Способ мультиплексного анализа в-клеток для оценки клеточного звена иммунной системы рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Способ мультиплексного анализа В-лимфоцитов рогатого скота для оценки В-клеточного звена иммунной системы заключается в том, что проводят исследования на 10-луночных предметных стеклах с двумя контрольными лунками с адсорбированными В-клетками положительный контроль, полученными методом сепарации с частицами латекса, покрытых моноклональными антителами к CD19, и Т-клетками отрицательный контроль, полученными методом сепарации с частицами латекса, покрытых моноклональными антителами к CD3 из пула мононуклеаров крови рогатого скота. Используется прямой метод иммунопероксидазного окрашивания с применением в качестве детектирующих антител олигоклональной системы, не конкурирующих между собой моноклональных антител к G9 и С2-конформационным и C11-линейному эпитопу молекулы IgM рогатого скота. Далее окрашивают азур-эозином для проведения морфологического исследования В-клеток: их формы, размера клеток, ядра, ядерно-цитоплазматического соотношения, структуры хроматина. Изобретение обеспечивает разработку производительного, высокочувствительного и специфичного способа мультиплексного исследования. 12 ил., 3 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно иммунологии и может быть использовано для проведения исследований по выявлению и морфологии В-лимфоцитов крупного и мелкого рогатого скота в пробах крови и клеточных суспензиях различных органов.

Уровень техники

Количество иммунокомпетентных клеток каждого вида, их внешний вид и качественные характеристики - составляют общий клинический анализ крови. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови является одним из наиболее широко применяемых методов клинической лабораторной диагностики, который позволяет оценить состояние иммунной системы и ее нарушения у здоровых животных и при различных патологиях (иммунодефицитных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, воспалительных процессах, аллергических реакциях, и инфекционных и незаразных болезнях). Изучение характера локализации иммуноглобулиновых рецепторов (sIg) на поверхности В-клеток животных является перспективным направлением в рамках исследования механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза у животных. Эти структуры являются мишенями при иммунофенотипировании лимфоцитов и выявляются специфическими антителами.

Специфичность маркера sIgM⁺ обусловливается присутствием его практически на всех стадиях дифференцировки В-клеточной линии и отсутствием на других клетках иммунной системы.

В-лимфоцит в процессе созревания проходит стадии, для которых характерным является определенная локализация мономера IgM: 1. пре- В- лимфоцит-активно пролиферирующей клетки, имеющей цитоплазматические cIgM; 2. незрелый В- лимфоцит характеризуется появлением мембранного (рецепторного) sIgM на поверхности клетки; 3. зрелый В- лимфоцит, который может иметь два мембранных рецептора с одинаковой антигенной специфичностью (изотипа) - sIgM и sIgD.

Поверхностные антигены клеток находятся в постоянном подвижном «плавающем» состоянии. Перемещение IgM рецепторов по клеточной поверхности дает возможность концентрироваться им на одном участке мембраны в виде кластеров, имеющих форму «кэпов», «пэтчей», что способствует проведению антигенного сигнала в клетки. Рецепторные комплексы либо поглощаются лимфоцитами (эндоцитоз), либо сбрасываются в межклеточное пространство (шеддинг).

Образование В-клеток начинается в эмбриональной печени, затем в течение жизни организма в костном мозге - важнейшем кроветворном органе, где развиваются различные клоны В-клеток. Развитие этой популяции лимфоцитов зависит от экспрессии пре-BCR (рецептор В-клеток для антигена), сформированного из молекул суперсемейства иммуноглобулинов sIgM и CD79. Пре-В клетки могут впоследствии проходить продуктивную реаранжировку генов легких цепей, чтобы стать IgM-несущими В-клетками. В цитоплазме пре-В-клеток обнаруживается тяжелая μ-цепь IgM. Наивная В-клетка на своей поверхности экспрессирует мономерные молекулы данного иммуноглобулина. Циркулирующая, фолликулярные и экстра-фолликулярные В-клетки также несут на своей мембране sIgM.

В онтогенезе дифференцировка в зрелые В-клетки сопровождается изменением фенотипа лимфоцита, но поверхностный иммуноглобулин М является определяющим рецептором одного клона клеток, определяемого с помощью моноклональных антител методами иммуноцитохимии. Мембраносвязанные Ig и антитела являются сигнальными молекулами, с помощью которых осуществляются основные адаптивные иммунные реакции организма.

С использованием моноклональных антител к иммуноглобулинам, возможно изучение локализации поверхностных иммуноглобулинов (sIg) клетки и определение количества В-лимфоцитов. Изучение роли различных В-клеточных субпопуляций в иммунном ответе, механизмов их формирования и зависимости от факторов микроокружения является важнейшей задачей современной фундаментальной иммунологии.

Имеющиеся в литературе разночтения относительного содержания В-клеток в крови различных животных вызывают необходимость изыскания наиболее специфичного и точного метода их определения. Моноклональное антитело, направленное к одной антигенной детерминанте на молекуле иммуноглобулина М, является высокоспецифичным реагентом для определения антител и В-клеток. Мембранный IgM является неотъемлемой частью В-клеточного рецептора (BCR), важнейшего элемента развития и жизнеспособности В-клеток и его обнаружение на мембране клетки доказывает ее принадлежность к популяции В-лимфоцитов.

Определение экспрессии различных белков на поверхности клеток, основано на высокоспецифичной реакции антиген - антитело. Иммуноцитохимическое исследование - это метод молекулярной диагностики, используемый для оценки наличия специфического белка или антигена в клетках с использованием комплементарного антитела, которое связывается с ним, что позволяет визуализировать и анализировать результаты под микроскопом. Данный метод позволяет проводить иммунологический анализ цитологического материала в условиях сохранения морфологии клеток. Результаты оцениваются качественно и количественно.

В настоящий момент в литературе и медицинской практике широко освещается и применяются в анализе субпопуляционного состава лимфоцитов при иммунологических исследованиях многопараметровые проточные цитофлуориметры-анализаторы, вытесняя методы флуоресцентной и световой микроскопии. Метод проточной цитометрии предусматривает использование соответствующего набора и сочетания поли- или моноклональных антител к антигенам клеток и флуоресцентных меток [Van Dongen, J. J. M., Lhermitte, L, Bottcher, S., Almeida, J., Van der Velden, V.H. J., Flores-Montero, J., Mejstrikova, E. Euro Flow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes // Leukemia, 2012, 26(9), 1908]. В отечественной ветеринарной практике данный метод не так широко применяется, так как требует использования дорогостоящего оборудования (проточного цитофлуориметра) и импортных реактивов (флуоресцентные метки и антитела), так же в ветеринарной практике отсутствуют отечественные моноклональные антитела (МКА) к CD рецепторам лимфоидных клеток животных, что обусловливает невозможность его использования.

К тому же этот метод не дает информации о пространственном распределении sIg- и CD-рецепторов лимфоидных клеток; о расположении рецептор-экспрессирующих клеток в лимфоидных тканях и органах; морфологии клеток [Kuldeep S., Chattha et al. Immunohistochemical investigation of cells expressing CD21, membrane IgM, CD32 and a follicular dendritic cell marker in the lymphoid tissues of neonatal calves // Veterinary Immunology and Immunopathology, 2010, V. 137, (3-4), p. 284-290]. Поэтому, по-прежнему актуальным и лучшим способом остается световая микроскопия, используемая в клинической лабораторной диагностике, а также при подозрении на наличие патологических форменных элементов крови, выявления и оценки атипичных и незрелых иммунокомпетентных клеток.

Также в медицинской практике для исследования и оценки состояния В- и Т-клеточных популяций существуют способы применения иммунологических биочипов, суть которых заключается в том, что биочип представляет собой прозрачную подложку, выполненную из сплавов стекла, поливинилхлорида, нитроцеллюлозы и т.п., на которой размещены тестовые участки с иммобилизованными моноклональными антителами, специфичными к определенным CD-рецепторам лимфоцитов.

Клетки, имеющие на своей мембране соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизованными в строго определенных участках поверхности-подложки. Затем биочип отмывают от клеток, не специфически связавшихся с поверхностью биочипа, но не связавшихся с иммобилизованными антителами. В результате, на поверхности биочипа остаются только клетки, связавшиеся с антителами. Выполняют считывание результата, при котором получают изображение пятен биочипа (участков поверхности биочипа с иммобилизованными антителами). При определении иммунофенотипа лимфоцитов на биочипе процентное содержание клеток, экспрессирующих антиген CDx, определяли как плотность связывания клеток с анти-CDx на биочипе, нормированную на плотность связывания с анти-CD45. Плотность связывания клеток определялась подсчетом в программах ImageJ и CellProfiler. После этого биочип высушивают на воздухе, фиксируют метанолом, окрашивают по Романовскому-Гимза и проводят морфологическое исследование связавшихся клеток. Осуществляют анализ результатов. [А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток», Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с. 277-284]. [Шишкин А.В. Способ исследования клеток с помощью биочипа: пат. на изобр. 2433175 Россия. МПК C12N 5/07, G01N 33/53, С07К 17/14 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - №2009144005; заявл. 30.11.2009; опубл. 10.11.2011. - бюл. №31].

[Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного бичипа. Атауллаханов Ф.И., Новичкова Г.А., Кузнецова С.А., Федянина О.С., Хвастунова А.Н., Закирова А.О. RU 2681651 С1 МПК G01N 33/50(2006.01) 2017.12.18].

Существует способ диагностики с использованием методов определения морфологии и проточной цитометрии. При этом исследования проб пунктата костного мозга проводятся параллельно в мазках методами морфологии и цитохимии. Этот метод является наиболее точным из описанных, закреплен в медицинских стандартах и рекомендуется Всемирной организацией здравоохранения [Swerdlow, S., Campo, Е., Harris, N.L, Jaffe, E.S., Piled, S.A., Stein, H., Vardiman, J.W. (2008). WHO Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th Ed., c. 110-139, c. 168-178]. Однако при работе по данному способу требуется сравнивать данные, полученные с помощью двух диагностических методов, причем бластная популяция в них определяется по-разному. Это может приводить к затруднению в сопоставлении данных и постановке диагноза.

К недостаткам иммунобиочипов можно отнести: необходимость использования специального оборудования для иммобилизации отдельных МКА на подложку и сканирования биочипов со связавшимися клетками. Также препятствовать взаимодействию иммобилизированных МКА и лимфоцитов и, соответственно, их адсорбции на подложке, может наличие таких феноменов как цитоплазматическая локализация рецептора IgM (пре-В-лимфоциты) и других ко-рецепторов, эндоцитоз, интернализация, и шеддинг поверхностных рецепторов лимфоцитов, отсутствие маркера CD19 на плазматических В клетках, что повлечет за собой определение неполной картины популяций циркулирующих лимфоцитов в пробе. К тому же основным препятствием внедрения в ветеринарную практику иммунобиочипов является отсутствие отечественных МКА к CD-рецепторам лимфоидных клеток животных.

Известен Способ оценки экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитами периферической крови в микроварианте методом флуоресцирующих антител (МФА) на стекле.

В пленке «Parafilm» делают отверстия диаметром 3мм, фиксируют на обезжиренном предметном стекле наплавлением. В каждую образовавшуюся лунку вносят раствор поли-L-лизина, инкубируют при 37°С, затем в каждую лунку вносят исследуемую взвесь лимфоцитов, инкубируют при 37°С, отмывают, после чего в лунки вносят раствор соответствующих моноклональных антител. Препарат инкубируют при 4°С, промывают и вносят в лунки рабочий раствор Fab-фрагментов антимышиных антител, меченых флуорохромом. Инкубируют при 4°С, промывают. Вносят фосфатный буфер (ЗФР) с глицерином (глицерин смешивают с ЗФР 1:1 по объему). Препарат микроскопируют в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа «Люмам ИЗ». Оценивают наличие и специфичность флуоресценции (Фримель Г., 1987) не менее чем у 200 клеток. [Шуганов А.Е. Клинико-иммунологические корреляции у больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких Дисс. канд. мед. наук 14.01.04 - Внутренние болезни. 147 с.].

Недостатком данного метода является проведение исследования в условиях, защищенных от света, невозможность длительного хранения препаратов ввиду быстрого затухания флуоресценции, даже при использовании реагентов, снижающих данный эффект.

В ветеринарной практике известен «Способ определения антител» [Ездакова И.Ю. RU 2293330 C1 G01N 33/53(2006.01) 2007.02.10. Бюл. №4.] Сущность данного «Способа…» включает добавление в выделенные мононуклеары крови раствора лимонной кислоты, отмывки фосфатным буфером, инкубацией при 4°С в среде RPMI-1640 с сывороткой лошади, фиксацию клеток и использование в качестве антигена МКА к IgM крупного рогатого скота в разведении 1:10 тыс.-20 тыс. Использование «Способа…» дает возможность определять в мазках проб отобранной фракции мононуклеаров крови цитоплазматические и мембранные иммуноглобулины животных. Данный способ выбирается в качестве прототипа.

К недостаткам данного метода следует отнести: использование для исследования мазков выделенных мононуклеарных клеток (МНК), что влечет за собой большой расход реагентов, в том числе МКА; трудность учета морфологически измененных клеток расположенных на большой площади мазка, вероятность неадекватной оценки малоклеточных популяций лимфоцитов в пробе, невозможность организации контроля специфичности метода.

Технической проблемой является необходимость разработки производительного, высокочувствительного и специфичного способа идентификации В-лимфоцитов в крови и других органах крупного и мелкого рогатого скота, позволяющего проводить комплексные исследования клеток в одной пробе, а именно количественный анализ, изучение субпопуляционного состава, определение функциональной активности, степени дифференцировки и морфологии В-клеток для оценки клеточного звена иммунной системы рогатого скота, расширение арсенала способов анализа В-клеток для оценки клеточного звена иммунной системы рогатого скота.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является разработка производительного, высокочувствительного и специфичного способа мультиплексного исследования, включающего в себя определение количества, субпопуляционного состава, функциональной активности, морфологии В-клеток рогатого скота одновременно в одной пробе биологической жидкости, который обеспечивает соответствие результатов поставленным задачам, расширение арсенала способов анализа В-клеток для оценки клеточного звена иммунной системы рогатого скота.

Использование в способе положительного и отрицательного контролей повышает точность и обеспечивает стандартизацию исследования В-лимфоцитов.

Способ мультиплексного анализа В-лимфоцитов рогатого скота на основании одномоментного исследования с помощью светового микроскопа количества клеток, локализации, плотности и интенсивности экспрессии мономера IgM с использованием формата прямого метода иммунопероксидазного окрашивания и последующим окрашиванием азур-эозином (по Романовскому) в пробах крови и других органов животных. При этом для анализа выделяют мононуклеарную фракцию лейкоцитов, отмывают от разделяющего буфера, сорбируют на поверхности лунок предметных стекол.

Предметное стекло с контрольными лунками (тест-препарат), в данном случае, представляет собой прозрачную подложку с адгезивным гидрофобным покрытием, что обеспечивает максимальную адгезию клеток (лимфоцитов). Инкубацию клеточной суспензии проводят во влажной камере при t 18°С-22°С. Перед добавлением фиксирующей жидкости с поверхности лунок тест-препарата удаляют избыток жидкости, не допуская при этом высушивания, что препятствует запуску механизма апоптоза клеток и изменениям, обусловленным повышением концентрации солей. В заявленном способе на каждом стекле предусмотрено наличие двух контрольных лунок: К⁺(В-лимфоциты) и К^- (Т-лимфоциты), что повышает точность метода, способствует стандартизации проведения исследования. Затем поэтапно: в отмытых, высушенных на воздухе тест-препаратах (лунках) проводят блокировку эндогенной пероксидазы, неспецифических сайтов связывания, после отмывки вносят пероксидазный конъюгат системы олигоклональных специфических моноклональных антител к IgM KPC (МКА IgG1 мыши к IgM_KPC клонов G9, С11 и С2, специфически взаимодействующие с IgM рогатого скота), что позволяет идентифицировать В лимфоциты, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность метода. Затем после отмывки тест-препаратов вносят хромогенный субстратный раствор на основе 3-амино-9-этилкарбазола (АЭК), дающим при реакции с ферментом цветной нерастворимый осадок. При этом интенсивность окрашивания мест специфического взаимодействия МКА и эпитопов IgM лимфоцитов в лунке предметного стекла пропорциональна содержанию IgM В-клеток в исследуемом материале и оценивается визуально. Для изучения морфологии сорбированных лимфоцитов проводят контрастирующее окрашивание препаратов по Романовскому.

Впервые предложен способ мультиплексного анализа В-лимфоцитов рогатого скота, позволяющий при использовании иммунопероксидазного метода (ИПО) и окрашивания по Романовскому для проведения морфологического исследования клеток в одном и том же препарате определить относительное и абсолютное количество В-клеток, их функциональное состояние, субпопуляционный состав и морфологию в исследуемой пробе, одновременно.

Предлагаемый способ может быть использован в качестве средства для оценки состояния В-клеточного звена иммунной системы в норме и при патологии, в том числе при иммунодиагностике В-лимфопролиферативных болезней.

Способ мультиплексного анализа В-клеток для оценки клеточного звена иммунной системы рогатого скота включает следующие этапы:

1. В исследуемых образцах подсчитывают количество лейкоцитов в камере Горяева по стандартной методике (абсолютное количество - кл/мл).

2. Суспензию мононуклеаров (МНК) исследуемых образцов крови и клеточных суспензий различных органов животных получают путем градиентного центрифугирования в растворе Фиколла (1,077) согласно стандартной методике. Полученную суспензию мононуклеаров трижды отмывают физиологическим раствором (рН 7,2-7,4).

3. Для диссоциации экзогенных иммуноглобулинов, клетки обрабатывают 1%-ным раствором лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 10:1) в течение одной минуты. Затем отмывают, добавляя к суспензии клеток фосфатный буфер (PBS) и центрифугируя пятикратно по 5 мин. при 1200 об/мин. Или выдерживают клеточную суспензию при 37°С в течение 30 мин. Обработка клеточной суспензии таким образом позволяет избежать артефактов, связанных с неспецифическим связыванием антител на поверхности клеток.

4. Подсчитывают количество выделенных МНК в камере Горяева (кл/мл).

Проведение реакции иммунопероксидазного окрашивания (ИПО)

5. В способе используется 10-луночное предметное стекло с двумя контрольными лунками (тест-препарат): лунка №1 - положительный контроль (К⁺) содержит адсорбированные В-клетки в концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл на фосфатно-солевом буфере, рН 7,2 (PBS), 7,2 (PBS), полученные методом сепарации с частицами латекса, покрытых МКА CD19 из пула мононуклеаров крови; лунка №2 - отрицательный контроль (К^-) содержит адсорбированные Т-клетки в концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл на PBS, полученные методом сепарации с частицами латекса, покрытых МКА CD3 из пула мононуклеаров крови здоровых животных (рогатого скота) (фиг. 1). В лунки тест-препарата, кроме контрольных лунок (№1 и №2), начиная с лунки №3, вносят по 30 мкл/лунку клеточной суспензии отмытых исследуемых мононуклеаров (предварительно обработанных) в концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл на PBS; выдерживают t 18-22°С в течение 30 мин. для осаждения клеток. Надосадочную жидкость осторожно отбирают краем фильтровальной бумаги, не допуская высыхания.

6. Клетки фиксируют охлажденной (0+4°С) смесью спирт/ацетон в течение 5-10 мин., высушивают на воздухе. Промывают двукратно PBS, каждый раз внося в лунки по 0,03 мл.

7. Блокируют эндогенную пероксидазу водным раствором 0,3% Н₂О₂ во влажной камере в течение 10 мин.

8. Промывают 3-кратно PBS, каждый раз внося в лунки по 0,03 мл

9. Неспецифические активные сайты связывания блокируют 1% БСА на PBS во влажной камере в течение 60 мин.

10. Промывают PBS.

11. Вносят во все лунки тест-препарата по 30 мкл раствора пероксидазного конъюгата системы олигоклональных антител к IgM рогатого скота (олигоклональная система состоит из не конкурирующих между собой моноклональных антител, специфичных к конформационным (клоны С2 и G9) и линейным (клон С11) эпитопам молекулы IgM рогатого скота) в разведении 1:400 на PBS/БСА, инкубируют во влажной камере в течение 60 мин.

12. Промывают 5-кратно PBS, каждый раз внося в лунки по 0,03 мл.

Вносят по 30 мкл/лунку рабочий раствор АЭК субстратного буфера. Готовят ex tempore, растворяя 3 мг АЭК в 0,1 мл 2,5% раствора N,N-диметилформамида, затем к раствору 0,05 М ацетатного буфера добавляют 0,1 мл рабочего раствора хромофора, 8-10 мкл 1% раствора перекиси водорода, тщательно перемешивают, инкубируют в течение 10-15 мин.

13. Промывают двукратно PBS, третий раз - дистиллированной водой.

14. Учет и интерпретация обработанных результатов. Результаты проведенного исследования представляют в виде как относительных (%), так и абсолютных единиц.

Подсчитывают количество окрашенных клеток (специфическое мембранное и цитоплазматическое красно-коричневое окрашивание) под световым микроскопом с использованием водной иммерсии (х900, х1000). Считают 100 клеток.

Относительное содержание В-лимфоцитов, давших положительную реакцию на пероксидазу, подсчитывают по формуле:

Х_отн.=% (количество специфически окрашенных клеток из 100 посчитанных клеток в лунке).

15. Абсолютное количество В-лимфоцитов в каждой пробе на единицу объема крови определяли по формуле:

Х_абс.=а⋅b/100,

где а - абсолютное число лейкоцитов в исследуемой пробе предварительно подсчитанное в камере Горяева; b - % В-лимфоцитов в лунке.

Параллельно в исследуемых препаратах определяют формы локализации мембранных sIgM: «кэп» (колпачек), «пэтч» (пятно), «пэтч-эндоцитоз» и «шеддинг», а также наличие красно-коричневого окрашивания в виде гранул в цитоплазме клеток (cIgM).

16. Для исследования морфологии сорбированных на подложке мононуклеаров в исследуемой пробе проводят контрастирующее окрашивание препаратов по Романовскому в течение 5-8 мин.

17. Промывают двукратно водой.

18. Микроскопию проводят при помощи светового микроскопа (х1000),

19. Проводят морфологические исследования, определяя характерные признаки для идентификации В- лимфоцитов, форму и размеры клеток, ядра, ядерно-цитоплазматического соотношения, структуру хроматина ядра.

Краткое описание графических материалов

Фигура №1 - Контроль специфичности и чувствительности прямого метода иммунопероксидазного окрашивания. Специфическое окрашивание 100% В-лимфоцитов КРС в лунке №1 (К+) тест-препарата; отсутствие 100% специфического окрашивания всех клеток в лунке №2 (К^-)×1000.

Представлены микрофотографии участков тестируемых контрольных лунок тест-препарата. Результаты постановки контролей специфичности и чувствительности прямого метода иммунопероксидазного окрашивания: в лунках с адсорбированными клетками: В-лимфоцитами (лунка №1 К+) отмечается характерное специфическое красно-коричневое 100% окрашивание лимфоцитов; Т-лимфоцитами (лунка №2 К-) отмечается 100% отсутствие специфического окрашивания всех клеток в лунке тест-препарата. Интенсивность окрашивания мест специфического взаимодействия МКА и эпитопов IgM В-лимфоцитов в лунке тест-препарата пропорциональна содержанию антигена IgM в исследуемом материале лимфоцитов.

Фигура №2 - Определение степени специфического окрашивания мономера IgM.

Представлены микрофотографии участков тестируемых лунок с различной степенью интенсивности иммунопероксидазного окрашивания в зависимости от уровня экспрессии мембранного и цитоплазматического IgM В-лимфоцитов. По интенсивности экспрессии мономера IgM (степень специфического окрашивания) выявлены различия между субпопуляциями В-лимфоцитов: В-1 (IgM⁺⁺) и В-2 (IgM⁺) лимфоцитов животных.

Фигура №3. Определение В-лимфоцитов, находящихся на различных стадиях дифференцировки по экспрессии и месту локализации IgM: мембранного (sIgM) и цитоплазматического (cIgM). Представлены микрофотографии участков тестируемых лунок где В лимфоциты в зависимости от стадии дифференцировки специфически окрашены в красно-коричневый цвет в зависимости от уровня экспрессии и расположения мономера IgM: мембранного или цитоплазматического В лимфоцитов. Пре- В- лимфоцит-активно пролиферирующие клетки, имеющие цитоплазматические cIgM; незрелый В-лимфоцит и зрелый В- лимфоцит характеризуются появлением мембранного (рецепторного) sIgM на поверхности клетки.

Фигура №4 - Форма локализации рецепторов IgM на поверхности В-лимфоцитов. Концентрация молекул IgM на одном участке мембраны в виде иммуноглобулиновых кластеров, имеющих форму «кэпов».

Фигура №5 - Форма локализации рецепторов IgM на поверхности В-лимфоцитов - «пэтч-эндоцитоз». Поверхностные Ig взаимодействуя с антигеном («пэтч»), посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент (агрегаты рецепторов поглощаются лимфоцитами - эндоцитоз). Процессы пэтч-эндоцитоза являются неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки.

Фигура №6 - Форма локализации рецепторов IgM на поверхности В-лимфоцитов. Плотная концентрация экспрессируемого IgM по всей поверхности мембраны, имеющая форму «пэтчей».

Фигура №7 - Форма локализации рецепторов IgM на поверхности В-лимфоцитов. Феномен сбрасывания агрегированных комплексов антиген/sIg на одном из полюсов клетки, которые отделяются от поверхности клетки в окружающую среду - «шеддинг». Процесс шеддинга является неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки.

Фигура №8 - Идентификация аномальных форм лимфоцитов и клональной экспансии В-клеток фенотипа IgM+ при лейкозе КРС.

На фигуре представлены микрофотографии участков лунок, в которых сорбированы МНК крови коровы и козы, экспериментально внутривенно инфицированных вирусом лейкоза КРС (цельная кровь животного-донора). В пробах МНК инфицированных животных на стадии персистирующего лейкоза отмечали потерю В-клетками части IgM антигена, ранее присутствовавшего на их поверхности, наличие больших бластных клеток, недифференцированных и гигантских клеток Березовского-Штернберга.

Фигура №9 - Идентификация аномальных форм лимфоцитов и клональной экспансии В-клеток фенотипа IgM+ при лейкозе КРС.

На фигуре представлены микрофотографии участков лунок, в которых сорбированы МНК крови коровы и козы, экспериментально внутривенно инфицированных вирусом лейкоза КРС (цельная кровь животного-донора). В пробах МНК инфицированных животных отмечали наличие лимфоцитов с неравномерно окрашенным хроматином в ядре, а также большого количества тромбоцитов.

Фигура №10 - Идентификация аномальных форм лимфоцитов и клональной экспансии В-клеток фенотипа IgM+ при лейкозе КРС.

На фигуре представлены микрофотографии участков лунок, в которых сорбированы МНК крови рогатого скота, экспериментально внутривенно инфицированных вирусом лейкоза КРС (цельная кровь животного-донора). В пробах МНК инфицированных животных отмечали, что большинство В-клеток животных с признаками персистирующего лейкоза (PL) относятся к фенотипу IgM_low и IgM^-, характерно выявление в крови клеток лейколиза: разрушенные аномально хрупкие лимфоциты - клетки Боткина-Гумпрехта (тени Гумпрехта).

Фигура №11 - Идентификация аномальных форм лимфоцитов и клональной экспансии В-клеток фенотипа IgM+ при лейкозе КРС.

На фигуре представлены микрофотографии участков лунок, в которых сорбированы МНК крови коровы, экспериментально внутривенно инфицированных вирусом лейкоза КРС (цельная кровь животного-донора). В пробах МНК инфицированных животных отмечали: большинство В-клеток крупного рогатого скота с признаками персистирующего лейкоза (PL) относятся к фенотипу IgM_low и IgM^-, отмечена усиленная пролиферация В-лифоцитов и клональная экспансия В-лимфоцитов фенотипа sIgM_low/-.

Фигура №12 Идентификация аномальных форм лимфоцитов и клональной экспансии В-клеток фенотипа IgM+ при лейкозе КРС.

На фигуре представлены микрофотографии участков лунок, в которых сорбированы МНК крови козы, экспериментально внутривенно инфицированных вирусом лейкоза КРС (цельная кровь животного-донора). В пробах МНК инфицированных животных отмечали: большинство В-клеток коз относятся к фенотипу IgM⁺⁺, по сравнению с sIgM_low /-, отмечена усиленная пролиферация В-лифоцитов и клональная экспансия В-лимфоцитов фенотипа -cIgM++.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения. На основании полученных данных сформулированы основные принципы описываемого способа определения В-лимфоцитов, степени их дифференциации и функционального состояния.

Пример 1. В ходе работы нами для проверки чувствительности и специфичности заявленного способа были исследованы фракции мононуклеаров крови с/х жвачных животных - КРС, овец, коз.

Параллельно с использованием предлагаемого Способа проводили исследования стандартными гематологическими исследованиями.

Для исследования использовали три тест-препарата отдельный для каждого вида животных. Исследования выполняли заявленным Способом.

Мононуклеары выделяли из крови животных с антикоагуляном (ЭДТА) в градиенте плотности фиколла, инкубировали при 37°С, дважды центрифугировали при 1500 об/мин; в каждую лунку вносили отдельную пробу по 30 мкл в концентрации 10⁶кл/мл; инкубировали во влажной камере при 118-22°С для осаждения клеток. Затем надосадочную жидкость осторожно отбирали краем фильтровальной бумаги, клетки фиксировали охлажденной смесью спирт/ацетон (1:1); затем высушивали на воздухе. Далее все процессы инкубации проводили во влажной камере при температуре 18-22°С. Промывали PBS, блокировали эндогенную пероксидазу, отмывали PBS; обрабатывали белковым раствором, блокирующим неспецифические активные сайты связывания (1% БСА на PBS) в течение часа. Промывали PBS.

Вносили раствор пероксидазного конъюгата МКА к IgM КРС в предварительно определенной рабочей дозе (1:400), инкубировали в течение часа. Промывали PBS, вносили рабочий раствор АЭК субстратного буфера, инкубировали в течение 10-15 минут под контролем микроскопа. Промывали PBS, последний раз - дистиллированной водой. Высушивали в вертикальном положении. Микроскопию проводили при помощи светового микроскопа (х1000), подсчитывая количество специфически окрашенных клеток. Учет результатов проводили только в случае положительного окрашивания практически всех клеток в лунке положительного контроля и отсутствия окрашивания клеток в лунке с отрицательным контролем.

Подсчитывали 100 клеток. Результаты проведенного исследования представляли в виде как относительных (%), так и абсолютных единиц. Подсчитывали количество окрашенных клеток (специфическое мембранное и цитоплазматическое красно-коричневое окрашивание) под световым микроскопом с использованием водной иммерсии (х900, х1000).

В результате использования заявленного способа проведен анализ мононуклеаров крови, выделенных от крупного рогатого скота, овец и коз. Установлено, что используемая олигоклональная система моноклональных антител к эпитопам IgM рогатого скота в виде пероксидазного конъюгата специфически взаимодействует с антигенными детерминантами мономера IgM крупного рогатого скота (25,3±2,6%), овец (32,0±2,2%) и коз (20,0±1,5%), позволяя идентифицировать В-лимфоциты данных животных; определять мономер IgM как цитоплазматический (cIgM -19,2±1,2, фиг. 3, 12), так и поверхностный (sIgM, фиг. 2, 11), присутствующий на мембране В-клеток; определять интенсивность экспрессии и плотность IgM на В-клетках, играющих важную роль в дифференцировке их субпопуляций; выявлять различия между субпопуляциями В-1 (IgM⁺⁺) - 10,2%-20,0% и В-2 (IgM⁺) - 85,0% лимфоцитов животных (фиг. 3). Дифференцированное окрашивание клеток по Романовскому позволяет на одних и тех же препаратах проводить исследования клеток для получения подробной картины морфологического разнообразия МНК в пробе.

Пример 2. Идентификация аномальных форм лимфоцитов и клональной экспансии В-лимфоцитов фенотипа IgM⁺ при лейкозе КРС.

В ходе работы по выявлению и идентификации аномальных форм лимфоцитов, клональной экспансии В-лимфоцитов фенотипа IgM⁺ при лейкозе КРС были исследованы фракции мононуклеаров крови с/х животных - КРС и коз, экспериментально инфицированных вирусом лейкоза КРС. Параллельно с предлагаемым способом использовали стандартные гематологические исследования.

Для исследования использовали два тест-препарата отдельный для каждого вида животных. Мононуклеары были выделены из крови животных с антикоагулянтом (ЭДТА) общепринятым методом градиентного центрифугирования, инкубированы при 37°С, дважды центрифугированы в PBS при 1000 об/мин; в каждую лунку вносили отдельную пробу по 30 мкл в концентрации 10⁶кл/мл; инкубировали во влажной камере при t 18-22°С для осаждения клеток. Затем надосадочную жидкость осторожно отбирали краем фильтровальной бумаги, клетки фиксировали метанолом, затем высушивали на воздухе. Далее все процессы инкубации проводили во влажной камере при температуре 18-22°С. Промывали PBS, блокировали эндогенную пероксидазу, отмывали PBS; обрабатывали белковым раствором, блокирующим неспецифические активные сайты связывания (1% БСА на PBS) в течение часа. Промывали PBS.

Вносили раствор пероксидазного конъюгата МКА к IgM КРС в предварительно определенной рабочей дозе (1:400), инкубировали в течение часа. Промывали PBS, вносили рабочий раствор АЭК субстратного буфера, инкубировали в течение 10-15 минут. Промывали PBS, последний раз - дистиллированной водой. Высушивали в вертикальном положении. Микроскопию проводили при помощи светового микроскопа (х1000), подсчитывая количество специфически окрашенных клеток. Учет результатов проводили только в случае положительного окрашивания практически всех клеток в лунке положительного контроля и отсутствия окрашивания клеток в лунке с отрицательным контролем.

Подсчитывали 100 клеток. Результаты проведенного исследования представляли в виде как относительных (%), так и абсолютных единиц. Подсчитывали количество окрашенных клеток (специфическое мембранное и цитоплазматическое красно-коричневое окрашивание) под световым микроскопом с использованием водной иммерсии (х900, х1000).

Результаты количественного исследования

Исследования динамики экспрессии IgM заявленным Способом показали ее волнообразный характер с пиком на 5-7, 21 и 60 сутки после заражения. Экспрессия IgM+ на В-лимфоцитах увеличивается 1,5-3,0 раза по отношению к контролю. Также к этому времени отмечается увеличение В-лимфоцитов с цитоплазматическим cIgM.

Также методом ИПО установлено, что на ранней стадии развития болезни (28-30 суток после заражения) выявление доли В-лимфоцитов sIgM++ находилось в диапазоне 28-58,7% от общего числа лимфоцитов. К 2 месяцам интенсивность и плотность экспрессии sIgM+ снижалась, а доля В-лимфоцитов cIgM⁺ увеличивалась. Выявляемые на 90 сутки В-лимфоциты соответствовали незрелому субтипу, экспрессируя cIgM, отмечали снижение/отсутствие интенсивности и плотности экспрессии sIgM+ или sIgM^-/low. Подобная картина была отмечена в пробах МНК от коров в возрасте 4-5 лет, больных лейкозом КРС.

Для проведения морфологического исследования тест-препараты после качественно-количественного определения В-лимфоцитов отмывали после водной иммерсии и окрашивали по Романовскому. После отмывки на поверхности тест-препарата остаются лунки, покрытые МНК, часть из которых В-лимфоциты, несущие поверхностный или цитоплазматический IgM, морфология которых исследовали стандартными цитологическими методами, определяя форму и размер клеток, ядра, ядерно-цитоплазматического соотношение, структуру хроматина и признаки различных типов мононуклеаров для получения подробной картины морфологического разнообразия МНК в пробе.

Результаты исследования считали положительными на лейкоз: при обнаружении в крови 5% -10% и более слабо- или недифференцированных клеток; ≥55% пре- и/или пре-В-клеток в крови даже при нормальных показателях абсолютного количества лимфоцитов диагностируют лимфоцитарный лейкоз. Обнаружение ≥50 тыс. кл/мкл моноклональных В-лимфоцитов фенотипа sIgM+sIgM^-/low. (фиг. 11) или cIgM++ (фиг. 12) свидетельствовало о развитии персистирующего моноклонального В-лимфоцитоза, соответственно, при увеличении числа лейкоцитов и доли лимфоцитов в крови; если среди исследуемых лимфоцитов ≥20% составляют атипичные клетки: клетки небольших размеров с пикнотическим ядром и еле заметной цитоплазмой: разрушенные аномально хрупкие лимфоциты - клетки Боткина-Гумпрехта (тени Гумпрехта) (фиг. 10); лимфоциты с неравномерно распределенным хроматином в ядре (фиг. 9); недифференцированные и гигантские клетки Березовского-Штернберга (фиг. 8). В норме единичные плазмобласты, проплазмоциты и плазматические клетки встречаются в пунктате лимфоузлов и селезенки, в костном мозге.

Таким образом, заявляемый способ на основе тест-препарата и конъюгата олигоклональной системы MICA к IgM КРС позволяет исследовать морфологию В-клеток крови, для которых известен один из ее поверхностных антигенов.

Данные иммуноцитохимического исследования МНК крови и пунктатов лимфоидных органов, как свидетельствуют представленные на фиг. 8-12 результаты, заявленного Способа могут быть использованы для установления предварительного диагноза различных форм В-клеточных лимфопролиферативных болезней, в том числе и лейкоза КРС. Использование заявляемого Способа позволило установить, что при экспериментальном заражении животных ВЛКРС период процесса развития от заражения клеток-мишеней до клональной экспансии В-лимфоцитов составляет 2 месяца.

Мультиплексный анализ В-клеточной популяции и клональности заявляемым Способом оказался эффективным методом для определения неопластической трансформации клеток на ранней стадии инфекции. Такой подход облегчает и ускоряет диагностику ЛКРС, в том числе и на ранних этапах развития болезни, поскольку все диагностически значимые показатели определяются параллельно, в одном и том же образце, а высокая чувствительность описанного метода позволяет обнаружить атипичные лимфоциты даже при глубокой лейкопении и малой их доле в крови.

Пример №3. Определение форм локализации sIgM на В-клетках рогатого скота

Исследования выполняли заявленным Способом.

Мононуклеары были выделены из крови КРС с антикоагулянтом (ЭДТА) общепринятым методом градиентного центрифугирования, инкубированы при 37°С, дважды центрифугированы в PBS при 1500 об/мин; в каждую лунку вносили отдельную пробу по 30 мкл в концентрации 10⁶кл/мл; инкубировали во влажной камере при 118-22°С для осаждения клеток. Затем надосадочную жидкость осторожно отбирали краем фильтровальной бумаги, клетки фиксировали охлажденной смесью спирт/ацетон (1:1), затем высушивали на воздухе. Далее все процессы инкубации проводили во влажной камере при температуре 18-22°С. Промывали PBS, блокировали эндогенную пероксидазу, отмывали PBS; обрабатывали белковым раствором, блокирующим неспецифические активные сайты связывания (2% БСА на PBS) в течение часа. Промывали PBS.

Вносили раствор пероксидазного конъюгата МКА к IgM в предварительно отработанной рабочей дозе (1:400), инкубировали в течение часа. Промывали PBS, вносили рабочий раствор АЭК субстратного буфера, инкубировали в течение 10-15 минут. Промывали PBS. Высушивали в вертикальном положении. Микроскопию проводили при помощи светового микроскопа (х1000), подсчитывая количество специфически окрашенных клеток. Учет результатов проводили только в случае положительного окрашивания практически всех клеток в лунке положительного контроля и отсутствия окрашивания клеток в лунке с отрицательным контролем.

Подсчитывали 100 клеток.

Результаты проведенного исследования представляли в виде как относительных (%), так и абсолютных единиц. Подсчитывали количество окрашенных клеток - специфическое мембранное красно-коричневое окрашивание В-клеток под световым микроскопом с использованием водной иммерсии (х900, х1000).

В результате использования заявленного способа проведен анализ мононуклеаров, выделенных из крови коров. Установлено, что используемая олигоклональная система моноклональных антител к эпитопам IgM крупного рогатого скота в виде пероксидазного конъюгата специфически взаимодействует с антигенными детерминантами мономера IgM, позволяя идентифицировать различные формы локализации рецепторов на В-лимфоцитах данного вида животных.

Результаты исследования позволили выявить концентрирование молекул IgM на одном участке мембраны в виде: иммуноглобулиновых кластеров, имеющих форму «кэпов» - 5,6±1,9% (фиг. 4); неравномерное распределение sIgM на мембране клеток, имеющее форму «пэтчей» - 15,0±3,3% (фиг. 6). Также поверхностные Ig взаимодействуя с антигеном, посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент (агрегаты рецепторов поглощаются лимфоцитами - пэтч-эндоцитоз) (фиг. 5); также выявлен феномен сбрасывания агрегированных комплексов антиген/sIg на одном из полюсов клетки, которые отделяются от поверхности клетки в окружающую среду - «шеддинг» - 8,5±0,5% (фиг. 7). Процессы «эндоцитоза» и «шеддинга» являются неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки. Установлено, что основной формой локализации поверхностных рецепторов IgM на В-клетках рогатого скота является неравномерное распределение sIgM по периметру клетки, а именно «пэтч-эндоцитоз», которое составляет - 68,9±3,9%.

Способ мультиплексного анализа В-лимфоцитов рогатого скота для оценки В-клеточного звена иммунной системы, включающий выделение мононуклеаров в градиенте плотности фиколла 1,077 г/мл; добавление к выделенным мононуклеарам 1% раствора лимонной кислоты; отмывку фосфатным буфером; использование моноклональных антител к IgM рогатого скота; внесение хромогенного субстратного буфера, подсчет количество IgM⁺ В-лимфоцитов проводят по наличию и интенсивности окрашивания мест взаимодействия антиген/антитело с окрашенными в красно-коричневый цвет иммунными комплексами на мембране или в цитоплазме В-клетки, отличающийся тем, что исследования проводят на 10-луночных предметных стеклах с двумя контрольными лунками с адсорбированными В-клетками - положительный контроль, полученными методом сепарации с частицами латекса, покрытых моноклональными антителами к CD19, и Т-клетками - отрицательный контроль, полученными методом сепарации с частицами латекса, покрытых моноклональными антителами к CD3 из пула мононуклеаров крови рогатого скота; используется прямой метод иммунопероксидазного окрашивания с применением в качестве детектирующих антител олигоклональной системы, не конкурирующих между собой моноклональных антител к G9 и С2-конформационным и C11-линейному эпитопу молекулы IgM рогатого скота, последующим окрашиванием азур-эозином для проведения морфологического исследования В-клеток: их формы, размера клеток, ядра, ядерно-цитоплазматического соотношения, структуры хроматина.