggagccaac ccccgcgggc cgccgcccgg aaggccgcct 720

gcgcctgcga ccagaagccc tgcagctgct ccaaagtgga tgtcaactac gcgtttctcc 780

atgcaacaga cctgctgccg gcgtgtgatg gagaaaggcc cactttggcg tttctgcaag 840

atgttatgaa cattttactt cagtatgtgg tgaaaagttt cgatagatca accaaagtga 900

ttgatttcca ttatcctaat gagcttctcc aagaatataa ttgggaattg gcagaccaac 960

cacaaaattt ggaggaaatt ttgatgcatt gccaaacaac tctaaaatat gcaattaaaa 1020

cagggcatcc tagatacttc aatcaacttt ctactggttt ggatatggtt ggattagcag 1080

cagactggct gacatcaaca gcaaatacta acatgttcac ctatgaaatt gctccagtat 1140

ttgtgctttt ggaatatgtc acactaaaga aaatgagaga aatcattggc tggccagggg 1200

gctctggcga tgggatattt tctcccggtg gcgccatatc taacatgtat gccatgatga 1260

tcgcacgctt taagatgttc ccagaagtca aggagaaagg aatggctgct cttcccaggc 1320

tcattgcctt cacgtctgaa catagtcatt tttctctcaa gaagggagct gcagccttag 1380

ggattggaac agacagcgtg attctgatta aatgtgatga gagagggaaa atgattccat 1440

ctgatcttga aagaaggatt cttgaagcca aacagaaagg gtttgttcct ttcctcgtga 1500

gtgccacagc tggaaccacc gtgtacggag catttgaccc cctcttagct gtcgctgaca 1560

tttgcaaaaa gtataagatc tggatgcatg tggatgcagc ttggggtggg ggattactga 1620

tgtcccgaaa acacaagtgg aaactgagtg gcgtggagag ggccaactct gtgacgtgga 1680

atccacacaa gatgatggga gtccctttgc agtgctctgc tctcctggtt agagaagagg 1740

gattgatgca gaattgcaac caaatgcatg cctcctacct ctttcagcaa gataaacatt 1800

atgacctgtc ctatgacact ggagacaagg ccttacagtg cggacgccac gttgatgttt 1860

ttaaactatg gctgatgtgg agggcaaagg ggactaccgg gtttgaagcg catgttgata 1920

aatgtttgga gttggcagag tatttataca acatcataaa aaaccgagaa ggatatgaga 1980

tggtgtttga tgggaagcct cagcacacaa atgtctgctt ctggtacatt cctccaagct 2040

tgcgtactct ggaagacaat gaagagagaa tgagtcgcct ctcgaaggtg gctccagtga 2100

ttaaagccag aatgatggag tatggaacca caatggtcag ctaccaaccc ttgggagaca 2160

aggtcaattt cttccgcatg gtcatctcaa acccagcggc aactcaccaa gacattgact 2220

tcctgattga agaaatagaa cgccttggac aagatttata ataaccttgc tcaccaagct 2280

gttccacttc tctaggtaga caattaagtt gtcacaaact gtgtgaatgt atttgtagtt 2340

tgttccaaag taaatctatt tctatattgt ggtgtcaaag tagagtttaa aaattaaaca 2400

aaaaagacat tgctccttt 2419

<210> 19

<211> 979

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 19

Met Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Ser Arg Pro Gly Gly Cys

20 25 30

Ser Ala Val Ser Ala His Gly Cys Leu Phe Asp Arg Arg Leu Cys Ser

35 40 45

His Leu Glu Val Cys Ile Gln Asp Gly Leu Phe Gly Gln Cys Gln Val

50 55 60

Gly Val Gly Gln Ala Arg Pro Leu Leu Gln Val Thr Ser Pro Val Leu

65 70 75 80

Gln Arg Leu Gln Gly Val Leu Arg Gln Leu Met Ser Gln Gly Leu Ser

85 90 95

Trp His Asp Asp Leu Thr Gln Tyr Val Ile Ser Gln Glu Met Glu Arg

100 105 110

Ile Pro Arg Leu Arg Pro Pro Glu Pro Arg Pro Arg Asp Arg Ser Gly

115 120 125

Leu Ala Pro Lys Arg Pro Gly Pro Ala Gly Glu Leu Leu Leu Gln Asp

130 135 140

Ile Pro Thr Gly Ser Ala Pro Ala Ala Gln His Arg Leu Pro Gln Pro

145 150 155 160

Pro Val Gly Lys Gly Gly Ala Gly Ala Ser Ser Ser Leu Ser Pro Leu

165 170 175

Gln Ala Glu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Glu His Leu Leu Leu Pro Pro

180 185 190

Gln Pro Pro His Pro Ser Leu Ser Tyr Glu Pro Ala Leu Leu Gln Pro

195 200 205

Tyr Leu Phe His Gln Phe Gly Ser Arg Asp Gly Ser Arg Val Ser Glu

210 215 220

Gly Ser Pro Gly Met Val Ser Val Gly Pro Leu Pro Lys Ala Glu Ala

225 230 235 240

Pro Ala Leu Phe Ser Arg Thr Ala Ser Lys Gly Ile Phe Gly Asp His

245 250 255

Pro Gly His Ser Tyr Gly Asp Leu Pro Gly Pro Ser Pro Ala Gln Leu

260 265 270

Phe Gln Asp Ser Gly Leu Leu Tyr Leu Ala Gln Glu Leu Pro Ala Pro

275 280 285

Ser Arg Ala Arg Val Pro Arg Leu Pro Glu Gln Gly Ser Ser Ser Arg

290 295 300

Ala Glu Asp Ser Pro Glu Gly Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Asp Arg

305 310 315 320

Gly Glu Lys Pro Ala Ser Pro Ala Val Gln Pro Asp Ala Ala Leu Gln

325 330 335

Arg Leu Ala Ala Val Leu Ala Gly Tyr Gly Val Glu Leu Arg Gln Leu

340 345 350

Thr Pro Glu Gln Leu Ser Thr Leu Leu Thr Leu Leu Gln Leu Leu Pro

355 360 365

Lys Gly Ala Gly Arg Asn Pro Gly Gly Val Val Asn Val Gly Ala Asp

370 375 380

Ile Lys Lys Thr Met Glu Gly Pro Val Glu Gly Arg Asp Thr Ala Glu

385 390 395 400

Leu Pro Ala Arg Thr Ser Pro Met Pro Gly His Pro Thr Ala Ser Pro

405 410 415

Thr Ser Ser Glu Val Gln Gln Val Pro Ser Pro Val Ser Ser Glu Pro

420 425 430

Pro Lys Ala Ala Arg Pro Pro Val Thr Pro Val Leu Leu Glu Lys Lys

435 440 445

Ser Pro Leu Gly Gln Ser Gln Pro Thr Val Ala Gly Gln Pro Ser Ala

450 455 460

Arg Pro Ala Ala Glu Glu Tyr Gly Tyr Ile Val Thr Asp Gln Lys Pro

465 470 475 480

Leu Ser Leu Ala Ala Gly Val Lys Leu Leu Glu Ile Leu Ala Glu His

485 490 495

Val His Met Ser Ser Gly Ser Phe Ile Asn Ile Ser Val Val Gly Pro

500 505 510

Ala Leu Thr Phe Arg Ile Arg His Asn Glu Gln Asn Leu Ser Leu Ala

515 520 525

Asp Val Thr Gln Gln Ala Gly Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Ala Gln

530 535 540

Thr Gly Leu Gln Ile Leu Gln Thr Gly Val Gly Gln Arg Glu Glu Ala

545 550 555 560

Ala Ala Val Leu Pro Gln Thr Ala His Ser Thr Ser Pro Met Arg Ser

565 570 575

Val Leu Leu Thr Leu Val Ala Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu Leu Val

580 585 590

Ala Leu Ala Val Ala Leu Cys Val Arg Gln His Ala Arg Gln Gln Asp

595 600 605

Lys Glu Arg Leu Ala Ala Leu Gly Pro Glu Gly Ala His Gly Asp Thr

610 615 620

Thr Phe Glu Tyr Gln Asp Leu Cys Arg Gln His Met Ala Thr Lys Ser

625 630 635 640

Leu Phe Asn Arg Ala Glu Gly Pro Pro Glu Pro Ser Arg Val Ser Ser

645 650 655

Val Ser Ser Gln Phe Ser Asp Ala Ala Gln Ala Ser Pro Ser Ser His

660 665 670

Ser Ser Thr Pro Ser Trp Cys Glu Glu Pro Ala Gln Ala Asn Met Asp

675 680 685

Ile Ser Thr Gly His Met Ile Leu Ala Tyr Met Glu Asp His Leu Arg

690 695 700

Asn Arg Asp Arg Leu Ala Lys Glu Trp Gln Ala Leu Cys Ala Tyr Gln

705 710 715 720

Ala Glu Pro Asn Thr Cys Ala Thr Ala Gln Gly Glu Gly Asn Ile Lys

725 730 735

Lys Asn Arg His Pro Asp Phe Leu Pro Tyr Asp His Ala Arg Ile Lys

740 745 750

Leu Lys Val Glu Ser Ser Pro Ser Arg Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser

755 760 765

Pro Ile Ile Glu His Asp Pro Arg Met Pro Ala Tyr Ile Ala Thr Gln

770 775 780

Gly Pro Leu Ser His Thr Ile Ala Asp Phe Trp Gln Met Val Trp Glu

785 790 795 800

Ser Gly Cys Thr Val Ile Val Met Leu Thr Pro Leu Val Glu Asp Gly

805 810 815

Val Lys Gln Cys Asp Arg Tyr Trp Pro Asp Glu Gly Ala Ser Leu Tyr

820 825 830

His Val Tyr Glu Val Asn Leu Val Ser Glu His Ile Trp Cys Glu Asp

835 840 845

Phe Leu Val Arg Ser Phe Tyr Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr

850 855 860

Arg Thr Leu Thr Gln Phe His Phe Leu Ser Trp Pro Ala Glu Gly Thr

865 870 875 880

Pro Ala Ser Thr Arg Pro Leu Leu Asp Phe Arg Arg Lys Val Asn Lys

885 890 895

Cys Tyr Arg Gly Arg Ser Cys Pro Ile Ile Val His Cys Ser Asp Gly

900 905 910

Ala Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Leu Ile Asp Met Val Leu Asn Arg

915 920 925

Met Ala Lys Gly Val Lys Glu Ile Asp Ile Ala Ala Thr Leu Glu His

930 935 940

Val Arg Asp Gln Arg Pro Gly Leu Val Arg Ser Lys Asp Gln Phe Glu

945 950 955 960

Phe Ala Leu Thr Ala Val Ala Glu Glu Val Asn Ala Ile Leu Lys Ala

965 970 975

Leu Pro Gln

<210> 20

<211> 2940

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(2937)

<400> 20

atg cgg cgc ccg cgg cgg cct ggg ggt ctc ggg gga tcc ggg ggt ctc 48

Met Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu

1 5 10 15

cgg ctg ctc ctc tgc ctc ctg ctg ctg agc agc cgc ccg ggg ggc tgc 96

Arg Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Ser Arg Pro Gly Gly Cys

20 25 30

agc gcc gtt agt gcc cac ggc tgt cta ttt gac cgc agg ctc tgc tct 144

Ser Ala Val Ser Ala His Gly Cys Leu Phe Asp Arg Arg Leu Cys Ser

35 40 45

cac ctg gaa gtc tgt att cag gat ggc ttg ttt ggg cag tgc cag gtg 192

His Leu Glu Val Cys Ile Gln Asp Gly Leu Phe Gly Gln Cys Gln Val

50 55 60

gga gtg ggg cag gcc cgg ccc ctt ttg caa gtc acc tcc cca gtt ctc 240

Gly Val Gly Gln Ala Arg Pro Leu Leu Gln Val Thr Ser Pro Val Leu

65 70 75 80

caa cgc tta caa ggt gtg ctc cga caa ctc atg tcc caa gga ttg tcc 288

Gln Arg Leu Gln Gly Val Leu Arg Gln Leu Met Ser Gln Gly Leu Ser

85 90 95

tgg cac gat gac ctc acc cag tat gtg atc tct cag gag atg gag cgc 336

Trp His Asp Asp Leu Thr Gln Tyr Val Ile Ser Gln Glu Met Glu Arg

100 105 110

atc ccc agg ctt cgc ccc cca gag ccc cgt cca agg gac agg tct ggc 384

Ile Pro Arg Leu Arg Pro Pro Glu Pro Arg Pro Arg Asp Arg Ser Gly

115 120 125

ttg gca ccc aag aga cct ggt cct gct gga gag ctg ctt tta cag gac 432

Leu Ala Pro Lys Arg Pro Gly Pro Ala Gly Glu Leu Leu Leu Gln Asp

130 135 140

atc ccc act ggc tcc gcc cct gct gcc cag cat cgg ctt cca caa cca 480

Ile Pro Thr Gly Ser Ala Pro Ala Ala Gln His Arg Leu Pro Gln Pro

145 150 155 160

cca gtg ggc aaa ggt gga gct ggg gcc agc tcc tct ctg tcc cct ctg 528

Pro Val Gly Lys Gly Gly Ala Gly Ala Ser Ser Ser Leu Ser Pro Leu

165 170 175

cag gct gag ctg ctc ccg cct ctc ttg gag cac ctg ctg ctg ccc cca 576

Gln Ala Glu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Glu His Leu Leu Leu Pro Pro

180 185 190

cag cct ccc cac cct tca ctg agt tac gaa cct gcc ttg ctg cag ccc 624

Gln Pro Pro His Pro Ser Leu Ser Tyr Glu Pro Ala Leu Leu Gln Pro

195 200 205

tac ctg ttc cac cag ttt ggc tcc cgt gat ggc tcc agg gtc tca gag 672

Tyr Leu Phe His Gln Phe Gly Ser Arg Asp Gly Ser Arg Val Ser Glu

210 215 220

ggc tcc cca ggg atg gtc agt gtc ggc ccc ctg ccc aag gct gaa gcc 720

Gly Ser Pro Gly Met Val Ser Val Gly Pro Leu Pro Lys Ala Glu Ala

225 230 235 240

cct gcc ctc ttc agc aga act gcc tcc aag ggc ata ttt ggg gac cac 768

Pro Ala Leu Phe Ser Arg Thr Ala Ser Lys Gly Ile Phe Gly Asp His

245 250 255

cct ggc cac tcc tac ggg gac ctt cca ggg cct tca cct gcc cag ctt 816

Pro Gly His Ser Tyr Gly Asp Leu Pro Gly Pro Ser Pro Ala Gln Leu

260 265 270

ttt caa gac tct ggg ctg ctc tat ctg gcc cag gag ttg cca gca ccc 864

Phe Gln Asp Ser Gly Leu Leu Tyr Leu Ala Gln Glu Leu Pro Ala Pro

275 280 285

agc agg gcc agg gtg cca agg ctg cca gag caa ggg agc agc agc cgg 912

Ser Arg Ala Arg Val Pro Arg Leu Pro Glu Gln Gly Ser Ser Ser Arg

290 295 300

gca gag gac tcc cca gag ggc tat gag aag gaa gga cta ggg gat cgt 960

Ala Glu Asp Ser Pro Glu Gly Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Asp Arg

305 310 315 320

gga gag aag cct gct tcc cca gct gtg cag cca gat gcg gct ctg cag 1008

Gly Glu Lys Pro Ala Ser Pro Ala Val Gln Pro Asp Ala Ala Leu Gln

325 330 335

agg ctg gcc gct gtg ctg gcg ggc tat ggg gta gag ctg cgt cag ctg 1056

Arg Leu Ala Ala Val Leu Ala Gly Tyr Gly Val Glu Leu Arg Gln Leu

340 345 350

acc cct gag cag ctc tcc aca ctc ctg acc ctg ctg cag cta ctg ccc 1104

Thr Pro Glu Gln Leu Ser Thr Leu Leu Thr Leu Leu Gln Leu Leu Pro

355 360 365

aag ggt gca gga aga aat ccg gga ggg gtt gta aat gtt gga gct gat 1152

Lys Gly Ala Gly Arg Asn Pro Gly Gly Val Val Asn Val Gly Ala Asp

370 375 380

atc aag aaa aca atg gag ggg ccg gtg gag ggc aga gac aca gca gag 1200

Ile Lys Lys Thr Met Glu Gly Pro Val Glu Gly Arg Asp Thr Ala Glu

385 390 395 400

ctt cca gcc cgc aca tcc ccc atg cct gga cac ccc act gcc agc cct 1248

Leu Pro Ala Arg Thr Ser Pro Met Pro Gly His Pro Thr Ala Ser Pro

405 410 415

acc tcc agt gaa gtc cag cag gtg cca agc cct gtc tcc tct gag cct 1296

Thr Ser Ser Glu Val Gln Gln Val Pro Ser Pro Val Ser Ser Glu Pro

420 425 430

ccc aaa gct gcc aga ccc cct gtg aca cct gtc ctg cta gag aag aaa 1344

Pro Lys Ala Ala Arg Pro Pro Val Thr Pro Val Leu Leu Glu Lys Lys

435 440 445

agc cca ctg ggc cag agc cag ccc acg gtg gca gga cag ccc tca gcc 1392

Ser Pro Leu Gly Gln Ser Gln Pro Thr Val Ala Gly Gln Pro Ser Ala

450 455 460

cgc cca gca gca gag gaa tat ggc tac atc gtc act gat cag aag ccc 1440

Arg Pro Ala Ala Glu Glu Tyr Gly Tyr Ile Val Thr Asp Gln Lys Pro

465 470 475 480

ctg agc ctg gct gca gga gtg aag ctg ctg gag atc ctg gct gag cat 1488

Leu Ser Leu Ala Ala Gly Val Lys Leu Leu Glu Ile Leu Ala Glu His

485 490 495

gtg cac atg tcc tca ggc agc ttc atc aac atc agt gtg gtg gga cca 1536

Val His Met Ser Ser Gly Ser Phe Ile Asn Ile Ser Val Val Gly Pro

500 505 510

gcc ctc acc ttc cgc atc cgg cac aat gag cag aac ctg tct ttg gct 1584

Ala Leu Thr Phe Arg Ile Arg His Asn Glu Gln Asn Leu Ser Leu Ala

515 520 525

gat gtg acc caa caa gca ggg ctg gtg aag tct gaa ctg gaa gca cag 1632

Asp Val Thr Gln Gln Ala Gly Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Ala Gln

530 535 540

aca ggg ctc caa atc ttg cag aca gga gtg gga cag agg gag gag gca 1680

Thr Gly Leu Gln Ile Leu Gln Thr Gly Val Gly Gln Arg Glu Glu Ala

545 550 555 560

gct gca gtc ctt ccc caa act gcg cac agc acc tca ccc atg cgc tca 1728

Ala Ala Val Leu Pro Gln Thr Ala His Ser Thr Ser Pro Met Arg Ser

565 570 575

gtg ctg ctc act ctg gtg gcc ctg gca ggt gtg gct ggg ctg ctg gtg 1776

Val Leu Leu Thr Leu Val Ala Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu Leu Val

580 585 590

gct ctg gct gtg gct ctg tgt gtg cgg cag cat gcg cgg cag caa gac 1824

Ala Leu Ala Val Ala Leu Cys Val Arg Gln His Ala Arg Gln Gln Asp

595 600 605

aag gag cgc ctg gca gcc ctg ggg cct gag ggg gcc cat ggt gac act 1872

Lys Glu Arg Leu Ala Ala Leu Gly Pro Glu Gly Ala His Gly Asp Thr

610 615 620

acc ttt gag tac cag gac ctg tgc cgc cag cac atg gcc acg aag tcc 1920

Thr Phe Glu Tyr Gln Asp Leu Cys Arg Gln His Met Ala Thr Lys Ser

625 630 635 640

ttg ttc aac cgg gca gag ggt cca ccg gag cct tca cgg gtg agc agt 1968

Leu Phe Asn Arg Ala Glu Gly Pro Pro Glu Pro Ser Arg Val Ser Ser

645 650 655

gtg tcc tcc cag ttc agc gac gca gcc cag gcc agc ccc agc tcc cac 2016

Val Ser Ser Gln Phe Ser Asp Ala Ala Gln Ala Ser Pro Ser Ser His

660 665 670

agc agc acc ccg tcc tgg tgc gag gag ccg gcc caa gcc aac atg gac 2064

Ser Ser Thr Pro Ser Trp Cys Glu Glu Pro Ala Gln Ala Asn Met Asp

675 680 685

atc tcc acg gga cac atg att ctg gca tac atg gag gat cac ctg cgg 2112

Ile Ser Thr Gly His Met Ile Leu Ala Tyr Met Glu Asp His Leu Arg

690 695 700

aac cgg gac cgc ctt gcc aag gag tgg cag gcc ctc tgt gcc tac caa 2160

Asn Arg Asp Arg Leu Ala Lys Glu Trp Gln Ala Leu Cys Ala Tyr Gln

705 710 715 720

gca gag cca aac acc tgt gcc acc gcg cag ggg gag ggc aac atc aaa 2208

Ala Glu Pro Asn Thr Cys Ala Thr Ala Gln Gly Glu Gly Asn Ile Lys

725 730 735

aag aac cgg cat cct gac ttc ctg ccc tat gac cat gcc cgc ata aaa 2256

Lys Asn Arg His Pro Asp Phe Leu Pro Tyr Asp His Ala Arg Ile Lys

740 745 750

ctg aag gtg gag agc agc cct tct cgg agc gat tac atc aac gcc agc 2304

Leu Lys Val Glu Ser Ser Pro Ser Arg Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser

755 760 765

ccc att att gag cat gac cct cgg atg cca gcc tac ata gcc acg cag 2352

Pro Ile Ile Glu His Asp Pro Arg Met Pro Ala Tyr Ile Ala Thr Gln

770 775 780

ggc ccg ctg tcc cat acc atc gca gac ttc tgg cag atg gtg tgg gag 2400

Gly Pro Leu Ser His Thr Ile Ala Asp Phe Trp Gln Met Val Trp Glu

785 790 795 800

agc ggc tgc acc gtc atc gtc atg ctg acc ccg ctg gtg gag gat ggt 2448

Ser Gly Cys Thr Val Ile Val Met Leu Thr Pro Leu Val Glu Asp Gly

805 810 815

gtc aag cag tgt gac cgc tac tgg cca gat gag ggt gcc tcc ctc tac 2496

Val Lys Gln Cys Asp Arg Tyr Trp Pro Asp Glu Gly Ala Ser Leu Tyr

820 825 830

cac gta tat gag gtg aac ctg gtg tcg gag cac atc tgg tgc gag gac 2544

His Val Tyr Glu Val Asn Leu Val Ser Glu His Ile Trp Cys Glu Asp

835 840 845

ttt ctg gtg cgg agc ttc tac ctg aag aac gtg cag acc cag gag acg 2592

Phe Leu Val Arg Ser Phe Tyr Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr

850 855 860

cgc acg ctc acg cag ttc cac ttc ctc agc tgg ccg gca gag ggc aca 2640

Arg Thr Leu Thr Gln Phe His Phe Leu Ser Trp Pro Ala Glu Gly Thr

865 870 875 880

ccg gcc tcc acg cgg ccc ctg ctg gac ttc cgc agg aag gtg aac aag 2688

Pro Ala Ser Thr Arg Pro Leu Leu Asp Phe Arg Arg Lys Val Asn Lys

885 890 895

tgc tac cgg ggc cgc tcc tgc ccc atc atc gtg cac tgc agt gat ggt 2736

Cys Tyr Arg Gly Arg Ser Cys Pro Ile Ile Val His Cys Ser Asp Gly

900 905 910

gcg ggg agg acc ggc acc tac atc ctc atc gac atg gtc ctg aac cgc 2784

Ala Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Leu Ile Asp Met Val Leu Asn Arg

915 920 925

atg gca aaa gga gtg aag gag att gac atc gct gcc acc ctg gag cat 2832

Met Ala Lys Gly Val Lys Glu Ile Asp Ile Ala Ala Thr Leu Glu His

930 935 940

gtc cgt gac cag cgg cct ggc ctt gtc cgc tct aag gac cag ttt gaa 2880

Val Arg Asp Gln Arg Pro Gly Leu Val Arg Ser Lys Asp Gln Phe Glu

945 950 955 960

ttt gcc ctg aca gcc gtg gcg gag gaa gtg aat gcc atc ctc aag gcc 2928

Phe Ala Leu Thr Ala Val Ala Glu Glu Val Asn Ala Ile Leu Lys Ala

965 970 975

ctg ccc cag tga 2940

Leu Pro Gln

<210> 21

<211> 3801

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 21

aggtaggtcc cccgctccga cagggctctt acgccatatg tgacgcaaat tagcttacga 60

gccgggggtg gaggtgtcgt cagcacccgc ctgcggttgg ccgcgttgca gcgagagggg 120

catgtagacc ccgcctcgta gggaggtggg gagcggcaag ccccgcctca gcccctctgg 180

caggctcccg ccagcgtcgc tgcggctccg gcccgggagc gagcgcccgg agctcggaaa 240

gatgcggcgc ccgcggcggc ctgggggtct cgggggatcc gggggtctcc ggctgctcct 300

ctgcctcctg ctgctgagca gccgcccggg gggctgcagc gccgttagtg cccacggctg 360

tctatttgac cgcaggctct gctctcacct ggaagtctgt attcaggatg gcttgtttgg 420

gcagtgccag gtgggagtgg ggcaggcccg gccccttttg caagtcacct ccccagttct 480

ccaacgctta caaggtgtgc tccgacaact catgtcccaa ggattgtcct ggcacgatga 540

cctcacccag tatgtgatct ctcaggagat ggagcgcatc cccaggcttc gccccccaga 600

gccccgtcca agggacaggt ctggcttggc acccaagaga cctggtcctg ctggagagct 660

gcttttacag gacatcccca ctggctccgc ccctgctgcc cagcatcggc ttccacaacc 720

accagtgggc aaaggtggag ctggggccag ctcctctctg tcccctctgc aggctgagct 780

gctcccgcct ctcttggagc acctgctgct gcccccacag cctccccacc cttcactgag 840

ttacgaacct gccttgctgc agccctacct gttccaccag tttggctccc gtgatggctc 900

cagggtctca gagggctccc cagggatggt cagtgtcggc cccctgccca aggctgaagc 960

ccctgccctc ttcagcagaa ctgcctccaa gggcatattt ggggaccacc ctggccactc 1020

ctacggggac cttccagggc cttcacctgc ccagcttttt caagactctg ggctgctcta 1080

tctggcccag gagttgccag cacccagcag ggccagggtg ccaaggctgc cagagcaagg 1140

gagcagcagc cgggcagagg actccccaga gggctatgag aaggaaggac taggggatcg 1200

tggagagaag cctgcttccc cagctgtgca gccagatgcg gctctgcaga ggctggccgc 1260

tgtgctggcg ggctatgggg tagagctgcg tcagctgacc cctgagcagc tctccacact 1320

cctgaccctg ctgcagctac tgcccaaggg tgcaggaaga aatccgggag gggttgtaaa 1380

tgttggagct gatatcaaga aaacaatgga ggggccggtg gagggcagag acacagcaga 1440

gcttccagcc cgcacatccc ccatgcctgg acaccccact gccagcccta cctccagtga 1500

agtccagcag gtgccaagcc ctgtctcctc tgagcctccc aaagctgcca gaccccctgt 1560

gacacctgtc ctgctagaga agaaaagccc actgggccag agccagccca cggtggcagg 1620

acagccctca gcccgcccag cagcagagga atatggctac atcgtcactg atcagaagcc 1680

cctgagcctg gctgcaggag tgaagctgct ggagatcctg gctgagcatg tgcacatgtc 1740

ctcaggcagc ttcatcaaca tcagtgtggt gggaccagcc ctcaccttcc gcatccggca 1800

caatgagcag aacctgtctt tggctgatgt gacccaacaa gcagggctgg tgaagtctga 1860

actggaagca cagacagggc tccaaatctt gcagacagga gtgggacaga gggaggaggc 1920

agctgcagtc cttccccaaa ctgcgcacag cacctcaccc atgcgctcag tgctgctcac 1980

tctggtggcc ctggcaggtg tggctgggct gctggtggct ctggctgtgg ctctgtgtgt 2040

gcggcagcat gcgcggcagc aagacaagga gcgcctggca gccctggggc ctgagggggc 2100

ccatggtgac actacctttg agtaccagga cctgtgccgc cagcacatgg ccacgaagtc 2160

cttgttcaac cgggcagagg gtccaccgga gccttcacgg gtgagcagtg tgtcctccca 2220

gttcagcgac gcagcccagg ccagccccag ctcccacagc agcaccccgt cctggtgcga 2280

ggagccggcc caagccaaca tggacatctc cacgggacac atgattctgg catacatgga 2340

ggatcacctg cggaaccggg accgccttgc caaggagtgg caggccctct gtgcctacca 2400

agcagagcca aacacctgtg ccaccgcgca gggggagggc aacatcaaaa agaaccggca 2460

tcctgacttc ctgccctatg accatgcccg cataaaactg aaggtggaga gcagcccttc 2520

tcggagcgat tacatcaacg ccagccccat tattgagcat gaccctcgga tgccagccta 2580

catagccacg cagggcccgc tgtcccatac catcgcagac ttctggcaga tggtgtggga 2640

gagcggctgc accgtcatcg tcatgctgac cccgctggtg gaggatggtg tcaagcagtg 2700

tgaccgctac tggccagatg agggtgcctc cctctaccac gtatatgagg tgaacctggt 2760

gtcggagcac atctggtgcg aggactttct ggtgcggagc ttctacctga agaacgtgca 2820

gacccaggag acgcgcacgc tcacgcagtt ccacttcctc agctggccgg cagagggcac 2880

accggcctcc acgcggcccc tgctggactt ccgcaggaag gtgaacaagt gctaccgggg 2940

ccgctcctgc cccatcatcg tgcactgcag tgatggtgcg gggaggaccg gcacctacat 3000

cctcatcgac atggtcctga accgcatggc aaaaggagtg aaggagattg acatcgctgc 3060

caccctggag catgtccgtg accagcggcc tggccttgtc cgctctaagg accagtttga 3120

atttgccctg acagccgtgg cggaggaagt gaatgccatc ctcaaggccc tgccccagtg 3180

agaccctggg gccccttggc gggcagccca gcctctgtcc ctctttgcct gtgtgagcat 3240

ctctgtgtac ccactcctca ctgccccacc agccacctct tgggcatgct cagcccttcc 3300

tagaagagtc aggaagggaa agccagaagg ggcacgcctg cccagcctcg catgccagag 3360

cctggggcat cccagagccc agggcatccc atgggggtgc tgcagccagg aggagaggaa 3420

aggacatggg tagcaattct acccagagcc ttctcctgcc tacattccct ggcctggctc 3480

tcctgtagct ctcctggggt tctgggagtt ccctgaacat ctgtgtgtgt ccccctatgc 3540

tccagtatgg aagaatgggg tggagggtcg ccacacccgg ctccccctgc ttctcagccc 3600

cgggcctgcc tctgactcac acttgggcgc tctgccctcc ctggcctcac gcccagcctc 3660

ctcccaccac cctcccacca tgcgctgctc aacctctctc cttctggcgc aagagaacat 3720

ttctagaaaa aactactttt gtaccagtgt gaataaagtt agtgtgttgt ctgtgcagct 3780

gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3801

<210> 22

<211> 3712

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 22

aggtaggtcc cccgctccga cagggctctt acgccatatg tgacgcaaat tagcttacga 60

gccgggggtg gaggtgtcgt cagcacccgc ctgcggttgg ccgcgttgca gcgagagggg 120

catgtagacc ccgcctcgta gggaggtggg gagcggcaag ccccgcctca gcccctctgg 180

caggctcccg ccagcgtcgc tgcggctccg gcccgggagc gagcgcccgg agctcggaaa 240

gatgcggcgc ccgcggcggc ctgggggtct cgggggatcc gggggtctcc ggctgctcct 300

ctgcctcctg ctgctgagca gccgcccggg gggctgcagc gccgttagtg cccacggctg 360

tctatttgac cgcaggctct gctctcacct ggaagtctgt attcaggatg gcttgtttgg 420

gcagtgccag gtgggagtgg ggcaggcccg gccccttttg caagtcacct ccccagttct 480

ccaacgctta caaggtgtgc tccgacaact catgtcccaa ggattgtcct ggcacgatga 540

cctcacccag tatgtgatct ctcaggagat ggagcgcatc cccaggcttc gccccccaga 600

gccccgtcca agggacaggt ctggcttggc acccaagaga cctggtcctg ctggagagct 660

gcttttacag gacatcccca ctggctccgc ccctgctgcc cagcatcggc ttccacaacc 720

accagtgggc aaaggtggag ctggggccag ctcctctctg tcccctctgc aggctgagct 780

gctcccgcct ctcttggagc acctgctgct gcccccacag cctccccacc cttcactgag 840

ttacgaacct gccttgctgc agccctacct gttccaccag tttggctccc gtgatggctc 900

cagggtctca gagggctccc cagggatggt cagtgtcggc cccctgccca aggctgaagc 960

ccctgccctc ttcagcagaa ctgcctccaa gggcatattt ggggaccacc ctggccactc 1020

ctacggggac cttccagggc cttcacctgc ccagcttttt caagactctg ggctgctcta 1080

tctggcccag gagttgccag cacccagcag ggccagggtg ccaaggctgc cagagcaagg 1140

gagcagcagc cgggcagagg actccccaga gggctatgag aaggaaggac taggggatcg 1200

tggagagaag cctgcttccc cagctgtgca gccagatgcg gctctgcaga ggctggccgc 1260

tgtgctggcg ggctatgggg tagagctgcg tcagctgacc cctgagcagc tctccacact 1320

cctgaccctg ctgcagctac tgcccaaggg tgcaggaaga aatccgggag gggttgtaaa 1380

tgttggagct gatatcaaga aaacaatgga ggggccggtg gagggcagag acacagcaga 1440

gcttccagcc cgcacatccc ccatgcctgg acaccccact gccagcccta cctccagtga 1500

agtccagcag gtgccaagcc ctgtctcctc tgagcctccc aaagctgcca gaccccctgt 1560

gacacctgtc ctgctagaga agaaaagccc actgggccag agccagccca cggtggcagg 1620

acagccctca gcccgcccag cagcagagga atatggctac atcgtcactg atcagaatgt 1680

ggtgggacca gccctcacct tccgcatccg gcacaatgag cagaacctgt ctttggctga 1740

tgtgacccaa caagcagggc tggtgaagtc tgaactggaa gcacagacag ggctccaaat 1800

cttgcagaca ggagtgggac agagggagga ggcagctgca gtccttcccc aaactgcgca 1860

cagcacctca cccatgcgct cagtgctgct cactctggtg gccctggcag gtgtggctgg 1920

gctgctggtg gctctggctg tggctctgtg tgtgcggcag catgcgcggc agcaagacaa 1980

ggagcgcctg gcagccctgg ggcctgaggg ggcccatggt gacactacct ttgagtacca 2040

ggacctgtgc cgccagcaca tggccacgaa gtccttgttc aaccgggcag agggtccacc 2100

ggagccttca cgggtgagca gtgtgtcctc ccagttcagc gacgcagccc aggccagccc 2160

cagctcccac agcagcaccc cgtcctggtg cgaggagccg gcccaagcca acatggacat 2220

ctccacggga cacatgattc tggcatacat ggaggatcac ctgcggaacc gggaccgcct 2280

tgccaaggag tggcaggccc tctgtgccta ccaagcagag ccaaacacct gtgccaccgc 2340

gcagggggag ggcaacatca aaaagaaccg gcatcctgac ttcctgccct atgaccatgc 2400

ccgcataaaa ctgaaggtgg agagcagccc ttctcggagc gattacatca acgccagccc 2460

cattattgag catgaccctc ggatgccagc ctacatagcc acgcagggcc cgctgtccca 2520

taccatcgca gacttctggc agatggtgtg ggagagcggc tgcaccgtca tcgtcatgct 2580

gaccccgctg gtggaggatg gtgtcaagca gtgtgaccgc tactggccag atgagggtgc 2640

ctccctctac cacgtatatg aggtgaacct ggtgtcggag cacatctggt gcgaggactt 2700

tctggtgcgg agcttctacc tgaagaacgt gcagacccag gagacgcgca cgctcacgca 2760

gttccacttc ctcagctggc cggcagaggg cacaccggcc tccacgcggc ccctgctgga 2820

cttccgcagg aaggtgaaca agtgctaccg gggccgctcc tgccccatca tcgtgcactg 2880

cagtgatggt gcggggagga ccggcaccta catcctcatc gacatggtcc tgaaccgcat 2940

ggcaaaagga gtgaaggaga ttgacatcgc tgccaccctg gagcatgtcc gtgaccagcg 3000

gcctggcctt gtccgctcta aggaccagtt tgaatttgcc ctgacagccg tggcggagga 3060

agtgaatgcc atcctcaagg ccctgcccca gtgagaccct ggggcccctt ggcgggcagc 3120

ccagcctctg tccctctttg cctgtgtgag catctctgtg tacccactcc tcactgcccc 3180

accagccacc tcttgggcat gctcagccct tcctagaaga gtcaggaagg gaaagccaga 3240

aggggcacgc ctgcccagcc tcgcatgcca gagcctgggg catcccagag cccagggcat 3300

cccatggggg tgctgcagcc aggaggagag gaaaggacat gggtagcaat tctacccaga 3360

gccttctcct gcctacattc cctggcctgg ctctcctgta gctctcctgg ggttctggga 3420

gttccctgaa catctgtgtg tgtcccccta tgctccagta tggaagaatg gggtggaggg 3480

tcgccacacc cggctccccc tgcttctcag ccccgggcct gcctctgact cacacttggg 3540

cgctctgccc tccctggcct cacgcccagc ctcctcccac caccctccca ccatgcgctg 3600

ctcaacctct ctccttctgg cgcaagagaa catttctaga aaaaactact tttgtaccag 3660

tgtgaataaa gttagtgtgt tgtctgtgca gctgcaaaaa aaaaaaaaaa aa 3712

<210> 23

<211> 3570

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 23

aagagaattg ggctctgggg aaaattgcag gttcgggaga aggacacggg gtgcatgtgg 60

gcagagggac ttagagaccg gctgcgagac cacaggagaa gccacttgct ccgaggcgcc 120

tgggaggctg tctatttgac cgcaggctct gctctcacct ggaagtctgt attcaggatg 180

gcttgtttgg gcagtgccag gtgggagtgg ggcaggcccg gccccttttg caagtcacct 240

ccccagttct ccaacgctta caaggtgtgc tccgacaact catgtcccaa ggattgtcct 300

ggcacgatga cctcacccag tatgtgatct ctcaggagat ggagcgcatc cccaggcttc 360

gccccccaga gccccgtcca agggacaggt ctggcttggc acccaagaga cctggtcctg 420

ctggagagct gcttttacag gacatcccca ctggctccgc ccctgctgcc cagcatcggc 480

ttccacaacc accagtgggc aaaggtggag ctggggccag ctcctctctg tcccctctgc 540

aggctgagct gctcccgcct ctcttggagc acctgctgct gcccccacag cctccccacc 600

cttcactgag ttacgaacct gccttgctgc agccctacct gttccaccag tttggctccc 660

gtgatggctc cagggtctca gagggctccc cagggatggt cagtgtcggc cccctgccca 720

aggctgaagc ccctgccctc ttcagcagaa ctgcctccaa gggcatattt ggggaccacc 780

ctggccactc ctacggggac cttccagggc cttcacctgc ccagcttttt caagactctg 840

ggctgctcta tctggcccag gagttgccag cacccagcag ggccagggtg ccaaggctgc 900

cagagcaagg gagcagcagc cgggcagagg actccccaga gggctatgag aaggaaggac 960

taggggatcg tggagagaag cctgcttccc cagctgtgca gccagatgcg gctctgcaga 1020

ggctggccgc tgtgctggcg ggctatgggg tagagctgcg tcagctgacc cctgagcagc 1080

tctccacact cctgaccctg ctgcagctac tgcccaaggg tgcaggaaga aatccgggag 1140

gggttgtaaa tgttggagct gatatcaaga aaacaatgga ggggccggtg gagggcagag 1200

acacagcaga gcttccagcc cgcacatccc ccatgcctgg acaccccact gccagcccta 1260

cctccagtga agtccagcag gtgccaagcc ctgtctcctc tgagcctccc aaagctgcca 1320

gaccccctgt gacacctgtc ctgctagaga agaaaagccc actgggccag agccagccca 1380

cggtggcagg acagccctca gcccgcccag cagcagagga atatggctac atcgtcactg 1440

atcagaagcc cctgagcctg gctgcaggag tgaagctgct ggagatcctg gctgagcatg 1500

tgcacatgtc ctcaggcagc ttcatcaaca tcagtgtggt gggaccagcc ctcaccttcc 1560

gcatccggca caatgagcag aacctgtctt tggctgatgt gacccaacaa gcagggctgg 1620

tgaagtctga actggaagca cagacagggc tccaaatctt gcagacagga gtgggacaga 1680

gggaggaggc agctgcagtc cttccccaaa ctgcgcacag cacctcaccc atgcgctcag 1740

tgctgctcac tctggtggcc ctggcaggtg tggctgggct gctggtggct ctggctgtgg 1800

ctctgtgtgt gcggcagcat gcgcggcagc aagacaagga gcgcctggca gccctggggc 1860

ctgagggggc ccatggtgac actacctttg agtaccagga cctgtgccgc cagcacatgg 1920

ccacgaagtc cttgttcaac cgggcagagg gtccaccgga gccttcacgg gtgagcagtg 1980

tgtcctccca gttcagcgac gcagcccagg ccagccccag ctcccacagc agcaccccgt 2040

cctggtgcga ggagccggcc caagccaaca tggacatctc cacgggacac atgattctgg 2100

catacatgga ggatcacctg cggaaccggg accgccttgc caaggagtgg caggccctct 2160

gtgcctacca agcagagcca aacacctgtg ccaccgcgca gggggagggc aacatcaaaa 2220

agaaccggca tcctgacttc ctgccctatg accatgcccg cataaaactg aaggtggaga 2280

gcagcccttc tcggagcgat tacatcaacg ccagccccat tattgagcat gaccctcgga 2340

tgccagccta catagccacg cagggcccgc tgtcccatac catcgcagac ttctggcaga 2400

tggtgtggga gagcggctgc accgtcatcg tcatgctgac cccgctggtg gaggatggtg 2460

tcaagcagtg tgaccgctac tggccagatg agggtgcctc cctctaccac gtatatgagg 2520

tgaacctggt gtcggagcac atctggtgcg aggactttct ggtgcggagc ttctacctga 2580

agaacgtgca gacccaggag acgcgcacgc tcacgcagtt ccacttcctc agctggccgg 2640

cagagggcac accggcctcc acgcggcccc tgctggactt ccgcaggaag gtgaacaagt 2700

gctaccgggg ccgctcctgc cccatcatcg tgcactgcag tgatggtgcg gggaggaccg 2760

gcacctacat cctcatcgac atggtcctga accgcatggc aaaaggagtg aaggagattg 2820

acatcgctgc caccctggag catgtccgtg accagcggcc tggccttgtc cgctctaagg 2880

accagtttga atttgccctg acagccgtgg cggaggaagt gaatgccatc ctcaaggccc 2940

tgccccagtg agaccctggg gccccttggc gggcagccca gcctctgtcc ctctttgcct 3000

gtgtgagcat ctctgtgtac ccactcctca ctgccccacc agccacctct tgggcatgct 3060

cagcccttcc tagaagagtc aggaagggaa agccagaagg ggcacgcctg cccagcctcg 3120

catgccagag cctggggcat cccagagccc agggcatccc atgggggtgc tgcagccagg 3180

aggagaggaa aggacatggg tagcaattct acccagagcc ttctcctgcc tacattccct 3240

ggcctggctc tcctgtagct ctcctggggt tctgggagtt ccctgaacat ctgtgtgtgt 3300

ccccctatgc tccagtatgg aagaatgggg tggagggtcg ccacacccgg ctccccctgc 3360

ttctcagccc cgggcctgcc tctgactcac acttgggcgc tctgccctcc ctggcctcac 3420

gcccagcctc ctcccaccac cctcccacca tgcgctgctc aacctctctc cttctggcgc 3480

aagagaacat ttctagaaaa aactactttt gtaccagtgt gaataaagtt agtgtgttgt 3540

ctgtgcagct gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3570

<210> 24

<211> 355

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Met Asp Phe Leu His Arg Asn Gly Val Leu Ile Ile Gln His Leu Gln

1 5 10 15

Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr Tyr Thr Phe Leu Asn Phe Met Ser Asn Val

20 25 30

Gly Asp Pro Arg Asn Ile Phe Phe Ile Tyr Phe Pro Leu Cys Phe Gln

35 40 45

Phe Asn Gln Thr Val Gly Thr Lys Met Ile Trp Val Ala Val Ile Gly

50 55 60

Asp Trp Leu Asn Leu Ile Phe Lys Trp Ile Leu Phe Gly His Arg Pro

65 70 75 80

Tyr Trp Trp Val Gln Glu Thr Gln Ile Tyr Pro Asn His Ser Ser Pro

85 90 95

Cys Leu Glu Gln Phe Pro Thr Thr Cys Glu Thr Gly Pro Gly Ser Pro

100 105 110

Ser Gly His Ala Met Gly Ala Ser Cys Val Trp Tyr Val Met Val Thr

115 120 125

Ala Ala Leu Ser His Thr Val Cys Gly Met Asp Lys Phe Ser Ile Thr

130 135 140

Leu His Arg Leu Thr Trp Ser Phe Leu Trp Ser Val Phe Trp Leu Ile

145 150 155 160

Gln Ile Ser Val Cys Ile Ser Arg Val Phe Ile Ala Thr His Phe Pro

165 170 175

His Gln Val Ile Leu Gly Val Ile Gly Gly Met Leu Val Ala Glu Ala

180 185 190

Phe Glu His Thr Pro Gly Ile Gln Thr Ala Ser Leu Gly Thr Tyr Leu

195 200 205

Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Phe Ala Val Gly Phe Tyr Leu Leu

210 215 220

Leu Arg Val Leu Asn Ile Asp Leu Leu Trp Ser Val Pro Ile Ala Lys

225 230 235 240

Lys Trp Cys Ala Asn Pro Asp Trp Ile His Ile Asp Thr Thr Pro Phe

245 250 255

Ala Gly Leu Val Arg Asn Leu Gly Val Leu Phe Gly Leu Gly Phe Ala

260 265 270

Ile Asn Ser Glu Met Phe Leu Leu Ser Cys Arg Gly Gly Asn Asn Tyr

275 280 285

Thr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Cys Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ile Leu

290 295 300

Gln Leu Tyr His Phe Leu Gln Ile Pro Thr His Glu Glu His Leu Phe

305 310 315 320

Tyr Val Leu Ser Phe Cys Lys Ser Ala Ser Ile Pro Leu Thr Val Val

325 330 335

Ala Phe Ile Pro Tyr Ser Val His Met Leu Met Lys Gln Ser Gly Lys

340 345 350

Lys Ser Gln

355

<210> 25

<211> 1068

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(1065)

<400> 25

atg gat ttc ctt cac agg aat gga gtg ctc ata att cag cat ttg cag 48

Met Asp Phe Leu His Arg Asn Gly Val Leu Ile Ile Gln His Leu Gln

1 5 10 15

aag gac tac cga gct tac tac act ttt cta aat ttt atg tcc aat gtt 96

Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr Tyr Thr Phe Leu Asn Phe Met Ser Asn Val

20 25 30

gga gac ccc agg aat atc ttt ttc att tat ttt cca ctt tgt ttt caa 144

Gly Asp Pro Arg Asn Ile Phe Phe Ile Tyr Phe Pro Leu Cys Phe Gln

35 40 45

ttt aat cag aca gtt gga acc aag atg ata tgg gta gca gtc att ggg 192

Phe Asn Gln Thr Val Gly Thr Lys Met Ile Trp Val Ala Val Ile Gly

50 55 60

gat tgg tta aat ctt ata ttt aaa tgg ata tta ttt ggt cat cga cct 240

Asp Trp Leu Asn Leu Ile Phe Lys Trp Ile Leu Phe Gly His Arg Pro

65 70 75 80

tac tgg tgg gtc caa gaa act cag att tac cca aat cac tca agt cca 288

Tyr Trp Trp Val Gln Glu Thr Gln Ile Tyr Pro Asn His Ser Ser Pro

85 90 95

tgc ctt gaa cag ttc cct act aca tgt gaa aca ggt cca gga agt cca 336

Cys Leu Glu Gln Phe Pro Thr Thr Cys Glu Thr Gly Pro Gly Ser Pro

100 105 110

tct ggc cat gca atg ggc gca tcc tgt gtc tgg tat gtc atg gta acc 384

Ser Gly His Ala Met Gly Ala Ser Cys Val Trp Tyr Val Met Val Thr

115 120 125

gct gcc ctg agc cac act gtc tgt ggg atg gat aag ttc tct atc act 432

Ala Ala Leu Ser His Thr Val Cys Gly Met Asp Lys Phe Ser Ile Thr

130 135 140

ctg cac aga ctg acc tgg tca ttt ctt tgg agt gtt ttt tgg ttg att 480

Leu His Arg Leu Thr Trp Ser Phe Leu Trp Ser Val Phe Trp Leu Ile

145 150 155 160

caa atc agt gtc tgc atc tcc aga gta ttc ata gca aca cat ttt cct 528

Gln Ile Ser Val Cys Ile Ser Arg Val Phe Ile Ala Thr His Phe Pro

165 170 175

cat caa gtt att ctt gga gta att ggt ggc atg ctg gtg gca gag gcc 576

His Gln Val Ile Leu Gly Val Ile Gly Gly Met Leu Val Ala Glu Ala

180 185 190

ttt gaa cac act cca ggc atc caa acg gcc agt ctg ggc aca tac ctg 624

Phe Glu His Thr Pro Gly Ile Gln Thr Ala Ser Leu Gly Thr Tyr Leu

195 200 205

aag acc aac ctc ttt ctc ttc ctg ttt gca gtt ggc ttt tac ctg ctt 672

Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Phe Ala Val Gly Phe Tyr Leu Leu

210 215 220

ctt agg gtg ctc aac att gac ctg ctg tgg tcc gtg ccc ata gcc aaa 720

Leu Arg Val Leu Asn Ile Asp Leu Leu Trp Ser Val Pro Ile Ala Lys

225 230 235 240

aag tgg tgt gct aac ccc gac tgg atc cac att gac acc acg cct ttt 768

Lys Trp Cys Ala Asn Pro Asp Trp Ile His Ile Asp Thr Thr Pro Phe

245 250 255

gct gga ctc gtg aga aac ctt ggg gtc ctc ttt ggc ttg ggc ttt gca 816

Ala Gly Leu Val Arg Asn Leu Gly Val Leu Phe Gly Leu Gly Phe Ala

260 265 270

atc aac tca gag atg ttc ctc ctg agc tgc cga ggg gga aat aac tac 864

Ile Asn Ser Glu Met Phe Leu Leu Ser Cys Arg Gly Gly Asn Asn Tyr

275 280 285

aca ctg agc ttc cgg ttg ctc tgt gcc ttg acc tca ttg aca ata ctg 912

Thr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Cys Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ile Leu

290 295 300

cag ctc tac cat ttc ctc cag atc ccg act cac gaa gag cat tta ttt 960

Gln Leu Tyr His Phe Leu Gln Ile Pro Thr His Glu Glu His Leu Phe

305 310 315 320

tat gtg ctg tct ttt tgt aaa agt gca tcc att ccc cta act gtg gtt 1008

Tyr Val Leu Ser Phe Cys Lys Ser Ala Ser Ile Pro Leu Thr Val Val

325 330 335

gct ttc att ccc tac tct gtt cat atg tta atg aaa caa agc gga aag 1056

Ala Phe Ile Pro Tyr Ser Val His Met Leu Met Lys Gln Ser Gly Lys

340 345 350

aag agt cag taa 1068

Lys Ser Gln

355

<210> 26

<211> 3096

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 26

tcgacatgcc acaaaggcac agtataaaaa cggtgggaat cagagcactt cagctccaat 60

tgctctatgt ttagaattgc ctctttttca agatggattt ccttcacagg aatggagtgc 120

tcataattca gcatttgcag aaggactacc gagcttacta cacttttcta aattttatgt 180

ccaatgttgg agaccccagg aatatctttt tcatttattt tccactttgt tttcaattta 240

atcagacagt tggaaccaag atgatatggg tagcagtcat tggggattgg ttaaatctta 300

tatttaaatg gatattattt ggtcatcgac cttactggtg ggtccaagaa actcagattt 360

acccaaatca ctcaagtcca tgccttgaac agttccctac tacatgtgaa acaggtccag 420

gaagtccatc tggccatgca atgggcgcat cctgtgtctg gtatgtcatg gtaaccgctg 480

ccctgagcca cactgtctgt gggatggata agttctctat cactctgcac agactgacct 540

ggtcatttct ttggagtgtt ttttggttga ttcaaatcag tgtctgcatc tccagagtat 600

tcatagcaac acattttcct catcaagtta ttcttggagt aattggtggc atgctggtgg 660

cagaggcctt tgaacacact ccaggcatcc aaacggccag tctgggcaca tacctgaaga 720

ccaacctctt tctcttcctg tttgcagttg gcttttacct gcttcttagg gtgctcaaca 780

ttgacctgct gtggtccgtg cccatagcca aaaagtggtg tgctaacccc gactggatcc 840

acattgacac cacgcctttt gctggactcg tgagaaacct tggggtcctc tttggcttgg 900

gctttgcaat caactcagag atgttcctcc tgagctgccg agggggaaat aactacacac 960

tgagcttccg gttgctctgt gccttgacct cattgacaat actgcagctc taccatttcc 1020

tccagatccc gactcacgaa gagcatttat tttatgtgct gtctttttgt aaaagtgcat 1080

ccattcccct aactgtggtt gctttcattc cctactctgt tcatatgtta atgaaacaaa 1140

gcggaaagaa gagtcagtag agtggtgcct agagttagtg ctctgtgtca cagatcaccc 1200

ttctccatcc accagtagag ccacagagta ggcacagacc agaggcttct aatccgactt 1260

cacagaatag cggcacaggc cccattcccc atagagatgt ttagtttggc cttcgcactg 1320

gtcttttttt ttaatccttc agttaccaat atttagatac aagaatattt gacataaaaa 1380

tcggaagttc tgtatttctt gaaaaatctg atagtatgac aacacagagc ctgcatcccc 1440

agctggagac aactgaccag agctgcatac taacagtccc cagtaggagg caaggactcc 1500

attttctcac agtcttcagc atcccagcag gagccccact atgattcctt tatcttctta 1560

aggccaggct gcatctgatt cctgttgaca ttttagtggg gaccacagcc atatccagtt 1620

tcagttttca gatgaggaaa tggaagccta tttaggtaaa agaacttgcc tggagtcacg 1680

ccaccttcag agcaggaatt agaacccaag gcttctgaca catatcccca ttacactgtg 1740

tgtttgagtg tgcacacatg cacatgcttt ttgtttgtat gtttcctttt tagaaccagg 1800

gacttgctct gttgcccagg ctggagtgca gtggtggata gcggctcact gcagcctcaa 1860

actcctggct caaatgatcc tccctcctca gcctcccatt agctaagact acaggtgtgc 1920

accaccatgc ctggctaatt tttgaatatt ttttagagcc agcttcttac tatatttgcc 1980

caggctggtc ttgaactcct ggcctcaagg agttcccttg aggatgttcc acccatgtca 2040

gcctcccaca gtgctgggat tgcaggcttg agccattgta ttaatagttg gcctacactg 2100

tcttttgttt cttcatttac aagaggtaaa aatcagtaag aatgaatgct ttcatttaga 2160

ttctatgatg actgccatat aaatcagcta ccttttcaga aatgacattg aaatactgca 2220

tcctctttga cttatacccc acacatacat gcagggtcta ggtgggacca acagtggctc 2280

cagatgtata tacacacggg tccagggaca acagaacagg ccaggctaca gtatggactt 2340

gaacctctgc ttcacttctg gtctctgttt tacagtagtg ctcaccaata tttcaataaa 2400

ttctactgaa cttactctaa tagaacatta ttcaaccccc aaagacttat ctcttcacta 2460

tgacatctcc atactttatt tttaggagac agactttcaa aaccagagaa atcaggtgcc 2520

ttcctcaagg tcatgctcca acccaggcca actattaaat gcttgcatct gttagctgga 2580

ttagtctcta tgtatactga actgtgatga aaatctatag ctttgtttta gaaaattatt 2640

gttgatggac tattaatatt atattaacaa tttctcagta agtgtgtttt ttcctcattg 2700

aatctaggaa tgctgggctt taagttgata actgtgtcat ttcaatcaag tacaaggatt 2760

ttgaggcaga ttttgctaga tatcttagta atcccccaca atgttttatg taactcttct 2820

cagaatatca atacattaat tattttagat gacatattaa ataatctatg aatattaatg 2880

aaaacaatac agttgaagtg agtgttgttt aacatgatag tagctgagga taacaaacct 2940

caaaaaatca aagtattaat tactcctttc caagtatatg tatagagcat gtgtcattgc 3000

ttttataaaa cgcacttaat agctttcttt ctaaaaggca actgaacttt ctaaaaggta 3060

aataaactga acttgatatt aaaaaaaaaa aaaaaa 3096

<210> 27

<211> 2980

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 27

tcgacatgcc acaaaggcac agtataaaaa cggtgggaat cagagcactt cagctccaat 60

tgctctatgt ttagaattgc ctctttttca agatggattt ccttcacagg aatggagtgc 120

tcataattca gcatttgcag aaggactacc gagcttacta cacttttcta aattttatgt 180

ccaatgttgg agaccccagg aatatctttt tcatttattt tccactttgt tttcaattta 240

atcagacagt tggaaccaag atgatatggg tagcagtcat tggggattgg ttaaatctta 300

tatttaaatg gatattattt ggtcatcgac cttactggtg ggtccaagaa actcagattt 360

acccaaatca ctcaagtcca tgccttgaac agttccctac tacatgtgaa acaggtccag 420

gaagtccatc tggccatgca atgggcgcat cctgtgtctg gtatgtcatg gtaaccgctg 480

ccctgagcca cactgtctgt gggatggata agttctctat cactctgcac aggcatgctg 540

gtggcagagg cctttgaaca cactccaggc atccaaacgg ccagtctggg cacatacctg 600

aagaccaacc tctttctctt cctgtttgca gttggctttt acctgcttct tagggtgctc 660

aacattgacc tgctgtggtc cgtgcccata gccaaaaagt ggtgtgctaa ccccgactgg 720

atccacattg acaccacgcc ttttgctgga ctcgtgagaa accttggggt cctctttggc 780

ttgggctttg caatcaactc agagatgttc ctcctgagct gccgaggggg aaataactac 840

acactgagct tccggttgct ctgtgccttg acctcattga caatactgca gctctaccat 900

ttcctccaga tcccgactca cgaagagcat ttattttatg tgctgtcttt ttgtaaaagt 960

gcatccattc ccctaactgt ggttgctttc attccctact ctgttcatat gttaatgaaa 1020

caaagcggaa agaagagtca gtagagtggt gcctagagtt agtgctctgt gtcacagatc 1080

acccttctcc atccaccagt agagccacag agtaggcaca gaccagaggc ttctaatccg 1140

acttcacaga atagcggcac aggccccatt ccccatagag atgtttagtt tggccttcgc 1200

actggtcttt ttttttaatc cttcagttac caatatttag atacaagaat atttgacata 1260

aaaatcggaa gttctgtatt tcttgaaaaa tctgatagta tgacaacaca gagcctgcat 1320

ccccagctgg agacaactga ccagagctgc atactaacag tccccagtag gaggcaagga 1380

ctccattttc tcacagtctt cagcatccca gcaggagccc cactatgatt cctttatctt 1440

cttaaggcca ggctgcatct gattcctgtt gacattttag tggggaccac agccatatcc 1500

agtttcagtt ttcagatgag gaaatggaag cctatttagg taaaagaact tgcctggagt 1560

cacgccacct tcagagcagg aattagaacc caaggcttct gacacatatc cccattacac 1620

tgtgtgtttg agtgtgcaca catgcacatg ctttttgttt gtatgtttcc tttttagaac 1680

cagggacttg ctctgttgcc caggctggag tgcagtggtg gatagcggct cactgcagcc 1740

tcaaactcct ggctcaaatg atcctccctc ctcagcctcc cattagctaa gactacaggt 1800

gtgcaccacc atgcctggct aatttttgaa tattttttag agccagcttc ttactatatt 1860

tgcccaggct ggtcttgaac tcctggcctc aaggagttcc cttgaggatg ttccacccat 1920

gtcagcctcc cacagtgctg ggattgcagg cttgagccat tgtattaata gttggcctac 1980

actgtctttt gtttcttcat ttacaagagg taaaaatcag taagaatgaa tgctttcatt 2040

tagattctat gatgactgcc atataaatca gctacctttt cagaaatgac attgaaatac 2100

tgcatcctct ttgacttata ccccacacat acatgcaggg tctaggtggg accaacagtg 2160

gctccagatg tatatacaca cgggtccagg gacaacagaa caggccaggc tacagtatgg 2220

acttgaacct ctgcttcact tctggtctct gttttacagt agtgctcacc aatatttcaa 2280

taaattctac tgaacttact ctaatagaac attattcaac ccccaaagac ttatctcttc 2340

actatgacat ctccatactt tatttttagg agacagactt tcaaaaccag agaaatcagg 2400

tgccttcctc aaggtcatgc tccaacccag gccaactatt aaatgcttgc atctgttagc 2460

tggattagtc tctatgtata ctgaactgtg atgaaaatct atagctttgt tttagaaaat 2520

tattgttgat ggactattaa tattatatta acaatttctc agtaagtgtg ttttttcctc 2580

attgaatcta ggaatgctgg gctttaagtt gataactgtg tcatttcaat caagtacaag 2640

gattttgagg cagattttgc tagatatctt agtaatcccc cacaatgttt tatgtaactc 2700

ttctcagaat atcaatacat taattatttt agatgacata ttaaataatc tatgaatatt 2760

aatgaaaaca atacagttga agtgagtgtt gtttaacatg atagtagctg aggataacaa 2820

acctcaaaaa atcaaagtat taattactcc tttccaagta tatgtataga gcatgtgtca 2880

ttgcttttat aaaacgcact taatagcttt ctttctaaaa ggcaactgaa ctttctaaaa 2940

ggtaaataaa ctgaacttga tattaaaaaa aaaaaaaaaa 2980

<210> 28

<211> 4092

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 28

atagcagagc aatcaccacc aagcctggaa taactgcaag ggctctgctg acatcttcct 60

gaggtgccaa ggaaatgagg atggaggaag gaatgaatgt tctccatgac tttgggatcc 120

agtcaacaca ttacctccag gtgaattacc aagactccca ggactggttc atcttggtgt 180

ccgtgatcgc agacctcagg aatgccttct acgtcctctt ccccatctgg ttccatcttc 240

aggaagctgt gggcattaaa ctcctttggg tagctgtgat tggagactgg ctcaacctcg 300

tctttaagtg gattctcttt ggacagcgtc catactggtg ggttttggat actgactact 360

acagcaacac ttccgtgccc ctgataaagc agttccctgt aacctgtgag actggaccag 420

ggaaagataa agccgaccta cagatttcgg tgcttgaatg tcattttgtg gttgggattc 480

tgggctgtgc agctgaatgt ctgtctgtca cgaatctacc ttgctgctca ttttcctcat 540

caagttgttg ctggagtcct gtcaggcatt gctgttgcag aaactttcag ccacatccac 600

agcatctata atgccagcct caagaaatat tttctcatta ccttcttcct gttcagcttc 660

gccatcggat tttatctgct gctcaaggga ctgggtgtag acctcctgtg gactctggag 720

aaagcccaga ggtggtgcga gcagccagaa tgggtccaca ttgacaccac accctttgcc 780

agcctcctca agaacctggg cacgctcttt ggcctggggc tggctctcaa ctccagcatg 840

tacagggaga gctgcaaggg gaaactcagc aagtggctcc cattccgcct cagctctatt 900

gtagcctccc tcgtcctcct gcacgtcttt gactccttga aacccccatc ccaagtcgag 960

ctggtcttct acgtcttgtc cttctgcaag agtgcggtag tgcccctggc atccgtcagt 1020

gtcatcccct actgcctcgc ccaggtcctg ggccagccgc acaagaagtc gttgtaagag 1080

atgtggagtc ttcggtgttt aaagtcaaca accatgccag ggattgagga ggactactat 1140

ttgaagcaat gggcactggt atttggagca agtgacatgc catccattct gccgtcgtgg 1200

aattaaatca cggatggcag attggagggt cgcctggctt attcccatgt gtgactccag 1260

cctgccctca gcacagactc tttcagatgg aggtgccata tcacgtacac catatgcaag 1320

tttcccgcca ggaggtcctc ctctctctac ttgaatactc tcacaagtag ggagctcact 1380

cccactggaa cagcccattt tatctttgaa tggtcttctg ccagcccatt ttgaggccag 1440

aggtgctgtc agctcaggtg gtcctctttt acaatcctaa tcatattggg taatgttttt 1500

gaaaagctaa tgaagctatt gagaaagacc tgttgctaga agttgggttg ttctggattt 1560

tcccctgaag acttacttat tcttccgtca catatacaaa agcaagactt ccaggtaggg 1620

ccagctcaca agcccaggct ggagatccta actgagaatt ttctacctgt gttcattctt 1680

accgagaaaa ggagaaagga gctctgaatc tgataggaaa agaaggctgc ctaaggagga 1740

gtttttagta tgtggcgtat catgcaagtg ctatgccaag ccatgtctaa atggctttaa 1800

ttatatagta atgcactctc agtaatgggg gaccagctta agtataatta atagatggtt 1860

agtggggtaa ttctgcttct agtatttttt ttactgtgca tacatgttca tcgtatttcc 1920

ttggatttct gaatggctgc agtgacccag atattgcact aggtcaaaac attcaggtat 1980

agctgacatc tcctctatca cattacatca tcctccttat aagcccagct ctgctttttc 2040

cagattcttc cactggctcc acatccaccc cactggatct tcagaaggct agagggcgac 2100

tctggtggtg cttttgtatg tttcaattag gctctgaaat cttgggcaaa atgacaaggg 2160

gagggccagg attcctctct caggtcactc cagtgttact tttaattcct agagggtaaa 2220

tatgactcct ttctctatcc caagccaacc aagagcacat tcttaaagga aaagtcaaca 2280

tcttctctct tttttttttt ttttgagaca gggtctcact atgttgccca ggctgctctt 2340

gaattcctgg gctcaagcag tcctcccacc ctaccacagc gtcccgcgta gctgggacta 2400

caggtgcaag ccactatgtc cagctagcca actcctcctt gcctgctttt cttttttttt 2460

ctttttttga gacggcgcac ctatcaccca ggctggagtg gagtggcacg atcttggctc 2520

actgcaacct cttcctcctg gttcaagcga ttctcatgtc tcagcctcct cagtagctag 2580

gactaccggc gtgcaccacc atgccaggct aatttttata tttttagaat tttagaagag 2640

atgggatttc atcatgttgg ccaggctggt ctcgaactcc tgacctcaag tgatccacct 2700

gccttggcct cccaaggtgc taggattaca ggcatgagcc accgcaccgg gccctccttg 2760

cctgtttttc aatctcatct gatatgcaga gtatttctgc cccacccacc taccccccaa 2820

aaaaagctga agcctattta tttgaaagtc cttgtttttg ctactaatta tatagtatac 2880

catacattat cattcaaaac aaccatcctg ctcataacat ctttgaaaag aaaaatatat 2940

atgtgcagta ttttattaaa gcaacatttt atttaagaat aaagtcttgt taattactat 3000

attttagatg caatgtgatc tgaagtttct aattctggcc caactaaatt tctagctctg 3060

tttccctaaa caaataattt ggtttctctg tgcctgcatt ttccctttgg agaagaaaag 3120

tgctctctct tgagttgacc gagagtccca ttagggatag ggagacttaa atgcatccac 3180

aggggcacag gcagagttga gcacataaac ggaggcccaa aatcagcata gaaccagaaa 3240

gattcagagt tggccaagaa tgaacattgg ctaccagacc acaagtcagc atgagttgct 3300

ctatggcatc aaattgcaac ttgagagtag atgggcaggg tcactatcaa attaagcaat 3360

cagggcacac aagttgcagt aacacaacaa gactaggcca gctctggaat ccagtaactc 3420

agtgtcagca aggttttggg ttatagttca agaaagtcta aacagagcca gtcacagcac 3480

caaggaatgc tcaagggagc tattgcaggt ttctctgcta agagatttat ttcatcctgg 3540

gtgcagggtt cgacctccaa aggcctcaaa tcatcaccgt atcaatggat ttcctgaggg 3600

taagctccgc tatttcacac ctgaactccg gagtctgtat attcagggaa gattgcattc 3660

tcctactgga tttgggctct cagagggcgt tgtgggaacc aggcccctca cagaatcaaa 3720

tggtcccaac cagggagaaa gaaaatagtc tttttttttt ttttaataga gatgggggtc 3780

tcactatgct gcccaggctg gtcttgaact cctgggttca agtgatcctc ctgcctcagc 3840

ctcccaaagt gctgggatta cagtgtgagc cactgcgctt ggccagaaat ggttttgatc 3900

tgtctgaact gaaccctact gcttaggcat agccccatcc ttgataatct atttgctccc 3960

aaggaccaag tccaagatcc ttacaagaaa ggtctgccag aaagtaaata ctgcccccac 4020

tccctgaagt ttatgaggtt gataagaaaa cataacagat aaagtttatt gagtgctaac 4080

tttaaaaaaa aa 4092

<210> 29

<211> 369

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 29

Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys

1 5 10 15

Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val

20 25 30

Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly

35 40 45

Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala

50 55 60

Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile

65 70 75 80

Cys Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly

85 90 95

Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr

100 105 110

Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro

115 120 125

Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala

130 135 140

Leu Leu Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr

145 150 155 160

Leu Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr

165 170 175

Val Met Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu

180 185 190

Thr Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val

195 200 205

Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp

210 215 220

Leu Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe

225 230 235 240

Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser

245 250 255

Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile

260 265 270

Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys

275 280 285

Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His

290 295 300

Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala

305 310 315 320

Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys

325 330 335

Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu

340 345 350

Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys

355 360 365

Asp

<210> 30

<211> 1110

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(1107)

<400> 30

atg gag ttt ctt gaa aga acg tat ctt gtg aat gat aaa gct gcc aag 48

Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys

1 5 10 15

atg tat gct ttc aca cta gaa agt gtg gaa ctc caa cag aaa ccg gtg 96

Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val

20 25 30

aat aaa gat cag tgt ccc aga gag aga cca gag gag ctg gag tca gga 144

Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly

35 40 45

ggc atg tac cac tgc cac agt ggc tcc aag ccc aca gaa aag ggg gcg 192

Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala

50 55 60

aat gag tac gcc tat gcc aag tgg aaa ctc tgt tct gct tca gca ata 240

Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile

65 70 75 80

tgc ttc att ttc atg att gca gag gtc gtg ggt ggg cac att gct ggg 288

Cys Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly

85 90 95

agt ctt gct gtt gtc aca gat gct gcc cac ctc tta att gac ctg acc 336

Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr

100 105 110

agt ttc ctg ctc agt ctc ttc tcc ctg tgg ttg tca tcg aag cct ccc 384

Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro

115 120 125

tct aag cgg ctg aca ttt gga tgg cac cga gca gag atc ctt ggt gcc 432

Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala

130 135 140

ctg ctc tcc atc ctg tgc atc tgg gtg gtg act ggc gtg cta gtg tac 480

Leu Leu Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr

145 150 155 160

ctg gca tgt gag cgc ctg ctg tat cct gat tac cag atc cag gcg act 528

Leu Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr

165 170 175

gtg atg atc atc gtt tcc agc tgc gca gtg gcg gcc aac att gta cta 576

Val Met Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu

180 185 190

act gtg gtt ttg cac cag aga tgc ctt ggc cac aat cac aag gaa gta 624

Thr Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val

195 200 205

caa gcc aat gcc agc gtc aga gct gct ttt gtg cat gcc ctt gga gat 672

Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp

210 215 220

cta ttt cag agt atc agt gtg cta att agt gca ctt att atc tac ttt 720

Leu Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe

225 230 235 240

aag cca gag tat aaa ata gcc gac cca atc tgc aca ttc atc ttt tcc 768

Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser

245 250 255

atc ctg gtc ttg gcc agc acc atc act atc tta aag gac ttc tcc atc 816

Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile

260 265 270

tta ctc atg gaa ggt gtg cca aag agc ctg aat tac agt ggt gtg aaa 864

Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys

275 280 285

gag ctt att tta gca gtc gac ggg gtg ctg tct gtg cac agc ctg cac 912

Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His

290 295 300

atc tgg tct cta aca atg aat caa gta att ctc tca gct cat gtt gct 960

Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala

305 310 315 320

aca gca gcc agc cgg gac agc caa gtg gtt cgg aga gaa att gct aaa 1008

Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys

325 330 335

gcc ctt agc aaa agc ttt acg atg cac tca ctc acc att cag atg gaa 1056

Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu

340 345 350

tct cca gtt gac cag gac ccc gac tgc ctt ttc tgt gaa gac ccc tgt 1104

Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys

355 360 365

gac taa 1110

Asp

<210> 31

<211> 1955

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 31

ctcggcctcg cgttataaaa agcggtgggg cagggccggc gagacaatct gggaggcggg 60

taccgggcct cacggatccg cgccgcgccc cccacctgtg gctgcgcgcg gggtgggctg 120

cgctcccctg ggcggcgccg ggcgcccggg gctggtggcg agatgggccg ctactctggc 180

aagacgtgcc ggctgctctt catgctggtg ctcaccgtcg ccttcttcgt ggcggagctg 240

gtctccggct acctgggcaa ctccatcgcg ctgctctccg actccttcaa catgttctcc 300

gacctgatct cgctgtgcgt gggcctgagc gccggctaca tcgcccggcg ccccacccgg 360

ggcttcagcg ccacctacgg ctacgcccgc gccgaggtgg tgggcgcgct gagcaacgcg 420

gtcttcctca ccgcgctctg cttcaccatc ttcgtggagg ccgtgctgcg cctggcccgg 480

cccgagcgca tcgatgaccc cgagctggtg ctcatcgtcg gcgtcctggg gctgttggtc 540

aacgtggtgg ggctgctcat cttccaggac tgcgccgcct ggttcgcgtg ctgcctccgg 600

ggacgcagtc gccgcctgca gcagcggcag cagctggcgg agggctgtgt ccccggcgct 660

ttcggggggc ctcagggcgc ggaggacccg cggcgcgcgg cggacccgac agccccaggc 720

tcggactcgg ccgtaaccct ccgggggacc tcggtggaaa ggaagcggga gaagggggcg 780

accgtgttcg caaacgtagc aggtgattcc ttcaacaccc agaatgagcc agaagacatg 840

atgaaaaaag agaaaaagtc tgaagctctg aatatcagag gtgtactttt gcatgtgatg 900

ggagatgccc tggggtccgt ggttgtggtc atcacggcca tcatattcta tgtgcttccc 960

ctgaagagtg aggacccgtg taactggcag tgttacattg accccagcct gactgtcctc 1020

atggtcatca tcattttgtc atctgccttc ccgcttatca aggagaccgc tgccattctg 1080

ctacagatgg tcccaaaagg agtcaacatg gaagagctga tgagtaaact ctctgctgtg 1140

cctggaatta gcagtgtaca tgaagtgcac atctgggaac ttgtaagtgg aaagattatt 1200

gccaccctgc acatcaagta tcctaaggac aggggatatc aagatgccag cacaaaaatt 1260

cgagaaatct tccaccatgc gggaatccac aatgtgacca tccagtttga aaatgtggac 1320

ttgaaggaac ccctggagca gaaggactta ctgttgctct gcaactcacc ctgcatctcc 1380

aagggctgtg ctaagcagct gtgttgtccc cccggggcac tgcctctggc tcacgtcaat 1440

ggctgtgctg agcacttcct ctgtcacgtc aatggctgtg ctgagcacaa tggtgggccc 1500

tctctagaca catacggaag tgatggcctc agtagaagag acgcaagaga agtggctatt 1560

gaagtgtctt tggatagctg tctgagtgac cacggacaaa gtcttaacaa aactcaggag 1620

gaccaatgtt atgtcaacag aacgcatttt taatctggta ctcacataat cagaccatat 1680

agacgaggca ctttggaacc acaagcttgg ctcacaaaaa gagctttcct gggttgtagg 1740

cccagactag acttgcagca tgcatgctct gtgttcacta ggggttggct gtttgggatt 1800

ttagttaaac gtgtctgtga atttttatgt aactaactcc tttccattcc cctgggtgtc 1860

tcatgctgct ctttgactgt ttcagcttga acatgcattt tctaaagcaa actgcactag 1920

tgtatatatc agggtttgaa gctcatgggc tctct 1955

<210> 32

<211> 5373

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 32

agcagttttt gtaggtgaaa acaatgaagc caggtaatat tgcaaggagg ctgtaatttt 60

agcagaccta ccaacaacac tgatgtagga agctcattat tttaatttct ggagcctttt 120

aattttttct ttagaaagtg tataaataat tgcagtgctg ctttgcttcc aaaactgggc 180

agtgagttca acaacaacga caacaacagc cgcagctcat cctggccgtc atggagtttc 240

ttgaaagaac gtatcttgtg aatgataaag ctgccaagat gtatgctttc acactagaaa 300

gtgtggaact ccaacagaaa ccggtgaata aagatcagtg tcccagagag agaccagagg 360

agctggagtc aggaggcatg taccactgcc acagtggctc caagcccaca gaaaaggggg 420

cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac tctgttctgc ttcagcaata tgcttcattt 480

tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca ttgctgggag tcttgctgtt gtcacagatg 540

ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt tcctgctcag tctcttctcc ctgtggttgt 600

catcgaagcc tccctctaag cggctgacat ttggatggca ccgagcagag atccttggtg 660

ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg tgactggcgt gctagtgtac ctggcatgtg 720

agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc aggcgactgt gatgatcatc gtttccagct 780

gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg tggttttgca ccagagatgc cttggccaca 840

atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg tcagagctgc ttttgtgcat gcccttggag 900

atctatttca gagtatcagt gtgctaatta gtgcacttat tatctacttt aagccagagt 960

ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca tcttttccat cctggtcttg gccagcacca 1020

tcactatctt aaaggacttc tccatcttac tcatggaagg tgtgccaaag agcctgaatt 1080

acagtggtgt gaaagagctt attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg cacagcctgc 1140

acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct acagcagcca 1200

gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa agctttacga 1260

tgcactcact caccattcag atggaatctc cagttgacca ggaccccgac tgccttttct 1320

gtgaagaccc ctgtgactag ctcagtcaca ccgtcagttt cccaaatttg acaggccacc 1380

ttcaaacatg ctgctatgca gtttctgcat catagaaaat aaggaaccaa aggaagaaat 1440

tcatgtcatg gtgcaatgca cattttatct atttatttag ttccattcac catgaaggaa 1500

gaggcactga gatccatcaa tcaattggat tatatactga tcagtagctg tgttcaattg 1560

caggaatgtg tatatagatt attcctgagt ggagccgaag taacagctgt ttgtaactat 1620

cggcaatacc aaattcatct cccttccaat aatgcatctt gagaacacat aggtaaattt 1680

gaactcagga aagtcttact agaaatcagt ggaagggaca aatagtcaca aaattttacc 1740

aaaacattag aaacaaaaaa taaggagagc caagtcagga ataaaagtga ctctgtatgc 1800

taacgccaca ttagaacttg gttctctcac caagctgtaa tgtgattttt ttttctactc 1860

tgaattggaa atatgtatga atatacagag aagtgcttac aactaatttt tatttacttg 1920

tcacattttg gcaataaatc cctcttattt ctaaattcta acttgtttat ttcaaaactt 1980

tatataatca ctgttcaaaa ggaaatattt tcacctacca gagtgcttaa acactggcac 2040

cagccaaaga atgtggttgt agagacccag aagtcttcaa gaacagccga caaaaacatt 2100

cgagttgacc ccaccaagtt gttgccacag ataatttaga tatttacctg caagaaggaa 2160

taaagcagat gcaaccaatt cattcagtcc acgagcatga tgtgagcact gctttgtgct 2220

agacattggg cttagcattg aaactataaa gaggaatcag acgcagcaag tgcttctgtg 2280

ttctggtagc aactcaacac tatctgtgga gagtaaactg aagatgtgca ggccaacatt 2340

ctggaaatcc tatgtcaatg ggtttggttt ggaacctgga cttctgcatt tttaaaagtt 2400

acccagagat gcttctaaag atgagccata gtctagaaga ttgtcaacca caggagttca 2460

ttgagtggga cagctagaca catacattgg cagctacaat agtatcatga attgcaatga 2520

tgtagtgggg tataaaagga aagcgatgga tattgccgga tgggcatggc cagtgatgtt 2580

tcacgtcatt gaggtgacag ctctgctgga ctttgaatta catatggagg ctctccagga 2640

agacgaagaa gagaaggaca ttctaggcaa aaagaagact aggcacaagg cacacttatg 2700

tttgtctgtt agcttttagt tgaaaaagca aaatacatga tgcaaagaaa cctctccacg 2760

ctgtgatttt taaaactaca tactttttgc aactttatgg ttatgagtat tgtagagaac 2820

aggagatagg tcttagatga tttttatgtt gttgtcagac tctagcaagg tactagaaac 2880

ctagcaggca ttaataattg ttgaggcaat gactctgagg ctatatctgg gccttgtcat 2940

tatttatcat ttatatttgt atttttttct gaaatttgag ggccaagaaa acattgactt 3000

tgactgagga ggtcacatct gtgccatctc tgcaaatcaa tcagcaccac tgaaataact 3060

acttagcatt ctgctgagct ttccctgctc agtagagaca aatatactca tcccccacct 3120

cagtgagctt gtttaggcaa ccaggattag agctgctcag gttcccaacg tctcctgcca 3180

catcgggttc tcaaaatgga aagaatggtt tatgccaaat cacttttcct gtctgaagga 3240

ccactgaatg gttttgtttt tccatatttt gcataggacg ccctaaagac taggtgactt 3300

ggcaaacaca caagtgttag tataattctt tgcttctgct tctttttgaa aatcatgttt 3360

agatttgatt ttaagtcaga aattcactga atgtcaggta atcattatgg agggagattt 3420

gtgtgtcaac caaagtaatt gtcccatggc cccagggtat ttctgttgtt tccctgaaat 3480

tctgcttttt tagtcagcta gattgaaaac tctgaacagt agatgtttat atggcaaaat 3540

gcaagacaat ctacaaggga gattttaagg attttgagat gaaaaaacag atgctactca 3600

ggggctttat gaaccatcca tcaattctga agttctgact ctcccattac cctttccctg 3660

gtgtggtcag aactccaggt cactggaagt tagtggaatc atgtagttga attctttact 3720

tcaagacatt gtattctctc cagctatcaa aacattaatg atcttttatg tctttttttt 3780

gttattgtta tactttaagt tctggggtac atgtgcggaa catgtaggtt tgttacatag 3840

gtatacatgt gccatggtgg tttgctgcac tcatcaacct gtcatctaca ttcttttatg 3900

tctgtctttc aaagcaacac tctgttcttc tgagtagtga aatcaggtca actttaccac 3960

cagcctccat ttttaatatg cttcaccatc atccagcacc tacttaagat ttatctaggg 4020

ctctgtggtg atgttaggac ccataaaaga aatttatgcc ttccatatgt ttggttacag 4080

atgggaaatg ggaatgttga aggacatgaa agaaaggatg tttacacatt aagcatcagt 4140

tctgaagcta gattgtctga gtttgaatct tagctcttcc ctttattagc tctgtgacct 4200

cgagctagtt acttaaatgc tctgatcctc tatttcctga tcagtgaaac ctccctattc 4260

aaatgtgtga gagtttaata aattaggaca cttaaaaatg ttggagcagt gcatagcatg 4320

tagtgttcag tacatgttaa atgttgtttt ttattatgta caaacatgag tgggcacaga 4380

attttaaatc atctcaactt ttgagaaatt ttgagttatc aacaccgttc ccacaagaca 4440

gtggcaaaat tattggtgag aattaaacag ctgtttctca gaggaagcaa tggaggcttg 4500

ctgggataaa ggcatttact gagaggctgt tacctagtga gagtgatgaa ttaattaaaa 4560

tagtcgaatc cctttctgac tgtctctgaa agcttccgct tttatctttg aagagcagaa 4620

ttgtcactcc aaggacattt attaataaaa agaacaactg tccagtgcaa tgaaggcaaa 4680

gtcataggtc tcccaagtct taccccattc ctgtgaaata tcaagttctt ggcttttctc 4740

tgtcatgtag cctcaacttt ctctgaccgg gtgcatttct ttctctggtt tctaaattgc 4800

cagtggcaaa tttggatcac ttacttaata tctgttaaat tttgtgaccc aacaaagtct 4860

tttagcactg tggtgtcaaa aagaaaaaca cctcccaggc atatacattt tatagattcc 4920

tggagaatgt tgctctccag ctccatcccc acccaatgaa atatgatcca gagagtcttg 4980

caaagagaca agcctcattt tccacaatta gctctaaagt gcctccagga aatgattttc 5040

tcagctcatc tctctgtatt ccctgttttg gatcacaggg caatctgttt aaatgactaa 5100

ttacagaaat cattaaaggc accaagcaaa tgtcatctct gaatacacac atcccaagct 5160

ttacaaatcc tgcctggctt gacagtgatg aggccactta acagtccagc gcaggcggat 5220

gttaaaaaaa ataaaaaggt gaccatctgc ggtttagttt tttaactttc tgatttcaca 5280

cttaacgtct gtcattctgt tactgggcac ctgtttaaat tctattttaa aatgttaatg 5340

tgtgttgttt aaaataaaat caagaaagag aga 5373

<210> 33

<211> 5403

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 33

agcagttttt gtaggtgaaa acaatgaagc caggtaatat tgcaaggagg ctgtaatttt 60

agcagaccta ccaacaacac tgatgtagga agctcattat tttaatttct ggagcctttt 120

aattttttct ttagaaagtg tataaataat tgcagtgctg ctttgcttcc aaaactgggc 180

agtgagttca acaacaacga caacaacagc cgcagctcat cctggccgtc atggagtttc 240

ttgaaagaac gtatcttgtg aatgataaag ctgccaagat gtatgctttc acactagaaa 300

gaaggagctg caaatgaaca cttcatagca atgtggaact ccaacagaaa ccggtgaata 360

aagatcagtg tcccagagag agaccagagg agctggagtc aggaggcatg taccactgcc 420

acagtggctc caagcccaca gaaaaggggg cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac 480

tctgttctgc ttcagcaata tgcttcattt tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca 540

ttgctgggag tcttgctgtt gtcacagatg ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt 600

tcctgctcag tctcttctcc ctgtggttgt catcgaagcc tccctctaag cggctgacat 660

ttggatggca ccgagcagag atccttggtg ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg 720

tgactggcgt gctagtgtac ctggcatgtg agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc 780

aggcgactgt gatgatcatc gtttccagct gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg 840

tggttttgca ccagagatgc cttggccaca atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg 900

tcagagctgc ttttgtgcat gcccttggag atctatttca gagtatcagt gtgctaatta 960

gtgcacttat tatctacttt aagccagagt ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca 1020

tcttttccat cctggtcttg gccagcacca tcactatctt aaaggacttc tccatcttac 1080

tcatggaagg tgtgccaaag agcctgaatt acagtggtgt gaaagagctt attttagcag 1140

tcgacggggt gctgtctgtg cacagcctgc acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa 1200

ttctctcagc tcatgttgct acagcagcca gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa 1260

ttgctaaagc ccttagcaaa agctttacga tgcactcact caccattcag atggaatctc 1320

cagttgacca ggaccccgac tgccttttct gtgaagaccc ctgtgactag ctcagtcaca 1380

ccgtcagttt cccaaatttg acaggccacc ttcaaacatg ctgctatgca gtttctgcat 1440

catagaaaat aaggaaccaa aggaagaaat tcatgtcatg gtgcaatgca cattttatct 1500

atttatttag ttccattcac catgaaggaa gaggcactga gatccatcaa tcaattggat 1560

tatatactga tcagtagctg tgttcaattg caggaatgtg tatatagatt attcctgagt 1620

ggagccgaag taacagctgt ttgtaactat cggcaatacc aaattcatct cccttccaat 1680

aatgcatctt gagaacacat aggtaaattt gaactcagga aagtcttact agaaatcagt 1740

ggaagggaca aatagtcaca aaattttacc aaaacattag aaacaaaaaa taaggagagc 1800

caagtcagga ataaaagtga ctctgtatgc taacgccaca ttagaacttg gttctctcac 1860

caagctgtaa tgtgattttt ttttctactc tgaattggaa atatgtatga atatacagag 1920

aagtgcttac aactaatttt tatttacttg tcacattttg gcaataaatc cctcttattt 1980

ctaaattcta acttgtttat ttcaaaactt tatataatca ctgttcaaaa ggaaatattt 2040

tcacctacca gagtgcttaa acactggcac cagccaaaga atgtggttgt agagacccag 2100

aagtcttcaa gaacagccga caaaaacatt cgagttgacc ccaccaagtt gttgccacag 2160

ataatttaga tatttacctg caagaaggaa taaagcagat gcaaccaatt cattcagtcc 2220

acgagcatga tgtgagcact gctttgtgct agacattggg cttagcattg aaactataaa 2280

gaggaatcag acgcagcaag tgcttctgtg ttctggtagc aactcaacac tatctgtgga 2340

gagtaaactg aagatgtgca ggccaacatt ctggaaatcc tatgtcaatg ggtttggttt 2400

ggaacctgga cttctgcatt tttaaaagtt acccagagat gcttctaaag atgagccata 2460

gtctagaaga ttgtcaacca caggagttca ttgagtggga cagctagaca catacattgg 2520

cagctacaat agtatcatga attgcaatga tgtagtgggg tataaaagga aagcgatgga 2580

tattgccgga tgggcatggc cagtgatgtt tcacgtcatt gaggtgacag ctctgctgga 2640

ctttgaatta catatggagg ctctccagga agacgaagaa gagaaggaca ttctaggcaa 2700

aaagaagact aggcacaagg cacacttatg tttgtctgtt agcttttagt tgaaaaagca 2760

aaatacatga tgcaaagaaa cctctccacg ctgtgatttt taaaactaca tactttttgc 2820

aactttatgg ttatgagtat tgtagagaac aggagatagg tcttagatga tttttatgtt 2880

gttgtcagac tctagcaagg tactagaaac ctagcaggca ttaataattg ttgaggcaat 2940

gactctgagg ctatatctgg gccttgtcat tatttatcat ttatatttgt atttttttct 3000

gaaatttgag ggccaagaaa acattgactt tgactgagga ggtcacatct gtgccatctc 3060

tgcaaatcaa tcagcaccac tgaaataact acttagcatt ctgctgagct ttccctgctc 3120

agtagagaca aatatactca tcccccacct cagtgagctt gtttaggcaa ccaggattag 3180

agctgctcag gttcccaacg tctcctgcca catcgggttc tcaaaatgga aagaatggtt 3240

tatgccaaat cacttttcct gtctgaagga ccactgaatg gttttgtttt tccatatttt 3300

gcataggacg ccctaaagac taggtgactt ggcaaacaca caagtgttag tataattctt 3360

tgcttctgct tctttttgaa aatcatgttt agatttgatt ttaagtcaga aattcactga 3420

atgtcaggta atcattatgg agggagattt gtgtgtcaac caaagtaatt gtcccatggc 3480

cccagggtat ttctgttgtt tccctgaaat tctgcttttt tagtcagcta gattgaaaac 3540

tctgaacagt agatgtttat atggcaaaat gcaagacaat ctacaaggga gattttaagg 3600

attttgagat gaaaaaacag atgctactca ggggctttat gaaccatcca tcaattctga 3660

agttctgact ctcccattac cctttccctg gtgtggtcag aactccaggt cactggaagt 3720

tagtggaatc atgtagttga attctttact tcaagacatt gtattctctc cagctatcaa 3780

aacattaatg atcttttatg tctttttttt gttattgtta tactttaagt tctggggtac 3840

atgtgcggaa catgtaggtt tgttacatag gtatacatgt gccatggtgg tttgctgcac 3900

tcatcaacct gtcatctaca ttcttttatg tctgtctttc aaagcaacac tctgttcttc 3960

tgagtagtga aatcaggtca actttaccac cagcctccat ttttaatatg cttcaccatc 4020

atccagcacc tacttaagat ttatctaggg ctctgtggtg atgttaggac ccataaaaga 4080

aatttatgcc ttccatatgt ttggttacag atgggaaatg ggaatgttga aggacatgaa 4140

agaaaggatg tttacacatt aagcatcagt tctgaagcta gattgtctga gtttgaatct 4200

tagctcttcc ctttattagc tctgtgacct cgagctagtt acttaaatgc tctgatcctc 4260

tatttcctga tcagtgaaac ctccctattc aaatgtgtga gagtttaata aattaggaca 4320

cttaaaaatg ttggagcagt gcatagcatg tagtgttcag tacatgttaa atgttgtttt 4380

ttattatgta caaacatgag tgggcacaga attttaaatc atctcaactt ttgagaaatt 4440

ttgagttatc aacaccgttc ccacaagaca gtggcaaaat tattggtgag aattaaacag 4500

ctgtttctca gaggaagcaa tggaggcttg ctgggataaa ggcatttact gagaggctgt 4560

tacctagtga gagtgatgaa ttaattaaaa tagtcgaatc cctttctgac tgtctctgaa 4620

agcttccgct tttatctttg aagagcagaa ttgtcactcc aaggacattt attaataaaa 4680

agaacaactg tccagtgcaa tgaaggcaaa gtcataggtc tcccaagtct taccccattc 4740

ctgtgaaata tcaagttctt ggcttttctc tgtcatgtag cctcaacttt ctctgaccgg 4800

gtgcatttct ttctctggtt tctaaattgc cagtggcaaa tttggatcac ttacttaata 4860

tctgttaaat tttgtgaccc aacaaagtct tttagcactg tggtgtcaaa aagaaaaaca 4920

cctcccaggc atatacattt tatagattcc tggagaatgt tgctctccag ctccatcccc 4980

acccaatgaa atatgatcca gagagtcttg caaagagaca agcctcattt tccacaatta 5040

gctctaaagt gcctccagga aatgattttc tcagctcatc tctctgtatt ccctgttttg 5100

gatcacaggg caatctgttt aaatgactaa ttacagaaat cattaaaggc accaagcaaa 5160

tgtcatctct gaatacacac atcccaagct ttacaaatcc tgcctggctt gacagtgatg 5220

aggccactta acagtccagc gcaggcggat gttaaaaaaa ataaaaaggt gaccatctgc 5280

ggtttagttt tttaactttc tgatttcaca cttaacgtct gtcattctgt tactgggcac 5340

ctgtttaaat tctattttaa aatgttaatg tgtgttgttt aaaataaaat caagaaagag 5400

aga 5403

<210> 34

<211> 5316

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 34

gggctgccag catgctgtca cctctcaata ggagatcagt taatgcatac tgaaggaagg 60

cttgttggag aagaatcctc tcctgaaccc tgtggagact ctagaatcct gcggatgtct 120

ctctccctaa gtaagagatg ttacttcctg gagggaatgc agtgttggga atctgaagac 180

ccagctttga gctgaatttg ctttgtgata cctgaaggag ctgcaaatga acacttcata 240

gcaatgtgga actccaacag aaaccggtga ataaagatca gtgtcccaga gagagaccag 300

aggagctgga gtcaggaggc atgtaccact gccacagtgg ctccaagccc acagaaaagg 360

gggcgaatga gtacgcctat gccaagtgga aactctgttc tgcttcagca atatgcttca 420

ttttcatgat tgcagaggtc gtgggtgggc acattgctgg gagtcttgct gttgtcacag 480

atgctgccca cctcttaatt gacctgacca gtttcctgct cagtctcttc tccctgtggt 540

tgtcatcgaa gcctccctct aagcggctga catttggatg gcaccgagca gagatccttg 600

gtgccctgct ctccatcctg tgcatctggg tggtgactgg cgtgctagtg tacctggcat 660

gtgagcgcct gctgtatcct gattaccaga tccaggcgac tgtgatgatc atcgtttcca 720

gctgcgcagt ggcggccaac attgtactaa ctgtggtttt gcaccagaga tgccttggcc 780

acaatcacaa ggaagtacaa gccaatgcca gcgtcagagc tgcttttgtg catgcccttg 840

gagatctatt tcagagtatc agtgtgctaa ttagtgcact tattatctac tttaagccag 900

agtataaaat agccgaccca atctgcacat tcatcttttc catcctggtc ttggccagca 960

ccatcactat cttaaaggac ttctccatct tactcatgga aggtgtgcca aagagcctga 1020

attacagtgg tgtgaaagag cttattttag cagtcgacgg ggtgctgtct gtgcacagcc 1080

tgcacatctg gtctctaaca atgaatcaag taattctctc agctcatgtt gctacagcag 1140

ccagccggga cagccaagtg gttcggagag aaattgctaa agcccttagc aaaagcttta 1200

cgatgcactc actcaccatt cagatggaat ctccagttga ccaggacccc gactgccttt 1260

tctgtgaaga cccctgtgac tagctcagtc acaccgtcag tttcccaaat ttgacaggcc 1320

accttcaaac atgctgctat gcagtttctg catcatagaa aataaggaac caaaggaaga 1380

aattcatgtc atggtgcaat gcacatttta tctatttatt tagttccatt caccatgaag 1440

gaagaggcac tgagatccat caatcaattg gattatatac tgatcagtag ctgtgttcaa 1500

ttgcaggaat gtgtatatag attattcctg agtggagccg aagtaacagc tgtttgtaac 1560

tatcggcaat accaaattca tctcccttcc aataatgcat cttgagaaca cataggtaaa 1620

tttgaactca ggaaagtctt actagaaatc agtggaaggg acaaatagtc acaaaatttt 1680

accaaaacat tagaaacaaa aaataaggag agccaagtca ggaataaaag tgactctgta 1740

tgctaacgcc acattagaac ttggttctct caccaagctg taatgtgatt tttttttcta 1800

ctctgaattg gaaatatgta tgaatataca gagaagtgct tacaactaat ttttatttac 1860

ttgtcacatt ttggcaataa atccctctta tttctaaatt ctaacttgtt tatttcaaaa 1920

ctttatataa tcactgttca aaaggaaata ttttcaccta ccagagtgct taaacactgg 1980

caccagccaa agaatgtggt tgtagagacc cagaagtctt caagaacagc cgacaaaaac 2040

attcgagttg accccaccaa gttgttgcca cagataattt agatatttac ctgcaagaag 2100

gaataaagca gatgcaacca attcattcag tccacgagca tgatgtgagc actgctttgt 2160

gctagacatt gggcttagca ttgaaactat aaagaggaat cagacgcagc aagtgcttct 2220

gtgttctggt agcaactcaa cactatctgt ggagagtaaa ctgaagatgt gcaggccaac 2280

attctggaaa tcctatgtca atgggtttgg tttggaacct ggacttctgc atttttaaaa 2340

gttacccaga gatgcttcta aagatgagcc atagtctaga agattgtcaa ccacaggagt 2400

tcattgagtg ggacagctag acacatacat tggcagctac aatagtatca tgaattgcaa 2460

tgatgtagtg gggtataaaa ggaaagcgat ggatattgcc ggatgggcat ggccagtgat 2520

gtttcacgtc attgaggtga cagctctgct ggactttgaa ttacatatgg aggctctcca 2580

ggaagacgaa gaagagaagg acattctagg caaaaagaag actaggcaca aggcacactt 2640

atgtttgtct gttagctttt agttgaaaaa gcaaaataca tgatgcaaag aaacctctcc 2700

acgctgtgat ttttaaaact acatactttt tgcaacttta tggttatgag tattgtagag 2760

aacaggagat aggtcttaga tgatttttat gttgttgtca gactctagca aggtactaga 2820

aacctagcag gcattaataa ttgttgaggc aatgactctg aggctatatc tgggccttgt 2880

cattatttat catttatatt tgtatttttt tctgaaattt gagggccaag aaaacattga 2940

ctttgactga ggaggtcaca tctgtgccat ctctgcaaat caatcagcac cactgaaata 3000

actacttagc attctgctga gctttccctg ctcagtagag acaaatatac tcatccccca 3060

cctcagtgag cttgtttagg caaccaggat tagagctgct caggttccca acgtctcctg 3120

ccacatcggg ttctcaaaat ggaaagaatg gtttatgcca aatcactttt cctgtctgaa 3180

ggaccactga atggttttgt ttttccatat tttgcatagg acgccctaaa gactaggtga 3240

cttggcaaac acacaagtgt tagtataatt ctttgcttct gcttcttttt gaaaatcatg 3300

tttagatttg attttaagtc agaaattcac tgaatgtcag gtaatcatta tggagggaga 3360

tttgtgtgtc aaccaaagta attgtcccat ggccccaggg tatttctgtt gtttccctga 3420

aattctgctt ttttagtcag ctagattgaa aactctgaac agtagatgtt tatatggcaa 3480

aatgcaagac aatctacaag ggagatttta aggattttga gatgaaaaaa cagatgctac 3540

tcaggggctt tatgaaccat ccatcaattc tgaagttctg actctcccat taccctttcc 3600

ctggtgtggt cagaactcca ggtcactgga agttagtgga atcatgtagt tgaattcttt 3660

acttcaagac attgtattct ctccagctat caaaacatta atgatctttt atgtcttttt 3720

tttgttattg ttatacttta agttctgggg tacatgtgcg gaacatgtag gtttgttaca 3780

taggtataca tgtgccatgg tggtttgctg cactcatcaa cctgtcatct acattctttt 3840

atgtctgtct ttcaaagcaa cactctgttc ttctgagtag tgaaatcagg tcaactttac 3900

caccagcctc catttttaat atgcttcacc atcatccagc acctacttaa gatttatcta 3960

gggctctgtg gtgatgttag gacccataaa agaaatttat gccttccata tgtttggtta 4020

cagatgggaa atgggaatgt tgaaggacat gaaagaaagg atgtttacac attaagcatc 4080

agttctgaag ctagattgtc tgagtttgaa tcttagctct tccctttatt agctctgtga 4140

cctcgagcta gttacttaaa tgctctgatc ctctatttcc tgatcagtga aacctcccta 4200

ttcaaatgtg tgagagttta ataaattagg acacttaaaa atgttggagc agtgcatagc 4260

atgtagtgtt cagtacatgt taaatgttgt tttttattat gtacaaacat gagtgggcac 4320

agaattttaa atcatctcaa cttttgagaa attttgagtt atcaacaccg ttcccacaag 4380

acagtggcaa aattattggt gagaattaaa cagctgtttc tcagaggaag caatggaggc 4440

ttgctgggat aaaggcattt actgagaggc tgttacctag tgagagtgat gaattaatta 4500

aaatagtcga atccctttct gactgtctct gaaagcttcc gcttttatct ttgaagagca 4560

gaattgtcac tccaaggaca tttattaata aaaagaacaa ctgtccagtg caatgaaggc 4620

aaagtcatag gtctcccaag tcttacccca ttcctgtgaa atatcaagtt cttggctttt 4680

ctctgtcatg tagcctcaac tttctctgac cgggtgcatt tctttctctg gtttctaaat 4740

tgccagtggc aaatttggat cacttactta atatctgtta aattttgtga cccaacaaag 4800

tcttttagca ctgtggtgtc aaaaagaaaa acacctccca ggcatataca ttttatagat 4860

tcctggagaa tgttgctctc cagctccatc cccacccaat gaaatatgat ccagagagtc 4920

ttgcaaagag acaagcctca ttttccacaa ttagctctaa agtgcctcca ggaaatgatt 4980

ttctcagctc atctctctgt attccctgtt ttggatcaca gggcaatctg tttaaatgac 5040

taattacaga aatcattaaa ggcaccaagc aaatgtcatc tctgaataca cacatcccaa 5100

gctttacaaa tcctgcctgg cttgacagtg atgaggccac ttaacagtcc agcgcaggcg 5160

gatgttaaaa aaaataaaaa ggtgaccatc tgcggtttag ttttttaact ttctgatttc 5220

acacttaacg tctgtcattc tgttactggg cacctgttta aattctattt taaaatgtta 5280

atgtgtgttg tttaaaataa aatcaagaaa gagaga 5316

<210> 35

<211> 5561

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 35

ttttaagaag catcaagaaa gcctgcctgt ctaactttgg aaatatcacc ctcatgctgt 60

cttcccagga tgtctctctc cctaagtaag agatgttact tcctggaggg aatgcagtgt 120

tgggaatctg aagacccagc tttgagctga atttgctttg tgatacctga gacagcattt 180

ccccatgttg gccaggctgg tcttgaactc ctgacctcaa gtgatccgcc cgcctcggcc 240

tcccaaagtg ctgggtttac aagcgtgagc caccgcgccc cgggggagtc agaaagtgta 300

taaataattg cagtgctgct ttgcttccaa aactgggcag tgagttcaac aacaacgaca 360

acaacagccg cagctcatcc tggccgtcat ggagtttctt gaaagaacgt atcttgtgaa 420

tgataaagct gccaagatgt atgctttcac actagaaaga aggagctgca aatgaacact 480

tcatagcaat gtggaactcc aacagaaacc ggtgaataaa gatcagtgtc ccagagagag 540

accagaggag ctggagtcag gaggcatgta ccactgccac agtggctcca agcccacaga 600

aaagggggcg aatgagtacg cctatgccaa gtggaaactc tgttctgctt cagcaatatg 660

cttcattttc atgattgcag aggtcgtggg tgggcacatt gctgggagtc ttgctgttgt 720

cacagatgct gcccacctct taattgacct gaccagtttc ctgctcagtc tcttctccct 780

gtggttgtca tcgaagcctc cctctaagcg gctgacattt ggatggcacc gagcagagat 840

ccttggtgcc ctgctctcca tcctgtgcat ctgggtggtg actggcgtgc tagtgtacct 900

ggcatgtgag cgcctgctgt atcctgatta ccagatccag gcgactgtga tgatcatcgt 960

ttccagctgc gcagtggcgg ccaacattgt actaactgtg gttttgcacc agagatgcct 1020

tggccacaat cacaaggaag tacaagccaa tgccagcgtc agagctgctt ttgtgcatgc 1080

ccttggagat ctatttcaga gtatcagtgt gctaattagt gcacttatta tctactttaa 1140

gccagagtat aaaatagccg acccaatctg cacattcatc ttttccatcc tggtcttggc 1200

cagcaccatc actatcttaa aggacttctc catcttactc atggaaggtg tgccaaagag 1260

cctgaattac agtggtgtga aagagcttat tttagcagtc gacggggtgc tgtctgtgca 1320

cagcctgcac atctggtctc taacaatgaa tcaagtaatt ctctcagctc atgttgctac 1380

agcagccagc cgggacagcc aagtggttcg gagagaaatt gctaaagccc ttagcaaaag 1440

ctttacgatg cactcactca ccattcagat ggaatctcca gttgaccagg accccgactg 1500

ccttttctgt gaagacccct gtgactagct cagtcacacc gtcagtttcc caaatttgac 1560

aggccacctt caaacatgct gctatgcagt ttctgcatca tagaaaataa ggaaccaaag 1620

gaagaaattc atgtcatggt gcaatgcaca ttttatctat ttatttagtt ccattcacca 1680

tgaaggaaga ggcactgaga tccatcaatc aattggatta tatactgatc agtagctgtg 1740

ttcaattgca ggaatgtgta tatagattat tcctgagtgg agccgaagta acagctgttt 1800

gtaactatcg gcaataccaa attcatctcc cttccaataa tgcatcttga gaacacatag 1860

gtaaatttga actcaggaaa gtcttactag aaatcagtgg aagggacaaa tagtcacaaa 1920

attttaccaa aacattagaa acaaaaaata aggagagcca agtcaggaat aaaagtgact 1980

ctgtatgcta acgccacatt agaacttggt tctctcacca agctgtaatg tgattttttt 2040

ttctactctg aattggaaat atgtatgaat atacagagaa gtgcttacaa ctaattttta 2100

tttacttgtc acattttggc aataaatccc tcttatttct aaattctaac ttgtttattt 2160

caaaacttta tataatcact gttcaaaagg aaatattttc acctaccaga gtgcttaaac 2220

actggcacca gccaaagaat gtggttgtag agacccagaa gtcttcaaga acagccgaca 2280

aaaacattcg agttgacccc accaagttgt tgccacagat aatttagata tttacctgca 2340

agaaggaata aagcagatgc aaccaattca ttcagtccac gagcatgatg tgagcactgc 2400

tttgtgctag acattgggct tagcattgaa actataaaga ggaatcagac gcagcaagtg 2460

cttctgtgtt ctggtagcaa ctcaacacta tctgtggaga gtaaactgaa gatgtgcagg 2520

ccaacattct ggaaatccta tgtcaatggg tttggtttgg aacctggact tctgcatttt 2580

taaaagttac ccagagatgc ttctaaagat gagccatagt ctagaagatt gtcaaccaca 2640

ggagttcatt gagtgggaca gctagacaca tacattggca gctacaatag tatcatgaat 2700

tgcaatgatg tagtggggta taaaaggaaa gcgatggata ttgccggatg ggcatggcca 2760

gtgatgtttc acgtcattga ggtgacagct ctgctggact ttgaattaca tatggaggct 2820

ctccaggaag acgaagaaga gaaggacatt ctaggcaaaa agaagactag gcacaaggca 2880

cacttatgtt tgtctgttag cttttagttg aaaaagcaaa atacatgatg caaagaaacc 2940

tctccacgct gtgattttta aaactacata ctttttgcaa ctttatggtt atgagtattg 3000

tagagaacag gagataggtc ttagatgatt tttatgttgt tgtcagactc tagcaaggta 3060

ctagaaacct agcaggcatt aataattgtt gaggcaatga ctctgaggct atatctgggc 3120

cttgtcatta tttatcattt atatttgtat ttttttctga aatttgaggg ccaagaaaac 3180

attgactttg actgaggagg tcacatctgt gccatctctg caaatcaatc agcaccactg 3240

aaataactac ttagcattct gctgagcttt ccctgctcag tagagacaaa tatactcatc 3300

ccccacctca gtgagcttgt ttaggcaacc aggattagag ctgctcaggt tcccaacgtc 3360

tcctgccaca tcgggttctc aaaatggaaa gaatggttta tgccaaatca cttttcctgt 3420

ctgaaggacc actgaatggt tttgtttttc catattttgc ataggacgcc ctaaagacta 3480

ggtgacttgg caaacacaca agtgttagta taattctttg cttctgcttc tttttgaaaa 3540

tcatgtttag atttgatttt aagtcagaaa ttcactgaat gtcaggtaat cattatggag 3600

ggagatttgt gtgtcaacca aagtaattgt cccatggccc cagggtattt ctgttgtttc 3660

cctgaaattc tgctttttta gtcagctaga ttgaaaactc tgaacagtag atgtttatat 3720

ggcaaaatgc aagacaatct acaagggaga ttttaaggat tttgagatga aaaaacagat 3780

gctactcagg ggctttatga accatccatc aattctgaag ttctgactct cccattaccc 3840

tttccctggt gtggtcagaa ctccaggtca ctggaagtta gtggaatcat gtagttgaat 3900

tctttacttc aagacattgt attctctcca gctatcaaaa cattaatgat cttttatgtc 3960

ttttttttgt tattgttata ctttaagttc tggggtacat gtgcggaaca tgtaggtttg 4020

ttacataggt atacatgtgc catggtggtt tgctgcactc atcaacctgt catctacatt 4080

cttttatgtc tgtctttcaa agcaacactc tgttcttctg agtagtgaaa tcaggtcaac 4140

tttaccacca gcctccattt ttaatatgct tcaccatcat ccagcaccta cttaagattt 4200

atctagggct ctgtggtgat gttaggaccc ataaaagaaa tttatgcctt ccatatgttt 4260

ggttacagat gggaaatggg aatgttgaag gacatgaaag aaaggatgtt tacacattaa 4320

gcatcagttc tgaagctaga ttgtctgagt ttgaatctta gctcttccct ttattagctc 4380

tgtgacctcg agctagttac ttaaatgctc tgatcctcta tttcctgatc agtgaaacct 4440

ccctattcaa atgtgtgaga gtttaataaa ttaggacact taaaaatgtt ggagcagtgc 4500

atagcatgta gtgttcagta catgttaaat gttgtttttt attatgtaca aacatgagtg 4560

ggcacagaat tttaaatcat ctcaactttt gagaaatttt gagttatcaa caccgttccc 4620

acaagacagt ggcaaaatta ttggtgagaa ttaaacagct gtttctcaga ggaagcaatg 4680

gaggcttgct gggataaagg catttactga gaggctgtta cctagtgaga gtgatgaatt 4740

aattaaaata gtcgaatccc tttctgactg tctctgaaag cttccgcttt tatctttgaa 4800

gagcagaatt gtcactccaa ggacatttat taataaaaag aacaactgtc cagtgcaatg 4860

aaggcaaagt cataggtctc ccaagtctta ccccattcct gtgaaatatc aagttcttgg 4920

cttttctctg tcatgtagcc tcaactttct ctgaccgggt gcatttcttt ctctggtttc 4980

taaattgcca gtggcaaatt tggatcactt acttaatatc tgttaaattt tgtgacccaa 5040

caaagtcttt tagcactgtg gtgtcaaaaa gaaaaacacc tcccaggcat atacatttta 5100

tagattcctg gagaatgttg ctctccagct ccatccccac ccaatgaaat atgatccaga 5160

gagtcttgca aagagacaag cctcattttc cacaattagc tctaaagtgc ctccaggaaa 5220

tgattttctc agctcatctc tctgtattcc ctgttttgga tcacagggca atctgtttaa 5280

atgactaatt acagaaatca ttaaaggcac caagcaaatg tcatctctga atacacacat 5340

cccaagcttt acaaatcctg cctggcttga cagtgatgag gccacttaac agtccagcgc 5400

aggcggatgt taaaaaaaat aaaaaggtga ccatctgcgg tttagttttt taactttctg 5460

atttcacact taacgtctgt cattctgtta ctgggcacct gtttaaattc tattttaaaa 5520

tgttaatgtg tgttgtttaa aataaaatca agaaagagag a 5561

<210> 36

<211> 5430

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 36

ttttaagaag catcaagaaa gcctgcctgt ctaactttgg aaatatcacc ctcatgctgt 60

cttcccagga tgtctctctc cctaagtaag agatgttact tcctggaggg aatgcagtgt 120

tgggaatctg aagacccagc tttgagctga atttgctttg tgatacctgg agagaagacg 180

tgttttcttg acaacagcac agtacctagt gagttcaaca acaacgacaa caacagccgc 240

agctcatcct ggccgtcatg gagtttcttg aaagaacgta tcttgtgaat gataaagctg 300

ccaagatgta tgctttcaca ctagaaagaa ggagctgcaa atgaacactt catagcaatg 360

tggaactcca acagaaaccg gtgaataaag atcagtgtcc cagagagaga ccagaggagc 420

tggagtcagg aggcatgtac cactgccaca gtggctccaa gcccacagaa aagggggcga 480

atgagtacgc ctatgccaag tggaaactct gttctgcttc agcaatatgc ttcattttca 540

tgattgcaga ggtcgtgggt gggcacattg ctgggagtct tgctgttgtc acagatgctg 600

cccacctctt aattgacctg accagtttcc tgctcagtct cttctccctg tggttgtcat 660

cgaagcctcc ctctaagcgg ctgacatttg gatggcaccg agcagagatc cttggtgccc 720

tgctctccat cctgtgcatc tgggtggtga ctggcgtgct agtgtacctg gcatgtgagc 780

gcctgctgta tcctgattac cagatccagg cgactgtgat gatcatcgtt tccagctgcg 840

cagtggcggc caacattgta ctaactgtgg ttttgcacca gagatgcctt ggccacaatc 900

acaaggaagt acaagccaat gccagcgtca gagctgcttt tgtgcatgcc cttggagatc 960

tatttcagag tatcagtgtg ctaattagtg cacttattat ctactttaag ccagagtata 1020

aaatagccga cccaatctgc acattcatct tttccatcct ggtcttggcc agcaccatca 1080

ctatcttaaa ggacttctcc atcttactca tggaaggtgt gccaaagagc ctgaattaca 1140

gtggtgtgaa agagcttatt ttagcagtcg acggggtgct gtctgtgcac agcctgcaca 1200

tctggtctct aacaatgaat caagtaattc tctcagctca tgttgctaca gcagccagcc 1260

gggacagcca agtggttcgg agagaaattg ctaaagccct tagcaaaagc tttacgatgc 1320

actcactcac cattcagatg gaatctccag ttgaccagga ccccgactgc cttttctgtg 1380

aagacccctg tgactagctc agtcacaccg tcagtttccc aaatttgaca ggccaccttc 1440

aaacatgctg ctatgcagtt tctgcatcat agaaaataag gaaccaaagg aagaaattca 1500

tgtcatggtg caatgcacat tttatctatt tatttagttc cattcaccat gaaggaagag 1560

gcactgagat ccatcaatca attggattat atactgatca gtagctgtgt tcaattgcag 1620

gaatgtgtat atagattatt cctgagtgga gccgaagtaa cagctgtttg taactatcgg 1680

caataccaaa ttcatctccc ttccaataat gcatcttgag aacacatagg taaatttgaa 1740

ctcaggaaag tcttactaga aatcagtgga agggacaaat agtcacaaaa ttttaccaaa 1800

acattagaaa caaaaaataa ggagagccaa gtcaggaata aaagtgactc tgtatgctaa 1860

cgccacatta gaacttggtt ctctcaccaa gctgtaatgt gatttttttt tctactctga 1920

attggaaata tgtatgaata tacagagaag tgcttacaac taatttttat ttacttgtca 1980

cattttggca ataaatccct cttatttcta aattctaact tgtttatttc aaaactttat 2040

ataatcactg ttcaaaagga aatattttca cctaccagag tgcttaaaca ctggcaccag 2100

ccaaagaatg tggttgtaga gacccagaag tcttcaagaa cagccgacaa aaacattcga 2160

gttgacccca ccaagttgtt gccacagata atttagatat ttacctgcaa gaaggaataa 2220

agcagatgca accaattcat tcagtccacg agcatgatgt gagcactgct ttgtgctaga 2280

cattgggctt agcattgaaa ctataaagag gaatcagacg cagcaagtgc ttctgtgttc 2340

tggtagcaac tcaacactat ctgtggagag taaactgaag atgtgcaggc caacattctg 2400

gaaatcctat gtcaatgggt ttggtttgga acctggactt ctgcattttt aaaagttacc 2460

cagagatgct tctaaagatg agccatagtc tagaagattg tcaaccacag gagttcattg 2520

agtgggacag ctagacacat acattggcag ctacaatagt atcatgaatt gcaatgatgt 2580

agtggggtat aaaaggaaag cgatggatat tgccggatgg gcatggccag tgatgtttca 2640

cgtcattgag gtgacagctc tgctggactt tgaattacat atggaggctc tccaggaaga 2700

cgaagaagag aaggacattc taggcaaaaa gaagactagg cacaaggcac acttatgttt 2760

gtctgttagc ttttagttga aaaagcaaaa tacatgatgc aaagaaacct ctccacgctg 2820

tgatttttaa aactacatac tttttgcaac tttatggtta tgagtattgt agagaacagg 2880

agataggtct tagatgattt ttatgttgtt gtcagactct agcaaggtac tagaaaccta 2940

gcaggcatta ataattgttg aggcaatgac tctgaggcta tatctgggcc ttgtcattat 3000

ttatcattta tatttgtatt tttttctgaa atttgagggc caagaaaaca ttgactttga 3060

ctgaggaggt cacatctgtg ccatctctgc aaatcaatca gcaccactga aataactact 3120

tagcattctg ctgagctttc cctgctcagt agagacaaat atactcatcc cccacctcag 3180

tgagcttgtt taggcaacca ggattagagc tgctcaggtt cccaacgtct cctgccacat 3240

cgggttctca aaatggaaag aatggtttat gccaaatcac ttttcctgtc tgaaggacca 3300

ctgaatggtt ttgtttttcc atattttgca taggacgccc taaagactag gtgacttggc 3360

aaacacacaa gtgttagtat aattctttgc ttctgcttct ttttgaaaat catgtttaga 3420

tttgatttta agtcagaaat tcactgaatg tcaggtaatc attatggagg gagatttgtg 3480

tgtcaaccaa agtaattgtc ccatggcccc agggtatttc tgttgtttcc ctgaaattct 3540

gcttttttag tcagctagat tgaaaactct gaacagtaga tgtttatatg gcaaaatgca 3600

agacaatcta caagggagat tttaaggatt ttgagatgaa aaaacagatg ctactcaggg 3660

gctttatgaa ccatccatca attctgaagt tctgactctc ccattaccct ttccctggtg 3720

tggtcagaac tccaggtcac tggaagttag tggaatcatg tagttgaatt ctttacttca 3780

agacattgta ttctctccag ctatcaaaac attaatgatc ttttatgtct tttttttgtt 3840

attgttatac tttaagttct ggggtacatg tgcggaacat gtaggtttgt tacataggta 3900

tacatgtgcc atggtggttt gctgcactca tcaacctgtc atctacattc ttttatgtct 3960

gtctttcaaa gcaacactct gttcttctga gtagtgaaat caggtcaact ttaccaccag 4020

cctccatttt taatatgctt caccatcatc cagcacctac ttaagattta tctagggctc 4080

tgtggtgatg ttaggaccca taaaagaaat ttatgccttc catatgtttg gttacagatg 4140

ggaaatggga atgttgaagg acatgaaaga aaggatgttt acacattaag catcagttct 4200

gaagctagat tgtctgagtt tgaatcttag ctcttccctt tattagctct gtgacctcga 4260

gctagttact taaatgctct gatcctctat ttcctgatca gtgaaacctc cctattcaaa 4320

tgtgtgagag tttaataaat taggacactt aaaaatgttg gagcagtgca tagcatgtag 4380

tgttcagtac atgttaaatg ttgtttttta ttatgtacaa acatgagtgg gcacagaatt 4440

ttaaatcatc tcaacttttg agaaattttg agttatcaac accgttccca caagacagtg 4500

gcaaaattat tggtgagaat taaacagctg tttctcagag gaagcaatgg aggcttgctg 4560

ggataaaggc atttactgag aggctgttac ctagtgagag tgatgaatta attaaaatag 4620

tcgaatccct ttctgactgt ctctgaaagc ttccgctttt atctttgaag agcagaattg 4680

tcactccaag gacatttatt aataaaaaga acaactgtcc agtgcaatga aggcaaagtc 4740

ataggtctcc caagtcttac cccattcctg tgaaatatca agttcttggc ttttctctgt 4800

catgtagcct caactttctc tgaccgggtg catttctttc tctggtttct aaattgccag 4860

tggcaaattt ggatcactta cttaatatct gttaaatttt gtgacccaac aaagtctttt 4920

agcactgtgg tgtcaaaaag aaaaacacct cccaggcata tacattttat agattcctgg 4980

agaatgttgc tctccagctc catccccacc caatgaaata tgatccagag agtcttgcaa 5040

agagacaagc ctcattttcc acaattagct ctaaagtgcc tccaggaaat gattttctca 5100

gctcatctct ctgtattccc tgttttggat cacagggcaa tctgtttaaa tgactaatta 5160

cagaaatcat taaaggcacc aagcaaatgt catctctgaa tacacacatc ccaagcttta 5220

caaatcctgc ctggcttgac agtgatgagg ccacttaaca gtccagcgca ggcggatgtt 5280

aaaaaaaata aaaaggtgac catctgcggt ttagtttttt aactttctga tttcacactt 5340

aacgtctgtc attctgttac tgggcacctg tttaaattct attttaaaat gttaatgtgt 5400

gttgtttaaa ataaaatcaa gaaagagaga 5430

<210> 37

<211> 89

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 37

Met Gly Ile Leu Lys Leu Gln Val Phe Leu Ile Val Leu Ser Val Ala

1 5 10 15

Leu Asn His Leu Lys Ala Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys

20 25 30

Arg Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe

35 40 45

Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn

50 55 60

Val Gly Ser Asn Thr Tyr Gly Lys Arg Asn Ala Val Glu Val Leu Lys

65 70 75 80

Arg Glu Pro Leu Asn Tyr Leu Pro Leu

85

<210> 38

<211> 267

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(267)

<400> 38

atg ggc atc ctg aag ctg caa gta ttt ctc att gtg ctc tct gtt gca 48

Met Gly Ile Leu Lys Leu Gln Val Phe Leu Ile Val Leu Ser Val Ala

1 5 10 15

ttg aac cat ctg aaa gct aca ccc att gaa agt cat cag gtg gaa aag 96

Leu Asn His Leu Lys Ala Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys

20 25 30

cgg aaa tgc aac act gcc aca tgt gca acg cag cgc ctg gca aat ttt 144

Arg Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe

35 40 45

tta gtt cat tcc agc aac aac ttt ggt gcc att ctc tca tct acc aac 192

Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn

50 55 60

gtg gga tcc aat aca tat ggc aag agg aat gca gta gag gtt tta aag 240

Val Gly Ser Asn Thr Tyr Gly Lys Arg Asn Ala Val Glu Val Leu Lys

65 70 75 80

aga gag cca ctg aat tac ttg ccc ctt 267

Arg Glu Pro Leu Asn Tyr Leu Pro Leu

85

<210> 39

<211> 470

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 39

Met Ser His His Pro Ser Gly Leu Arg Ala Gly Phe Ser Ser Thr Ser

1 5 10 15

Tyr Arg Arg Thr Phe Gly Pro Pro Pro Ser Leu Ser Pro Gly Ala Phe

20 25 30

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Arg Phe Ser Ser Ser Arg Leu Leu Gly Ser

35 40 45

Ala Ser Pro Ser Ser Ser Val Arg Leu Gly Ser Phe Arg Ser Pro Arg

50 55 60

Ala Gly Ala Gly Ala Leu Leu Arg Leu Pro Ser Glu Arg Leu Asp Phe

65 70 75 80

Ser Met Ala Glu Ala Leu Asn Gln Glu Phe Leu Ala Thr Arg Ser Asn

85 90 95

Glu Lys Gln Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Phe Ile

100 105 110

Glu Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Ala Ala Leu Arg Gly Glu

115 120 125

Leu Ser Gln Ala Arg Gly Gln Glu Pro Ala Arg Ala Asp Gln Leu Cys

130 135 140

Gln Gln Glu Leu Arg Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Gly Arg

145 150 155 160

Glu Arg Asp Arg Val Gln Val Glu Arg Asp Gly Leu Ala Glu Asp Leu

165 170 175

Ala Ala Leu Lys Gln Arg Leu Glu Glu Glu Thr Arg Lys Arg Glu Asp

180 185 190

Ala Glu His Asn Leu Val Leu Phe Arg Lys Asp Val Asp Asp Ala Thr

195 200 205

Leu Ser Arg Leu Glu Leu Glu Arg Lys Ile Glu Ser Leu Met Asp Glu

210 215 220

Ile Glu Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu Glu Leu Arg Asp Leu Gln

225 230 235 240

Val Ser Val Glu Ser Gln Gln Val Gln Gln Val Glu Val Glu Ala Thr

245 250 255

Val Lys Pro Glu Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ile Arg Ala Gln Tyr

260 265 270

Glu Ser Ile Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu Glu Trp Tyr Lys

275 280 285

Ser Lys Tyr Ala Asp Leu Ser Asp Ala Ala Asn Arg Asn His Glu Ala

290 295 300

Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Met Asn Glu Ser Arg Arg Gln Ile Gln

305 310 315 320

Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Gly Leu Arg Gly Thr Asn Glu Ala Leu

325 330 335

Leu Arg Gln Leu Arg Glu Leu Glu Glu Gln Phe Ala Leu Glu Ala Gly

340 345 350

Gly Tyr Gln Ala Gly Ala Ala Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Gln Leu

355 360 365

Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asn

370 375 380

Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu

385 390 395 400

Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Val Pro Val His Ser Phe Ala Ser

405 410 415

Leu Asn Ile Lys Thr Thr Val Pro Glu Val Glu Pro Pro Gln Asp Ser

420 425 430

His Ser Arg Lys Thr Val Leu Ile Lys Thr Ile Glu Thr Arg Asn Gly

435 440 445

Glu Val Val Thr Glu Ser Gln Lys Glu Gln Arg Ser Glu Leu Asp Lys

450 455 460

Ser Ser Ala His Ser Tyr

465 470

<210> 40

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(1410)

<400> 40

atg agc cac cac ccg tcg ggc ctc cgg gcc ggc ttc agc tcc acc tca 48

Met Ser His His Pro Ser Gly Leu Arg Ala Gly Phe Ser Ser Thr Ser

1 5 10 15

tac cgc cgt acc ttc ggt cca ccg ccc tca cta tcc ccc ggg gcc ttc 96

Tyr Arg Arg Thr Phe Gly Pro Pro Pro Ser Leu Ser Pro Gly Ala Phe

20 25 30

tcc tac tcg tcc agc tcc cgc ttc tcc agc agc cgc ctg ctg ggc tcc 144

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Arg Phe Ser Ser Ser Arg Leu Leu Gly Ser

35 40 45

gcg tcc ccg agc tcc tcg gtg cgc ctg ggc agc ttc cgt agc ccc cga 192

Ala Ser Pro Ser Ser Ser Val Arg Leu Gly Ser Phe Arg Ser Pro Arg

50 55 60

gcg gga gcg ggc gcc ctc ctg cgc ctg ccc tcg gag cgc ctc gac ttc 240

Ala Gly Ala Gly Ala Leu Leu Arg Leu Pro Ser Glu Arg Leu Asp Phe

65 70 75 80

tcc atg gcc gag gcc ctc aac cag gag ttc ctg gcc acg cgc agc aac 288

Ser Met Ala Glu Ala Leu Asn Gln Glu Phe Leu Ala Thr Arg Ser Asn

85 90 95

gag aag cag gag ctg cag gag ctc aac gac cgc ttc gcc aac ttc atc 336

Glu Lys Gln Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Phe Ile

100 105 110

gag aag gta cgc ttt ctg gag cag cag aac gcg gcc ctg cgc ggg gag 384

Glu Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Ala Ala Leu Arg Gly Glu

115 120 125

ctg agc caa gcc cgg ggc cag gag ccg gcg cgc gcc gac cag ctg tgc 432

Leu Ser Gln Ala Arg Gly Gln Glu Pro Ala Arg Ala Asp Gln Leu Cys

130 135 140

cag cag gag ctg cgc gag ctg cgg cga gag ctg gag ctg ttg ggc cgc 480

Gln Gln Glu Leu Arg Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Gly Arg

145 150 155 160

gag cgt gac cgg gtg cag gtg gag cgc gac ggg ctg gcg gag gac ctg 528

Glu Arg Asp Arg Val Gln Val Glu Arg Asp Gly Leu Ala Glu Asp Leu

165 170 175

gcg gcg ctc aag cag agg ttg gag gag gag acg cgc aag cgg gag gac 576

Ala Ala Leu Lys Gln Arg Leu Glu Glu Glu Thr Arg Lys Arg Glu Asp

180 185 190

gcg gag cac aac ctc gtg ctc ttc cgc aag gac gtg gac gat gcc act 624

Ala Glu His Asn Leu Val Leu Phe Arg Lys Asp Val Asp Asp Ala Thr

195 200 205

ctg tcc cgc ctg gaa cta gag cgc aag att gag tct ctg atg gat gag 672

Leu Ser Arg Leu Glu Leu Glu Arg Lys Ile Glu Ser Leu Met Asp Glu

210 215 220

att gag ttc ctc aag aag ctg cac gag gag gag ctg cga gac ctg cag 720

Ile Glu Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu Glu Leu Arg Asp Leu Gln

225 230 235 240

gtg agt gtg gag agc cag cag gtg cag cag gtg gag gtg gaa gcc acg 768

Val Ser Val Glu Ser Gln Gln Val Gln Gln Val Glu Val Glu Ala Thr

245 250 255

gtg aag ccc gag ctg acg gca gcg ctg agg gac atc cgc gcg cag tac 816

Val Lys Pro Glu Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ile Arg Ala Gln Tyr

260 265 270

gag agc atc gcc gcg aag aac ctg cag gag gcg gag gag tgg tac aag 864

Glu Ser Ile Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu Glu Trp Tyr Lys

275 280 285

tcc aag tac gcg gac ctg tcc gac gct gcc aac cgg aac cac gag gcc 912

Ser Lys Tyr Ala Asp Leu Ser Asp Ala Ala Asn Arg Asn His Glu Ala

290 295 300

ctg cgc cag gcc aag cag gag atg aac gag tcc cga cgc cag atc cag 960

Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Met Asn Glu Ser Arg Arg Gln Ile Gln

305 310 315 320

agt cta acg tgc gag gtg gac ggg ctg cgc ggc acg aac gag gcg ctg 1008

Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Gly Leu Arg Gly Thr Asn Glu Ala Leu

325 330 335

ctc agg cag ttg aga gag ctg gag gag cag ttc gcc ctg gag gcg ggg 1056

Leu Arg Gln Leu Arg Glu Leu Glu Glu Gln Phe Ala Leu Glu Ala Gly

340 345 350

ggc tac cag gcg ggc gct gcg cgg ctc gag gag gag ctg cga cag cta 1104

Gly Tyr Gln Ala Gly Ala Ala Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Gln Leu

355 360 365

aaa gag gag atg gcg cgg cac ctg agg gag tac cag gag ctc ctc aac 1152

Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asn

370 375 380

gtc aag atg gcc ctg gac atc gag atc gcc acc tac cgc aag ctg ctg 1200

Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu

385 390 395 400

gag ggc gag gag agc cgg atc tcc gtg ccc gtc cat tct ttt gcc tcc 1248

Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Val Pro Val His Ser Phe Ala Ser

405 410 415

tta aat ata aag acg act gtg cct gag gtg gag cct ccc cag gac agc 1296

Leu Asn Ile Lys Thr Thr Val Pro Glu Val Glu Pro Pro Gln Asp Ser

420 425 430

cac agc cgg aag acg gtt ctg atc aag acc att gag acc cgg aat ggg 1344

His Ser Arg Lys Thr Val Leu Ile Lys Thr Ile Glu Thr Arg Asn Gly

435 440 445

gag gtg gtg aca gag tcc cag aag gag cag cgc agt gag ctg gac aag 1392

Glu Val Val Thr Glu Ser Gln Lys Glu Gln Arg Ser Glu Leu Asp Lys

450 455 460

tct tct gcc cac agt tac taa 1413

Ser Ser Ala His Ser Tyr

465 470

<210> 41

<211> 1833

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 41

cctcgcagcg gtctgcggct ccttcccagc ccccggccta gctctgcgaa cggtgactgc 60

ccatccttgg ccgcaatgag ccaccacccg tcgggcctcc gggccggctt cagctccacc 120

tcataccgcc gtaccttcgg tccaccgccc tcactatccc ccggggcctt ctcctactcg 180

tccagctccc gcttctccag cagccgcctg ctgggctccg cgtccccgag ctcctcggtg 240

cgcctgggca gcttccgtag cccccgagcg ggagcgggcg ccctcctgcg cctgccctcg 300

gagcgcctcg acttctccat ggccgaggcc ctcaaccagg agttcctggc cacgcgcagc 360

aacgagaagc aggagctgca ggagctcaac gaccgcttcg ccaacttcat cgagaaggta 420

cgctttctgg agcagcagaa cgcggccctg cgcggggagc tgagccaagc ccggggccag 480

gagccggcgc gcgccgacca gctgtgccag caggagctgc gcgagctgcg gcgagagctg 540

gagctgttgg gccgcgagcg tgaccgggtg caggtggagc gcgacgggct ggcggaggac 600

ctggcggcgc tcaagcagag gttggaggag gagacgcgca agcgggagga cgcggagcac 660

aacctcgtgc tcttccgcaa ggacgtggac gatgccactc tgtcccgcct ggaactagag 720

cgcaagattg agtctctgat ggatgagatt gagttcctca agaagctgca cgaggaggag 780

ctgcgagacc tgcaggtgag tgtggagagc cagcaggtgc agcaggtgga ggtggaagcc 840

acggtgaagc ccgagctgac ggcagcgctg agggacatcc gcgcgcagta cgagagcatc 900

gccgcgaaga acctgcagga ggcggaggag tggtacaagt ccaagtacgc ggacctgtcc 960

gacgctgcca accggaacca cgaggccctg cgccaggcca agcaggagat gaacgagtcc 1020

cgacgccaga tccagagtct aacgtgcgag gtggacgggc tgcgcggcac gaacgaggcg 1080

ctgctcaggc agttgagaga gctggaggag cagttcgccc tggaggcggg gggctaccag 1140

gcgggcgctg cgcggctcga ggaggagctg cgacagctaa aagaggagat ggcgcggcac 1200

ctgagggagt accaggagct cctcaacgtc aagatggccc tggacatcga gatcgccacc 1260

taccgcaagc tgctggaggg cgaggagagc cggatctccg tgcccgtcca ttcttttgcc 1320

tccttaaata taaagacgac tgtgcctgag gtggagcctc cccaggacag ccacagccgg 1380

aagacggttc tgatcaagac cattgagacc cggaatgggg aggtggtgac agagtcccag 1440

aaggagcagc gcagtgagct ggacaagtct tctgcccaca gttactgaac cccttggtcc 1500

ggagccttga ctctgcccta ggcctgctca aagcccaaac cctaagacca ctcctgaatt 1560

gtctcctctc cctctgcatg tgtctaaaag gtggtaccag gcatcccttt cctggcttat 1620

ggccaagccc tacccggcca gcagtcgctg ggcctctccc tgccctgaca cttgatgtga 1680

cctatgtgct tcccttttca tgtcccgata agaagccaat gatcccccct caggacaaat 1740

ctactccagc cacgatgaga agtgggtgag ccagggtctg agtttcacat ttgaaccaaa 1800

taaaatgctg tcaagagaaa actctccagt gca 1833

<210> 42

<211> 1949

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 42

tgttccgcag gggtggggca tccccctccc catacaaccc ccctccagcg ggccatcagg 60

ccagtgggag gagctgcccg tgccccccct gagaccgcag ggctataaag ccgcctcgca 120

gcggtctgcg gctccttccc agcccccggc ctagctctgc gaacggtgac tgcccatcct 180

tggccgcaat gagccaccac ccgtcgggcc tccgggccgg cttcagctcc acctcatacc 240

gccgtacctt cggtccaccg ccctcactat cccccggggc cttctcctac tcgtccagct 300

cccgcttctc cagcagccgc ctgctgggct ccgcgtcccc gagctcctcg gtgcgcctgg 360

gcagcttccg tagcccccga gcgggagcgg gcgccctcct gcgcctgccc tcggagcgcc 420

tcgacttctc catggccgag gccctcaacc aggagttcct ggccacgcgc agcaacgaga 480

agcaggagct gcaggagctc aacgaccgct tcgccaactt catcgagaag gtacgctttc 540

tggagcagca gaacgcggcc ctgcgcgggg agctgagcca agcccggggc caggagccgg 600

cgcgcgccga ccagctgtgc cagcaggagc tgcgcgagct gcggcgagag ctggagctgt 660

tgggccgcga gcgtgaccgg gtgcaggtgg agcgcgacgg gctggcggag gacctggcgg 720

cgctcaagca gaggttggag gaggagacgc gcaagcggga ggacgcggag cacaacctcg 780

tgctcttccg caaggacgtg gacgatgcca ctctgtcccg cctggaacta gagcgcaaga 840

ttgagtctct gatggatgag attgagttcc tcaagaagct gcacgaggag gagctgcgag 900

acctgcaggt gagtgtggag agccagcagg tgcagcaggt ggaggtggaa gccacggtga 960

agcccgagct gacggcagcg ctgagggaca tccgcgcgca gtacgagagc atcgccgcga 1020

agaacctgca ggaggcggag gagtggtaca agtccaagta cgcggacctg tccgacgctg 1080

ccaaccggaa ccacgaggcc ctgcgccagg ccaagcagga gatgaacgag tcccgacgcc 1140

agatccagag tctaacgtgc gaggtggacg ggctgcgcgg cacgaacgag gcgctgctca 1200

ggcagttgag agagctggag gagcagttcg ccctggaggc ggggggctac caggcgggcg 1260

ctgcgcggct cgaggaggag ctgcgacagc taaaagagga gatggcgcgg cacctgaggg 1320

agtaccagga gctcctcaac gtcaagatgg ccctggacat cgagatcgcc acctaccgca 1380

agctgctgga gggcgaggag agccggatct ccgtgcccgt ccattctttt gcctccttaa 1440

atataaagac gactgtgcct gaggtggagc ctccccagga cagccacagc cggaagacgg 1500

ttctgatcaa gaccattgag acccggaatg gggagcaggt ggtgacagag tcccagaagg 1560

agcagcgcag tgagctggac aagtcttctg cccacagtta ctgaacccct tggtccggag 1620

ccttgactct gccctaggcc tgctcaaagc ccaaacccta agaccactcc tgaattgtct 1680

cctctccctc tgcatgtgtc taaaaggtgg taccaggcat ccctttcctg gcttatggcc 1740

aagccctacc cggccagcag tcgctgggcc tctccctgcc ctgacacttg atgtgaccta 1800

tgtgcttccc ttttcatgtc ccgataagaa gccaatgatc ccccctcagg acaaatctac 1860

tccagccacg atgagaagtg ggtgagccag ggtctgagtt tcacatttga accaaataaa 1920

atgctgtcaa gagaaaactc tccagtgca 1949

<210> 43

<211> 1628

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 43

tgttccgcag gggtggggca tccccctccc catacaaccc ccctccagcg ggccatcagg 60

ccagtgggag gagctgcccg tgccccccct gagaccgcag ggctataaag ccgcctcgca 120

gcggtctgcg gctccttccc agcccccggc ctagctctgc gaacggtgac tgcccatcct 180

tggccgcaat gagccaccac ccgtcgggcc tccgggccgg cttcagctcc acctcatacc 240

gccgtacctt cggtccaccg ccctcactat cccccggggc cttctcctac tcgtccagct 300

cccgcttctc cagcagccgc ctgctgggct ccgcgtcccc gagctcctcg gtgcgcctgg 360

gcagcttccg tagcccccga gcgggagcgg gcgccctcct gcgcctgccc tcggagcgcc 420

tcgacttctc catggccgag gccctcaacc aggagttcct ggccacgcgc agcaacgaga 480

agcaggagct gcaggagctc aacgaccgct tcgccaactt catcgagaag gtacgctttc 540

tggagcagca gaacgcggcc ctgcgcgggg agctgagcca agcccggggc caggagccgg 600

cgcgcgccga ccagctgtgc cagcaggagc tgcgcgagct gcggcgagag ctggagctgt 660

tgggccgcga gcgtgaccgg gtgcaggtgg agcgcgacgg gctggcggag gacctggcgg 720

cgctcaagca gaggtcaggg ggcagggctg ggccgctgcc gtcgaggcga ggtcgaagcg 780

gccgtcgagg cggctgctct tgcctcccct cgcttcccct ctccatcagc agcccaaggg 840

tgtggctccc cttaccaacc caggttggag gaggagacgc gcaagcggga ggacgcggag 900

cacaacctcg tgctcttccg caaggacgtg gacgatgcca ctctgtcccg cctggaacta 960

gagcgcaaga ttgagtctct gatggatgag attgagttcc tcaagaagct gcacgaggag 1020

gagctgcgag acctgcaggt gagtgtggag agccagcagg tgcagcaggt ggaggtggaa 1080

gccacggtga agcccgagct gacggcagcg ctgagggaca tccgcgcgca gtacgagagc 1140

atcgccgcga agaacctgca ggaggcggag gagtggtaca agtccaagta cgcggacctg 1200

tccgacgctg ccaaccggaa ccacgaggcc ctgcgccagg ccaagcagga gatgaacgag 1260

tcccgacgcc agatccagag tctaacgtgc gaggtggacg ggctgcgcgg cacgaacgag 1320

gcgctgctca ggcagttgag agagctggag gagcagttcg ccctggaggc ggggggctac 1380

caggcgggcg ctgcgcggct cgaggaggag ctgcgacagc taaaagagga gatggcgcgg 1440

cacctgaggg agtaccagga gctcctcaac gtcaagatgg ccctggacat cgagatcgcc 1500

acctaccgca agctgctgga gggcgaggag agccggatct ccgtgcccgt ccattctttt 1560

gcctccttaa atataaagac gactgtgcct gaggtggagc ctccccagga cagccacagc 1620

cggaagac 1628

<210> 44

<211> 653

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala

1 5 10 15

Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly

20 25 30

Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly

35 40 45

Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser

50 55 60

Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala

65 70 75 80

Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys

85 90 95

Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile

100 105 110

Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile

115 120 125

Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu

130 135 140

Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe

165 170 175

Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly

180 185 190

Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala

195 200 205

Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp

210 215 220

Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly

225 230 235 240

Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu

245 250 255

Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys

260 265 270

Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu

275 280 285

Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala

290 295 300

Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr

305 310 315 320

Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser

325 330 335

Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys

340 345 350

Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro

355 360 365

Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser

370 375 380

Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln

385 390 395 400

Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu

405 410 415

His Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met

420 425 430

Thr Lys Leu Ile Pro Ser Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Asn Ser Gln

435 440 445

Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val

450 455 460

Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr

465 470 475 480

Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile

485 490 495

Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala

500 505 510

Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp

515 520 525

Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala

530 535 540

Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr

545 550 555 560

Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly

565 570 575

Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr

580 585 590

Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln

595 600 605

Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu

610 615 620

Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro

625 630 635 640

Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu

645 650

<210> 45

<211> 1962

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<212> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(1959)

<400> 45

atg aag ctc tcc ctg gtg gcc gcg atg ctg ctg ctg ctc agc gcg gcg 48

Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala

1 5 10 15

cgg gcc gag gag gag gac aag aag gag gac gtg ggc acg gtg gtc ggc 96

Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly

20 25 30

atc gac ttg ggg acc acc tac tcc tgc gtc ggc gtg ttc aag aac ggc 144

Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly

35 40 45

cgc gtg gag atc atc gcc aac gat cag ggc aac cgc atc acg ccg tcc 192

Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser

50 55 60

tat gtc gcc ttc act cct gaa ggg gaa cgt ctg att ggc gat gcc gcc 240

Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala

65 70 75 80

aag aac cag ctc acc tcc aac ccc gag aac acg gtc ttt gac gcc aag 288

Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys

85 90 95

cgg ctc atc ggc cgc acg tgg aat gac ccg tct gtg cag cag gac atc 336

Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile

100 105 110

aag ttc ttg ccg ttc aag gtg gtt gaa aag aaa act aaa cca tac att 384

Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile

115 120 125

caa gtt gat att gga ggt ggg caa aca aag aca ttt gct cct gaa gaa 432

Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu

130 135 140

att tct gcc atg gtt ctc act aaa atg aaa gaa acc gct gag gct tat 480

Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr

145 150 155 160

ttg gga aag aag gtt acc cat gca gtt gtt act gta cca gcc tat ttt 528

Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe

165 170 175

aat gat gcc caa cgc caa gca acc aaa gac gct gga act att gct ggc 576

Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly

180 185 190

cta aat gtt atg agg atc atc aac gag cct acg gca gct gct att gct 624

Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala

195 200 205

tat ggc ctg gat aag agg gag ggg gag aag aac atc ctg gtg ttt gac 672

Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp

210 215 220

ctg ggt ggc gga acc ttc gat gtg tct ctt ctc acc att gac aat ggt 720

Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly

225 230 235 240

gtc ttc gaa gtt gtg gcc act aat gga gat act cat ctg ggt gga gaa 768

Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu

245 250 255

gac ttt gac cag cgt gtc atg gaa cac ttc atc aaa ctg tac aaa aag 816

Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys

260 265 270

aag acg ggc aaa gat gtc agg aag gac aat aga gct gtg cag aaa ctc 864

Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu

275 280 285

cgg cgc gag gta gaa aag gcc aag gcc ctg tct tct cag cat caa gca 912

Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala

290 295 300

aga att gaa att gag tcc ttc tat gaa gga gaa gac ttt tct gag acc 960

Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr

305 310 315 320

ctg act cgg gcc aaa ttt gaa gag ctc aac atg gat ctg ttc cgg tct 1008

Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser

325 330 335

act atg aag ccc gtc cag aaa gtg ttg gaa gat tct gat ttg aag aag 1056

Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys

340 345 350

tct gat att gat gaa att gtt ctt gtt ggt ggc tcg act cga att cca 1104

Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro

355 360 365

aag att cag caa ctg gtt aaa gag ttc ttc aat ggc aag gaa cca tcc 1152

Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser

370 375 380

cgt ggc ata aac cca gat gaa gct gta gcg tat ggt gct gct gtc cag 1200

Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln

385 390 395 400

gct ggt gtg ctc tct ggt gat caa gat aca ggt gac ctg gta ctg ctt 1248

Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu

405 410 415

cat gta tgt ccc ctt aca ctt ggt att gaa act gta gga ggt gtc atg 1296

His Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met

420 425 430

acc aaa ctg att cca agt aat aca gtg gtg cct acc aag aac tct cag 1344

Thr Lys Leu Ile Pro Ser Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Asn Ser Gln

435 440 445

atc ttt tct aca gct tct gat aat caa cca act gtt aca atc aag gtc 1392

Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val

450 455 460

tat gaa ggt gaa aga ccc ctg aca aaa gac aat cat ctt ctg ggt aca 1440

Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr

465 470 475 480

ttt gat ctg act gga att cct cct gct cct cgt ggg gtc cca cag att 1488

Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile

485 490 495

gaa gtc acc ttt gag ata gat gtg aat ggt att ctt cga gtg aca gct 1536

Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala

500 505 510

gaa gac aag ggt aca ggg aac aaa aat aag atc aca atc acc aat gac 1584

Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp

515 520 525

cag aat cgc ctg aca cct gaa gaa atc gaa agg atg gtt aat gat gct 1632

Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala

530 535 540

gag aag ttt gct gag gaa gac aaa aag ctc aag gag cgc att gat act 1680

Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr

545 550 555 560

aga aat gag ttg gaa agc tat gcc tat tct cta aag aat cag att gga 1728

Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly

565 570 575

gat aaa gaa aag ctg gga ggt aaa ctt tcc tct gaa gat aag gag acc 1776

Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr

580 585 590

atg gaa aaa gct gta gaa gaa aag att gaa tgg ctg gaa agc cac caa 1824

Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln

595 600 605

gat gct gac att gaa gac ttc aaa gct aag aag aag gaa ctg gaa gaa 1872

Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu

610 615 620

att gtt caa cca att atc agc aaa ctc tat gga agt gca ggc cct ccc 1920

Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro

625 630 635 640

cca act ggt gaa gag gat aca gca gaa aaa gat gag ttg tag 1962

Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu

645 650

<210> 46

<211> 700

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

полинуклеотид"

<400> 46

aactgaagat tcaacaatct cagacatcgc tgttgcaact aacgctggtc aaatcaaaac 60

tggttcactt tcacgtacag accgtatggc taaatacaac caattgcttc gtattgaaga 120

ccaattggct gaagttgctc aatacaaagg tcttaaagca ttctacaacc ttaaaaaata 180

aggaggaaaa aatgaaaaaa aagattatct cagctatttt aatgtctaca gtgatacttt 240

ctgctgcagc cccgttgtca ggtgtttacg ccgctccaac ttcatcatca actaaaaaaa 300

ctcaattgca acttgaacac ttgcttttgg atcttcaaat gatcttgaac ggtatcaaca 360

actacaaaaa cccaaaactt actcgtatgt tgacttttaa attttacatg ccaaaaaaag 420

ctactgaact taaacacttg caatgtcttg aagaagaatt gaaaccactt gaagaagttt 480

tgaaccttgc tcaatcaaaa aactttcact tgcgtccacg tgatcttatc tcaaacatca 540

acgttatcgt tttggaactt aaaggttcag aaactacttt tatgtgtgaa tacgctgatg 600

aaactgctac tatcgttgaa tttttgaacc gttggatcac tttttgtcaa tcaatcatct 660

caactttgac ttaaggttta gatggtttta attagcaata 700

<210> 47

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 47

aatccaatga cggcacttct tc 22

<210> 48

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 48

cttgtcgtta aagcctattc 20

<210> 49

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 49

cgtaaccatg taaaagcact tctg 24

<210> 50

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 50

gtaattctaa tgctggtggg 20

<210> 51

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 51

attacgccat ctaaatcaaa c 21

<210> 52

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 52

catcgctgaa gctatcatcg 20

<210> 53

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 53

gatggctgaa gctccaactc 20

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 54

gcatggaaga ggacaaagag 20

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 55

aacctgtggg agggcgaaag 20

<210> 56

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 56

tgggtcgtga atacttcc 18

<210> 57

<211> 500

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

полинуклеотид"

<400> 57

tcagctaacg gagctcaact tgttaaaact gtatcttggt acgataacga aatgtcatac 60

acttcaaacc ttgttcgtac acttgcatac ttcgctaaaa tcgctaaata aggaggaaaa 120

aatgaagaag aaaatcatta gtgccatctt aatgtctaca gtgattcttt cagctgcagc 180

tcctttatca ggcgtttatg catttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga 240

agctctctac ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga 300

ggcagaggac ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct 360

gcagcccttg gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac 420

cagcatctgc tccctctacc agctggagaa ctactgcaac taattttccg attttaacgg 480

tataaaaacc agtcttcggg 500

<210> 58

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 58

aaccgctttc agaagaaggg 20

<210> 59

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 59

caccgaatta acacgcatta tgactt 26

<210> 60

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 60

tttcgctggg aaagcacac 19

<210> 61

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтезированный

олигонуклеотид"

<400> 61

gcgtgtccaa gcaatagatg 20

<---

1. Молочнокислая бактерия (LAB) для лечения сахарного диабета 1-го типа (T1D) посредством доставки в слизистую оболочку полипептида интерлейкина-2 (IL-2) и полипептида T1D-специфического антигена, где указанная LAB содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид IL-2, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид T1D-специфического антигена, при этом указанная LAB способна продуцировать указанный полипептид IL-2 и указанный полипептид T1D-специфического антигена, причём указанный полипептид T1D-специфического антигена представляет собой: проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), инсулинома-ассоциированный белок 2 (IA-2), каталитическую субъединицу связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), транспортер цинка 8 (ZnT8), хромогранин A, (препро) островковый амилоидный полипептид (ppIAPP), периферин или цитруллинированный глюкозорегулируемый белок (GRP).

2. LAB по п. 1, отличающаяся тем, что указанная LAB принадлежит к виду Lactococcus, виду Lactobacillus, виду Bifidobacterium, виду Streptococcus или виду Enterococcus.

3. LAB по п. 2, отличающаяся тем, что указанная LAB представляет собой вид Lactococcus.

4. LAB по п. 3, отличающаяся тем, что указанная LAB представляет собой Lactococcus lactis.

5. LAB по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанный полипептид T1D-специфического антигена представляет собой PINS.

6. LAB по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид специфического антигена сахарного диабета 1-го типа (T1D), содержит в направлении от 5’ к 3’ промотор gapB (PgapB), gapB и лидер секреции usp45, транскрипционно- и трансляционно-связанные с pins.

7. LAB по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид IL-2, включает в себя в направлении от 5’ к 3’ промотор eno (Peno) и лидер секреции usp45, транскрипционно- и трансляционно-связанные с последовательностью, кодирующей полипептид IL-2.

8. LAB по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что указанная LAB дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих генетических модификаций:

а) инактивацию thyA;

b) инактивацию trePP;

c) инактивацию ptcC;

d) встраивание экзогенного otsB; и

e) экспрессию ptsI и ptsII под контролем конститутивного промотора.

9. LAB по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что указанная LAB представляет собой Lactoccus lactis и дополнительно содержит следующие генетические модификации:

а) удаление thyA;

b) удаление trePP;

c) нарушение ptcC;

d) встраивание и экспрессию экзогенного otsB; и

e) экспрессию ptsI и ptsII под контролем конститутивного промотора.

10. LAB по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена, интегрированы в хромосому указанной LAB.

11. LAB по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид IL-2, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид T1D-специфического антигена, каждая являются частью полицистронной единицы экспрессии.

12. LAB по любому из пп. 1-11, отличающаяся тем, что указанный полипептид IL-2 секретируется.

13. LAB по любому из пп. 1-12, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид IL-2, кодирует вариант полипептида IL-2.

14. LAB по любому из пп. 1-13, отличающаяся тем, что указанная LAB обеспечивает доставку указанного IL-2 и указанного полипептида специфического антигена сахарного диабета 1-го типа (T1D) в слизистую оболочку при введении указанной композиции в организм субъекта-млекопитающего.

15. Композиция для лечения сахарного диабета 1-го типа (T1D) посредством доставки в слизистую оболочку полипептида интерлейкина-2 (IL-2) и полипептида T1D-специфического антигена, содержащая в эффективном количестве:

(а) первую LAB, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид IL-2 и способную продуцировать указанный полипептид IL-2, и

(б) вторую LAB, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид T1D-специфического антигена и способную продуцировать указанный полипептид T1D-специфического антигена, причём указанный полипептид T1D-специфического антигена представляет собой: проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), инсулинома-ассоциированный белок 2 (IA-2), каталитическую субъединицу связанного белка островково-специфической глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), транспортер цинка 8 (ZnT8), хромогранин A, (препро) островковый амилоидный полипептид (ppIAPP), периферин или цитруллинированный глюкозорегулируемый белок (GRP).

16. Композиция по п. 15, отличающаяся тем, что указанная LAB принадлежит к виду Lactococcus, виду Lactobacillus, виду Bifidobacterium, виду Streptococcus или виду Enterococcus.

17. Композиция по п. 16, отличающаяся тем, что указанная LAB представляет собой вид Lactococcus.

18. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что указанная LAB представляет собой Lactococcus lactis.

19. Композиция по любому из пп. 15-18, отличающаяся тем, что указанный полипептид T1D-специфического антигена представляет собой PINS.

20. Композиция по любому из пп. 15-19, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид специфического антигена сахарного диабета 1-го типа (T1D), содержит в направлении от 5’ к 3’ промотор gapB (PgapB), gapB и лидер секреции usp45, транскрипционно- и трансляционно-связанные с pins.

21. Композиция по любому из пп. 15-20, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, включает в себя в направлении от 5’ к 3’ промотор eno (Peno) и лидер секреции usp45, транскрипционно- и трансляционно-связанные с последовательностью, кодирующей полипептид IL-2.

22. Композиция по любому из пп. 15-21, отличающаяся тем, что указанная LAB дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих генетических модификаций:

а) инактивацию thyA;

b) инактивацию trePP;

c) инактивацию ptcC;

d) встраивание экзогенного otsB; и

e) экспрессию ptsI и ptsII под контролем конститутивного промотора.

23. Композиция по любому из пп. 15-22, отличающаяся тем, что указанная LAB представляет собой Lactoccus lactis и дополнительно содержит следующие генетические модификации:

а) удаление thyA;

b) удаление trePP;

c) нарушение ptcC;

d) встраивание и экспрессию экзогенного otsB; и

e) экспрессию ptsI и ptsII под контролем конститутивного промотора.

24. Композиция по любому из пп. 15-23, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид IL-2, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена, интегрированы в хромосому указанной LAB.

25. Композиция по любому из пп. 15-24, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид IL-2, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид T1D-специфического антигена, каждая являются частью полицистронной единицы экспрессии.

26. Композиция по любому из пп. 15-25, отличающаяся тем, что указанный полипептид IL-2 секретируется.

27. Композиция по любому из пп. 15-26, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид IL-2, кодирует вариант полипептида IL-2.

28. Композиция по любому из пп. 15-27, отличающаяся тем, что указанная LAB обеспечивает доставку указанного полипептида IL-2 и указанного полипептида специфического антигена сахарного диабета 1-го типа (T1D) в слизистую оболочку, при введении указанной композиции в организм субъекта-млекопитающего.

29. Фармацевтическая композиция для лечения сахарного диабета 1-го типа (T1D), содержащая (i) эффективное количество LAB по любому из пп. 1-14 и фармацевтически приемлемый носитель или (ii) эффективное количество композиции по любому из пп. 15-28 и фармацевтически приемлемый носитель.

30. Применение LAB по любому из пп. 1-14, композиции по любому из пп.15-28 или фармацевтической композиции по п. 29 для лечения сахарного диабета 1-го типа (T1D) у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в этом.

31. Способ лечения сахарного диабета 1-го типа (T1D) у нуждающегося в этом субъекта-млекопитающего, включающий:

пероральное введение указанному субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества LAB по любому из пп. 1-14, композиции по любому из пп.15-28 или фармацевтической композиции по п. 29.

32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанному субъекту не вводят антитело против CD3.

33. Способ по п. 31, дополнительно включающий введение указанному субъекту антитела против CD3.

34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанное антитело против CD3 вводят указанному субъекту одновременно с указанной LAB, указанной композицией или указанной фармацевтической композицией.

35. Способ по любому из пп. 31-34, отличающийся тем, что указанный субъект имеет концентрацию C-пептида в крови или моче, указывающую на остаточную функцию бета-клеток.

36. Способ по любому из пп. 31-35, отличающийся тем, что указанным субъектом является пациент, представляющий собой человека, имеющий концентрацию С-пептида в крови натощак от приблизительно 0,2 нмоль/л до приблизительно 1 нмоль/л или имеющий стимулированную концентрацию C-пептида в крови от приблизительно 0,5 нмоль/л до приблизительно 4 нмоль/л.

37. Способ по любому из пп. 31-36, отличающийся тем, что у указанного субъекта был диагностирован T1D в течение предшествующих 12 месяцев до введения указанной LAB, указанной композиции или указанной фармацевтической композиции.

38. Способ по любому из пп. 31-37, отличающийся тем, что указанную LAB, указанную композицию или указанную фармацевтическую композицию вводят в виде единичной лекарственной формы, содержащей от приблизительно 1 × 10⁴ до приблизительно 1 × 10¹²; от приблизительно 1 × 10⁶ до приблизительно 1 × 10¹² или от приблизительно 1 × 10⁹ до приблизительно 1 × 10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ).

39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанная единичная лекарственная форма представляет собой капсулу, таблетку, гранулу, суппозиторий или дозированный аэрозоль.

40. Способ по любому из пп. 31-39, отличающийся тем, что указанная LAB, указанная композиция или указанная фармацевтическая композиция находится в форме сухого порошка или его спрессованном варианте.