Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп

Изобретение может быть использовано при получении материалов для конструирования био- и химических сенсоров в области генной диагностики для получения генных библиотек и проведения полимеразной цепной реакции на нуклеиновых кислотах, иммобилизованных на поверхности стекла. Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп включает активацию раствором концентрированной H₂SO₄ и 30% H₂O₂, промывку дистиллированной водой, сушку, обработку раствором тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора аммиака и нонилфеноксиполиэтоксиэтанола, промывку неполярным органическим растворителем и этанолом, сушку. Затем проводят обработку раствором (3-аминопропил)триалкоксисилана в этаноле, промывку этанолом, сушку. В качестве неполярного органического растворителя используют циклогексан. Изобретение позволяет получать поверхность стекла с контролируемой плотностью и равномерным распределением функциональных аминогрупп для последующей иммобилизации олигонуклеотидов посредством амидной связи. 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области химии, биотехнологии, медицины и химико-фармацевтической промышленности. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения покрытий, обладающих повышенной поверхностной плотностью и равномерностью распределения функциональных групп, в частности к способу модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп. Данные материалы могут быть использованы для конструирования био- и химических сенсоров, прежде всего в области генной диагностики для получения генных библиотек и проведения полимеразной цепной реакции на нуклеиновых кислотах, иммобилизованных на поверхности стекла.

Уровень техники

Наиболее простым и широко распространенным способом получения функционализированных поверхностей является обработка стекла органосилоксанами или другими реагентами, содержащими соответствующие функциональные группы (см., например, патенты США №№ 5077210, 6689473, 6916541, 7049064, 9982250; заявка РСТ, опубликованная как WO2005003391; А.Х. Туктамышева и др., "Сравнительный анализ различных вариантов химической модификации поверхности кремнезема", Вестник Башкирского университета, 2012, т.17, №3, 1247-1252). Покрытия, получаемые описанными способами, имеют низкую плотность целевых групп, причем их расположение на ровной поверхности зачастую создает стерические препятствия для реакции гибридизации.

Среди разработанных на сегодняшний день методик силанизации поверхности стекла наиболее широко распространен газофазный метод обработки 1% раствором (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTES) в абсолютном толуоле, благодаря таким преимуществам как простота исполнения, а также возможность крупномасштабного производства (Wei Wang, Mark W. Vaughn, Morphology and amine accessibility of APTES films on glass surface // Scanning, 30, 65-77, 2008).

Однако за счет того, что реакция протекает в газовой фазе, трудно контролировать распределение и плотность аминогрупп на поверхности стекла. Кроме того, силанизация напрямую APTES приводит к довольно низкой поверхностной плотности функциональных аминогрупп.

Указанная цель была достигнута путем разработки нового способа модификации поверхности стекла с получением поверхности с функционально активными аминогруппами и необходимой плотностью и равномерным распределением аминогрупп на поверхности стекла для последующей иммобилизации олигонуклеотидов посредством амидной связи.

Так, настоящее изобретение представляет собой способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп, включающий следующие последовательные стадии:

а) активация раствором "пираньи" (конц. H₂SO₄: 30% H₂O₂);

б) промывка дистиллированной водой и сушка;

в) обработка раствором тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора аммиака и нонилфеноксиполиэтоксиэтанола;

г) промывка указанным неполярным органическим растворителем и этанолом, и сушка;

д) обработка(3-аминопропил)триалкоксисиланом в этаноле;

е) промывка этанолом и сушка.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором используют раствор "пираньи" с соотношением конц. H₂SO₄ и 30% H₂O₂ в диапазоне 2-3:1, соответственно.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором используют раствор 0,2-0,4% тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора 25-30% аммиака и 0,5-1% нонилфеноксиполиэтоксиэтанола.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором в качестве неполярного органического растворителя используют циклогексан.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанный (3-аминопропил)триалкоксисилан выбран из группы, включающей (3-аминопропил)триметоксисилан (APTMS) и (3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES).

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанный (3-аминопропил)триалкоксисилан используют в виде 10-20% раствора в этаноле.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором сушку проводят в течение 1-2 часов при температуре 81-110°C.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором стадии в) - е) повторяют два или три раза.

Краткое описание рисунков

На Фиг. 1 приведены изображение стекла, модифицированногоспособом, указанным в Примере 1, по данным атомно-силовой микроскопии и гистограмма распределения высот.

На Фиг. 2 приведены изображение стекла, модифицированногоспособом, указанным в Примере 2, по данным атомно-силовой микроскопии и гистограмма распределения высот.

На Фиг. 3 приведены изображение стекла, модифицированногоспособом, указанным в Примере 3, по данным атомно-силовой микроскопии и гистограмма распределения высот.

На Фиг. 4 приведеныфотографии каналов проточных ячеек, полученных согласно Примерам 1, 2 и 3, соответственно, модифицированных олигонуклеотидами А1 и В1, до (слева) и после (справа) гибридизации с комплементарными им олигонуклеотидами, меченными флуоресцентным красителем Cy5.

На Фиг. 5 приведены фотографии колоний после изотермической полимеразной цепной реакции на 4-х спектрально отличных каналах детекции сигнала флуоресценции.

Подробное описание настоящего изобретения

Способ, согласно настоящему изобретению, позволяет осуществлять модификацию поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп. Данные материалы могут быть использованы для конструирования био- и химических сенсоров, прежде всего в области генной диагностики для получения генных библиотек и проведения полимеразной цепной реакции на нуклеиновых кислотах, иммобилизованных на поверхности стекла.

Используемая стеклянная подложка может быть предоставлена в любой подходящей форме, такой как предметные стекла, пластины, сферы, листы, трубки, капилляры, прокладки, пластины, предметные стекла и т.д. Подложка может иметь любую удобную форму, такую как форма диска, квадрата, сферы, круга и т.д. В частности, указанная стеклянная подложка может внутренней поверхностью канала проточной ячейки секвенатора ДНК.

В предпочтительном варианте осуществления подложка представляет собой низкофлуоресцентное стекло или стекло из чистого SiO₂, наиболее предпочтительно низкофлуоресцентное боросиликатное, боросиликатное стекло, приваренное к кремниевому, или натриево-известковое стекло.

Первой стадией способа согласно настоящему изобретению является стадия очистки и активации поверхности стеклянной подложки. Указанную стадию осуществляют посредством обработки поверхности стекла раствором "пираньи".

Раствор "пираньи" представляет собой смесь концентрированной серной кислоты (H₂SO₄) и перекиси водорода (H₂O₂). Поскольку указанная смесь является сильным окислителем, ее применение позволяет удалять с поверхности органические вещества, а также позволяет гидроксилировать поверхность стекла, повышая его гидрофильность.

Используют различные соотношения компонентов указанной смеси. Предпочтительно использовать раствор пираньи с соотношением концентрированной H₂SO₄ и 30%-50%H₂O₂ в диапазоне 2-3:1, соответственно. Типичный раствор "пираньи" - это 2-3 части концентрированной серной кислоты и 1 часть 30% раствора перекиси водорода.

После стадии очистки подложки осуществляют стадию нанесения покрытия поверхности стекла диоксидом кремния SiO₂. Предпочтительное покрытие SiO₂ представляет собой золь-гель покрытие, полученное изтетраэтоксисилана (TEOS). Наиболее предпочтительно использование тетраэтоксисилана в виде раствора в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора аммиака и поверхностно-активного вещества.

Такой модифицирующий слой обычно имеют толщину от мономолекулярной толщины до нескольких сотен микрон. Предпочтительная толщина покрытия из TEOS составляет 0,1-1 микрон.

В качестве неполярного органического растворителя возможно использование различных неполярных органических растворителей, известных специалисту данной области техники. Предпочтительным является использование циклогексана.

В качестве поверхностно-активного вещества предпочтительно использовать неионогенное неденатурирующее средство, предпочтительно нонилфеноксиполиэтоксиэтанол. Указанное вещество также известно под коммерческим наименованием IGEPAL^®CO-520 (Sigma-Aldrich, кат. № 238643).

Наиболее предпочтительно использование тетраэтоксисилана в виде раствора в циклогексане в присутствии в присутствии водного раствора 25-30% аммиака и 0,5-1% нонилфеноксиполиэтоксиэтанола.

Для внесения на поверхность стекла функциональных аминогрупп, необходимых для ковалентного присоединения олигонуклеотидов, используют различные аминосиланы, связывающиеся с гидроксильными группами протравленных и покрытых SiO₂ субстратов, упомянутых выше. В качестве аминосиланов предпочтительно использование (3-аминопропил)триалкоксисиланов, включая(3-аминопропил)триметоксисилан (APTMS), (3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES), (3-аминопропил)трипропоксисилан(APTPS) и т.п.

Предпочтительно использовать указанные (3-аминопропил)триалкоксисиланы в виде 10-20% раствора в этаноле.

Особенностью способа согласно настоящему изобретению является то, что каждую из стадий проводят раздельно, с использованием отдельных реакционных сред, при этом после каждой из стадий осуществляют промывку и сушку обработанной поверхности.

Осуществление способа согласно настоящему изобретению позволяет получить поверхность стекла с высокой степенью равномерности распределения функциональных аминогрупп.

Повторение стадий в) - е) способа согласно настоящему изобретению последовательно несколько раз, предпочтительно два или три, с одним и тем же стеклом позволяет контролировать плотность функциональных аминогрупп на поверхности материала.

В настоящем описании в качестве примера осуществления настоящего изобретения, не ограничивающего рамки настоящего изобретения, приведен вариант осуществления, в котором стеклянная подложка выполнена в виде проточной ячейки секвенатора, в которой модификации подвергают канал указанной проточной ячейки. Типичные ячейки имеют толщину стекла около 1 мм и размеры 14 мм × 28 мм.

Сопоставительный анализ способа согласно настоящему изобретению с известными и широко используемыми способами силанизации и внесения функциональных аминогрупп, таким, например, как силанизация 1% раствором APTES в абсолютном толуоле, показал, что способ согласно настоящему изобретению обладает следующими преимуществами:

1) увеличение плотности аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки,

2) возможность контроля за равномерным распределением аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки.

Далее приведены примеры вариантов осуществления способа согласно настоящему изобретению. Указанные примеры приведены для целей разъяснения сути настоящего изобретения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения, определяемые формулой настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Способ модификации поверхности канала проточной ячейки.

Поверхность канала проточной ячейки активировали раствором "пираньи" (H₂SO₄:H₂O₂=2:1), который вводили в канал и оставляли реагировать при 100°C в течение 24 ч. Затем ячейку промывали 20×20 мкл дистиллированной воды и высушивали при 100°C в течение 2 ч. Далее готовили раствор циклогексан:IGEPALC-520:NH₄OH:TEOS = 150:7,5:1:4, который вводили в канал, помещали ячейку в этот же раствор и оставляли реагировать при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 24 ч. После чего ячейку промывали 20х20 мкл циклогексана и 20х20 мкл этанола и сушили при 100°C в течение 2 ч. На последнем этапе в канал проточной ячейки вводили 10% раствор APTES в этаноле и оставляли реагировать при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем ячейку промывали 20х20 мкл этанола и сушили при 100°C в течение 2 ч.

Заселенность поверхности стекла и рельеф поверхности стекла определяли с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) с использованием сканирующего электронного микроскопа Inspect (FEI, США), напылительной установки SPIModuleSputter/CarbonCoater (StructureProbeInc., США), сканирующего зондового микроскопа NtegraAura (NT-MDT, Россия). Исследовали морфологию и механические свойства поверхности стекол с помощью полуконтактного и контактного режимов сканирования методом АСМ. Использовали зонды серии HA_NC, NSG01, NSG10 (NT-MDT, Россия). Коэффициент жесткости зондов измеряли с помощью метода Садера (Sader, J.E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L.R. Method for calibration of atomic force microscope cantilevers. // Rev. Sci. Instrum. 66, - 1995. - P. 3789-3498), механические свойства изучались по кривым подвода/отвода. Изучение образцов проводили на воздухе при средней температуре 23°С и относительной влажности в пределах 30-40%. При измерениях использовали пассивную (гранитная плита) и активную (антивибрационный стол) виброзащиты. Для юстировки зонда и выбора области для АСМ измерений использовали оптическую систему регистрации Optem (Excelitas Technologies Corp., Уолтем, Массачусетс, США) с камерой и зумом в пределах 85х - 1050х кратного увеличения. Для изучения морфологии образцов стекол методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) предварительно напыляли магнетронным методом золотую токопроводящую пленку толщиной около 30 нм для снятия заряда во время сканирования образца пучком сфокусированных электронов. Измерения методом СЭМ проводили в вакууме при давлении около 10^-3 Па и ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме вторичных электронов (детектор Эверхарта-Торнли).

На Фиг. 1 представлена фотография, демонстрирующая заселенность поверхности стекла, и гистограмма распределения высот.

Пример 2. Способ модификации поверхности канала проточной ячейки, в котором стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли два раза.

Для увеличения плотности аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки по сравнению с Примером 1 стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли два раза на одной и той же проточной ячейке.

На Фиг. 2 представлена фотография, демонстрирующая заселенность поверхности стекла, и гистограмма распределения высот. Данные получены методом, описанным в Примере 1.

Пример 3. Способ модификации поверхности канала проточной ячейки, в котором стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли три раза.

Для увеличения плотности аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки по сравнению с Примером 1 стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли три раза на одной и той же проточной ячейке.

На Фиг. 3 представлена фотография, демонстрирующая заселенность поверхности стекла, и гистограмма распределения высот. Данные получены методом, описанным в Примере 1.

Пример 4. Подтверждение наличия функциональных аминогрупп на поверхности стекла, модифицированного способом согласно настоящему изобретению.

Данные в Примерах 1-3, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии, показывают заселенность поверхности стекла, модифицированного способом согласно настоящему изобретению, но не доказывают, что на поверхность канала проточной ячейки внесены функциональные аминогруппы.

Для доказательства наличия функциональных аминогрупп на поверхности канала ячеек, полученных согласно Примерам 1, 2 и 3, посредством амидной связи иммобилизовали олигонуклеотиды А1, Б1:

5'-(Carboxy-dT)tt-ttt-ttt-ttt-act-atg-ccg-ctg-gtg-gct-cta-gat-gtg-3'

5'-(Carboxy-dT)tt-ttt-ttt-ttg-ttc-gtc-ttc-tgc-cgt-atg-ctc-ta-3'

Для этого в канал проточной ячейки вводили раствор, содержащий 27 мкл 100 мМ буферного раствора 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты(MES), рН 4,8, 1 мкл 1,25М раствора N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC) и по 4 мкл 25 мкМ раствора каждого олигонуклеотида. Ячейку оставляли реагировать при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем ячейку промывали 20х20 мкл буферного раствора MES, рН4,8.

Далее осуществляли гибридизацию иммобилизованных олигонуклеотидов с комплементарными им олигонуклеотидами, меченными флуоресцентным красителем Cy5:

5'-(Cy5)cac-atc-tag-agc-cac-cag-cgg-cat-agt-aa-3'

5'-(Cy5)tag-agc-ata-cgg-cag-aag-acg-aac-a-3'

После гибридизации сигнал флуоресценции красителя снимали на приборе Typhoon 9200.

На Фиг. 4 представлены фотографии каналов проточных ячеек, полученных согласно Примерам 1,2 и 3, соответственно, модифицированных олигонуклеотидами А1 и Б1, до и после гибридизации с комплементарными им олигонуклеотидами, меченными флуоресцентным красителем Cy5.

Как видно на Фиг. 4, использование способа согласно настоящему изобретению позволяет модифицировать поверхность канала проточной ячейки с достижением высокой плотности и равномерным распределением функциональных аминогрупп на поверхности материала.

Пример 5. Изучение образования колоний на стекле, модифицированном способом согласно настоящему изобретению, после поведения изотермической полимеразной цепной реакции

Изотермическую ПЦР проводили, как описано в WO 98/44151. На поверхности стекла иммобилизовали олинонуклеотиды А1 и Б1. Фотографии, приведенные на Фиг. 5, получали на приборе Нанофор-СПС (время экспозиции 3 сек, размер кадра 2448х2048 пикселей, площадь зрения 0,393 кв.мм). В результате обработки данных изображений в поле зрения было обнаружено 527324 колонии (плотность колоний составила 1343311 колоний/кв.мм). Полученный результат свидетельствуют о достижении уровня загрузки иммобилизованными на поверхности стекла ДНК колониями, достаточного для реализации различных методов исследования, в частности, метода массового параллельного секвенирования ДНК.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, специалисту в данной области техники понятно, что могут быть сделаны различные замены и использованы различные эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все документы, процитированные в настоящем описании, являются частью настоящей заявки, и целиком включены в настоящее описание посредством ссылки.

1. Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп, включающий следующие последовательные стадии:

а) активация раствором конц. H₂SO₄ : 30% H₂O₂ с соотношением конц. H₂SO₄ и 30% H₂O₂ в диапазоне 2-3:1 соответственно;

б) промывка дистиллированной водой, сушка;

в) обработка раствором 0,2-0,4% тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора 25-30% аммиака и 0,5-1% нонилфеноксиполиэтоксиэтанола;

г) промывка неполярным органическим растворителем и этанолом, сушка;

д) обработка раствором 10-20% (3-аминопропил)триалкоксисилана в этаноле;

е) промывка этанолом, сушка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неполярного органического растворителя используют циклогексан.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный (3-аминопропил)триалкоксисилан выбран из группы, включающей (3-аминопропил)триметоксисилан и (3-аминопропил)триэтоксисилан.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сушку проводят в течение 1-2 часов при температуре 81-110°C.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные стадии в) - е) повторяют два раза.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные стадии в) - е) повторяют три раза.