Состав, содержащий агонист tlr, и способы применения

Авторы патента:

ФОКС Кристофер Б. (US)

C07K14/70596 - Пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные

C07K14/705 - рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61P33/04 - противоамебные средства

A61P31/12 - противовирусные средства

A61P31/06 - для лечения туберкулеза

A61K45/06 - Лекарственные препараты, содержащие активные ингредиенты, не отнесенные к группам A61K 31/00- A61K 41/00

A61K39/39 - отличающиеся иммуностимулирующими добавками, например усиливающими действие препарата

A61K39/12 - вирусные антигены

A61K39/04 - Mycobacterium, например Mycobacterium туберкулеза

A61K39/02 - бактериальные антигены

A61K39/00 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K35/76 - вирусы

A61K35/74 - бактерии

A61K33/06 - алюминий, кальций или магний; их соединения

Владельцы патента RU 2761870:

ИНФЕКШЕС ДИЗИС РИСЁРЧ ИНСТИТЬЮТ (US)

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая композицию для усиления адсорбции агониста TLR на солях алюминия, способ стимулирования иммунного ответа у субъекта и способ получения композиции для стимулирования иммунного ответа у субъекта, содержащей агонист TLR, выбранный из агониста TLR7/8 или агониста TLR4, и вспомогательный липид. В одном из вариантов реализации изобретения композиция содержит в себе агонист TLR, выбранный из агониста TLR7/8 или TLR4, вспомогательный липид и соль алюминия. Изобретение расширяет арсенал средств для стимулирования иммунного ответа у субъекта при усиленной адсорбции агониста TLR на солях алюминия. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 28 ил., 4 табл., 2 пр.

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/337322, поданной 16 мая 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[0002] Настоящее изобретение сделано при государственной поддержке по контракту № HHSO100201000039С, присужденному Управлением перспективных биомедицинских исследований и разработок (BARDA) в Канцелярии помощника министра по вопросам готовности и реагирования (ASPR) в Министерстве здравоохранения и социальных служб США. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

[0003] Все документы, цитируемые в настоящем документе, включая заявки на патент и публикации патентов, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки так как если бы каждый отдельный документ был конкретно и отдельно указан как включенный посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0004] Настоящее изобретение относится к области фармацевтических и вакцинных составов. Более конкретно, варианты реализации, описанные в настоящем документе, относятся к стабильным водным составам адъювантов, содержащим агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид, которые необязательно могут быть адсорбированы на солях алюминия.

Описание предшествующего уровня техники

[0005] После новаторской работы Гленни (Glenny) начала 20-го века (1) соли алюминия стали наиболее широко применяемыми в вакцинах для людей адъювантами, создавая непревзойденную историю безопасности и совместимости с различными вакцинными антигенами. Соли алюминия обычно содержат полукристаллические нано- и микрочастицы с большой площадью поверхности и высокой плотностью заряда. Они могут быть наиболее эффективными в качестве адъювантов, когда вакцинные антигены оптимально адсорбированы на поверхности частиц соли алюминия (2). Соли алюминия эффективны в усилении антительных ответов против вакцинных антигенов, но свидетельств того, что они существенно увеличивают клеточный иммунитет к вакцинным антигенам, мало. Вероятно, для разработки эффективных вакцин против различных заболеваний, включая туберкулез, ВИЧ и малярию, необходима индукция эффективного клеточного иммунитета. Таким образом, адсорбция дополнительных иммуностимуляторов на солях алюминия также должна иметь первостепенное значение при разработке вакцинных составов. Соответственно, в 2009 г. имел место прогресс в клиническом применении адъювантов, когда FDA США одобрило вакцину против вируса папилломы человека GlaxoSmithKline Cervarix® для применения на людях в 2009; Cervarix® содержит AS04, адъювантную систему, состоящую из лиганда Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) монофосфориллипида A (MPL®), адсорбированную на оксигидроксиде алюминия (3). Помимо агонистов TLR4 в доклинических и клинических исследованиях другие лиганды паттерн-распознающих рецепторов (PRR) могут преимущественно быть адсорбированы на солях алюминия (4). Некоторые лиганды PRR, такие как лиганд TLR4 MPL®, адсорбируются на некоторые соли алюминия благодаря совместимости физико-химической структуры. Таким образом, оксигидроксид алюминия адсорбирует такие молекулы за счет лигандного обмена с участием фосфатных групп и/или электростатических взаимодействий (2). Тем не менее, другие представляющие интерес лиганды PRR, такие как агонисты TLR7/8 имидазохинолины, не содержат структурных фрагментов, которые могут способствовать адсорбции на оксигидроксиде алюминия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В настоящем изобретении предложен водный состав TLR, содержащий: (а) агонист TLR; и (b) вспомогательный липид. В некоторых вариантах реализации агонист TLR включает агонист TLR2, агонист TLR3, агонист TLR4, агонист TLR5, агонист TLR6, агонист TLR7, агонист TLR8, агонист TLR7/8 или агонист TLR9. В некоторых вариантах реализации водный состав дополнительно содержит соль алюминия.

[0007] В настоящем изобретении предложен водный состав TLR7/8, содержащий: (а) агонист TLR7/8; и (b) вспомогательный липид. В некоторых вариантах реализации водный состав представляет собой стабильную наносуспензию, имеющую размер частиц 400 нм или менее.

[0008] В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) агонист TLR7/8; (b) вспомогательный липид; и (с) соль алюминия. В некоторых вариантах реализации агонист TLR7/8 адсорбирован на соли алюминия. В некоторых вариантах реализации агонист TLR7/8 адсорбирован на соли алюминия при 25 процентах соли алюминия. В некоторых вариантах реализации соль алюминия выбрана из группы, состоящей из гидроксида алюминия, тригидрата алюминия, оксигидроксида алюминия, фосфата алюминия, гидроксифосфата алюминия, гидроксифосфата-сульфата алюминия и сульфата алюминия-калия. В некоторых вариантах реализации соль алюминия включает Alhydrogel®. В некоторых вариантах реализации соль алюминия включает AdjuPhos®. В некоторых вариантах реализации агонист TLR7/8 включает 3М-052. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой фосфолипид или липид соли четвертичного аммония. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид содержит С_10-20 алкильную цепь. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DOPC, DSPG, DSTAP и полисорбата 80. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DSPG и DSTAP. В некоторых вариантах реализации композиция содержит 3М-052, Alhydrogel® и DSPG. В некоторых вариантах реализации композиция содержит 3М-052, AdjuPhos® и DSTAP. В некоторых вариантах реализации композиция дополнительно содержит антиген. В некоторых вариантах реализации антиген выбран из антигена, связанного с туберкулезом, антигена, связанного с гриппом, антигена, связанного с гемагглютинином, антигена, связанного с раком, антигена, связанного с вирусом, и антигена, связанного с амебиазом. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с туберкулезом, выбран из группы, состоящей из ID93, ID91 и БЦЖ. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с гриппом, выбран из группы, состоящей из H5N1, гриппа А, гриппа В и гриппа С. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с амебиазом, представляет собой LecA. В некоторых вариантах реализации вирусный антиген выбран из группы, состоящей из гепатита В и гепатита С. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно одного года. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере шести месяцев. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере одного года.

[0009] В настоящем изобретении предложен водный состав TLR4, содержаний: (а) агонист TLR4; и (b) вспомогательный липид, который представляет собой DPTAP. В некоторых вариантах реализации водный состав представляет собой стабильную наносуспензию, имеющую размер частиц 400 нм или менее.

[0010] В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) агонист TLR4; (b) вспомогательный липид, который представляет собой DPTAP; и (с) соль алюминия, которая представляет собой AdjuPhos®. В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 адсорбирован на соли алюминия. В некоторых вариантах реализации агонист TLR7/8 адсорбирован на соли алюминия при 25 процентах соли алюминия. В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 адсорбирован на фосфате алюминия. В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 включает 3D-монофосфориллипид A (MPL). В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 включает GLA. В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 включает синтетический GLA (галактозил-липидный адъювант) формулы (IV):

или его фармацевтически приемлемую соль, где

L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ и L₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой -О-, -NH- или -(СН₂)-;

L₇, L₈, L₉ и L₁₀ являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или представляют собой -С(=O)-;

Y₁ представляет собой кислотную функциональную группу;

Y₂ и Y₃ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой -ОН, -SH или кислотную функциональную группу;

Y₄ представляет собой -ОН или -SH;

R₁, R₃, R₅ и R₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой C_8-13 алкил; и

R₂ и R₄ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой С_6-11 алкил.

[0011] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 включает синтетический GLA формулы (V):

или его фармацевтически приемлемую соль, где

R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С_11-20 алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₁₂-С₂₀ алкил.

[0012] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 включает синтетический GLA формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль.

[0013] В некоторых вариантах реализации композиция дополнительно содержит антиген. В некоторых вариантах реализации антиген выбран из антигена, связанного с туберкулезом, антигена, связанного с гриппом, антигена, связанного с гемагглютинином, антигена, связанного с раком, антигена, связанного с вирусом, и антигена, связанного с амебиазом. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с туберкулезом, выбран из группы, состоящей из ID93, ID91 и БЦЖ. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с гриппом, выбран из группы, состоящей из H5N1, гриппа А, гриппа В и гриппа С. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с амебиазом, представляет собой LecA. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с вирусом, выбран из группы, состоящей из гепатита В и гепатита С. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно одного года. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере шести месяцев. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере одного года.

[0014] В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая состав или композицию, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой вакцину. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция дополнительно содержит антиген. В некоторых вариантах реализации антиген выбран из антигена, связанного с туберкулезом, антигена, связанного с гриппом, антигена, связанного с гемагглютинином, антигена, связанного с раком, антигена, связанного с вирусом, и антигена, связанного с амебиазом. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с туберкулезом, выбран из группы, состоящей из ID93, ID91 и БЦЖ. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с гриппом, выбран из группы, состоящей из H5N1, гриппа А, гриппа В и гриппа С. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с амебиазом, представляет собой LecA. В некоторых вариантах реализации антиген, связанный с вирусом, выбран из группы, состоящей из гепатита В и гепатита С. В некоторых вариантах реализации композиция фармацевтической композиции является стабильной. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно одного года. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере шести месяцев. В некоторых вариантах реализации композиция является стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере одного года.

[0015] В настоящем изобретении предложен способ стимулирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение состава или композиции, описанных в настоящем документе, субъекту и стимулирование таким образом иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой неспецифический иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой антиген-специфический иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ включает активацию В-клеток, активацию Т-клеток, продуцирование антител или выделение цитокинов. В некоторых вариантах реализации композицию применяют для монотерапии. В некоторых вариантах реализации композицию применяют для лечения аллергии, зависимости, рака или аутоиммунной реакции. В некоторых вариантах реализации композицию применяют в качестве вакцины. В некоторых вариантах реализации путь введения композиции является пероральным, внутривенным, внутрикожным, чрескожным, назальным, подкожным или анальным. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой млекопитающее, отличное от человека. В некоторых вариантах реализации млекопитающее, отличное от человека, представляет собой собаку, корову или лошадь.

[0016] В настоящем изобретении предложен способ получения водного состава, содержащего агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид, где композиция, содержащая агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид, содержит частицы, имеющие размер в диапазоне от 1 нм до примерно 450 нм; где способ включает (а) смешивание агониста TLR7/8 или агониста TLR4 и вспомогательного липида в растворителе с получением раствора; (b) удаление растворителя из раствора со стадии (а) с получением пленочной композиции; и (с) регидратирование пленочной композиции со стадии (с) с получением регидратированной композиции; и (d) воздействие на регидратированную композицию мощным источником энергии с получением наносуспензионной композиции. В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии представляет собой микрофлюидизатор, экструдер, ультразвуковой диспергатор, смеситель Silverson или гомогенизатор. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает смешивание антигена с наносуспензионной композицией. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает смешивание соли алюминия с наносуспензионной композицией. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает смешивание соли алюминия и антигена с наносуспензионной композицией.

[0017] Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут понятны при обращении к приведенному ниже подробному описанию и прилагаемым чертежам. Кроме того, в настоящем документе представлены различные ссылки, которые более подробно описывают некоторые аспекты настоящего изобретения и поэтому включены во всей полноте посредством ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] На ФИГ. 1 представлены структуры 3М-052 и различных фосфолипидов.

[0019] На ФИГ. 2A-2D представлены физические свойства водных суспензий 3М-052 и адсорбция на солях алюминия. На ФИГ. 2А представлены размеры частиц и коэффициенты полидисперсности водных суспензий 3М-052 во время получения (показаны в виде среднего значения +/- СКО трех измерений одного и того же образца). На ФИГ. 2В представлена стабильность размеров частиц в течение 2 недель для выбранных суспензий 3М-052 (показана в виде среднего значения +/- СКО трех измерений одного и того же образца). На ФИГ. 2С представлен дзета-потенциал выбранных суспензий 3М-052 (показан в виде среднего значения +/- СКО девяти измерений дзета-потенциала одного и того же образца). На ФИГ. 2D представлена адсорбция водных суспензий 3М-052 на Alhydrogel® или AdjuPhos®, которую оценивали путем мониторинга концентрации 3М-052 в центрифугированной надосадочной жидкости образцов, содержащих соль алюминия, по сравнению с образцами, не содержащими соль алюминия. Образцы центрифугировали в течение 2 мин при 2000 х g. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение для двух отдельных экспериментов с применением отдельных партий 3М-052, где каждый из образцов в каждом из экспериментов выполняли в двух экземплярах.

[0020] На ФИГ. 3А-3В представлены характеристики размера частиц 3M-052-AF индивидуально или в присутствии оксигидроксида алюминия. На ФИГ. 3А представлено распределение по размерам, определенное путем рассеяния света, на основе интенсивности. На ФИГ. 3В представлено распределение по размерам, определенное путем рассеяния света, на основе объема.

[0021] На ФИГ. 4 представлена изотерма адсорбции 3M-052-AF на Alhydrogel®, измеренной путем УФ-поглощения надосадочной жидкости. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение для двух отдельных экспериментов с применением отдельных партий 3М-052, где каждый из образцов в каждом из экспериментов выполняли в двух экземплярах.

[0022] На ФИГ. 5А-5В показано, что квасцы и 3М052 индуцируют синергическую антиген-специфическую иммуногенность. Мышей C57BL/6 иммунизировали три раза с интервалом три недели путем внутримышечной инъекции ID93 (0,5 мкг), индивидуального или адъювированного 3M-052-AF (0,5 мкг), Alhydrogel® или 3M-052-AF (0,5 мкг), связанным с Alhydrogel®. На ФИГ. 5А через три недели после первой иммунизации конечные точки титрования ID93-специфического IgG1, IgG2c и общего IgG (IgGT) сыворотки определяли путем ELISA. N = 4-5 мышей/группа. На ФИГ. 5В через четыре недели после последней иммунизации спленоциты повторно стимулировали средой или ID93 в присутствии брефельдина А в течение восьми часов, а частоту продуцирования цитокинов CD4 Т-клетками определяли путем вычитания ответа среды из ID93-специфического ответа. Данные представляют собой два эксперимента с аналогичными результатами с 4-5 животными на группу. Представлено среднее значение +/- СКО. *р<0,05 для ID93, #р<0,05 для ID93+3M-052-AF, для ID93+3М-052-квасцы.

[0023] На ФИГ. 6A-6D представлено титрование дозы 3М-052. Мышей C57BL/6 иммунизировали два раза с интервалом три недели путем внутримышечной инъекции ID93 (0,5 мкг), индивидуального или адъювированного 3M-052-AF (0,1, 0,5, 1 или 10 мкг), Alhydrogel® или 3M-052-AF (0,1, 0,5, 1 или 10 мкг), связанным с Alhydrogel®. На ФИГ. 6А и 6В через три недели после первой иммунизации конечные точки титрования ID93-специфического IgG1, IgG2c и общего IgG сыворотки определяли путем ELISA. N = 5 мышей/группа. На ФИГ. 6С и 6D через одну неделю после последней иммунизации спленоциты повторно стимулировали средой или ID93 в присутствии брефельдина А в течение восьми часов, а частоту продуцирования цитокинов CD4 Т-клетками определяли путем вычитания ответа среды из ID93-специфического ответа. Данные представляют собой два эксперимента с аналогичными результатами с 5 животными на группу. Представлено среднее значение +/- СКО.

[0024] На ФИГ. 7А-7В показано, что TLR7 применяли для индуцированной ТН1 адъювантной активности 3М-052. Мышей C57BL/6 дикого типа или B6.129S1-TLR7^tmlFlv (TLR7^-/-) иммунизировали два раза в интервалом три недели путем внутримышечной инъекции ID93 (0,5 мкг), адъювированного Alhydrogel®, 3M-052-AF (1 мкг), связанным с Alhydrogel®, или GLA-AF (5 мкг), связанным с Alhydrogel®. На ФИГ. 7А конечные точки титрования ID93-специфического IgG1 и IgG2c сыворотки определяли через три недели после первой иммунизации. На ФИГ. 7В показаны ID93-специфические CD4 Т-клетки, которые определяли количественно после ex-vivo стимуляции спленоцитов при помощи ID93 через одну неделю после второй иммунизации. N = 5 мышей/группа. Данные представляют собой два эксперимента с аналогичными результатами с 5 животными на группу. Столбцы представляют среднее значение +/- СКО. *р<0,05.

[0025] На ФИГ. 8A-8D показано, что ВИЧ gp120 антиген в комбинации с 3М-052-Alhydrogel индуцирует усиленные антительные и клеточные ответы TH1-типа по сравнению с ВИЧ gp120 антигеном в комбинации с 3М-052-AdjuPhos, индивидуальным 3М-052 или любым типом индивидуальных квасцов. Мышей C57BL/6 иммунизировали три раза с интервалом три недели путем внутримышечной инъекции ВИЧ gp120 антигена (10 мкг), индивидуального или адъювированного 3M-052-AF (1 мкг), Alhydrogel®, AdjuPhos®, 3М-052-Alhydrogel® или 3М-052-AdjuPhos®. На ФИГ. 8А представлен протокол эксперимента. На ФИГ. 8В представлены результаты определения конечных точек титрования ВИЧ gp120 антиген-специфического IgG1, IgG2c и общего IgG (IgG) сыворотки через три недели после первой иммунизации, которые определяли путем ELISA. N = 5 мышей/группа, столбцы представляют среднее значение +/- СКО. На ФИГ. 8С через одну неделю после второй иммунизации спленоциты повторно стимулировали ВИЧ gp120 антигеном и частоту продуцирования цитокинов CD4 Т-клетками определяли путем проточной цитометрии. N = 5 мышей/группа, столбцы представляют среднее значение +/- СКО. На ФИГ. 8D через три недели после второй и третьей иммунизации клетки костного мозга, секретирующие ВИЧ gp120 антиген-специфические антитела, измеряли путем ELISPOT. N = 5 мышей/группа, столбцы представляют среднее значение +/- СКО. *р<0,05 для ВИЧ gp120 антиген, #р<0,05 для 3M-052-AF, для соответствующих квасцов (Alhydrogel® или AdjuPhos®), для 3М-052-AdjuPhos®.

[0026] На ФИГ. 9A-9D показано, что 3М-052 и квасцы синергически усиливают врожденные ответы после иммунизации. Мышей C57BL/6 дикого типа иммунизировали внутримышечно с применением 3M-052-AF (1 мкг), Alhydrogel®, AdjuPhos®, 3М-052-Alhydrogel® или 3М-052-AdjuPhos®. Через восемнадцать часов дренирующие паховые лимфатические узлы извлекали и анализировали на (ФИГ. 9А) миграцию CD11b+ Ly6C+ воспалительных моноцитов, (ФИГ. 9В) экспрессию костимулирующей молекулы CD86 на В-клетках, воспалительных моноцитах или DC, (ФИГ. 9С) экспрессию CD69 на лимфоцитах и (ФИГ. 9D) экспрессию IFN-γ или IL-1b NK-клетками и нейтрофилами, соответственно. N = 5 мышей/группа. Данные представляют собой два эксперимента с аналогичными результатами с 5 животными на группу. Столбцы представляют среднее значение +/- СКО. *р<0,05 при отсутствии, #р<0,05 для 3M-052-AF, для соответствующих квасцов (Alhydrogel® или AdjuPhos®), для 3М-052-AdjuPhos®.

[0027] На ФИГ. 10 представлены размер частиц наносуспензии 3M-052-DSPG и коэффициент полидисперсности в течение 6 месяцев (n=6 партий, представлено среднее значение +/- СКО).

[0028] На ФИГ. 11А-11С показано, что ВИЧ gp120 антиген в комбинации с 3М-052-Alhydrogel индуцирует усиленные вагинальные и клеточные ответы TH1-типа. Мышей C57BL/6 иммунизировали три раза с интервалом три недели путем внутримышечной инъекции ВИЧ gp120 антигена (10 мкг), индивидуального или адъювированного 3M-052-AF (1 мкг), Alhydrogel®, AdjuPhos®, 3М-052-Alhydrogel® или 3М-052-AdjuPhos®. На ФИГ. 11А представлен протокол эксперимента. На ФИГ. 11В через три недели после третьей иммунизации конечные точки титрования ВИЧ gp120 антиген-специфического IgG1, IgG2c и общего IgG жидкости вагинального смыва определяли путем ELISA. N = 9-10 мышей/группа, столбцы представляют среднее значение +/- СКО. На ФИГ. 11С через одну неделю после каждой иммунизации спленоциты повторно стимулировали ВИЧ gp120 антигеном и частоту продуцирования цитокинов CD4 Т-клетками определяли путем проточной цитометрии. N = 5 мышей/группа, столбцы представляют среднее значение +/- СКО. *р<0,05 для ВИЧ gp120 антиген, #р<0,05 для 3M-052-AF, для соответствующих квасцов (Alhydrogel® или AdjuPhos®), для 3М-052-AdjuPhos®.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0029] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид, где композиция подходит для связывания с солью алюминия в водном растворе. В настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид. В настоящем изобретении также предложена стабильная водная композиция адъюванта, содержащая агонист TLR7/8 или агонист TLR4 с вспомогательным липидом, которая адсорбирована на соли алюминия.

[0030] Абсорбция лигандов TLR на солях алюминия может приводить к более локализованной доставке и способствовать улучшенной адъювантной активности. Тем не менее, структура некоторых агонистов TLR может не подходить для эффективной адсорбции на квасцах. Настоящее изобретение относится к композиции на основе липидов, содержащей агонист TLR, который способствует адсорбции на соли алюминия посредством вспомогательного липида.

[0031] В настоящем изобретении предложено улучшение физико-химической структурной совместимости агонистов TLR с квасцами и/или антигенами посредством объединения агониста TLR с вспомогательным липидом с получением стабильного водного состава. Получение стабильного водного состава или наносуспензии облегчается за счет приложения энергии (например, путем обработки ультразвуком или микрофлюидизации), в результате которого размеры частиц агониста TLR и вспомогательного липида могут быть снижены до примерно 450 нм или менее. Водный состав или наносуспензия является стабильной при примерно 2-8°С в течение по меньшей мере примерно 1 недели, 2 недель, 4 недель, 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев или 1 года. Водный состав или наносуспензия представляет собой композицию агониста TLR и вспомогательного липида, где композиция представляет собой дисперсию агониста TLR и вспомогательного липида, которая является стабильной в течение заранее определенного периода времени, как описано в настоящем документе.

[0032] Также предложены композиции (такие как вакцинные композиции, фармацевтические композиции), содержащие водный состав, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации композиция подходит для стимулирования иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах реализации композиция, описанная в настоящем документе, дополнительно содержит один или более антигенов.

[0033] В настоящем описании термины "примерно" и "состоящий по существу из" обозначает ±20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Следует понимать, что термины в форме единственного числа, применяемые в настоящем документе, относится к "одному или более" перечисляемым компонентам. Использование альтернативных вариантов (например, "или") следует понимать, как один, оба или любую комбинацию указанных альтернативных вариантов. Применяемые в настоящем документе термины "включает", "имеет" и "содержит" используют синонимично, при этом термины и их вариации являются неограничивающими.

[0034] Следующие термины имеют следующие значения, если не указано иное. Любые не определенные термины имеют свои общепризнанные значения.

[0035] "Алкил" обозначает линейный или разветвленный, нециклический или циклический, ненасыщенный или насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 20 атомов углерода и в некоторых предпочтительных вариантах реализации содержащий от 11 до 20 атомов углерода. Типичные насыщенные линейные алкилы включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п., включая ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил, пентадецил, гексадецил, гептадецил, октадецил и т.д.; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; тогда как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил, циклогексенил и т.п. Циклические алкилы также называют в настоящем документе "гомоциклами" или "гомоциклическими кольцами". Ненасыщенные алкилы содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь между смежными атомами углерода (обозначаются как "алкенил" или "алкинил" соответственно). Типичные линейные и разветвленные алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил- 1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и т.п.; тогда как типичные линейные и разветвленные алкинилы включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и т.п.

[0036] Термин "галоген-" или "галоген" относится к фтор-, хлор-, бром- и иод-.

[0037] Термин "гидрокси" или "гидроксил" относится к группе -ОН.

[0038] Термин "алкокси" относится к группе -О-алкил, где алкил является таким, как определено в настоящем документе. Алкокси включает, например, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, трет-бутокси, втор-бутокси, н-пентокси и т.п..

[0039] Термин "ациламино" относится к группам -NR²⁰C(O)R²¹, где R²⁰ и R²¹ независимо выбраны из водорода, алкила и арила.

[0040] Термин "кислотная функциональная группа" обозначает функциональную группу, способную выступать донором протона в водной среде (т.е. кислоту Бренстеда-Лоури). После отдачи протона кислотная функциональная группа становится отрицательно заряженным фрагментом (т.е. основанием, сопряженным с кислотной функциональной группой). Примеры кислотных функциональных групп включают, но не ограничиваются ими: -ОР(=O)(ОН)₂ (фосфат), -OS(=O)(OH)₂ (сульфат), -OS(OH)₂ (сульфит), -С(=O)ОН (карбоксилат), -OC(=O)CH(NH₂)CH₂C(=O)OH (аспартат), -ОС(=O)СН₂СН₂С(=O)ОН (сукцинат) и -ОС(=O)СН₂ОР(=O)(ОН)₂ (карбоксиметилфосфат).

Композиции

[0041] В настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий агонист TLR и вспомогательный липид. В некоторых вариантах реализации водный состав или наносуспензию, содержащую агонист TLR и вспомогательный липид, смешивают с солью алюминия. В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или более агентов или антигенов.

[0042] В настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и (2) вспомогательный липид. В некоторых вариантах реализации композицию, содержащую агонист TLR7/8 и вспомогательный липид, подвергают воздействию мощного источника энергии с получением водного состава или наносуспензионной композиции. В некоторых вариантах реализации композицию, содержащую агонист TLR4 и вспомогательный липид, подвергают воздействию мощного источника энергии с получением водного состава или наносуспензионной композиции. В некоторых вариантах реализации водный состав или наносуспензионная композиция содержит частицы, имеющие размер в диапазоне от примерно 1 нм до 450 нм, например, менее примерно 400 нм или менее примерно 200 нм.

[0043] В некоторых вариантах реализации водный состав или наносуспензию, содержащую агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид, смешивают с солью алюминия.

В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (1) агонист TLR7/8; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия. В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (1) агонист TLR4; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия.

[0044] В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или более агентов или антигенов. В настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и (2) вспомогательный липид, дополнительно содержащий один или более агентов или антигенов. В настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR7/8 или агонист TLR4; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия, дополнительно содержащая один или более агентов или антигенов. В настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR7/8; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия, дополнительно содержащая один или более агентов или антигенов. В настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR4; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия, дополнительно содержащая один или более агентов или антигенов.

[0045] Описание компонентов водной композиции представлено ниже.

Агонисты TLR

[0046] В некоторых вариантах реализации агонисты TLR, описанные в настоящем документе, являются гидрофобными или относительно гидрофобными и при отсутствии вспомогательного липида по существу не образуют стабильные водные наносуспензии согласно настоящему изобретению при смешивании с водой в присутствии или при отсутствии воздействия мощного источника энергии. В некоторых вариантах реализации агонисты TLR согласно настоящему изобретению содержат неполярные фрагменты, такие как углеводородные цепи. В некоторых вариантах реализации агонисты TLR согласно настоящему изобретению являются растворимыми в органических растворителях, но слабо растворимыми или нерастворимыми в воде и склонные образовывать большие агрегаты в водных растворах при отсутствии вспомогательных липидов согласно настоящему изобретению. Физико-химические свойства агонистов TLR описаны в Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations by Mary Luckey, Cambridge University Press, New York, 2014, содержание которого включено в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки.

[0047] Применяемый в настоящей заявке термин "нерастворимое в воде" относится к соединению, которое не растворяется при смешивании соединения с водой, например, при смешивании с водой при комнатной температуре, например, между или примерно между 25°С и 50°С. Применяемый в настоящей заявке термин "низкая растворимость в воде" относится к соединению, которое имеет растворимость в воде менее или примерно 30 мг/мл, например, при смешивании с водой при комнатной температуре, например, между или примерно между 25°С и 50°С. Применяемый в настоящей заявке термин "слабо растворимые в воде" можно применять для обозначения соединений, например, неполярных соединений, которые являются нерастворимыми в воде или имеют низкую растворимость в воде.

Агонисты TLR7/8

[0048] В настоящем документе предложены агонисты TLR7/8, которые можно применять в композициях, описанных в настоящем документе. Применяемый в настоящей заявке термин "агонист TLR7/8" относится к агонисту, который влияет на биологическую активностью путем взаимодействия с TLR7, TLR8 или обоими. Такие биологические активности включают, но не ограничиваются ими, индукцию TLR7- и/или TLR8-опосредованной передачи сигналов для усиления иммунных ответов посредством врожденной иммунной системы. В некоторых вариантах реализации TLR представляет собой имидазохинолинаминное производное (см., например, патент США №4689338 (Герстер (Gerster))), но также известны другие классы соединений (см., например, патент США №5446153 (Линдстрем (Lindstrom) et al.); патент США №6194425 (Герстер (Gerster) et al.); и патент США №6110929 (Герстер (Gerster) et al); и международную публикацию № WO2005/079195 (Хэйс (Hays) et al.)).

[0049] В некоторых вариантах реализации агонист TLR7/8 представляет собой соединение, имеющее следующую структуру формулы (I):

или его фармацевтически приемлемую соль, где

R¹⁰ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-6 алкила; и

R^11b представляет собой C_1-6 алкил, необязательно замещенный одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, C_1-6 алкокси и ациламино.

[0050] В некоторых вариантах реализации формулы (I) R¹⁰ представляет собой водород. В некоторых вариантах реализации R¹⁰ представляет собой C_1-6 алкил. В некоторых вариантах реализации R¹⁰ представляет собой метил, этил, н-пропил или н-бутил. В некоторых вариантах реализации R¹⁰ представляет собой н-бутил.

[0051] В некоторых вариантах реализации формулы (I) R^11b представляет собой С_2-4 алкил, который замещен ациламино. В некоторых вариантах реализации R^11b представляет собой -(СН₂)₄-ациламино. В некоторых вариантах реализации R^11b представляет собой -(CH₂)₄-NH-C(O)-C_1-25 алкил. В некоторых вариантах реализации R^11b представляет собой -(CH₂)₄-NH-C(O)-C_15-25 алкил. В некоторых вариантах реализации R^11b представляет собой -(CH₂)₄-NH-C(O)-C_15-20 алкил. В некоторых вариантах реализации R^11b представляет собой -(CH₂)₄-NH-С(O)-С₁₇ алкил.

[0052] В некоторых вариантах реализации агонист TLR7/8 представляет собой соединение, имеющее следующую структуру, или его фармацевтически приемлемые соли:

В определенных предпочтительных вариантах реализации агонист TLR7/8, применяемый в композициях согласно настоящему изобретению, включает N-(4-{[4-амино-2-бутил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил]окси}бутил)октадеканамид), 3М-052, как описано в патенте США №9242980.

Агонисты TLR4

[0053] В определенных предпочтительных вариантах реализации агонист TLR4, применяемый в композициях согласно настоящему изобретению, включает глюкопиранозил-липидный адъювант (GLA) такой, как описанные в публикациях патентов США №№ US 2007/021017, US 2009/045033, US 2010/037466 и US 2010/0310602, содержания которых включены в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки.

[0054] Например, в некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру формулы (II):

или его фармацевтически приемлемую соль, где

L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ и L₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой -О-, -NH- или -(СН₂)-;

L₇, L₈, L₉ и L₁₀ являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или представляют собой -С(=O)-;

Y₁ представляет собой кислотную функциональную группу;

Y₄ представляет собой -ОН или -SH;

R₁, R₃, R₅ и R₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой C_8-13 алкил; и

R₂ и R₄ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой С_6-11 алкил.

[0055] В некоторых вариантах реализации структуры синтетического GLA R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой C₈ алкил. В некоторых вариантах реализации R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉ алкил.

[0056] Например, в некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру формулы (III), или его фармацевтически приемлемую соль:

[0057] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁-С₂₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₁₂-С₂₀ алкил. В другом конкретном варианте реализации GLA имеет формулу, приведенную выше, где R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой C₁₃ алкил. В другом конкретном варианте реализации GLA имеет формулу, приведенную выше, где R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₈ алкил.

[0058] В другом конкретном варианте реализации GLA имеет формулу, приведенную выше, где R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁-С₂₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉-С₂₀ алкил. В некоторых вариантах реализации R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉ алкил.

[0059] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру формулы (IV), или его фармацевтически приемлемую соль:

[0060] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁-С₂₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉-C₂₀ алкил. В некоторых вариантах реализации R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉ алкил.

[0061] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру формулы (V):

[0062] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁-С₂₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉-С₂₀ алкил. В некоторых вариантах реализации R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉ алкил.

[0063] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру формулы (VI), или его фармацевтически приемлемую соль:

[0064] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁-С₂₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉-С₂₀ алкил. В некоторых вариантах реализации R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₉ алкил.

[0065] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру, или его фармацевтически приемлемую соль:

[0066] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру, или его фармацевтически приемлемую соль:

[0067] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий следующую структуру, или его фармацевтически приемлемую соль:

[0068] В другом варианте реализации в композиции, описанные в настоящему документе, включают ослабленное производное липида A (ALD). ALD представляют собой липид А-подобные молекулы, которые были изменены или сконструированы таким образом, что молекула демонстрирует меньшие или другие побочные эффекты по сравнению с липидом А.

Указанные побочные эффекты включают пирогенность, местную реакционную способность Шварцмана и токсичность, которую оценивают путем исследования дозы, летальной для 50% куриных эмбрионов (CELD₅₀). ALD, подходящие для применения в соответствии с настоящим изобретением, включают монофосфориллипид A (MLA или MPL) и 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MLA или 3D-MPL). MLA (MPL) и 3D-MLA (3D-MPL) известны и не нуждаются в подробном описании в настоящем документе. См., например, патент США №4436727, выданный 13 марта 1984 и присвоенный Ribi ImmunoChem Research, Inc., который описывает монофосфориллипид А и его получение. В патенте США №4912094 и в получившем свидетельство о произведенной повторной экспертизе на патентоспособность В1 патенте США №4912094, выданном Майерсу (Myers) et al., также присвоенных Ribi ImmunoChem Research, Inc., описаны 3-деацилированный монофосфориллипид А и способ его получения. См. также, например, документы №№ GB 2220211 и WO 92/116556. 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А также известен из документа № GB 2220211 (Ribi). Химически он представляет собой смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями и производится Ribi Immunochem Montana. Определенная форма 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А описана в международной заявке на патент № WO 92/116556. Описания каждого из указанных патентов в отношении MLA и 3D-MLA включены в настоящий документ посредством ссылки.

[0069] В приведенных выше соединениях агонистах TLR4 общий заряд может быть определен в соответствии с функциональными группами в молекуле. Например, фосфатная группа может быть отрицательно заряженной или нейтральной в зависимости от ионизированного состояния фосфатной группы.

[0070] В любом из вариантов реализации, предложенных в настоящем документе, агонист TLR4 представляет собой синтетический галактозил-липидный адъювант, имеющий структуру формулы (III), или его фармацевтически приемлемую соль, где R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляют собой С₁₃ алкил.

Вспомогательный липид

[0071] В настоящем документе предложены вспомогательные липиды, которые можно применять в композициях, описанных в настоящем документе.

[0072] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой фосфолипид или четвертичную аммонийную соль липида. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой фосфолипид, который представляет собой фосфатидилхолин или фосфоглицерид. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид содержит любой из следующих фрагментов:

где X^- представляет собой противоион щелочного металла, и Y⁺ представляет собой галоидный противоион.

[0073] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид содержит С_10-20 алкильную цепь. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид содержит С_12-18 алкильную цепь.

[0074] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид является анионным. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид является катионным. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид является в целом нейтрально заряженным. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой цвиттер-ион. [0075] Вспомогательные липиды, подходящие в некоторых вариантах реализации, представлены ниже.

[0076] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DLPG, DMPG, DPPG, DSPG, DOPG, DSTAP и DPTAP. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DLPG, DMPG, DPPG, DSPG и DOPG. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DSTAP и DPTAP.

[0077] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DSPG. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DSTAP. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DPTAP.

[0078] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DSPG и DSTAP. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DSPG и DSTAP. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DSPG. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DSTAP.

[0079] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC и РОРС. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DLPC, DSPC и DOPC.

[0080] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DPPC и DPTAP. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DPPC. В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид представляет собой DPTAP.

[0081] В некоторых вариантах реализации вспомогательный липид выбран из DOPC, DSPG, DSTAP и полисорбата 80.

[0082] В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, вспомогательный липид может представлять собой DLPE.

[0083] В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, вспомогательный липид может представлять собой DMTAP.

[0084] В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, вспомогательный липид может представлять собой DTAP.

Соль алюминия

[0085] Как отмечено выше, композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать соль алюминия, которая может называться в настоящем документе квасцами. Подходящие соли алюминия включают гидроксида алюминия, тригидрата алюминия, оксигидроксида алюминия, фосфата алюминия, гидроксифосфата алюминия, гидроксифосфата-сульфата алюминия и сульфата алюминия-калия. Соли алюминия также могут быть обозначены формулами: Al(ОН)₃, AlH₃O₃, AlH₆O₃, AlO(ОН), Al(ОН)(PO₄) и KAl(SO₄)₂. Соли алюминия, применяемые в качестве коадъювантов, являются выгодными, поскольку они имеют хорошие показатели безопасности, усиливают антительные ответы, стабилизируют антигены и являются относительно простыми для крупномасштабного производства (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2:370-383).

[0086] В некоторых вариантах реализации соль алюминия представляет собой Alhydrogel®, гидроксид алюминия или оксигидроксид алюминия. Alhydrogel® имеет общий положительный заряд и может легко адсорбировать отрицательно заряженные фрагменты. Alhydrogel® также может называться Amphojel; гелем гидроксида алюминия; гидратированным оксидом алюминия; тригидроксидом алюминия или Alugelibye.

[0087] В некоторых вариантах реализации соль алюминия представляет собой AdjuPhos®, фосфат алюминия. AdjuPhos® имеет общий отрицательный заряд и может легко адсорбировать положительно заряженные фрагменты.

Водный состав агониста TLR и вспомогательного липида

[0088] Как отмечено выше, в настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR и (2) вспомогательный липид. В настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и (2) вспомогательный липид.

[0089] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR7/8 и (2) вспомогательный липид. В некоторых вариантах реализации водный состав содержит агонист TLR7/8 и вспомогательный липид, выбранный из группы, состоящей из DOPC, DSPG, DSTAP и полисорбата 80. В некоторых вариантах реализации водный состав содержит агонист TLR7/8 и вспомогательный липид, выбранный из группы, состоящей из DSPG и DSTAP.

[0090] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR4 и (2) вспомогательный липид. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен водный состав, содержащий (1) агонист TLR4 и (2) вспомогательный липид, который представляет собой DPTAP.

[0091] В некоторых вариантах реализации композицию, содержащую агонист TLR и вспомогательный липид, подвергают воздействию мощного источника энергии с получением водного состава или наносуспензионной композиции. В некоторых вариантах реализации композицию, содержащую агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и вспомогательный липид, подвергают воздействию мощного источника энергии с получением водного состава или наносуспензионной композиции. В некоторых вариантах реализации водный состав содержит наносуспензию частиц агониста TLR и вспомогательного липида, которые имеют размер в диапазоне от примерно 1 нм до 450 нм, например, менее примерно 400 нм или менее примерно 200 нм.

Размер

[0092] В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 75 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 100 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 150 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 20 нм до 100 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 20 нм до 50 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 10 нм до 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 10 нм до 100 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 10 нм до 50 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии составляет примерно 1 нм, примерно 5 нм, примерно 10 нм, примерно 15 нм, примерно 20 нм, примерно 25 нм, примерно 30 нм, примерно 35 нм, примерно 40 нм, примерно 45 нм, примерно 50 нм, примерно 55 нм, примерно 60 нм, примерно 65 нм, примерно 70 нм, примерно 75 нм, примерно 80 нм, примерно 85 нм, примерно 90 нм, примерно 95 нм, примерно 100 нм, примерно 105 нм, примерно 110 нм, примерно 115 нм, примерно 120 нм, примерно 125 нм, примерно 130 нм, примерно 135 нм, примерно 140 нм, примерно 145 нм, примерно 150 нм, примерно 155 нм, примерно 160 нм, примерно 165 нм, примерно 170 нм, примерно 175 нм, примерно 180 нм, примерно 185 нм, примерно 190 нм, примерно 195 нм или примерно 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии составляет не более примерно 1 нм, не более примерно 5 нм, не более примерно 10 нм, не более примерно 15 нм, не более примерно 20 нм, не более примерно 25 нм, не более примерно 30 нм, не более примерно 35 нм, не более примерно 40 нм, не более примерно 45 нм, не более примерно 50 нм, не более примерно 55 нм, не более примерно 60 нм, не более примерно 65 нм, не более примерно 70 нм, не более примерно 75 нм, не более примерно 80 нм, не более примерно 85 нм, не более примерно 90 нм, не более примерно 95 нм, не более примерно 100 нм, не более примерно 105 нм, не более примерно 110 нм, не более примерно 115 нм, не более примерно 120 нм, не более примерно 125 нм, не более примерно 130 нм, не более примерно 135 нм, не более примерно 140 нм, не более примерно 145 нм, не более примерно 150 нм, не более примерно 155 нм, не более примерно 160 нм, не более примерно 165 нм, не более примерно 170 нм, не более примерно 175 нм, не более примерно 180 нм, не более примерно 185 нм, не более примерно 190 нм, не более примерно 195 нм, или не более примерно 199 нм.

[0093] В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии агониста TLR и вспомогательного липида составляет не более примерно 200 нм, не более примерно 205 нм, не более примерно 10 нм, не более примерно 215 нм, не более примерно 220 нм, не более примерно 225 нм, не более примерно 230 нм, не более примерно 235 нм, не более примерно 240 нм, не более примерно 245 нм, не более примерно 250 нм, не более примерно 255 нм, не более примерно 260 нм, не более примерно 265 нм, не более примерно 270 нм, не более примерно 275 нм, не более примерно 280 нм, не более примерно 285 нм, не более примерно 90 нм, не более примерно 295 нм, не более примерно 300 нм, не более примерно 305 нм, не более примерно 310 нм, не более примерно 315 нм, не более примерно 320 нм, не более примерно 325 нм, не более примерно 130 нм, не более примерно 335 нм, не более примерно 140 нм, не более примерно 145 нм, не более примерно 150 нм, не более примерно 355 нм, не более примерно 360 нм, не более примерно 365 нм, не более примерно 370 нм, не более примерно 375 нм, не более примерно 380 нм, не более примерно 385 нм, не более примерно 390 нм, не более примерно 395 нм, не более примерно 399 нм, не более примерно 400 нм, не более примерно 405 нм, не более примерно 410 нм, не более примерно 415 нм, не более примерно 420 нм, не более примерно 425 нм, не более примерно 430 нм, не более примерно 435 нм, не более примерно 440 нм, не более примерно 440 нм, не более примерно 445 нм, или не более примерно 450 нм.

[0094] В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии можно фильтровать через по меньшей мере 45-микронный фильтр. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии можно фильтровать через по меньшей мере фильтр с размером пор 45 микрон или менее. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии можно фильтровать через 45-микронный фильтр. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии можно фильтровать через 20-микронный фильтр. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии можно фильтровать через 22-микронный фильтр.

Стабильность

[0095] В некоторых вариантах реализации, предложенных в настоящем документе, водная наносуспензия с размером частиц 1-450 нм, содержащая агонист TLR (например, агонист TLR7/8 или агонист TLR4) и вспомогательный липид, является стабильной, поскольку наносуспензия с размером частиц менее 450 нм сохраняется, и частицы демонстрируют пониженную агрегацию или отсутствие агрегации по сравнению с агонистом TLR при отсутствии вспомогательного липида согласно настоящему изобретению.

[0096] В некоторых вариантах реализации термин "стабильный" относится к составу или композиции, состоящей из частиц наносуспензии, которые практически не демонстрируют агрегацию, или демонстрируют пониженную агрегацию, или практически не демонстрируют общее увеличение среднего размера частиц или полидисперсности состава с течением времени по сравнению с исходным размером частиц.

[0097] Стабильность частиц наносуспензии может быть измерена способами, известными специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации стабильность наблюдают визуально. Визуальный осмотр может включать осмотр на наличие макрочастиц, хлопьевидности или агрегатов. В некоторых вариантах реализации стабильность определяют по размеру частиц наносуспензии. Например, размер может быть оценен способами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, рентгеновскую и лазерную дифракцию, динамическое рассеяние света (DLS), крио-ЭМ или применение анализатора размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала Malvern. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии относится к Z-среднему диаметру. В некоторых вариантах реализации стабильность оценивают способностью частиц наносуспензии проходить через фильтр конкретного размера, например, через 20-, 22- или 45-микронный фильтр. В некоторых вариантах реализации стабильность определяют по рН. В некоторых вариантах реализации стабильность определяют путем измерения коэффициентов полидисперсности (PdI), например, с применением способа динамического рассеяния света (DLS).

[0098] В некоторых вариантах реализации Z-средний диаметр частиц наносуспензии увеличивается на менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее 25%, менее 20%, менее 15%, менее 12%, менее 10%, менее 7%, менее 5%, менее 3%, менее 1% с течением времени.

[0099]

[00100] В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 0-8°С, например, при 2-8°С. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 0°С, 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С или 8°С в течение по меньшей мере 1 минуты, в течение по меньшей мере 5 минут, в течение по меньшей мере 10 минут, в течение по меньшей мере 15 минут, в течение по меньшей мере 20 минут, в течение по меньшей мере 25 минут, в течение по меньшей мере 30 минут, в течение по меньшей мере 35 минут, в течение по меньшей мере 40 минут, в течение по меньшей мере 45 минут, в течение по меньшей мере 50 минут, в течение по меньшей мере 55 минут, в течение по меньшей мере 1 часа, в течение по меньшей мере 2 часов, в течение по меньшей мере 6 часов, в течение по меньшей мере 12 часов, в течение по меньшей мере 18 часов, в течение по меньшей мере 24 часов, в течение по меньшей мере 48 часов, в течение по меньшей мере 72 часов, в течение по меньшей мере 1 недели, в течение по меньшей мере 2 недель, в течение по меньшей мере 3 недель, в течение по меньшей мере 1 месяца, в течение по меньшей мере 2 месяцев, в течение по меньшей мере 3 месяцев, в течение по меньшей мере 4 месяцев, в течение по меньшей мере 5 месяцев, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 7 месяцев, в течение по меньшей мере 8 месяцев, в течение по меньшей мере 9 месяцев, в течение по меньшей мере 10 месяцев, в течение по меньшей мере 11 месяцев, в течение по меньшей мере 1 года, в течение по меньшей мере 2 лет или в течение по меньшей мере 5 лет.

[00101] В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 20-30°С. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 25°С в течение по меньшей мере 1 минуты, в течение по меньшей мере 5 минут, в течение по меньшей мере 10 минут, в течение по меньшей мере 15 минут, в течение по меньшей мере 20 минут, в течение по меньшей мере 25 минут, в течение по меньшей мере 30 минут, в течение по меньшей мере 35 минут, в течение по меньшей мере 40 минут, в течение по меньшей мере 45 минут, в течение по меньшей мере 50 минут, в течение по меньшей мере 55 минут, в течение по меньшей мере 1 часа, в течение по меньшей мере 2 часов, в течение по меньшей мере 6 часов, в течение по меньшей мере 12 часов, в течение по меньшей мере 18 часов, в течение по меньшей мере 24 часов, в течение по меньшей мере 48 часов, в течение по меньшей мере 72 часов, в течение по меньшей мере 1 недели, в течение по меньшей мере 2 недель, в течение по меньшей мере 3 недель, в течение по меньшей мере 1 месяца, в течение по меньшей мере 2 месяцев, в течение по меньшей мере 3 месяцев, в течение по меньшей мере 4 месяцев, в течение по меньшей мере 5 месяцев, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 7 месяцев, в течение по меньшей мере 8 месяцев, в течение по меньшей мере 9 месяцев, в течение по меньшей мере 10 месяцев, в течение по меньшей мере 11 месяцев, в течение по меньшей мере 1 года, в течение по меньшей мере 2 лет или в течение по меньшей мере 5 лет.

[00102] В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 35-40°С. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 35°С, 36°С, 37°С, 38°С, 39°С или 40°С в течение по меньшей мере 1 минуты, в течение по меньшей мере 5 минут, в течение по меньшей мере 10 минут, в течение по меньшей мере 15 минут, в течение по меньшей мере 20 минут, в течение по меньшей мере 25 минут, в течение по меньшей мере 30 минут, в течение по меньшей мере 35 минут, в течение по меньшей мере 40 минут, в течение по меньшей мере 45 минут, в течение по меньшей мере 50 минут, в течение по меньшей мере 55 минут, в течение по меньшей мере 1 часа, в течение по меньшей мере 2 часов, в течение по меньшей мере 6 часов, в течение по меньшей мере 12 часов, в течение по меньшей мере 18 часов, в течение по меньшей мере 24 часов, в течение по меньшей мере 48 часов, в течение по меньшей мере 72 часов, в течение по меньшей мере 1 недели, в течение по меньшей мере 2 недель, в течение по меньшей мере 3 недель, в течение по меньшей мере 1 месяца, в течение по меньшей мере 2 месяцев, в течение по меньшей мере 3 месяцев, в течение по меньшей мере 4 месяцев, в течение по меньшей мере 5 месяцев, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 7 месяцев, в течение по меньшей мере 8 месяцев, в течение по меньшей мере 9 месяцев, в течение по меньшей мере 10 месяцев, в течение по меньшей мере 11 месяцев, в течение по меньшей мере 1 года, в течение по меньшей мере 2 лет или в течение по меньшей мере 5 лет.

[00103] В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 57-62°С. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 57°С, 58°С, 59°С, 60°С, 61°С или 62°С в течение по меньшей мере 1 минуты, в течение по меньшей мере 5 минут, в течение по меньшей мере 10 минут, в течение по меньшей мере 15 минут, в течение по меньшей мере 20 минут, в течение по меньшей мере 25 минут, в течение по меньшей мере 30 минут, в течение по меньшей мере 35 минут, в течение по меньшей мере 40 минут, в течение по меньшей мере 45 минут, в течение по меньшей мере 50 минут, в течение по меньшей мере 55 минут, в течение по меньшей мере 1 часа, в течение по меньшей мере 2 часов, в течение по меньшей мере 6 часов, в течение по меньшей мере 12 часов, в течение по меньшей мере 18 часов, в течение по меньшей мере 24 часов, в течение по меньшей мере 48 часов, в течение по меньшей мере 72 часов, в течение по меньшей мере 1 недели, в течение по меньшей мере 2 недель, в течение по меньшей мере 3 недель, в течение по меньшей мере 1 месяца.

[00104] В одном из приведенных в качестве примера вариантов реализации частицы наносуспензии являются стабильными при 2-8°С в течение по меньшей мере 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или одного года.

[00105] В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными после 1-4 циклов замерзания и оттаивания. В некоторых вариантах реализации частицы наносуспензии являются стабильными после 1, после 2, после 3 или после 4 циклов замерзания и оттаивания.

Комбинация агониста TLR. вспомогательного липида и соли алюминия

[00106] Как отмечено выше, предложен стабильный водный состав адъюванта, содержащий агонист TLR с вспомогательным липидом, который адсорбирован на соли алюминия. В настоящем изобретении предложен стабильный водный состав адъюванта, содержащий агонист TLR7/8 или агонист TLR4 с вспомогательным липидом, который адсорбирован на соли алюминия.

[00107] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR7/8; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия. В некоторых вариантах реализации водный состав содержит (1) агонист TLR7/8; (2) вспомогательный липид, выбранный из группы, состоящей из DOPC, DSPG, DSTAP и полисорбата 80; и (3) соль алюминия. В некоторых вариантах реализации водный состав содержит (1) агонист TLR7/8; (2) вспомогательный липид, выбранный из группы, состоящей из DSPG и DSTAP; и (3) соль алюминия.

[00108] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR4; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR4; (2) вспомогательный липид, который представляет собой DPTAP; и (3) соль алюминия. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR4; (2) вспомогательный липид; и (3) соль алюминия, которая представляет собой фосфат алюминия (например, AdjuPhos®). В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена водная композиция, содержащая (1) агонист TLR4; (2) вспомогательный липид, который представляет собой DPTAP; и (3) соль алюминия, которая представляет собой фосфат алюминия (например, AdjuPhos®).

[00109] Факторы, которые относятся к выбору каждого из компонентов, включают, но не ограничиваются ими, заряды компонентов и наличие заменяемых лигандов. При правильном выборе компонентов агонист TLR и вспомогательный липид подходят для адсорбции на соли алюминия. В некоторых вариантах реализации адсорбция происходит в in vitro условиях.

[00110] Термин "связывание" или "адсорбция" относится к взаимодействую между молекулами или их фрагментами, которые демонстрируют взаимное сродство или связывающую способность, как правило, за счет специфического или неспецифического связывания или взаимодействия, включая, но не ограничиваясь ими, биохимические, физиологические и/или химические взаимодействия. В некоторых вариантах реализации связывание с солью алюминия можно определять при помощи УФ-спектроскопии, ДСН-ПААГ-электрофореза или центрифугирования.

[00111] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 25%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% агониста TLR с вспомогательным липидом, присутствующих в композиции, связаны с частицами квасцов. Один приведенный в качестве примера способ определения процента ассоциации показан в примере 1.

[00112] Адсорбция на соли алюминия может происходить в основном по следующим механизмам, но не ограничиваясь ими: электростатическое взаимодействие и лигандный обмен. При электростатическом взаимодействии используется наличие противоположных зарядов на компонентах в растворе в определенных условиях. При лигандном обмене используется фосфатная группа в одном из компонентов для обмена на гидроксильную группу другого компонента. Для лигандного обмена используются доступные фосфатные группы и гидроксильные группы в компонентах. Для получения вакцинной композиции с антигеном в комбинации с адъювантной композицией, содержащей агонист TLR, вспомогательный липид и соль алюминия, учитывают заряд и присутствие фосфатных групп и гидроксильных групп на антигене.

Лигандный обмен

[00113] В некоторых вариантах реализации в отношении механизма лигандного обмена может происходить лигандный обмен между антигеном и адъювантной композицией, содержащей агонист TLR, вспомогательный липид и соль алюминия.

[00114] В некоторых вариантах реализации может происходить лигандный обмен между компонентами адъювантной композиции (например, агонистом TLR, вспомогательным липидом и солью алюминия). Как отмечено выше, некоторые компоненты в адъювантной композиции содержат фосфатные группы, тогда как некоторые другие компоненты содержат гидроксильные группы, что позволяет происходить лигандному обмену. Например, некоторые агонисты TLR4 содержат фосфатные группы. Кроме того, некоторые вспомогательные липиды содержат фосфатные группы. Также AdjuPhos® содержит фосфатные группы. Гидроксильные группы присутствуют в следующих компонентах: антигены, агонисты TLR, вспомогательный липид и Alhydrogel®.

Электростатическое взаимодействие

[00115] В некоторых вариантах реализации в отношении механизма электростатического взаимодействия вакцинная композиции является по существу нейтрально заряженной при примерно физиологическом рН.

[00116] Если антиген для вакцинной композиции является заряженным, компоненты для адъювантной композиции (например, агонист TLR, вспомогательный липид и соль алюминия) можно выбирать для нейтрализации заряда антигена с получением по существу нейтрально заряженной вакцинной композиции. Если антиген для вакцинной композиции является по существу нейтрально заряженным, компоненты для адъювантной композиции (например, агонист TLR, вспомогательный липид и соль алюминия) можно выбирать для поддержания по существу нейтрального заряда антигена с получением по существу нейтрально заряженной вакцинной композиции. Как отмечено выше, каждый из компонентов в адъювантной композиции может быть охарактеризован, как отрицательно заряженный, положительно заряженный или нейтрально заряженный.

[00117] В некоторых вариантах реализации состав композиции содержит агонист TLR, вспомогательный липид и соль алюминия, где компоненты выбраны с отличительными признаками из таблицы ниже.

[00118] В некоторых вариантах реализации состав композиции содержит агонист TLR, вспомогательный липид и соль алюминия, где компоненты выбраны из таблицы ниже.

Способ получения композиций

[00119] В настоящем изобретении предложен способ получения водного состава, содержащего агонист TLR (например, агонист TLR7/8 или агонист TLR4) и вспомогательный липид; где способ включает

(a) смешивание агониста TLR (например, агониста TLR7/8 или агониста TLR4) и вспомогательного липида в растворителе с получением раствора;

(b) удаление растворителя из раствора со стадии (а) с получением пленочной композиции; и

(d) воздействие на регидратированную композицию мощным источником энергии с получением наносуспензионной композиции.

[00120] В некоторых вариантах реализации растворитель имеет низкую температуру плавления. Растворители, которые подходят для способа, включают, но не ограничиваются ими, хлороформ, метиленхлорид, метанол и воду. В некоторых вариантах реализации растворитель представляет собой хлороформ. В некоторых вариантах реализации растворитель включает хлороформ, метанол и воду.

[00121] В некоторых вариантах реализации смешивание агониста TLR7/8 или агониста TLR4 и вспомогательного липида можно проводить в отношении примерно 1:2 агониста TLR7/8 или агониста TLR4 к вспомогательному липиду.

[00122] Смешивание компонентов на стадии (а) можно проводить при комнатной температуре или при небольшом нагревании. Небольшое нагревание может представлять собой нагревание до 30, 35 или 40°С.

[00123] На стадии (b) способа растворитель удаляют при небольшом нагревании или при пониженном давлении. В некоторых вариантах реализации растворитель удаляют при пониженном давлении. Пониженное давление представляет собой давление, которое ниже атмосферного давления.

[00124] На стадии (с) пленочную композицию регидратируют. Подходящим растворителем для регидратации является вода. В некоторых вариантах реализации вода является ультрачистой водой.

[00125] На стадии (d) регидратированную композицию подвергают воздействию мощного источника энергии с получением наносуспензионной композиции. В некоторых вариантах реализации регидратированную композицию тщательно перемешивают. Способ тщательного перемешивания представляет собой обработку ультразвуком. Обработку ультразвуком можно проводить в течение нескольких часов. В некоторых вариантах реализации тщательное перемешивание продолжают до получения полупрозрачной композиции. В некоторых вариантах реализации тщательное перемешивание продолжают до момента, когда композиция по существу не содержит видимых частиц. В некоторых вариантах реализации раствор является полупрозрачным, что подтверждается при помощи УФ-спектроскопии, турбидиметра или динамического рассеяния света.

[00126] На стадии (d) регидратированную композицию можно обрабатывать или измельчать. Обработку или измельчение проводят с применением стандартных способов, известных в данной области техники, включая обработку ультразвуком, применение смесителя Silverson и микрофлюидизацию.

[00127] В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии обеспечивает по меньшей мере 2000 фунт/кв. дюйм (13,8 МПа), по меньшей мере 3000 фунт/кв. дюйм (20,7 МПа), по меньшей мере 5000 фунт/кв. дюйм (34,5 МПа), по меньшей мере 10000 фунт/кв. дюйм (69,0 МПа), по меньшей мере 15000 фунт/кв. дюйм (103,4 МПа), по меньшей мере 20000 фунт/кв. дюйм (137,9 МПа), по меньшей мере 25000 фунт/кв. дюйм (172,4 МПа), по меньшей мере 30000 фунт/кв. дюйм (206,8 МПа), по меньшей мере 35000 фунт/кв. дюйм (241,3 МПа), по меньшей мере 40000 фунт/кв. дюйм (275,8 МПа), по меньшей мере 45000 фунт/кв. дюйм (310,3 МПа) или по меньшей мере 50000 фунт/кв. дюйм (344,7 МПа). В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии обеспечивает примерно от 5000 до 50000; от 5000 до 10000; от 5000 до 15000; от 5000 до 20000; от 5000 до 25000; от 5000 до 30000; от 5000 до 35000; от 5000 до 40000; от 5000 до 45000 или от 5000 до 50000 фунт/кв. дюйм (МПа). В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии обеспечивает примерно от 45000 до 50000; от 40000 до 50000; от 35000 до 50000; от 30000 до 50000; от 25000 до 50000; от 20000 до 50000; от 15000 до 50000; от 10000 до 50000 или от 5000 до 50000 фунт/кв. дюйм (МПа). В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии обеспечивает примерно от 25000 до 35000; от 25000 до 30000 или от 30000 до 35000 фунт/кв. дюйм (МПа). В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии обеспечивает примерно 30000 фунт/кв. дюйм (206,8 МПа).

[00128] В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии представляет собой источник с высоким сдвиговым усилием.

[00129] В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии представляет собой микрофлюидизатор. Термин "микрофлюидизация" применяют для описания процесса, в котором композиции подвергают воздействию сильного сдвигового усилия. В некоторых вариантах реализации композиции обрабатывают при помощи инструмента или устройства, известного как MICROFLUIDIZER®.

[00130] В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии представляет собой экструдер.

[00131] В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии представляет собой ультразвуковой диспергатор.

[00132] В некоторых вариантах реализации мощный источник энергии представляет собой гомогенизатор.

[00133] В некоторых вариантах реализации композицию подвергают по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50 или 100 проходам сильного сдвигового усилия. В некоторых вариантах реализации композицию подвергают 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 или 91-100 проходам сильного сдвигового усилия. В некоторых вариантах реализации композицию подвергают 3, 6 или 10 проходам сильного сдвигового усилия.

[00134] В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется в диапазоне от примерно 1 нм до 450 нм, например, менее примерно 400 нм или менее примерно 200 нм.

[00135] В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 75 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 100 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 150 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 50 нм до 200 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 20 нм до 100 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 20 нм до 50 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 10 нм до 200 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 10 нм до 100 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии варьируется от примерно 10 нм до 50 нм. В некоторых вариантах реализации частиц наносуспензии составляет примерно 1 нм, примерно 5 нм, примерно 10 нм, примерно 15 нм, примерно 20 нм, примерно 25 нм, примерно 30 нм, примерно 35 нм, примерно 40 нм, примерно 45 нм, примерно 50 нм, примерно 55 нм, примерно 60 нм, примерно 65 нм, примерно 70 нм, примерно 75 нм, примерно 80 нм, примерно 85 нм, примерно 90 нм, примерно 95 нм, примерно 100 нм, примерно 105 нм, примерно 110 нм, примерно 115 нм, примерно 120 нм, примерно 125 нм, примерно 130 нм, примерно 135 нм, примерно 140 нм, примерно 145 нм, примерно 150 нм, примерно 155 нм, примерно 160 нм, примерно 165 нм, примерно 170 нм, примерно 175 нм, примерно 180 нм, примерно 185 нм, примерно 190 нм, примерно 195 нм или примерно 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер частиц наносуспензии составляет не более примерно 1 нм, не более примерно 5 нм, не более примерно 10 нм, не более примерно 15 нм, не более примерно 20 нм, не более примерно 25 нм, не более примерно 30 нм, не более примерно 35 нм, не более примерно 40 нм, не более примерно 45 нм, не более примерно 50 нм, не более примерно 55 нм, не более примерно 60 нм, не более примерно 65 нм, не более примерно 70 нм, не более примерно 75 нм, не более примерно 80 нм, не более примерно 85 нм, не более примерно 90 нм, не более примерно 95 нм, не более примерно 100 нм, не более примерно 105 нм, не более примерно 110 нм, не более примерно 115 нм, не более примерно 120 нм, не более примерно 125 нм, не более примерно 130 нм, не более примерно 135 нм, не более примерно 140 нм, не более примерно 145 нм, не более примерно 150 нм, не более примерно 155 нм, не более примерно 160 нм, не более примерно 165 нм, не более примерно 170 нм, не более примерно 175 нм, не более примерно 180 нм, не более примерно 185 нм, не более примерно 190 нм, не более примерно 195 нм, или не более примерно 199 нм.

[00136] Водный состав можно дополнительно смешивать с солью алюминия, как описано в настоящем документе.

[00137] Водный состав можно дополнительно смешивать с антигеном, как описано в настоящем документе.

[00138] Водный состав можно дополнительно смешивать солью алюминия и с антигеном, как описано в настоящем документе.

[00139] В настоящем изобретении предложены продукты, полученные по любому из приведенных выше способов.

[00140] В настоящем изобретении предложена наносуспензионная композиция, полученная путем

(a) смешивания агониста TLR (например, агониста TLR7/8 или агониста TLR4) и вспомогательного липида в растворителе с получением раствора;

(b) удаления растворителя из раствора со стадии (а) с получением пленочной композиции; и

[00141] В настоящем изобретении предложена наносуспензионная композиция, полученная на описанных выше стадиях (а) - (d), дополнительно включающих смешивание наносуспензионной композиции с солью алюминия; смешивание наносуспензионной композиции с антигеном; или смешивание наносуспензионной композиции с солью алюминия и антигеном.

Агенты

[00142] Водный состав, предложенный в настоящем документе, может дополнительно содержать один или более агентов, где агент может представлять собой полипептид, полинуклеотид, антиген, адъювант, диагностический агент, терапевтический агент, организм, геном или вирус. В некоторых вариантах реализации водный состав содержит два или более агентов. В некоторых вариантах реализации агент связывается с водным составом. В некоторых вариантах реализации агент связывается с водным составом путем лигандного обмена и/или путем электростатического (на основе зарядов) взаимодействия.

Полипептиды

[00143] В некоторых вариантах реализации агент представляет собой полипептид. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой полноразмерный белок или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой пептид. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой гибридный белок. В некоторых конкретных вариантах реализации гибридный белок способен вызывать иммунный ответ при введении индивидууму. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой антиген, как описано ниже.

Антигены

[00144] В одном из вариантов реализации агент содержит антиген.

[00145] В некоторых вариантах реализации полипептидный антиген задействован в или

образуется в результате аллергии, рака или инфекционного заболевания.

[00146] В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, подходят для целей вакцинации и представлены в виде вакцинных составов (вакцинных композиций).

[00147] Антиген может представлять собой любой целевой эпитоп, молекулу (включая биомолекулу), молекулярный комплекс (включая молекулярные комплексы, которые содержат биомолекулы), субклеточное образование, клетку или ткань, в отношении которых желательно проявление или усиление иммунной реактивности у субъекта. Часто термин "антиген" относится к представляющему интерес полипептидному антигену. Тем не менее, применяемый в настоящем документе термин "антиген" также может относиться к рекомбинантной конструкции, которая кодирует представляющий интерес полипептидный антиген (например, экспрессионной конструкции). В некоторых вариантах реализации антиген может представлять собой, или может быть получен из, или может являться иммунологически перекрестно-реагирующим с инфекционным патогеном и/или эпитопом, биомолекулой, клеткой или тканью, которые связаны с инфекцией, раком, аутоиммунным заболеванием, аллергией, астмой или любым другим состоянием, при котором стимулирование антиген-специфического иммунного ответа является желательным или полезным.

[00148] В некоторых вариантах реализации предложен антиген, который получен из по меньшей мере одного инфекционного патогена, такого как бактерия, вирус или грибок, включая актинобактерию, такую как М. tuberculosis, или М. leprae, или другую микобактерию; бактерию, такую как член рода Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia или Bordetella; вирус, такой как вирус простого герпеса, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус иммунодефицита кошек (ВИК), цитомегаловирус, вирус варицелла-зостер, вирус гепатита, вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы человека (ВПЧ) и цитомегаловирус; ВИЧ, такой как ВИЧ-1 или ВИЧ-2; грибок, такой как Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides и Pneumocysti или дрожжевой грибок, включая виды Candida, такие как С. albicans, С. glabrata, С. krusei, С. lusitaniae, С. tropicalis и С. parapsilosis; паразита, такого как простейший, например, виды Plasmodium, включая Р. falciparum, P. vivax, P. malariae и P. ovale; или другого паразита, такого как один или более из Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia и Leishmania. В конкретных вариантах реализации антиген может быть из или связан с антигенами, задействованных в туберкулезе, группе, амебиазе, ВИЧ, гепатите или лейшманиозе.

[00149] В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой антиген, связанный с амебиазом. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой антиген, вызывающий амебиаз. В некоторых вариантах реализации антиген происходит из организма, вызывающего амебиаз. В некоторых вариантах реализации антиген происходит из Entamoeba histolytica. В одном из вариантов реализации антиген включает LecA. В одном из вариантов реализации антиген представляет собой LecA.

[00150] В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой антиген, связанный с гриппом. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой антиген, вызывающий грипп. В некоторых вариантах реализации антиген происходит из вируса, вызывающего грипп. В одном из вариантов реализации антиген включает H5N1. В одном из вариантов реализации антиген включает H5N1.

[00151] Например, в некоторых вариантах реализации антигены получены из Borrelia sp., при этом антигены могут включать нуклеиновую кислоту, полученный из патогена антиген или антигенные препараты, рекомбинантно продуцируемый белок или пептиды и химерные гибридные белки. Один из таких антигенов представляет собой OspA. OspA может представлять собой полностью созревший белок в липидированной форме вследствие его биосинтеза в клетке-хозяине (Lipo-OspA) или альтернативно может представлять собой не липидированное производное. Такие не липидированные производные включают не липидированный гибридный белок NS1-OspA, который содержит первые 81 N-концевые аминокислоты неструктурного белка (NS1) вируса гриппа и полный белок OspA, и MDP-OspA, который представляет собой не липидированную форму OspA, несущую 3 дополнительные N-концевые аминокислоты.

[00152] В некоторых вариантах реализации антиген получен из вируса, такого как ВИЧ-1 (например, tat, nef, gp120 или gp160), вирусы герпеса человека, например, gD или его производные или предранний белок, например, ICP27 из ВПГ1 или ВПГ2, цитомегаловирус (в частности, человека) (например, gB или его производные), ротавирус (включая живые аттенуированные вирусы), вирус Эпштейна-Барр (например, gp350 или его производные), вирус варицелла-зостер (например, gp1, II и IE63), или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (например, поверхностный антиген вируса гепатита В или его производное), вирус гепатита А, вирус гепатита С и вирус гепатита Е, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (например, белки F и G или их производные), вирус парагриппа, вирус кори, вирус свинки, вирусы папилломы человека (например, ВПЧ 6, 11, 16, 18 и т.п.), флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или вирус гриппа (целый живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или клетках MDCK, или целые виросомы вируса гриппа (описанные в Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920), или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки НА, NP, NA или М, или их комбинации).

[00153] В некоторых других вариантах реализации антиген получен из одного или более бактериальных патогенов, таких как Neisseria spp, включая N. gonorrhea и N. meningitidis (например, капсульные полисахариды и их конъюгаты, трансферрин-связывающие белки, лактоферрин-связывающие белки, PilC, адгезины); S. pyogenes (например, белки М или их фрагменты, С5А протеаза, липотейхоевые кислоты), S. agalactiae, S. mutans: Н. ducreyi; Moraxella spp, включая M. catarrhalis, также известную как Branhamella catarrhalis (например, высоко- и низкомолекулярные адгезины и инвазины); Bordetella spp, включая В. pertussis (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, филаментный гемагглютинин, аденилатциклаза, фимбрии), В. parapertussis и В. bronchiseptica; Mycobacterium spp., включая М. tuberculosis (например, ESAT6, антиген 85А, -В или -С), М. bovis, М. leprae, М. avium, М. paratuberculosis, М. smegmatis; Legionella spp, включая L. pneumophila; Escherichia spp, включая энтеротоксическую E. coli (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагическую Е. coli, энтеропатогенную Е. coli (например, шигаподобный токсин или его производные); Vibrio spp, включая V. cholera (например, холерный токсин или его производные); Shigella spp, включая S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, включая Y. enterocolitica (например, белок Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, включая С. jejuni (например, токсины, адгезины и инвазины) и С. coli; Salmonella spp, включая S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., включая L. monocytogenes; Helicobacter spp, включая H. pylori (например, уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); Pseudomonas spp, включая P. aeruginosa; Staphylococcus spp., включая S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., включая E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., включая С. tetani (например, тетанотоксин и его производное), С. botulinum (например, ботулинический токсин и его производное), С. difficile (например, токсины клостридии А или В и их производные); Bacillus spp., включая В. anthracis (например, ботулинический токсин и его производные); Corynebacterium spp., включая С. diphtheriae (например, дифтерийный токсин и его производные); Borrelia spp., включая В. burgdorferi (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), В. garinii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), В. hermsii; Ehrlichia spp., включая E. equi и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; Rickettsia spp, включая R. rickettsii; Chlamydia spp. включая С. trachomatis (например, MOMP, гепарин-связывающие белки), С. pneumoniae (например, МОМР, гепарин-связывающие белки), С. psittaci; Leptospira spp., включая L. interrogans; Treponema spp., включая Т. pallidum (например, редкие белки наружной мембраны), Т. denticola, Т. hyodysenteriae; или другие бактериальные патогены.

[00154] В некоторых других вариантах реализации антиген получен из одного или более паразитов (см., например, John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology-9^th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians-8^th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia), таких как Plasmodium spp., включая P. falciparum; Toxoplasma spp., включая Т. gondii (например, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., включая E. histolytica; Babesia spp., включая В. microti; Trypanosoma spp., включая Т. cruzi; Giardia spp., включая G. lamblia; Leshmania spp., включая L. major; Pneumocystis spp., включая P. carinii; Trichomonas spp., включая Т. vaginalis; или из гельминтов, способных инфицировать млекопитающее, например: (i) нематодными инфекциями (включая, но не ограничиваясь ими, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis и Strongyloides stercoralis); (ii) трематодными инфекциями (включая, но не ограничиваясь ими, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); и (iii) цестодными инфекциями (включая, но не ограничиваясь ими, Taenia saginata и Taenia solium). В некоторых вариантах реализации антиген получен из Schisostoma spp., Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium и/или Schistosoma japonicum, или получен из дрожжевого грибка, такого как Candida spp., включая С. albicans; Cryptococcus spp., включая С. neoformans.

[00155] Другие специфические антигены получают из М. tuberculosis, например, Th Ra12, Tb Н9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 и hTCC1 (документ № WO 99/51748). Белки для M. tuberculosis также включают гибридные белки и их варианты, в которых по меньшей мере два, три, четыре или более полипептидов М. tuberculosis слиты в более крупный белок. Некоторые слияния включают Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (документ № WO 99151748). Другие антигены, которые можно применять, включают антигены, комбинации антигенов и гибридные белки, описанные в документах №№ US 2010/0129391 и WO 2008/124647. В одном приведенном в качестве примера варианте реализации гибридный белок представляет собой ID93. В одном приведенном в качестве примера варианте реализации гибридный белок представляет собой ID91.

[00156] Другие специфические антигены получают из хламидии, и они включают, например, высокомолекулярный белок (HWMP) (документ № WO 99/17741), ORF3 (документ № ЕР 366412) и путативные мембранные белки (Pmp). Другие антигены хламидии можно выбирать из группы, описанной в документе № WO 99128475. Некоторые антигены можно получать из Streptococcus spp, включая S. pneumoniae (например, капсульные полисахариды и их конъюгаты, PsaA, PspA, стрептолизин, холин-связывающие белки) и белкового антигена пневмолизина (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) и его детоксифицированных производных (документы №№ WO 90/06951; WO 99/03884). Другие бактериальные вакцины содержат антигены, полученные из Haemophilus spp., включая Н. influenzae типа В (например, PRP и его конъюгаты), нетипируемой H. influenzae, например, ОМР26, высокомолекулярных адгезинов, Р5, Р6, белка D и липопротеина D, фимбрина и полученных из фимбрина пептидов (патент США №5843464) или их многокопийных вариантов или гибридных белков.

[00157] Другие специфические антигены получают из гепатита В. Производные поверхностного антигена гепатита В хорошо известны в данной области техники и включают, в частности, PreS1, Pars2 S антигены, указанные в заявках на европейские патенты №№ ЕР-А414374; ЕР-А-0304578 и ЕР 198474. В одном из аспектов антиген представляет собой ВИЧ-1 gp120, особенно когда он экспрессирован в клетках СНО. В другом варианте реализации антиген представляет собой gD2t.

[00158] В других вариантах реализации антиген получают из вируса папилломы человека (ВПЧ), который считают ответственным за развитие генитальных кондилом (ВПЧ 6 или ВПЧ 11 и другие) и ВПЧ вирусов, ответственных за развитие рака шейки матки (ВПЧ 16, ВПЧ 18 и другие). Конкретные антигены включают L1 частицы или капсомеры и гибридные белки, содержащие один или более антигенов, выбранных из белков Е6, Е7, L1 и L2 ВПЧ 6 и ВПЧ 11. Некоторые формы гибридного белка включают L2E7, как описано в документе № WO 96/26277 и белок D(1/3)-E7, описанный в документе № GB 9717953.5 (РСТ/ЕР98/05285). Дополнительные возможные антигены включают антигены ВПЧ 16 или 18. Например, L1 или L2 антигенные мономеры, или L1 или L2 антигены, представленные вместе как вирусоподобная частица (VLP), или отдельный L1 белок, представленный отдельно в VLP или капсомерной структуре. Такие антигены, вирусоподобные частицы и капсомеры хорошо известны. См., например, документы №№ WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 и WO 93/02184.

[00159] В других вариантах реализации антиген представляет собой гибридный белок. Гибридные белки могут быть включены по отдельности или в виде гибридных белков, таких как Е7, Е2 или F5, например; конкретные варианты реализации включают VLP, содержащую L1E7 гибридные белки (документ № WO 96/11272). Конкретные антигены ВПЧ 16 содержат ранние белки Е6 или F7 в слиянии с белком D-носителем с образованием слияний белка D-E6 или Е7 из ВПЧ 16, или их комбинации; или комбинации Е6 или Е7 с L2 (документ № WO 96/26277). Альтернативно, ранние белки Е6 и Е7 ВПЧ 16 или 18 могут быть представлены в одной молекуле, например, слияние белка D-E6/E7. Композиции необязательно могут содержать один из двух или оба белка Е6 и Е7 из ВПЧ 18, например, в форме гибридного белка белок D-E6 или белок D-E7 или гибридного белка белок D-E6/E7. Композиции могут дополнительно содержать антигены из других штаммов ВПЧ, например, из штаммов ВПЧ 31 или 33.

[00160] Антигены также можно получать из паразитов, которые вызывают малярию. Например, антигены из Plasmodia falciparum включают RTS,S и TRAP. RTS представляет собой гибридный белок, содержащий по существу весь С-концевой фрагмент белка спорозоита (CS) Р.falciparum, связанную посредством четырех аминокислот preS2 фрагмента поверхностного антигена гепатита В с поверхностным (S) антигеном вируса гепатита В. Его полная структура описана в международной заявке на патент № РСТ/ЕР92/02591, опубликованной как документ № WO 93/10152, испрашивающей приоритет на основании заявки на патент Великобритании №9124390.7. При экспрессии в дрожжах RTS продуцируется как липопротеидная частица, а при совместной экспрессии с S антигеном из HBV он продуцирует смешанную частицу, известную как RTS,S.

[00161] TRAP антигены описаны в международной заявке на патент № PCT/GB89/00895, опубликованной как документ № WO 90/01496. Вариант реализации настоящего изобретения представляет собой малярийную вакцину, где антигенный препарат содержит комбинацию RTS,S и TRAP антигенов. Другими плазмодийными антигенами, которые являются вероятными кандидатами в компоненты малярийной вакцины, обеспечивающей защиту на разных стадиях жизненного цикла, являются P. faciparum MSP1, АМА1, MSP3, ЕВА, GLURP, RAP1, RAP2, секвестрин, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 и их аналоги в Plasmodium spp.

[00162] В одном из вариантов реализации антиген получают из раковых клеток, что может быть полезно для иммунотерапевтического лечения рака. Например, антиген может представлять собой антиген отторжения опухоли, такой как рак предстательной железы, рак молочной железы, колоректальный рак, рак легких, рак поджелудочной железы, рак почки или меланома. Приведенные в качестве примера раковые или полученные из раковых клеток антигены включают MAGE 1, 3 и MAGE 4 или другие MAGE антигены, такие как описанные в документе № WO 99/40188, PRAME, BAGE, Lage (также известный как NY Eos 1) SAGE и HAGE (документ № WO 99/53061) или GAGE (Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293). Указанные неограничивающие примеры раковых антигенов экспрессируются в широком диапазоне типов опухолей, таких как меланома, карцинома легких, саркома и карцинома мочевого пузыря. См., например, патент США №6544518.

[00163] Другие опухолеспецифические антигены включают, но не ограничиваются ими, опухолеспецифические или связанные с опухолью ганглиозиды, такие как GM₂ и GM₃ или их конъюгаты с белками-носителями; или аутопептидный гормон, такой как полноразмерный гонадотропин-рилизинг-гормон (GnRH, документ № WO 95/20600), короткий пептид длиной 10 аминокислот, подходящий для лечения многих видов рака. В другом варианте реализации применяют простатические антигены, такие как простатоспецифический антиген (ПСА), PAP, PSCA (например, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), PSMA или, в одном из вариантов реализации, антиген, известный как простаза (например, Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119; документ № WO 98/12302; патент США №5955306; документ № WO 98/20117; патенты США №№5840871 и 5786148; документ № WO 00/04149. Другие простатоспецифические антигены известны из документов №№ WO 98/137418 и WO/004149. Другой простатоспецифический антиген представляет собой STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).

[00164] Другие связанные с опухолью антигены, полезные в контексте настоящего изобретения, включают: Plu-1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70, патент США №5654140) и криптин (патент США №5981215). Кроме того, антигены, особенно подходящие для вакцин при терапии рака, также включают тирозиназу и сурвивин.

[00165] В некоторых вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению особенно подходят для лечения пожилых пациентов и/или пациентов с ослабленным иммунитетом, включая субъекты с диализом почек, субъекты, проходящие химиотерапию и/или лучевую терапию, реципиентов трансплантатов и т.п. Такие индивидуумы обычно проявляются ослабленные иммунные ответы на вакцины, и поэтому применение композиций согласно настоящему изобретению может усиливать иммунные ответы, получаемые у указанных субъектов.

[00166] В других вариантах реализации агенты, применяемые в композициях согласно настоящему изобретению, содержат антигены, связанные с респираторными заболеваниями, такими как заболевания, вызываемые или усугубляемые бактериальной инфекцией (например, пневмококковой), для профилактики и лечения состояний, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). ХОБЛ определяется физиологически наличием необратимой или частично обратимой обструкции дыхательных путей у пациентов с хроническим бронхитом и/или эмфиземой (Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov; 152 (5 Pt 2):S77-121). Обострения ХОБЛ часто вызываются бактериальной (например, пневмококковой) инфекцией (Clin Microbiol Rev. 2001 Apr; 14 (2):336-63).

Полинуклеотиды

[00167] В некоторых вариантах реализации агент представляет собой полинуклеотид. Полинуклеотид включает, но не ограничивается ими, ДНК, РНК, аптамер или олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид представляет собой ДНК. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид представляет собой РНК. В некоторых вариантах реализации ДНК или РНК являются одноцепочечными или двухцепочечными. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид представляет собой некодирующую РНК. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид представляет собой кодирующую РНК. В некоторых вариантах реализации РНК выбран из группы, состоящей из репликона РНК, мРНК, тРНК, миРНК, короткой РНК, образующей шпильки, и микроРНК.

[00168] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид кодирует полипептид. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид кодирует полипептид, который представляет собой антиген или содержит антиген. В некоторых вариантах реализации полипептид, кодируемый полинуклеотидом, представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах реализации полипептид, кодируемый полинуклеотидом, представляет собой LecA. В некоторых вариантах реализации полипептид, кодируемый полинуклеотидом, представляет собой H5N1. В некоторых вариантах реализации полипептид, кодируемый полинуклеотидом, представляет собой ID93.

[00169] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид представляет собой репликон. В некоторых вариантах реализации репликон представляет собой плазмиду, космиду, бакмиду, фаг или вирус, которые способны к саморегулируемой в значительной степени репликации. В некоторых вариантах реализации репликон представляет собой РНК или ДНК. В некоторых вариантах реализации репликон является одно- или двухцепочечным. В некоторых вариантах реализации репликон получают из РНК-вируса.

Адъюванты

[00170] В некоторых вариантах реализации композиции, предложенные в настоящем изобретении, дополнительно содержат адъювант, отличный от агониста TLR. В некоторых вариантах реализации адъювант выбран из группы, состоящей из AS-2, монофосфориллипида А, 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида A, IFA, QS21, CWS, ТОМ, AGPs, CpG-содержащих олигонуклеотидов, агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR), Leif, сапонинов, миметиков сапонинов, биологического и синтетического липида А, имиквимода, гардиквимода, резиквимода, поли И:Ц, флагеллина, GLA, SLA, стингина и их комбинаций.

Организмы

[00171] В некоторых вариантах реализации композиции, предложенные в настоящем изобретении, содержат организм. Например, Entamoeba histolytica, вирус, вызывающий грипп, или бактерии Mycobacterium tuberculosis, которые вызывают туберкулез (ТВ). В настоящее время вакцинация живыми бактериями является наиболее эффективным способом индукции защитного иммунитета против туберкулеза. Наиболее распространенной микобактерией, применяемой с указанной целью, является бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ), авирулентный штамм бычьей микобактерии. Таким образом, в некоторых вариантах реализации композиция содержит микобактерию.

[00172] В некоторых вариантах реализации агент представляет собой вирус или вирусные геном. Таким образом, в указанных вариантах реализации композиции содержат вирус или вирусный геном.

Агонисты TLR

[00173] Как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложены композиции и иммунологические адъювантные композиции, включая фармацевтические композиции, которые содержат один или более агонистов Toll-подобных рецепторов (агонистов TLR). Toll-подобные рецепторы (TLR) включают трансмембранные рецепторы клеточной поверхности врожденной иммунной системы, которые придают клеткам-хозяевам способность распознавания на ранней стадии множества консервативных микробных молекулярных структур, которые могут присутствовать в большом количестве инфекционных патогенов или на них (например, Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8): reviews 3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect. 6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102).

[00174] Индукция TLR-опосредованной передачи сигнала для усиления инициации иммунных ответов посредством врожденной иммунной системы может зависеть от агонистов TLR, которые соединяются с TLR поверхности клеток. Например, липополисахарид (ЛПС) может являться агонистом TLR, действующие на TLR2 или TLR4 (Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206); поли(инозин-цитидин) (поли И:Ц) может являться агонистом TLR, действующие на TLR3 (Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119); пептидогликаны могут являться агонистами TLR2 и/или TLR6 (Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174:1566); 3M003 (4-амино-2-(этоксиметил)-α,α-диметил-6,7,8,9-тетрагидро-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-этанола гидрат, мол. масса 318 Да производства 3М Pharmaceuticals, St. Paul, MN, который также является источником родственных соединений 3М001 и 3М002; Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259), может являться агонистом TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) и/или агонистом TLR8 (Johansen 2005); флагеллин может являться агонистом TLR5 (Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487); и антигены гепатита С могут действовать, как агонисты TLR, действующие на TLR7 и/или TLR9 (Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724). Другие агонисты TLR известны (например, Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198) и могут применяться в соответствии некоторыми вариантами реализации, описанными в настоящем документе.

[00175] В различных вариантах реализации агонист TLR может представлять собой агонист TLR2, агонист TLR3, агонист TLR4, агонист TLR5, агонист TLR6, агонист TLR7, агонист TLR8, агонист TLR7/8, агонист TLR9 или их комбинации.

Рекомбинантная экспрессионная конструкция

[00176] В соответствии с некоторыми вариантами реализации, описанными в настоящем документе, композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать по меньшей мене одну рекомбинантную экспрессионную конструкцию, которая содержит промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген. В некоторых других вариантах реализации рекомбинантная экспрессионная конструкция присутствует в вирусном векторе, таком как вектор на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса, герпесвируса, лентивируса, поксвируса или ретровируса. В данной области техники известны композиции и способы получения и применения таких экспрессионных конструкций и векторов для экспрессии полипептидных антигенов, как предложено в настоящем документе, например, в соответствии с Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NY. Неограничивающие примеры рекомбинантных экспрессионных конструкций, как правило, можно найти, например, в патентах США №№6844192; 7037712; 7052904; 7001770; 6106824; 5693531; 6613892; 6875610; 7067310; 6218186; 6783981; 7052904; 6783981; 6734172; 6713068; 5795577 и 6770445, и в других документах с описаниями, которые могут быть адаптированы для экспрессии полипептидных антигенов, как предложено в настоящем документе, для применения в некоторых вариантах реализации, описанных в настоящем документе.

Иммунный ответ

[00177] Таким образом, в настоящем изобретении предложены композиции для изменения (например, усиления или ослабления статистически значимым образом, например, относительно соответствующего контроля, как понятно специалистам в данной области техники) иммунных ответов у хозяина, способного производить иммунный ответ. Как известно специалистам в данной области, иммунным ответом может являться любое активное изменение иммунного статуса хозяина, которое может включать любое изменение в структуре или функции одной или нескольких тканей, органов, клеток или молекул, которые участвуют в поддержании и/или регуляции иммунного статуса хозяина. Как правило, иммунные ответы могут быть выявлены любым из ряда хорошо известных параметров, включая, но не ограничиваясь ими, in vivo или in vitro определение: растворимых иммуноглобулинов или антител; растворимых медиаторов, таких как цитокины, лимфокины, хемокины, гормоны, факторы роста и т.п., а также других растворимых низкомолекулярных пептидных, углеводных, нуклеотидных и/или липидных медиаторов; клеточных активационных изменений состояния, определенных по измененным функциональным или структурным свойствам клеток иммунной системы, например, клеточной пролиферации, измененной подвижности, индукции специализированных активностей, таких как специфическая генная экспрессия или цитолитическое действие; клеточной дифференцировки клетками иммунной системы, включая измененные профили экспрессии поверхностных антигенов или наступление апоптоза (запрограммированной гибели клеток); или любого другого критерия, по которому может быть выявлено наличие иммунного ответа.

[00178] Иммунные ответы часто можно рассматривать, например, как способность клеток и тканей иммунной системы хозяина различать свои и чужие структуры на молекулярном и клеточном уровнях, но настоящее изобретение не должно ограничиваться этим. Например, иммунные ответы также могут включать изменения состояния иммунной системы, которые возникают в результате иммунного распознавания своих молекул, клеток или тканей и могут сопровождать множество нормальных состояний, таких как типичная регуляция компонентов иммунной системы, или могут присутствовать при патологических состояниях, таких как неадекватные аутоиммунные ответы, наблюдаемые при аутоиммунных и дегенеративных заболеваниях. В качестве другого примера, в дополнение к индукции повышающей регуляцией специфических активностей иммунной системы (таких как продуцирование антител и/или цитокинов или активация опосредованного клетками иммунитета) иммунные ответы также могут включать супрессию, ослабление или любую другую понижающую регуляцию выявляемого иммунитета, которые могут являться следствием выбранного антигена, способа введения антигена, индукции специфической толерантности или других факторов.

[00179] Определение индукции иммунного ответа вакцинами согласно настоящему изобретению может быть осуществлено любым из ряда хорошо известных иммунологических анализов, знакомых специалисту в данной области техники. Такие анализы включают, но не ограничиваются ими, in vivo или in vitro определение: растворимых антител; растворимых медиаторов, таких как цитокины, лимфокины, хемокины, гормоны, факторы роста и т.п., а также других растворимых низкомолекулярных пептидных, углеводных, нуклеотидных и/или липидных медиаторов; клеточных активационных изменений состояния, определенных по измененным функциональным или структурным свойствам клеток иммунной системы, например, клеточной пролиферации, измененной подвижности, индукции специализированных активностей, таких как специфическая генная экспрессия или цитолитическое действие; клеточной дифференцировки клетками иммунной системы, включая измененные профили экспрессии поверхностных антигенов или наступление апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Процедуры для выполнения указанных и подобных анализов широко известны и могут быть найдены, например, в Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; см. также Current Protocols in Immunology; см. также, например, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green and Reed, 1998 Science 281:1309 и ссылки, приведенные в указанных документах).

[00180] Определение пролиферации антиген-реактивных Т-клеток можно проводить при помощи множества известных способов. Например, Т-клеточную пролиферацию можно определять путем измерения интенсивности синтеза ДНК, а антигенную специфичность можно определять путем регулирования стимулирующего воздействия (такого как, например, сенсибилизированные специфическим целевым антигеном или контрольным антигеном антигенпрезентирующие клетки), которому подвергают Т-клетки, реактивные в отношении кандидатных антигенов. Т-клетки, которые стимулировали к пролиферации, демонстрируют повышенную интенсивность синтеза ДНК. Типичным способом измерения интенсивности синтеза ДНК является, например, способ импульсного мечения культур Т-клеток тритированным тимидином, нуклеозидным предшественником, который включается во вновь синтезирующуюся ДНК. Количество включенного тритированного тимидина можно определять с применением жидкостного сцинтилляционного спектрофотометра. Другие способы определения Т-клеточной пролиферации включают измерение повышений в продуцировании интерлейкина-2 (IL-2), потоке Са²⁺ или поглощении красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий. Альтернативно, можно измерять синтез лимфокинов (таких как интерферон-гамма) или можно количественно определять относительное число Т-клеток, которые могут отвечать за конкретный антиген.

[00181] Определение продуцирования антиген-специфических антител можно проводить, например, путем анализа образца (например, содержащего иммуноглобулин образца, такого как сыворотка, плазма или кровь) от хозяина, обработанного вакциной в соответствии с настоящим изобретением с применением in vitro способов, таких как радиоиммуноанализ (RIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), равновесный диализ или иммуноблоттинг на твердой фазе, включая вестерн-блоттинг. В предпочтительных вариантах реализации анализы ELISA могут дополнительно включать иммобилизацию при помощи антигенной ловушки антигена-мишени на твердой фазе с моноклональным антителом, специфическим к антигену, например, для усиления чувствительности анализа. Выработку растворимых медиаторов (например, цитокинов, хемокинов, лимфокинов, простагландинов и т.д.) также можно легко определять путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), например, с применением способов, устройств и реагентов, которые легко доступны из коммерческих источников (например, Sigma, St. Louis, МО; см. также R & D Systems 2006 Catalog, R & D Systems, Minneapolis, MN).

[00182] Множество других иммунологических параметров можно контролировать с применением обычных анализов, которые хорошо известны в данной области техники. Они могут включать, например, анализы антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), вторичные антительные ответы in vitro, проточный иммуноцитофлуориметрический анализ различных субпопуляций клеток периферической крови или лимфоидных мононуклеарных клеток с применением общепринятых систем маркерных антигенов, иммуногистохимию или другие подходящие анализы. Указанные и другие анализы можно найти, например, в Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5^th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.

[00183] Соответственно, предполагается, что вакцинные и адъювантные композиции, предложенные в настоящем документе, будут способны индуцировать или усиливать у хозяина по меньшей мере один иммунный ответ, выбранный из Т-лимфоцитарного ответа T_H1-типа, Т-лимфоцитарного ответа T_H2-типа, цитотоксического Т-лимфоцитарного (CTL) ответа, антительного ответа, цитокинового ответа, лимфокинового ответа, хемокинового ответа и воспалительного ответа. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ может включать по меньшей мере одно из продуцирования одного или множества цитокинов, где цитокин выбран из интерферона-гамма (IFN-γ), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), продуцирования одного или множества интерлейкинов, где интерлейкин выбран из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 и IL-23, продуцирования одного или множества хемокинов, где хемокин выбран из MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL4 и CCL5, и лимфоцитарного ответа, который выбран из ответа Т-клеток памяти, ответа В-клеток памяти, ответа эффекторных Т-клеток, ответа цитотоксических Т-клеток и ответа эффекторных В-клеток. См., например, документы №№ WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; патенты США №№ U.S. 6692752; U.S. 7084256; U.S. 6977073; U.S. 6749856; U.S. 6733763; U.S. 6797276; U.S. 6752995; U.S. 6057427; U.S. 6472515; U.S. 6309847; U.S. 6969704; U.S. 6120769; U.S. 5993800; U.S. 5595888; Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6951; Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53; Beutler et al., 1986 Nature 320:584; патенты США №№ U.S. 6991791; U.S. 6654462; U.S. 6375944.

Фармацевтические композиции

[00184] В настоящем документе предложены фармацевтические композиции (включая фармацевтические композиции), содержащие композиции, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вещество-носитель, вспомогательное вещество или разбавитель. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой вакцинную композицию. Композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту для стимулирования иммунного ответа у субъекта (включая неспецифический ответ или антиген-специфический ответ). В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой млекопитающее (например, животное, включая сельскохозяйственных животных (коров, свиней, коз, лошадей и т.д.) и домашних животных (кошек, собак и т.д.) или человека). В одном из вариантов реализации субъект представляет собой человека. В другом варианте реализации субъект представляет собой млекопитающее, отличное от человека. В другом варианте реализации млекопитающее, отличное от человека, представляет собой собаку, корову или лошадь. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой теплокровное животное.

[00185] Фармацевтические композиции обычно содержат композиции, описанные в настоящем документе, и могут дополнительно содержать один или более компонентов, представленных в настоящем документе, которые выбраны из антигена, дополнительных агонистов TLR или рекомбинантной экспрессионной конструкции, в комбинации с фармацевтически приемлемым веществом-носителем, вспомогательным веществом или разбавителем.

[00186] Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к "монотерапии" агонистом TLR7/8 или агонистом TLR4, где агонист TLR7/8 или агонист TLR4, описанные в настоящем документе, получают в виде композиции, которая по существу не содержит других антигенов и которую вводят субъекту для стимулирования иммунного ответа, например, неспецифического иммунного ответа, для лечения или предотвращения заболевания или другого состояния, такого как инфицирование организмом. В других аспектах настоящее изобретение относится к агонисту TLR7/8 или агонисту TLR4 в композиции, которая по существу не содержит других антигенов и которую вводят субъекту для стимулирования иммунного ответа, например, неспецифического иммунного ответа, для лечения или предотвращения заболевания или другого состояния, такого как инфицирование организмом. В одном из вариантов реализации, например, композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для стимулирования иммунного ответа у субъекта. В другом варианте реализации GLA представлен в виде спрея, необязательно представляемого в наборе.

[00187] В некоторых других вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой вакцинную композицию, которая содержит композиции, описанные в настоящем документе, и антиген и может дополнительно содержать один или более компонентов, представленных в настоящем документе, которые выбраны из других агонистов TLR и аналогичных соединений и/или рекомбинантной экспрессионной конструкции, в комбинации с фармацевтически приемлемым веществом-носителем, вспомогательным веществом или разбавителем. Иллюстративные вещества-носители являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях.

[00188] Иллюстративные вещества-носители являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Для вакцин, содержащих агонист TLR7/8 или агонист TLR4 и антиген, вводят от примерно 0,01 мкг/кг до примерно 100 мг/кг массы тела, как правило, путем внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного способов введения или путем других способов.

[00189] Предпочтительная доза составляет от примерно 1 мкг/кг до примерно 1 мг/кг, при этом доза от примерно 5 мкг/кг до примерно 200 мкг/кг является особенно предпочтительной. Специалистам в данной области техники понятно, что количество и частота введения зависит от ответа хозяина. "Фармацевтически эффективные вещества-носители" для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Например, можно применять стерильный солевой раствор и забуференный фосфатом солевой раствор при физиологическом рН. В фармацевтической композиции могут присутствовать консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизаторы. Например, в качестве консервантов можно добавлять бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры n-гидроксибензойной кислоты. Там же, стр. 1449. Кроме того, можно применять антиоксиданты и суспендирующие агенты. Там же.

[00190] Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям соединений согласно настоящему изобретению, полученным из комбинации таких соединений и органической или неорганической кислоты (соли присоединения кислоты) или органического или неорганического основания (соли присоединения оснований). Композиции согласно настоящему изобретению можно применять как в форме свободного основания, так и в форме соли, при этом обе формы включены в объем настоящего изобретения.

[00191] Фармацевтические композиции могут находиться в любой форме, которая позволяет вводить композицию пациенту. Например, композиция может находиться в форме твердого вещества, жидкости или газа (аэрозоля). Типичные способы введения включают, без ограничения, пероральный, местный, парентеральный (например, сублингвально или буккально), сублингвальный, ректальный, вагинальный и интраназальный (например, в виде спрея). В настоящем документе термин "парентеральный" включает ионтофоретическое (например, патенты США №№7033598; 7018345; 6970739), сонофоретическое (например, патенты США №№4780212; 4767402; 4948587; 5618275; 5656016; 5722397; 6322532; 6018678), термальное (например, патенты США №№5885211; 6685699), пассивное трансдермальное (например, патенты США №№3598122; 3598123; 4286592; 4314557; 4379454; 4568343; 5464387; патент Великобритании №2232892; патенты США №№6871477; 6974588; 6676961) введение, введение при помощи микроиглы (например, патенты США №№6908453; 5457041; 5591139; 6033928), а также подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинные, внутривенные, внутриоболочечные, интрамеатальные, внутриуретральные способы инъекции или инфузии. В конкретном варианте реализации композицию, описанную в настоящем документе (включая вакцинные и фармацевтические композиции), вводят внутрикожно при помощи способа, выбранного из ионтофореза, микрокавитации, сонофореза или введения при помощи микроигл.

[00192] Фармацевтическую композицию составляют таким образом, чтобы сделать содержащиеся в ней активные ингредиенты биодоступными после введения композиции пациенту. Композиции, которые подлежат введению пациенту, принимают форму одной или более дозированных лекарственных форм, где, например, таблетка может представлять собой стандартную лекарственную форму, а емкость с одним или более соединениями согласно настоящему изобретению в форме аэрозоля может содержать множество дозированных лекарственных форм.

[00193] В случае перорального введения могут присутствовать вспомогательное вещество и/или связующее вещество. Примеры представляют собой сахарозу, каолин, глицерин, декстрины из крахмала, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу и этилцеллюлозу. Могут присутствовать окрашивающие агенты и/или ароматизаторы. Можно применять покровную оболочку.

[00194] Композиция может находиться в форме жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. В качестве двух примеров, жидкость можно применять для перорального введения или для доставки путем инъекции. Если предполагается пероральное введение, предпочтительные композиции содержат один или более из подсластителя, консервантов, красителя/окрашивающего агента и усилителя вкуса. В композицию, предполагаемую для введения путем инъекции, можно включать одно или более из поверхностно-активного вещества, консерванта, увлажнителя, диспергатора, суспендирующего агента, буфера, стабилизатора и изотонического агента.

[00195] Применяемая в настоящем документе жидкая фармацевтическая композиция, в форме раствора, суспензии или другой подобной форме, может содержать один или более следующих веществ-носителей или вспомогательных веществ: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический солевой раствор, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия, жирные масла, такие как сквален, сквалан, минеральное масло, моноолеат маннида, холестерин и/или синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат можно помещать в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократного применения, сделанные из стекла или пластика. Инъекционная фармацевтическая композиция предпочтительно является стерильной.

[00196] В другом варианте реализации композиция согласно настоящему изобретению составлена таким образом, что ее можно распылять.

[00197] Также может быть желательный включать в вакцинную или фармацевтическую композицию другие компоненты, такие как носители для доставки, включая, но не ограничиваясь ими, соли алюминия, эмульсии типа "вода-в-масле", биоразлагаемые масляные основы, эмульсии типа "масло-в-воде", биоразлагаемые микрокапсулы и липосомы. Примеры дополнительных иммуностимулирующих веществ (коадъювантов) для применения в указанных носителях также описаны выше и могут включать N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (MDP), глюкан, IL-12, ГМ-КСФ, интерферон-гамма и IL-12.

[00198] Хотя в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению можно применять любое подходящее вещество-носитель, известное специалистам в данной области техники, тип носителя варьируется в зависимости от способа введения и того, желательно ли замедленное высвобождение. В случае парентерального введения, такого как подкожная инъекция, вещество-носитель предпочтительно включает воду, солевой раствор, спирт, жир, воск или буфер. В случае перорального введения можно применять любое из указанных выше веществ-носителей или твердофазный носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Также в качестве веществ-носителей для композиций согласно настоящему изобретению можно применять биоразлагаемые микросферы (например, галактид полимолочной кислоты). Подходящие биоразлагаемые микросферы описаны, например, в патентах США №№4897268 и 5075109. При этом предпочтительно, чтобы микросфера имела диаметр больше, чем примерно 25 микрон.

[00199] Фармацевтические композиции также могут содержать разбавители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды, белки, аминокислоты, углеводы, включая глюкозу, сахарозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, глутатион и другие стабилизаторы и вспомогательные вещества. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином, представляют собой типичные подходящие разбавители. Предпочтительно, продукт может быть составлен в виде лиофилизата с применением растворов подходящих вспомогательных веществ (например, сахарозы) в качестве разбавителей.

[00200] Как описано выше, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает композиции, способные доставлять молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих целевые антигены. Такие композиции включают рекомбинантные вирусные векторы (например, ретровирусы (см. документы №№ WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 и WO 94/03622), аденовирус (см. Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134, 1993; и Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994), поксвирус (см. патент США №4769330; патент США №5017487 и документ № WO 89/01973)), молекулы рекомбинантной экспрессионной ДНК-конструкции в комплексе с поликатионной молекулой (см. документ № WO 93/03709) и ассоциированные с липосомами нуклеиновые кислоты (см. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987). В некоторых вариантах реализации ДНК может быть соединена с убитым или инактивированным аденовирусом (см. Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). Другие подходящие композиции включают комбинации ДНК-лиганд (см. Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989) и липид-ДНК (см. Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989).

[00201] В дополнение к прямым процедурам in vivo можно применять процедуры ex vivo, в которых клетки извлекают из хозяина, модифицируют и помещают в то же самое или другое животное-хозяина. Очевидно, что в контексте введения ex vivo молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антиген, в клетки ткани можно применять любую из указанных выше композиций. Протоколы для вирусных, физических и химических способов введения хорошо известны в данной области техники.

[00202] Соответственно, настоящее изобретение подходит для усиления или индукции иммунного ответа у хозяина, пациента или в клеточной культуре. В настоящем документе термин "пациент" относится к любому теплокровному животному, предпочтительно человеку. Пациент может страдать от инфекционного заболевания, рака, такого как рак молочной железы, или аутоиммунного заболевания, или может находиться в норме (например, не иметь определяемого заболевания и/или инфекции). Термин "клеточная культура" представляет собой любой препарат, содержащий иммунокомпетентные клетки или выделенные клетки иммунной системы (включая, но не ограничиваясь ими, Т-клетки, макрофаги, моноциты, В-клетки и дендритные клетки). Такие клетки можно выделять при помощи любого из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области техники (например, центрифугирование в градиенте плотности Ficoll-Hypaque). Клетки могут быть (но не обязательно) выделены из пациента, страдающего от рака, и могут быть введены пациенту после обработки.

[00203] В некоторых вариантах реализации жидкая композиция, предназначенная для парентерального или перорального введения, должна содержать количество вакцинной композиции, требуемое для получения подходящей дозировки. Как правило, указанное количество составляет по меньшей мере 0,01 масс. % антигена в композиции. В случае перорального введения указанное количество может варьироваться от 0,1 до примерно 70 масс. % композиции. Предпочтительные пероральные композиции содержат от примерно 4% до примерно 50% антигена. Предпочтительные композиции и препараты готовят таким образом, что парентеральная лекарственная форма содержит от 0,01 до 1 масс. % активной композиции.

[00204] Фармацевтическая композиция может быть предназначена для местного введения, и в этом случае вещество-носитель может подходящим образом содержать основу раствора, эмульсии, мази или геля. Например, основа может содержать один или более из следующих компонентов: вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, пчелиный воск, минеральное масло, разбавители, такие как вода и спирт, эмульгаторы и стабилизаторы. В фармацевтической композиции для местного введения могут присутствовать загустители. В случае чрескожного введения композиция может включать чрескожный пластырь или устройство для ионтофореза. Составы для местного введения могут содержать концентрацию антигена (например, вакцинная композиция с GLA-антигеном) или GLA (например, иммунологическая адъювантная композиция; GLA производства Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; например, продукт №699800) от примерно 0,1 до примерно 10 масс. %/об. (масса на единицу объема).

[00205] Композиция может быть предназначена для ректального введения, например, в форме суппозитория, который плавится в прямой кишке и высвобождает лекарственное средство. Композиция для ректального введения может содержать масляную основу в качестве подходящего вспомогательного вещества, не вызывающего раздражения. Такие основы включают, без ограничения, ланолин, масло какао и полиэтиленгликоль. В способах согласно настоящему изобретению вакцинные композиции/адъюванты можно вводить путем применения вкладки(ок), гранул(ы), состава(ов) с замедленным высвобождением, пластыря(ей) или состава(ов) с быстрым высвобождением.

[00206] В некоторых вариантах реализации также предусмотрены наборы, содержащие описанные в настоящем документе вакцинные композиции и/или иммунологические адъювантные композиции, которые могут быть представлены в одной или более емкостях. В одном из вариантов реализации все компоненты вакцинных композиций и/или иммунологических адъювантных композиций присутствуют вместе в одной емкости, но варианты реализации не ограничиваются таким ограничением и также предполагают наличие двух или более емкостей, в которых, например, иммунологическая адъювантная композиция отделена от антигенного компонента и не контактирует с ним. Не ограничиваясь теорией, полагают, что в некоторых случаях преимущественным может являться введение только иммунологической адъювантной композиции, тогда как в других случаях такое введение может являться преимущественным при временном и/или пространственном (например, в анатомически разные места) разделении относительно введения антигена, тогда как в других случаях субъекту преимущественно проводят введение вакцинной композиции, описанной в настоящем документе и содержащей антиген и адъювантную композицию, а также необязательно другие компоненты, описанные в настоящем документе.

[00207] Емкость в соответствии с указанными вариантами реализации наборов может представлять собой любую подходящую емкость, баллон, флакон, ампулу, пробирку, чашку, коробку, бутылку, колбу, сосуд, лоток, лунку однолуночного или многолуночного устройства, резервуар, бак и т.п. или другое устройство, в котором описанные в настоящем документе композиции могут размещаться, храниться и/или транспортироваться и легко извлекаться. Как правило, такая емкость может быть изготовлена из материала, который совместим с предполагаемым применением, и она представляет собой емкость, из которой можно легко извлекать содержимое. Предпочтительные примеры таких емкостей включают стеклянные и/или пластиковые герметичные или повторно герметизируемые пробирки и ампулы, включая содержащие резиновую диафрагму или другие герметизирующие средства, которые совместимы с извлечением содержимого с применением иглы или шприца. Например, такие емкости могут быть изготовлены из стекла или химически совместимого пластика или смолы, которые могут быть сделаны из, или могут быть покрыты материалом, который позволяет эффективно извлекать материал из емкости и/или защищает материал, например, от разрушающих условий, таких как ультрафиолетовый свет или перепады температур, или от попадания нежелательных контаминантов, включая микробные контаминанты. Емкости предпочтительно являются стерильными или стерилизуемыми и изготовлены из материалов, которые совместимы с любым веществом-носителем, вспомогательным веществом, растворителем, носителем и т.п., которые можно применять для суспендирования или растворения описанных в настоящем документе вакцинных композиций и/или иммунологических адъювантных композиций, и/или антигенов, и/или рекомбинантных экспрессионных конструкций и т.п.

[00208] Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. АДСОРБЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ЛИГАНДА TLR7/8 НА ОКСИГИДРОКСИДЕ АЛЮМИНИЯ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ АДЪЮВАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

Краткое описание

[00209] Уже почти в течение века соли алюминия являются наиболее широко применяемыми вакцинными адъювантными составами и, таким образом, имеют подтвержденную временем безопасность и эффективность. Тем не менее, в случае чрезвычайно сложных болезней, таких как туберкулез или ВИЧ, адъювантная активность солей алюминия может являться недостаточно сильной для достижения защитной эффективности. Адсорбция лигандов TLR на солях алюминия способствует усиленной адъювантной активности, например, в вакцине против вируса папилломы человека Cervarix®. Тем не менее, некоторые лиганды TLR, такие как имидазохинолины агонисты TLR7/8, не способны эффективно адсорбироваться на солях алюминия. В настоящем изобретении описан способ получения, позволяющий решить указанную проблему путем получения наносуспензия синтетического лиганда TLR7/8 (например, 3М-052) на основе липидов, которая облегчает адсорбцию на солях алюминия благодаря структурным свойствам применяемого вспомогательного липида. В случае иммунизированных мышей, адсорбированного на оксигидроксиде алюминия состава антитела, усиленного 3М-052, и клеточных иммунных ответов TH1-типа на вакцинные антигены для туберкулеза и ВИЧ.

[00210] В настоящем изобретении указано, что структурные свойства вспомогательных липидов могут способствовать адсорбции лигандов PRR на солях алюминия без изменения химической структуры лиганда PRR, когда лиганд PRR сначала получают в виде водной наносуспензии с вспомогательным липидом. Кроме того, универсальность способа может позволить адсорбцию одного и того же лиганда PRR на различные типы солей алюминия в зависимости от структуры вспомогательного липида, с которым он образует комплекс. В настоящем изобретении предложен способ получения, включающий получение наносуспензии для контролирования адсорбционных взаимодействий между синтетическим лигандом TLR7/8 3М-052 (5) и солями алюминия для получения вакцинного адъювантного состава, который усиливает антительную и клеточную иммуногенность соадсорбированных рекомбинантных туберкулезных или ВИЧ вакцинных антигенов.

Материалы и способы

[00211] Материалы адъювантных составов. Синтетический 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (DLPG), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (DMPG), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (DPPG), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (DSPG), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (DOPG), 1,2-дистеароил-3-триметиламмонийпропан (DSTAP), 1,2-дипальмитоил-3-триметиламмонийпропан (DPTAP) и глюкопиранозил-липидный адъювант (GLA, также известный, как PHAD®) приобретали в Avanti Polar Lipids Inc (Alabaster, AL). Полисорбат 80 приобретали в J.Т. Baker (San Francisco, CA). Полоксамер 188 приобретали в Spectrum Chemical (Gardena, CA). Солевой раствор (0,9 масс. %/об.) приобретали в Teknova (Hollister, CA). TLR9 CpG контроль приобретали в Avecia (Milfrod, MA). Alhydrogel® '85' и AdjuPhos® приобретали в E.M. Sergeant Pulp & Chemical Co. (Clifton, NJ). ВИЧ gp120 антиген упоминается в Fouts et al. ("Expression and Characterization of a Single-Chain Polypeptide Analogue of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120-CD4 Receptor Complex" Virol. vol. 74, no. 24, December 2000, 11427-11436). GLA, применяемый в примерах, имел структуру формулы (III), где R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляли собой С₁₁ алкил; и R² и R⁴ представляли собой С₁₃ алкил.

[00212] Получение адъювантного состава. Водные наносуспензии получали путем диспергирования 3М-052 или GLA с липидным вспомогательным веществом в мольном отношении 1:2 (адъювант:липид) в хлороформе или смеси хлороформа, метанола и воды. Затем растворитель выпаривали с применением центрифужного испарителя Genevac EZ-2 (Stone Ridge, NY). Высушенные пленки повторно гидратировали в ультрачистой воде, а затем обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой водяной бане Crest Powersonic CP230D (Trenton, NJ) при ~60°C в течение нескольких часов или до получения полупрозрачных составов, не содержащих видимых частиц. Для получения композиций, содержащих квасцы, водные наносуспензии смешивали с Alhydrogel® или AdjuPhos®. Для проведения исследований иммуногенности рекомбинантные вакцинные антигены (ID93 или ВИЧ gp120 антиген) смешивали с наносуспензией, квасцами и указанным разбавителем.

[00213] Определение характеристик и стабильности адъювантного состава. Водные наносуспензии охарактеризовывали по размеру частиц путем динамического рассеяния света (DLS) с применением анализатора размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала Zetasizer Nano-S или -ZS производства Malvern Instruments (Worcestershire, UK). Водные наносуспензии разбавляли в воде в отношении 1:10 или 1:100 в кювете из полистирола перед началом анализа, который состоял из трех измерений, приводящих к получению среднего значения диаметра, определяемого по отклонению интенсивности рассеяния, указанного как Z-cp. Дзета-потенциал определяли с применением Zetasizer Nano-ZS с применением одноразовой капиллярной ячейки на основе девяти последовательных измерений каждого из образцов, полученных при 1:10 разбавлении в воде. В целом, концентрацию 3М-052 измеряли путем определения УФ-поглощения при 322,5 нм после 1:20 разбавления составов в смеси этанол:HCl (98:2 об./об.) и сравнения с калибровочной кривой. Разбавление органическим растворителем устраняет возможную интерференцию от рассеяния света частицами наносуспензии. Тем не менее, для изотермы связывания 3М-052, для которой желательная максимальная чувствительность, не проводили разбавление образцов или стандартов. Концентрацию TLR9 CpG контроля измеряли путем определения УФ-поглощения при 260 нм после 1:20 разбавления в смеси этанол:HCl. Концентрацию GLA измеряли путем обращенно-фазовой ВЭЖХ на С18 колонке (Atlantis Т3 или Agilent XBridge) и детектирования заряженного аэрозоля (CAD) с применением градиента подвижной фазы метанол:хлороформ:вода, как описано ранее (6). Для детектирования несвязанного лиганда TLR составы, содержащие квасцы, недолго центрифугировали, как указано, и надосадочную жидкость анализировали путем определения УФ-поглощения или при помощи ВЭЖХ-CAD. Если не указано иное, время центрифугирования составляло 5 мин при 16000 × g.

[00214] Получение крио-ПЭМ изображений. Образцы хранили в аморфном льде в перфорированных углеродных пленках на медных сетках размером 400 меш. Образцы получали путем нанесения 3 мкл капли суспензии образца на очищенную сетку, промокания фильтровальной бумаги и немедленного стеклования в жидком этане. Сетки хранили в жидком азоте до переноса на электронный микроскоп для получения изображений. Электронную микроскопию проводили с применением электронного микроскопа FEI Tecnai Т12, работающего при 120 кэВ и снабженного FEI Eagle 4k × 4k CCD камерой. Решетки аморфного льда переносили на электронный микроскоп с применением криостата, который поддерживал температуру решеток ниже -170°С. Изображения каждой из решеток получали в нескольких масштабах для оценки общего распределения образца. После определения потенциально подходящих целевых областей для получения изображений при меньших увеличениях изображения с большим увеличением получали при номинальном увеличении 110000x (0,10 нм/пиксель), 52000х (0,21 нм/пиксель) и 21000х (0,50 нм/пиксель). Изображения получали при номинальной недофокусировке -2 мкм (110000х), от -3 мкм до -2 мкм (52000х) и -5 мкм (21000х) и электронных дозах ~9-42 е/Å².

[00215] Адсорбция антигена на солях алюминия. Эффективность связывания 3М-052 и ID93 или ВИЧ gp120 антигена с Alhydrogel® и AdjuPhos® определяли путем спектроскопии в УФ и видимой областях и ДСН-ПААГ-электрофореза с применением набора для окраски гелей серебром Silver Stain. 1 мл состава получали путем смешивания солевого разбавителя, антигена, 3M-052-AF и/или соли алюминия. Для определения адсорбции ВИЧ gp120 антигена 30 мкл образца надосадочной жидкости смешивали с 10 мкл 4Х восстанавливающего или невосстанавливающего LDS буфера для образцов, после чего 20-25 мкл загружали в 10-полосный гель для ДСН-ПААГ-электрофореза с 15 мкл предварительно окрашенного стандарта SeeBlue2. Для определения адсорбции ID93 45 мкл образца надосадочной жидкости смешивали с 15 мкл 4Х восстанавливающего LDS буфера для образцов, после чего 25 мкл загружали в 10-полосный гель для ДСН-ПААГ-электрофореза с 15 мкл предварительно окрашенного стандарта SeeBlue2. Разделение в гелях проводили в течение 55 минут при 190 В, а затем гели помещали в фиксирующий раствор 50:40:10 EtOH:СН₃СООН:H₂O на ночь. Затем гели окрашивали в соответствии с указаниями, представленными Sigma-Aldrich (Saint Louis, МО) для набора ProteoSilver Plus Silver Stain Kit.

[00216] Животные и иммунизация. С57В 1/6 и B6.129S1-TLR7^tm1Flv/J (TLR7^-/-) приобретали в Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Мышей иммунизировали путем внутримышечной инъекции противотуберкулезной вакцины рекомбинантного антигена ID93 (0,5 мкг/доза) или ВИЧ gp120 антигена (10 мкг/доза) с добавлением адъюванта AdjuPhos, Alhydrogel®, 3М-052 + Alhydrogel®, 3М-052 + AdjuPhos или GLA + Alhydrogel®. Конечная доза адъюванта составляла 5 мкг GLA или 0,1-10 мкг 3М-052 с 200 мкг AdjuPhos или Alhydrogel® в 100 мклL. Мышей стимулировали через три недели после первой иммунизации. Всех мышей выдерживали в свободных от специфической патогенной микрофлоры условиях. Все процедуры были одобрены IDRI Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных.

[00217] Титры антител. Сыворотки мышей (N=5/группа) получали через 21 день после иммунизации путем отбора крови из ретроорбитального синуса в пробирки Microtainer для сбора сыворотки (VWR International, West Chester, РА) с последующим центрифугированием. Затем каждый из образцов сыворотки анализировали путем ELISA с захватом антител. Вкратце, планшеты для ELISA (Nunc, Rochester, NY) покрывали 2 мкг/мл раствором иммунизирующего антигена в 0,1 М бикарбонатном буфере и блокировали 1% раствором БСА в ФСБ. Затем в последовательном порядке и с последующим промыванием в смеси ФСБ/Tween20 на планшеты добавляли последовательно разведенные образцы сыворотки, антимышиные IgG, IgG1 или IgG2c-ПОХ (Southern Biotech, Birmingham, AL) и ABTS-H2O2 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Планшеты анализировали при 405 нм (ELX808, Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT). Конечные точки титрования рассчитывали с применением программного обеспечения Prism software V6 (GraphPad). Альтернативно, через три недели после третьей иммунизации ВИЧ gp120 антигеном отбирали жидкость вагинального смыва и анализировали на титры антител с применением тех же способов.

[00218] Внутриклеточное окрашивание цитокинов. Через одну неделю после последней иммунизации выделяли спленоциты. Красные кровяные клетки лизировали с применением буфера для лизиса красных кровяных клеток (eBioscience) и повторно суспендировали в RPMI 1640 и 10% ФБС. Клетки высеивали в количестве 2×10⁶ клеток/лунка в 96-луночные планшеты и стимулировали в течение 2 часов иммунизирующим антигеном (10 мкг/мл) или не стимулировали при 37°С. Добавляли GolgiPlug (BD Biosciences) и клетки инкубировали в течение дополнительных 8 часов при 37°С. Клетки промывали и окрашивали поверхность меченными флуорохромом антителами к CD4 (клон GK1.5), CD44 (клон IM7) и CD8 (клон 53-6.7) (BioLegend and eBioscience) в присутствии антител к CD 16/32 (клон 2.4G2) в течение 20 минут. Клетки промывали и пермеабилизировали Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) в течение 20 минут. Клетки промывали два раза Perm/Wash (BD Biosciences) и внутриклеточно окрашивали меченными флуорохромом антителами к CD154 (клон MR1), IFN-γ (клон XMG-1.2), IL-2 (клон JES6-5H4), ФНО (клон МР6-ХТ22), ГМ-КСФ (клон МР1-22Е9), IL-5 (клон TRFK5) и IL-17A (клон TC11-18Н10.1) (BioLegend and eBioscience) в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки промывали и повторно суспендировали в ФСБ. На проточном цитометре LSRFortessa (BD Biosciences) собирали до 10⁶ событий. Данные анализировали при помощи FlowJo (TreeStar). Клетки сортировали, как синглеты > лимфоциты > CD4+ CD8- > цитокин-положительные или CD44^hi > цитокин-положительные. Частоты антиген-специфических ответов определяли путем вычитания частоты положительных ответов нестимулированных клеток из антиген-стимулированных клеток.

[00219] ELISPOT исследование клеток, секретирующих антитела. Клетки, секретирующие антиген-специфические антитела, присутствующие в костном мозге, определяли количественно с применением ELISPOT исследования. За один день до начала исследования планшеты Multiscreen ELISPOT (Millipore) покрывали в количестве 1 мкг антигена/лунка и инкубировали в течение ночи. Заблокированные планшеты промывали три раза промывочным буфером (ФСБ + 0,5% Tween 20), блокировали средой для сбора клеток в течение двух часов и промывали 3 раза. Костный мозг отбирали через 21 день после иммунизации в RPMI среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС), определяли количественно с применением автоматического счетчика клеток Guava (Millipore) и повторно суспендировали до 1×10⁶ клеток/мл. Клетки последовательно разбавляли 3 раза, добавляли в планшеты и инкубировали в течение 5 часов при 37°С. Секретируемые антитела детектировали путем добавления 1:100 разбавленного комплекса пероксидазы хрена (ПОХ) с козьим антимышиным IgG антителом (Southern Biotech). Пятна визуализировали при помощи набора субстрата пероксидазы АЕС (Vector Labs) в соответствии с инструкциями производителя. Пятна определяли количественно на CTL биоанализаторе.

[00220] Врожденный иммунный ответ. Через восемнадцать часов после внутримышечной иммунизации в икроножную мышцу дренирующий подколенный лимфатический узел извлекали и диссоциировали в ФСБ, содержащем ингибиторы протеазы (Thermo Fisher Scientific). Окрашивали поверхностные антигены клеток CD8, CD90.2 (клон 53-2.1), CD19 (клон 1D3), NK1.1 (клон PK136), CD11c (клон N418), CD11b (клон M1/70), Ly6G (клон 1А8), Ly6C (HK1.4), CD69 (клон H1.2F3) и CD86 (клон GL1) в течение 20 минут во льду. Клетки промывали и пермеабилизировали Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) в течение 20 минут. Клетки промывали два раза Perm/Wash (BD Biosciences) и внутриклеточно окрашивали меченными флуорохромом антителами к IFN-γ и proIL-1β (клон NJTEN3) (BioLegend and eBioscience) в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки промывали и повторно суспендировали в ФСБ. На проточном цитометре LSRFortessa (BD Biosciences) собирали до 10⁶ событий. Данные анализировали при помощи FlowJo (TreeStar). Клетки сортировали, как синглеты > клетки > CD19+ CD90.2- (В-клетки), CD8+ CD90.2+ (CD8 Т-клетки), CD8- CD90.2+ (CD4 Т-клетки), CD8- CD19- NK1.1+ (NK-клетки), CD8- CD19- CD11c+ (DCs), CD8- CD19- CD11b+ Ly6C+ (воспалительные моноциты) или CD19-CD11b+Ly6G+ (PMNs).

[00221] Статистический анализ. Антительные и Т-клеточные ответы анализировали при помощи двухфакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки с применением программного обеспечения Prism версии 5 или более поздней (GraphPad). Сравнения, приводящие к значениям р<0,05, считали значимыми. На фигурах представляли только значимые сравнения (адъювантные группы по сравнению с отдельным антигеном; 3М-052-Alhydrogel® по сравнению с Alhydrogel®, 3M-052-AF или 3М-052-AdjuPhos®; 3М-052-AdjuPhos по сравнению с AdjuPhos® или 3M-052-AF).

Результаты

Разработка состава и определение физико-химических характеристик

[00222] Водные наносуспензии лигандов TLR получали путем добавления подходящего вспомогательного липида и приложения энергии (например, ультразвука) для уменьшения размера частиц липидного комплекса (7). Для определения вспомогательного липида, подходящего для получения наноразмерных частиц с 3М-052, рассматривали ряд фосфолипидов (фигура 1). Указанные вспомогательные липиды сначала смешивали с 3М-052 в органическом растворителе в мольном отношении 1:2 (3М-052: вспомогательный липид) в расчете на количество лигандов TLR4 (8). После выпаривания растворителя составы гидратировали и обрабатывали ультразвуком для уменьшения размера частиц до примерно<200 нм для обеспечения возможности проведения конечного стерильного фильтрования. Некоторые составы демонстрировали приемлемый размер частиц (примерно <200 нм) после получения, что определяли путем динамического рассеяния света (фигура 2А). Природа вспомогательного липида определяла размер частиц и физическую стабильность состава. Некоторые составы демонстрировали значительное увеличение размера частиц (DLPC, DOPC, полисорбат 80), что указывает на физическую нестабильность состава, тогда как другие демонстрировали небольшое изменение (DSPG, DSTAP) при хранении при 5°С в течение 2 недель (фигура 2В).

[00223] Большинство составов являлись положительно заряженными (фигура 2С), как и ожидалось, исходя из химической структуры имидазохинолинов, таких как 3М-052, которые имеют pKa ~7 (9). Тем не менее, DSPG вызывал образование анионных частиц из-за отрицательного заряда фосфатной группы в DSPG. Анионная водная суспензия представляет особый интерес с точки зрения разработки вакцинных адъювантов по причине способности адсорбироваться на оксигидроксиде алюминия. Соответственно, исследовали адсорбцию стабильных водных суспензий 3М-052 на оксигидроксиде алюминия или фосфате алюминия. При концентрации 3М-052 100 мкг/мл наблюдали эффективное связывание суспензии на основе DSPG с оксигидроксидом алюминия, но в случае суспензии 3М-052 на основе DSTAP не происходило детектируемой адсорбции на оксигидроксиде алюминия (фигура 2D, расчетный НПЧ ~5 мкг/мл). Напротив, суспензия на основе DSTAP эффективно адсорбировалась на фосфате алюминия, но не на оксигидроксиде алюминия. Таким образом, путем соответствующего выбора вспомогательного липида облегчается адсорбция водных наносуспензий 3М-052 на различные типы солей алюминия. Фосфолипиды с той же или подобной головной группой, как в DSPG, но с другой длиной ацильной цепи или степенью ненасыщенности, также способствовали образованию наносуспензий и адсорбции 3М-052 на оксигидроксиде алюминия (таблица 1).

[00224] Последующие исследования были сфокусированы на наносуспензии на основе DSPG (далее обозначаемой, как 3M-052-AF) из-за ее способности образовывать наносуспензию, которая адсорбируется на оксигидроксиде алюминия, который обычно является предпочтительной солью алюминия для анионных рекомбинантных белковых антигенов, таких как антигены, применяемые в настоящем изобретении. 3M-052-AF являлась физически стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев при 4°С, демонстрируя небольшое изменение среднего размера частиц или полидисперсности частиц (фигура 10).

[00225] Морфология 3M-052-AF, определяемая путем криогенной просвечивающей электронной микроскопии (крио-ПЭМ), свидетельствовала о довольно однородной суспензии мицеллярных структур диаметром ~5-15 нм, хотя также присутствовали более крупные частицы неправильной формы (данные не представлены). Указанные характеристики размеров могут показаться противоречащими указанному выше динамическому рассеянию света, где значения Z-cp. обычно превышали 100 нм. Тем не менее, на значение Z-cp. на основе интенсивности рассеяния света, описываемое путем динамического рассеяния света, влияет небольшая доля крупных частиц, поскольку они рассеивают больше света, чем более мелкие частицы (рассеяние света пропорционально 10⁶ диаметра частицы), что видно на фигуре 3А. Математическое преобразование распределения по размеру на основе интенсивности в распределение по размеру на основе объема указывает на большее количество частиц в диапазоне ~20 нм, хотя даже распределения по размеру на основе объема также искажаются более крупными частицами с пропорциональностью 10³. Тем не менее, распределение по размеру на основе объема 3M-052-AF больше соответствует результатам крио-ПЭМ (фигура 3В). Из-за малого размера частиц 3M-052-AF на крио-ПЭМ изображениях не отчетливо видны частицы наносуспензии, содержащие оксигидроксид алюминия (данные не представлены). Действительно, морфология частиц оксигидроксида алюминия проявляется почти одинаково независимо от присутствия 3M-052-AF, за исключением того, что кристаллические агрегаты оказываются более крупными по размеру в образце, содержащем 3M-052-AF, по сравнению с контрольным оксигидроксидом алюминия.

[00226] Для определения адсорбционной способности Alhydrogel® в отношении 3M-052-AF наносуспензию в различных концентрациях смешивали с оксигидроксидом алюминия и оставляли отстаиваться на ~30 мин с периодическим перемешиванием на вортексе, а затем центрифугировали таким образом, чтобы частицы алюминия осаждались. Затем надосадочную жидкость анализировали на содержание 3М-052 для обнаружения несвязанного материала (фигура 4). Адсорбционная способность наносуспензии составляла ~0,16 мг на мг алюминия. Дозы 3М-052, применяемые в последующих экспериментах на иммуногенность у мышей, описанных в настоящем документе, находились ниже указанного уровня. Адсорбционную способность 3M-052-AF в отношении Alhydrogel® во времени оценивали путем анализа образцов на несвязанный 3М-052 до и после хранения при 5°С в течение 16 недель. Хотя в надосадочных жидкостях контрольных образцов наблюдали частичную потерю 3М-052 (возможно указывающую на прилипание к пластиковой микроцентрифужной пробирке), не наблюдали увеличения детектируемого 3М-052 в надосадочных жидкостях образцов, содержащих квасцы, что указывает на отсутствие десорбции после 16 недель (таблица 2). Кроме того, присутствие других лигандов TLR не препятствовало адсорбции 3М-052 на оксигидроксиде алюминия, что указывает на возможность получения состава на основе квасцов, содержащего несколько адсорбированных лигандов PRR (таблица 2).

NM: не измерено

[00227] Для определения того, адсорбируется ли 3М-052 на оксигидроксиде алюминия посредством лигандного обмена или при помощи электростатического механизма, оценивали влияние на адсорбцию ионной силы, которая нейтрализует связывание, опосредованное электростатическими взаимодействиями (10). Тенденция снижения содержания 3М-052 в надосадочной жидкости контрольных образцов с увеличением концентрации хлорида натрия объясняется быстрым увеличением частицы 3M-052-AF под воздействием солевого раствора, что приводит к осаждению наносуспензий даже при отсутствии алюминия (таблица 3). Тем не менее, увеличение концентрации хлорида натрия не приводил к уменьшению связывания 3M-052-AF с оксигидроксидом алюминия.

Адъювантная биологическая активность

[00228] Для определения того, влияет ли связывание 3М-052 с оксигидроксидом алюминия на адъювантность in vivo оксигидроксида алюминия или 3M-052-AF, иммунизировали C57BL/6 мышей антигеном ID93 туберкулезной вакцины (11) с добавлением 3M-052-AF, оксигидроксида алюминия или 3M-052-AF, связанного с оксигидроксидом алюминия. Через три недели после первой иммунизации у мышей, получавших ID93+3M-052-Alhydrogel®, наблюдали самые высокие значения титров ID93-специфического общего IgG, а также подтипов IgG1 и IgG2c сыворотки, что указывает на то, что 3М-052-Alhyrogel обладает уникальными адъювантными свойствами по сравнению с 3M-052-AF или Alhydrogel® по отдельности (фигура 5А). Через один месяц после третьей иммунизации оценивали ответы CD4 Т-клеток путем стимуляции спленоцитов при помощи ID93 и измерения продуцирования цитокинов в присутствии брефельдина А путем проточной цитометрии. По сравнению с мышами, иммунизированными только ID93, мыши, иммунизированные ID93+3M-052-AF, и мыши, иммунизированные ID93+3M-052-Alhydrogel®, демонстрировали более высокие частоты экспрессирования CD154 ID93-специфическими CD4 Т-клетками. Мыши, иммунизированные ID93+3M-052-Alhydrogel®, демонстрировали наличие ТН1-клеток, которые продуцировали IFN-γ, ФНО, IL-2 и ГМ-КСФ при стимуляции ID93 (фигура 5В). Хотя некоторые последующие эксперименты подтверждали указанные результаты, некоторые партии 3M-052-AF индуцировали адъювантную активность ТН1 Т-клеток, сравнимую с 3М-052-Alhydrogel®. Одно из возможных объяснений указанного несоответствия относится к отношению фосфолипида (DSPG) к 3М-052. При применении лиганда TLR4 было показано, что систематическое изменение отношения фосфолипид : лиганд TLR4 выявило двухфазный ответ в физико-химических исследованиях, а также исследованиях биологической активности in vitro (12). Таким образом, если применяемое в настоящем документе отношение фосфолипид:3М-052 находится вблизи точки перегиба, даже незначительные изменения в способе получения или физико-химических свойствах состава могут приводить к изменениям его биологической активности.

[00229] Для определения того, изменяет ли связывание 3M-052-AF с оксигидроксидом алюминия его адъювантную активность принципиальным образом или просто изменяет его биодоступность, изучали адъювантную активность 3M-052-AF, индивидуально и при связывании с оксигидроксидом алюминия, в двух log₁₀ диапазонах доз. Через три недели после первой иммунизации адъювированным ID93 состав 3M-052-AF, адсорбированный на квасцах, последовательно демонстрировали более высокие значения титров антител сыворотки во всем диапазоне доз по сравнению как с индивидуальным Alhydrogel®, так и с аналогичным диапазоном доз 3M-052-AF (фигуры 6А и 6В). Аналогично, 3М-052-Alhydrogel® демонстрировал колоколообразный дозозависимый ответ для увеличения содержания Ш93-специфических CD4 Т-клеток с пиковым ответом на испытываемые дозы при 1 мкг. Указанные CD154 и IFN-γ ответы были значительно выше, чем ответы, демонстрируемые ID93, адъювированным оксигидроксидом алюминия или 3M-052-AF при 0,1, 1 или 10 мкг (фигуры 6С и 6D). Аналогичные дозозависимые ответы также наблюдали для ФНО и IL-2, продуцированных CD4 Т-клетками. Исходя из описанного выше, можно сделать вывод, что связывание 3M-052-AF с оксигидроксидом алюминия изменяет его адъювантную активность некоторыми способами, отличными от простого изменения биодоступности, в 1 log₁₀ диапазоне в любом направлении.

[00230] 3М-052 in vitro активирует TLR7 и TLR8 человека (5). Для определения того, являются ли указанные рецепторы врожденного иммунитета фактором адъювантной активности in vivo 3М-052-Alhydrogel®, сравнивали иммунные ответы вакцинированных мышей C57BL/6 дикого типа (WT) и мышей, лишенных TLR7 (У мышей C57BL/6 экспрессируется гипофункциональный TLR8). В качестве контроля мышей C57BL/6 и TLR7-/- иммунизировали ID93, адъювированным адъювантом GLA-квасцы с агонистом TLR4. Все иммунизированные группы характеризовались высокими значениями титров ID93-специфических IgG1 антител, независимо от адъюванта или генотипа (фигура 7А). Как 3М-052-Alhydrogel®, так и GLA-Alhydrogel® также приводили к высоким значениям титров IgG2c у мышей C57Bl/6 по сравнению с индивидуальным Alhydrogel®. В случае мышей TLR7-/- индукция IgG2c значительно снижалась у животных, иммунизированных ID93+3M-052-квасцы, тогда как ответ IgG2c на ID93+GLA-Alhdyrogel не был затронут дефицитом TLR7, что указывает на то, что TLR7 использовали для распознавания 3М-052, но не Alhydrogel® или GLA. ID93+3M-052-Alhdyrogel® также вызывает устойчивые клеточные ответы у мышей WT, характеризующиеся CD4 Т-клетками, способными продуцировать IFN-γ и ФНО при незначительном продуцировании IL-5 или IL-17A (маркеры ТН2 и ТН17 иммунитета, соответственно). Тем не менее, у мышей TLR7-/- ID93+3M-052-Alhydrogel® приводил только к незначительным CD4 Т-клеточным ответам на ID93, которые по существу не отличались по величине от ответов, обеспечиваемых ID93, адъювированным индивидуальным Alhydrogel® у мышей WT (фигура 7В). Иммунизация мышей WT и TLR7-/- с применением ID93+GLA-Alhydrogel® приводила к аналогичным ТН1 ответам, что указывает на то, что у мышей TLR7-/- не ослабляется CD4 Т-клеточный ответ на вакцины с другими содержащими агонист TLR адъювантами, полученными на квасцах. Таким образом, можно сделать вывод, что аналогично результатам исследований in vitro, в 3М-052-Alhydrogel® применяют TLR7, который обладает адъювантной активностью in vivo, в частности, обеспечения высоких частот ответов ТН1 CD4 Т-клеток и IgG2c переключенного антитела.

[00231] Для испытания адъювантной активности in vivo 3М-052 с другим вакцинным антигеном, а также влияния других солей алюминия, мышей C57BL/6 иммунизировали ВИЧ gp120 антигеном (13), адъювированным 3M-052-AF, оксигидроксидом алюминия, фосфатом алюминия или 3M-052-AF в комбинации с оксигидроксидом алюминия или фосфатом алюминия. Через три недели после первой иммунизации наиболее повышенные ответы на IgG и IgG2c антитела сыворотки наблюдали в случае ВИЧ gp120 антигена, адъювированного 3М-052-оксигидроксидом алюминия (фигура 8В). Интересно, что 3М-052-оксигидроксид алюминия также приводил к наиболее высоким уровням секретирующих IgG2c и антитела долгоживущих плазматических клеток слизистых оболочек (фигуры 8D и 11). Кроме того, состав, содержащий 3М-052 и оксигидроксид алюминия, являлся мощным индуктором IFNγ и ФНО из CD4+ Т-клеток (фигура 8С), в частности, через одну неделю после примирующей иммунизации (фигура 11). В целом, 3М-052-оксигидроксид алюминия вероятно обладает более высокой адъювантной активностью в указанной модели по сравнению с 3М-052-фосфатом алюминия; тем не менее, поскольку ВИЧ gp120 антиген адсорбируется на оксигидроксиде алюминия, но по существу не на фосфате алюминия (данные не представлены), пониженные иммуногенности могут быть связаны с менее оптимальной адсорбцией антигена и/или 3М-052 на фосфате алюминия.

[00232] Индукция устойчивого адаптивного иммунного ответа на вакцинные антигены задействует соответствующую активацию врожденной иммунной системы для обеспечения костимулирующей и цитокиновой среды. Таким образом, анализировали врожденные иммунные ответы в дренирующем лимфатическом узле, которые изменяли путем иммунизации при помощи 3М-052 +/- фосфата алюминия или оксигидроксида алюминия. 3М-052 действовал синергически с оксигидроксидом алюминия и в меньшей степени с фосфатом алюминия с обеспечением устойчивого увеличения количества воспалительных моноцитов (CD11b⁺ Ly6C⁺) в дренирующем лимфатическом узле через 18 часов после внутримышечной инъекции (фигура 9А). Аналогично, 3М-052 и оба состава квасцов усиливали экспрессию костимулирующей молекулы CD86 на АПК, включая В-клетки, моноциты и дендритные клетки, и транзиентную активацию CD4 и CD8 Т-клеток, а также В-клеток, определяемую экспрессией CD69 (фигуры 9В и С). 3М-052 действовал исключительно синергически с оксигидроксидом алюминия с увеличением количества NK-клеток, экспрессирующих IFN-γ, и нейтрофилов, продуцирующих IL-1 (фигура 9D), причем обе молекулы важны для индукции устойчивых ТН1 ответов посредством вакцинных адъювантов (14). Указанный врожденный ответ на синергию между 3М-052 и квасцами вероятно создает подходящую среду для устойчивой генерации адаптивных иммунных ответов на вакцинные антигены. Экспансия NK-клеток, продуцирующих IFN-γ, и нейтрофилов, продуцирующих IL-1, коррелирует с более высокой адъювантной активностью 3М-052+оксигидроксид алюминия по сравнению с более слабыми ответами, вызываемыми 3М-052+фосфат алюминия.

Обсуждение результатов

[00233] Получение подходящих составов агонистов TLR7/8 представляет собой перспективный способ разработки адъювантов по нескольким причинам, включая технологичность, индукцию сильных ТН1 ответов и предшествующее применение в продукте, одобренном FDA. Способность имидазохинолинов направленно воздействовать на TLR7 и/или TLR8 с получением усиленных врожденных иммунных ответов ТН1-типа, включая IgG2 антитела у мышей, была задокументирована в литературе (15-17). Имидазохинолины могут быть получены экономически эффективным способом и с высокой степенью чистоты в виде синтетических малых молекул. Имиквимод, лиганд TLR7, является активным компонентом в креме для местного нанесения Aldara®, одобренном для иммунотерапевтического применения на людях для лечения рака кожи и генитальных кондилом. Тем не менее, инъецируемые в виде вакцинных адъювантов имидазохинолины не продвигались дальше начальной стадии клинических испытаний. Из-за их небольшого размера предполагают, что растворимые имидазохинолины, представленные не в виде составов, такие как R848, быстро диффундируют из места инъекции, что вызывает системную активацию иммунитета, а не локализованную стимуляцию. По этой причине стратегии "замедления" диффузии имидазохинолина, такие как ковалентное конъюгирование с вакцинными антигенами или инкапсуляция в составах в виде частиц, продемонстрировали перспективность в доклиническом испытании (5, 18-21). Смирнов (Smirnov) et al. описывают способ химического синтеза, приводящий к присоединению 18-членной углеродной цепи к структуре имидазохинолина, которая поддерживает местную адъювантную активность, но не системные ответы, обусловленные нелипидированными структурами, такими как R848 (5). Таким образом, указанная молекула, называемая 3М-052 (фигура 1), является более подходящей для включения в составы на основе липидов, такие как наносуспензии, липосомы или эмульсии.

[00234] В своей работе У (Wu) et al. продемонстрировали, что химический синтез новых лигандов TLR7 с фосфонатными группами облегчает адсорбцию на оксигидроксиде алюминия, что приводит к улучшению транзиентной местной адъювантной активности при одновременном снижении системной активации (21). Составы TLR7, адсорбированные на квасцах, эффективно повышали количество и качество антител к различным вакцинным антигенам, включая улучшенную защиту от заражения по сравнению с антигеном только с квасцами или только с лигандом TLR7 (21). Напротив, в способе получения составов, описанном в настоящем документе, по существу не используют фосфонатные группы на лиганде PRR для облегчения адсорбции лигандов PRR на солях алюминия и, следовательно, способ может иметь более широкую применимость. Способность содействовать адсорбции лигандов PRR на солях алюминия может обеспечивать преимущество разработки с точки зрения регулирования, поскольку адсорбированный на квасцах состав на основе лиганда PRR уже содержится в одобренных вакцинах, таких как Cervarix®. Способ, основанный на получении состава, может помочь избежать необходимости химически модифицировать структуры существующих агонистов, вместо этого полагаясь на способность состава усиливать адсорбцию на солях алюминия. Кроме того, модификации липидного состава могут адаптировать избирательность адсорбции лиганда PRR на конкретные соли алюминия таким образом, чтобы вакцинный антиген и лиганд PRR могли быть адсорбированы на один и тот же тип соли алюминия. Такие свойства вспомогательных веществ включают длину и степень насыщенности ацильных цепей и структуру/заряд головной группы. Было обнаружено, что последний вероятно является основным определяющим фактором в отношении способности наносуспензии адсорбироваться на солях алюминия, хотя структуру ацильной цепи также следует учитывать для обеспечения получения стабильной суспензии лиганда PRR и вспомогательного липида.

[00235] Несмотря на универсальность указанного способа получения на основе наносуспензии, следует отметить, что влияние выбора буфера/соли, типа соли алюминия, порядка смешивания, свойств разбавителя и вакцинного антигена должны быть тщательно охарактеризованы для оптимизации получения адъювантной вакцины. Например, невозможно полностью выделить важность адсорбции 3M-052-AF независимо от адсорбции антигена, поскольку ВИЧ gp120 антиген и 3M-052-AF адсорбировались менее оптимально на фосфате алюминия по сравнению с оксигидридом алюминия.

[00236] Способ на основе вспомогательного липида использовали для адсорбции лигандов TLR4 на оксигидроксиде алюминия. В другом случае нерастворимый лиганд TLR4 GLA можно получать в виде водной суспензии с применением вспомогательного липида, которую затем можно смешивать с оксигидроксидом алюминия для обеспечения адсорбции. Тем не менее, в случае GLA сам агонист содержит фосфатную группу, которая способствует адсорбции посредством лигандного обмена. В случае 3М-052 агонист не содержит фосфатных групп, поэтому адсорбцию посредством лигандного обмена можно отнести к вспомогательному липиду. Хотя в настоящем документе ID93+3М-052-квасцы, по-видимому, индуцирует более сильный ТН1 ответ по сравнению с ID93+GLA-квасцы. Расположение и распределение TLR7/8 и TLR4 в клетках существенно различается и варьируется между видами (17). Например, TLR8 считается резистентным у мышей; таким образом, агонист, такой как 3М-052, может обеспечивать измененные или усиленные ответы у людей или других видов с функциональным TLR8. Такие аспекты в сочетании с представленными в настоящем документе данными указывают на то, что адъювантный состав TLR7/8 на основе квасцов может обеспечивать получение сильного адъювантного состава для продуцирования ТН1 ответов у людей.

[00237] 3М-052 и квасцы синергически влияли на усиление экспрессии костимулирующей молекулы CD86 на АПК в дренирующем лимфатическом узле и на транзиентную активацию лимфоцитов, позволяя оставаться в дренирующем лимфатическом узле антиген-независимым образом. Путем активации АПК и улавливания лимфоцитов в одном и том же дренирующем лимфатическом узле указанная синергия создавала оптимальную среду для прайминга и экспансии лимфоцитов. Интересно, что врожденные ответы, включая продуцирование IFN-γ и IL-1β на ранних стадиях, которые, как было обнаружено, участвуют в адъювантности GLA-SE (14), также отчетливо проявлялись при получении состава 3М-052 с оксигидроксидом алюминия. Это может свидетельствовать о том, что указанные параметры могут являться полезными универсальными признаками эффективной адъювантной активности. Идентификация таких признаков будет способствовать рациональной разработке новых вакцинных кандидатов.

[00238] Наконец, был разработан способ формирования лигандов PRR на основе липидов в виде водных наносуспензий, которые можно получать для адсорбции на солях алюминия, на основе свойств вспомогательного липида. Способность разрабатывать совместимые с квасцами составы новых лигандов PRR может обеспечить более быстрое внедрение в клиническую практику, поскольку такие составы аналогичны комбинациям лиганд TLR4-квасцы, применяемым в Cervarix®, и соли алюминия являются наиболее широко применяемым классом адъювантов в вакцинах для людей с общепризнанной безопасностью и иммуногенностью.

ПРИМЕР 2. АДСОРБЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ЛИГАНДА TLR4 НА КВАСЦАХ

[00239] Испытывали адсорбцию стабильных водных суспензий лиганда TLR4 GLA на оксигидроксиде алюминия или фосфате алюминия, и результаты приведены в таблице 4. Указанные данные свидетельствуют о том, что адсорбцию лиганда TLR4 можно адаптировать к оксигидроксиду алюминия или фосфату алюминия путем выбора подходящего вспомогательного липида.

Источники информации

1. Glenny AT, Pope CG, Waddington H, Wallace U. The antigenic value of toxoid precipitated by potassium alum. J Pathol Bacteriol. 1926; 29:31-40.

2. Hem SL, HogenEsch H. Aluminum-containing adjuvants: properties, formulation and use. In: Singh M, editor. Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons; 2007. p. 81-114.

3. Didierlaurent AM, Morel S, Lockman L, Giannini SL, Bisteau M, Carlsen H, Kielland A, Vosters O, Vanderheyde N, Schiavetti F, Larocque D, Van Mechelen M, Garcon N. AS04, an aluminium salt- and TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity. J Immunol. 2009; 10:6186-97.

4. Mullen GED, Aebig JA, Dobrescu G, Rausch K, Lambert L, Long CA, Miles AP, Saul A. Enhanced antibody production in mice to the malaria antigen AMA1 by CPG 7909 requires physical association of CpG and antigen. Vaccine. 2007; 25(29):5343-7.

5. Smirnov D, Schmidt JJ, Capecchi JT, Wightman PD. Vaccine adjuvant activity of 3M-052: an imidazoquinoline designed for local activity without systemic cytokine induction. Vaccine. 2011; 29:5434-42.

6. Misquith A, Fung M, Dowling QM, Guderian JA, Vedvick TS, Fox CB. In vitro evaluation of TLR4 agonist activity: formulation effects. Coll Surf В: Biointerfaces. 2014; 113:312-9.

7. Fung HWM, Mikasa TJT, Vergara J, Sivananthan SJ, Guderian JA, Duthie MS, Vedvick TS. Optimizing manufacturing and composition of a TLR4 nanosuspension: physicochemical stability and vaccine adjuvant activity. J Nanobiotechnology. 2013; 11:43.

8. Fox CB. Characterization of TLR4 agonist effects on Alhydrogel sedimentation: a novel application of laser scattering optical profiling. J Pharm Sci. 2012; 101:4357-64.

9. Chollet JL, Jozwiakowski MJ, Phares KR, Reiter MJ, Roddy PJ, Schultz HJ, Та QV, Tomai MA. Development of a topically active imiquimod formulation. Pharm Dev Technol. 1999; 4:35-43.

10. Iyer S, Robinett RSR, HogenEsch H, Hem SL. Mechanism of adsorption of hepatitis В surface antigen by aluminum hydroxide adjuvant. Vaccine. 2004; 22(11-12):1475-9.

11. Bertholet S, Ireton GC, Ordway DJ, Windish HP, Pine SO, Kahn M, Phan T, Orme IM, Vedvick TS, Baldwin SL, Coler RN, Reed SG. A defined tuberculosis vaccine candidate boosts BCG and protects against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Sci Transl Med. 2010; 2:53ra74.

12. Dowling QM, Sivananthan SJ, Guderian JA, Moutaftsi M, Chesko JD, Fox CB, Vedvick TS, Kramer RM. Modulating Potency: Physicochemical Characteristics are a Determining Factor of TLR4-Agonist Nanosuspension Activity. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2014; 103(3):879-89.

13. Fouts TR, Tuskan R, Godfrey K, Reitz M, Hone D, Lewis GK, DeVico AL. Expression and Characterization of a Single-Chain Polypeptide Analogue of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120-CD4 Receptor Complex. Journal of Virology. 2000; 74(24):11427-36.

14. Desbien AL, Reed SJ, Bailor HR, Cauwelaert ND, Laurance JD, Orr MT, Fox CB, Carter D, Reed SG, Duthie MS. Squalene emulsion potentiates the adjuvant activity of the TLR4 agonist, GLA, via inflammatory caspases, IL-18 and IFN-γ. European Journal of Immunology. 2015; 45(2):407-17.

15. Vasilakos JP, Tomai MA. The use of Toll-like receptor 7/8 agonists as vaccine adjuvants. Expert Review of Vaccines. 2013; 12(7):809-19.

16. Schwenk R, DeBot M, Porter M, Nikki J, Rein L, Spaccapelo R, Crisanti A, Wightman PD, Ockenhouse CF, Dutta S. IgG2 Antibodies against a Clinical Grade Plasmodium falciparum CSP Vaccine Antigen Associate with Protection against Transgenic Sporozoite Challenge in Mice. PLoS ONE. 2014; 9(10):e111020.

17. Reed SG, Orr MT, Fox CB. Key roles of adjuvants in modern vaccines. Nat Med. 2013; 19:1597-608.

18. Fox C, Sivananthan S, Duthie M, Vergara J, Guderian J, Moon E, Coblentz D, Reed S, Carter D. A nanoliposome delivery system to synergistically trigger TLR4 AND TLR7. Journal of Nanobiotechnology. 2014; 12(1):17.

19. Kasturi SP, Skountzou I, Albrecht RA, Koutsonanos D, Hua T, Nakaya HI, Ravindran R, Stewart S, Alam M, Kwissa M, Villinger F, Murthy N, Steel J, Jacob J, Hogan RJ, García-Sastre A, Compans R, Pulendran B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 2011; 470:543-7.

20. Wille-Reece U, Wu C-y, Flynn BJ, Kedl RM, Seder RA. Immunization with HIV-1 Gag Protein Conjugated to a TLR7/8 Agonist Results in the Generation of HIV-1 Gag-Specific Th1 and CD8+ T Cell Responses. The Journal of Immunology. 2005; 174(12):7676-83.

21. Wu TY-H, Singh M, Miller AT, De Gregorio E, Doro F, DʼOro U, Skibinski DAG, Mbow ML, Bufali S, Herman AE, Cortez A, Li Y, Nayak BP, Tritto E, Filippi CM, Otten GR, Brito LA, Monaci E, Li C, Aprea S, Valentini S, Calabró S, Laera D, Brunelli B, Caproni E, Malyala P, Panchal RG, Warren TK, Bavari S, OʼHagan DT, Cooke MP, Valiante NM. Rational design of small molecules as vaccine adjuvants. Science Translational Medicine. 2014; 6(263):263ra160

[00240] Все указанные выше патенты США, публикации заявок на патенты США, заявки на патенты США, зарубежный патенты, заявки на зарубежные патенты и непатентные публикации, упомянутые в настоящем описании и/или перечисленные в информационном листе заявки, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

[00241] Из вышеизложенного понятно, что хотя в настоящем документе в иллюстративных целях описаны конкретные варианты реализации настоящего изобретения, возможны различные модификации без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Соответственно, настоящее изобретение не ограничено ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.

1. Композиция для усиления адсорбции агониста TLR на солях алюминия, содержащая:

агонист TLR, выбранный из агониста TLR7/8 или TLR4;

вспомогательный липид; и

соль алюминия.

2. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что указанный антагонист TLR представляет собой агонист TLR7/8.

3. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что указанный антагонист TLR представляет собой агонист TLR4.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, характеризующаяся тем, что агонист TLR7/8 адсорбирован на указанной соли алюминия, при этом необязательно агонист TLR7/8 адсорбирован на соли алюминия при 25 процентах соли алюминия.

5. Композиция по пп. 1-4, характеризующаяся тем, что соль алюминия выбрана из группы, состоящей из гидроксида алюминия, тригидрата алюминия, оксигидроксида алюминия, фосфата алюминия, гидроксифосфата алюминия, гидроксифосфата-сульфата алюминия и сульфата алюминия-калия, или тем, что соль алюминия включает Alhydrogel® или AdjuPhos®.

6. Композиция по любому из пп. 1, 2 или 4, 5, характеризующаяся тем, что агонист TLR7/8 включает 3M-052.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, характеризующаяся тем, что вспомогательный липид представляет собой фосфолипид или четвертичную аммонийную соль липида; или тем, что вспомогательный липид содержит C_10-20 алкильную цепь, или тем, что вспомогательный липид выбран из DOPC (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина), DSPG (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерина)), DSTAP (1,2-дистеароил-3-триметиламмонийпропана) и полисорбата 80.

8. Композиция по п. 1, содержащая 3M-052, Alhydrogel® и DSPG или содержащая 3M-052, AdjuPhos® и DSTAP.

9. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR4, и вспомогательный липид представляет собой DPTAP; и соль алюминия представляет собой AdjuPhos®.

10. Композиция по п. 9, характеризующаяся тем, что агонист TLR4 адсорбирован на соли алюминия; при этом необязательно агонист TLR4 адсорбирован на соли алюминия при 25 процентах соли алюминия.

11. Композиция по п. 9 или 10, характеризующаяся тем, что агонист TLR4 включает 3D-монофосфориллипид A (MPL); или тем, что агонист TLR4 включает галактозил-липидный адъювант (GLA).

12. Композиция по п. 11, характеризующаяся тем, что агонист TLR4 включает синтетический GLA формулы (IV):

(IV)

или его фармацевтически приемлемую соль, где

L₁, L₂, L₃, L₄, L₅ и L₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой -O-, -NH- или -(CH₂)-;

L₇, L₈, L₉ и L₁₀ являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или представляют собой -C(=O)-;

Y₁ представляет собой кислотную функциональную группу;

Y₂ и Y₃ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой -OH, -SH или кислотную функциональную группу;

Y₄ представляет собой -OH или -SH;

R₁, R₃, R₅ и R₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой C_8-13 алкил; и

R₂ и R₄ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой C_6-11 алкил; или

тем, что агонист TLR4 включает синтетический GLA формулы (V):

(V)

или его фармацевтически приемлемую соль, где

R¹, R³, R⁵ и R⁶ представляют собой C₁₁-C₂₀ алкил; и R² и R⁴ представляют собой C₁₂-C₂₀ алкил; или тем, что

агонист TLR4 включает синтетический GLA формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль.

13. Композиция по любому из пп. 1-12, дополнительно содержащая антиген.

14. Композиция по п. 13, характеризующаяся тем, что антиген выбран из антигена, связанного с туберкулезом, антигена, связанного с гриппом, антигена, связанного с гемагглютинином, антигена, связанного с раком, антигена, связанного с вирусом, и антигена, связанного с амебиазом; при этом необязательно антиген, связанный с туберкулезом, выбран из группы, состоящей из ID93, ID91 и БЦЖ; при этом необязательно антиген, связанный с гриппом, выбран из группы, состоящей из H5N1, гриппа A, гриппа B и гриппа C; при этом необязательно антиген, связанный с амебиазом, представляет собой LecA; при этом необязательно антиген, связанный с вирусом, выбран из группы, состоящей из гепатита B и гепатита C.

15. Композиция по любому из пп. 1-14, характеризующаяся тем, что композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно шести месяцев; или тем, что композиция является стабильной в течение по меньшей мере примерно одного года; или тем, что композиция является стабильной при 2-8°C в течение по меньшей мере шести месяцев; или тем, что композиция является стабильной при 2-8°C в течение по меньшей мере одного года.

16. Способ стимулирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение композиции по любому из пп. 1-15 субъекту и стимулирование таким образом иммунного ответа у субъекта.

17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что иммунный ответ представляет собой неспецифический иммунный ответ, или тем, что иммунный ответ представляет собой антиген-специфический иммунный ответ.

18. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что иммунный ответ включает активацию B-клеток, активацию T-клеток, продуцирование антител или выделение цитокинов.

19. Способ по п. 18, характеризующийся тем, что композицию применяют для лечения аллергии, зависимости, рака или аутоиммунной реакции.

20. Способ по любому из пп. 16-19, характеризующийся тем, что субъект представляет собой человека или млекопитающее, отличное от человека; при этом необязательно млекопитающее, отличное от человека, представляет собой собаку, корову или лошадь.

21. Способ получения композиции для стимулирования иммунного ответа у субъекта, содержащей агонист TLR, выбранный из агониста TLR7/8 или агониста TLR4, и вспомогательный липид, где указанная композиция содержит частицы, имеющие размер в диапазоне от 1 нм до примерно 450 нм; характеризующийся тем, что способ включает

(a) смешивание указанного агониста и вспомогательного липида в растворителе с получением раствора;

(b) удаление растворителя из раствора со стадии (a) с получением пленочной композиции; и

(d) воздействие на регидратированную композицию мощным источником энергии с получением наносуспензионной композиции; и

(e) смешивание соли алюминия с указанной наносуспензионнной композицией.

22. Способ по п. 21, характеризующийся тем, что мощный источник энергии представляет собой микрофлюидизатор, экструдер, ультразвуковой диспергатор, смеситель Silverson или гомогенизатор.

23. Способ по п. 21, дополнительно включающий смешивание антигена с наносуспензионной композицией.

24. Способ по п. 21, характеризующийся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR7/8.

25. Способ по п. 21, характеризующийся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR4.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены химерные антигенные рецепторы (CAR) против антигена созревания В-клеток (ВСМА), иммунореактивные клетки, молекула нуклеиновой кислоты, экспрессионный вектор, Т-клетки.

Способы культивирования клеток и наборы и устройство для них // 2761557

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для культивирования Т-клеток. Предложенные способы предусматривают индукцию первого сигнала, который представляет собой ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал, в T-клетках при их культивировании, где индукция указанного сигнала вызывает активацию, стимуляцию и/или размножение Т-клеток.

Противораковые вакцины, направленные на lemd1, и их применение // 2760984

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, содержащий домен LAP2-Emerin-MAN1, 1 (LEMD1), а также к содержащему его вектору и композиции. Также раскрыт антиген, содержащий домен LAP2-Emerin-MAN1, 1 (LEMD1), а также содержащая его вакцина.

Условно активные химерные антигенные рецепторы для модифицированных т-клеток // 2759957

Группа изобретений относится к способам создания условно активного химерного антигенного рецептора для связывания с целевым антигеном, выбранным из тирозинкиназного рецептора фактора роста, расположенного на поверхности раковой клетки твердой опухоли. Способы включают эволюционирование антиген-специфической нацеливающей области для создания условно активной антиген-специфической нацеливающей области, которая имеет снижение в активности связывания целевого антигена при нормальном физиологическом pH по сравнению с активностью связывания того же целевого антигена при аномальном pH в микроокружении опухоли; и связывание условно активной антиген-специфической нацеливающей области с трансмембранным доменом и с внутриклеточным сигнальным доменом для образования химерного антигенного рецептора.

Дисплей интегрального мембранного белка на внеклеточных оболочечных вирионах поксвируса // 2759846

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к композициям и способам экспрессии и получения выделенных интегральных мембранных белков (IMP) или их фрагментов в нативной конформации для применения в скрининге, селекции и идентификации антител или антителоподобных молекул, которые связываются с представляющей интерес IMP-мишенью.

Композиции il-12, нацеленные на edb // 2758143

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам на основе IL-12, слитого с EDB-связывающими доменами, и может быть использовано в медицине для противоопухолевой терапии, где злокачественная опухоль экспрессирует экстрадомен В фибронектина (EDB-FN). Предложенный иммуноцитокин с SEQ ID NO:16 обеспечивает улучшенный терапевтический потенциал IL-12 за счет улучшения профиля биораспределения, переносимости, терапевтического окна и/или эффективности в достижении места заболевания.

Производство рекомбинантного лубрицина // 2758115

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, в частности к композициям новой высокогликозилированной человекоподобной форме лубрицина. Рекомбинантный гликопротеин лубрицина экспрессируют из человеческого гена PRG4 в культуре клетки-хозяина, где полученный лубрицин содержит по меньшей мере 30 мас.% гликозидных остатков, причем по меньшей мере 99 мас.% гликозилирования представляет собой гликозилирование ядра 1.

Антитела к muc16 и их применение // 2758113

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с MUC16, конъюгаты, химерный антигенный рецептор, Т-клетка, полинуклеотиды.

Индуктор иммунитета // 2758112

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены композиции, имеющие индуцирующую иммунитет активность против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201, а также полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью против белка PDS5A у пациентов-носителей HLA-A0201.

В высокой степени сжатое синтетическое фиброиновое волокно, способ его получения и способ сжатия синтетического фиброинового волокна // 2757909

Изобретение относится к искусственному фиброиновому волокну с высокой степенью сжатия. Искусственное фиброиновое полотно включает модифицированный фиброин, причем процент сжатия превышает 7%.

Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания в-клеток, и их применение // 2761632