Индуктор иммунитета

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены композиции, имеющие индуцирующую иммунитет активность против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201, а также полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии опухолей, экспрессирующих белок PDS5A. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001]

Настоящее изобретение относится к новому иммунному индуктору, применимому в качестве активного ингредиента средства для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002]

Белок PDS5A (PDS5, регулятор поддержания когезии, гомолог A), также известный как SSC-112, представляет собой белок, идентифицированный как регулятор клеточного цикла, вовлеченный в распределение хромосом.

[0003]

Предполагалось, что белок PDS5A ассоциирован с развитием злокачественной опухоли. Например, в патентной литературе 1 описано, что экспрессия белка PDS5A выше в случае рака носоглотки, рака почек, рака печения и одного из типов злокачественных клеток молочной железы, по сравнению с нормальной тканью. Кроме того, в патентной литературе 1 также описано, что пролиферация злокачественных клеток может быть ингибирована в результате подавления экспрессии белка PDS5A в злокачественных клетках с использованием антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозима или ми-РНК против гена PDS5A или антитела против белка PDS5A, и что можно индуцировать апоптоз в злокачественных клетках посредством введения полноразмерного белка PDS5A или неполного пептида данного белка.

[0004]

В патентной литературе 2 описано, что белок PDS5A, который связывается с HLA-A0201, который является подтипом молекул MHC класса I, и его неполные пептиды обладают индуцирующей иммунитет активностью против злокачественных клеток, и поэтому применимы для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли. Однако в патентной литературе 2 не раскрыты все пептиды, которые связываются с HLA-A0201, нет информации о пептидах, которые связываются с другими подтипами, отличными от HLA-A0201.

Список литературы

Патентная литература

[0005]

Патентная литература 1: WO 2002/081641.

Патентная литература 2: WO 2011/027807.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

[0006]

Целью настоящего изобретения является обнаружение нового полипептида, применимого в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли, и обеспечение применения полипептида в качестве индуктора иммунитета.

[0007]

Другой целью настоящего изобретения является получение изолированной антигенпрезентирующей клетки, содержащей комплекс полипептида и молекулы HLA, и изолированной T-клетки, которая избирательно связывается с комплексом полипептида и молекулы HLA, а также содержащего их средства для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

Решение проблемы

[0008]

В результате интенсивного исследования авторы настоящего изобретения обнаружили, что белок PDS5A человека, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 2, специфично экспрессируется в тканях или клетках лейкоза, злокачественной лимфомы, рака молочной железы, рака печени, рака простаты, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака почки, рака прямой и ободочной кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака пищевода и рака легкого. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что неполный пептид, присутствующий в специфичной области белка PDS5A, обладает способностью (индуцирующей иммунитет активностью) активировать и способствовать размножению T-клеток, специфичных для полипептида посредством презентации антигенпрезентирующими клетками, и что индуцирующая иммунитет активность применима для лечения или профилактики злокачественной опухоли. На основании таких данных авторы настоящего изобретения обнаружили, что полипептид можно применять в качестве активного ингредиента для индуктора иммунитета, предназначенного для лечения или профилактики злокачественной опухоли, и что антигенпрезентирующие клетки, которые контактировали с пептидом, и T-клетки, которые контактировали с антигенпрезентирующими клетками, также применимы для лечения или профилактики злокачественной опухоли, таким образом осуществив настоящее изобретение.

[0009]

В частности, настоящее изобретение имеет следующие характерные признаки (1)-(14).

(1) Индуктор иммунитета содержащий в качестве активного ингредиента следующее (i) или (ii):

[0010]

(i) по меньшей мере, один полипептид, обладающие индуцирующей иммунитет активностью и выбранный из группы полипептидов (a) или (b), указанных ниже:

(a) полипептидов, содержащих семь или больше непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 и положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(b) полипептидов, содержащих от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a);

(ii) рекомбинантный вектор, содержащий, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов и способный экспрессировать полипептид in vivo.

(2) Индуктор иммунитета по п. (1), в котором полипептид (i) связывается с молекулой MHC класса I.

(3) Индуктор иммунитета по п. (2), в котором полипептид (i) представляет собой любой из полипептидов, выбранный из группы полипептидов (c)-(e), указанных ниже:

[0011]

(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-34;

(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);

(e) полипептиды, каждый из которых содержит неполную последовательность любого из полипептидов (c) или (d).

(4) Индуктор иммунитета по п. (1), в котором полипептид (i) связывается с молекулой MHC класса II.

(5) Индуктор иммунитета по п. (4), в котором полипептид (i) представляет собой любой из полипептидов, выбранный из группы полипептидов (f)-(h), указанных ниже:

[0012]

(f) полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 35-67;

(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);

(h) полипептиды, каждый из которых содержит неполную последовательность любого из полипептидов (f) или (g).

(6) Индуктор иммунитета по любому из пп. (1)-(5), который применим в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

(7) Индуктор иммунитета по п. (6), в котором злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок PDS5A.

(8) Индуктор иммунитета по любому из пп. (6) или (7), в котором злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, злокачественную лимфому, рак простаты, рак печени, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, злокачественную опухоль головного мозга, рак легкого или рак пищевода.

(9) Индуктор иммунитета по любому из пп. (1)-(8), дополнительно содержащий иммуностимулятор.

(10) Полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью и выбранный из группы полипептидов (a) или (b), указанных ниже:

[0013]

(a) полипептиды, обладающие индуцирующей иммунитет активностью и состоящие из 7 или большего количества непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 и положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a).

(11) Полипептид по п. (10), в котором полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы полипептидов (c)-(e), указанных ниже:

[0014]

(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-34;

(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);

(e) полипептиды, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов (c) или (d).

(12) Полипептид по п. (10), в котором полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы полипептидов (f)-(h), указанных ниже:

[0015]

(f) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 35-67;

(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);

(h) полипептиды, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов (f) или (g).

(13) Изолированная антигенпрезентирующая клетка, содержащая комплекс полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, по любому из пп. (10)-(12), и молекулы MHC.

(14) Изолированная T-клетка, которая избирательно связывается с комплексом полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, по любому из пп. (10)-(12), и молекулы MHC.

[0016]

Настоящее описание охватывает раскрытие заявки на выдачу патента Японии № 2015-158539, на основании которой настоящая заявка притязает на приоритет.

Эффекты изобретения

[0017]

Настоящее изобретение относится к новому индуктору иммунитета, применимому в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

[0018]

Кроме того, как специально показано в примерах, описанных далее, полипептиды, применимые в настоящем изобретении, могут индуцировать иммунные клетки, которые убивают злокачественные клетки, тем самым обеспечивая возможность уменьшения размера или регрессии уже существующей злокачественной опухоли. Кроме того, пептиды, применимые в настоящем изобретении, также могут усиливать индукцию иммунных клеток, которые убивают злокачественные клетки, и тем самым способствовать уменьшению размера или регрессии уже существующей злокачественной опухоли. Таким образом, полипептиды согласно настоящему изобретению применимы в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

КРАТКОЕ ОПСИАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0019]

[Фигура 1] На фигуре 1 показаны картины экспрессии гена PDS5A в опухолевых тканях человека и линиях злокачественных клеток. Идентификационный номер 1 указывает картину экспрессии гена PDS5A человека. Идентификационный номер 2 указывает картину экспрессии гена GAPDH человека, который является геном «домашнего хозяйства» человека.

[Фигура 2] На фигуре 2 показано, что CD8-позитивные T-клетки, специфичные для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19, узнают комплекс, состоящий из полипептида и HLA-A0201, и продуцируют IFN-γ. На фигуре 2, дорожки 13-29 на горизонтальной оси показывают IFN-γ-продуцирующие способности HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, на которые импульсно воздействовали полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, соответственно. Дорожка 1 показывает результат, полученный, когда описанную выше обработку осуществляли без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 показывает результат, полученный, когда описанную выше обработку осуществляли с добавлением полипептида для отрицательного контроля, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, которая не входит в объем настоящего изобретения; дорожка 3 показывает результат, полученный, когда описанную выше обработку осуществляли с добавлением полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и дорожки 4-12 показывают результаты, полученные, когда описанную выше обработку осуществляли с добавлением полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83, соответственно, которые не входят в объем настоящего изобретения.

[Фигура 3] На фигуре 3 показано, что CD8-позитивные T-клетки, специфичные для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34, узнают комплекс, состоящий из полипептида и HLA-A24, и продуцируют IFN-γ. На фигуре 3 дорожки 4-18 на горизонтальной оси показывают IFN-γ-продуцирующую способность HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, на которые импульсно воздействовали полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, соответственно. Дорожка 1 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 показывает результат, полученный когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением пептида для отрицательного контроля, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, которая не входит в объем настоящего изобретения; и дорожка 3 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[Фигура 4A] На фигуре 4A показана направленная против злокачественных клеток цитотоксическая активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19. На фигуре 4A дорожки 13-29 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток U251, HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74); дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и дорожки 4-12 показывают цитотоксические активности CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83, соответственно, которые не входят в объем настоящего изобретения.

[Фигура 4B] Фигура 4B показывает направленную против злокачественных клеток цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19. На фигуре 4B дорожки 12-28 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток Jurkat, HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74); дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и дорожки 4-11 показывают цитотоксические активности CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83, соответственно, которые не входят в объем настоящего изобретения.

[Фигура 5A] Фигура 5A представляет собой график, показывающий направленную против злокачественных клеток цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34. На фигуре 5A дорожки 4-18 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток THP1, HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток, стимулированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 84); и дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[Фигура 5B] Фигура 5B показывает направленную против злокачественных клеток цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из пептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34. На фигуре 5B дорожки 4-18 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток SW480, HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток, стимулированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 84); и дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[Фигура 6] Фигура 6 представляет собой график, показывающий, что CD4-позитивные T-клетки, специфичные для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 35-67, узнают комплекс полипептида и HLA-DRB1*04 и продуцируют IFN-γ. На фигуре 6 дорожки 4-36 на горизонтальной оси показывают IFN-γ-продуцирующую способность HLA-DRB1*04-позитивных CD4-позитивных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, на которые импульсно воздействовали полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 35-67, соответственно. Дорожка 1 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением полипептида отрицательного контроля, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 85, которая не входит в объем настоящего изобретения; и дорожка 3 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0020]

Полипептид.

В настоящем изобретении термин «полипептид» относится к молекуле, образованной за счет образования пептидных связей из множества аминокислот. Полипептиды согласно настоящему изобретению включают не только полипептидные молекулы, состоящие из большого количества аминокислот, но также и молекулы с низкой молекулярной массой (олигопептиды), состоящие из небольшого количества аминокислот.

[0021]

Полипептидом, представляющий собой индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению, может быть, например, по меньшей мере, один полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью и выбранный из группы полипептидов (a) или (b), указанных ниже:

(a) полипептиды, состоящие из 7 или большего количества непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97 (74 аминокислоты), положений 113-132 (20 аминокислот), положений 134-197 (64 аминокислоты), положений 204-225 (22 аминокислоты), положений 265-332 (68 аминокислот), положений 378-463 (86 аминокислот), положений 472-498 (27 аминокислот), положений 533-567 (35 аминокислот), положений 613-643 (31 аминокислота), положений 671-735 (65 аминокислот), положений 737-780 (44 аминокислоты), положений 792-830 (39 аминокислот), положений 832-899 (68 аминокислот), положений 920-943 (24 аминокислоты), положений 946-993 (58 аминокислот), положений 1029-1069 (41 аминокислота) и положений 1074-1215 (142 аминокислоты) в белке PDS5A человека, состоящем из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, при этом инициирующий метионин определяют как положение 1;

(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a).

[0022]

В настоящем изобретении выражение «состоящий из аминокислотной последовательности» означает, что аминокислотные остатки распределены в определенном порядке. Таким образом, например, «полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность Met Asp Phe Thr… (пропущено)…Asp Leu Gln Arg, представленную в SEQ ID NO: 2, и который имеет размер 1337 аминокислотных остатков. Кроме того, в настоящем описании «полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2» часто сокращенно обозначают, например, как «полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2». ТО же применимо для выражения «состоящий из последовательности оснований».

[0023]

Термин «индуцирующая иммунитет активность» в используемом в настоящем изобретении смысле относится к способности активировать и приводить к размножению T-клеток, которые отвечают на злокачественные клетки, экспрессирующие белок PDS5A. В частности, индуцирующая иммунитет активность означает, что: IFN-γ-продуцирующая способность цитотоксических T-клеток и/или хелперных T-клеток, стимулированных белком PDS5A или его неполным полипептидом, выше, чем IFN-γ-продуцирующая способность нестимулированных контрольных T-клеток; цитотоксическая активность, направленная против злокачественных клеток, экспрессирующих белок PDS5A, цитотоксических T-клеток, стимулированных белком PDS5A или его неполным полипептидом, выше, чем в случае нестимулированных контрольных T-клеток; цитотоксическая активность хелперных T-клеток, стимулированных белком PDS5A или его неполным полипептидом, повышена по сравнению с цитотоксической активностью нестимулированных контрольных T-клеток; или цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, стимулированные белком PDS5A или его неполным полипептидом, пролиферируют больше, чем нестимулированные контрольные T-клетки.

[0024]

Пролиферация клеток может быть подтверждена в результате: визуального наблюдения; подсчета клеток под микроскопом; проточной цитометрии; определения количества меченого тритием тимидина, включенного из среды в клетки; и тому подобного. Кроме того, можно осуществить измерение IFN-γ-продуцирующей способности, например, в известном анализе ELISPOT, и тому подобное. В частности, как будет описано в примерах ниже, например, T-клетки сначала культивируют совместно с полипептидом, индуцирующую иммунитет активность которого необходимо оценить (белок PDS5A или его неполный полипептид согласно настоящему изобретению), и антигенпрезентирующими клетками, полученными из мононуклеарных клеток периферической крови (далее называемых «PBMC»), чтобы обеспечить возможность T-клеткам контактировать с антигенпрезентирующими клетками, которые презентируют оцениваемый полипептид. Затем измеряют количество IFN-γ, продуцируемого T-клетками, используя антитело, специфичное для IFN-γ. Такой способ позволяет измерить количество иммунных клеток среди T-клеток. Затем индуцирующую иммунитет активность оценивают на основе полученных результатов измерений.

[0025]

Цитотоксическую активность можно оценить, например, при совместном культивировании T-клеток с полипептидом, цитотоксическую активность которого необходимо оценить (белком PDS5A или его неполным полипептидом, предлагаемом в настоящем изобретении), и антигенпрезентирующими клетками, полученными из PBMC, и затем анализируя проявляют ли T-клетки, или не проявляют способность подавлять пролиферацию опухолевых клеток или убивать опухолевые клетки (далее называемую «цитотоксической активностью») in vitro. Контактирование T-клеток и антигенпрезентирующих клеток можно достичь при совместном культивировании обоих типов клеток в жидкой среде, как будет описано далее. Измерение цитотоксической активности можно осуществить, например, известным способом, называемым анализом высвобождения ⁵¹Cr, описанным в Int. J. Cancer, 58: P 317, 1994.

[0026]

При введении T-клеток, индуцированных, как описано выше, в живой организм, несущий злокачественную опухоль, размер опухоли может уменьшиться, или опухоль может быть подвергнута регрессии вследствие цитотоксической активности T-клеток. Таким образом, Описанная выше индуцирующую иммунитет активность также можно оценивать по способности подавлять пролиферацию злокачественных клеток или по способности вызывать уменьшение размера или исчезновение злокачественной ткани (опухоли) (далее называемая «противоопухолевой активностью»).

[0027]

В случаях, когда описанный выше полипептид применяют для лечения или профилактики злокачественной опухоли, оценку индуцирующей иммунитет активности предпочтительно осуществляют, используя цитотоксическую активность или противоопухолевую активность в качестве показателя, хотя показатель особым образом не ограничен.

[0028]

Так как полипептид длиной примерно 7 или большего количества аминокислотных остатков может содержать эпитоп, и такой полипептид может проявлять антигенность и иммуногенность и может обладать индуцирующей иммунитет активностью, как хорошо известно в данной области, такой полипептид можно применять в качестве индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению.

[0029]

Соответственно, полипептид (a) представляет собой полипептид, состоящий из 7 или большего количества непрерывно следующих друг за другом аминокислот, предпочтительно 8, 9 или 10 или больше непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и обладающий индуцирующей иммунитет активностью. Полипептид особенно предпочтительно имеет аминокислотную последовательность положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[0030]

Принцип иммунной индукции при введении полипептида ракового антигена заключается в том, что полипептид включается в антигенпрезентирующую клетку и затем разрушается на более мелкие фрагменты пептидазами в клетке, и после этого фрагменты антигенного пептида презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Известно, что цитотоксические T-клетки и тому подобные узнают антигены, презентированные на клеточной поверхности, и избирательно убивают злокачественные клетки, презентирующие антигены на клеточной поверхности. Кроме того, также известно, что хелперные T-клетки узнают антигены, презентированные на поверхности антигенпрезентирующих клеток, и усаливают индукцию цитотоксических T-клеток, которые избирательно убивают злокачественные клетки, презентирующие антигены на клеточной поверхности. Размер антигенного полипептида, презентированного на поверхности антигенпрезентирующей клетки, относительно небольшой и составляет примерно от 7 до 30 аминокислот. Таким образом, в отношении возможности того, что полипептид может быть презентирован на антигенпрезентирующих клетках полипептид (a) предпочтительно имеет примерно от 7 до 30 непрерывно следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Достаточным является полипептид, состоящий примерно из 8-30, примерно 9-30 или примерно 9-25 аминокислот. Такие относительно небольшие полипептиды могут быть презентированы непосредственно на поверхности антигенпрезентирующих клеток без включения в клетки.

[0031]

Кроме того, так как полипептид, включенный в антигенпрезентирующую клетку расщепляется в случайных местах пептидазами в клетка с образованием различных фрагментов полипептида, и затем полученные в результате фрагменты полипептида презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, введение крупного полипептида, такого как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, неизбежно приводит к образованию фрагментов полипептида, активных в отношении индукции иммунитета через антигенпрезентирующие клетки, вследствие распада полипептида в антигенпрезентирующих клетках. Таким образом, крупный полипептид также может быть применим для индукции иммунитета посредством антигенпрезентирующих клеток. Например, можно использовать полипептид, состоящий из 30 или более аминокислот, предпочтительно из 40 или более, более предпочтительно из 50 или большего количества аминокислот и еще более предпочтительно из 100 или более аминокислот.

[0032]

Кроме того, полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть проверены с использованием средства для проверки, такого как Прогнозирование связывания пептидов HLA (Peptide Binding Predictions) (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.htmL) в Bioinformatics and Molecular Analysis Selection (BIMAS), или SYFPEITHI, которые могут искать пептидные эпитопы, состоящие из 8-25, предпочтительно из 9-24 и более предпочтительно из 9-23 аминокислот и имеющие мотивы связывания для молекул класса I или молекул класса II MHC (HLA у человека), которые описаны ниже, чтобы провести скрининг пептидов, которые могут представлять собой пептидные эпитопы. В частности, описанный выше полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 7 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Примеры полипептида включают: полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 3-67, и полипептиды, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-67 и имеющих от 10 до 30 аминокислотных остатков. Среди полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 3-67, и полипептидов, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-67 и имеющих от 10 до 30 аминокислотных остатков, индуцирующая иммунитет активность полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 3-67, является следствием связывания с молекулами MHC класса I, и индуцирующая иммунитет активность полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 35-67, является следствием связывания с молекулами MHC класса II.

[0033]

С другой стороны, полипептид (b) является полипептидом, содержащим одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или добавлений в аминокислотной последовательности полипептида (a), и обладает индуцирующей иммунитет активностью. Например, полипептид (b) включает полипептид, содержащий одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или добавлений в аминокислотной последовательности, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-67.

[0034]

Термин «несколько» в используемом в настоящем изобретении смысле относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно к целому числу от 2 до 6, более предпочтительно к целому числу от 2 до 4, и еще более предпочтительно к целому числу 2 или 3.

[0035]

В общем, подразумевают, что модификация одной или нескольких аминокислот в полипептиде не влияет на функции исходного полипептида; а некоторых случаях полагают, что такая модификация даже усиливает необходимую функцию исходного полипептида. Действительно, известно, что модифицированный пептид, содержащий от одной до нескольких модификаций (а именно, замен, делеций, добавлений и/или инсерций) в аминокислотной последовательности исходной аминокислотной последовательности, сохраняет биологическую активность исходного пептида (Mark et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5662-5666, Zoller and Smith, 1982, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500, Dalbadie-McFarland et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 6409-6413). Соответственно, полипептид (b) также может проявлять индуцирующую иммунитет активность, и таким образом, может быть использован для получения индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению.

[0036]

20 типов аминокислот, составляющих встречающиеся в природе белки, могут быть классифицированы на группы аминокислот со сходными свойствами, такие как, например: нейтральные аминокислоты с боковыми цепями, имеющими низкую полярность (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислые аминокислоты (Asp и Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys и His); и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr и Trp). Во многих случаях известно, что замены аминокислот в пределах одной и той же группы не изменяют свойства полипептида. Таким образом, в тех случаях, когда аминокислотный остаток(ки) в полипептида (a) согласно настоящему изобретению заменен, замену(ны) предпочтительно осуществляют в пределах одной и той же группы, так как при этом повышается вероятность сохранения индуцирующей иммунитет активности.

[0037]

Кроме того, полипептид (b) может представлять собой полипептид, который имеет идентичность последовательности 90% или больше, предпочтительно 95% или больше, более предпочтительно 98% или больше и еще более предпочтительно 99% или больше или 99,5% или больше с аминокислотной последовательностью положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и которые обладает индуцирующей иммунитет активностью.

[0038]

В используемом в настоящем описании смысле термин «идентичность последовательности» между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований) относится к значению в процентах, полученному посредством: выравнивания двух сравниваемых аминокислотных последовательностей (или последовательностей оснований), так чтобы максимизировать количество совпадающих аминокислотных остатков (или оснований) между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований); и деления количества совпадающих аминокислотных остатков (или количества совпадающих оснований) на общее количество аминокислотных остатков (или общее количество оснований). Если требуется, при выравнивании последовательностей, пробел (пробелы) встраивают в одну или обе последовательности, которые необходимо сравнить. Такое выравнивание последовательностей может быть осуществлено с использованием известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W. В случаях, когда встраивают пробел (пробелы), указанное выше общее количество аминокислотных остатков представляет собой количество остатков, полученных с учетом одного пробела как одного аминокислотного остатка. Когда такое подсчитанное общее количество аминокислотных остатков отличается в двух сравниваемых последовательностях, идентичность последовательностей (%) вычисляют делением количества совпадающих аминокислотных остатков на общее количество аминокислотных остатков в более длинной последовательность.

[0039]

При применении в связи с лечением или профилактикой злокачественной опухоли полипептид согласно настоящему изобретению должен экспрессироваться на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в виде комплекса пептида и любого из различных классов HLA. Соответственно, предпочтительно выбрать пептид, обладающий не только индуцирующей иммунитет активностью, но также и высокой аффинностью связывания с различными классами HLA. С указанной целью пептид может быть модифицирован в результате замены, инсерции, делеции и/или добавления аминокислотного остатка(ов), чтобы получить модифицированный пептид, обладающий улучшенной аффинностью связывания. Так как порядок последовательностей пептидов, презентируемых посредством связывания с различными классами HLA, известен, в дополнение к порядку презентируемых в природе пептидов (J. Immunol., 1994, 152: 3913; Immunogenetics, 1995, 41: 178; J. Immunol., 1994, 155: 4307), можно ввести модификацию, основанную на таком порядке, в иммуногенный пептид согласно настоящему изобретению. Например, замена второй аминокислоты на N-конце лейцином или метионином и/или замена аминокислоты на C-конце валином или лейцином может быть желательной в целях улучшения аффинности связывания с HLA-A24. Соответственно, пептид, имеющий аминокислотную последовательность любой из последовательностей SEQ ID NO: 20-34, в котором вторая аминокислота на N-конце заменена лейцином или метионином и/или аминокислота на C-конце заменена валином или лейцином, также входит в объем настоящего изобретения.

[0040]

Замены могут быть введены не только по концевым аминокислотам, но также в потенциальный сайт (сайты) регуляции TCR пептидов. В нескольких исследованиях показано, что пептид с аминокислотными заменами обладает такими же или улучшенными свойствами, по сравнению с исходным пептидом, и примеры пептида с аминокислотными заменами включают CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) и gp100 (209-217) (Zaremba et al., 1997, Cancer Res. 57: 4570-4577, T. K. Hoffmann et al. 2002, J. Immunol. 168 (3): 1338-47, S. O. Dionne et al. 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52: 199-206, и S. O. Dionne et al. 2004, Cancer Immunology, Immunotherapy, 53: 307-314).

[0041]

В дополнение к описанным выше модификациям также можно связывать полипептид согласно настоящему изобретению с другим веществом(ами), при условии, что получаемый в результате связанный полипептид сохраняет необходимую индуцирующую иммунитет активность исходного пептида. Примеры других веществ включают без ограничения пептиды, липиды, сахара и цепи сахаров, ацетильные группы и природные и синтетические полимеры. Пептид также может содержать модификацию, такую как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, при условии, что биологическая активность исходного пептида не нарушена вследствие модификации. Указанные типы модификаций могут быть осуществлены для придания дополнительных функций (таких как функция таргетинга и функция доставки) полипептиду или для стабилизации полипептида. Например, в данной области известно введение D-аминокислоты, миметика аминокислоты или неприродной аминокислоты в полипептид для усиления его стабильности in vivo; и такой принцип можно использовать в полипептидах согласно настоящему изобретению. Стабильность полипептида можно анализировать несколькими способами. Например, стабильность можно тестировать, используя пептидазы, а также различные типа биологических сред, таких как плазма и сыворотка человека (смотри, например, Verhoef et al., 1986, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin., 11: 291-302).

[0042]

Кроме того, полипептид согласно настоящему изобретению может быть связан с другим пептидом(ами) посредством спейсера(ов) или линкера(ов). Примеры другого пептида включают без ограничения эпитопные пептиды, полученные из других полипептидов. Альтернативно, два или более полипептидов согласно настоящему изобретению могут быть связаны через спейсер(ры) или линекер(ры). Пептиды, которые связывают спейсером(ами) или линекером(ами), могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга. Типы спейсера и линкера особым образом не ограничены, и их примеры включают спейсер и линкер, состоящий из пептидов, более предпочтительно состоящий из пептидов, имеющих один или несколько сайтов расщепления, которые можно расщепить ферментами, такими как пептидазы, протеазы и протеосомы. Линкером или спейсером может быть, например, AAY (P. M. Daftarian et al., J. Trans. Med., 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J. Immunol. 2000, 165: 7308-7315), или от одного до нескольких остатков лизина (S. Ota et al., 2002, Can. Res. 62: 1471-1476, K. S. Kawamura et al., 2002, J. Immunol. 168: 5709-5715), но без ограничения указанными примерами. В настоящем изобретении предлагается полипептид, связанный с другим пептидом(ами) через спейсер(ры) или линекер(ры).

[0043]

В случаях, когда полипептиды согласно настоящему изобретению содержат остатки цистеина, такие полипептиды имеют тенденцию образовывать димеры за счет дисульфидных связей между SH-группами остатков цистеина. Таким образом, димеры таких полипептидов также включены полипептиды согласно настоящему изобретению.

[0044]

Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением известных методик. Например, полипептиды могут быть синтезированы способом химического синтеза, таким как Fmoc-способ (способ на основе флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-способ (способ на основе т-бутилоксикарбонила). Кроме того, они могут быть синтезированы обычными способами с использованием различных типов коммерчески доступных синтезаторов пептидов.

[0045]

Кроме того, представляющий интерес полипептид может быть получен с использованием известных способов генетической инженерии посредством: получения полинуклеотида, кодирующего указанный выше полипептид; включения полинуклеотида в экспрессирующий вектор; введения вектора в клетку-хозяина; и затем обеспечения возможности для продуцирования представляющего интерес полипептида в клетке-хозяине. При получении представляющего интерес полипептида из клеток-хозяев полипептид может быть очищен или выделен так, чтобы полипептид по существу не включал других встречающихся в природе белков и их фрагментов из клеток-хозяев или других произвольных химических веществ.

[0046]

Полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, может быть легко получен известным способом генетической инженерии или обычным способом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, имеющая последовательность оснований SEQ ID NO: 1, может быть получена в ПЦР с использованием хромосомной ДНК человека или библиотеки кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных для амплификации последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 1. Условия реакции для ПЦР могут быть установлены соответствующим образом, и примеры включают без ограничения повторение цикла, состоящего из реакций при: 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (удлинение) в ходе 30 циклов с последующей реакцией при 72°C в течение 1 минуты. Кроме того, требуемая ДНК может быть выделена с использованием получения подходящего зонда(ов) или праймера(ов) на основе информации о последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 1, и аминокислотной последовательности, и скрининга библиотеки кДНК человека или тому подобной с использованием зонда(ов) или праймера(ов). Библиотеку кДНК предпочтительно получают из клетки, органа или ткани, экспрессирующей белок с последовательностью SEQ ID NO: 2. Описанные выше операции, такие как получение зонда(ов) или праймера(ов), конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области и могут быть осуществлены согласно способам, описанным, например, в Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Current Protocol in Molecular Biology: www.currentprotocols.com; и тому подобных публикациях. Из полученной таким образом ДНК может быть получена ДНК, кодирующая полипептид (a). Кроме того, так известны кодоны, кодирующие каждую аминокислоту, последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего конкретную аминокислотную последовательность, может быть легко установлена. Соответственно последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего описанный выше полипептид (b), также может быть легко установлена, и таким образом, такой полинуклеотид также может быть синтезирован с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновой кислоты согласно обычному способу.

[0047]

Клеткой-хозяином может быть любая клетка, при условии, что она может экспрессировать описанный выше полипептид. Примеры прокариотических клеток включают без ограничения E. coli; и примеры эукариотических клеток включают без ограничения культивируемые клетки млекопитающих, включая клетки почки обезьяны COS-1 и клетки яичника китайского хомячка CHO; почкующиеся дрожжи; делящиеся дрожжи; клетки шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus laevis.

[0048]

В случаях, когда в качестве клетки-хозяина используют прокариотическую клетку, используют экспрессирующий вектор, содержащий начало, которое обеспечивает его репликацию в прокариотической клетке, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт ДНК-клонирования, терминатор и т.д.. Примеры экспрессирующего вектора для E. coli включают систему pUC, pBluescript II, систему экспрессии pET и систему экспрессии pGEX. Полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в прокариотической клетке-хозяине посредством включения ДНК, кодирующей описанный выше полипептид, в экспрессирующий вектор, трансформации прокариотической клетки-хозяина таким вектором и затем культивирования полученного в результате трансформанта. В таком способе полипептид также может быть экспрессирован в виде белка, слитого с другим белком.

[0049]

В тех случаях, когда в качестве клетки-хозяина используют эукариотическую клетку, используют экспрессирующий вектор для эукариотических клеток, содержащий промотор, сайт сплайсинга, сайт присоединения поли(A) и т.д. Примеры такого экспрессирующего вектора включают вектор pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3, pMSG и pYES2. Таким же образом, который описан выше, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотической клетке-хозяине посредством включения ДНК, кодирующей описанный выше полипептид, в такой экспрессирующий вектор, трансформации эукариотической клетки-хозяина в такой вектор и затем культивирования полученного в результате трансформанта. В случаях, когда pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобный используют в качестве экспрессирующего вектора, описанный выше полипептид может быть экспрессирован в виде слитого белка, к которому добавляют различные типы меток, такие как His-метка, FLAG-метка, myc-метка, HA-метка и GFP.

[0050]

Введение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно осуществить известным способом, таким как электропорация, способ на основе фосфата кальция, способ на основе липосом или способ на основе DEAE-декстрана.

[0051]

Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев с использованием сочетания известных способов разделения. Примеры известных способов разделения включают без ограничения: обработку денатурирующим агентом, таким как мочевина, или поверхностно-активным веществом; обработку ультразвуком; расщепление ферментами; высаливание или осаждение фракций растворителями; диализ; центрифугирование; ультрафильтрацию; гель-фильтрацию; SDS-ПААГ; изоэлектрическое фокусирование; ионообменную хроматографию; гидрофобную хроматографию; аффинную хроматографию; и обращено-фазовую хроматографию.

[0052]

Полипептиды, полученные описанным выше способом, также включают, как указано выше, полипептиды в виде белка, слитого с другим произвольным белком. Примеры полипептидов включают слитые белки с глутатион-S-трансферазой (GST) и белки, слитые с His-меткой. Соответственно, такой полипептид в форме слитого белка также включен в объем настоящего изобретения. Кроме того, полипептид, экспрессированный в трансформированной клетке, может быть модифицирован посттрансляционно различными путями. Такой посттрансляционно модифицированный полипептид также включен в объем настоящего изобретения, при условии, что он обладает индуцирующей иммунитет активностью. Примеры такой посттрансляционной модификации включают: удаление N-концевого метионина; N-концевое ацетилирование; гликозилирование; ограниченное расщепление внутриклеточной протеазой; миристоилирование; изопренилирование и фосфорилирование.

ИНДУКТОР ИММУНИТЕТА

Уже существующая опухоль может быть подвергнута регрессии при введении полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью согласно настоящему изобретению, или экспрессирующего вектора, содержащего ген, кодирующий полипептид, в живой организм, несущий злокачественную опухоль. Кроме того, появление опухоли можно предотвратить введением описанного выше полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, или гена, кодирующего полипептид, в живой организм до появления злокачественной опухоли. Соответственно, полипептид согласно настоящему изобретению или ген, кодирующий полипептид, можно применять в качестве активного ингредиента в индукторе иммунитета.

[0053]

Каждый из терминов «опухоль» и «злокачественная опухоль», используемых в настоящем описании, относится к злокачественной неоплазии, и термины использованы взаимозаменяемо. В данном случае злокачественной опухолью, подвергаемой лечению, предпочтительно является злокачественная опухоль, экспрессирующая белок PDS5A, и более предпочтительно лейкоз, злокачественная лимфома, рак простаты, рак печени, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, злокачественная опухоль головного мозга, рак легкого или рак пищевода.

[0054]

Животным предпочтительно является млекопитающее, более предпочтительно такое млекопитающее, как примат, домашний питомец, домашнее животное или спортивное животное, еще более предпочтительно человек, собака или кошка, и особенно предпочтительно человек.

[0055]

Пораженный злокачественной опухолью индивидуум (пациент со злокачественной опухолью, в тех случаях, когда индивидуумом является человек), подвергаемый лечению, предпочтительно является пораженным злокачественной опухолью индивидуумом, злокачественные клетки у которого экспрессируют белок PDS5A in vivo. В частности, предпочтительным является пораженный злокачественной опухолью индивидуум, подвергнутый скринингу способом выявления злокачественной опухоли, описанном в WO 2011/027807. В частности, пораженным злокачественной опухолью индивидуумом предпочтительно является индивидуум, отобранный при скрининге на основании того факта, что уровни экспрессии антител против белка PDS5A, находящегося в образце, полученном из данного живого организма, выше по сравнению с уровнями экспрессии антител, содержащихся в образце, полученном от здорового индивидуума. Примеры образца, используемого для скрининга пораженных злокачественной опухолью индивидуумов, которых необходимо лечить, включают жидкости организма, такие как кровь, сыворотка, плазма, асциты и плевральный выпот; ткани и клетки. В тех случаях, когда скрининг осуществляют, измеряя уровни экспрессии антител против белка PDS5A, образец предпочтительно представляет собой сыворотку, плазму, асцит и плевральный выпот.

[0056]

Введение индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению можно осуществлять либо перорально, либо парентерально. Однако предпочтительными путями введения являются парентеральные пути введения, такие как внутримышечное введение, подкожное введение, внутривенное введение и внутриартериальное введение. В тех случаях, когда индуктор иммунитета применяют для лечения злокачественной опухоли, его можно вводить в регионарный лимфатический узел вблизи опухоли, подвергаемой лечению, чтобы усилить его противоопухолевую активность. Индуктор иммунитета можно вводить в любом дозированном количестве, эффективным для индукции иммунитета. Например, в случаях, когда индуктор иммунитета применяют для лечения или профилактики злокачественной опухоли, средство можно вводить в количестве, эффективном для лечения или профилактики злокачественной опухоли. Количество, эффективное для лечения или профилактики злокачественной опухоли, может быть выбрано соответствующим образом, в зависимости от размера опухоли, симптомов, массы тела и объема данного животного и тому подобного. В случаях, когда животным является человек, эффективное количество обычно составляет от 0,0001 до 1000 мкг и предпочтительно от 0,001 до 1000 мкг в сутки. Описанное выше дозированное количество можно вводить в виде единичной дозы или в виде нескольких дробных доз. Указанное выше дозированное количество дробят и вводят несколько раз в сутки, и введение осуществляют каждые несколько дней или несколько месяцев. Как будет конкретно описано в примерах ниже, индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению может приводить к регрессу уже образованной опухоли. Таким образом, поскольку индуктор иммунитета также может проявлять свою противоопухолевую активность также против небольшого количества злокачественных клеток на ранних стадия, развитие или рецидив злокачественной опухоли можно предотвратить с использованием средства до появления или после лечения злокачественной опухоли. Другими словами, индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению применим как для лечения, так и для профилактики злокачественной опухоли и может быть применен в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

[0057]

Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента описанный выше полипептид согласно настоящему изобретению и может состоять из одного полипептида или из сочетания множества полипептидов. При сочетании множества полипептидов согласно настоящему изобретению индуцирующая иммунитет активность (активность в отношении индукции и активации цитотоксических T-клеток) каждого из полипептидов усиливается и может быть осуществлено более эффективное лечение или профилактика злокачественной опухоли.

[0058]

Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению также можно применять в сочетании с известным пептидом(ами), способным индуцировать цитотоксические T-клетки. При сочетании полипептида(ов) согласно настоящему изобретению с таким известным пептидом(ами) индуцирующая иммунитет активность (активность в отношении индукции и активации цитотоксических T-клеток) каждого из полипептидов усиливается, и может быть осуществлено более эффективное лечение или профилактика злокачественной опухоли. Термин «сочетание» в используемом в данном случае смысле включает случай, когда индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят раздельно или одновременно. Выражение «вводимые раздельно» в используемом в настоящем описании смысле означает, что индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят по-отдельности в разных временных точках с определенным интервалом времени между введениями. Порядок введения не ограничен. С другой стороны, выражение «вводимые одновременно» означает, что индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, смешивают заранее и вводят в форме смеси, или что индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят в раздельных формах, но в одно и то же время без какого-либо временного интервала.

[0059]

Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с другим иммуностимулятором, способным усиливать иммунный ответ in vivo. Другой иммуностимулятор может быть включен в индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению или может быть введен пациенту в виде отдельной композиции при комбинированном введении с индуктором иммунитета согласно настоящему изобретению.

[0060]

«Другой иммуностимулятор» включает, например, адъювант. Адъювант может усиливать иммунный ответ за счет обеспечения источника антигенов (внеклеточно или в макрофагах), активировать макрофаги и стимулировать конкретные группы лимфоцитов, так чтобы усилить противоопухолевую активность. Таким образом, в тех случаях, когда индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению применяют в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли, индуктор иммунитета предпочтительно дополнительно содержит адъювант кроме полипептида согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. В данной области известно множество типов адъювантов, и можно применять любой из таких адъювантов. Конкретные примеры адъювантов включают MPL (SmithKline Beecham), аналоги липополисахарида Salmonella minnesota Re 595, полученного после очистки и кислотного гидролиза липополисахарида; QS21 (SmithKline Beecham), чистый сапонин QA-21, очищенный из экстракта Quillja saponaria; DQS21, описанный в заявке PCT WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 и QS-L1 (So, H. S., et al., «Molecules and cells», 1997, 7: 178-186); неполный адъювант Фрейнда; полный адъювант Фрейнда; витамин E; монтанид; квасцы; CpG-олигонуклеотиды (смотри, например, Kreig, A. M., et al., 1995, Nature 374: 546-549); поли-I:C и их производные (такие как поли-ICLC); и различные эмульсии типа «вода в масле», полученные из биологически разрушаемых масел, такие как сквален и/или токоферол. Среди указанных адъювантов предпочтительными являются неполный адъювант Фрейнда; монтанид; поли-I:C и его производные; и CpG-олигонуклеотиды. Соотношение в смеси описанного выше адъюванта и полипептида обычно составляет примерно от 1:10 до 10:1, предпочтительно примерно от 1:5 до 5:1 и более предпочтительно примерно 1:1. Однако адъювант не ограничен описанными выше примерами, и также можно использовать любой другой адъювант, известный в данной области, отличный от адъювантов, описанных выше, при введении индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению (смотри, например, Goding, «Monoclonal Antibodies: Principles and Practice», 2nd edition, 1986). Способы приготовления смеси или эмульсии индуктора иммунитета и адъюванта хорошо известны специалистам в области вакцинации.

[0061]

Кроме того, в дополнение к описанным выше адъювантам в качестве другого иммуностимулятора можно использовать факторы, которые стимулируют иммунный ответ субъекта. Например, любой из различных типов цитокинов, обладающих свойством стимулировать лимфоциты и/или антигенпрезентирующие клетки, можно использовать в качестве иммуностимулятора в сочетании с индуктором иммунитета согласно настоящему изобретению. Ряд таких цитокинов, способных усиливать иммунный ответ, известны специалистам в данной области, и примеры включают без ограничения интерлейкин-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, интерферон-α (IFN-α), интерферон-β (IFN-β), интерферон-ω (IFN-ω), интерферон-γ (IFN-γ) и лиганд Flt3, которые, как было показано, усиливают защитное действие вакцин. Любой из таких факторов также можно использовать в качестве описанного выше иммуностимулятора и можно вводить пациенту в сочетании с индуктором иммунитета согласно настоящему изобретению, либо включать в индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению, либо вводить в виде отдельной композиции.

СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАТКИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ

Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению можно применять в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

[0062]

Средство для лечения или профилактики злокачественной опухоли может быть приготовлено смешиванием соответствующим образом индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению с добавкой(ами), такой как фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент, подходящий для каждой дозированной формы.

[0063]

Способы приготовления препаратов и добавки, которые можно использовать, известны в области приготовления фармацевтических препаратов, и можно применять любой из способов и любые добавки. Конкретные примеры добавок включают без ограничения: разбавители, такие как физиологические буферные растворы; эксципиенты, такие как сахар, лактоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит и глицин; связывающие средства, такие как сироп, желатин, аравийская камедь, сорбит, поливинилхлорид и трагакантовая камедь; и скользящие вещества, такие как стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк и диоксид кремния. Примеры дозированных форм включают пероральные препараты, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и сиропы; и парентеральные препараты, такие как ингалируемые средства, инъекционные растворы, суппозитории и растворы. Такие препараты могут быть получены общеизвестными способы приготовления.

АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ

Полипептид может быть презентирован антигенпрезентирующими клетками в результате приведения описанного выше полипептида в контакт с антигенпрезентирующими клетками in vitro. Другими словами, описанный выше полипептид (a) или (b) можно применять в качестве средства для обработки антигенпрезентирующих клеток. В качестве антигенпрезентирующих клеток предпочтительно можно использовать дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы MHC класса I и молекулы MHC класса II. Было идентифицировано и известно множество молекул MHC класса I и класса II. Молекулы MHC у человека называют HLA.

[0064]

Примеры молекул HLA класса I включают HLA-A, HLA-B и HLA-C. Более конкретные примеры молекул HLA класса I включают HLA-A, HLA-B и HLA-C; и еще более конкретные их примеры включают HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 и HLA-Cw0602.

[0065]

Примеры молекул HLA класса II включают HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP; и более конкретные примеры таких молекул включают HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*08, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*13, HLA-DRB1*15, HLA-DRB1*15, HLA-DQA1, HLA-DQB1 и HLA-DPB1.

[0066]

Дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы HLA класса I или HLA класса II, могут быть получены из крови или тому подобного хорошо известным способом. Например, специфичные для опухоли дендритные клетки могут быть индуцированы в результате индукции дендритных клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови пациента с использованием колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и IL-3 (или IL-4) и затем добавления связанного с опухолью пептида в систему культивирования.

[0067]

Иммунный ответ, необходимый для лечения злокачественной опухоли, может быть индуцирован введением эффективного количества полученных таким образом дендритных клеток. Используемые клетки могут быть получены из костного мозга или пуповинной крови здорового индивидуума или костного мозга или периферической крови или тому подобного от самого пациента. Использование аутологичных клеток полученных от самого пациента, является предпочтительным, поскольку они в высокой степени безопасны и, как ожидается, позволяют избегать серьезных побочных эффектов. Периферическая кровь или костный мозг могут быть либо в виде свежего образца, либо хранимого в холоде образца, либо замороженного образца. Периферическая кровь может быть получена с использованием культивирования цельной крови или культивирования отдельных лейкоцитарных компонентов, и последнее является более эффективным и, следовательно, предпочтительным. Кроме того, из лейкоцитарных компонентов могут быть отделены мононуклеарные клетки. В случаях, когда используемые клетки представляют собой клетки, полученные костного мозга или пуповинной крови, могут быть культивированы все клетки, составляющие костный мозг, или мононуклеарные клетки могут быть отделены и подвергнуты культивированию. Периферическая кровь, ее лейкоцитарные компоненты и клетки костного мозга содержат мононуклеарные клетки, гематопоэтические стволовые клетки и незрелые дендритные клетки, из которых происходят дендритные клетки, а также CD4-позитивные клетки и тому подобные. Не существует особого ограничения способа получения используемых цитокинов, и может быть использован любой цитокин, либо природный, либо рекомбинантный, при условии, что подтверждена его безопасность и физиологическая активность. Предпочтительно использование препарата гарантированного качества для медицинского применения в минимальном необходимом количестве. Концентрация добавляемого цитокина(ов) особым образом не ограничена, при условии, что она может индуцировать дендритные клетки. Обычно общая концентрация цитокина(ов) предпочтительно составляет примерно от 10 до 1000 нг/мл и более предпочтительно примерно от 20 до 500 нг/мл. Культивирование может быть осуществлено с использованием хорошо известной среды, обычно применяемой для культивирования лейкоцитов. Температура культивирования особым образом не ограничена, при условии, что она позволяет размножаться лейкоцитам; однако температура примерно 37°C, которая равна температуре тела человека, является наиболее предпочтительной. Кроме того, атмосферная среда во время культивирования особым образом не ограничена, при условии, что она позволяет размножаться лейкоцитам; однако предпочтителен приток 5% CO₂. Период времени культивирования особым образом не ограничен, при условии, что необходимо количество клеток может быть индуцировано в течение такого периода. Культивирование обычно осуществляют в течение периода от 3 дней до 2 недель. Оборудование, используемое для разделения и культивирования клеток, может быть выбрано соответствующим образом. Предпочтительным является оборудование, безопасность применения которого для медицинского применения была подтверждена, и которое может работать стабильно и просто. Что касается оборудования для культивирования клеток, то можно использовать, в частности, не только обычные емкости, такие как чашка Петри, колба или флакон, но и многослойный сосуд, многокамерный сосуд, роллерный флакон, вращаемый флакон, ссуд для культивирования в форме мешка, колонку с полыми волокнами или тому подобное.

[0068]

Приведение описанного выше полипептида в контакт с антигенпрезентирующими клетками in vitro можно осуществить хорошо известным способом. Например, контакт можно осуществить, культивируя антигенпрезентирующие клетки в культуральной среде, содержащей описанный выше полипептид. Концентрация пептида в среде особым образом не ограничена и обычно составляет примерно от 1 до 100 мкг/мл, и предпочтительно примерно от 5 до 20 мкг/мл. Плотность клеток во время культивирования особым образом не ограничена и обычно составляет примерно от 10³ до 10⁷ клеток/мл и предпочтительно примерно от 5×10⁴ до 5×10⁶ клеток/мл. Культивирование предпочтительно осуществляют при 37°C в атмосфере 5% CO₂ согласно обычному способу. Максимальная длина пептида, который может быть презентирован на поверхности антигенпрезентирующих клеток обычно составляет примерно 30 аминокислотных остатков. Таким образом, в тех случаях, когда антигенпрезентирующие клетки приводят к контакту с полипептидом in vitro, может быть получен такой полипептид, чтобы его длина была не больше чем примерно 30 аминокислотных остатков, но особым образом он не ограничен.

[0069]

При культивировании антигенпрезентирующих клеток с описанным выше полипептидом полипептид включается в молекулы MHC антигенпрезентирующих клеток и презентируется на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Таким образом, изолированные антигенпрезентирующие клетки, содержащие комплекс полипептида и молекулы MHC, могут быть получены с использованием описанного выше полипептида. Такие антигенпрезентирующие клетки могут презентировать полипептид T-клеткам in vivo или in vitro, индуцировать цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, специфичные для полипептида, и приводить к размножению таких клеток.

[0070]

Посредством приведения полученных таким образом антигенпрезентирующих клеток, содержащих комплекс описанного выше полипептида и молекулы MHC, в контакт с T-клетками in vitro можно индуцировать цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, специфичные для полипептида и обеспечить возможность пролиферации таких клеток. Указанного эффекта можно достичь в результате совместного культивирования антигенпрезентирующих клеток и T-клеток в жидкой среде. Например, такое совместное культивирование можно осуществить, суспендируя антигенпрезентирующие клетки в жидкой среде, помещая полученную в результате суспензию в такой сосуд, как лунки планшета для микротитрования, добавляя в лунки T-клетки и затем культивируя клетки. Соотношение для смешивания антигенпрезентирующих клеток и T-клеток при совместном культивировании таких клеток особым образом не ограничено и обычно составляет примерно от 1:1 до 1:100 и предпочтительно примерно от 1:5 до 1:20 в пересчете на количество клеток. Плотность антигенпрезентирующих клеток, суспендируемых в жидкой среде, особым образом не ограничено и обычно составляет примерно от 100 до 10 миллионов клеток/мл и предпочтительно примерно от 10000 до 1 миллиона клеток/мл. Совместное культивирование предпочтительно осуществляют при 37°C в атмосфере 5% CO₂ согласно обычному способу. Период времени для культивирования особым образом не ограничен и обычно составляет примерно от 2 суток до 3 недель и предпочтительно примерно от 4 суток до 2 недель. Кроме того, совместное культивирование предпочтительно осуществляют в присутствии одного или нескольких типов интерлейкинов, таких как IL-2, IL-6, IL-7 и/или IL-12. В таких случаях концентрация IL-2 или IL-7 обычно составляет примерно от 5 до 20 единиц/мл, концентрация IL-6 обычно составляет примерно от 500 до 2000 единиц/мл и концентрация IL-12 обычно составляет примерно от 5 до 20 нг/мл, но не ограничена указанными значениями. Описанное выше совместное культивирование можно повторять один или несколько раз, добавляя свежие антигенпрезентирующие клетки. Например, операцию удаления культурального надосадка после совместного культивирования и добавления свежей суспензии антигенпрезентирующих клеток для осуществления следующего совместного культивирования можно повторять один или несколько раз. Условия для каждого совместного культивирования могут быть такими же, как описано выше.

[0071]

Описанное выше совместное культивирование обеспечивает возможность индукции и пролиферации цитотоксических T-клеток и хелперных T-клеток, специфичных для полипептида. Таким образом, изолированные T-клетки, которые избирательно связываются с комплексом полипептида и молекулы MHC, могут быть получены с применением описанного выше полипептида.

[0072]

Как будет описано в примерах ниже, ген (ген PDS5A), кодирующий белок PDS5A, специфично экспрессируется в: лейкоцитах при лейкозе, в тканях злокачественной лимфомы, клетках злокачественной лимфомы, тканях злокачественных опухолей простаты, злокачественных клетках простаты, тканях злокачественных опухолей печени, злокачественных клетках печени, тканях злокачественных опухолей молочной железы, злокачественных клетках молочной железы, тканях злокачественных опухолей поджелудочной железы, злокачественных клетках поджелудочной железы, тканях злокачественных опухолей яичника, злокачественных клетках яичника, тканях злокачественных опухолей почек, злокачественных клетках почек, тканях злокачественных опухолей прямой и ободочной кишки, злокачественных клетках прямой и ободочной кишки, тканях злокачественных опухолей желудка, злокачественных клетках желудка, тканях злокачественных опухолей головного мозга, злокачественных клетках головного мозга, тканях злокачественных опухолей легкого, злокачественных клетках легкого, тканях злокачественных опухолей пищевода и злокачественных клетках пищевода. Таким образом, полагают, что значительно большее количество белка PDS5A присутствует в клетках таких типов злокачественных опухолей, чем в нормальных клетках. Когда цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, полученные как описано выше, вводят в живой организм в то время, как часть белка PDS5A, присутствующего в злокачественных клетках, презентирована молекулами MHC на поверхности злокачественных клеток, присутствующий белок служит в качестве маркера, позволяя цитотоксическим T-клеткам повреждать злокачественные клетки или усиливать цитотоксическую активность цитотоксических T-клеток. Так как антигенпрезентирующие клетки, презентирующие описанный выше полипептид, также могут индуцировать и способствовать размножению цитотоксических T-клеток и хелперных T-клеток, специфичных для полипептида, in vivo, введение антигенпрезентирующих клеток в живой организм также может позволять цитотоксическим T-клеткам повреждать злокачественные клетки или усиливать цитотоксическую активность цитотоксических T-клеток. Другими словами, цитотоксические T-клетки и хелперные T-клетки, а также антигенпрезентирующие клетки, полученные с использованием описанного выше полипептида, также применимы в качестве средств для лечения или профилактики злокачественной опухоли, как и индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению.

[0073]

В случае введения описанных выше изолированных антигенпрезентирующих клеток или изолированных T-клеток в живой организм такие клетки предпочтительно получают в результате обработки антигенпрезентирующих клеток или T-клеток, собранных от пациента, которому необходимо провести лечение, полипептидом (a) или (b), который описан выше, чтобы избежать иммунного ответа в живом организме, который атакует такие клетки как чужеродные вещества.

[0074]

Средство для лечения или профилактики злокачественной опухоли, содержащее в качестве активного ингредиента антигенпрезентирующие клетки или изолированные T-клетки, предпочтительно вводят парентеральным путем введения, таким как внутривенное или внутриартериальное введение. Дозовое количество выбирают соответствующим образом в зависимости от симптомов, цели введения и тому подобного. Дозовое количество обычно составляет от одной до 10 триллионов клеток и предпочтительно от 1 миллиона до 1 миллиарда клеток, и такое количество предпочтительно вводят один раз в несколько дней или несколько месяцев. Препарат может представлять собой, например, суспензию клеток в физиологическом забуренном растворе соли, и препарат можно применять в сочетании с другим противоопухолевым средством(ами), цитокином(ами) и/или тому подобным. Кроме того, в препарат также может добавлена одна или две или больше добавок.

ГЕННАЯ ВАКЦИНА

Иммунная индукция, а именно, индукция продукции антител или цитотоксических T-клеток в организме животного, также может быть достигнута за счет обеспечения возможности экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид (a) или (b), в живом организме. При этом обеспечивается эффект, эквивалентный эффекту при введении полипептида. Другими словами индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению может содержать в качестве активного ингредиента рекомбинантный вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид (a) или (b), и который может экспрессировать полипептид в живом организме. Такой рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антигенный полипептид, который будет показан в примерах ниже, также называют «генной вакциной».

[0075]

Вектор, применяемый для получения генной вакцины, особым образом не ограничен, при условии, что он может экспрессировать полипептид в клетке животного (предпочтительно, в клетке млекопитающего). Вектор может представлять собой либо плазмидный вектор, либо вирусный вектор, и можно использовать любой вектор, известный в области получения генных вакцин. Полинуклеотид, такой как ДНК или РНК, кодирующий описанный выше полипептид, может быть легко получен, как описано выше, обычным способом. Кроме того, полинуклеотид может быть включен в вектор с использованием способа, хорошо известного специалистам в данной области.

[0076]

Генную вакцину предпочтительно вводят парентеральным путем введения, таким как внутримышечное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение. Дозированное количество генной вакцины может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от типа антигена и тому подобного, и обычно оно составляет примерно от 0,1 мкг до 100 мг, и предпочтительно примерно от 1 мкг до 10 мг в единицах массы генной вакцины на 1 кг массы тела.

[0077]

Способом применения вирусного вектора может быть, например, способ, при котором полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, включают в РНК-вирус или ДНК-вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус вакцинии, поксвирус, вирус полиомиелита или вирус Синдбис, и затем животного субъекта инфицируют полученным в результате вирусом. В частности, способ применения ретровируса, аденовирус, аденоассоциированного вируса, вируса вакцинии или тому подобного является особенно предпочтительным.

[0078]

Примеры других способов включают способ, при котором экспрессирующую плазмиду непосредственно вводят внутримышечно (способ ДНК-вакцинации), способ с использованием липосом, способ с использованием липофектина, способ микроинъекций, способ с использованием фосфата кальция и способ электропорации. Из указанных способов особенно предпочтительным является способ ДНК-вакцинации и способ с использованием липосом.

[0079]

Способы, позволяющие гену, кодирующему полипептид, применяемый в настоящем изобретении, действительно действовать как фармацевтическое средство, включают: способ in vivo, включающий в себя непосредственное введение гена в организм субъекта; и способ ex vivo, включающий в себя сбор определенного типа клеток из организма животного субъекта и введение гена в клетки ex vivo с последующим возвращением клеток в организм животного субъекта. Из указанных способов более предпочтительным является способ in vivo.

[0080]

В тех случаях, когда ген вводят способом in vivo, ген можно вводить соответствующим путем введения в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, симптомов и тому подобного. Например, ген можно вводить, используя внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное введение или тому подобное. В случае введения гена способом in vivo ген может быть приготовлен в дозированной форме, такой как раствор; но обычно его готовят в виде инъекционного раствора или тому подобного, содержащего ДНК, кодирующую описанный выше пептид согласно настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента. При необходимости в препарат может быть добавлен обычно используемый носитель (носители). В случае использования липосомы или слитой с мембраной липосомы (вирус Сендай (HVJ)-липосома или тому подобное), содержащей ДНК, липосома может быть приготовлена в виде липосомного препарата, такого как суспензия, замороженный препарат или сконцентрированный центрифугированием замороженный препарат.

[0081]

В настоящем изобретение «последовательность оснований, представленная в SEQ ID NO: 1» включает не только последовательность, фактически представленную в SEQ ID NO: 1, но также и комплементарную ей последовательность. Таким образом, «полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO: 1» включает однонитевой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, фактически представленную в SEQ ID NO: 1, однонитевой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, комплементарную указанной последовательности, и двунитевой полинуклеотид, состоящий из таких однонитевых полинуклеотидов. При получении полинуклеотида, кодирующего полипептид, применяемый в настоящем изобретении, соответствующим образом отбирают любую из таких последовательностей оснований, и такой отбор легко могут осуществить специалисты в данной области.

ПРИМЕРЫ

[0082]

Настоящее изобретение будет более конкретно описано ниже с помощью примеров.

Пример 1: Анализ экспрессии в различных тканях.

(1) Анализ экспрессии гена PDS5A в различных линиях злокачественных клеток.

Последовательность гена (SEQ ID NO: 1), кодирующую аминокислотную последовательность белка PDS5A человека, получали из Gene Bank. Экспрессию полученного таким образом гена в различных типах линий клеток человека анализировали, используя ОТ-ПЦР (обратная транскрипция-ПЦР). Реакцию обратной транскрипции осуществляли следующим образом. В частности, из 50-100 мг каждой ткани или 5-10×10⁶ клеток каждой клеточной линии экстрагировали суммарную РНК, используя реагент TRIZOL (производства Life Technologies, Inc.) согласно протоколу, описанному в прилагаемых инструкциях. Полученную таким образом РНК использовали для синтеза кДНК с применением системы для синтеза первой нити Superscript для ОТ-ПЦР (производства Life Technologies, Inc.) согласно протоколу, описанному в прилагаемых инструкциях. В качестве кДНК нормальных тканей человека (головного мозга, гиппокампа, семенников, ободочной кишки и плаценты) использовали кДНК генного пула (производства Life Technologies, Inc.), кДНК QUICK-Clone (производства Clontech Laboratories, Inc.) и библиотеку кДНК крупных вставок (Large-Insert) (производства Clontech Laboratories, Inc.). Реакции ПЦР осуществляли следующим образом, используя праймеры, специфичные для получаемого гена (последовательности оснований праймеров представлены в SEQ ID NO: 68 и 69). В частности, добавляли реагенты и прилагаемый буфер для получения смеси, имеющий общих объем 25 мкл и содержащий 0,25 мкл образца, полученного в реакции обратной транскрипции, 2 мкМ каждого из описанных выше праймеров, 0,2 мМ каждого из dNTP и 0,65 единиц полимеразы ExTaq (производства Takara Shuzo Co., Ltd.). Затем осуществляли реакцию, используя термоциклер (производства Bio-Rad laboratories Inc.), повторяя цикл, состоящий из реакций при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 1 минуты, 30 раз. В то же время использовали праймеры, специфичные для GAPDH, который является геном «домашнего хозяйства» (последовательности оснований праймеров GAPDH человека представлены в SEQ ID NO: 70 и 71), в качестве контроля для сравнения.

[0083]

В результате, как показано на фигуре 1, экспрессию гена PDS5A человека выявляли в большинстве линий злокачественных клеток, а именно, в линиях клеток лейкоза, злокачественной лимфомы, рака простаты, рака печени, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака почки, рака прямой и ободочной кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака легкого и рака пищевода.

(2) Экспрессия белка PDS5A в ткани злокачественной опухоли человека (иммуногистохимическое окрашивание).

Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли на 72 образцах тканей злокачественных опухолей на залитой в парафин матрице множества тканей злокачественных опухолей (производства Biomax Inc.). Матрицу тканей злокачественных опухолей человека обрабатывали при 60°C в течение 3 часов и помещали в сосуд для окрашивания, наполненный ксиленом и процедуру замены ксилена свежим ксиленом повторяли каждые 5 минут 3 раза. Затем такую же процедуру осуществляли, используя этанол и PBS-T вместо ксилена. Матрицу тканей злокачественных опухолей человека помещали в сосуд для окрашивания, наполненный 10 мМ раствором цитратного буфера (pH 6,0), содержащего 0,05% твин 20, обрабатывали при 125°C в течение 5 минут и затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 40 минут или больше. Избыток влаги вокруг срезов тканей вытирали, используя Kimwipes, срезы тканей окружали кольцом, используя DAKOPEN, и по каплям добавляли соответствующее количество пероксидазного блока (производства DAKO). После того как матрица стояла при комнатной температуре в течение 5 минут, матрицу помещали в сосуд для окрашивания, наполненный PBS-T, и процедуру замены PBS-T свежим PBS-T каждые 5 минут повторяли 3 раза. Раствор PBS-T, содержащий 10% FBS, в качестве блокирующего раствора наносили на матрицу, и матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем коммерчески доступное поликлональное антитело кролика (производства Sigma-Aldrich Co. LLC.), которое взаимодействует с белком PDS5A, разбавляли раствором PBS-T, содержащим 5% FBS, до концентрации 10 мкг/мл и полученный в результате раствор наносили на матрицу, затем оставляли матрицу стоять в течение ночи во влажной камере с контролируемой температурой 4°C. После промывки матрицы в PBS-T в течение 10 минут 3 раза добавляли по каплям соответствующее количество меченого пероксидазой конъюгируемого полимера (производства DAKO) и матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки матрицы PBS-T в течение 10 минут 3 раза наносили раствор для развития окраски DAB (производства DAKO) и матрицу оставляли стоять при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Затем раствор для развития окраски удаляли и матрицу промывали PBS-T в течение 10 минут 3 раза с последующей промывкой дистиллированной водой. Затем матрицу последовательно погружали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола по 1 минуте в каждый и затем оставляли стоять в течение ночи погруженной в ксилен. Предметные стекла с матрицей извлекали, заливали средой для заливки глицергелем (производства DAKO) и затем проводили исследования.

[0084]

В результате наблюдали сильную экспрессию белка PDS5A в большинстве тестируемых тканей злокачественных опухолей, а именно: рака простаты, рака печени, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака почки, рака прямой и ободочной кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака легкого и рака пищевода.

Пример 2: Индукция реактивных по отношению к пептидным эпитопам CD8-позитивных T-клеток.

(1) Прогнозирование пептидных мотивов, которые связываются с HLA-A0201 и HLA-A24.

Информацию об аминокислотной последовательности белка PDS5A человека, представленной в SEQ ID NO: 2, получали из GenBank. Для прогнозирования мотивов связывания HLA-A0201 и HLA-A24 анализировали аминокислотную последовательность белка PDS5A человека с помощью компьютерной программы прогнозирования, используя известную компьютерную программу BIMAS (доступную на сайте http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). В результате отобрали 17 типов полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19, которые, как предполагалось, способны связываться с молекулой HLA-A0201; и 14 типов полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34, которые, как предполагалось, способны связываться с молекулой HLA-A24 молекула. Все выбранные полипептиды синтезировали в компании Greiner Japan Co. Ltd., которая предоставляет специализированные услуги по синтезу пептидов. Качество синтезированных полипептидов было гарантирована основании анализа ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

(2) Индукция реактивных по отношению к пептидным эпитопам CD8-позитивных T-клеток.

Периферическую кровь разделяли, используя кровь HLA-A0201-позитивного здорового индивидуума. Периферическую кровь наносили на среду для отделения лимфоцитов (Organon Teknika Corporation, Durham, NC) и затем центрифугировали при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 20 минут. PBMC-содержащую фракцию собирали и 3 раза (или больше) промывали холодным раствором фосфатного буфера, получая PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (производства Life Technologies, Inc.) и давали возможность прикрепиться к культуральному сосуду (производства Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO₂. Неприкрепленные клетки использовали для получения T-клеток, а прикрепленные клетки использовали для получения дендритных клеток.

[0085]

Прикрепленные клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 ед./мл) и GM-CSF (1000 ед./мл). Спустя шесть дней среду заменяли средой AIM-V с добавлением IL-4 (1000 единиц/мл), GM-CSF (1000 единиц/мл), IL-6 (1000 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), IL-1β (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation) и TNF-α (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и клетки культивировали в течение еще двух дней. Полученную в результате популяцию неприкрепленных клеток использовали в качестве дендритных клеток.

[0086]

Полученные таким образом дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при плотности клеток 1×10⁶ клеток/мл. Каждый из пептидов, которые были выбраны в соответствии с описанным выше пунктом (1) и предположительно способны связываться с молекулой HLA-A0201, добавляли к клеткам в концентрации 10 мкг/мл, затем культивировали в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO₂, используя 96-луночный планшет. После культивирования клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека (производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-6 (1000 единиц/мл) и IL-12 (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и затем помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10⁵ клеток на лунку. Затем полученную популяцию T-клеток добавляли в лунки в количестве 1×10⁶ клеток на лунку, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO_2. Спустя семь дней надосадок каждой культуры отбрасывали. Затем дендритные клетки, полученные таким же образом, как описано выше, обработкой каждым пептидом и последующим облучением рентгеновскими лучами, суспендировали (плотность клеток: 1×10⁵ клеток/мл) в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека(производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-7 (10 единиц/мл, производства Genzyme Corporation) и IL-2 (10 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), и полученную в результате суспензию добавляли в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10⁵ клеток на лунку, затем дополнительно культивировали клетки. Такие же операции повторяли 4 раза с интервалами в 7 дней и затем собирали стимулированные T-клетки. затем индукцию CD8-позитивных T-клеток подтверждали проточной цитометрией.

[0087]

Кроме того, такую же обработку, как описано выше, осуществляли, используя отрицательный контроль, пептид (SEQ ID NO: 74), имеющий последовательность, не входящую в объем настоящего изобретения; и используя в качестве сравнительных примеров известные пептиды (SEQ ID NO: 75-83), которые связываются с молекулой HLA-A0201, и белок PDS5A, который был получен согласно примеру 5 в WO 2011/027807 и который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

[0088]

Также делали попытки индукции реактивных по отношению к пептидным эпитопам CD8-позитивных T-клеток для пептидов, которые предположительно способны связываться с молекулой HLA-A24 молекула, таким же образом, как описано выше, используя дендритные клетки и популяцию индуцированных T-клеток из периферической крови HLA-A24-позитивного здорового индивидуума. Кроме того, такую же обработку, как описано выше, осуществляли, используя в качестве отрицательного контроля пептид (SEQ ID NO: 84), имеющий последовательность, не входящую в объем настоящего изобретения; и используя в качестве сравнительного примера белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

Пример 3: Определение эпитопов антигенов цитотоксических T-клеток.

(1) Способность продуцирования IFN-γ.

Чтобы исследовать специфичность соответствующих T-клеток, индуцированных в примере 2 (2), по отношению к соответствующим пептидным эпитопам и белку, дендритные клетки, экспрессирующие молекулу HLA-A0201, импульсно обрабатывали различными типами полипептидов. Дендритные клетки получали культивированием в среде AIM-V с добавлением каждого полипептида в концентрации 10 мкг/мл в условиях 37°C и 5% CO₂ в течение 4 часов. В качестве различных типов полипептидов использовали соответствующие полипептиды, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3-19 и предположительно способные связываться с молекулой HLA-A0201, полипептид отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74), известные полипептиды (SEQ ID NO: 75-83), которые связываются с молекулой HLA-A0201, и белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. К 5×10⁴ дендритных клеток, которые были импульсно обработаны каждым пептидом, добавляли 5×10³ T-клеток, и клетки культивировали в течение 24 часов в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека, в 96-луночном планшете. Каждый надосадок после культивирования собирали, и количество продуцированного IFN-γ измеряли в ELISA.

[0089]

В результате явно более высокую продукцию IFN-γ наблюдали в надосадках на дорожках 13-29, на которых использовали дендритные клетки, которые были импульсно обработаны полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, по сравнению с надосадками на дорожках 1 и 2, на которых использовали дендритные клетки, которые не были импульсно обработаны никаким полипептидом, и дендритные клетки, импульсно обработанные полипептидом отрицательного контроля, соответственно (фигура 2). Полученные результаты показали, что пептиды SEQ ID NO: 3-19 являются T-клеточными эпитопными пептидами, обладающими способностью специфично стимулировать пролиферацию HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, также было обнаружено, что количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными такими пептидами, намного выше, чем количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными известными пептидами, которые связываются с молекулой HLA-A0201 и которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83 (дорожки 4-12), и полноразмерным белком PDS5A, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 (дорожка 3). Другими словами, полученные результаты свидетельствуют, что полипептиды SEQ ID NO: 3-19 обладают намного более высокой индуцирующей иммунитет активностью, по сравнению с пептидами, о которых сообщалось ранее. Кроме того, хотя последовательности SEQ ID NO: 3-19, обладающие описанной выше индуцирующей иммунитет активностью, входят в состав аминокислотной последовательности полноразмерного белка PDS5A, представленной в SEQ ID NO: 2, количество IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком PDS5A SEQ ID NO: 2, было меньше. Полагают, что причиной такого явления то, что полноразмерный белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность, поскольку аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A также включает в себя ряд последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.

[0090]

Кроме того, чтобы исследовать специфичность каждой взаимодействующих с пептидными эпитопами CD8-позитивных T-клеток, индуцированных в примере 3 (2) с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, по отношению к пептидным эпитопам, количество IFN-γ, продуцированного T-клетками, против дендритных клеток, экспрессирующих молекулу HLA-A24, измеряли в ELISA таким же образом, как описано выше, при этом дендритные клетки были импульсно обработаны каждым из следующих полипептидов: полипептидами SEQ ID NO: 20-34 (дорожки 4-18); полипептидом отрицательного контроля, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84; и полноразмерным белком PDS5A, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

[0091]

В результате намного более высокую продукцию IFN-γ наблюдали в надосадках культур на дорожках 4-18, в которых использовали дендритные клетки, импульсно обработанные полипептидами SEQ ID NO: 20-34, по сравнению с надосадками на дорожках 1 и 2, в которых использованы дендритные клетки, импульсно не обработанные никаким полипептидом, и дендритные клетки, импульсно обработанные полипептидом отрицательного контроля, соответственно (фигура 3).

[0092]

Полученные результаты показали, что полипептиды SEQ ID NO: 20-34 являются пептидами T-клеточных эпитопов, обладающими способностью специфично стимулировать пролиферацию HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, также было обнаружено, что количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными такими полипептидами, намного больше, чем количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком PDS5A, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Полагают, что причина такого явления заключается в том, что полноразмерный белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность по той же причине, которая описана выше.

(2) Анализ цитотоксичности

Затем исследовали следующее: презентируются или не презентируются полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, которые применяют в настоящем изобретении, на молекулах HLA-A0201 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A0201-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; могут ли или не могут CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами согласно настоящему изобретению, повреждать опухолевые клетки, которые являются HLA-A0201-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; и кроме того, обладают ли или не обладают описанные выше CD8-позитивные T-клетки намного более высокой способностью повреждать опухолевые клетки, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками, стимулированными известными пептидами (SEQ ID NO: 75-83), и T-клетками, стимулированными белком PDS5A.

[0093]

Каждую из 10 типов клеточных линий, экспрессия белка PDS5A человека в которых была подтверждена, а именно: клетки U251 линии клеток глиомы (злокачественной опухоли головного мозга) человека; клетки линии клеток лейкоза Jurkat; линию клеток рака печени SK-Hep1; линию клеток рака молочной железы MCF7; линию клеток рака поджелудочной железы Panc1; линию клеток рака яичника OVCAR3; линию клеток рака почки A498; линию клеток рака прямой и ободочной кишки HCT116; линию клеток рака желудка KATO3; и линию клеток рака легкого NCI-H522 (приобретенную из ATCC); собирали в центрифужную пробирку объемом 50 мл в количестве 1×10⁶ клеток каждой. После добавления в пробирки 100 мккюри хрома клетки инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем каждый тип клеток промывали 3 раза средой RPMI (производства Gibco Brl Co.), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (далее называемой FBS; производства Gibco Brl Co.) и помещали в лунки 96-луночного планшета с V-образным дном в количестве 1×10³ клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавляли 5×10⁴ клеток HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, суспендированных в среде RPMI, содержащей 10% FBS, и такие клетки были индуцированы посредством стимуляции каждым из следующих полипептидов: полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, полипептидом отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74), известными пептидами (SEQ ID NO: 75-83) и полноразмерным белком PDS5A, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, затем культивировали в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO_2. После культивирования измеряли количество хрома 51, высвобождаемого из поврежденных опухолевых клеток в каждый надосадок культуры, при этом вычисляли цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных стимуляцией каждым из полипептидов и белком.

[0094]

В результате было показано, что HLA-A0201-позитивные CD8-позитивные T-клетки, индуцированные стимуляцией полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, проявляют заметную высокую цитотоксическую активность, которая намного выше обычно прогнозируемого диапазона, против всех описанных выше 10 типов клеток. В качестве типичных примеров цитотоксическая активность против клеток U251 и клеток Jurkat показаны на фигуре 4A и фигуре 4B, соответственно. Можно видеть, что CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19 (дорожки 13-29, соответственно), проявляют намного более высокую цитотоксическую активность против клеток U251 и клеток Jurkat, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками, стимулированными полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83 (дорожки 4-12, соответственно), и такими клетками, стимулированными полноразмерным белком PDS5A (дорожка 3). С другой стороны, CD8-позитивные T-клетки, индуцированные полипептидом отрицательного контроля (дорожка 2), не проявляли какой-либо цитотоксической активности, результат примерно такой ж, как в случае имитации (дорожка 1). Полученные результаты свидетельствуют, что каждый из полипептидов SEQ ID NO: 3-19, используемых в настоящем изобретении, презентируется на молекулах HLA-A0201 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A0201-позитивными и которые экспрессируют полипептид PDS5A человека, и кроме того, свидетельствуют, что полипептиды согласно настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CD8-позитивные цитотоксические T-клетки, способные повреждать такие опухолевые клетки, до уровня, намного выше прогнозируемого диапазона. Кроме того, независимо от того факта, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A включает в себя последовательности SEQ ID NO: 3-19, CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полноразмерным белком PDS5A, проявляли намного более низкую цитотоксическую активность, по сравнению с активностью CD8-позитивных T-клеток, стимулированных полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3-19 (дорожки 3, 13-29). Причина такого явления заключается в том, что белок PDS5A не может индуцировать T-клетки, обладающие высокой цитотоксической активностью, так как аминокислотная последовательность белка PDS5A включает в себя ряд последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.

[0095]

Подобным образом, было исследовано, презентируются ли или не презентируются полипептиды SEQ ID NO: 20-34 на молекулах HLA-A24 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; могут ли или не могут CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами согласно настоящему изобретению, повреждать опухолевые клетки, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; и кроме того, обладают ли описанные выше CD8-позитивные T-клетки намного более высокой способностью повреждать опухолевые клетки, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками, стимулированными белком PDS5A.

[0096]

Обеспечивали возможность включения хрома 51 в 6 типов клеточных линий, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека, а именно: линию лейкозных клеток THP1; линию клеток глиомы человека KNS-42; линию клеток рака печени SK-Hep1; линию клеток рака почки Caki1; линию клеток рака прямой и ободочной кишки SW480; и линию клеток рака желудка KATO3 (приобретенные из RIKEN и ATCC). Клетки каждого типа культивировали с HLA-A24-позитивными CD8-позитивными T-клетками, которые были индуцированы стимуляцией каждым из полипептидов: полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34; полипептидом отрицательного контроля (SEQ ID NO: 84) и полноразмерным белком PDS5A, и измеряли количество хрома 51, высвобождаемого из поврежденных клеток в надосадок каждой культуры.

[0097]

В результате было обнаружено, что HLA-A24-позитивные CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, проявляют заметно более высокую цитотоксическую активность, которая была намного выше обычно прогнозируемого диапазона, против всех типов используемых злокачественных клеток. В качестве типичным примеров показана цитотоксическая активность против клеток THP1 и клеток SW480 на фигуре 5A и фигуре 5B, соответственно. Можно видеть, что CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34 (дорожки 4-18, соответственно), проявляют заметно более высокую цитотоксическую активность против клеток THP1 и клеток SW480, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками (дорожка 3), стимулированными полноразмерным белком PDS5A. С другой стороны, CD8-позитивные T-клетки, индуцированные полипептидом отрицательного контроля (дорожка 2) не проявляли никакой цитотоксической активности, результат примерно такой же, как в случае имитации (дорожка 1). Таким образом, можно видеть, что каждый из полипептидов SEQ ID NO: 20-34 презентируется на молекулах HLA-A24 на клетках, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека, и полученные результаты свидетельствуют о том, что полипептиды согласно настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CD8-позитивные цитотоксические T-клетки, способные повреждать такие клетки.

[0098]

С другой стороны, когда описанные выше 14 типов злокачественных клеток подвергали воздействию полипептидов, представленных аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3-34, и полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, злокачественные клетки вообще не были убиты. Полученный результат подтверждает тот факт, что такие полипептиды не обладают активностью непосредственно убивать злокачественные клетки.

[0099]

Цитотоксическую активность определяли, как описано выше, смешивая 5×10⁴ клеток CD8-позитивных T-клеток, стимулированных и индуцированных каждым из полипептидов, применяемых в настоящем изобретении, и 1×10³ клеток каждого типа опухолевых клеток, в которые был включен хром 51; культивируя каждую смесь клеток в течение 4 часов; измеряя количество хрома 51, высвобождаемого в каждую культуральную среду, после культивирования; и вычисляя цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток против каждого типа опухолевых клеток (называемых клетками-мишенями) согласно следующей формуле *.

[0100]

*Формула: цитотоксическая активность (%)=количество хрома 51, высвобождаемого из клеток-мишеней при добавлении CD8-позитивных T-клеток/количество хрома 51, высвобождаемого из клеток-мишеней при добавлении 1 N хлористоводородной кислоты × 100.

Пример 4: Индукция CD4-позитивных T-клеток, взаимодействующих с пептидными эпитопами, полученными из пептида, происходящего из белка PDS5A.

Для прогнозирования эпитопов антигенов CD4-позитивных T-клеток аминокислотную последовательность белка PDS5A человека анализировали с помощью компьютерной программы прогнозирования, в которой использован алгоритм SYFPEITHI (Rammensee), и отобрали 33 типа пептидов, представленных в SEQ ID NO: 35-67, и предположительно являющихся пептидами, связывающими молекулы HLA класса II. Все отобранные пептиды синтезировали в компании Greiner Japan Co. Ltd., которая предоставляет специализированные услуги по синтезу пептидов.

[0101]

Периферическую кровь, полученную от здорового HLA-DRB1*04-позитивного индивидуума, разделяли. Периферическую кровь наслаивали на среду для отделения лимфоцитов (производства Organon Teknika Corporation) и центрифугировали при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 20 минут. PBMC-содержащую фракцию собирали и промывали 3 раза (или больше) холодным раствором фосфатного буфера, получая PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (производства Life Technologies, Inc.) и давали возможность прикрепиться к культуральному флакону (производства Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO₂. Неприкрепленные клетки использовали для получения T-клеток, а прикрепленные клетки использовали для получения дендритных клетки.

[0102]

Прикрепленные клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 ед./мл) и GM-CSF (1000 ед./мл). Спустя шесть дней среду заменяли средой AIM-V с добавлением IL-4 (1000 единиц/мл), GM-CSF (1000 единиц/мл), IL-6 (1000 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), IL-1β (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation) и TNF-α (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и клетки культивировали в течение еще 2 дней. Полученную в результате популяцию неприкрепленных клеток использовали в качестве дендритных клеток.

[0103]

Полученные таким образом дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при плотности клеток 1×10⁶ клеток/мл. Каждый из полипептидов SEQ ID NO: 35-67, полипептид отрицательного контроля (SEQ ID NO: 85) и белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, добавляли к клеткам в концентрации 10 мг/мл с последующим культивированием в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO₂ с использованием 96-луночного планшета. После культивирования клетки облучали рентгеновскими лучами (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека (производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-6 (1000 единиц/мл) и IL-12 (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и затем помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10⁵ клеток на лунку. Затем полученную популяцию T-клеток добавляли в лунки в количестве 1×10⁶ клеток на лунку, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO_2. Спустя семь дней надосадок каждой культуры отбрасывали. Затем дендритные клетки, обработанные каждым пептидом, полученным таким же образом, как описано выше, или белком PDS5A, после облучения рентгеновским излучением суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека (производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.) и IL-2 (10 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), и полученную суспензию добавляли в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10⁵ клеток на лунку с последующим дополнительным культивированием клеток. Такие же операции повторяли 4 раза с интервалами в 7 дней и затем собирали стимулированные T-клетки. Затем индукцию CD4-позитивных T-клеток подтверждали проточной цитометрией. В результате было подтверждено, что индуцированные T-клетки в каждой лунке пролиферировали.

Пример 5: Определение полученных из белка PDS5A эпитопов антигена хелперных T-клеток, которые стимулируют HLA-DRB1*04-позитивные CD4-позитивные T-клетки.

Чтобы исследовать специфичность соответствующих CD4-позитивных T-клеток, индуцированных, как описано выше в примере 4, по отношению к соответствующим пептидам и белкам, PBMC, экспрессирующие молекулы HLA-DRB1*04, импульсно обрабатывали различными типами полипептидов. PBMC получали культивированием в среде AIM-V с добавлением каждого полипептида в концентрации 10 мкг/мл в условиях 37°C и 5% CO₂ в течение 4 часов. В качестве разных типов полипептидов использовали соответствующие полипептиды, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 35-67, полипептид отрицательного контроля (SEQ ID NO: 85) и полноразмерный белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. К 5×10⁴ PBMC, которые были импульсно обработаны каждым пептидом, добавляли 5×10⁴ CD4-позитивных T-клеток и клетки культивировали в течение 24 часов в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека, в a 96-луночном планшете. Каждый надосадок после культивирования собирали и измеряли количество продуцированного IFN-γ, используя ELISA.

[0104]

В результате была подтверждена продукция IFN-γ 1000 пг/мл и больше в надосадках культур в лунках с PBMC импульсно обработанными соответствующими пептидами SEQ ID NO: 35-67. С другой стороны, продукцию IFN-γ почти не наблюдали в надосадках культур в лунке с PBMC, импульсно обработанными полипептидом отрицательного контроля, и в лунке, содержащей только дендритные клетки, не обработанные импульсно никаким полипептидом. Таким образом, было обнаружено, что полипептиды, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 35-67, являются пептидами T-клеточных эпитопов, обладающими способностью специфично стимулировать и вызывать размножение HLA-DRB1*04-позитивных CD4-позитивных T-клеток и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, независимо от того факта, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A включает в себя описанные выше последовательности SEQ ID NO: 35-67, обладающие индуцирующей иммунитет активностью, количество IFN-γ, продуцированного в надосадке культуры в лунке с клетками PBMC, импульсно обработанными полноразмерным белком PDS5A, было намного меньше. Полагают, что причина такого явления заключается в том, что белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность, поскольку аминокислотная последовательность белка PDS5A включает в себя несколько последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.

[0105]

Затем исследовали, являются ли полипептиды SEQ ID NO: 35-67 способностью, стимулирующие пролиферацию HLA-DRB1*04-позитивных T-клеток, эпитопами, которые в природе процессируются из белка PDS5A в антигенпрезентирующих клетках и презентируются на HLA-DR. Лизат клеток HEK293 (приобретенных из ATCC), временно экспрессирующих белок PDS5A, добавляли к незрелым дендритным клеткам, обеспечивая возможность расщепления белка и созревания дендритных клеток. Затем исследовали, стимулируются ли T-клетки, стимулируемые каждым из полипептидов SEQ ID NO: 35-67, полипептидом отрицательного контроля и белком PDS5A, полученными в результате дендритными клетками. Периферическую кровь из крови HLA-DRB1*04-позитивного здорового индивидуума разделяли. Периферическую кровь наслаивали на среду для отделения лимфоцитов и центрифугировали при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 20 минут. Промежуточный слой, содержащий PBMC, собирали и 3 раза (или больше) промывали холодным раствором фосфатного буфера, получая PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V и давали возможность прикрепиться к культуральному флакону (производства Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO₂. Прикрепленные клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 единиц/мл) и GM-CSF (1000 единиц/мл) в течение 6 дней, чтобы получить незрелые дендритные клетки. Описанный выше лизат добавляли к 5×10⁵ незрелых дендритных клеток с последующим культивированием в среде AIM-V с добавлением IL-4 (1000 единиц/мл), GM-CSF (1000 единиц/мл), IL-6 (1000 единиц/мл), IL-1β (10 нг/мл) и TNF-α (10 нг/мл) в течение 2 дней. Культивированные дендритные клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека, и затем помещали в лунки 96-луночного планшета в количестве 3,3×10⁴ клеток на лунку. В каждую лунку добавляли 5×10⁴ T-клеток, стимулированных каждым из полипептидов SEQ ID NO: 35-67, полипептидом отрицательного контроля и белком PDS5A, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO₂ в течение 24 часов. Каждый надосадок после культивирования собирали и измеряли количество продуцированного IFN-γ, используя ELISA.

[0106]

В результате, как показано на фигуре 6, было обнаружено, что T-клетки на дорожках 4-36, которые были стимулированы полипептидами SEQ ID NO: 35-67, соответственно, продуцировали IFN-γ в ответ на стимуляцию дендритными клетками, к которым добавляли белок PDS5A. С другой стороны, продукцию IFN-γ почти не наблюдали в T-клетках на дорожке 2, стимулированных полипептидом отрицательного контроля, и T-клетках на дорожке 1, не стимулированным никаким полипептидом. Таким образом, было обнаружено, что полипептиды SEQ ID NO: 35-67 являются эпитопами, которые в природе процессируются из белка PDS5A в антигенпрезентирующих клетках и презентируются на HLA-DR. Кроме того, в настоящем эксперименте продукция IFN-γ в T-клетках на дорожке 3, импульсно обработанных полноразмерным белком PDS5A, также была экстремально низкой. Полагают, что причина такого явления заключается в том, что полноразмерный белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность, поскольку аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A включает в себя несколько последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.

Промышленная применимость

[0107]

Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению, содержащий полипептид, который проявляет противоопухолевую активность против различных типов злокачественных опухолей, применим для лечения или профилактики злокачественной опухоли, или для выявления злокачественной опухоли.

[0108]

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> TORAY INDUSTRIES, INC.

<120> Индуцирующее иммунитет средство

<130> PH-6650-PCT

<150> JP 2015-158539

<151> 2015-08-10

<160> 85

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 7190

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Кодирующая последовательность

<222> (541)..(4554)

<400> 1

ggccggcgga ggaaggggag ggagcgagga gcgcgcgctg ctctcgcgtg ctctcgcgcc 60

gctcgcgtga ccggccggtg tgtgcgcgag gccccggctc ccggggcacg gacggccggg 120

cgcgcgcctc tgcgaggggc gtccgggtcc gagtcggcgg tccgggccgg cgcgaggtgc 180

gtgcgggcgg gccgcggggg tcccggacgg acacaagcgc acacactccc ggaggagcct 240

tcgaggctgc tcttcctcgg ccagacggag agcggcactg tctccccgcc cagcgctcac 300

tcgccccgcg tctccccccg cggcggctgc tcctcctcgg caccgccagc cccagcgccg 360

ctcccgggcg ggcgggcggc ggcggcggcg gcggcgggac ccgcggagcc gctttgtgtg 420

cagcccgact aggggcggcg gcgcaaccac ctgacagagg cccgggcgct cgatgcacct 480

tccgcccgca tgaggaggag aggccggtag aggactgtga accaaaagtt gtcccccagg 540

atg gac ttc acc gcg cag ccc aag cct gcc act gcc ctc tgt ggc gtc 588

Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val

1 5 10 15

gtg agt gcc gac ggg aag atc gct tac cct ccg ggg gta aaa gag atc 636

Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile

20 25 30

acc gac aag atc acc acg gac gag atg atc aaa cgc ctg aag atg gta 684

Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val

35 40 45

gtg aaa acc ttt atg gat atg gat cag gac tca gaa gat gaa aaa cag 732

Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln

50 55 60

cag tat ctc cca cta gcc ttg cat ctt gca tct gaa ttc ttc ctc agg 780

Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg

65 70 75 80

aac ccc aat aaa gat gtg cgt ctc ctt gta gca tgt tgt ttg gct gat 828

Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp

85 90 95

atc ttt cgt atc tat gcc cca gaa gct cca tat act tcc cat gat aaa 876

Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys

100 105 110

ctt aag gac ata ttt ttg ttt att acc aga caa tta aaa ggt ttg gag 924

Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu

115 120 125

gat aca aag agt cca cag ttt aat aga tac ttt tat tta tta gag aat 972

Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn

130 135 140

tta gct tgg gtt aaa tca tat aac atc tgc ttt gaa ttg gaa gat tgc 1020

Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys

145 150 155 160

aat gaa att ttt att cag ctt ttt aga act ctc ttc tca gtg atc aac 1068

Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn

165 170 175

aat agc cac aat aag aag gta caa atg cac atg cta gat ttg atg agt 1116

Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser

180 185 190

tct atc atc atg gaa ggt gat gga gtt act caa gaa tta ttg gac tcc 1164

Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser

195 200 205

att ctt att aac ctc att cct gca cat aag aac tta aat aaa cag tcc 1212

Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser

210 215 220

ttt gac ctt gca aaa gtg cta ttg aaa aga aca gtc cag act att gag 1260

Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu

225 230 235 240

gca tgc att gct aat ttt ttc aat caa gtc ctg gtg ctg gga aga tca 1308

Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser

245 250 255

tca gta agt gat ttg tca gaa cat gta ttt gat ctg att cag gaa ctt 1356

Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu

260 265 270

ttt gct ata gat cct cat tta tta tta tcc gtc atg cca cag ctt gaa 1404

Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu

275 280 285

ttc aaa cta aag agc aat gat gga gaa gag cga tta gct gtt gtt cga 1452

Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg

290 295 300

ctt cta gct aaa ttg ttt ggc tcc aaa gat tct gat ttg gca aca cag 1500

Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln

305 310 315 320

aat cgt cct ctt tgg caa tgt ttt ctt gga cga ttt aat gat att cat 1548

Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His

325 330 335

gtt cct gtg aga tta gaa agt gtg aaa ttt gcc agt cat tgt tta atg 1596

Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met

340 345 350

aat cac cca gat tta gcg aag gat ctc aca gaa tat tta aag gtt aga 1644

Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg

355 360 365

tca cat gat cca gaa gaa gct att cgt cat gat gtc att gtt act ata 1692

Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile

370 375 380

ata aca gct gcc aag agg gac ctg gcc tta gta aat gat cag ctg ctt 1740

Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu

385 390 395 400

ggc ttt gta agg gaa aga aca ctg gat aaa cgg tgg cga gta aga aaa 1788

Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys

405 410 415

gaa gct atg atg ggt ctg gct cag ctt tat aag aaa tac tgt ctt cat 1836

Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His

420 425 430

ggt gaa gca gga aag gaa gct gca gag aaa gtc agc tgg ata aag gac 1884

Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp

435 440 445

aaa ctt ctg cat att tat tat cag aac agc att gac gac aaa ctg ttg 1932

Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu

450 455 460

gta gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtc ccc cac aac ctg gaa aca 1980

Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr

465 470 475 480

gaa gag aga atg aaa tgc tta tat tac tta tat gct agt ttg gat cca 2028

Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro

485 490 495

aat gct gta aaa gct ctc aac gaa atg tgg aag tgt cag aac atg ctt 2076

Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu

500 505 510

cgg agc cat gta cgc gaa cta ttg gat ttg cac aag cag cct aca tca 2124

Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser

515 520 525

gag gct aac tgt tct gcc atg ttt gga aaa ctg atg acc ata gca aag 2172

Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys

530 535 540

aat ttg cct gac ccc ggg aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa ttt aac 2220

Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn

545 550 555 560

cag gtt ctc ggc gat gat gag aaa ctt cgg tct cag ttg gag tta tta 2268

Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu

565 570 575

att agc cca acc tgt tct tgc aaa caa gca gat att tgt gtg aga gaa 2316

Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu

580 585 590

ata gcc cgg aaa ctt gca aat cct aag caa cca aca aat cct ttt cta 2364

Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu

595 600 605

gag atg gtc aaa ttt ctg ttg gaa aga atc gca cct gtg cac att gat 2412

Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp

610 615 620

tca gaa gcc ata agt gca cta gtg aaa ttg atg aat aag tca ata gag 2460

Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu

625 630 635 640

ggg aca gca gat gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct atc 2508

Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile

645 650 655

cgt tca gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttt aca cat cct acc 2556

Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr

660 665 670

tcg ttc cac tct gca gag aca tat gag tcc ttg tta cag tgc cta aga 2604

Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg

675 680 685

atg gag gat gac aag gta gca gaa gct gct att caa att ttt aga aat 2652

Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn

690 695 700

aca ggt cac aaa ata gaa aca gac ctt ccc cag ata cga tcg acc tta 2700

Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu

705 710 715 720

att ccc att tta cat caa aaa gca aag agg ggt act cca cac caa gca 2748

Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala

725 730 735

aaa cag gct gtg cac tgt ata cac gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc 2796

Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val

740 745 750

cag ctt gca cag att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gat 2844

Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp

755 760 765

gtg cca gaa caa ctt ata act cca tta gtt tca ttg ggc cac att tct 2892

Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser

770 775 780

atg tta gca cca gat cag ttt gct tcc cca atg aaa tct gta gta gca 2940

Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala

785 790 795 800

aat ttt att gtg aaa gat ctg cta atg aat gac agg tca aca ggt gaa 2988

Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu

805 810 815

aag aat gga aaa ctg tgg tct cca gat gaa gag gtt tcc cct gaa gta 3036

Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val

820 825 830

cta gca aag gta cag gca att aaa ctt ctg gta agg tgg ctg ttg ggt 3084

Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly

835 840 845

atg aaa aac aac cag tct aaa tct gcc aat tca acc ctt cgg tta tta 3132

Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu

850 855 860

tca gcg atg ttg gtt agt gag ggt gac ctg aca gag caa aag agg atc 3180

Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile

865 870 875 880

agt aaa tct gat atg tct cgc ttg cga tta gct gct ggt agt gcc ata 3228

Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile

885 890 895

atg aag ctt gct cag gaa cct tgt tac cat gaa att att acc cca gaa 3276

Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu

900 905 910

cag ttt cag ctc tgt gca ctt gtt att aat gat gag tgt tac caa gta 3324

Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val

915 920 925

agg cag ata ttt gct cag aag ctg cat aag gca ctt gtg aag tta ctg 3372

Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu

930 935 940

ctc cca ttg gag tat atg gcg atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct 3420

Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro

945 950 955 960

gtg aag gag aga aga gca cac gca cga caa tgt tta ctg aaa aat atc 3468

Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile

965 970 975

agt ata cgc agg gaa tac att aag cag aat cct atg gct act gag aaa 3516

Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys

980 985 990

tta tta tca ctg ttg cct gaa tat gta gtt cca tac atg att cac ctg 3564

Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu

995 1000 1005

cta gcc cat gat cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat cag 3609

Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln

1010 1015 1020

ctt cgt gat atc aaa gag tgc cta tgg ttc atg ctt gaa gtt tta 3654

Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu

1025 1030 1035

atg aca aag aat gaa aac aat agc cat gcc ttt atg aag aag atg 3699

Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met

1040 1045 1050

gca gag aac atc aag tta acc aga gat gcc cag tct cca gat gaa 3744

Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu

1055 1060 1065

tcc aag aca aat gaa aaa ctg tat aca gta tgt gat gtg gct ctc 3789

Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu

1070 1075 1080

tgt gtt ata aat agt aaa agt gct ttg tgc aat gca gat tca cca 3834

Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro

1085 1090 1095

aag gac cca gtc ctc cca atg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag 3879

Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys

1100 1105 1110

gac ttc tgt aac gat aag agt tat att tca gaa gag aca aga gta 3924

Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val

1115 1120 1125

ctt ctg tta aca gga aag cca aag cct gct gga gta cta ggt gca 3969

Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala

1130 1135 1140

gta aat aag cct tta tca gca acg gga agg aaa ccc tat gtt aga 4014

Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg

1145 1150 1155

agc act ggc act gag act gga agc aat att aat gta aat tca gag 4059

Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu

1160 1165 1170

ctg aac cct tca acc gga aat cga tca agg gaa cag agt tca gag 4104

Leu Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu

1175 1180 1185

gca gca gaa act gga gtt agt gaa aat gaa gag aac cct gtg agg 4149

Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg

1190 1195 1200

att att tca gtc aca cct gta aag aat att gac cca gta aag aat 4194

Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn

1205 1210 1215

aag gaa att aat tct gat cag gct acc cag ggc aac atc agc agt 4239

Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser

1220 1225 1230

gac cga gga aag aaa aga aca gta aca gca gct ggt gca gag aat 4284

Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn

1235 1240 1245

atc caa caa aaa aca gat gag aaa gta gat gaa tcg gga cct ccc 4329

Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro

1250 1255 1260

gcc cct tcc aaa ccc agg aga gga cgt cga ccc aag tct gaa tct 4374

Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser

1265 1270 1275

cag ggc aat gct acc aaa aat gat gat cta aat aaa cct att aac 4419

Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn

1280 1285 1290

aag gga agg aag aga gct gca gtg ggt cag gag agc cct ggg ggt 4464

Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly

1295 1300 1305

ttg gaa gca ggt aat gcc aaa gca ccc aaa ctg caa gat tta gcc 4509

Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala

1310 1315 1320

aaa aag gca gca cca gca gaa aga caa att gac tta caa agg taa 4554

Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg

1325 1330 1335

aaatgcattt gcaaagggag aaaatgaagg ccaaacagaa gcaggctcca gcttctgcaa 4614

aaacttggat tcacaaatgt ccctgaacag aaaatgaagc tcacttcaga acacacactc 4674

tctgccttga aaactaaaga gactattact tccttttcac atgaccacaa gtcctctgat 4734

ggaaatgtac agcagaaact cttgagagag aggctaaaag caactctgtt ctcccccttc 4794

ccctagactt ttcttacgaa aagtcaataa ttaagcaaat tgcttaacac ttggttccag 4854

ttcctgccta tctggagttt aaatgcgtaa tacaccatta atttccacgc tgcagttttt 4914

attttaaaga aagtaacaag atgtctttac actgacactg aaaattcatc cattttagag 4974

ccaggaattc ccatgttaca caggaaaaaa tagaagtcta ctgaattaat tttttaaaag 5034

aaaagagatc agattaaata tttctttgtt tttccttttg gaaactttta tgtataattc 5094

tttctgcctg cctacttttc tgcaaaaatg agatgtacag atttcggttc cctgctatga 5154

aaagtgatgt ggtagcaatt ttataaatgt tgctttctga tttttatcag agtgagaaaa 5214

ttaaaattat tgatttgcaa gtagtaaaca gttcatattt tgatttcccc tcattttagt 5274

ttaatataat ttgcaataaa tgtacatatt gttgtttgtt tcataaagca tatcacttta 5334

aaatggtttt tactcctgtg attatgttgg aatatttgga attttaaagg agtaaagact 5394

gtccagcatt tggttttata atgtttgtca ccagattttt attaatgtaa aaaaaatcaa 5454

tttttaaaaa atagttggac tttggcagct tttaaggaaa gttggaggtg ttttaggatt 5514

gctatcaatt ttcagcattg tgctatttgg aaataagtgt tttgcttttg tctgatggtc 5574

tgggctcatt tttatgttta ttttagaaaa ctgttgcatc aatatattat gtttcttggc 5634

attgttcagc ataggtaatg tgtgcacttt atgtgtacac ataatcatat ttaagttttt 5694

tgcataaaat aaatgcttct agatgtcatg gcagtctttt taatcttttt atcatatgct 5754

ttcttgtgaa ttttttcatg ttaaagagct aaagtcataa catgattaca gtcaactctc 5814

cattatctat ataaaatagt gactaagcct caggttttta attttgtgat aacaaaataa 5874

cgaaggcatg taagacctga ttctggagga acatgaaatt tgtcttttct catgtccaga 5934

gttctatcct gcccccactg tccactgtag ggtcatccgc aaagccctag cagaatgtgc 5994

tcactccatt tccttacacg tttctagcat gggtcagagg aaacaacatt tgtgttataa 6054

cttcgtcttg ataggctgta gtgtacatgg gatgtaaaac aaacaagtgt atcaaaggtg 6114

gatgattctg ttagagtgaa gtttgagagt aaatgtcact tacgtttctc atagataatc 6174

aagagttggc tgtgtattga ctgaaagatg ggtaattatt ttaaatatgc atttacacac 6234

atttaggtat cagaagatgc ttagggaaca atggatacca atgatagaaa atgatacctt 6294

tacaggggca gaaaaatccc cactcttcct tattgcctct tcagaaccct ttagaaagta 6354

taaaatattg cctccaacat gctgaaaaag agtatctatg cataagtatc agagaagtcc 6414

ctcaagcaat cagtaggtgt gttctattta gagagagttt aaagttctct tagcatcaga 6474

caacttgatt cctaaggttt ccagtgtgtc accaacaaaa agtgcattga tagggacctt 6534

tgtctcttcc tccctttgat taattgcccg gcatcacagt ttactagatt accaagtgtt 6594

acatcatatt aaataaaatg tagcagaacc atctgcatca atatattcct gtttagattt 6654

ttgcaggaga gaagttaaaa ggatttgctc cttgtatgat gtaagtggcc caccccaatt 6714

ttgtaacatg atgcaagtgt ctggcactaa gggaagcaag agtagggttg tggaaagacc 6774

aagctgatgg ggagggactt gtttacggga atttttttag ttttcctttt caaaggaaaa 6834

cattaaaatc ccttaggaat ttggtattca catctcagag aactacaaca caaaagtgca 6894

gacttatatt tgagaattaa tgttaaccct ttgtgtctag tttgaagctt cttgtatttg 6954

tctaaaacaa caagccagaa ttttgtatct cctttgataa aaagtgtgta taatgtaaag 7014

tagttttgca tattcttgtg ctgcacatgg gctgaatttt taaatttttt ttaaaaactt 7074

gaagcagaac cttgtaattt gtgtaaatga caagtgtaaa atcctaccat aaaatgctaa 7134

aaatatgcac tgtttcaaat aaaaccaaga aatgcagcat taaaaaaaaa aaaaaa 7190

<210> 2

<211> 1337

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val

1 5 10 15

Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile

20 25 30

Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val

35 40 45

Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln

50 55 60

Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg

65 70 75 80

Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp

85 90 95

Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys

100 105 110

Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn

130 135 140

Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys

145 150 155 160

Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn

165 170 175

Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser

180 185 190

Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser

195 200 205

Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser

210 215 220

Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu

225 230 235 240

Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser

245 250 255

Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu

260 265 270

Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu

275 280 285

Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg

290 295 300

Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln

305 310 315 320

Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His

325 330 335

Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met

340 345 350

Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg

355 360 365

Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile

370 375 380

Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu

385 390 395 400

Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys

405 410 415

Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His

420 425 430

Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp

435 440 445

Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu

450 455 460

Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr

465 470 475 480

Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro

485 490 495

Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu

500 505 510

Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser

515 520 525

Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys

530 535 540

Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn

545 550 555 560

Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu

565 570 575

Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu

580 585 590

Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu

595 600 605

Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp

610 615 620

Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu

625 630 635 640

Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile

645 650 655

Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr

660 665 670

Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg

675 680 685

Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn

690 695 700

Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu

705 710 715 720

Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala

725 730 735

Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val

740 745 750

Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp

755 760 765

Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser

770 775 780

Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala

785 790 795 800

Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu

805 810 815

Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val

820 825 830

Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly

835 840 845

Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu

850 855 860

Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile

865 870 875 880

Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile

885 890 895

Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu

900 905 910

Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val

915 920 925

Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu

930 935 940

Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro

945 950 955 960

Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile

965 970 975

Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys

980 985 990

Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu

995 1000 1005

Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln

1010 1015 1020

Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu

1025 1030 1035

Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met

1040 1045 1050

Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu

1055 1060 1065

Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu

1070 1075 1080

Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro

1085 1090 1095

Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys

1100 1105 1110

Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val

1115 1120 1125

Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala

1130 1135 1140

Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg

1145 1150 1155

Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu

1160 1165 1170

Leu Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu

1175 1180 1185

Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg

1190 1195 1200

Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn

1205 1210 1215

Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser

1220 1225 1230

Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn

1235 1240 1245

Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro

1250 1255 1260

Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser

1265 1270 1275

Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn

1280 1285 1290

Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly

1295 1300 1305

Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala

1310 1315 1320

Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg

1325 1330 1335

<210> 3

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp Ile

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Leu Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Asn Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Leu Asn Ala Asp Val Pro Glu Gln Leu

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 15

Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 17

Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 18

Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 19

Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu Cys Val

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 21

Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 22

Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 23

Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 25

Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp

1 5

<210> 26

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 26

Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe

1 5 10

<210> 27

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 27

Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 28

Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu Phe

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 29

Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 30

Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 31

Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu

1 5 10

<210> 32

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 32

Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 33

Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 34

Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu

1 5

<210> 35

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 35

Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu

1 5 10 15

<210> 36

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 36

Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu

1 5 10 15

Asp Thr Lys

<210> 37

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 37

Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser

1 5 10 15

Tyr

<210> 38

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 38

Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu

1 5 10 15

<210> 39

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 39

Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn

1 5 10 15

Asn Ser

<210> 40

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 40

Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met

1 5 10 15

His

<210> 41

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 41

Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser Ser Ile Ile

1 5 10 15

Met Glu

<210> 42

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 42

Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn

1 5 10 15

Lys Gln Ser

<210> 43

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 43

Ile Gln Glu Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met

1 5 10 15

Pro Gln Leu Glu Phe Lys Leu

20

<210> 44

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 45

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 45

His Asp Val Ile Val Thr Ile Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Asn

<210> 46

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 46

Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys Asn Leu Pro Asp

1 5 10 15

Pro Gly Lys

<210> 47

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 47

Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu

1 5 10 15

<210> 48

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 48

Glu Cys Leu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gly Thr Ala

20

<210> 49

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 49

Pro Thr Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 50

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 50

Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile Glu Thr

1 5 10 15

Asp Leu

<210> 51

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 51

Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala

1 5 10 15

Lys Arg

<210> 52

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 52

Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln

1 5 10 15

<210> 53

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 53

Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val

1 5 10 15

Gln Leu Ala Gln

20

<210> 54

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 54

Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala Asn Phe Ile Val Lys Asp

1 5 10 15

<210> 55

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 55

Val Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu

1 5 10 15

Gly Met Lys

<210> 56

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 56

Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ala

<210> 57

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 57

Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser Ala Met Leu Val Ser Glu

1 5 10 15

Gly Asp Leu Thr

20

<210> 58

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 58

Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met

1 5 10 15

Lys Leu

<210> 59

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 59

Cys Tyr Gln Val Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu

1 5 10 15

Val Lys Leu

<210> 60

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 60

Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro

1 5 10 15

<210> 61

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 61

Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser Ile Arg Arg Glu

1 5 10 15

Tyr Ile

<210> 62

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 62

Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu

1 5 10 15

<210> 63

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 63

Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn

1 5 10 15

Asn Ser His Ala Phe Met

20

<210> 64

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 64

Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg

1 5 10 15

Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu

20

<210> 65

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 65

Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys

1 5 10 15

Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu

20

<210> 66

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 66

Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly

1 5 10 15

Arg Lys

<210> 67

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 67

Glu Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp

1 5 10 15

Pro

<210> 68

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер смысловой

<400> 68

gtaaggtggc tgttgggtat g 21

<210> 69

<211> 24

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер антисмысловой

<400> 69

ggctagcagg tgaatcatgt atgg 24

<210> 70

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер GAPDH

<400> 70

gggctgcttt taactctg 18

<210> 71

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер GAPDH

<400> 71

ccaggaaatg agcttgac 18

<210> 72

<211> 29

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер смысловой

<400> 72

gcggccgcat ggacttcacc gcgcagccc 29

<210> 73

<211> 29

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> праймер антисмысловой

<400> 73

ctcgagttac ctttgtaagt caatttgtc 29

<210> 74

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 74

Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu

1 5

<210> 75

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 75

Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu

1 5

<210> 76

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 76

Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val

1 5 10

<210> 77

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 77

Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His Val

1 5 10

<210> 78

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 78

Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile

1 5 10

<210> 79

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 79

Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu

1 5 10

<210> 80

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 80

Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile

1 5

<210> 81

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 81

Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val

1 5 10

<210> 82

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 82

Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr

1 5

<210> 83

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 83

Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser Ser Val

1 5 10

<210> 84

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 84

Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu

1 5

<210> 85

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 85

Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln

1 5 10 15

Asp Val

<---

1. Композиция, имеющая индуцирующую иммунитет активность против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201, содержащая по меньшей мере один полипептид в качестве активного ингредиента, который имеет индуцирующую иммунитет активность против белка PDS5A и выбранный из группы полипептидов, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 3 - 19.

2. Композиция по п. 1, в которой полипептид связывается с молекулой MHC класса I, который представляет собой любой полипептид, выбранный из группы полипептидов, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 3 - 19.

3. Композиция по п. 1 или 2, которая применима в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

4. Композиция по п. 3, где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок PDS5A.

5. Композиция по п. 3 или 4, где злокачественной опухолью является лейкоз, злокачественная лимфома, рак простаты, рак печени, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, злокачественная опухоль головного мозга, рак легкого или рак пищевода.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащая иммуностимулятор.

7. Полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201 и выбранный из группы полипептидов, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 3 - 19.

8. Композиция, имеющая индуцирующую иммунитет активность против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201, содержащая рекомбинантный вектор в качестве активного ингредиента, который содержит по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы полипептидов, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 3 - 19.