Рекомбинантные векторы, экспрессирующие антигены вируса птичьего гриппа, и их применения

Авторы патента:

ПРИТЧАРД, Джойс (US)

МЕБАТСЬОН, Тешоме (US)

СУЭЙН, Девид (US)

C12N15/86 - вирусные векторы

A61P31/16 - против гриппа или риновирусов

A61K39/145 - Orthomyxoviridae, например вирус гриппа

A61K39/00 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

Владельцы патента RU 2761869:

БЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ЭНИМАЛ ХЕЛТ ЮЭсЭй ИНК. (US)
ТЕ ЮНАЙТИД СТЕЙТС ОВ АМЕРИКА, ЭЗ РЕПРИЗЕНТИД БАЙ ТЕ СЕКРЕТАРИ ОВ АГРИКАЛЧЕР (US)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные вирусные векторы, которые включают и экспрессируют антигены птичьих патогенов, композиции, включающие рекомбинантные вирусные векторы, вакцины, включающие рекомбинантные вирусные векторы. В настоящем изобретении также предлагаются способы вакцинации против различных птичьих патогенов и способ получения рекомбинантных вирусных векторов. Изобретение позволяет эффективно использовать вирусные векторы для вакцинации. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 24 ил., 13 табл., 5 пр.

Перекрестная ссылка на связанные заявки

Эта заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США 62/410885, поданной 21 октября 2016 года.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к рекомбинантным вирусным векторам для вставки и экспрессии чужеродных генов для применения в качестве безопасных средств иммунизации для защиты от различных патогенов. Оно также относится к поливалентной композиции или вакцине, содержащей один или несколько рекомбинантных вирусных векторов, для защиты от различных патогенов. Настоящее изобретение относится к способам получения и применения рекомбинантных вирусных векторов.

Предшествующий уровень техники

Вирус гриппа является представителем семейства Orthomyxoviridae (Murphy and Webster, Orthomyxoviruses, Fields Virology, Third Edition, vol. 1, pp. 1397-1445, 1996). Существует три типа вирусов гриппа, обозначенных А, В и С. Вирион гриппа содержит сегментированный РНК-геном негативной полярности. Вирион гриппа включает следующие белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матрикс (M1), белок протонного ионного канала (M2), нуклеопротеин (NP), основной белок полимеразы 1 (PB1), основной белок полимеразы 2 (PB2), полимеразный кислый белок (PA) и неструктурный белок 2 (NS2). NP и матричный белок M1 используются для классификации вируса гриппа в группу A, B или C.

Белки HA и NA являются гликопротеинами оболочки. Белок HA отвечает за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку и включает основные иммунодоминантные эпитопы для нейтрализации вируса и защитного иммунитета. Как HA, так и NA белки считаются наиболее важными компонентами для профилактических вакцин против гриппа. К настоящему времени было идентифицировано восемнадцать различных подтипов HA и одиннадцать различных подтипов NA (Tong et al., 2013, PLoS Pathogens, Vol. 9 (10), New World Bats harbor diverse influenza A viruses).

Во всем мире грипп является наиболее экономически значимым респираторным заболеванием у людей, свиней, лошадей и птицы. Вирус гриппа известен своими постоянными генетическими и антигенными изменениями, которые препятствуют эффективному контролю над вирусом. Особую озабоченность при предотвращении эпидемий и пандемий вызывает появление нового подтипа вируса в результате генетической реассортации или межвидовой передачи.

Высокопатогенный вирус подтипа H5N1 вируса гриппа А является новым вирусом птичьего гриппа (AIV), который вызывает глобальную обеспокоенность в качестве потенциальной угрозы пандемии. H5N1 убил миллионы птиц во множестве стран Азии, Европы и Африки. Эксперты в области здравоохранения обеспокоены тем, что сосуществование вирусов человеческого гриппа и вирусов птичьего гриппа (особенно H5N1) позволяет обмениваться генетическим материалом между видоспецифичными вирусами, что может привести к появлению нового вирулентного штамма гриппа, который легко передается и вызывает летальный исход у людей (Food Safety Research Information Office. «A Focus on Avian Influenza». Created May 2006, Updated November 2007). В US8394384 сообщается о производстве вакцин против птичьего гриппа с использованием системы экспрессии в растениях. В US 7910112 раскрыты вакцины на основе поксвирусного вектора против птичьего гриппа. В US 8592558 раскрыты вакцины, содержащие белки H5. В WO 2007019094 исследована иммуногенность молекулы HA, в которой замещены определенные остатки HA.

15 декабря 2014 года и 16 января 2015 года Министерство сельского хозяйства США получило 14 сообщений о птицах, зараженных высокопатогенным птичьим гриппом А (HPAI) азиатского происхождения, включая вирусы H5N2. Эти отчеты представляют собой первые случаи заражения этими вирусами у диких или домашних птиц в США. Хотя эти вирусы, как известно, не вызывают заболевания у людей, их появление в Северной Америке может повысить вероятность заражения людей в Соединенных Штатах (Morbidity and Mortality Weekly Report, Centers for Disease Control and Prevention, February 6, 2015/64(04),111; Bertran et al., 2016, Virology 494, 190-197).

Учитывая восприимчивость животных, в том числе людей, к AIV, очень важен метод предотвращения AIV-инфекции и защиты животных. Соответственно, существует потребность в способах получения эффективных вакцин против гриппа.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к вектору рекомбинантного герпесвируса индейки (HVT) или вектора вируса оспы кур (FPV), содержащему один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих, по меньшей мере, один антиген птичьего патогена.

Настоящее изобретение относится к композиции или вакцине, содержащей один или несколько рекомбинантных векторов HVT или FPV, содержащих один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих, по меньшей мере, один антиген птичьего патогена.

Настоящее изобретение также относится к поливалентной композиции или вакцине, содержащей один или несколько рекомбинантных векторов HVT или FPV, содержащих гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие, по меньшей мере, один антиген птичьего патогена, и один или несколько рекомбинантных векторов HVT или FPV, содержащих гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие по меньшей мере, один антиген птичьего патогена.

Настоящее изобретение относится к способу вакцинации животного или индукции иммуногенного или защитного ответа у животного, включающему, по меньшей мере, одно введение композиции или вектора по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение показало неожиданный результат, который заключается в том, что рекомбинантные вирусные векторы, экспрессирующие модифицированный белок HA, обеспечивают лучшую защиту у птиц, чем рекомбинантные вирусные векторы, экспрессирующие мутантный белок HA. Настоящее изобретение также продемонстрировало, что поливалентные композиции или вакцины, содержащие вирусные векторы, были эффективными для защиты животных от различных птичьих патогенов без вмешательства.

Краткое описание чертежей

Следующее подробное описание, данное в качестве примера и не предназначенное для ограничения изобретения конкретными описанными воплощениями, может быть понято в сочетании с прилагаемыми фигурами, включенными в настоящий документ ссылкой, в которых:

на фиг. 1А и 1В изображена таблица, показывающая SEQ ID NO, назначенные для каждой последовательности ДНК и белка;

на фиг. 2 изображена структура генома HVT и сайтов вставки в нем. Показан сайт вставки UL55;

на фиг. 3 изображена карта плазмиды pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI;

на фиг. 4 изображено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание рекомбинантного вируса vHVT501, экспрессирующего белок LPC-HA H5N2;

на фиг. 5 изображено схематическое представление сайтов связывания праймеров;

на фиг. 6 изображены результаты ПЦР для идентификации rHVT501;

на фиг. 7 изображена карта плазмиды pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI;

на фиг. 8 изображено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание рекомбинантного вируса vHVT502, экспрессирующего белок LPC-HA H5N2;

на фиг. 9 изображено схематическое представление сайтов связывания праймеров;

на фиг. 10 изображены результаты ПЦР для идентификации rHVT502;

на фиг. 11 изображена карта плазмиды pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI;

на фиг. 12 изображено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание рекомбинантного вируса vHVT503, экспрессирующего белок 3 Mut-HA H5N2;

на фиг. 13 изображено схематическое представление сайтов связывания праймеров;

на фиг. 14 изображены результаты ПЦР для идентификации rHVT503;

на фиг. 15А изображена карта плазмиды pCD046-H5N2 HA;

на фиг. 15В изображено схематическое представление сайтов связывания праймеров;

на фиг. 15С изображены результаты ПЦР для идентификации rHVT510;

на фиг. 16 изображено схематическое представление положения сайта вставки F8 в геноме вируса оспы кур (TROVAC);

на фиг. 17 показаны стадии клонирования донорной плазмиды вируса оспы кур pF8 H6pLPC-HA H5N2;

на фиг. 18 изображено схематическое представление сайтов связывания праймеров для плазмиды pF8 H6pLPC-HA H5N2;

на фиг. 19 показаны результаты PCT для идентификации rFPV3003;

на фиг. 20 показаны стадии клонирования донорной плазмиды вируса оспы кур pF8 H6p3Mut-HA H5N2;

на фиг. 21 изображено схематическое представление сайтов связывания праймеров для плазмиды pF8 H6p3Mut-HA H5N2;

на фиг. 22 показаны результаты PCT для идентификации rFPV3004;

на фиг. 23А показаны данные о выделении вируса rHVT-H5 в количестве копий РНК/10 мкл;

на фиг. 23В показаны результаты серологии для гомологичного контрольного заражения A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2);

на фиг. 23C показаны результаты серологии для гомологичного контрольного заражения A/Egypt/N04915/2014 (H5N1);

на фиг. 23D показаны результаты выделения вируса при гомологичном контрольном заражении A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2);

на фиг. 23E показаны результаты выделения вируса в гетерологичном контрольном заражении A/Egypt/N04915/2014 (H5N1);

на фиг. 24А-24G изображены выравнивания последовательностей ДНК и белков.

Подробное описание изобретения

Следует отметить, что в этом раскрытии и, в частности, в формуле изобретения такие термины, как «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное, могут иметь значение, приписанное ему в патентном законодательстве США; например, они могут означать «содержит», «содержащийся», «содержащий» и тому подобное; и что такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из», имеют значение, приписываемое им в Патентном законе США, например, они допускают элементы, которые не указаны явно, но исключают элементы, которые встречаются в предшествующем уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристику изобретения.

Если не указано иное, технические термины используются в соответствии с обычным использованием. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V., опубликовано Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликовано VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Термины, приведенные в единственном числе также включают и свое множественное число, если контекст явно не указывает иное. Точно так же, слово «или» предназначено для включения «и», если контекст явно не указывает иное. Слово «или» означает любого элемента определенного списка, а также включает любую комбинацию элементов этого списка.

Используемый в данном документе термин «около» означает приблизительно, в области, ориентировочно или приближенно. Когда термин «около» используется в сочетании с численным интервалом, то он модифицирует этот интервал путем расширения границ выше и ниже указанных числовых значений. В общем, термин «около» используется в данном документе для изменения числового значения выше и ниже указанного значения посредством варьирования на 10%. В одном аспекте термин «около» означает плюс или минус 20% от численного значения числа, с которым он используется. Следовательно, около 50% означает в диапазоне от 45 до 55%. Численные диапазоны, указанные в данном документе конечными точками, включают все числа и дроби, включенные в этот диапазон (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 и 5). Также следует понимать, что все числа и их дроби, как предполагается, модифицируются термином «около».

Термин «животное» используется в данном документе для включения всех млекопитающих, птиц и рыб. Используемое в данном документе животное может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие крупные кошки и другие кошачьи, включая гепардов и рысь), крупного рогатого скота (например, корова), свиней (например, домашняя свинья), овец (например, овца, коза, лама, бизон), птиц (например, курица, утка, гусь, индейка, перепел, фазан, попугай, зяблик, ястреб, ворона, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяна, долгопят, мартышка, гиббон, человекообразная обезьяна), людей и рыб. Термин «животное» также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональную и фетальную стадии.

Термины «полипептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из последовательных аминокислотных остатков.

Антигенным полипептидом, представляющим особый интерес, является гемагглютинин (HA). Гемагглютинин гриппа относится к типу гемагглютинина, обнаруженного на поверхности вирусов гриппа. Это антигенный гликопротеин, который отвечает за связывание вируса с заражаемой клеткой. Существуют различные антигены HA, любой из которых может быть использован при осуществлении изобретения. Интерес представляет HA из H5N2, высокопатогенного вируса птичьего гриппа. Однако на практике можно использовать при осуществлении изобретения HA из других вирусов гриппа (т.е. H1-H16), включая H1, H3, H5, H6, H7, H9 и тому подобное. Также можно использовать предшественники HA любого из белков HA.

HA представляет собой гомотримерный трансмембранный белок с эктодоменом, состоящим из шаровидной головки и стволовой области. Обе области несут N-связанные олигосахариды, которые играют важную роль в биологической функции HA (Schulze, IT, J Infect Dis, 1997. 176 Suppl 1: p. S24-8; Deshpande, K.L., et al., PNAS USA, 1987, 84(1): p. 36-40). Среди различных подтипов вирусов гриппа A существует значительный разброс в сайтах гликозилирования области головки, тогда как олигосахариды ствола являются более консервативными и необходимыми для активности слияния (Ohuchi, R., et al., J. Virol, 1997, 71 (5): стр. 3719-25). Гликаны вблизи антигенных пептидных эпитопов мешают распознаванию антител (Skehel, JJ, et al., PNAS USA, 1984, 81 (6): p. 1779-83), а гликаны вблизи протеолитического сайта модулируют расщепление и влияют на инфекционность вируса гриппа. (Deshpande, KL, et al., 1987). Анализ нуклеотидной последовательности 62 генов H5 подтвердил гипотезу о том, что дополнительное гликозилирование вблизи сайта связывания рецептора в глобулярной головке HA представляет собой адаптацию вируса после межвидовой передачи от диких птиц, особенно водоплавающих птиц, к домашней птице (Banks, J., et al., Avian Dis, 2003, 47 (3 Suppl): стр. 942-50).

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеотид» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к РНК, ДНК, кДНК или кРНК и их производным, таким как те, которые содержат модифицированные каркасы. Следует понимать, что изобретение обеспечивает полинуклеотиды, содержащие последовательности, комплементарные описанным в данном документе. «Полинуклеотид», рассматриваемый в настоящем изобретении, включает как прямую цепь (от 5' до 3'), так и обратную комплементарную цепь (от 3' до 5'). Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть получены различными способами (например, химическим синтезом, клонированием генов и т.д.) и могут принимать различные формы (например, линейные или разветвленные, одноцепочечные или двухцепочечные или их гибрид, праймеры, зонды и т.д.).

Термин «геномная ДНК» или «геном» используется взаимозаменяемо и относится к наследственной генетической информации организма-хозяина. Геномная ДНК включает ДНК ядра (также известная как хромосомная ДНК), но и ДНК пластид (например, хлоропластов) и других клеточных органелл (например, митохондрий). Геномная ДНК или геном, рассматриваемый в настоящем изобретении, также относится к РНК вируса. РНК может быть положительной цепью или отрицательной цепью РНК. Термин «геномная ДНК», рассматриваемый в настоящем изобретении, включает геномную ДНК, содержащую последовательности, комплементарные описанным в данном документе. Термин «геномная ДНК» также относится к матричной РНК (мРНК), комплементарной ДНК (кДНК) и комплементарной РНК (кРНК).

Термин «ген» используется в широком смысле для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены или полинуклеотиды включают интроны и экзоны, как в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности, как в кДНК, такие как открытая рамка считывания (ORF), начиная от стартового кодона (метионинового кодона) и заканчивая сигналом терминации (стоп кодон). Гены и полинуклеотиды могут также включать области, которые регулируют их экспрессию, такие как инициация транскрипции, трансляция и терминация транскрипции. Таким образом, сюда также входят промоторы и области связывания рибосом (в общем, эти регуляторные элементы лежат около между 60 и 250 нуклеотидами выше по отношению к стартовому кодону кодирующей последовательности или гена), терминаторы транскрипции (как правило, терминатор расположен в пределах около 50 нуклеотидов ниже стоп-кодона кодирующей последовательности или гена). Ген или полинуклеотид также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует конкретный белок и который включает регуляторные последовательности.

Используемый в данном документе термин «гетерологичная ДНК» относится к ДНК, полученной из другого организма, такого как другой тип клеток или отличный от реципиента вид. Термин также относится к ДНК или ее фрагменту в том же геноме ДНК-хозяина, где гетерологичная ДНК встроена в область генома, которая отличается от ее первоначального расположения.

Используемый в данном документе термин «антиген» или «иммуноген» означает вещество, которое индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способных индуцировать иммунный ответ при представлении животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен, или любые их комбинации. С другой стороны, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.

Термин «иммуногенный белок или пептид», используемый в данном документе, включает полипептиды, которые иммунологически активны в том смысле, что, как только их вводят хозяину, они способны вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против белка. Предпочтительно, если белковый фрагмент является таким, что имеет по существу такую же иммунологическую активность, что и общий белок. Таким образом, фрагмент белка согласно изобретению содержит или состоит по существу или состоит, по меньшей мере, из одного эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный» белок или полипептид, при использовании в данном документе, включает последовательность полной длины белка, их аналоги, или их иммуногенные фрагменты. Под термином «иммуногенный фрагмент» понимается фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов, и, таким образом, вызывает иммунологический ответ, как описано выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с использованием любого числа методик картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, параллельным синтезом большого числа пептидов на твердых подложках, которые соответствуют частям белковой молекулы, и взаимодействием пептидов с антителами, когда пептиды все еще прикреплены к подложкам. Точно так же, конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот, например, путем рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса.

Термин «иммуногенный белок или пептид» дополнительно рассматривает делеции, добавления и замены последовательности, при условии, что полипептид функционирует для получения иммунологического ответа, как определено в данном документе. Термин «консервативная вариация» означает замену аминокислотного остатка другим биологически аналогичным остатком, или замены нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, что закодированный остаток аминокислоты не изменяется или является другим биологически сходным остатком. В связи с этим, в частности, предпочтительные замены, как правило, консервативны по своей природе, т.е., являются заменами внутри семейства аминокислот. Так, например, аминокислоты, как правило, делятся на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой гидрофобный остаток, или замены одного полярного остатка на другой полярный остаток, например замены лизина на аргинин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, и тому подобное; или подобная консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту, которая не будет иметь большое влияние на биологическую активность. Белки, имеющие по существу одну и ту же аминокислотную последовательность, в качестве исходной молекулы, но имеющие незначительные аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на иммуногенность белка, таким образом, находятся в пределах определения эталонного полипептида. Все полипептиды, полученные этими изменениями, включены в данный документ. Термин «консервативная вариация» также включает применение замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты при условии, что антитела, индуцированные полипептидом с заменой также иммунореагируют с незамещенным полипептидом.

Термин «эпитоп» относится к участку на антигене или к гаптену, на который отвечают специфические В-клетки и/или Т-клетки. Термин также используется взаимозаменяемо с термином «антигенная детерминанта» или «участок антигенной детерминанты». Антитела, которые распознают тот же эпитоп, могут быть идентифицированы простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

«Иммунологический ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие в хозяине клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Обычно, «иммунологический ответ» включает, без ограничения перечисленным, один или несколько из следующих эффектов: продуцирование антител, В-клеток, Т-хелперов, и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, если хозяин будет демонстрировать либо терапевтическую, либо защитную иммунологическую реакцию таким образом, чтобы устойчивость к новой инфекции была усилена и/или клиническая тяжесть заболевания снизилась. Такая защита будет продемонстрирована либо снижением, либо отсутствием симптомов, обычно демонстрируемых зараженным хозяином, более быстрым временем восстановления и/или пониженным титром вируса в зараженном хозяине.

Термины «рекомбинантный» и «генетически модифицированный» используются взаимозаменяемо и относятся к любой модификации, изменению или конструированию полинуклеотида или белка в его нативной форме или структуре или любой модификации, изменению или конструированию полинуклеотида или белка в его естественной среде или окружении. Модификация, изменение или конструирование полинуклеотида или белка может включать, без ограничения указанным, делецию одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот, делецию целого гена, кодоновую оптимизацию гена, консервативную аминокислотную замену, вставку одного или нескольких гетерологичных полинуклеотидов.

Термины «поливалентная вакцина или композиция», «комбинированная или комбовакцина или композиция» и «мультивалентная вакцина или композиция» используются взаимозаменяемо для обозначения композиции или вакцины, содержащей более одной композиции или вакцины. Поливалентная вакцина или композиция может содержать две, три, четыре или более композиций или вакцин. Поливалентная вакцина или композиция может содержать рекомбинантные вирусные векторы, активные или аттенуированные или убитые вирусы дикого типа или смесь рекомбинантных вирусных векторов и вирусов дикого типа в активной или аттенуированной или убитой формах.

Одно воплощение изобретения обеспечивает рекомбинантный вирусный вектор HVT, содержащий один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих, по меньшей мере, один антиген или полипептид птичьего патогена. Штаммы HVT, используемые для рекомбинантного вирусного вектора, может представлять собой любые штаммы HVT, в том числе, без ограничения указанным, штамм HVT FC126 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).

В другом воплощении изобретения предлагается вирусный вектор рекомбинантного поксвируса, содержащий один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих, по меньшей мере, один антиген или полипептид птичьего патогена. Вирус оспы может представлять собой вирус осповакцины или авипоксвирус, такой как вирус оспы кур и вирус оспы канареек. Штаммы вируса оспы канареек или вируса оспы кур могут быть аттенуированными штаммами, такими как ослабленный рекомбинантный вирус оспы канареек, например, ALVAC (патент США №5756103), или ослабленный вирус оспы кур, например, TROVAC (патент США №5766599, 5174993, 5505941). Как ALVAC, так и TROVAC включают производные, которые были пассированы от родительских штаммов ALVAC или TROVAC, и/или потомства или потомков ALVAC или TROVAC. В одном воплощении рекомбинантная вакцина TROVAC может использоваться в качестве вакцины против птичьего гриппа. В случае оспы кур сайтом или сайтами вставки являются ORF F7 и/или F8. Локус вставки F8 соответствует гену оспы кур, кодирующему фотолиазу, описанный Srinivasan and Tripathy (2005, Veterinary Microbiology 108: 215-223). Этот ген также описан под названием FPV158 в полной последовательности генома оспы кур (учетный номер GenBank AF198100.1). В случае оспы канареек сайтом или сайтами вставки являются ORF C3, C5 и/или C6; см. также документы, процитированные в данном документе, особенно те, которые относятся к вирусу оспы канареек.

Таким образом, вирусный вектор в изобретении может быть любым подходящим рекомбинантным вирусом или вирусным вектором, таким как поксвирус (например, вирус осповакцины, авипоксвирус, вирус оспы канарейки, вирус оспы кур, вирус оспы енота, вирус оспы свиней и т.д.), аденовирус (например, аденовирус человека, аденовирус собаки), герпесвирус (например, герпесвирус собаки), бакуловирус, ретровирус и т.д.

В другом воплощении изобретения предложен рекомбинантный вирусный вектор NDV, содержащий один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих, по меньшей мере, один антиген или полипептид птичьего патогена. Эти штаммы NDV могут быть любыми штаммами NDV, в том числе, без ограничения указанным, Ulster 2C, Queensland V4, Hitchner B1, F (например, Asplin), La Sota, штамм H, Mukteswar, Roakin, Beaudette C, Texas GB, NY parrot 70181, Italien, Milano, Herts 33/56 и AVINEW^®.

Гены, кодирующие антиген или полипептид, могут быть генами, кодирующими белок HA вируса птичьего гриппа. Антиген или полипептид может быть любым антигеном из птичьего возбудителя вируса птичьего гриппа. Вирус птичьего гриппа может представлять собой любой подтип AIV, включая, без ограничения указанным, H5, H7 и H9.

Кроме того, предполагается, что гомологи вышеупомянутых антигенов или полинуклеотидов входят в объем настоящего изобретения. Используемый в данном документе термин «гомологи» включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одинаковую или сходную функцию, но которые развиваются отдельно у неродственных организмов. Термин «ортологи» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам от разных видов, эволюционировавших из общего предкового гена при видообразовании. Обычно ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин «паралоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые родственны из-за дублирования в геноме. Паралоги обычно имеют разные функции, но эти функции могут быть родственными. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида дикого типа могут отличаться от полипептида дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями аминокислотных последовательностей или и тем, и другим. В частности, гомологи по изобретению, как правило, будут демонстрировать, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности, полностью или частично полинуклеотидных или полипептидных последовательностей антигенов, описанных выше, и будут проявлять аналогичную функцию.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусному вектору HVT или FPV, содержащему один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих и экспрессирующих антиген или полипептид AIV-HA. В одном аспекте воплощения антиген или полипептид AIV-HA идентичен, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, или консервативным вариантом, аллельным вариантом, гомологом или иммуногенным фрагментом, содержащим, по меньшей мере, восемь или, по меньшей мере, десять последовательных аминокислот одного из этих полипептидов или комбинацию этих полипептидов. Антиген или полипептид AIV-HA может быть модифицирован в сайте расщепления между HA1 и HA2 из высокопатогенной последовательности птичьего гриппа (множественные основные аминокислоты: RERRRKR - SEQ ID NO: 14) в низкопатогенную последовательность птичьего гриппа (RETR - SEQ ID NO:15). В другом аспекте воплощения гетерологичный полинуклеотид, кодирующий антиген или полипептид AIV-HA, идентичный, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28. В еще одном аспекте воплощения гетерологичный полинуклеотид идентичный, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности с полинуклеотидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 8, 9, 10, 12, 13 17 или 19.

Варианты включают аллельные варианты. Термин «аллельный вариант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизм, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и которые существуют в пределах естественной популяции (например, видов или разновидностей вируса). Такие естественные аллельные вариации обычно могут приводить к дисперсии 1-5% в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы путем секвенирования последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, для ряда различных видов, которые могут быть легко осуществлены с применением гибридизационных зондов для идентификации того же генетического локуса генов у этих видов. Любые и все такие вариации нуклеиновой кислоты и полученные аминокислотные полиморфизмы или вариации, которые являются результатом естественных аллельных вариаций и которые не изменяют функциональную активность гена, представляющего интерес, подразумеваются охваченными изобретением.

Термин «идентичность» в отношении последовательностей может относиться, например, к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на число нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, где выравнивание двух последовательностей может быть определено в соответствии с алгоритмом Wilbur и Lipman (Wilbur and Lipman). Идентичность последовательности или сходство последовательностей двух аминокислотных последовательностей или идентичность последовательности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью программного пакета Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Карлсбад, Калифорния). Когда говорят, что последовательности РНК являются сходными или имеют степень идентичности последовательности или гомологию с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в последовательности ДНК считается равным урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК входят в объем изобретения и могут быть получены из последовательностей ДНК, причем тимидин (Т) в последовательности ДНК считается равным урацилу (U) в последовательностях РНК.

Полинуклеотиды раскрытия включают последовательности, которые являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода, например, в случае оптимизированного использования кодонов для конкретного хозяина. Используемый в данном документе термин «оптимизированный» относится к полинуклеотиду, который генетически модифицирован, чтобы увеличить его экспрессию у данного вида. Для обеспечения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды AIV-HA, последовательность ДНК гена белка AIV-HA может быть модифицирована для того, чтобы 1) включать кодоны, предпочтительные для высоко экспрессированных генов у конкретного вида; 2) включать содержание A + T или G + C в композиции нуклеотидных оснований как по существу найдено у указанных видов; 3) формировать инициирующую последовательность указанных видов; или 4) устранять последовательности, которые вызывают дестабилизацию, ненадлежащее полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК, или которые образуют шпильки вторичной структуры или сайты сплайсинга РНК. Повышенная экспрессия белка AIV-HA у указанных видов может быть достигнута за счет использования частоты распределения использования кодонов у эукариот и прокариот, или у конкретного вида. Термин «частота предпочтительного использования кодонов» относится к предпочтению, проявляемому конкретной клеткой-хозяином в использовании нуклеотидных кодонов, для указания данной аминокислоты. Есть 20 природных аминокислот, большинство из которых указаны более чем одним кодоном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены в раскрытие, пока аминокислотная последовательность полипептида AIV-HA, кодируемого нуклеотидной последовательностью, функционально не изменяется.

Успешная экспрессия гетерологичных полинуклеотидов рекомбинантным/модифицированным инфекционным вирусом требует двух условий. Во-первых, гетерологичные полинуклеотиды должны быть вставлены или введены в область генома вируса, чтобы модифицированный вирус оставался жизнеспособным. Вторым условием для экспрессии встроенных гетерологичных полинуклеотидов является наличие регуляторных последовательностей, позволяющих экспрессировать ген в вирусном фоне (например, промотор, энхансер, донорный и акцепторный сайты сплайсинга и интрон, консенсусная последовательность инициации трансляции Kozak, сигналы полиаденилирования, нетранслируемые элементы последовательности).

Сайт вставки может быть любой несущественной областью генома HVT, включая, без ограничения указанным, область между STOP-кодоном ORF UL55 и местом соединения UL с соседней повторяющейся областью (межгенная область 1, локус IG1, US 5980906), локус IG2 (межгенная область 2), локус IG3 (межгенная область 3), локус UL43, локус US10, локус US2, локус SORF3/US2 (см. фиг. 2).

Как правило, в эукариотических клетках выгодно использовать сильный промоторный функционал. Промоторы включают, без ограничения указанным, предранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор CMV IE мыши, промотор CMV морской свинки, промотор SV40, промотор гликопротеина B (HHV3gB) герпесвируса человека типа III, промоторы вируса псевдобешенства, такие как промотор гликопротеина X, вируса простого герпеса-1, такого как промотор альфа-4, вируса болезни Марека (включая MDV-1, MDV-2 и HVT), такие как те, которые управляют экспрессией гликопротеинов gC, gB, gE или gI, промоторы вируса инфекционного ларинготрахеита, такие как гены гликопротеина gB, gE, gI, gD или другие промоторы герпесвируса.

В одном воплощении изобретения предложен рекомбинантный вектор HVT, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид AIV-HA. В одном аспекте воплощения полинуклеотид, кодирующий полипептид AIV-HA, функционально связан с промотором SV40, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и, следовательно, экспрессия антигена или полипептида AIV-HA регулируется посредством промотора SV40. В другом аспекте воплощения полинуклеотид, кодирующий полипептид AIV-HA, функционально связан с промотором mCMV, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, и, следовательно, экспрессия антигена или полипептида AIV-HA регулируется посредством промотор mCMV. В еще одном аспекте воплощения экспрессия антигена или полипептида AIV-HA регулируется сигналом синтетического PolyA, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В еще одном аспекте воплощения экспрессия антигена или полипептида AIV-HA регулируется SV40 PolyA, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18. В еще одном аспекте воплощения полинуклеотид, кодирующий полипептид AIV-HA, функционально связан с промотором HHV3gB в обратной ориентации, имеющей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6, и, следовательно, экспрессию антигена или полипептида NDV-F регулируется промотором HHV3gB и/или промотором SV40. В одном аспекте полинуклеотид, кодирующий полипептид AIV-HA, оптимизирован по кодонам. В еще одном аспекте полинуклеотид, кодирующий полипептид AIV-HA, представляет собой ДНК дикого типа.

В другом воплощении изобретения предложен рекомбинантный вектор FPV, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий и экспрессирующий антиген или полипептид AIV-HA. В одном аспекте воплощения полинуклеотид, кодирующий полипептид AIV-HA, функционально связан с промотором H6 (H6) вируса осповакцины, имеющим последовательность, указанную в SEQ ID NO: 11, и, следовательно, экспрессия антигена или полипептида AIV-HA регулируется промотором Н6.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или вакцине, содержащей вирусный вектор HVT или FPV, содержащий полинуклеотид, кодирующий антиген AIV-HA, и, необязательно, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, носитель или адъювант. В другом воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтической поливалентной композиции или вакцине, содержащей два или более вирусных вектора, включающих полинуклеотиды, кодирующие антигены AIV-HA, и, необязательно, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель, носитель или адъювант. Вирусные векторы могут быть вектором HVT или вектором FPV.

Фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или основы или адъювант или эксципиенты хорошо известны специалисту в данной области. Другие фармацевтически или ветеринарно приемлемые носитель или адъювант, или носитель, или наполнители, которые можно использовать для способов по данному изобретению, включают, без ограничения указанным, 0,9% раствор NaCl (например, физиологический раствор) или фосфатный буфер, поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или носитель, или адъювант, или эксципиенты могут представлять собой любое соединение или комбинацию соединений, облегчающих введение вектора (или белка, экспрессированного из вектора изобретения) in vitro, или облегчающих трансфекцию или инфекцию и/или улучшающих сохранение вектора (или белка). Дозы и дозовые объемы в данном документе обсуждаются в общем описании, и могут также быть определены специалистами в данной области из этого описания в сочетании с информацией в данной области, без проведения излишних экспериментов.

Необязательно другие соединения могут быть добавлены в качестве фармацевтически или ветеринарно приемлемых носителей или адъювантов или носителей или наполнителей, включая, без ограничения указанным, квасцы; CpG-олигонуклеотиды (ODN), в частности ODN 2006, 2007, 2059 или 2135 (Pontarollo RA et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); polyA-polyU, диметилдиоктадециламмонийбромид (DDA) (“Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, p. 157); N,N-диоктадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин (такой как AVRIDINE^®) (там же, стр. 148); карбомер, хитозан (см., например, патент США №5980912).

Фармацевтические композиции и вакцины согласно изобретению могут содержать или состоять по существу из одного или нескольких адъювантов. Подходящими адъювантами для практического применения настоящего изобретения являются (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеинового ангидрида и алкенильных производных полимеров, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как олигодезоксирибонуклеотидные последовательности, имеющие один или несколько неметилированных CpG (Klinman et al., 1996; WO 98/16247), (3) эмульсия масло-в-воде, такая как эмульсия SPT, описанная на стр. 147 «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», опубликованная M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на стр. 183 той же работы, (4) катионные липиды, содержащие четвертичную аммониевую соль, например DDA (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом документе, приведенном и включенном ссылкой в настоящую заявку, или (9) любые комбинации или их смеси.

В одном воплощении адъювант может включать TS6, TS7, TS8 и TS9 (US 7371395), LR2, LR3 и LR4 (US 7691368), TSAP (US20110129494), TRIGEN™ (Newport Labs), синтетические дцРНК (например, поли-IC), поли-ICLC [HILTONOL^®]), а также вспомогательные вещества MONTANIDE™ (W/O W/O/W, O/W, IMS и гель, все производства SEPPIC).

В одном воплощении изобретение предусматривает введение терапевтически эффективного количества вакцины или композиции для доставки рекомбинантных векторов HVT и FPV в целевую клетку. Определение терапевтически эффективного количества представляет собой обычные экспериментальные работы для специалиста в данной области.

Другой аспект изобретения относится к способу индукции иммунологического ответа у животного против одного или нескольких антигенов или защитного ответа у животного против одного или нескольких птичьих патогенов, причем этот способ включает инокуляцию животному, по меньшей мере, один раз вакциной или фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Еще один аспект изобретения относится к способу индукции иммунологического ответа у животного на один или несколько антигенов или защитного ответа у животного против одного или нескольких птичьих патогенов в режиме введения «прайм-буст», которое состоит, по меньшей мере, из одного праймирующего введения и, по меньшей мере, одно бустерного введения с использованием, по меньшей мере, одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Иммунологическая композиция или вакцина, используемые при праймирующем введении, могут быть одинаковыми, могут отличаться по природе от тех, которые используются в качестве бустера. Протокол в режиме введения «прайм-буст» в соответствии с изобретением включает праймирующее введение, за которым следует, по меньшей мере, второе введение для усиления ответа.

В одном аспекте протокола первичной активации по изобретению вводят композицию или вакцину, содержащую рекомбинантный вирусный вектор, который содержит и экспрессирует антиген птичьего гриппа in vivo, с последующим введением композиции или вакцины, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, который содержит и экспрессирует антиген птичьего гриппа in vivo. Рекомбинантный вирусный вектор, используемый при праймирующем введении, может отличаться по природе от тех, которые используются в качестве более позднего бустерного рекомбинантного вектора. Вирусный вектор, используемый при праймирующем введении, может быть выбран из HVT или FPV, а вирусный вектор, используемый при бустерном введении, может быть выбран из HVT или FPV, который отличается от вирусного вектора, используемого при праймирующем введении. Отмечено, однако, что праймирующая и бустерная композиция или вакцина могут содержать один и тот же рекомбинантный вектор. Также отмечено, что праймирующая и бустерная композиция или вакцина могут представлять собой поливалентное положение или вакцину, которая может содержать два или более вирусных векторов.

Режим «прайм-буст» может включать, по меньшей мере, одно праймирующее введение и, по меньшей мере, одно бустерное введение с использованием, по меньшей мере, одного общего полипептида или антигена. Режим «прайм-буст» может также включать, по меньшей мере, одно первичное введение и, по меньшей мере, одно бустерное введение с использованием различных полипептидов или антигенов. Праймирующее введение может включать одно или несколько введений. Аналогичным образом, бустерное введение может включать одно или несколько введений.

Птичьими патогенами могут быть вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус инфекционного бурсита (т.е. вирус IBDV или болезнь Гумборо), вирус болезни Марека (MDV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вирус птичьего энцефаломиелита, птичий реовирус, птичий парамиксовирус, птичий метапневмовирус, вирус птичьего гриппа, птичий аденовирус, вирус оспы кур, птичий коронавирус, птичий ротавирус, птичий парвовирус, птичий астровирус и вирус анемии цыплят, кокцидиоз (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli или Clostridium sp.

Обычно одно введение вакцины выполняется либо в возрасте одного дня подкожным или внутримышечным путем, либо in ovo у 17-19-дневного эмбриона. Повторное введение может быть сделано в течение 5-30 дней после первого введения.

Могут быть использованы различные способы введения суточным цыплятам, такие как подкожно или внутримышечно, внутрикожно, трансдермально. In ovo вакцинации может быть выполнена в амниотической мешок и/или эмбрион. Для вакцинации можно использовать имеющиеся в продаже устройства для введения in ovo и SC.

Композиция или вакцина может содержать дозу от около 10² до около 10²⁰, от около 10³ до около 10¹⁸, от около 10⁴ до около 10¹⁶, от около 10⁵ до около 10¹² VLP (вирусоподобных частиц), продуцируемых in vitro или in vivo из вирусного вектора, плазмиды или бакуловируса. Вирусный вектор может быть титрован на основании любых способов титрования вируса, включая, без ограничения указанным, FFA (анализ образования фокусов) или FFU (фокусобразующая единица), TCID50 (50%-ная инфекционная доза для тканевой культуры), PFU (бляшкообразующая единица), и FAID50 (50% -ная инфекционная доза флуоресцентного антитела), и VLP, полученные in vitro, можно титровать с помощью анализа гемагглютинации, ELISA и электронной микроскопии. Другие способы также могут быть применимы в зависимости от типа VLP. Композиция или вакцина может содержать от около 10^2,0 до около 10^10,0 pfu/дозу вирусного вектора.

Объем доз может составлять от около 0,1 до около 10 мл, от около 0,2 до около 5 мл.

Далее раскрытие будет описано посредством следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Конструирование ДНК-вставок, плазмид и рекомбинантных вирусных векторов проводили с применением стандартных методов молекулярной биологии, описанных J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014).

Пример 1 Конструирование рекомбинантных векторов HVT, экспрессирующих H5N2-HA

Пример 1.1 Конструирование рекомбинантного HVT501, экспрессирующего H5N2-HA

Целью исследования является создание рекомбинантного вируса HVT, в котором экспрессирующая кассета, содержащая промотор вируса обезьян 40 (SV40), гликопротеин гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа и синтетический поли А-хвост, вставлены в межгенный сайт UL55 в вирусе HVT (фиг. 2).

Родительским вирусом, использованным в конструкции, является HVT FC126. Гликопротеин гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа (названный LPC-HA), соответствующий последовательности H5N2-HA (SEQ ID NO: 2, кодируемый SEQ ID NO: 1, оптимизированный по кодонам), был синтезирован химически (GenScript). H5N2-HA (LPC-HA) был получен из высокопатогенного изолята вируса птичьего гриппа A (A/chicken/Washington/61-9/2014 (H5N2) (учетный номер GenBank KP739381.1). Ген синтетического HA (LPC-HA) был модифицирован в сайте расщепления между HA1 и HA2 из последовательности высокопатогенного птичьего гриппа (несколько основных аминокислот: RERRRKR - SEQ ID NO: 14) в последовательность низкопатогенного птичьего гриппа (RETR - SEQ ID NO: 15).

Промотор представляет собой промотор вируса обезьян 40 (SV40) (SEQ ID NO: 5). Локус вставки является межгенным сайтом UL55 (IG1) в HVT (фиг. 2). Донорную плазмиду pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI (плазмиду со вставкой, содержащую фланкирующие области UL55 вируса HVT + SV40 + синтетический поли A) конструировали, как описано ниже. Клетки фибробластов куриных эмбрионов (CEF) использовали для рекомбинации in vitro.

Конструирование донорной плазмиды

Для конструирования донорной плазмиды pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI фрагмент, включающий синтетический ген H5N2-HA, вырезали из LPC-HA H5N2 в pUC57 (синтезирован с помощью GeneScript) с помощью NotI и вставлен в тот же сайт, что и в плазмиде pHVTIG2SVCaFsyn SbfI, включающей промотор SV40, ген NDV-F и синтетический полиА-хвост, который также гидролизовали NotI и обрабатывали CIP, чтобы заменить ген NDV-F на LPC-HA. Гидролизованные NotI вставку (LPC-HA) и вектор (pHVTIG2) экстрагировали из геля с помощью набора Qiagens Gel Extraction, а затем лигировали. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Плазмиды подвергали скринингу на ориентацию вставки с помощью гидролиза SmaI. Правильная донорная плазмида была названа pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI. Минипрепаративно выделенную плазмиду pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI трансфицировали в одну лунку 6-луночного планшета и проводили ИФА с использованием куриной антисыворотки против птичьего гриппа H5N2 (Charles Rivers Laboratories, Lot # J0210) и FITC-меченных антител против куриных антител (Sigma, Кат. № F8888). После подтверждения транзиторной экспрессии плазмиду выращивали в культуре большего масштаба и экстракцию плазмиды осуществляли с использованием набора Qiagens Maxi Prep.

Гидролиз с SbfI проводили на максипрепаративно выделенных pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI и pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI (ранее сконструированной и верифицированной по последовательности плазмиды). Экспрессирующую кассету H5N2-HA с синтетическим поли-А SV40 из плазмиды pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI, фланкированную рестриктазами SbfI, экстрагировали из геля с использованием набора Qiagens Gel Extraction. Вектор pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI, фланкированный рестриктазами Sbf I, также экстрагировали из геля и обрабатывали CIP. Экспрессирующую кассету pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI лигировали с вектором pIG1HHV3gBCaFsyn SbfI. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Плазмиды подвергали скринингу на ориентацию вставки путем гидролиза с помощью EcoRI + SmaI. Плазмиду в отрицательной ориентации генома отбирали, выращивали в культуре большего масштаба и экстрагирование плазмиды осуществляли с использованием набора Qiagens Maxi Prep. Эта плазмида была верифицирована по последовательности и названа pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI (фиг. 3).

Получение рекомбинантов

За стандартной процедурой гомологичной рекомбинации следовала совместная электропорация вторичных клеток CEF с использованием донорной плазмиды pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI и вирусной ДНК, выделенной из вируса HVT FC126. Совместную электропорацию проводили с использованием 1×10⁷ 2° CEF в 300 мкл Opti-MEM и шокового воздействия при 150 В с емкостью 950 в кювете для электропорации 2 мм. Трансфицированные клетки высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 4 дней. Клетки, выращенные в 96-луночном планшете, затем дублировали в два 96-луночных планшета и инкубировали еще 3 дня. Один набор 96-луночных планшетов использовали для ИФА с использованием куриных поликлональных сывороток против птичьего гриппа H5N2 для идентификации положительных лунок, содержащих рекомбинанты, а другой набор 96-луночных планшетов использовали для извлечения инфицированных клеток из положительных лунок.

Способы очистки рекомбинантных вирусов выполняли сначала путем дупликации 96-луночного планшета и отбора ИФА для лунок, содержащих большинство ИФА-положительных бляшек с наименьшим количеством ИФА-отрицательных бляшек. Затем лунки, соответствующие этим критериям, собирали и доводили до 1 мл DMEM + 2% FBS. Из 1 мл исходного материала 5-20 мкл (в зависимости от количества видимых бляшек) удаляли и смешивали с 1×10⁷ CEF в 10 мл DMEM + 2% FBS и переносили аликвоты в новый 96-луночный планшет в попытке получить отдельные бляшки HVT на лунку. 96-луночные планшеты дублировали после 3 дней инкубации, и лунки, которые содержали бляшки, проверяли на наличие рекомбинантного HVT и отсутствие родительского вируса с помощью ИФА и ПЦР. Опять же, лунки, которые, как оказалось, содержат больше рекомбинантного вируса, путем сравнения результатов ПЦР-полос, собирали и доводили до 1 мл и аликвотировали в новые 96-луночные планшеты (такие же, как и раньше). После трех циклов очистки инфицированных вирусом клеток выделяли рекомбинантный HVT, экспрессирующий белок LPC-HA, и чистоту рекомбинантного вируса проверяли с помощью ИФА и ПЦР для подтверждения отсутствия родительского вируса. Отобранный рекомбинантный вирус затем пассировали из одной лунки 96-луночного планшета (P0) в 2xT-25 колбы (P1), затем в 2xT-75 колбы (P2), затем в 2xT-150 колбы (P3) и, наконец, 3×850 см²роллерные флаконы (пре-MSV сток или P4). Флаконы с 2 мл аликвотами хранили в жидком азоте.

Анализ рекомбинантов с помощью ПЦР

ДНК выделяли из исходного вируса экстракцией фенолом/хлороформом; осаждением этанолом и ресуспендированием в 20 мМ HEPES. Праймеры для ПЦР были сконструированы для специфической идентификации гена H5N2-HA, промотора, поли A, а также чистоты рекомбинантного вируса от родительского вируса HVT. ПЦР проводили с использованием 200 мкг ДНК-матрицы вместе с заданными парами праймеров, указанными в таблице 1. Условия проведения циклов ПЦР следующие (если не указано иное): 94°C - 2 мин; 30 циклов: 94°C - 30 с, 60°C - 45 с, 68°C - 2 мин; 68°C - 3 мин.

Анализ экспрессии

Для иммунофлуоресцентного тестирования материал P4 разводили в среде 1:100. Приблизительно 50 мкл разведенного вируса добавляли к 10 мл DMEM + 2% FBS с 1 × 10⁷ CEF и затем переносили аликвоты в 96-луночный планшет (100 мкл/лунку). Планшеты инкубировали в течение 3 дней при 37°C + 5% CO_2, пока не становились видны вирусные бляшки. Планшеты фиксировали 95% ледяным ацетоном в течение трех минут и трижды осторожно промывали водой. Добавляли куриную антисыворотку против птичьего гриппа H5N2 (лот № J0210, Charles Rivers Laboratory) в соотношении 1: 500 и HVT Mab L78 (лот № 072103, Merial) в соотношении 1:3000 и инкубировали чашки при 37°C в течение 45 минут. После инкубации планшеты трижды промывали PBS и FITC против курицы (cat # F8888, Sigma) в соотношении 1: 500 и добавляли TRITC против мыши (кат. № A10037, Life Technologies) в соотношении 1: 300. Планшеты опять инкубировали при 37°C в течение 45 минут. После инкубации клетки трижды промывали PBS и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, используя фильтр изотиоцианат флуоресцеина (FITC) и фильтр изотиоцианат тетраметил родамина (TRITC).

Результаты

Нуклеотидным и аминокислотным последовательностям донорной плазмиды pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI присвоены SEQ ID NO, показанные на фиг. 1.

Получение рекомбинантов и анализ экспрессии

Геномную ДНК вируса HVT FC126 совместно электропорировали с донорной плазмидой pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI для получения рекомбинантного HVT с помощью метода гомологичной рекомбинации. Рекомбинантный вирус отделяли от родительского вируса HVT путем отбора иммунофлуоресцентно положительных лунок и ПЦР-скрининга в нескольких раундах очистки бляшек. Очищенный из бляшек рекомбинантный вирус HVT, экспрессирующий белок LPC-HA H5N2, обозначенный как rHVT501, масштабировали из колб для тканевых культур в 3 роллерных флаконах по 850 см². Через около 72 часа после инфекции инфицированные CEF собирали. Аликвоты замораживали в жидком азоте, содержащем 10% FBS и 10% DMSO. Титрование проводили в трех повторах на CEF и титр 5,75 × 10⁵ БОЕ/мл был получен для rHVT501.

Иммунофлуоресцентные исследования проводили с использованием куриных антисывороток (лот № J0210, Charles Rivers Laboratories) и моноклонального антитела, специфичного к HVT (Merial), а затем FITC-меченными антителами против куриных IgG (cat # F8888, Sigma) и TRITC-меченными антителами против мышиных IgG (кат. № A10037, Life Technologies). Обнаружено, что все исследованные бляшки rHVT501 экспрессируют белок LPC-HA H5N2 (фиг. 4).

ПЦР-анализ rHVT501

Чистота рекомбинантного вируса была подтверждена с помощью ПЦР с использованием пар праймеров, которые являются специфичными для фланкирующих плеч HVT, промотора SV40, гена LPC-HA H5N2 и синтетического полиА-хвоста. Результаты ПЦР показывают, что рекомбинантный вирус rHVT501 несет предполагаемую кассету экспрессии, а сток вируса не содержит детектируемых количеств родительского вируса HVT (таблица 1 и фиг. 5-6).

Таблица 1. Праймер и ожидаемые полосы ПЦР

праймеры	HVT FC126	донор pHVTIG1SVLPC-HAsyn	rHVT501
MB080+MB081	323 п.н.	2593 п.н.	2593 п.н.
SV40PromoterF + syntailR	-	2223 п.н.	2223 п.н.
MB081 + H5N2 LPC F.3	-	888 п.н.	888 п.н.

Реакции ПЦР со всеми парами праймеров привели к ожидаемым продуктам ПЦР и паттерну полос. Как показано выше, нет никаких свидетельств родительского FC126 в rHVT501.

Заключение

На основании ПЦР-тестирования и иммунофлуоресцентного анализа, rHVT501 представляет собой рекомбинантный HVT, экспрессирующий ген H5N2-HA под контролем промотора SV40. rHVT501 не содержит детектируемого родительского вируса HVT.

Пример 1.2. Конструирование рекомбинантного HVT502, экспрессирующего H5N2-HA

Целью исследования является создание рекомбинантного вируса HVT, в котором экспрессирующая кассета, содержащая промотор гликопротеина B герпесвируса человека типа III (HHV3gB) в обратной ориентации (ro), промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), гемагглютинин вируса птичьего гриппа (HA), и синтетический поли A-хвост, вставляется в межгенный сайт UL55 в вирусе HVT (фиг. 2).

Родительским вирусом, использованным в конструкции, является HVT FC126. Гликопротеин гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа (названный LPC-HA), соответствующий последовательности H5N2-HA (SEQ ID NO: 2, кодируемой SEQ ID NO: 1, оптимизированной по кодонам), был синтезирован химически (GenScript). Используемые промоторы представляют собой промотор гликопротеина B герпесвируса человека типа III (HHV3gB) в обратной ориентации (ro) и промотор вируса обезьян 40 (SV40). Локус вставки является межгенным сайтом UL55 (IG1) в HVT (фиг. 2). Донорную плазмиду pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI (плазмида со вставкой, содержащая фланкирующие области UL55 вируса HVT + HHV3gBro + SV40 + синтетический поли A), конструировали, как описано ниже. Клетки фибробластов куриного эмбриона (CEF) использовали для рекомбинации in vitro.

Конструирование донорной плазмиды

Чтобы сконструировать донорную плазмиду pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI, фрагмент, включающий синтетический ген H5N2-HA, вырезали из LPC-HA H5N2 в pUC57 (синтезированной с помощью GeneScript) с использованием NotI и вставляли в тот же сайт в плазмиде pHVTIG1HHV3gBroSVCaFsyn SbfI (ранее сконструированная и верифицированная по последовательности плазмида), содержащей промотор HHV3gB в обратной ориентации, промотор SV40, ген NDV-F и синтетический хвост поли A, которую также гидролизовали NotI и обрабатывали CIP, заменяя ген NDV-F на LPC-HA. Гидролизованную по NotI вставку (LPC-HA) и вектор (pHVTIG1) экстрагировали из геля с помощью набора Qiagens Gel Extraction, а затем лигировали. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Плазмиды подвергали скринингу на ориентацию вставки с использованием гидролиза по SmaI. Правильная донорная плазмида была обозначена как pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI. Минипрепаративно выделенную плазмиду pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI трансфицировали в одну лунку 6-луночного планшета и проводили ИФА с использованием антисыворотки цыпленка против птичьего гриппа H5N2 (Charles Rivers Laboratories, Lot # J0210) и FITC-меченные антитела против антител курицы (Sigma, Кат. № F8888). После подтверждения транзиторной экспрессии плазмиду выращивали в более крупной культуре и экстракцию плазмиды осуществляли с использованием набора Qiagens Maxi Prep. Эта плазмида была проверена на последовательность и обозначена как pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI (фиг. 7).

Получение рекомбинантов

Процедуру гомологичной рекомбинации, как описано в Примере 1.1, использовали для получения рекомбинантного rHVT502.

Анализ рекомбинантов методом ПЦР

Для проверки rHVT502 была выполнена процедура ПЦР-анализа, как описано в Примере 1.1.

Анализ экспрессии

Для анализа экспрессии rHVT502 проводили анализ экспрессии, описанный в примере 1.1.

Результаты

Нуклеотидной и аминокислотной последовательности донорной плазмиды pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI были назначены SEQ ID NO, показанные на фиг. 1.

Получение рекомбинантов и анализы экспрессии

Геномную ДНК вируса HVT FC126 совместно электропорировали с донорной плазмидой pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI для получения рекомбинантного HVT с помощью метода гомологичной рекомбинации. Рекомбинантный вирус отделяли от родительского вируса HVT путем отбора иммунофлуоресцентно положительных лунок и ПЦР-скрининга в нескольких раундах очистки бляшек. Очищенный из бляшек рекомбинантный вирус HVT, экспрессирующий белок LPC-HA H5N2, обозначенный как vHVT502, масштабировали из колб для тканевых культур в 2×850 см² роллерных флакона. Через около 72 часа после инфекции собирали инфицированные CEF. Аликвоты, содержащие 10% FBS и 10% DMSO, замораживали в жидком азоте. Титрование проводили в трех повторах на CEF, и титр 8,25×10⁵ БОЕ/мл был получен для vHVT502.

Иммунофлуоресцентные исследования проводили с использованием куриных антисывороток (лот № J0210, Charles Rivers Laboratories) и моноклонального антитела, специфичного к HVT, а затем FITC-меченных антител против куриных IgG (cat # F8888, Sigma) и TRITC-меченных антител против мышиных IgG (cat # A10037, Life Technologies). Было обнаружено, что все исследованные бляшки vHVT502 экспрессируют белок LPC-HA H5N2 (фиг. 8).

ПЦР-анализ rHVT502

Чистота рекомбинантного вируса была подтверждена с помощью ПЦР с использованием пар праймеров, которые специфичны для фланкирующих плеч HVT, промоторов, гена LPC-HA H5N2 и синтетического полиА-хвоста. Результаты ПЦР показывают, что рекомбинантный вирус rHVT502 несет предполагаемую кассету экспрессии, а сток вируса не содержит детектируемых количеств родительского вируса HVT (таблица 2 и фиг. 9-10).

Таблица 2. Праймеры и ожидаемые полосы ПЦР

праймеры	HVT FC126	донор pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn	rHVT501
MB080+MB081	323 п.н.	3086 п.н.	3086 п.н.
SV40PromoterF + syntailR	--	2223 п.н.	2223 п.н.
MB081 + H5N2 LPC F.3	--	888 п.н.	888 п.н.
MB080 + HHV3gBF	--	607 п.н.	607 п.н.

Реакции ПЦР со всеми парами праймеров привели к ожидаемым продуктам ПЦР и паттерну полос. Как показано на фиг. 10, нет никаких признаков родительского FC126 в rHVT502.

Заключение

Основываясь на ПЦР-тестировании и иммунофлуоресцентном анализе, rHVT502 представляет собой рекомбинантный HVT, экспрессирующий ген H5N2-HA под контролем обратно ориентированного промотора HHV3gB и SV40. rHVT502 не содержит детектируемого родительского вируса HVT.

Пример 1.3. Конструирование рекомбинантного HVT503, экспрессирующего мутант H5N2-HA

Целью исследования является конструирование рекомбинантного вируса HVT, в котором экспрессирующая кассета, содержащая промотор вируса обезьян 40 (SV40), гликопротеин мутантного гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа и синтетический поли А-хвост, вставлена в межгенный сайт UL55 в вирусе HVT (фиг. 2).

Используется родительский вирус HVT FC126. Гликопротеин мутантного гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа (названный Mut-HA H5N2), соответствующий последовательности H5N2-HA (SEQ ID NO: 4, кодируемая SEQ ID NO: 3), был синтезирован химически (GenScript). H5N2-HA (Mut-HA H5N2) был получен из высокопатогенного изолята вируса птичьего гриппа A (A/chicken/Washington/61-9/2014 (H5N2) (учетный номер GenBank KP739381.1). Сайт расщепления синтетического гликопротеина НА этого синтетического гена был изменен для соответствия сайту расщепления низкопатогенной последовательности. H5N2-HA (Mut-HA H5N2) был дополнительно модифицирован для включения трех аминокислотных мутаций S136N, D171N, S239N (или в зрелом белке HA без сигнального пептида, S120N, D155N и S223N, Hoffmann et al., 2005, PNAS, 102 (36), p12915-12920).

В конструкции использовали промотор вируса обезьян 40 (SV40). Локус вставки является межгенным сайтом UL55 в HVT (см. фиг. 2). Донорную плазмиду pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI (плазмида со вставкой, содержащая фланкирующие области UL55 вируса HVT + SV40 + синтетический поли А), получали, как описано ниже. Клетки фибробластов куриных эмбрионов (CEF) использовали для рекомбинации in vitro.

Конструирование донорной плазмиды

Фрагмент, включающий синтетический ген H5N2-HA, вырезали из 3 Mut-HA H5N2 в pUC57 (синтезирован GeneScript) с использованием NotI и вставляли в тот же сайт в плазмиду pHVTIG2SVCaFsyn SbfI, содержащую промотор SV40, ген NDV-F и синтетический хвост поли A, который также гидролизовали NotI и обрабатывали CIP, чтобы заменить ген NDV-F на 3 Mut-HA. Гидролизованные NotI вставку (3 MUT-HA) и вектор (pHVTIG2) экстрагировали из геля с использованием набора Qiagens Gel Extraction, а затем лигировали. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Плазмиды подвергали скринингу на ориентацию вставки с использованием гидролиза по SmaI. Правильная донорная плазмида была обозначена pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI. Минипрепаративно выделенную плазмиду pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI трансфицировали в одну лунку 6-луночного планшета и проводили ИФА с использованием куриной антисыворотки против птичьего гриппа H5N2 (Charles Rivers Laboratories) и FITC-меченными антителами против куриных антител (Sigma, Cat # F8888). После подтверждения транзиторной экспрессии плазмиду выращивали в более крупной культуре и осуществляли экстракцию плазмиды с использованием набора Qiagens Maxi Prep.

Гидролиз SbfI проводили на максиперпаративно выделенных pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI и pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI (ранее сконструированная и верифицированная по последовательности плазмида). Экспрессирующую кассету SV40 H5N2-HA с синтетическим поли А, фланкированную рестриктазами SbfI, экстрагировали из геля из плазмиды pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI с использованием набора Qiagens Gel Extraction. Вектор pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI, фланкированный ферментами рестрикции SbfI, также экстрагировали из геля и обрабатывали CIP. Экспрессирующую кассету pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI лигировали в вектор pIG1HHV3gBCaFsyn SbfI. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Плазмиды подвергали скринингу на ориентацию вставки с использованием гидролиза EcoRI + SmaI. Плазмиду с отрицательной ориентацией генома отбирали, выращивали в более крупной культуре и осуществляли экстрагирование плазмиды с использованием набора Qiagens Maxi Prep. Эту плазмиду верифицировали по последовательности и назвали pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI (фиг. 11).

Получение рекомбинантов

Для получения рекомбинантного rHVT503 была использована процедура гомологичной рекомбинации, описанная в примере 1.1.

Анализ рекомбинантов методом ПЦР

Для проверки rHVT503 была выполнена процедура ПЦР, описанная в Примере 1.1.

Анализ экспрессии

Была использована процедура анализа экспрессии, описанная в примере 1.1.

Результаты

Нуклеотидным и аминокислотным последовательностям донорной плазмиды pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI назначены SEQ ID NO, представленные на фиг. 1.

Получение рекомбинантов и анализы экспрессии

Геномную ДНК вируса HVT FC126 электропорировали вместе с донорной плазмидой pHVTIG1HHV3gBroSVMut-HAsyn SbfI для получения рекомбинантного HVT с помощью метода гомологичной рекомбинации. Рекомбинантный вирус отделяли от родительского вируса HVT путем отбора иммунофлуоресцентно положительных лунок и ПЦР-скрининга в нескольких раундах очистки бляшек. Очищенный из бляшек рекомбинантный вирус HVT, экспрессирующий белок 3 Mut-HA H5N2, обозначенный как vHVT503, масштабировали из колб для тканевых культур в 2×850 см² роллерных флакона. Через около 72 часа после инфекции инфицированные CEF собирали. Аликвоты замораживали в жидком азоте, содержащем 10% FBS и 10% DMSO. Титрование проводили в трех повторах на CEF, и титр 3×10⁵ БОЕ/мл был получен для vHVT503.

Иммунофлуоресцентные исследования проводили с использованием куриных антисывороток (лот № J0210, Charles Rivers Laboratories) и моноклонального антитела, специфичного к HVT, а затем FITC-меченных антител против куриных IgG (cat # F8888, Sigma) и TRITC-меченных антител против мышиных IgG (cat # A10037, Life Technologies). Было обнаружено, что все исследованные бляшки vHVT503 экспрессируют белок LPC-HA H5N2 (фиг. 12).

ПЦР-анализ rHVT503

Чистота рекомбинантного вируса была подтверждена с помощью ПЦР с использованием пар праймеров, которые специфичны для фланкирующих плеч HVT, промотора SV40, гена 3 Mut-HA H5N2 и синтетического полиА-хвоста. Результаты ПЦР показывают, что рекомбинантный вирус vHVT503 несет предполагаемую кассету экспрессии, а сток вируса не содержит детектируемых количеств родительского вируса HVT (таблица 3 и фиг. 13-14).

Таблица 3. Последовательности праймеров и ожидаемые полосы ПЦР

праймеры	HVT FC126	донор pHVTIG1SVMut-HAsyn	rHVT501
MB080+MB081	323 п.н.	2593 п.н.	2593 п.н.
SV40PromoterF + syntailR	--	2223 п.н.	2223 п.н.
MB081 + H5N2 LPC F.3	--	888 п.н.	888 п.н.

Реакции ПЦР со всеми парами праймеров привели к ожидаемым продуктам ПЦР и характеру полос. Как показано на фиг. 14, нет никаких признаков родительского FC126 в rHVT503.

Заключение

Основываясь на ПЦР-тестировании и иммунофлуоресцентном анализе, rHVT503 является рекомбинантным HVT, экспрессирующим ген H5N2-HA под контролем промотора SV40. rHVT503 не содержит какого-либо детектируемого родительского вируса HVT.

Пример 1.4. Конструирование рекомбинантного HVT510, экспрессирующего мутант H5N2-HA

Целью исследования является создание рекомбинантного вируса HVT, в котором экспрессирующая кассета, содержащая промотор mCMV, гликопротеин мутантного гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа и полиА-хвост SV40, вставлена в межгенный сайт UL55 вируса HVT (фиг. 2).

Промотор представляет собой промотор mCMV (SEQ ID NO: 16). Локус вставки является межгенным сайтом UL55 (IG1) в HVT (фиг. 2). Донорную плазмиду pCD046-H5N2 HA, плазмиду со вставкой, содержащую фланкирующие области UL55 вируса HVT + промотор mCMV + полиА SV40 (SEQ ID NO: 18), конструировали, как описано ниже. Клетки фибробластов куриных эмбрионов (CEF) использовали для рекомбинации in vitro.

В этой конструкции экспрессия H5N2-HA управляется промотором mCMV, а ген H5N2-HA является ДНК дикого типа, не оптимизированной по кодонам. Сильный промотор, такой как CMV и оптимизация кодонов, приводит к генетической нестабильности конструкции.

Конструирование донорной плазмиды

Ген HA H5N2 (учетный номер GenBank-KP739381) (1704 п.н.) плазмиды «pUC57-H5N2 HA» (4424 п.н.) был получен путем синтеза генов (GenScript) и клонирован в сайт EcoRV pUC57. Донорную плазмиду pCD046 расщепляли NotI и обрабатывали CIP, и фрагмент размером 6,6 т.п.н. экстрагировали из геля. pUC57-H5N2 HA также расщепляли NotI, и фрагмент размером 1,7 т.п.н., содержащий HA H5N2, экстрагировали из геля. Фрагменты размером 6,6 т.п.н. и 1,7 т.п.н. лигировали для создания HA pCD046-H5N2 (см. фиг. 15).

Получение рекомбинантов

Процедура гомологичной рекомбинации, описанная в примере 1.1, была использована для получения рекомбинантного rHVT510.

ПЦР-анализ rHVT510

Процедура ПЦР, описанная в Примере 1.1, была выполнена для проверки rHVT510.

Анализ экспрессии

Была использована процедура анализа экспрессии, описанная в примере 1.1.

Результаты

Рекомбинантный вирус

После двух раундов очистки из бляшек выделяли чистый рекомбинантный вирус (rHVT510). RHVT510 был протестирован ИФА и ПЦР для проверки правильности вставки трансгена, а также отсутствия остаточного родительского вируса. Результаты анализа генетической стабильности показали, что rHVT510 стабилен после более чем 12 пассажей.

ПЦР-анализ rHVT510

Праймеры для ПЦР были разработаны для идентификации присутствия AIV H5N2 HA, промотора mCMV, полиА-хвост SV40, фланкирующих плеч рекомбинации вируса HVT. ПЦР-амплификации проводили с использованием ~200 нг ДНК-матрицы вместе с парами праймеров, указанными в таблице 3.1 и на фиг. 15В.

Таблица 3.1 Последовательности праймеров и ожидаемые полосы ПЦР

Наборы праймеров	Ожидаемые ампликоны (п.н.)
	rHVT510	HVT Fc126
MB080 + MB081	3649	323
mCMV.F + SV40tail.R	3320	Нет
SV40pro.F + syntail.R	Нет	Нет

ПЦР-амплификация с различными праймерами, перечисленными в таблице 3.1, подтвердила, что rHVT510 имеет ожидаемый паттерн амплификации и ампликоны (фиг. 15C).

Было подтверждено, что rHVT510 представляет собой рекомбинантный HVT, экспрессирующий ген H5N2-HA под контролем промотора mCMV. rHVT510 не содержит детектируемого родительского вируса HVT.

Пример 2. Конструирование рекомбинантных векторов вируса оспы кур, экспрессирующих H5N2-HA.

Пример 2.1 Конструирование рекомбинантного FPV3003, экспрессирующего H5N2-HA

Целью исследования является создание рекомбинантного вируса оспы кур, в котором экспрессирующая кассета, содержащая промотор H6 вируса осповакцины и гликопротеин гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа, заменяет CDS FPV158 (также известный как F8) в вирусе оспы кур (фиг. 16).

Родительский вирус, используемый в конструкции, представляет собой ослабленный вирус оспы кур (TROVAC). Химически синтезировали гликопротеин гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа, соответствующий последовательности H5N2-HA (SEQ ID NO: 2, кодируемой SEQ ID NO: 1) (GenScript). Сайт расщепления гликопротеина НА этого синтетического гена был изменен для соответствия сайту расщепления низкопатогенной последовательности.

Промотор является промотором Н6 вируса осповакцины (Н6) (SEQ ID NO: 11). Локус вставки является заменой FPV158 CDS (F8). Донорная плазмида pF8 H6pLPC-HA H5N2 (плазмида, содержащая фланкирующие области FPV158 (F8) вируса оспы кур + H6), была сконструирована, как описано ниже. Клетки фибробластов куриных эмбрионов (CEF) использовали для рекомбинации in vitro.

Конструирование донорной плазмиды

Фрагмент, включающий синтетический ген H5N2-HA, вырезали из LPC-HA H5N2 в pUC57 (синтезирован с помощью GeneScript) с использованием NruI и XhoI и вставляли в тот же сайт в плазмиду pF8 H6p (ранее сконструированная и подтвержденная по последовательности плазмида, Merial), содержащую промотор Н6 (фиг. 17), которая также была гидролизована по NruI и XhoI. NruI и XhoI расщепляли вставку (LPC-HA) и вектор (PF8 H6) экстрагировали с помощью набора Qiagens Gel Extraction, а затем лигировали. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Шесть минипрепаративно выделенных плазмид были подвергнуты скринингу на вставку с использованием расщепления SmaI. Все минипрепаративно выделенные плазмиды имели ожидаемый паттерн рестрикционных эндонуклеаз. Минипреп #1 выращивали в более крупной культуре и экстракцию плазмиды осуществляли с использованием набора Qiagens Maxi Prep. Эта плазмида была верифицирована по последовательности и названа pF8 H6pLPC-HA H5N2.

Получение рекомбинантов

Для получения рекомбинантного rFPV3003 была использована процедура гомологичной рекомбинации, описанная в Примере 1.1.

Анализ рекомбинантов с помощью ПЦР

Процедура ПЦР-анализа, как описано в Примере 1.1, была выполнена для проверки rFPV3003.

Анализ экспрессии

Анализ экспрессии, описанный в Примере 1.1, проводили для анализа экспрессии rFPV3003.

Результаты

Нуклеотидной и аминокислотной последовательностям донорной плазмиды pF8 H6pLPC-HA H5N2 назначены SEQ ID NO, показанные на фиг. 1.

Используя метод иммунофлуоресценции, как описано выше, было обнаружено, что рекомбинантные бляшки экспрессируют ген гемагглютинина H5N2.

Чистота рекомбинантного вируса была подтверждена с помощью ПЦР с использованием пар праймеров, специфичных к фланкирующим плечам оспы кур (фиг. 18). Результаты ПЦР демонстрируют, что рекомбинантный вирус rFP3003 несет предполагаемую кассету экспрессии, и сток вируса не содержит детектируемых количеств родительского вируса оспы кур (фиг. 19).

Заключение

На основании ПЦР-тестирования и иммунофлуоресцентного анализа rFPV3003 представляет собой рекомбинантный FPV, экспрессирующий ген H5N2-HA под контролем промотора H6 вируса осповакцины. rFPV3003 не содержит никаких детектируемых родительских FPV.

Пример 2.2 Конструирование рекомбинантного FP3004, экспрессирующего мутант H5N2-HA

Используемый родительский вирус представляет собой ослабленный вирус оспы кур (TROVAC). Гликопротеин гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа, соответствующий мутантной последовательности H5N2-HA (SEQ ID NO: 4, кодируемой SEQ ID NO: 3), был синтезирован химически (GenScript). Сайт расщепления гликопротеина НА этого синтетического гена был изменен для соответствия сайту расщепления низкопатогенной последовательности.

В конструкции использовали промотор H6 вируса осповакцины (H6). Локус вставки - замена CDS FPV158 (F8). Донорную плазмиду pF8 H6p3Mut-HA H5N2 (плазмиду, содержащую фланкирующие области FPV158 (F8) вируса оспы кур + H6) получали, как описано ниже. Клетки фибробластов куриных эмбрионов (CEF) использовали для рекомбинации in vitro.

Конструирование донорной плазмиды

Фрагмент, включающий синтетический мутантный ген H5N2-HA, вырезали из 3 Mut-HA H5N2 в pUC57 (синтезирован с помощью GeneScript) с использованием Nru I и Xho I и вставляли в тот же сайт в плазмиде HFp pF8 (Merial), содержащей промотор H6 (фиг. 20), которая был также гидролизована по NruI и XhoI. Гидролизованную по NruI и XhoI вставку (3 MUT-HA) и вектор (PF8 H6) экстрагировали из геля при помощи набора Qiagens Gel Extraction, а затем лигировали. Лигированный материал трансформировали с использованием набора Top10 Oneshot (кат. № C404002, Invitrogen). Бактериальные колонии выращивали в питательной среде LBamp и плазмиду экстрагировали с использованием набора Qiagens MiniSpin Prep. Шесть минипрепаративно выделенных плазмид подвергали скринингу на вставку с использованием гидролиза по SmaI. Все минипрепаративно выделенные плазмиды имели ожидаемый паттерн рестрикционных эндонуклеаз. Минипреп #1 выращивали в более крупной культуре и экстракцию плазмиды осуществляли с использованием набора Qiagens Maxi Prep. Эта плазмида была проверена на последовательность и названа pF8 H6p3Mut-HA H5N2.

Получение рекомбинантов

Для получения рекомбинантного rFP3004 использовали процедуру гомологичной рекомбинации, описанную в Примере 1.1.

Анализ рекомбинантов методом ПЦР

Для проверки rFP3004 была выполнена процедура ПЦР-анализа, описанная в Примере 1.1.

Анализ экспрессии

Для анализа экспрессии rFP3004 был выполнен анализ экспрессии, описанный в Примере 1.1.

Результаты

Нуклеотидной и аминокислотной последовательностям донорной плазмиды pF8 H6p3Mut-HA H5N2 назначены SEQ ID NO, представленные на фиг. 1.

Чистота рекомбинантного вируса была подтверждена с помощью ПЦР с использованием пар праймеров, специфичных для фланкирующих плечей оспы кур (фиг. 21). Результаты ПЦР показывают, что рекомбинантный вирус rFP3004 несет предполагаемую кассету экспрессии, а сток вируса не содержит детектируемых количеств родительского вируса оспы кур (фиг. 22).

Заключение

На основании ПЦР-тестирования и иммунофлуоресцентного анализа rFPV3004 представляет собой рекомбинантный FPV, экспрессирующий мутантный ген H5N2-HA под контролем промотора H6 вируса осповакцины. rFPV3004 не содержит никаких детектируемых родительских FPV.

Пример 3. Исследования иммуногенности и заражения у SPF-цыплят.

Исследования иммуногенности и заражения были проведены на цыплятах, не имеющих патогенов (SPF), вакцинированных в возрасте одного дня подкожно 0,2 мл на цыпленка, 3100 БОЕ/доза, рекомбинантными вакцинами HVT-AIV. Двадцать цыплят были отнесены к каждой вакцинной группе (см. таблицу 4). Группа, вакцинированная только разбавителем, была включена в качестве контроля заражения.

Таблица 4. Схема вакцинации

Группа	Вакцины
SHAM(1)^a	Только разбавитель
rHVT-501(1)^a	вектор rHVT-501
rHVT-502(2)^b	вектор rHVT-502
rHVT-503(2)^b	вектор rHVT-503
SHAM(2)^b	Только разбавитель

^arHVT-501: Исследование 1

^brHVT-502; rHVT-503: Исследование 2

Исследование проверочного заражения

Однодневных цыплят вакцинировали в соответствии с таблицей 4. В возрасте 4 недель цыплят заражали Tk/MN/12582/15 H5N2 при 10^6,0 EID₅₀ на цыпленка. После заражения цыплят ежедневно наблюдали на предмет заболеваемости и смертности, а нездоровых цыплят считали зараженными гриппом. Ротоглоточные мазки для определения выделения вируса проверочного заражения из дыхательных путей собирали через 2 и 4 дня после проверочного заражения (DPC) в 1,5 мл среды сердечно-мозговой инфузии (BHI) (Becton-Dickinson, Спаркс, Мэриленд), содержащей антимикробные соединения (100 мкг/мл гентамицина, 100 единиц/мл пенициллина и 5 мкг/мл амфотерицина В). У оставшихся цыплят из всех групп брали кровь для сбора сыворотки в 42 и 56 дни. Птицы были умерщвлены с помощью внутривенного пентобарбитала натрия (100 мг/кг массы тела) в возрасте 56 дней.

Как показано в таблицах 5 и 6, для групп, зараженных Tk/MN/12582/15 H5N2, неожиданно оказалось, что rHVT501, экспрессирующий HA H5N2 (LPC-HA H5N2), обеспечивал лучшую защиту у кур, чем rHVT503, который содержит мутантный ген HA H5N2. rHVT501 обеспечивает 100% защиту от клинического заболевания, тогда как rHVT502 и rHVT 503 обеспечивают 45-50% и 15% защиту от клинического заболевания, соответственно. Все три рекомбинантные вакцины rHVT обеспечивали защиту от инфекций вирусом птичьего гриппа по сравнению с контрольной группой.

Таблица 5. Результаты эффективности rHVT-AIV - количество птиц, выживших после проверочного заражения

Дни после инокуляции	SHAM(1)	rHVT-501(1)	rHVT-502(2)	rHVT-503(2)	SHAM(2)
0	20	19	20	20	20
1	20	19	20	20	20
2	6	19	11	5	5
3	3	19	10	3	1
4	1	19	10	3	0
5	1	19	10	3	0
6	1	19	9	3	0
7	1	19	9	3	0
8	1	19	9	3	0
9	1	19	9	3	0
10	1	19	9	3	0
11	1	19	9	3	0
12	1	19	9	3	0
13	1	19	9	3	0
14	1	19	9	3	0

Таблица 6. Результаты эффективности rHVT-AIV - процент выживания после заражения

Дни после инокуляции	SHAM(1)	rHVT-501(1)	rHVT-502(2)	rHVT-503(2)	SHAM(2)
0	100	100	100	100	100
1	100	100	100	100	100
2	30	100	55	25	25
3	15	100	50	15	5

4	5	100	50	15
5	5	100	50	15
6	5	100	45	15
7	5	100	45	15
8	5	100	45	15
9	5	100	45	15
10	5	100	45	15
11	5	100	45	15
12	5	100	45	15
13	5	100	45	15
14	5	100	45	15

Вирусовыделение исследовали с использованием количественного теста RT-PCR на образцах мазков ротоглотки и клоаки, взятых у выживших птиц при 2 и 4 dpc. Мазки были проверены с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени (qRRT-PCR) для вируса птичьего гриппа, и пороговые значения цикла qRRT-PCR были преобразованы в эквивалентные инфекционные титры в оплодотворенных куриных яйцах на основе линии регрессии, полученной с помощью серии разведений заражающего вируса (Lee et al., Journal of Virological Methods 119 (2): 151-158). Вкратце, РНК экстрагировали из материала ротоглоточного мазка путем добавления 250 мкл среды для мазков к 750 мкл Trizol LS (Invitrogen Inc., Карлсбад, Калифорния) затем перемешивали с помощью вихревой мешалки, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и затем добавляли 200 мкл хлороформа. Образцы снова встряхивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и затем центрифугировали в течение 15 минут при около 12000 × g. Водную фазу собирали и выделяли РНК с помощью набора для выделения вирусной РНК MagMAX AI/ND (Ambion, Inc. Аустин, Техас) в соответствии с инструкциями набора, используя систему обработки магнитных частиц KingFisher (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс). Штаммы вируса птичьего гриппа для проверочного заражения использовали при получении РНК для количественного стандарта. Стоки вируса в аллантоисной жидкости разводили в бульоне BHI (Becton-Dickinson) и титровали на зародышах куриных яиц во время разведения в соответствии со стандартными способами (Swayne et al., 2008, Avian influenza. In: Isolation and Identification of Avian Pathogens. 5th ed., pp. 128-134). РНК всего вируса экстрагировали из десятикратных разведений титруемого вируса, как описано для материала с мазка. qRRT-ПЦР для гена матрицы вируса гриппа проводили, как описано ранее (Lee et al., 2004). Титры вируса в образцах рассчитывали на основании стандартных кривых, либо рассчитанных с помощью программного обеспечения Smart Cycler II (Cepheid, Inc. Саннивэйл, Калифорния), либо путем экстраполяции уравнения стандартной кривой.

В дополнение к обеспечению 100% защиты от клинического заболевания, rHVT501 также значительно уменьшил вирусовыделение, что было определено по количеству копий вируса в 10 мкл материала мазка, как показано на фиг. 23.

Пример 4. Исследования иммуногенности и заражения на SPF-цыплятах против гомологичных и гетерологичных проверочных заражений AIV.

Целью исследования является определение эффективности rHVT501 и rHVT510, вводимых цыплятам SPF однодневного возраста, в отношении заражения двумя (гомологичным и гетерологичным) штаммами вируса птичьего гриппа с высокой патогенностью (HPAIV).

Семьдесят два однодневных цыпленка были разделены на 6 групп (см. таблицу 7). Исследование проводилось в соответствии с графиком, указанным в таблице 8.

Таблица 7. Группы исследования

Группа	Вакцина БОЕ/доза	Путь/Объем (мл)	Количество размещенных птиц	Количество птиц при проверочном заражении	Проверочное заражение H5*
1	rHVT501 ~ 2200	0,2 мл/SQ	12	10	[Minnesota/12582]
2	rHVT510 ~ 2100	0,2 мл/SQ	12	10	[Minnesota/12582]
3	Ложно-вакцинированные отрицательные контроли	0,2 мл/SQ	12	10	[Minnesota/12582]
4	rHVT501 ~ 2200	0.2 мл/SQ	12	10	Гетерологичный
5	rHVT510 ~ 2100	0.2 мл/SQ	12	10	Гетерологичный
6	Ложно-вакцинированные отрицательные контроли	0.2 мл/SQ	12	10	Гетерологичный

* Птицы были заражены на 28-й день исследования одним из двух штаммов HPAIV H5: «гомологичный» A/turkey/Minnesota/12582/2015; Клада 2.3.4.4; [Minnesota/12582]; или «Гетерологичный» - (A/Egypt/N04915/2014, H5N1) по интрахоанальному пути с ~ 10^6,0 EID₅₀ на дозу.

Таблица 8. Хронология исследования

День исследования или диапазон	Активность
День 0	Все птицы были вакцинированы или ложно-вакцинированы по пути SQ.
Дни 16-25	Все группы были сокращены до десяти (10) птиц и шеи метили для индивидуальной идентификации с помощью пронумерованных повязок.
Дни 25-28	Кровь собирали через венопункцию из крыла или яремной вены.
День 28	Все птицы были заражены HPAIV по интрахоанальному пути, 0,1 мл на птицу.
Дни 28-42	Птиц ежедневно наблюдали на предмет любых неблагоприятных реакций на заражение.

День 30*	Мазки ротоглотки и/или клоаки были собраны у всех птиц (в том числе птиц, найденных мертвыми в этот день исследования) и хранили инфузионные среды мозга и сердца (BHI) при -70°C до проведения молекулярного тестирования для определения вирусовыделения.
День 32*	Мазки ротоглотки и/или клоаки собирали из всех птиц (в том числе птиц, найденных мертвыми в этом день исследования) и хранили инфузионные среды мозга и сердца (BHI) при -70°C до проведения молекулярного тестирования для определения вирусовыделения.
День 42	У всех оставшихся птиц была собрана кровь, и птицы были уничтожены.

* Образцы мазков были собраны только в дни исследования 30 и 32 у всех птиц, живых в эти дни, а также у птиц, найденных мертвыми в эти конкретные дни исследования. Любые другие птицы, которые были найдены мертвыми или подвергнуты эвтаназии в любой другой день исследования, не использовались для сбора образцов.

У всех птиц наблюдались типичные клинические признаки HPAIV, включая смертность в течение 14 дней после заражения. Клинические признаки включают: тяжелую депрессию, признаки болезни в нервной или дыхательной системе и/или смерть. В конце периода наблюдения (42 день исследования), выжившие будут подвергнуты забору крови на серологию и уничтожены.

Сыворотку, собранную до и после заражения, использовали в анализах ингибирования гемагглютинации (HI) для определения уровней антител против выбранных штаммов AIV. Аликвоту сыворотки перед заражением также использовали для перекрестной нейтрализации.

Вирусную нагрузку HPAIV тестировали методом ОТ-ПЦР в реальном времени в собранных мазках, следуя обычным процедурам. Вирусную РНК экстрагировали, используя набор для выделения вирусной РНК MagMAX™ -96 AI/ND® (Ambion, Inc.), следуя инструкциям производителя. Полученные экстракты вирусной РНК определяли количественно с помощью одностадийной qRRT-PCR, которая нацелена на матричный ген вируса гриппа, используя систему ПЦР в реальном времени 7500 FAST (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Стандартные кривые количественного определения вирусной РНК были получены для РНК, выделенной из разведений тех же титрованных стоков вирусов проверочного заражения. Для анализа все отрицательные образцы считались ниже предела обнаружения, установленного для каждого вируса.

Результаты

Результаты смертности показаны в таблице 9 ниже. Результаты показали, что как rHVT501, так и rHVT510 обеспечивали 100% защиту от гомологичных проверочных заражений AIV, rHVT510 обеспечивала 100% защиту от гетерологичных проверочных заражений AIV, а rHVT501 обеспечивала 90% защиту от гетерологичных проверочных заражений AIV.

Таблица 9. Количество птиц, положительных по HPAIV и процент защиты/заражения по группам

Группа	Вакцина БОЕ/доза*	Проверочное заражение H5**	# Положительных/Всего # птиц	% Защиты (% Инфекции)
1	rHVT501 2,200	Minnesota/12582	0/10	100
2	rHVT510 2,100	Minnesota/12582	0/10	100
3	Ложно-вакцинированные отрицательные контроли	Minnesota/12582	10/10	(100%)
4	rHVT501 +2200	Egypt/2014	1/10	90
5	rHVT510 +2100	Egypt/2014	0/10	100
6	Ложно-вакцинированные отрицательные контроли	Egypt/2014	10/10	(100%)

*Все птицы были заражены в 28 день исследования по интрахоанальному пути с помощью A/turkey/Minnesota/12582/2015; Клада 2.3.4.4; [Minnesota/12582], при 10 6,9 EID 50 на дозу (группы 1-3) или A/Egypt/N04915/2014, H5N1, клада 2.2.1; [Egypt/2014], при 10 5,7 EID 50 на дозу (группы 4-6).

Результаты серологии показаны на фиг. 23В и 23С и в таблицах 10 и 11.

Таблица 10. Результаты анализа ингибирования гемагглютинации (HI) -

Гомологичное проверочное заражение A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2)

Группа	# Птиц	HI Серология - положительное количество * на общее количество (GMT- включает положительных птиц)	log2 GMT
		Перед проверочным заражением	После проверочного заражения	Перед проверочным заражением	После проверочного заражения
rHVT501	1	16	128	4	7
	2	32	64	5	6
	3	32	128	5	7
	4	32	16	5	4
	5	32	32	5	5
	6	32	128	5	7
	7	64	64	6	6
	8	32	64	5	6
	9	64	64	6	6
10	32	32	5	5
	# птиц	10/10	10/10
	GMT	34,3	59,7
log2 GMT	5,1	5,9
rHVT510	1	32	128	5	7

	2	16	16	4	4
	3	16	32	4	5
	4	16	32	4	5
	5	16	8	4	3
	6	16	32	4	5
	7	8	8	3	3
	8	16	32	4	5
	9	16	32	4	5
10	32	64	5	6
	# птиц	10/10	10/10
	GMT	17,1	27,9
log2 GMT	4,1	4,8
Ложный	1	4	-**	2	-
	2	4	-	2	-
	3	4	-	2	-
	4	4	-	2	-
	5	4	-	2	-
	6	4	-	2	-
	7	4	-	2	-
	8	4	-	2	-
	9	4	-	2	-
10	4	-	2	-
	# птиц
	GMT
log2 GMT

Положительный*: выше 4 log2 GMT считаются положительными.

-**: птица не выжила при проверочном заражении.

Таблица 11. Результаты анализа ингибирования гемагглютинации (HI)

Гетерологичное проверочное заражение A/Egypt/N04915/2014 (H5N1)

Группа	# Птиц	HI Серология - положительное количество * на общее количество (GMT- включает положительных птиц)	log2 GMT
		Перед проверочным заражением	После проверочного заражения	Перед проверочным заражением	После проверочного заражения
rHVT501	1	8	512	3	9
	2	4	64	2	6
	3	4	-	2	-
	4	4	128	2	7
	5	8	8	3	3
	6	4	4	2	2
	7	4	512	2	9
	8	4	256	2	8
	9	4	32	2	5
10	4	64	2	6
	# птиц	2/10	8/9
GMT	8	69,1

	log2 GMT	3	6,1
rHVT510	1	4	4	2	2
	2	4	4	2	2
	3	4	4	2	2
	4	4	4	2	2
	5	4	8	2	2
	6	4	4	2	2
	7	4	8	2	3
	8	4	32	2	5
	9	4	16	2	4
10	4	4	2	2
	# птиц	0/10	4/10
	GMT	4	13,5
log2 GMT	2	3,8
Ложный	1	4	-	2	-
	2	4	-	2	-
	3	4	-	2	-
	4	4	-	2	-
	5	4	-	2	-
	6	4	-	2	-
	7	4	-	2	-
	8	4	-	2	-
	9	4	-	2	-
10	4	-	2	-
	# птиц	0/10
	GMT	4
log2 GMT	2

Результаты HI показали, что в случае ответа до проверочного заражения в общей сложности 12 птиц имеют титры HI выше порогового значения в группе rHVT501 против 10 в группе rHVT510, а в случае ответа после заражения соответствующие цифры составляют 18 и 14. Разница в ответе после гетерологичного заражения показала, что меньшее количество птиц реагировало в группе rHVT510, потому что вакцина хорошо контролировала репликацию вируса проверочного заражения. Также более низкий уровень титра HI в группе rHVT510 по сравнению с группой rHVT501 указывает на то, что вирус заражения не мог легко реплицироваться.

Результаты вирусовыделения показаны на фиг. 23D и 23E и в таблицах 12 и 13.

Таблица 12. Результаты вирусовыделения - Гомологичное проверочное заражение A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2)

Группа	Птица #	qRT-PCR (log10 EID50 титр/1 мл)
		2dpc	4dpc
rHVT501	1	1,9*	1,9
	2	1,9	1,9
	3	1,9	2,0
4	1,9	2,3

	5	1,9	1,9
	6	1,9	2,0
	7	1,9	1,9
	8	4,7	4,8
	9	1,9	1,9
10	1,9	1,9
	# птиц	1/10	4/10
	среднее	2,2	2,2
	STD	0,9	0,9
rHVT510	1	1,9	1,9
	2	1,9	1,9
	3	1,9	1,9
	4	1,9	1,9
	5	1,9	1,9
	6	1,9	1,9
	7	1,9	1,9
	8	1,9	1,9
	9	1,9	1,9
10	1,9	1,9
	# птиц	0/10	0/10
	среднее	1,9	1,9
	STD	0,0	0,0
Ложный	1	7,3	-
	2	7,9	-
	3	7,1	-
	4	5,7	-
	5	7,9	-
	6	6,6	-
	7	6,8	-
	8	8,4	-
	9	7,5	-
10	6,7	-
	# птиц	10/10
	Среднее	7,2
	STD	0,8

*: 2,0 = самый низкий предел обнаружения. Отрицательные значения равны 1,9

Таблица 13. Результаты вирусовыделения - Гомологичное проверочное заражение A/Egypt/N04915/2014 (H5N1)

Группа	Птица #	qRT-PCR (log10 EID50, титр/1 мл)
		2dpc	4dpc
rHVT501	1	3,5*	3,4
	2	3,7	3,3
	3	4,1	4,0
	4	5,2	4,5
	5	1,6	2,5
	6	2,5	2,1
	7	3,9	3,6
	8	5,6	3,7
	9	3,5	2,8
	10	5,0	3,9
	# птиц	9/10	10/10
	среднее	3,9	3,4
STD	1,2	0,7
rHVT510	1	3,5	3,7
	2	2,4	1,6
	3	4,6	4,2
	4	2,8	1,7
	5	5,2	4,4
	6	4,4	4,5
	7	2,1	1,6
	8	4,8	4,1
	9	4,3	4,8
	10	2,0	2,1
	# птиц	10/10	8/10
	среднее	3,6	3,3
STD	1,2	1,4
Ложный	1	5,9	-
	2	7,0	-
	3	6,7	-
	4	6,7	-
	5	6,0	-
	6	5,2	-
	7	5,6	-
	8	6,4	-
	9	6,2	-
	10	6,7	-
	# птиц	10/10
	среднее	6,2
STD	0,6

*: 1.7 = Самый низкий предел обнаружения. Отрицательные значения равны 1,6

Таблицы 12-13 и фиг. 23D-23E продемонстрировали, что как rHVT501, так и rHVT510 уменьшали вирусовыделение у вакцинированных птиц. Среднее вирусовыделение в группах rHVT501 и rHVT510 значительно ниже, чем вирусовыделения в ложной группе в обоих исследованиях гомологичного и гетерологичного проверочного заражения. Результаты вирусовыделения показали, что в исследовании гомологичного проверочного заражения A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2) ни у одной (0/10) птицы в группе rHVT510 не было ни одного вирусовыделения как при 2dpc, так и при 4dpc, а у одной (1/10) и четырех (4/10) птиц в группе rHVT501 происходило вирусовыделение при 2dpc и 4dpc соответственно. У всех птиц (10/10) в ложной группе происходило вирусовыделение. Результаты вирусовыделения подтвердили результаты HI о том, что rHVT510 хорошо контролировал репликацию вируса проверочного заражения, так что вирус проверочного заражения не мог легко реплицироваться.

Пример 5. Исследования иммуногенности и проверочное заражение у цыплят-бройлеров с антителами материнского происхождения (MDA).

Целью исследования является оценка введения в режиме «прайм-буст» (двух введений) двух гетерологичных вакцин или одновременного введения (одного введения) двух гетерологичных вакцин MDA-положительным цыплятам-бройлерам для преодоления MDA и усиления иммунного ответа. Гетерологичными вакцинами могут быть вакцины разных типов, такие как вакцина HVT AIV-HA или FPV AIV-HA.

Бройлерных цыплят с AI H5 MDA вакцинировали rHVT501 отдельно in ovo или в однодневном возрасте и через 3 недели проводили бустерную вакцинацию рекомбинантным NDV, экспрессирующим HA гриппа (rNDV-H5), чтобы определить наличие синергии между этими двумя кандидатами на вакцину. Через 3 недели после бустерной вакцинации (в 6-недельном возрасте) птиц заражали Tk/MN/12582/15 H5N2 при 10^6,0 EID₅₀ на курицу интраназальным путем.

Клоакальные и ротоглоточные мазки брали во 2 и 4 DPC для оценки воздействия на вирусовыделение, как описано ранее.

***

Опираясь таким образом на подробные воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение, определенное вышеприведенными примерами, не должно ограничиваться конкретными деталями, изложенными в вышеприведенном описании, поскольку многие его возможные варианты возможны без отступления от духа или объема настоящего изобретения.

Все процитированные или упоминаемые в данном документе документы («документы, процитированные в данном документе») и все документы, цитируемые или упоминаемые в процитированных документах, вместе с инструкциями изготовителя, описаниями, спецификациями продукта и технологическими картами для любых продуктов, упомянутых в данном документе или в любом документе, включенном ссылкой в данный документ, включены в данный документ ссылкой и могут быть использованы при практическом применении данного изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Merial, Inc.

Соединенные Штаты Америки, представленные

Министром сельского хозяйства

Prichard, Joyce

Mebatsion, Teshome

Swayne, David

<120> РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВЕКТОРЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ АНТИГЕНЫ

ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА,

И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> MER 16-303

<150> 62/410,885

<151> 2016-10-21

<160> 28

<170> версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 1692

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> ДНК, кодирующая белок H5N2 HA в плазмидах pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI

и pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI

<400> 1

atggaaaaga ttgtgctgct gtttgctgtg attagcctgg tgaagtcaga tcagatttgt 60

atcggttacc atgccaataa ttctactaaa caggtggata caattatgga aaagaacgtg 120

accgtgacac acgctcagga catcctggag agaactcata acgggaagct gtgcgatctg 180

aatggtgtga aacccctgat cctgaaggac tgctctgtgg caggctggct gctgggaaac 240

cccatgtgtg atgagttcat cagagtgcct gaatggtcct acattgtgga gagggctaac 300

cctgcaaatg atctgtgcta cccaggaacc ctgaacgact atgaggaact gaagcacctg 360

ctgagccgca tcaaccattt cgaaaagaca ctgatcatcc cccggagctc ctggcctaat 420

cacgagacta gcctgggagt gtccgcagct tgtccatacc agggagcatc ttcattcttt 480

cgcaacgtgg tgtggctgat caagaaaaat gatgcctacc ccaccatcaa aatctcatac 540

aacaacacaa accgggaaga tcttctgatc ctgtggggca tccaccattc caacaatgca 600

gccgagcaga ctaacctgta caaaaatcct gatacctatg tgtctgtggg gacttcaacc 660

ctgaaccagc gcctggtgcc aaagatcgcc actcggtcac aagtgaatgg gcagagtggt 720

cgcatggatt tcttttggac catcctgaag ccaaacgacg ctattcactt cgaaagcaac 780

ggcaatttta tcgcccccga gtacgcttat aagattgtga agaaaggaga cagtaccatc 840

atgaaaagcg agatggaata cgggcactgc aacacaaagt gtcagactcc tatcggtgcc 900

attaacagta gcatgccatt ccacaatatc catcccctga caattgggga gtgccccaag 960

tatgtgaaat ctaacaagct ggtgctggct actggtctga gaaacagccc cctgagagag 1020

acccggggcc tgtttggagc aattgctggg tttattgagg gcggatggca gggtatggtg 1080

gatgggtggt acggttatca ccattccaac gaacaggggt ctggttacgc tgcagataaa 1140

gagtccacac agaaggctat tgacggagtg actaacaaag tgaacagcat cattgacaag 1200

atgaatactc agttcgaggc agtggggaga gaatttaaca atctggagag aaggatcgaa 1260

aacctgaata agaaaatgga agatggcttc ctggacgtgt ggacctacaa cgcagagctg 1320

ctggtgctga tggagaatga aaggacactg gattttcacg acagcaacgt gaaaaatctg 1380

tatgataaag tgagactgca gctgagggac aacgctaaag aactgggcaa tggatgtttc 1440

gagttttacc ataagtgcga taacgagtgt atggaaagtg tgagaaatgg cacatacgac 1500

tatccaaaat atagcgagga agcaatcctg aagagggagg aaattagcgg cgtgaaactg 1560

gagtccatcg gaacctacca gatcctgtca atttatagta cagtggcctc ctctctggca 1620

ctggccatca ttgtggctgg gctgtctctg tggatgtgta gtaacgggag tctgcagtgt 1680

aggatttgta tc 1692

<210> 2

<211> 564

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> Белок H5N2 HA в vHVT-501, vHVT-502 и vHVT510

<400> 2

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Val Ile Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Arg Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Thr Leu Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Thr Leu Ile Ile Pro Arg Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ala Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Ile Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys

195 200 205

Asn Pro Asp Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Met Glu Tyr Gly

275 280 285

His Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Leu Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

340 345 350

Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His

355 360 365

Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln

370 375 380

Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys

385 390 395 400

Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu

405 410 415

Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp

420 425 430

Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg

435 440 445

Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val

450 455 460

Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe

465 470 475 480

Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn

485 490 495

Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Ile Leu Lys Arg

500 505 510

Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile

515 520 525

Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Ile

530 535 540

Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys

545 550 555 560

Arg Ile Cys Ile

<210> 3

<211> 1692

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> ДНК, кодирующая мутант H5N2 HA в плазмиде pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI

(vHVT503)

<400> 3

atggaaaaga ttgtgctgct gtttgctgtg atttccctgg tgaagtccga ccagatttgt 60

attggctacc acgctaataa ctcaaccaaa caggtggata caattatgga aaagaacgtg 120

accgtgacac acgctcagga catcctggag agaactcata acgggaagct gtgcgatctg 180

aatggtgtga aacccctgat cctgaaggac tgctcagtgg caggctggct gctgggaaac 240

cccatgtgtg atgagttcat cagagtgcct gaatggtcct acattgtgga gagggctaac 300

cctgcaaatg atctgtgcta cccaggaacc ctgaacgact atgaggaact gaagcacctg 360

ctgagtcgca tcaaccattt cgaaaagaca ctgatcatcc cccggaacag ctggcctaat 420

cacgagactt cactgggcgt gagtgccgct tgtccatacc agggagcaag ctccttcttt 480

cgcaacgtgg tgtggctgat caagaaaaac aatgcctacc ccaccatcaa aatctcctac 540

aacaacacaa atcgggaaga tcttctgatc ctgtggggca tccaccattc taacaatgca 600

gccgagcaga ctaacctgta caaaaatcct gacacctatg tgagcgtggg gacttccacc 660

ctgaaccagc gcctggtgcc aaagatcgcc actcggtctc aggtgaacgg gcagaatggt 720

cgcatggatt tcttttggac catcctgaag ccaaatgacg ctattcactt cgaatccaac 780

ggcaatttta tcgcccccga gtacgcttat aagattgtga agaaaggaga ctctaccatc 840

atgaaatcag agatggaata cgggcactgc aacacaaagt gtcagactcc tatcggtgcc 900

attaactctt caatgccatt ccacaatatc catcccctga caattgggga gtgccccaag 960

tatgtgaaat caaacaagct ggtgctggct actggtctga ggaatagtcc tctgcgcgaa 1020

acccggggcc tgtttggagc aattgctggt tttattgagg gcggatggca gggtatggtg 1080

gatgggtggt acggttatca ccatagtaac gaacagggga gcggttacgc tgcagataaa 1140

gagtctacac agaaggctat tgacggagtg actaacaaag tgaacagcat cattgacaag 1200

atgaacactc agttcgaggc agtggggaga gaatttaaca atctggagag aaggatcgaa 1260

aacctgaata agaaaatgga agatggcttc ctggacgtgt ggacctacaa cgcagagctg 1320

ctggtgctga tggagaatga aaggacactg gattttcacg acagcaacgt gaaaaatctg 1380

tatgataaag tgagactgca gctgagggac aacgctaaag aactgggcaa tggatgtttc 1440

gagttttacc ataagtgcga taacgagtgt atggaaagcg tgagaaatgg cacatacgac 1500

tatccaaaat attccgagga agcaatcctg aagagggagg aaatttccgg cgtgaaactg 1560

gagtctatcg gaacctacca gatcctgtcc atttattcta cagtggccag tagcctggca 1620

ctggccatca ttgtggctgg tctgtctctg tggatgtgtt caaacggtag tctgcagtgt 1680

agaatctgta tc 1692

<210> 4

<211> 564

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> мутант H5N2 HA в vHVT503

<400> 4

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Val Ile Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Arg Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Thr Leu Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Thr Leu Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ala Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Ile Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys

195 200 205

Asn Pro Asp Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Asn Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Met Glu Tyr Gly

275 280 285

His Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Leu Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

340 345 350

Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His

355 360 365

Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln

370 375 380

Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys

385 390 395 400

Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu

405 410 415

Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp

420 425 430

Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg

435 440 445

Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val

450 455 460

Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe

465 470 475 480

Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn

485 490 495

Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Ile Leu Lys Arg

500 505 510

Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile

515 520 525

Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Ile

530 535 540

Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys

545 550 555 560

Arg Ile Cys Ile

<210> 5

<211> 368

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> промотор SV40

<400> 5

caattcgagc tcggtacagc ttggctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc 60

ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg 120

tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 180

tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 240

gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 300

tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc 360

aaaaagct 368

<210> 6

<211> 478

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Промотор HHV3gB

<400> 6

ttatatcttc tgattgtgtg ggctctactt gtaaactctc aaaaaacgag cttggagaga 60

ccgacacaac cgccgtaaca aacaaagaaa atatgcataa aaagcataac cacacccccg 120

taacggatgt tatgaaaacg ccgggtccgt tgaatccgga gccagccgct gcattagggt 180

gtatagaaga gaaaaaacgt ctgaatcgta gattacgacg gtattctggt cgatccctgt 240

ttctccactt tgaataatag ccacaagggg acatgtttct tcgtacgtta aataaatgcc 300

gtctaagggt ccgtgggaac tgcctatacc tttaggttga gacgtgcacc cgcgtggatc 360

cttacctaga cggtcaacgc gacataaccg cacctcccca caatggaaaa cagaggtgaa 420

tagtgtggtt gcaaacacaa gctccctaat atatttccag gcaagtctct gaattccc 478

<210> 7

<211> 154

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> синтетический Поли-A

<400> 7

aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta 60

ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc 120

cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt ctct 154

<210> 8

<211> 4359

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность донорной плазмиды:

pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI

<220>

<221> Фланкирующие плечи

<222> (1)..(832)

<220>

<221> Промотор SV40

<222> (853)..(1220)

<220>

<221> HA H5N2

<222> (1236)..(2930)

<220>

<221> Синтетический Поли-А

<222> (2945)..(3098)

<220>

<221> Фланкирующие плечи

<222> (3119)..(4359)

<400> 8

ctcgaggata catccaaaga ggttgagtat tctctctaca cttcttgtta aatggaaagt 60

gcatttgctt gttcttacaa tcggcccgag tctcgttcac agcgcctcgt tcacacttaa 120

accacaaata gtctacaggc tatatgggag ccagactgaa actcacatat gactaatatt 180

cgggggtgtt agtcacgtgt agcccattgt gtgcatataa cgatgttgga cgcgtcctta 240

ttcgcggtgt acttgatact atggcagcga gcatgggata ttcatcctcg tcatcgttaa 300

catctctacg ggttcagaat gtttggcatg tcgtcgatcc tttgcccatc gttgcaaatt 360

acaagtccga tcgccatgac cgcgataagc ctgtaccatg tggcattagg gtgacatctc 420

gatcatacat tataagacca acgtgcgagt cttccaaaga cctgcacgcc ttcttcttcg 480

gattgtcaac gggttcttca gaatctatgc ccatatctgg cgttgagacc attgtgcgtt 540

taatgaacaa taaagcggca tgccatggaa aggagggctg cagatctcca ttttctcacg 600

ccactatcct ggacgctgta gacgataatt ataccatgaa tatagagggg gtatgtttcc 660

actgccactg tgatgataag ttttctccag attgttggat atctgcattt tctgctgccg 720

aacaaacttc atcgctatgc aaagagatgc gtgtgtacac gcgccgttga gtatacggga 780

aactaaatgt tcatagaggt ctttgggcta tatgttatta aataaaataa ttgtcgaccc 840

tgcaggtcga cccaattcga gctcggtaca gcttggctgt ggaatgtgtg tcagttaggg 900

tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 960

tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 1020

catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact 1080

ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag 1140

gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc 1200

ctaggctttt gcaaaaagct cccggggcgg ccgccatgga aaagattgtg ctgctgtttg 1260

ctgtgattag cctggtgaag tcagatcaga tttgtatcgg ttaccatgcc aataattcta 1320

ctaaacaggt ggatacaatt atggaaaaga acgtgaccgt gacacacgct caggacatcc 1380

tggagagaac tcataacggg aagctgtgcg atctgaatgg tgtgaaaccc ctgatcctga 1440

aggactgctc tgtggcaggc tggctgctgg gaaaccccat gtgtgatgag ttcatcagag 1500

tgcctgaatg gtcctacatt gtggagaggg ctaaccctgc aaatgatctg tgctacccag 1560

gaaccctgaa cgactatgag gaactgaagc acctgctgag ccgcatcaac catttcgaaa 1620

agacactgat catcccccgg agctcctggc ctaatcacga gactagcctg ggagtgtccg 1680

cagcttgtcc ataccaggga gcatcttcat tctttcgcaa cgtggtgtgg ctgatcaaga 1740

aaaatgatgc ctaccccacc atcaaaatct catacaacaa cacaaaccgg gaagatcttc 1800

tgatcctgtg gggcatccac cattccaaca atgcagccga gcagactaac ctgtacaaaa 1860

atcctgatac ctatgtgtct gtggggactt caaccctgaa ccagcgcctg gtgccaaaga 1920

tcgccactcg gtcacaagtg aatgggcaga gtggtcgcat ggatttcttt tggaccatcc 1980

tgaagccaaa cgacgctatt cacttcgaaa gcaacggcaa ttttatcgcc cccgagtacg 2040

cttataagat tgtgaagaaa ggagacagta ccatcatgaa aagcgagatg gaatacgggc 2100

actgcaacac aaagtgtcag actcctatcg gtgccattaa cagtagcatg ccattccaca 2160

atatccatcc cctgacaatt ggggagtgcc ccaagtatgt gaaatctaac aagctggtgc 2220

tggctactgg tctgagaaac agccccctga gagagacccg gggcctgttt ggagcaattg 2280

ctgggtttat tgagggcgga tggcagggta tggtggatgg gtggtacggt tatcaccatt 2340

ccaacgaaca ggggtctggt tacgctgcag ataaagagtc cacacagaag gctattgacg 2400

gagtgactaa caaagtgaac agcatcattg acaagatgaa tactcagttc gaggcagtgg 2460

ggagagaatt taacaatctg gagagaagga tcgaaaacct gaataagaaa atggaagatg 2520

gcttcctgga cgtgtggacc tacaacgcag agctgctggt gctgatggag aatgaaagga 2580

cactggattt tcacgacagc aacgtgaaaa atctgtatga taaagtgaga ctgcagctga 2640

gggacaacgc taaagaactg ggcaatggat gtttcgagtt ttaccataag tgcgataacg 2700

agtgtatgga aagtgtgaga aatggcacat acgactatcc aaaatatagc gaggaagcaa 2760

tcctgaagag ggaggaaatt agcggcgtga aactggagtc catcggaacc taccagatcc 2820

tgtcaattta tagtacagtg gcctcctctc tggcactggc catcattgtg gctgggctgt 2880

ctctgtggat gtgtagtaac gggagtctgc agtgtaggat ttgtatctga gcggccgcga 2940

tatcaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatcgat 3000

agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc 3060

tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctcttc tagacctgca gggaattcgt 3120

ttaatgttag tttattcaat gcattggttg caaatattca ttacttctcc aatcccaggt 3180

cattctttag cgagatgatg ttatgacatt gctgtgaaaa ttactacagg atatattttt 3240

aagatgcagg agtaacaatg tgcatagtag gcgtagttat cgcagacgtg caacgcttcg 3300

catttgagtt accgaagtgc ccaacagtgc tgcggttatg gtttatgcgc acagaatcca 3360

tgcatgtcct aattgaacca tccgattttt cttttaatcg cgatcgttgt ttgggcaact 3420

gcgttatttc agatctaaaa aatttaccct ttatgaccat cacatctctc tggctcatac 3480

cccgcttgga taagatatca tgtagattcc gccctaagaa atgcaaacta acattattgt 3540

cggttccata tacacttcca tcttgtcctt cgaaaataac aaactcgcgc aatagaccgt 3600

ccgtacatgc atggccgatg tgtgtcaaca tcattggtct gctagatccc gatgggacga 3660

atcgtacagt cgtcgctcca gcattggcaa aaatccccag ataccctcca tgcggcaaat 3720

ctaaattgcg accccgaaga gactgcacca aagtcttatc gacgcacgct gatttttttg 3780

aacagcggga gcccattatc ttcagtggag cgtagacggg cgaggctaat tatgtgacat 3840

agcaacactg catgtatgtt tttataaatc aataagagta cataatttat tacgtatcat 3900

ttccgtttgt aatatactgt atacatcatc cacactatta gtcagcacta gcgcgcgggc 3960

gcacgttaca atagcagcgt gcccgttatc tatattgtcc gatatttaca cataacattt 4020

catcgacatg attaaatacc taagtactgc acacagatgt ttaatgtata tcgtcatata 4080

aattatatcg ctaggacaga cccaaacgac ctttatccca aacagtcaga tcctcttctc 4140

aagtgtcgat ttctgttatg gaatatgcat accctggccc agaaattgca cgcacgagcg 4200

tagtgaatgc gtcattggtt ttacatttaa aggctaaatg cacaaattct ttagacgaca 4260

gcacatcgtt aaatagcatc tctagcgttc ttatgaatgc taagcattgg agtcctcctg 4320

gtcggccaca ataacagctg agtatcatac cctgagctc 4359

<210> 9

<211> 4852

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность донорной плазмиды:

pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn

SbfI

<220>

<221> Фланкирующие плечи

<222> (1)..(1241)

<220>

<221> Промотор HHV3gB

<222> (1271)..(1748)

<220>

<221> Промотор SV40

<222> (1755)..(2122)

<220>

<221> HA H5N2

<222> (2138)..(3832)

<220>

<221> Синтетический Поли-А

<222> (3847)..(4000)

<220>

<221> Фланкирующие плечи

<222> (4021)..(4852)

<400> 9

gagctcaggg tatgatactc agctgttatt gtggccgacc aggaggactc caatgcttag 60

cattcataag aacgctagag atgctattta acgatgtgct gtcgtctaaa gaatttgtgc 120

atttagcctt taaatgtaaa accaatgacg cattcactac gctcgtgcgt gcaatttctg 180

ggccagggta tgcatattcc ataacagaaa tcgacacttg agaagaggat ctgactgttt 240

gggataaagg tcgtttgggt ctgtcctagc gatataattt atatgacgat atacattaaa 300

catctgtgtg cagtacttag gtatttaatc atgtcgatga aatgttatgt gtaaatatcg 360

gacaatatag ataacgggca cgctgctatt gtaacgtgcg cccgcgcgct agtgctgact 420

aatagtgtgg atgatgtata cagtatatta caaacggaaa tgatacgtaa taaattatgt 480

actcttattg atttataaaa acatacatgc agtgttgcta tgtcacataa ttagcctcgc 540

ccgtctacgc tccactgaag ataatgggct cccgctgttc aaaaaaatca gcgtgcgtcg 600

ataagacttt ggtgcagtct cttcggggtc gcaatttaga tttgccgcat ggagggtatc 660

tggggatttt tgccaatgct ggagcgacga ctgtacgatt cgtcccatcg ggatctagca 720

gaccaatgat gttgacacac atcggccatg catgtacgga cggtctattg cgcgagtttg 780

ttattttcga aggacaagat ggaagtgtat atggaaccga caataatgtt agtttgcatt 840

tcttagggcg gaatctacat gatatcttat ccaagcgggg tatgagccag agagatgtga 900

tggtcataaa gggtaaattt tttagatctg aaataacgca gttgcccaaa caacgatcgc 960

gattaaaaga aaaatcggat ggttcaatta ggacatgcat ggattctgtg cgcataaacc 1020

ataaccgcag cactgttggg cacttcggta actcaaatgc gaagcgttgc acgtctgcga 1080

taactacgcc tactatgcac attgttactc ctgcatctta aaaatatatc ctgtagtaat 1140

tttcacagca atgtcataac atcatctcgc taaagaatga cctgggattg gagaagtaat 1200

gaatatttgc aaccaatgca ttgaataaac taacattaaa cgaattccct gcaggtcgag 1260

gccgcccggg ttatatcttc tgattgtgtg ggctctactt gtaaactctc aaaaaacgag 1320

cttggagaga ccgacacaac cgccgtaaca aacaaagaaa atatgcataa aaagcataac 1380

cacacccccg taacggatgt tatgaaaacg ccgggtccgt tgaatccgga gccagccgct 1440

gcattagggt gtatagaaga gaaaaaacgt ctgaatcgta gattacgacg gtattctggt 1500

cgatccctgt ttctccactt tgaataatag ccacaagggg acatgtttct tcgtacgtta 1560

aataaatgcc gtctaagggt ccgtgggaac tgcctatacc tttaggttga gacgtgcacc 1620

cgcgtggatc cttacctaga cggtcaacgc gacataaccg cacctcccca caatggaaaa 1680

cagaggtgaa tagtgtggtt gcaaacacaa gctccctaat atatttccag gcaagtctct 1740

gaattccctc gacccaattc gagctcggta cagcttggct gtggaatgtg tgtcagttag 1800

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 1860

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 1920

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 1980

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 2040

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 2100

gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccggggc ggccgccatg gaaaagattg tgctgctgtt 2160

tgctgtgatt agcctggtga agtcagatca gatttgtatc ggttaccatg ccaataattc 2220

tactaaacag gtggatacaa ttatggaaaa gaacgtgacc gtgacacacg ctcaggacat 2280

cctggagaga actcataacg ggaagctgtg cgatctgaat ggtgtgaaac ccctgatcct 2340

gaaggactgc tctgtggcag gctggctgct gggaaacccc atgtgtgatg agttcatcag 2400

agtgcctgaa tggtcctaca ttgtggagag ggctaaccct gcaaatgatc tgtgctaccc 2460

aggaaccctg aacgactatg aggaactgaa gcacctgctg agccgcatca accatttcga 2520

aaagacactg atcatccccc ggagctcctg gcctaatcac gagactagcc tgggagtgtc 2580

cgcagcttgt ccataccagg gagcatcttc attctttcgc aacgtggtgt ggctgatcaa 2640

gaaaaatgat gcctacccca ccatcaaaat ctcatacaac aacacaaacc gggaagatct 2700

tctgatcctg tggggcatcc accattccaa caatgcagcc gagcagacta acctgtacaa 2760

aaatcctgat acctatgtgt ctgtggggac ttcaaccctg aaccagcgcc tggtgccaaa 2820

gatcgccact cggtcacaag tgaatgggca gagtggtcgc atggatttct tttggaccat 2880

cctgaagcca aacgacgcta ttcacttcga aagcaacggc aattttatcg cccccgagta 2940

cgcttataag attgtgaaga aaggagacag taccatcatg aaaagcgaga tggaatacgg 3000

gcactgcaac acaaagtgtc agactcctat cggtgccatt aacagtagca tgccattcca 3060

caatatccat cccctgacaa ttggggagtg ccccaagtat gtgaaatcta acaagctggt 3120

gctggctact ggtctgagaa acagccccct gagagagacc cggggcctgt ttggagcaat 3180

tgctgggttt attgagggcg gatggcaggg tatggtggat gggtggtacg gttatcacca 3240

ttccaacgaa caggggtctg gttacgctgc agataaagag tccacacaga aggctattga 3300

cggagtgact aacaaagtga acagcatcat tgacaagatg aatactcagt tcgaggcagt 3360

ggggagagaa tttaacaatc tggagagaag gatcgaaaac ctgaataaga aaatggaaga 3420

tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc agagctgctg gtgctgatgg agaatgaaag 3480

gacactggat tttcacgaca gcaacgtgaa aaatctgtat gataaagtga gactgcagct 3540

gagggacaac gctaaagaac tgggcaatgg atgtttcgag ttttaccata agtgcgataa 3600

cgagtgtatg gaaagtgtga gaaatggcac atacgactat ccaaaatata gcgaggaagc 3660

aatcctgaag agggaggaaa ttagcggcgt gaaactggag tccatcggaa cctaccagat 3720

cctgtcaatt tatagtacag tggcctcctc tctggcactg gccatcattg tggctgggct 3780

gtctctgtgg atgtgtagta acgggagtct gcagtgtagg atttgtatct gagcggccgc 3840

gatatcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg 3900

atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag 3960

gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct tctagacctg cagggtcgac 4020

aattatttta tttaataaca tatagcccaa agacctctat gaacatttag tttcccgtat 4080

actcaacggc gcgtgtacac acgcatctct ttgcatagcg atgaagtttg ttcggcagca 4140

gaaaatgcag atatccaaca atctggagaa aacttatcat cacagtggca gtggaaacat 4200

accccctcta tattcatggt ataattatcg tctacagcgt ccaggatagt ggcgtgagaa 4260

aatggagatc tgcagccctc ctttccatgg catgccgctt tattgttcat taaacgcaca 4320

atggtctcaa cgccagatat gggcatagat tctgaagaac ccgctgacaa tccgaagaag 4380

aaggcgtgca ggtctttgga agactcgcac gttggtctta taatgtatga tcgagatgtc 4440

accctaatgc cacatggtac aggcttatcg cggtcatggc gatcggactt gtaatttgca 4500

acgatgggca aaggatcgac gacatgccaa acattctgaa cccgtagaga tgttaacgat 4560

gacgaggatg aatatcccat gctcgctgcc atagtatcaa gtacaccgcg aataaggacg 4620

cgtccaacat cgttatatgc acacaatggg ctacacgtga ctaacacccc cgaatattag 4680

tcatatgtga gtttcagtct ggctcccata tagcctgtag actatttgtg gtttaagtgt 4740

gaacgaggcg ctgtgaacga gactcgggcc gattgtaaga acaagcaaat gcactttcca 4800

tttaacaaga agtgtagaga gaatactcaa cctctttgga tgtatcctcg ag 4852

<210> 10

<211> 4359

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность донорной плазмиды:

pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI

<220>

<221> Фланкирующие плечи

<222> (1)..(832)

<220>

<221> Промотор SV40

<222> (853)..(1220)

<220>

<221> Mut-HA H5N2

<222> (1236)..(2930)

<220>

<221> Синтетический Поли-А

<222> (2945)..(3098)

<220>

<221> Фланкирующие плечи

<222> (3119)..(4359)

<400> 10