Реагенты для лечения окулофарингеальной мышечной дистрофии (офмд) и их применение

Авторы патента:

СЬЮХИ, Дэвид (US)

СТРИНГЗ-УФОМБАХ, Ванесса (US)

C12N15/867 - ретровирусные векторы

C12N15/864 - парвовирусные векторы

C12N15/861 - аденовирусные векторы

C12N15/113 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

A61P27/02 - офтальмологические агенты

A61P21/00 - Лекарственные средства для лечения заболеваний мышечной или нервно-мышечной систем

A61K48/00 - Лекарственные препараты, содержащие генетический материал, который включен в клетки живого организма для лечения генетических заболеваний; для генной терапии

A61K31/7088 - соединения, содержащие три или более нуклеозида или нуклеотида

Владельцы патента RU 2763319:

Бенитек АйПи Холдингз Инк. (US)

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конструкт ДНК–направленной РНК–интерференции (днРНКи) для ингибирования экспрессии белка PABPN1, являющегося причиной окулофарингеальной мышечной дистрофии (ОФМД), конструкт ДНК для лечения окулофарингеальной мышечной дистрофии (ОФМД), вектор экспрессии, содержащий конструкт днРНКи, композицию для ингибирования экспрессии белка PABPN1 (варианты), способ ингибирования экспрессии белка PABPN1, способ лечения окулофарингеальной мышечной дистрофии (ОФМД) у субъекта, страдающего от нее, и набор для ингибирования экспрессии белка PABPN1. Изобретение расширяет арсенал средств для ингибирования экспрессии белка PABPN1. 8 н. и 35 з.п. ф-лы, 20 ил., 4 табл., 9 пр.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает право приоритета по предварительной заявке США № 62/434312, поданной 14 декабря 2016 года, полное содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники

Данное изобретение относится к реагентам для РНК-интерференции (РНКи) для лечения окулофарингеальной мышечной дистрофии (ОФМД), композициям, содержащих их, и их применению для лечения индивидуумов, страдающих ОФМД или предрасположенных к ней.

Уровень техники

ОФМД является наследуемым по аутосомно-доминантному типу, медленно прогрессирующим, дегенеративным мышечным расстройством с поздним началом. Заболевание в основном характеризуется прогрессирующим опущением век (птоз) и трудностями при глотании (дисфагия). Фарингеальные и крикофарингеальные мышцы являются специфическими мишенями при ОФМД. Слабость проксимальных отделов конечностей, как правило, возникает на более поздней стадии прогрессирования заболевания. Мутация, которая вызывает заболевание, представляет собой аномальное увеличение тринуклеотидного повтора (GCN)n в кодирующей области гена полиаланин-связывающего ядерного белка 1 (PABPN1). Данное увеличение приводит к увеличению полиаланинового участка на N-конце белка PABPN1: 10 аланинов, которые присутствуют в нормальном белке, увеличиваются в количестве до 11-18 аланинов в мутантной форме (expPABPN1). Основным патологическим признаком заболевания являются ядерные агрегаты expPABPN1. Неправильный фолдинг увеличенного PABPN1 приводит к накоплению нерастворимых полимерных фибриллярных агрегатов внутри ядер пораженных клеток. PABPN1 является склонным к агрегации белком, а мутантный аланин-увеличенный PABPN1 в ОФМД имеет более высокую скорость агрегации, чем у нормального белка дикого типа. Однако до сих пор неясно, имеют ли ядерные агрегаты при ОФМД патологическую функцию или защитную роль как следствие механизма клеточной защиты.

В настоящее время никакое лечение, фармакологическое или иное, не доступно для ОФМД. Симптоматические хирургические вмешательства могут частично исправить птоз и улучшить глотание у индивидуумов с умеренной и тяжелой степенью поражения. Например, перстнеглоточная миотомия в настоящее время является единственно возможным способом лечения, позволяющим улучшить глотание у этих пациентов. Тем не менее, это не исправляет прогрессирующую деградацию глоточной мускулатуры, которая часто приводит к смерти в результате глотания и удушья.

Соответственно, остается потребность в терапевтических агентах для лечения ОФМД у пациентов, страдающих от них и/или предрасположенных к ним.

Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, статей или тому подобного, которое было включено в данное описание, не должно восприниматься как признание того, что какой-либо или все эти вопросы являются частью предшествующего уровня техники или были общеизвестными в области техники, относящейся к данному раскрытию, как они существовали до даты приоритета каждой из прилагаемых пунктов формулы изобретения.

Сущность изобретения

Данное раскрытие частично основано на признании авторами изобретения того, что в настоящее время не существует терапевтических агентов для лечения ОФМД. Данное изобретение, следовательно, обеспечивает реагенты для РНКи, нацеленные на области мРНК-транскрипта PABPN1, который является причиной ОФМД. Авторы изобретения показали, что эти реагенты для РНКи эффективны для посттранскрипционной супрессии мРНК-транскриптов PABPN1, включая варианты транскриптов, которые в противном случае транслировались бы в мутантный белок PABPN1, вызывающий ОФМД, то есть в те белки PABPN1, которые содержат увеличенный полиаланиновый участок. Например, было показано, что иллюстративные реагенты для РНКи согласно раскрытию ингибируют или уменьшают экспрессию белка PABPN1 in vitro. Кроме того, в данном раскрытии представлены реагенты для синтеза человеческого белка PABPN1 дикого типа, имеющего мРНК-транскрипт, на который не нацелены реагенты для РНКи согласно данному изобретению (далее «замещающие реагенты PABPN1»). Авторы изобретения показали, что, когда они экспрессируются вместе с реагентами для РНКи согласно раскрытию, замещающие препараты PABPN1 способны продуцировать транскрипт PABPN1, который устойчив к реагентам для РНКи и который способен транслироваться в функциональный белок PABPN1. Данные результаты авторов изобретения обеспечивают реагенты, которые могут иметь терапевтическое применение при лечении ОФМД.

Соответственно, данное раскрытие обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, которая кодирует короткую шпилечную микроРНК (кшмиР - short hairpin micro-RNA), причем указанная кшмиР содержит:

эффекторную последовательность длиной по меньшей мере 17 нуклеотидов;

эффекторную комплементарную последовательность;

последовательность стебля-петли; и

остов первичной микроРНК (пер-миРНК - pri-miRNA - primary micro RNA);

при этом эффекторная последовательность по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13. Предпочтительно, чтобы эффекторная последовательность имела длину менее 30 нуклеотидов. Например, подходящая эффекторная последовательность может иметь длину 17-29 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы эффекторная последовательность имела длину 20 нуклеотидов. Более предпочтительно, эффекторная последовательность будет иметь длину 21 нуклеотид, а эффекторная комплементарная последовательность будет иметь длину 20 нуклеотидов.

Эффекторная последовательность может содержать 4 ошибки спаривания оснований относительно области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13, к которой эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 3 ошибки спаривания оснований относительно области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13, к которой эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 2 ошибки спаривания оснований относительно области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13, к которой эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 1 ошибку спаривания оснований относительно области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13, к которой эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В еще одном примере эффекторная последовательность на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13. Когда присутствуют ошибки спаривания, предпочтительно, чтобы они не находились в области, соответствующей затравочной области кшмиР, то есть в нуклеотидах 2-8 эффекторной последовательности.

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 1, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР2»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 2, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР3»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 3, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР4»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 4, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР5»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 5, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР6»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 6, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР7»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 7, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР9»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 8, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР11»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 9, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР13»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 10, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР14»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 11, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР15»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 12, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР16»).

Иллюстративные кшмиР, содержащие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 13, описаны в данном документе (далее называемые как «кшмиР17»).

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, выбранную из группы, состоящей из:

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 14, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 14; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР2);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 16, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 16; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР3);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 18; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР4);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 20; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР5);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 22, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 22; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР6);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 24, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 24; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР7);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 26; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР9);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 28, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 28; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР11);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 30, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 30; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР13);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 32, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 32; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР14);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 34, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 34; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР15);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 36, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 36; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР16);

кшмиР, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 38, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 38; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности (кшмиР17).

В другом примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, выбранную из группы, состоящей из:

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР2);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР3);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР4);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 21, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР5);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 23, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР6);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 25, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 25, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР7);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР9);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР11);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР13);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР14);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 35, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР15);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 37, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР16); и

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39, и способна образовывать с ней дуплекс (кшмиР17).

Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, описанной в данном документе, может содержать эффекторную комплементарную последовательность, содержащую 1, 2, 3 или 4 ошибок спаривания относительно соответствующей эффекторной последовательности, при условии, что когнатные эффекторные и эффекторные комплементаные последовательности способны образовывать область дуплекса.

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14 (кшмиР2);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18 (кшмиР4);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20 (кшмиР5);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22 (кшмиР6);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 25, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24 (кшмиР7);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26 (кшмиР9);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28 (кшмиР11);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32 (кшмиР14);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34 (кшмиР15);

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36 (кшмиР16); и

кшмиР, содержащей эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17).

кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой согласно данному раскрытию, может содержать в направлении от 5' к 3':

5'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК;

эффекторную комплементарную последовательность;

последовательность стебля-петли;

эффекторную последовательность; и

3'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК.

кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой согласно данному раскрытию, может содержать в направлении от 5' к 3':

5'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК;

эффекторную последовательность;

последовательность стебля-петли;

эффекторную комплементарную последовательность; и

3'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК.

Подходящие последовательности петли могут быть выбраны из известных в данной области техники. Тем не менее, иллюстративная последовательность стебля-петли указана в SEQ ID NO: 40.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит последовательность ДНК, выбранную из последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 56-68. В соответствии с этим примером кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой согласно раскрытию, может содержать последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 43-55.

Специалисту в данной области будет понятно, что нуклеиновую кислоту в соответствии с данным раскрытием можно комбинировать или использовать в комбинации с другими терапевтическими агентами для лечения ОФМД, например, такими как другие агенты РНКи, нацеленные на РНК-транскрипты, соответствующие белку PABPN1, который является причиной ОФМД. Соответственно, данное раскрытие обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, как описано в данном документе, в комбинации с одним или более другими агентами РНКи для лечения ОФМД. В одном примере предоставлено множество нуклеиновых кислот, содержащих:

(a) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе; и

(b) по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, выбранную из:

(i) нуклеиновой кислоты в соответствии с нуклеиновыми кислотами, описанными в данном документе; или

(ii) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или короткую шпилечную РНК (кшРНК), содержащую эффекторную последовательность длиной по меньшей мере 17 нуклеотидов и эффекторную комплементарную последовательность, причем эффекторная последовательность по существу комплементарна РНК-транскрипту, соответствующему белку PABPN1, который является причиной окулофарингеальной мышечной дистрофии (ОФМД);

при этом кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой в (а), и кшмиР или кшРНК, кодируемая нуклеиновой кислотой в (b), содержат разные эффекторные последовательности.

В одном примере эффекторная последовательность кшмиР или кшРНК в (b) (ii) по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13. Предпочтительно, эффекторная последовательность кшмиР или кшРНК в (b) (ii), которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанной в любом из SEQ ID NO: 1-13, будет менее 30 нуклеотидов в длину. Например, подходящая эффекторная последовательность кшмиР или кшРНК может иметь длину 17-29 нуклеотидов.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР2, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР3, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР4, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР5, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР6, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР7, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР9, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР11, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР13, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР14, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР15, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР16, как описано в данном документе.

В одном примере по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот из множества содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР17, как описано в данном документе.

Множество нуклеиновых кислот в соответствии с данным раскрытием может содержать до 10 нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе, т.е. кшмиР2-7, кшмиР9, кшмиР11 и кшмиР13-17, такие как две нуклеиновые кислоты или три нуклеиновые кислоты, или четыре нуклеиновые кислоты, или пять нуклеиновых кислот, или шесть нуклеиновых кислот, или семь нуклеиновых кислот, или восемь нуклеиновых кислот, или девять нуклеиновых кислот, или десять нуклеиновых кислот. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит две нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В другом примере множество нуклеиновых кислот содержит три нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит четыре нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит пять нуклеиновых кислот согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит шесть нуклеиновых кислот согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит семь нуклеиновых кислот согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит восемь нуклеиновых кислот согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит девять нуклеиновых кислот согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество РНК содержит десять нуклеиновых кислот согласно раскрытию, каждая из которых кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В соответствии с любым из примеров, описанных в данном документе, одна или более нуклеиновых кислот во множестве могут кодировать кшРНК, как описано в данном документе.

В одном примере множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты, каждая из которых содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, выбранную из группы, состоящей из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17, как описано в данном документе.

Одно иллюстративное множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию изобретению содержит одну нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР13, как описано в данном документе, и другую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР17, как описано в данном документе.

Другое иллюстративное множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию содержит одну нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР3, как описано в данном документе, и другую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР14, как описано в данном документе.

Одна или каждая нуклеиновая кислота в соответствии с данным раскрытием может содержать или находиться в функциональной связи с одной или более последовательностей терминаторов транскрипции. Например, одна или каждая нуклеиновая кислота может содержать последовательность терминатора транскрипции на 3'-конце последовательности, кодирующей кшмиР. Такие последовательности будут зависеть от выбора промотора и будут известны специалисту в данной области техники. Однако в данном документе описаны подходящие варианты последовательностей промотора и терминатора транскрипции для использования в соответствии с нуклеиновой кислотой согласно раскрытию или их множеством.

Альтернативно или в дополнение, одна или каждая нуклеиновая кислота в соответствии с данным раскрытием может содержать или находиться в функциональной связи с последовательностью инициации транскрипции. Например, одна или каждая нуклеиновая кислота может содержать последовательность инициации транскрипции на 5'-конце последовательности, кодирующей кшмиР. Такие последовательности будут известны специалисту в данной области техники.

Нуклеиновая кислота в соответствии с данным раскрытием или множество нуклеиновых кислот, как описано в данном документе, также могут быть представлены в форме или в составе конструкта ДНК-направленной РНК-интерференции (днРНКи- ddRNAi - DNA-directed RNA interference), который способен экспрессировать одну или более кшмиР, которые кодируются нуклеиновой кислотой (ами) согласно раскрытию.

В одном примере конструкт днРНКи содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, так что конструкт днРНКи кодирует по меньшей мере две кшмиР, нацеленных на РНК-транскрипт, соответствующий белку PABPN1, который является причиной ОФМД, каждая из которых отличается друг от друга.

В одном примере каждая из по меньшей мере двух нуклеиновых кислот в конструкте днРНКи кодирует кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 и 13 Таким образом, конструкт днРНКи в соответствии с этим примером кодирует две кшмиР, выбранных из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17, как описано в данном документе.

Один пример конструкта днРНКи согласно раскрытию содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты, выбранные из группы, состоящей из:

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 15 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14 (кшмиР2);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 17 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 21 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20 (кшмиР5);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 27 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26 (кшмиР9);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 31 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 33 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 39 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17).

В одном примере конструкт днРНКи содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты, выбранные из группы, состоящей из:

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56 (кшмиР2);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59 (кшмиР5);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62 (кшмиР9);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

Один иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит:

Конструкт днРНКи в соответствии с этим примером может содержать:

(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13); и

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

Другой иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32 (кшмиР14).

Конструкт днРНКи в соответствии с этим примером может содержать:

(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3); и

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14).

В одном примере конструкт днРНКи, как описано в данном документе, содержит один промотор, который функционально связан с нуклеиновой кислотой или каждой нуклеиновой кислотой, кодирующей кшмиР согласно раскрытию. В другом примере каждая нуклеиновая кислота, кодирующая кшмиР согласно раскрытию, функционально связана с отдельным промотором. Например, промотор(ы) расположен(ы) в прямом направлении от соответствующей нуклеиновой кислоты (кислот), кодирующей кшмиР.

В соответствии с примером, в котором конструкт днРНКи содержит несколько промоторов, промоторы могут быть одинаковыми или разными. Иллюстративные промоторы, которые могут быть использованы, представляют собой мышечно-специфические промоторы, такие как, например, Spc512 и CK8. Другие промоторы, которые можно использовать, представляют собой промоторы РНК-полимеразы III, такие как, например, промоторы U6 и H1. Иллюстративные промоторы U6 представляют собой промоторы U6-1, U6-8 и U6-9.

Множество нуклеиновых кислот, как описано в данном документе, также может быть обеспечено в форме множества конструктов днРНКи или содержаться в них, каждый из которых способен экспрессировать одну или более кшмиР, которые кодируются/кодируется нуклеиновой кислотой (кислотами) согласно данному раскрытию. Например, каждая нуклеиновая кислота во множестве нуклеиновых кислот может быть представлена в форме или может быть включена в отдельный конструкт днРНКи.

В одном примере множество конструктов днРНКи содержит по меньшей мере два конструкта днРНКи, каждая из которых содержит нуклеиновую кислоту из множества нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, так что вместе конструкты днРНКи кодируют по меньшей мере две кшмиР, нацеленные на РНК-транскрипт, соответствующий белку PABPN1, который является причиной ОФМД, каждая из которых отличается друг от друга.

В одном примере каждый из по меньшей мере двух конструктов днРНКи кодирует кшмиР, содержащий эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 и 13. Таким образом, множество конструктов днРНКи в соответствии с этим примером совместно кодируют две кшмиР, выбранные из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17, как описано в данном документе.

Один пример из множества конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит по меньшей мере два конструкта днРНКи, выбранные из группы, состоящей из:

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 15 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14 (кшмиР2);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 17 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 21 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20 (кшмиР5);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 27 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26 (кшмиР9);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 31 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 33 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32 (кшмиР14); и

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 39 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17).

В одном примере множество конструктов днРНКи содержит по меньшей мере конструкты днРНКи, выбранные из группы, состоящей из:

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56 (кшмиР2);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59 (кшмиР5);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62 (кшмиР9);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере каждый из по меньшей мере двух конструктов днРНКи кодирует кшмиР, содержащий эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 2, 9, 10 и 13. Таким образом, множество конструктов днРНКи в соответствии с этим примером совместно кодирует два кшмиР, выбранных из кшмиР3, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17, как описано в данном документе.

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 17 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 31 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13);

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 33 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32 (кшмиР14); и

конструкта днРНКи, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанной в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна SEQ ID NO: 39 и способна образовывать с ней дуплекс, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17).

В одном примере по меньшей мере два конструкта днРНКи выбирают из группы, состоящей из:

Одно иллюстративное множество конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит:

(a) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13); и

(b) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17).

Множество конструктов днРНКи в соответствии с этим примером может содержать:

(a) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13); и

(b) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

Другое иллюстративное множество конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит:

(a) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3); и

(b) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32 (кшмиР14).

Множество конструктов днРНКи в соответствии с этим примером может содержать:

(a) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3); и

(b) конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14).

Каждый конструкт днРНКи во множестве конструктов днРНКи, как описано в данном документе, содержит один промотор, который функционально связан с одной или каждой нуклеиновой кислотой, кодирующей кшмиР, содержащейся в ней. Когда конструкт днРНКи во множестве конструктов днРНКи содержит более одной нуклеиновой кислоты, кодирующей кшмиР, каждая нуклеиновая кислота может быть функционально связана с одним и тем же промотором или функционально связана с отдельным промотором. В каждом из приведенных выше примеров, описывающих множество конструктов днРНКи, промотор(ы) расположен(ы) в прямом направлении от соответствующей нуклеиновой кислоты (кислот), кодирующей кшмиР.

Иллюстративные промоторы, которые могут быть использованы, представляют собой мышечно-специфические промоторы, такие как, например, Spc512 и CK8. Другие промоторы, которые можно использовать, представляют собой промоторы РНК-полимеразы III, такие как, например, промоторы U6 и H1. Иллюстративные промоторы U6 представляют собой промоторы U6-1, U6-8 и U6-9. Промоторы, содержащиеся в соответствующих конструктах днРНКи из множества конструктов днРНКи, могут быть одинаковыми или разными.

Данное раскрытие также обеспечивает конструкт ДНК, содержащий:

(a) конструкт днРНКи, как описано в данном документе; и

(b) конструкт PABPN1, содержащий последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, имеющий мРНК-транскрипт, на который не нацеливается кшмиР, кодируемая конструктом днРНКи. Предпочтительно, последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, оптимизируют по кодонам, так что на ее мРНК-транскрипт не нацеливается кшмиР конструкта днРНКи. В одном примере функциональный белок PABPN1 представляет собой человеческий белок PABPN1 дикого типа, например, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 74. В одном примере кодон-оптимизированная последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, указана в SEQ ID NO: 73.

Конструкт ДНК может содержать один или более промоторов. Иллюстративные промоторы для использования в конструктах ДНК согласно раскрытию представляют собой мышечно-специфические промоторы, такие как, например, Spc512 и CK8.

Согласно одному примеру конструкт ДНК содержит промотор, который функционально связан с конструктом PABPN1 и конструктом днРНКи, причем промотор расположен в прямом направлении от конструкта PABPN1 и конструкта днРНКи.

В одном примере конструкт ДНК содержит в направлении от 5’ к 3':

(a) мышечно-специфический промотор, например, Spc512;

(b) конструкт PABPN1, как описано в данном документе, содержащий последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, имеющий мРНК-транскрипт, на который не нацеливаются кшмиР, кодируемые конструктом днРНКи; и

(c) конструкт днРНКи согласно раскрытию, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР13, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР17, как описано в данном документе.

В другом примере конструкт ДНК содержит:

(a) мышечно-специфический промотор, например, Spc512;

(c) конструкт днРНКи согласно раскрытию, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР3, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР14, как описано в данном документе.

В другом примере конструкт PABPN1 и конструкт днРНКи, каждый функционально связан с отдельными промоторами в конструкте ДНК. Например, промотор, который находится в функциональной связи с конструктом PABPN1, будет функционально связан с последовательностью ДНК, кодирующей функциональный белок PABPN1, содержащийся в ней. Один или каждый промотор, который находится в функциональной связи с конструктом днРНКи, будет функционально связан с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими кшмиР согласно раскрытию, содержащемуся в конструкте днРНКи. Иллюстративные промоторы для использования в конструктах ДНК согласно раскрытию представляют собой мышечно-специфические промоторы, такие как, например, Spc512 и CK8.

Один конструкт ДНК в соответствии с этим примером содержит в направлении от 5' к 3':

(a) мышечно-специфический промотор, например, промотор CK8, расположенный в прямом направлении от конструкта днРНКи согласно раскрытию, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР13, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР17, как описано в данном документе; и

(b) мышечно-специфический промотор, например, промотор Spc512, расположенный в прямом направлении от конструкта PABPN1, как описано в данном документе, содержащий последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, имеющий мРНК-транскрипт, на который не нацеливаются кшмиР, кодируемые конструктом днРНКи.

Другой конструкт ДНК в соответствии с этим примером содержит в направлении от 5' к 3':

(a) мышечно-специфический промотор, например, промотор CK8, расположенный в прямом направлении от конструкта днРНКи согласно раскрытию, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР3, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР14, как описано в данном документе; и

Иллюстративный конструкт днРНКи, кодирующий кшмиР13 и кшмиР17 для включения в конструкт ДНК согласно раскрытию, может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17). Например, конструкт днРНКи в соответствии с этим примером конструкта ДНК может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

Иллюстративный конструкт днРНКи, кодирующий кшмиР3 и кшмиР14 для включения в конструкт ДНК согласно раскрытию, может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34 (кшмиР14); Например, конструкт днРНКи в соответствии с этим примером конструкта ДНК может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14).

Данное раскрытие также обеспечивает вектор экспрессии, содержащий конструкт днРНКи согласно раскрытию или множество конструктов днРНКи согласно раскрытию или конструкт ДНК согласно раскрытию.

Данное раскрытие также обеспечивает множество векторов экспрессии, каждый из которых содержит конструкт днРНКи согласно раскрытию. Например, один или более из множества векторов экспрессии содержат множество конструктов днРНКи, как описано в данном документе. В другом примере каждый вектор экспрессии во множестве векторов экспрессии содержит множество конструктов днРНКи, как описано в данном документе. В дополнительном примере каждый вектор экспрессии во множестве векторов экспрессии содержит единый конструкт днРНКи, как описано в данном документе. Любым из вышеперечисленных способов в данном абзаце множество векторов экспрессии может совместно экспрессировать множество кшмиР в соответствии с данным раскрытием.

Данное раскрытие также обеспечивает множество векторов экспрессии, содержащих:

(a) вектор экспрессии, содержащий один или более конструктов днРНКи согласно раскрытию; и

(b) вектор экспрессии, содержащий конструкт PABPN1, содержащую последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, имеющий мРНК-транскрипт, на который не нацеливаются кшмиР, кодируемые конструктом днРНКи.

Предпочтительно, последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, оптимизируют по кодонам, так что на ее мРНК-транскрипт не нацеливается кшмиР конструкта днРНКи. В одном примере функциональный белок PABPN1 представляет собой человеческий белок PABPN1 дикого типа, например, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 74. В одном примере кодон-оптимизированная последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, указана в SEQ ID NO: 73.

В одном примере последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, может быть функционально связана с промотором, содержащимся в конструкте PABPN1, и расположена в прямом направлении от последовательности ДНК, кодирующей функциональный белок PABPN1. В другом примере вектор экспрессии, содержащий конструкт PAPBN1, содержит промотор в прямом направлении от конструкта PABPN1 и находится в функциональной связи с последовательностью ДНК, кодирующей функциональный белок PABPN1. Иллюстративные промоторы для использования в векторе(ах) экспрессии согласно раскрытию представляют собой мышечно-специфические промоторы, такие как, например, Spc512 и CK8.

В одном примере один или каждый вектор экспрессии представляет собой плазмиду или миникольцо.

В одном примере плазмида или миникольцо, или вектор экспрессии, или конструкт днРНКи находится в комплексе с катионным ДНК-связывающим полимером, например, полиэтиленимином.

В другом примере один или каждый вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор. Например, вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), ретровирусного вектора, аденовирусного (AdV) вектора и лентивирусного (LV) вектора.

Данное раскрытие также обеспечивает композицию, содержащую конструкт днРНКи и/или множество конструктов днРНКи, и/или вектор экспрессии, и/или множество векторов экспрессии, как описано в данном документе. В одном примере композиция также может содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей.

Данное раскрытие также обеспечивает способ ингибирования экспрессии белка PABPN1, который является причиной ОФМД у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта днРНКи, множества конструктов днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии или композицию, описанных в данном документе.

Данное раскрытие также обеспечивает способ лечения ОФМД у субъекта, страдающего от него, включающий введение субъекту нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкты днРНКи, множества конструктов днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии или композицию, описанную в данном документе. Способ может включать введение множества векторов экспрессии субъекту вместе, одновременно или последовательно.

Данное раскрытие также обеспечивает набор, содержащий:

(a) один или более агентов для ингибирования экспрессии белка PABPN1, который является причиной ОФМД, причем указанный агент(ы) выбирают из нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта днРНКи, множества конструктов днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии или композиции, описанной в данном документе; и

(b) вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, имеющий мРНК-транскрипт, на который не нацеливаются кшмиР, экспрессируемые агентом в (а).

Предпочтительно, последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, оптимизирована таким образом, что ее транскрипт мРНК не нацеливается кшмиР, кодируемых агентом в (а). В одном примере функциональный белок PABPN1 представляет собой человеческий белок PABPN1 дикого типа, например, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 74. В одном примере кодон-оптимизированная последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, указана в SEQ ID NO: 73.

Последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, может быть функционально связана с промотором, содержащимся в векторе экспрессии в (b), и расположена в прямом направлении от последовательности ДНК, кодирующей функциональный белок PABPN1. Иллюстративный промотор для использования в векторе экспрессии в (b) представляет собой мышечно-специфический промотор, такой как, например, промотор Spc512 или CK8.

Данное раскрытие также обеспечивает набор, содержащий множество векторов экспрессии, описанных в данном документе, упакованных в виде отдельных компонентов.

Данное раскрытие также обеспечивает набор, содержащий нуклеиновую кислоту, множество нуклеиновых кислот, конструкт днРНКи, множество конструктов днРНКи, конструкт ДНК, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии или композицию, описанную в данном документе, в упаковке с инструкцией по применению в способе согласно раскрытию.

В одном примере набор, описанный в данном документе, предназначен для использования при лечении ОФМД в соответствии со способом, описанным в данном документе.

Данное раскрытие также обеспечивает использование нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструктов днРНКи, множества конструктов днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции, описанных в данном документе, в приготовлении лекарственного средства, например, для лечения ОФМД у субъекта и/или в способе, раскрытом в данном документе.

Данное раскрытие также обеспечивает нуклеиновую кислоту, множество нуклеиновых кислот, конструкт днРНКи, множество конструктов днРНКи, конструкт ДНК, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композицию, описанные в данном документе, для применения в терапии. Например, нуклеиновая кислота, множество нуклеиновых кислот, конструкт днРНКи, множество конструктов днРНКи, конструкт ДНК, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композиция могут быть использованы для лечения ОФМД у субъекта, который страдает от нее или предрасположен к ней, и/или в способе, раскрытом в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 продемонстрирована спрогнозированная вторичная структура иллюстративного конструкта кшмиР, содержащего 5'-фланкирующую область, смысловую цепь киРНК; последовательность соединения стебель/петля, антисмысловую цепь киРНК и 3'-фланкирующую область.

На Фиг. 2 продемонстрирована wtPABPN1-ингибирующую активность кшмиР, имеющих антисмысловые и смысловые последовательности кшмиР, обозначенные как кшмиР2-17, относительно контроля пСайленсер в клетках HEK293. На данном графике показано, что все кшмиР, за исключением кшмиР11, снижали уровень экспрессии люциферазы из репортера люциферазы wtPABPN1.

На Фиг. 3 продемонстрирована optPABPN1-ингибирующая активность кшмиР, имеющих антисмысловые и смысловые последовательности кшмиР, обозначенные как кшмиР 2-17, относительно контроля пСайленсер в клетках HEK293. На данном графике показано отсутствие подавления экспрессии у репортера люциферазы optPABPBN1.

На Фиг. 4(А) представлен вестерн-блот, демонстрирующий уровни FLAG-меченного белка wtPABPN1 относительно белка Hsp90, экспрессируемого в клетках HEK293T, трансфицированных плазмидами, кодирующими кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14, кшмиР16 или кшмиР17. Это демонстрирует, что все выбранные кшмиР снижали экспрессию wtPABPN1.

На Фиг. 4(B) продемонстрирован процент ингибирования FLAG-меченного белка wtPABPN1 в клетках HEK293 по сравнению с контрольным пСайленсер. На данном графике показано, что все выбранные кшмиР снижали экспрессию wtPABPN1 с процентным ингибированием >90%, как определено денситометрическим анализом вестерн-блоттинга на Фиг. 4(A).

На Фиг. 5(А) представлен вестерн-блот, демонстрирующий уровни FLAG-меченного кодон-оптимизированного белка PABPN1 относительно белка Hsp90, экспрессируемого в клетках HEK293T, трансфицированных кшмиР-плазмидами, кодирующими кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14, кшмиР16 или кшмиР17. Это демонстрирует, что ни одна из кшмиР не приводила к ингибированию продукта экспрессии кодон-оптимизированного конструкта PABPN1.

На Фиг. 5(B) продемонстрирован процент ингибирования FLAG-меченного кодон-оптимизированного белка PABPN1 в клетках HEK293 по сравнению с контрольным пСайленсер. На данном графике показано, что ни одна из кшмиР не приводила к ингибированию продукта экспрессии кодон-оптимизированного конструкта PABPN1, как определено при помощи денситометрии вестерн-блота на Фиг. 5(A).

На Фиг. 6 продемонстрирован процент ингибирования эндогенной экспрессии wtPABPN1 в клетках HEK293T с помощью кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14, кшмиР16 или кшмиР17, как определено при помощи анализа методом количественной ПЦР. На данном графике показано, что кшмиР подавляли экспрессию wtPABPN1 с процентом ингибирования в диапазоне от 16,4% до 49,1% (в среднем 35,5%).

На Фиг. 7 продемонстрирован процент ингибирования эндогенной экспрессии PABPN1 в клетках C2C12 в ответ на ингибирование с помощью кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14, кшмиР16 или кшмиР17, как определено при помощи количественной ПЦР. На графике показано, что все отдельные кшмиР, за исключением кшмиР 16 (процент ингибирования ~ 43%), подавляли экспрессию PABPN1 в клетках C2C12 со средним процентом ингибирования приблизительно 80% по сравнению с контролем пСайленсер.

На Фиг. 8 продемонстрирован процент ингибирования экспрессии PABPN1 в клетках C2C12 с помощью кшмиР: кшмиР13, кшмиР17, кшмиР3 и кшмиР14 по отдельности; кшмиР13 в комбинации с кшмиР17 (кшмиР13/17); и кшмиР3 в комбинации с кшмиР14 (кшмиР3/14), как определено при помощи количественной ПЦР. На данном графике показано, что совместная трансфекция кшмиР13/17 приводила к проценту ингибирования экспрессии PABPN1 равному 84,4% по сравнению с 92,5% и 76,7% для отдельных кшмиР13 и кшмиР17, соответственно, а совместная трансфекция кшмиР3/14 приводила к проценту ингибирования равному 79,0% по сравнению с 76,2% и 80,4% для отдельных кшмиР3 и кшмиР14, соответственно.

На Фиг. 9 продемонстрирован процент ингибирования экспрессии PABPN1 в клетках ARPE-19 с помощью кшмиР13, кшмиР17, кшмиР3 и кшмиР14 по отдельности; кшмиР13 в комбинации с кшмиР17 (кшмиР13/17); и кшмиР3 в комбинации с кшмиР14 (кшмиР3/14), как определено при помощи анализа методом количественной ПЦР. На графике показано, что процент ингибирования экспрессии PABPN1 увеличился в 1,14 раза между 48 и 72 часами в клетках ARPE-19.

На Фиг. 10(A) продемонстрированы стандартные кривые, полученные с помощью количественной ПЦР, определяющие общее количество кшмиР, экспрессированных в клетках C2C12, трансфицированных кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17.

На Фиг. 10(B) продемонстрирована нелинейная стандартная кривая, полученная с помощью количественной ПЦР, определяющая общее количество кшмиР, экспрессированных в клетках C2C12, трансфицированных кшмиР3.

На Фиг. 11 продемонстрированы уровни экспрессии кшмиР3, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17 в клетках C2C12, трансдуцированных кшмиР-векторами, экспрессирующими указанные кшмиР.

Фиг. 12(А) представляет собой схему, иллюстрирующую конструкт для одновременного генного сайленсинга эндогенного PABPN1 и замены кодон-оптимизированным PABPN1, генерируемым путем субклонирования двух кшмиР, нацеленных на wtPABPN1, в 3'-нетранслируемую область кодон-оптимизированного транскрипта PABPN1 в остове вектора на основе pAAV2.

Фиг. 12(B) представляет собой схему, иллюстрирующую конструкт для одновременного генного сайленсинга эндогенного PABPN1 и замены кодон-оптимизированным PABPN1, генерируемым путем субклонирования двух кшмиР, нацеленных на wtPABPN1, в последовательность в прямом направлении от optPABPN1.

На Фиг. 13 продемонстрирована флуоресценция in vivo в конечности мыши после инъекции AAV9-eGFP.

Фиг. 14 представляет собой схему, иллюстрирующую SR-конструкт, сконструированный для одновременного генного сайленсинга эндогенного PABPN1 и замены кодон-оптимизированным PABPN1, генерируемым путем субклонирования двух кшмиР, нацеленных на wtPABPN1 (кшмиР17 и кшмиР13), в 3'-нетранслируемую область транскрипта кодон-оптимизированного PABPN1 в остове вектора на основе pAAV2.

На Фиг. 15 продемонстрирован процент ингибирования PABPN1 у мышей A17, которых лечили с помощью конструкта для сайленсинга и замены (далее «SR-конструкт»), и продемонстрировано, что устойчивое ингибирование PABPN1 достигается как при высоких, так и при низких дозах.

На Фиг. 16 продемонстрирован уровень экспрессии кодон-оптимизированного PABPN1 относительно PABPN1 дикого типа (включая мутантную форму) у мышей A17, получавших SR-конструкт в высоких и низких дозах.

На Фиг. 17 продемонстрирована иммунофлюоресцентная гистохимия для определения PABPN1 и ламинина в срезах мышц передней большеберцовой кости (TA) у (i) мышей A17, получавших физиологический раствор, (ii) мышей FvB, получавших физиологический раствор, (iii) мышей A17, получавших SR-конструкт в высоких и низках дозах. Количество PABPN1-положительных внутриядерных включений (INI) значительно снижается в мышцах от мышей, получавших SR-конструкт как в высоких, так и в низких дозах.

На Фиг. 18 продемонстрирован уровень ядер, содержащих INI (выраженный в процентах) в срезах мышц передней большеберцовой кости (TA) от (i) мышей A17, получавших физиологический раствор, (ii) мышей FvB, получавших физиологический раствор, (iii) мышей A17, получавших SR-конструкт в высоких и низких дозах. На данном графике проиллюстрировано, что лечение SR-конструктом как в высоких, так и в низких дозах снижает количество INI до около 10% по сравнению с мышцами A17, инъецированными физиологическим раствором.

На Фиг. 19 продемонстрирована масса мышц передней большеберцовой кости (TA), иссеченных у (i) мышей A17, получавших физиологический раствор, (ii) мышей FvB, получавших физиологический раствор, (iii) мышей A17, получавших SR-конструкт в высоких и низких дозах. На данном графике показано, что лечение SR-конструктом как в высоких, так и в низких дозах восстанавливает мышечную массу до уровней, близких к дикому типу животных FvB. Все измерения мышц производились в день умерщвления, через 14 или 20 недель после инъекции.

На Фиг. 20 продемонстрирована максимальная изометрическая сила мыщц передней большеберцовой кости (TA), иссеченных у (i) мышей A17, получавших физиологический раствор, (ii) мышей FvB, получавших физиологический раствор, (iii) мышей A17, получавших SR-конструкт в высоких и низких дозах. Данный график демонстрирует, что лечение SR-конструктом как в высоких, так и в низких дозах восстанавливают примерно на 66% разницу в уменьшенной силе, отмеченной у мышей A17 по сравнению с животными FvB дикого типа. Все измерения мышц производились в день умерщвления, через 14 или 20 недель после инъекции. Статистические данные представлены в виде непарного t-критерия Стьюдента относительно мышей A17, получавших физиологический раствор. * p <0,05, ** p <0,01.

Ключ к перечню последовательностей

SEQ ID NO: 1: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 2 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 2: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 3 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 3: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 4 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 4: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 5 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 5: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 6 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 6: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 7 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 7: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 9 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 8: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 11 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 9: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 13 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 10: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 14 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 11: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 15 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 12: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 16 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 13: Последовательность РНК для области в мРНК-транскрипте, соответствующего белку PABPN1, обозначенная как область 17 мРНК PABPN1.

SEQ ID NO: 14: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР2.

SEQ ID NO: 15: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР2.

SEQ ID NO: 16: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР3.

SEQ ID NO: 17: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР3.

SEQ ID NO: 18: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР4.

SEQ ID NO: 19: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР4.

SEQ ID NO: 20: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР5.

SEQ ID NO: 21: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР5.

SEQ ID NO: 22: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР6.

SEQ ID NO: 23: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР6.

SEQ ID NO: 24: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР7.

SEQ ID NO: 25: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР7.

SEQ ID NO: 26: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР9.

SEQ ID NO: 27: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР9.

SEQ ID NO: 28: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР11.

SEQ ID NO: 29: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР11.

SEQ ID NO: 30: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР13.

SEQ ID NO: 31: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР13.

SEQ ID NO: 32: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР14.

SEQ ID NO: 33: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР14.

SEQ ID NO: 34: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР15.

SEQ ID NO: 35: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР15.

SEQ ID NO: 36: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР16.

SEQ ID NO: 37: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР16.

SEQ ID NO: 38: РНК эффекторная комплементарная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР17.

SEQ ID NO: 39: РНК эффекторная последовательность для кшмиР обозначена как кшмиР17.

SEQ ID NO: 40: Последовательность стебля-петли РНК для кшмиР

SEQ ID NO: 41: 5'-фланкирующая последовательность остова пер-миРНК.

SEQ ID NO: 42: 3'-фланкирующая последовательность остова пер-миРНК.

SEQ ID NO: 43: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР2.

SEQ ID NO: 44: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР3.

SEQ ID NO: 45: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР4.

SEQ ID NO: 46: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР5.

SEQ ID NO: 47: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР6.

SEQ ID NO: 48: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР7.

SEQ ID NO: 49: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР9.

SEQ ID NO: 50: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР11.

SEQ ID NO: 51: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР13.

SEQ ID NO: 52: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР14.

SEQ ID NO: 53: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР15.

SEQ ID NO: 54: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР16.

SEQ ID NO: 55: Последовательность РНК для кшмиР обозначена как кшмиР17.

SEQ ID NO: 56: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР2.

SEQ ID NO: 57: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР3.

SEQ ID NO: 58: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР4.

SEQ ID NO: 59: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР5.

SEQ ID NO: 60: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР6.

SEQ ID NO: 61: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР7.

SEQ ID NO: 62: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР9.

SEQ ID NO: 63: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР11.

SEQ ID NO: 64: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР13.

SEQ ID NO: 65: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР14.

SEQ ID NO: 66: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР15.

SEQ ID NO: 67: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР16.

SEQ ID NO: 68: Последовательность ДНК, кодирующая кшмиР, обозначена как кшмиР17.

SEQ ID NO: 69: Последовательность ДНК для двойного конструкта версии 1, кодирующего кшмиР3 и кшмиР14 под контролем мышечно-специфического промотора CK8 и кодон-оптимизированный PABPN1 под контролем Spc512.

SEQ ID NO: 70: Последовательность ДНК для двойного конструкта версии 1, кодирующего кшмиР17 и кшмиР13 под контролем мышечно-специфического промотора CK8 и кодон-оптимизированный PABPN1 под контролем Spc512.

SEQ ID NO: 71: Последовательность ДНК для двойного конструкта версии 2, кодирующего coPABPN1 и кшмиР, обозначенных как кшмиР3 и кшмиР14, под контролем Spc512.

SEQ ID NO: 72: Последовательность ДНК для двойного конструкта версии 2, кодирующего coPABPN1 и кшмиР, обозначенных кшмиР17 и кшмиР13, под контролем Spc512.

SEQ ID NO: 73 Последовательность ДНК для кодон-оптимизированной последовательности кДНК PABPN1 человека.

SEQ ID NO: 74 Аминокислотная последовательность для кодон-оптимизированного человеческого белка PABPN1.

SEQ ID NO: 75 Аминокислотная последовательность для человеческого белка PABPN1 дикого типа с FLAG-меткой.

SEQ ID NO: 76 Аминокислотная последовательность для кодон-оптимизированного человеческого белка PABPN1 с FLAG-меткой.

SEQ ID NO: 77 Последовательность ДНК для праймера обозначена wtPABPN1-Fwd.

SEQ ID NO: 78 Последовательность ДНК для праймера обозначена как wtPABPN1-Rev

SEQ ID NO: 79 Последовательность ДНК для зонда обозначена как wtPABPN1-Probe (probe-зонд)

SEQ ID NO: 80 Последовательность ДНК для праймера обозначена как optPABPN1-Fwd.

SEQ ID NO: 81 Последовательность ДНК для праймера обозначена как optPABPN1-Rev

SEQ ID NO: 82 Последовательность ДНК для зонда обозначена как optPABPN1-Probe

SEQ ID NO: 83 Последовательность ДНК для праймера обозначена как кшмиР3-FWD

SEQ ID NO: 84 Последовательность ДНК для праймера обозначена кшмиР13-FWD

SEQ ID NO: 85 Последовательность ДНК для праймера обозначена кшмиР14-FWD

SEQ ID NO: 86 Последовательность ДНК для праймера обозначена кшмиР17-FWD

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общие сведения

Во всем этом описании, если специально не указано иное или контекст не требует иного, ссылка на один этап, признак, смесь химически связанных веществ, группу этапов или группу признаков или смесей химически связанных веществ должна охватывать один и множество (то есть один или более) из этих этапов, признаков, смесей химически связанных веществ, групп этапов или групп признаков или смесей химически связанных веществ.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что данное раскрытие подвержено изменениям и модификациям, отличным от тех, которые конкретно описаны. Следует понимать, что раскрытие включает все такие вариации и модификации. Раскрытие также включает все этапы, признаки, композиции и соединения, упомянутые или указанные в данном описании, индивидуально или совместно, и любые и все комбинации или любые два или более из указанных этапов или признаков.

Данное раскрытие не должно быть ограничено в объеме конкретными примерами, описанными в данном документе, которые предназначены только для целей пояснения. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы явно находятся в рамках данного раскрытия.

Любой пример данного раскрытия в данном документе должен быть применен mutatis mutandis к любому другому примеру раскрытия, если специально не указано иное.

Если специально не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, должны иметь то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники (например, в клеточной культуре, молекулярной генетике, иммунологии, иммуногистохимии, химии белков и биохимии).

Если не указано иное, рекомбинантная ДНК, рекомбинантный белок, клеточная культура и иммунологические методы, используемые в данном описании, являются стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Такие методы описаны и объяснены в литературе в таких источниках, как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновления до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все обновления до настоящего времени).

Во всем этом описании, если контекст не требует иного, слово «содержит» или его варианты, такие как «содержит» или «содержащий», понимают как подразумевающее включение указанного этапа или элемента, или целого числа, или группы этапов, или элементов, или целых чисел, но не исключение какого-либо другого этапа или элемента, или целого числа, или группы элементов, или целых чисел.

Термин «и/или», например «X и/или Y», следует понимать как означающий «X и Y» или «X или Y», и его следует использовать для явного подтверждения обоих значений или одного из двух значений.

Избранные определения

Под «РНК» подразумевается молекула, содержащая по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток. Под «рибонуклеотидом» подразумевается нуклеотид с гидроксильной группой в положении 2' фрагмента β–D-рибофуранозы. Термины включают двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК, такую как частично очищенную РНК, по существу чистую РНК, синтетическую РНК, полученную рекомбинантным способом РНК, а также измененную РНК, которая отличается от природной РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или более нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала, например, к концу(ам) siNA (короткая интерферирующая НК) или в пределах, например, к одному или более нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК согласно данному раскрытию также могут содержать нестандартные нуклеотиды, такие как не встречающиеся в природе нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Эти измененные РНК могут упоминаться как аналоги или аналоги природной РНК.

Термин «РНК-интерференция» или «РНКи» относится, как правило, к РНК-зависимому сайленсингу экспрессии генов, инициируемому молекулами двухцепочечной РНК (дцРНК) в цитоплазме клетки. Молекула дцРНК уменьшает или ингибирует продукты транскрипции целевой последовательности нуклеиновой кислоты, тем самым вызывая сайленсинг гена или уменьшая экспрессию данного гена.

Используемый в данном документе термин «двухцепочечная РНК» или «дцРНК» относится к молекуле РНК, имеющей структуру дуплекса и содержащей эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность, которые имеют одинаковую длину друг с другом. Эффекторная последовательность и эффекторная комплементарная последовательность могут находиться в одной цепи РНК или в отдельных цепях РНК. «Эффекторная последовательность» (часто называемая «направляющей цепью») по существу комплементарна целевой последовательности, которая в данном случае является областью мРНК-транскрипта PABPN1. «Эффекторная последовательность» также может называться «антисмысловой последовательностью». «Эффекторная комплементарная последовательность» будет достаточно комплементарной эффекторной последовательности, так что она может отжигать эффекторную последовательность, образуя дуплекс. В этом отношении эффекторная комплементарная последовательность будет по существу гомологичной области целевой последовательности. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, термин «эффекторная комплементарная последовательность» также может называться «эффекторной комплементарной последовательностью» или смысловой последовательностью.

Используемый в данном документе термин «дуплекс» относится к областям в двух комплементарных или по существу комплементарных нуклеиновых кислотах (например, РНК), или в двух комплементарных или по существу комплементарных областях одноцепочечной нуклеиновой кислоты (например, РНК), которые образуют пары оснований друг с другом, или путем спаривания оснований согласно Уотсону-Крику, или любым другим способом, который позволяет стабилизировать дуплекс между нуклеотидными последовательностями, которые являются комплементарными или по существу комплементарными. Специалисту будет понятно, что в области дуплекса 100%-ная комплементарность не требуется; допустима существенная комплементарность. Существенная комплементарность включает 79% или более комплементарности. Например, одна ошибка спаривания в области дуплекса, состоящей из 19 пар оснований (то есть 18 пар оснований и одной ошибки спаривания), приводит к 94,7% комплементарности, что делает область дуплекса по существу комплементарной. В другом примере два ошибки спаривания в области дуплекса, состоящей из 19 пар оснований (то есть 17 пар оснований и двух ошибок спаривания), приводят к 89,5% комплементарности, что делает область дуплекса по существу комплементарной. В еще одном примере три ошибки спаривания в области дуплекса, состоящей из 19 пар оснований (то есть 16 пар оснований и трех ошибок спаривания), приводят к 84,2% комплементарности, что делает область дуплекса по существу комплементарной и т. д.

ДцРНК может быть представлена в виде структуры шпильки или стебель-петля с областью дуплекса, состоящей из эффекторной последовательности и эффекторной комплементарной последовательности, связанных по меньшей мере последовательностью из 2 нуклеотидов, которая называется стебель-петля. Когда дцРНК обеспечивают в качестве структуры шпильки или стебель-петля, ее можно назвать «шпилечной РНК» или «коротким шпилечным агентом РНКи» или «кшРНК». Другие молекулы дцРНК, содержащиеся в структуре шпильки или стебель-петля или образующие ее, включают первичные транскрипты микроРНК (пер-миРНК) и предшественика микроРНК (pre-miRNA). КшРНК pre-miRNA могут быть естественным образом получены из пер-миРНК под действием ферментов Drosha и Pasha, которые распознают и высвобождают области первичного транскрипта микроРНК, которые образуют структуру стебель-петля. Альтернативно, транскрипт пер-миРНК может быть сконструирован для замены природной структуры стебель-петля искусственной/рекомбинантной структурой стебель-петля. То есть искусственная/рекомбинантная структура стебель-петля может быть вставлена или клонирована в последовательность остова пер-миРНК, который не имеет своей природной структуры стебель-петля. В случае последовательностей стебель-петля, сконструированных для экспрессии как части молекулы пер-миРНК, Drosha и Pasha распознают и высвобождают искусственную кшРНК. Молекулы дцРНК, полученные с использованием этого подхода, известны как «shmiRNA», «кшмиР» или «каркасные кшРНК микроРНК».

Используемый в данном документе термин «комплементарный» в отношении последовательности относится к комплементарной последовательности посредством спаривания оснований согласно Уотсону-Крику, в результате чего гуанин (G) соединяется с цитозином (C), а аденин (A) соединяется с любым урацилом (U) или тимином (T). Последовательность может быть комплементарной ко всей длине другой последовательности, или она может быть комплементарной к определенной части или длине другой последовательности. Специалист в данной области техники поймет, что U может присутствовать в РНК и что T может присутствовать в ДНК. Следовательно, A в любой из последовательности РНК или ДНК может спариваться с U в последовательности РНК или T в последовательности ДНК.

Используемый в данном документе термин «по существу комплементарный» используется для обозначения достаточной степени комплементарности или точного спаривания, так что происходит стабильное и специфическое связывание между последовательностями нуклеиновых кислот, например, между эффекторной последовательностью и эффекторной комплементарной последовательностью или между эффекторной последовательностью и целевой последовательностью. Понятно, что последовательность нуклеиновой кислоты не обязательно должна быть на 100% комплементарной ее целевой или комплементарной цепи. Термин охватывает последовательность, комплементарную другой последовательности, за исключением липкого конца ДНК. В некоторых случаях последовательность является комплементарной другой последовательности, за исключением 1-2 ошибок спаривания. В некоторых случаях последовательности являются комплементарными, за исключением 1 ошибки спаривания. В некоторых случаях последовательности являются комплементарными, за исключением 2 ошибок спаривания. В других случаях последовательности являются комплементарными, за исключением 3 ошибок спаривания. В еще других случаях последовательности являются комплементарными, за исключением 4 ошибок спаривания.

Термин «кодированный», как он используется в контексте кшРНК или кшмиР согласно раскрытию, следует понимать как кшРНК или кшмиР, которая способна транскрибироваться с матрицы ДНК. Соответственно, нуклеиновая кислота, в которой закодирована или которая кодирует кшРНК или кшмиР согласно раскрытию, будет содержать последовательность ДНК, которая служит матрицей для транскрипции соответствующей кшРНК или кшмиР.

Термин «конструкт ДНК-направленной РНКи» или «конструкт днРНКи» относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность ДНК, которая при транскрибировании дает молекулу кшРНК или кшмиР (предпочтительно, кшмиР), которая вызывает РНКи. Конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, которая транскрибируется в виде одной РНК, которая способна к самоотжигу в структуру шпильки с областью дуплекса, связанной структурой стебель-петля по меньшей мере с 2 нуклеотидами, т.е. кшРНК или кшмиР, или в виде одной РНК с несколькими кшРНК или кшмиР или в виде нескольких РНК-транскриптов, каждый из которых способен складываться в виде одной кшРНК или кшмиР, соответственно. Конструкт днРНКи может быть представлен в более крупном «конструкте ДНК», содержащем одну или более дополнительных последовательностей ДНК. Например, конструкт днРНКи может быть представлен в конструкте ДНК, содержащем дополнительную последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, который был оптимизирован по кодонам так, что его мРНК-транскрипт не нацеливается кшмиР из конструкта днРНКи. Конструкт днРНКи и/или конструкт ДНК, содержащий его, может находиться в векторе экспрессии, например, функционально связанном с промотором.

Используемый в данном документе термин «функционально связанный» или «функциональная связь» (или аналогичный) означает, что кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты связывается с или в связи с регуляторной последовательностью, например, промотором, таким образом, что облегчается экспрессия кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают промоторы, энхансеры и другие элементы управления экспрессией, которые приняты в данной области техники и выбраны для направления экспрессии кодирующей последовательности.

Под «вектором» следует понимать носитель для введения нуклеиновой кислоты в клетку. Векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, фагемиды, вирусы, бактерии и носители, полученные из вирусных или бактериальных источников. «Плазмида» представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК. Подходящий тип вектор для использования в соответствии с данным раскрытием представляет собой вирусный вектор, причем гетерологичные последовательности ДНК встраивают в вирусный геном, который можно модифицировать для удаления одного или более вирусных генов или их частей. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине (например, векторы, имеющие точку начала репликации, которая функционирует в клетке-хозяине). Другие векторы могут быть стабильно интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Используемый в данном документе термин «вектор экспрессии» будет означать вектор, способный экспрессировать молекулу РНК согласно раскрытию.

Под «функциональным белком PABPN1» следует понимать белок PABPN1, имеющий функциональные свойства белка PABPN1 дикого типа, например, способность контролировать сайт полиаденилирования мРНК и/или сплайсинга интронов в клетке млекопитающего. Соответственно, под «функциональным белком PABPN1» следует понимать белок PABPN1, который не вызывает ОФМД, когда экспрессируется или присутствует у субъекта. В одном примере ссылка в данном документе на «функциональный белок PABPN1» является ссылкой на человеческий белок PABPN1 дикого типа. Последовательность белка PABPN1 дикого типа человека представлена в NCBI RefSeq NP_004634. Соответственно, функциональный человеческий белок PABPN1 может иметь in vivo функциональные свойства человеческого белка PABPN1, указанные в NCBI RefSeq NP_004634.

Используемые в данном документе термины «осуществлять лечение», «лечить» или «лечение» и их вариации относятся к клиническому вмешательству, направленному на изменение естественного развития индивидуума или клетки, которые подвергается лечению в течение клинической патологии. Желаемое воздействие лечения включают уменьшение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или уменьшение болезненного состояния, и ремиссию или улучшение прогноза у больных. Отсюда следует, что лечение ОФМД включает снижение или ингибирование синтеза белка PABPN1, который является причиной ОФМД у субъекта, и/или синтеза у субъекта белка PABPN1, имеющего нормальную длину полиаланиновых остатков. Предпочтительно лечение ОФМД включает снижение или ингибирование синтеза белка PABPN1, который является причиной ОФМД у субъекта, и синтез у субъекта белка PABPN1, имеющего нормальную длину полиаланиновых остатков. Индивидуума успешно «лечат", например, если достигнут один или более из указанных выше результатов лечения.

«Терапевтически эффективное количество» представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию или количество, требуемое для достижения измеримого улучшения патологического состояния ОФМД, такого как измеримое улучшение одного или более симптомов ОФМД, например, включая, но не ограничиваясь этим, птоз, дисфагию и мышечную слабость у субъекта. Терапевтически эффективное количество в данном документе может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и вес пациента, и способности кшмиР, нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, конструкта днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии или композиции, содержащие то же самое, вызывать желаемый ответ у индивидуума и/или способность вектора экспрессии экспрессировать функциональный белок PABPN1 у субъекта. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое количество, при котором любые токсические или вредные эффекты кшмиР, нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, конструкта днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии или содержащей их композиции, перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами кшмиР, нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, конструкта днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии или композиции, содержащей их, для ингибирования, подавления или снижения экспрессии белка PABPN1, вызывающего ОФМД, рассматриваемого отдельно или в комбинации с терапевтически полезными эффектами экспрессии функционального белка PABPN1 у субъекта.

Используемый в данном документе термин «субъект» или «пациент» может представлять собой человека или животного, не являющегося человеком, страдающего или генетически предрасположенного к ОФМД, то есть имеющего вариант гена PABPN1, который является причиной ОФМД. «Животное, не являющееся человеком» может быть приматом, домашним скотом (например, овцы, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, ослы), домашним животным (например, домашними животными, такими как собаки и кошки), лабораторным тестируемым животным (например, мышами, кроликами, крысами, морской свинкой, свиньями, дрозофилой, C.elegans, рыбой-данио), рабочим животным (например, скаковыми лошадьми, верблюдами, борзыми) или дикими животными в неволе. В одном примере субъект или пациент представляет собой млекопитающее. В одном примере субъект или пациент представляет собой человека.

Термины «пониженная экспрессия», «снижение экспрессии» или подобные, относятся к отсутствию или наблюдаемому снижению уровня белка и/или продукта мРНК из целевого гена, например, гена PABPN1. Снижение не обязательно должно быть абсолютным, но может быть частичным снижением, достаточным для возникновения детектируемого или наблюдаемого изменения в результате РНКи, на которые воздействует кшмиР, нуклеиновая кислота, кодирующая ее, конструкт днРНКи, конструкт ДНК, вектор экспрессии или композиция, содержащая то же самое согласно раскрытию. Снижение может быть измерено путем определения снижения уровня мРНК и/или белкового продукта из целевой нуклеиновой кислоты относительно клетки, в которой отсутствует кшмиР, нуклеиновая кислота, кодирующая ее, конструкт днРНКи, конструкт ДНК, вектор экспрессии или композиция, содержащая их, и может составлять всего 1%, 5% или 10% или может быть абсолютным, т.е. 100% ингибированием. Эффекты снижения могут быть определены путем исследования внешних свойств, т. е. количественной и/или качественной оценки фенотипа клетки или организма, и могут также включать обнаружение присутствия или изменения количества ядерных агрегатов expPABPN1 в клетке или организме после введения кшмиР, нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, конструкта днРНКи, конструкта ДНК, вектора экспрессии или композиции, содержащей их, согласно раскрытию.

Агенты для РНКи

В одном примере данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, которая кодирует короткую шпилечную микроРНК (кшмиР), причем указанная кшмиР содержит:

эффекторную последовательность длиной по меньшей мере 17 нуклеотидов;

эффекторную комплементарную последовательность;

последовательность стебля-петли; и

остов первичной микроРНК (пер-миРНК);

при этом эффекторная последовательность по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в любой из SEQ ID NO: 1-13. Предпочтительно, чтобы эффекторная последовательность имела длину менее 30 нуклеотидов. Например, подходящая эффекторная последовательность может иметь длину 17-29 нуклеотидов. В особенно предпочтительном примере эффекторная последовательность будет иметь длину 21 нуклеотид. Более предпочтительно, эффекторная последовательность будет иметь длину 21 нуклеотид, а эффекторная комплементарная последовательность будет иметь длину 20 нуклеотидов.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12.

В одном примере кшмиР содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и содержит 4 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и содержит 3 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и содержит 2 несоответствующих основания относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и содержит 1 несоответствующее основание относительно них. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13.

В соответствии с примером, в котором эффекторная последовательность кшмиР согласно раскрытию по существу комплементарна области соответствующей длины в мРНК-транскрипте PABPN1, описанном в данном документе, и содержит 1, 2, 3 или 4 несоответствующего основания(ий) относительно нее, она является предпочтительной, чтобы несоотвествие(я) не располагалось в пределах области, соответствующей затравочной области кшмиР, т.е. нуклеотидов 2-8 эффекторной последовательности.

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 14, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 14; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР2».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 16, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 16; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР3».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 18; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР4».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 20; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 21, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 21, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР5».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 22, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 22; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 23, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 23, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР6».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 24, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 24; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 25, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 25, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 25, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 24. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР7».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 26; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР9».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 28, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 28; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 28. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР11».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 30, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 30; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР13».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 32, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 32; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР14».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 34, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 34; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 35, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 35, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР15».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 36, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 36; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 37, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 37, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР16».

В одном примере описанная в данном документе нуклеиновая кислота может содержать последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 38, за исключением 1, 2, 3 или 4 ошибок в основаниях, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 38; и (ii) эффекторную комплементарную последовательность, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39, и способна образовывать с ней дуплекс. Эффекторная комплементарная последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39, может представлять собой последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38. кшмиР в соответствии с этим примером в дальнейшем обозначается как «кшмиР17».

В любом из описанных в данном документе примеров кшмиР, кодируемая нуклеиновой кислотой согласно данному раскрытию, может содержать в направлении от 5' к 3':

5'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК;

эффекторную комплементарную последовательность;

последовательность стебля-петли;

эффекторную последовательность; и

3'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК.

5'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК;

эффекторную последовательность;

последовательность стебля-петли;

эффекторную комплементарную последовательность; и

3'-фланкирующую последовательность остова пер-миРНК.

Подходящие остовы первичных микро-РНК (пер-миРНК или pri-R) для применения в нуклеиновой кислоте согласно раскрытию могут быть выбраны из известных в данной области техники. Например, остов пер-миРНК может быть выбран из остова пер-миР-30a, остова пер-миР-155, остова пер-миР-21 и остова пер-миР-136. Однако предпочтительно, чтобы остов пер-миРНК представлял собой остов пер-миР-30a. В соответствии с примером, в котором остов пер-миРНК представляет собой остов пер-миР-30a, 5'-фланкирующая последовательность остова пер-миРНК указана в SEQ ID NO: 41, а 3'-фланкирующая последовательность остова пер-миРНК указана в SEQ ID NO: 42. Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая кшмиР согласно раскрытию (например, от кшмиР-1 до кшмиР-16, описанные в данном документе), может содержать последовательность ДНК, кодирующую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 41, и последовательность ДНК, кодирующую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 42.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, может содержать последовательность ДНК, выбранную из последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 56-68.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56, и кодирует кшмиР (кшмиР2), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 43.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57, и кодирует кшмиР (кшмиР3), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 44.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 58, и кодирует кшмиР (кшмиР4), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 45.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59, и кодирует кшмиР (кшмиР5), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 46.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 60, и кодирует кшмиР (кшмиР6), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 47.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 61, и кодирует кшмиР (кшмиР7), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 48.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62, и кодирует кшмиР (кшмиР9), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 49.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 63, и кодирует кшмиР (кшмиР11), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 50.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64, и кодирует кшмиР (кшмиР13), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 51.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65, и кодирует кшмиР (кшмиР14), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 52.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 66, и кодирует кшмиР (кшмиР15), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 53.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 67, и кодирует кшмиР (кшмиР16), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 54.

В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68, и кодирует кшмиР (кшмиР17), содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 55.

Иллюстративные нуклеиновые кислоты согласно раскрытию кодируют кшмиР, выбранную из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5, кшмиР9, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17, как описано в данном документе. Нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, кодирующие кшмиР, выбранные из кшмиР3, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17, как описано в данном документе, являются особенно предпочтительными.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что нуклеиновую кислоту в соответствии с данным раскрытием можно комбинировать или использовать в сочетании с одной или более другими нуклеиновыми кислотами, содержащими последовательность ДНК, кодирующую кшРНК или кшмиР, содержащую эффекторную последовательность из по меньшей мере 17 смежных нуклеотидов, которые по существу комплементарны области РНК-транскрипта, соответствующей белку PABPN1, который является причиной ОФМД. В одном примере предоставлено множество нуклеиновых кислот, содержащее:

(a) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе; и

(b) по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, выбранную из:

(i) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, как описано в данном документе; или

(ii) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность ДНК, кодирующую короткую шпилечную РНК (кшРНК), содержащую когнатные эффекторные и эффекторные комплементарные последовательности кшмиР, как описано в данном документе;

Соответственно, в одном примере множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию может содержать две или более нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, как описано в данном документе, таких как две, или три, или четыре, или пять, или шесть, или семь, или восемь, или девять или десять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, как описано в данном документе.

В другом примере множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, как описано в данном документе, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shRNA, содержащую когнатные эффекторные и эффекторные комплементарные последовательности кшмиР, как описано в данном документе. Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР2, в дальнейшем обозначается как «shRNA2». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР3, в дальнейшем обозначается как «shRNA3». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР4, в дальнейшем обозначается как «shRNA4». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР5, в дальнейшем обозначается как «shRNA5». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР6, в дальнейшем обозначается как «shRNA6». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР7, в дальнейшем обозначается как «shRNA7». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР9, в дальнейшем обозначается как «shRNA9». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР11, в дальнейшем обозначается как «shRNA11». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР13, в дальнейшем обозначается как «shRNA13». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР14, в дальнейшем обозначается как «shRNA14». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР15, в дальнейшем обозначается как «shRNA15». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР16, в дальнейшем обозначается как «shRNA16». Например, кшРНК, содержащая эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность кшмиР17, в дальнейшем обозначается как «shRNA17».

В соответствии с любым примером, в котором одна или более нуклеиновых кислот из множества нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, кодирует кшРНК, кшРНК может содержать последовательность петли или последовательность стебель-петля, расположенную между когнатной эффекторной и эффекторной комплементарной последовательностями. Подходящие последовательности петли могут быть выбраны из известных в данной области техники. Альтернативно, подходящие структуры стебель-петля могут быть разработаны de novo. В одном примере нуклеиновая кислота из множества, описанного в данном документе, кодирующего кшРНК, может содержать последовательность ДНК, кодирующую стебель-петлю, расположенную между последовательностями ДНК, кодирующими эффекторную последовательность и эффекторную комплементарную последовательность, соответственно.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР2, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР2, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 43, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56 (кшмиР2), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР3-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР3, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР3, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 44, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2, кшмиР4-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР4, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР4, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 58, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 45, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 58 (кшмиР4), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР5, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР5, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 46, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59 (кшмиР5), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР4, кшмиР6-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР6, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР6, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 60, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 47, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 60 (кшмиР6), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР5, кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР7, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР7, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 61, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 48, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 61 (кшмиР7), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР6, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР9, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР9, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 49, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62 (кшмиР9), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР11, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР11, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 63, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 50, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 63 (кшмиР11), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР13, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР13, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 51, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР14-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР14, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР14, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 52, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13, кшмиР15-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР15, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР15, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 66, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 53, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 66 (кшмиР15), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР14, или кшмиР16-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР16, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР16, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 67, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 54, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 67 (кшмиР16), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР15, или кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них.

В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР17, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 55, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, которая кодирует кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1. Например, множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР16, или соответствующую кшРНК любой из них.

В соответствии с любым примером множества нуклеиновых кислот, как описано в данном документе, множество нуклеиновых кислот может содержать две или более нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, как описано в данном документе, таких как две, или три, или четыре, или пять, или шесть, или семь, или восемь, или девять, или десять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, как описано в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР согласно раскрытию.

В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит две нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит три нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит четыре нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит пять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит шесть нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит семь нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит восемь нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит девять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит десять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 1. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, описаны в данном документе, например, для кшмиР2.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 2. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, описаны в данном документе, например, для кшмиР3.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 4. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4, описаны в данном документе, например, для кшмиР5.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 7. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, описаны в данном документе, например, для кшмиР9.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК*транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 9. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9, описаны в данном документе, например, для кшмиР13.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 10. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10, описаны в данном документе, например, для кшмиР14.

В одном примере множества нуклеиновых кислот, описанного в данном документе, одна из нуклеиновых кислот содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из указанной последовательности в SEQ ID NO: 13. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, описаны в данном документе, например, для кшмиР17.

Иллюстративное множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты, каждая из которых содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР согласно раскрытию, причем каждый кшмиР содержит отличную от других эффекторную последовательность.

В одном примере каждая из по меньшей мере двух нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 и 13. Иллюстративные нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, кодирующие кшмиР, содержащие эффекторные последовательности, которые по существу комплементарны областям соответствующей длины в РНК-транскриптах, указанных в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 и 13, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере по меньшей мере две нуклеиновые кислоты выбирают из группы, состоящей из:

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56 (кшмиР2);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59 (кшмиР5);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62 (кшмиР9);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере каждая из по меньшей мере двух нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 2, 9, 10 и 13. Иллюстративные нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, кодирующие кшмиР, содержащие эффекторные последовательности, которые по существу комплементарны областям соответствующей длины в РНК-транскриптах, указанных в SEQ ID NO: 2, 9, 10 и 13, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере по меньшей мере две нуклеиновые кислоты выбирают из группы, состоящей из:

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 10, и нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 13. Например, множество нуклеиновых кислот может содержать:

(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, например, нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13); и

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38, например, нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

Иллюстративное множество нуклеиновых кислот согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере множество нуклеиновых кислот содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 2, и нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 9. Например, множество нуклеиновых кислот может содержать:

(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, например, нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3); и

В соответствии с примером, в котором предоставлено множество нуклеиновых кислот, две или более нуклеиновых кислот могут образовывать отдельные части одного и того же полинуклеотида. В другом примере две или более нуклеиновых кислот во множестве образуют части разных полинуклеотидов, соответственно. В другом примере множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, представлено в виде множества компонентов, например, нескольких композиций. Например, каждая из нуклеиновых кислот множества может быть обеспечена отдельно. Альтернативно, в примере, где предоставлены три или более нуклеиновых кислот согласно раскрытию, по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот может быть предоставлена отдельно, и две или более из множества предоставлены вместе.

В некоторых примерах нуклеиновая кислота или каждая нуклеиновая кислота в соответствии с данным раскрытием может содержать или находиться в функциональной связи с дополнительными элементами, например, для облегчения транскрипции кшмиР или кшРНК. Например, одна или каждая нуклеиновая кислота может содержать промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей кшмиР или кшРНК, описанную в данном документе. Другие элементы, например терминаторы и инициаторы транскрипции, известны в данной области техники и/или описаны в данном документе.

Альтернативно или дополнительно, одна или каждая нуклеиновая кислота в соответствии с данным раскрытием может содержать один или более сайтов рестрикции, например, для облегчения клонирования нуклеиновой кислоты(кислот) в клонирующие или экспрессирующие векторы. Например, нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, могут содержать сайт рестрикции в прямом и/или обратном направлении от последовательности, кодирующей кшмиР или кшРНК согласно раскрытию. Подходящие последовательности, распознаваемые рестриктазой, будут известны специалисту в данной области техники. Однако в одном примере нуклеиновая кислота(ы) согласно раскрытию может содержать сайт рестрикции BamH1 (GGATCC) на 5'-конце, т.е. в прямом направлении от последовательности, кодирующей кшмиР или кшРНК, и сайт рестрикции EcoR1 (GAATTC) в 3'-конец, т. е. в обратном направлении от последовательности, кодирующей кшмиР или кшРНК.

Конструкты днРНКи

В одном примере одна или каждая нуклеиновая кислота согласно раскрытию представлена в форме или в составе конструкта ДНК-направленной РНКи (днРНКи). Соответственно, в одном примере данное раскрытие обеспечивает конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе. В другом примере данное раскрытие обеспечивает конструкт днРНКи, содержащий множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе. В еще одном примере данное раскрытие обеспечивает множество конструктов днРНКи, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту из множества нуклеиновых кислот, как описано в данном документе (т.е. так, что все нуклеиновые кислоты из множества представлены в множестве конструктов днРНКи). Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, содержащие эффекторные последовательности, нацеленные на мРНК-транскрипт PABPN1, который является причиной ОФМД, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту согласно раскрытию, функционально связанную с промотором.

В соответствии с примером, в котором конструкт днРНКи содержит множество описанных в данном документе нуклеиновых кислот, каждая из нуклеиновых кислот может быть функционально связана с промотором. В одном примере нуклеиновые кислоты в конструкте днРНКи могут быть функционально связаны с одним и тем же промотором. В одном примере нуклеиновые кислоты в конструкте днРНКи могут быть функционально связаны с разными промоторами.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР2. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР2, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 43. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР3-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56 (кшмиР2), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР3-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17 или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР3-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 и кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР3. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР3, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 44. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2, кшмиР4-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2, кшмиР4-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2, кшмиР4-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР4. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР4, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 58, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 45. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 58 (кшмиР4), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2, кшмиР3, кшмиР5-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР5. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР5, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 46. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР4, кшмиР6-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59 (кшмиР5), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР4, кшмиР6-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР4, кшмиР6-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР6. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР6, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 60, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 47. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР5, кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 60 (кшмиР6), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР5, кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР5, кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР7. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР7, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 61, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 48. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР6, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 61 (кшмиР7), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР6, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР6, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР9. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР9, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 49. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62 (кшмиР9), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР11. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР11, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 63, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 50. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 63 (кшмиР11), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9 или кшмиР13-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9 или кшмиР13-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР13. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР13, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 51. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР14-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР14-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР14-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР14. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР14, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 52. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13, кшмиР15-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13, кшмиР15-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13, кшмиР15-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР15. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР15, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 66, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 53. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР14, или кшмиР16-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 66 (кшмиР15), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР14, или кшмиР16-кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР14, или кшмиР16-кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР16. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР16, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 67, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 54. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР15, или кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 67 (кшмиР16), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР15, или кшмиР17, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР15, или кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР17. Например, конструкт днРНКи может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, имеющую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, содержащем или состоящем из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР17, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68, и кодирует кшмиР, содержащую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 55. Конструкт днРНКи может содержать одну или более других нуклеиновых кислот согласно раскрытию, содержащих последовательность ДНК, кодирующую кшмиР или кшРНК, нацеленную на область мРНК-транскрипта PABPN1, такую как нуклеиновая кислота, содержащая или состоящая из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР16, или соответствующую кшРНК любой из них, как описано в данном документе. Например, конструкт днРНКи, описанный в данном документе, может содержать (i) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17), и (ii) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей одну из кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР16, или соответствующую кшРНК любой из них. Иллюстративные нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР, обозначенные как кшмиР2-кшмиР7, кшмиР9, кшмиР11 или кшмиР13-кшмиР16, описаны в данном документе и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В соответствии с любым примером конструкта днРНКи, содержащего множество нуклеиновых кислот, как описано в данном документе, конструкт днРНКи может содержать две или более нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, как описано в данном документе, например две, или три, или четыре, или пять, или шесть, или семь, или восемь, или девять, или десять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, как описано в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе.

В одном примере конструкт днРНКи содержит две нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит три нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит четыре нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит пять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит шесть нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит семь нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит восемь нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит девять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе. В одном примере конструкт днРНКи содержит десять нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР или кшРНК, описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует кшмиР, как описано в данном документе.

Иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты, каждая из которых содержит последовательность ДНК, кодирующую кшмиР согласно раскрытию, причем каждый кшмиР содержит отличную от других эффекторную последовательность. В одном примере каждая из по меньшей мере двух нуклеиновых кислот в конструкте днРНКи кодирует кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 и 13 Иллюстративные нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, кодирующие кшмиР, содержащие эффекторные последовательности, которые по существу комплементарны областям соответствующей длины в РНК-транскриптах, указанных в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 и 13, описаны в данном документе, и их следует применять mutatis mutandis к данному примеру раскрытия, описывающего конструкты днРНКи.

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 56 (кшмиР2);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 59 (кшмиР5);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 62 (кшмиР9);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере каждая из по меньшей мере двух нуклеиновых кислот в конструкте днРНКи кодирует кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в одной из SEQ ID NO: 2, 9, 10 и 13. Иллюстративные нуклеиновые кислоты согласно раскрытию, кодирующие кшмиР, содержащие эффекторные последовательности, которые по существу комплементарны областям соответствующей длины в РНК-транскриптах, указанных в SEQ ID NO: 2, 9, 10 и 13, описаны в данном документе, и их следует применять mutatis mutandis к данному примеру раскрытия, описывающего конструкты днРНКи.

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13);

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14); и

нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38, например, нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 10, и нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 13. Например, конструкт днРНКи может содержать:

Иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

В одном примере конструкт днРНКи содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 2, и нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна области соответствующей длины в РНК-транскрипте, указанном в SEQ ID NO: 9. Например, конструкт днРНКи может содержать:

В каждом из приведенных выше примеров, описывающих конструкт днРНКи согласно раскрытию, одна или каждая нуклеиновая кислота, содержащаяся в нем, может быть функционально связана с промотором. Например, конструкт днРНКи, как описано в данном документе, может содержать один промотор, который функционально связан с одной или с каждой нуклеиновой кислотой, содержащейся в нем, например, для управления экспрессией одной или более кшмиР и/или кшРНК из конструкта днРНКи.

В другом примере каждая нуклеиновая кислота, кодирующая кшмиР или кшРНК согласно раскрытию, содержащуюся в конструкте днРНКи, функционально связана с отдельным промотором.

Согласно примеру, в котором присутствуют несколько промоторов, промоторы могут быть одинаковыми или разными. Например, конструкт может содержать несколько копий одного и того же промотора, причем каждая копия функционально связана с другой нуклеиновой кислотой согласно раскрытию. В другом примере каждый промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой согласно раскрытию, отличается. Например, в конструкте днРНКи, кодирующем две кшмиР, каждая из двух нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, функционально связана с отличным от других промотором. Точно так же в примере, в котором конструкт днРНКи кодирует одну кшмиР и одну кшРНК, соответствующие нуклеиновые кислоты, кодирующие кшмиР и кшРНК, каждая из которых функционально связана с отличным от других промотором.

В одном примере промотор представляет собой конститутивный промотор. Термин «конститутивный», когда он используется в отношении промотора, означает, что промотор способен направлять транскрипцию функционально связанной последовательности нуклеиновой кислоты в отсутствие специфического стимула (например, теплового шока, химических веществ, света и т. д.). Как правило, конститутивные промоторы способны направлять экспрессию кодирующей последовательности практически в любой клетке и любой ткани. Промоторы, используемые для транскрипции кшмиР или кшРНК из нуклеиновой кислоты (кислот) согласно раскрытию, включают промоторы для генов убиквитина, ЦМВ, β-актина, гистона H4, EF-1α или pgk, контролируемых РНК-полимеразой II, или элементы промотора, контролируемые РНК-полимеразой I.

В одном примере используется промотор Pol II (Pol- полимераза), такой как ЦМВ, SV40, U1, β-актин или гибридный промотор Pol II. Другие подходящие промоторы Pol II известны в данной области техники и могут быть использованы в соответствии с этим примером раскрытия. Например, система промотора Pol II может быть предпочтительной в конструкте днРНКи согласно раскрытию, который экспрессирует пер-миРНК, которая под действием ферментов Drosha и Pasha превращается в одну или более кшмиР. Система промотора Pol II также может быть предпочтительной в конструкте днРНКи согласно раскрытию, содержащему последовательность, кодирующую множество кшРНК или кшмиР под управлением одного промотора. Система промотора Pol II также может быть предпочтительной, если желательна тканевая специфичность.

В другом примере используют промотор, контролируемый РНК-полимеразой III, такой как промотор U6 (U6-1, U6-8, U6-9), промотор H1, промотор 7SL, промотор Y человека (hY1, hY3, hY4 (see Maraia, et al., Nucleic Acids Res 22(15):3045-52(1994)) и hY5 (см. Maraia, et al., Nucleic Acids Res 24(18):3552-59(1994)), промотор MRP-7-2 человека, промотор VA1 аденовируса, промотор тРНК человека или промотор 5s рибосомальной РНК.

Подходящие промоторы для использования в конструкте днРНКи согласно раскрытию описаны в патенте США № 8008468 и патенте США № 8129510.

В одном примере промотор представляет собой промотор РНК pol III. Например, промотор представляет собой промотор U6 (например, промотор U6-1, U6-8 или U6-9). В другом примере промотор представляет собой промотор H1.

В случае конструкта днРНКи согласно раскрытию, кодирующей множество кшмиР или кодирующей одну или более кшмиР и кшРНК, как описано в данном документе, каждая из нуклеиновых кислот в конструкте днРНКи функционально связана с промотором U6, например, с отдельным промотором U6.

В одном примере промотор в конструкте представляет собой промотор U6. Например, промотор представляет собой промотор U6-1. Например, промотор представляет собой промотор U6-8. Например, промотор представляет собой промотор U6-9.

В некоторых примерах используются промоторы переменной силы. Например, использование двух или более сильных промоторов (таких как промотор типа Pol III) может истощать клетку, например, путем истощения пула доступных нуклеотидов или других клеточных компонентов, необходимых для транскрипции. Кроме того, или альтернативно, использование нескольких сильных промоторов может вызывать токсический уровень экспрессии агентов РНКи, например кшмиР или кшРНК, в клетке. Таким образом, в некоторых примерах один или более промоторов в конструкте днРНКи с множеством промоторов, которые слабее, чем другие промоторы в конструкте, или все промоторы в конструкте могут экспрессировать кшмиР или кшРНК со скоростью меньшей, чем максимальная. Промоторы также могут быть модифицированы с использованием различных молекулярных методов или иным образом, например, посредством модификации различных регуляторных элементов, чтобы достичь более низких уровней или более высоких уровней транскрипции. Одним из способов достижения сниженной транскрипции является модификация элементов последовательности в промоторах, о которых известно, что они контролируют активность промотора. Например, известно, что проксимальный энхансерн элемент (PSE) влияет на активность промоторов U6 человека (см. Domitrovich, et al., Nucleic Acids Res 31: 2344-2352 (2003). Замена элементов PSE, присутствующих в сильных промоторах, таких как промоторы U6-1, U6-8 или U6-9 человека, на элемент из слабого промотора, такого как промотор U6-7 человека, снижает активность гибридных промоторов U6-1, U6-8 или U6-9. Данный подход использовали в примерах, описанных в данной заявке, но и другие средства для достижения этого результата известны в данной области техники.

Промоторы, полезные в некоторых примерах данного раскрытия, могут быть тканеспецифическими или клеточноспецифическими. Термин «тканеспецифический» применительно к промотору относится к промотору, который способен направлять селективную транскрипцию представляющей интерес нуклеиновой кислоты на конкретный тип ткани (например, ткань глаза или мышцы) при относительном отсутствии экспрессии одной и той же представляющей интерес нуклеотидной последовательности в другом типе ткани (например, в печени). Термин «клеточноспецифический» применительно к промотору относится к промотору, который способен направлять селективную транскрипцию представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетке определенного типа при относительном отсутствии экспрессии той же самой представляющей интерес нуклеотидной последовательности в другом типе клеток в той же ткани. В соответствии с одним примером используется мышечно-специфический промотор, такой как Spc512 или CK8. Однако в данной области техники известны другие мышечно-специфические промоторы и они предполагаются для применения в конструкте днРНКи согласно раскрытию.

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию может дополнительно содержать один или более энхансеров для увеличения экспрессии кшмиР или кшРНК, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными в данном документе. Энхансеры, подходящие для использования в примерах данного раскрытия, включают энхансер Apo E HCR, энхансер ЦМВ (Xia et al, Nucleic Acids Res 31-17(2003) и другие энхансеры, известные специалистам в данной области техники. Подходящие энхансеры для использования в конструкте днРНКи согласно раскрытию описаны в патенте США № 8008468.

В дополнительном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию может содержать терминатор транскрипции, связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей кшмиР или кшРНК согласно раскрытию. В случае конструкта днРНКи, содержащего множество нуклеиновых кислот, описанное в данном документе, то есть кодирующих множество кшмиР и/или кшРНК, терминаторы, связанные с каждой нуклеиновой кислотой, могут быть одинаковыми или разными. Например, в конструкте днРНКи согласно раскрытию, в котором используется промотор РНК pol III, терминатор может представлять собой непрерывный участок из 4, более, или 5, или более, или 6, или более остатков Т. Однако, когда используются разные промоторы, терминаторы могут быть разными и сопоставляться с промотором из гена, из которого происходит терминатор. Такие терминаторы включают, но не ограничиваются ими, для полиА SV40, гена AdV VA1, гена 5S рибосомной РНК и терминаторы для т-РНК человека. Другие комбинации промотора и терминатора известны в данной области техники и предполагаются для использования в конструкте днРНКи согласно раскрытию.

Кроме того, промоторы и терминаторы могут быть смешаны и сопоставлены, как это обычно делается с промоторами и терминаторами РНК pol II.

В одном примере комбинации промотора и терминатора, используемые для каждой нуклеиновой кислоты в конструкте днРНКи, содержащем множество нуклеиновых кислот, отличаются для уменьшения вероятности событий рекомбинации ДНК между компонентами.

Один иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР13, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором, и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР17, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором. Например, иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64, функционально связанной с промотором, и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68, функционально связанной с промотором. В одном примере каждая нуклеиновая кислота в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР, функционально связана с отдельным промотором. В другом примере каждая нуклеиновая кислота в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР, функционально связана с одним и тем же промотором. Например, один или каждый промотор может представлять собой промотор U6, например, промотор U6-1, U6-8 или U6-9. Например, один или каждый промотор может представлять мышечно-специфический промотор, например, промотор Spc512 или CK8.

В соответствии с примером, в котором нуклеиновые кислоты в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР13 и кшмиР17, функционально связаны с одним и тем же промотором Spc512, конструкт днРНКи содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 72. В соответствии с примером, в котором нуклеиновые кислоты в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР13 и кшмиР17, функционально связаны с одним и тем же промотором CK8, конструкт днРНКи содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 70.

Другой иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР3, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором, и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР14, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором. Например, иллюстративный конструкт днРНКи согласно раскрытию содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57, функционально связанной с промотором, и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящей из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65, функционально связанной с промотором. В одном примере каждая нуклеиновая кислота в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР, функционально связана с отдельным промотором. В другом примере каждая нуклеиновая кислота в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР, функционально связана с одним и тем же промотором. Например, один или каждый промотор может представлять собой промотор U6, например, промотор U6-1, U6-8 или U6-9. Например, один или каждый промотор может представлять собой мышечно-специфический промотор, например, промотор Spc512 или CK8.

В соответствии с примером, в котором нуклеиновые кислоты в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР3 и кшмиР14, функционально связаны с одним и тем же промотором Spc512, конструкт днРНКи содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 71. В соответствии с примером, в котором нуклеиновые кислоты в конструкте днРНКи, кодирующем кшмиР3 и кшмиР14, функционально связаны с одним и тем же промотором CK8, конструкт днРНКи содержит или состоит из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 69.

Также обеспечено множество конструктов днРНКи. Например, множество нуклеиновых кислот в качестве кодирующих кшмиР, как описано в данном документе, может быть обеспечено во множестве конструктов днРНКи, причем каждый конструкт днРНКи содержит одну или более из множества нуклеиновых кислот, описанных в данном документе. Комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, были описаны и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия. В одном примере каждая нуклеиновая кислота во множестве нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, представлена в ее отдельном конструкте днРНКи.

В соответствии с любым примером, в котором обеспечено множество конструктов днРНКи, каждый конструкт днРНКи может также содержать один или более промоторов, функционально связанных с нуклеиновой кислотой(ами), кодирующей содержащиеся в ней кшмиР. В одном примере каждый конструкт днРНКи содержит одну нуклеиновую кислоту, кодирующую кшмиР, и промотор, функционально связанный с ней. В соответствии с примером, в котором один или более из множества конструктов днРНКи содержат две или более нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, каждая нуклеиновая кислота в одном или более конструктах днРНКи функционально связана с отдельным промотором. В другом примере, в котором один или более из множества конструктов днРНКи содержит две или более нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР, две или более нуклеиновые кислоты функционально связаны с одним и тем же промотором в конструкте днРНКи.

Одно иллюстративное множество конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР13, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором, и конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР17, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором. Например, иллюстративное множество конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64, функционально связанной с промотором, и конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислота, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68, функционально связанной с промотором. В одном примере промоторы представляют собой промоторы U6, например, выбранные из промоторов U6-1, U6-8 или U6-9. В другом примере промоторы представляют собой мышечно-специфические промоторы, например, промоторы Spc512 или CK8.

Другое иллюстративное множество конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР3, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором, и конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР14, как описано в данном документе, функционально связанной с промотором. Например, иллюстративное множество конструктов днРНКи согласно раскрытию содержит конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57, функционально связанной с промотором, и конструкт днРНКи, содержащий нуклеиновую кислота, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65, функционально связанной с промотором. В одном примере промоторы представляют собой промоторы U6, например, выбранные из промоторов U6-1, U6-8 или U6-9. В другом примере промоторы представляют собой мышечно-специфические промоторы, например, промоторы Spc512 или CK8.

Кроме того, один или каждый конструкт днРНКи может содержать один или более множественных сайтов клонирования и/или уникальных сайтов рестрикции, которые расположены рационально, так что промотор, нуклеиновая кислота, кодирующая кшмиР или кшРНК, и/или другие регуляторные элементы легко удаляются или заменяются. Один или каждый конструкт днРНКи может быть собран из более мелких олигонуклеотидных компонентов с использованием рационально расположенных сайтов рестрикции и/или комплементарных липких концов. Базовый вектор для одного подхода согласно данному раскрытию включает плазмиды с мультилинкером, в котором все сайты являются уникальными (хотя это не является абсолютным требованием). Последовательно каждый промотор вставляют между его назначенными уникальными сайтами, в результате чего получается базовая кассета с одним или более промоторами, каждый из которых может иметь переменную ориентацию. Последовательно, снова пары отожженных праймеров вставляют в уникальные сайты в обратном направлении от каждого из отдельных промоторов, что приводит к конструкту одно-, двух- или мульти-экспрессионной кассеты. Вставка может быть перемещена, например, в остов AdV или остов AAV, используя два уникальных сайта рестрикционных ферментов (одинаковые или разные), которые фланкируют вставку одно-, двух- или мульти-экспрессионной кассеты.

Создание одного или каждого конструкта днРНКи может быть осуществлена с использованием любых подходящих методов генной инженерии, известных в данной области техники, включая, без ограничения, стандартные методы ПЦР, синтез олигонуклеотидов, расщепление рестрикционной эндонуклеазой, лигирование, трансформацию, очистку плазмид и секвенирование ДНК. Если один или каждый конструкт представляет собой вирусный конструкт, он содержит, например, последовательности, необходимые для упаковки конструкта днРНКи в вирусные частицы и/или последовательности, которые позволяют интегрировать конструкт днРНКи в геном целевой клетки. В некоторых примерах вирусный конструкт, один или каждый вирусный конструкт дополнительно содержит гены, которые обеспечивают репликацию и размножение вируса, однако такие гены будут обеспечиваться в транс. Кроме того, один или каждый вирусный конструкт может содержать гены или генетические последовательности из генома любого известного организма, включенные в нативной форме или модифицированные. Например, вирусный конструкт может содержать последовательности, полезные для репликации конструкта в бактериях.

Один или каждый конструкт также может содержать дополнительные генетические элементы. Типы элементов, которые могут быть включены в конструкт, никоим образом не ограничены и могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, дополнительные генетические элементы могут включать репортерный ген, такой как один или более генов для флуоресцентного маркерного белка, такого как GFP или RFP; легко анализируемый фермент, такой как бета-галактозидаза, люцифераза, бета-глюкуронидаза, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы или секретированная эмбриональная щелочная фосфатаза; или белки, для которых легко доступны иммуноанализы, такие как гормоны или цитокины.

Другие генетические элементы, которые могут найти применение в вариантах осуществления данного раскрытия, включают те, которые кодируют белки, которые обеспечивают селективное преимущество роста в клетках, такие как аденозин-деаминаза, аминогликозид-фосфотрансфераза, дигидрофолатредуктаза, гигромицин-B-фосфотрансфераза, лекарственная устойчивость или те гены, которые кодируют белки, которые обеспечивают биосинтетическую способность, отсутствующую у ауксотрофа. Если репортерный ген включен вместе с одним или с каждым конструктом, может быть включена последовательность внутреннего сайта связывания рибосомы (IRES). В одном примере дополнительные генетические элементы функционально связаны с независимым промотором/энхансером и контролируются им. Кроме того, можно использовать подходящую точку начала репликации для размножения конструкта в бактериях. Последовательность точки начала репликации обычно отделена от конструкта днРНКи и других генетических последовательностей. Такие точки начала репликации известны в данной области техники и включают точки начала репликации pUC, ColE1, 2-микронной плазмиды или SV40.

Векторы экспрессии

В одном примере конструкт днРНКи согласно раскрытию включен в вектор экспрессии.

В одном примере вектор экспрессии представляет собой плазмиду, например, как известно в данной области техники. В одном примере подходящий плазмидный вектор экспрессии представляет собой вектор pAAV, например, самокомплементарный плазмидный вектор pAAV (pscAAV) или одноцепочечный плазмидный вектор pAAV (pssAAV). Как описано в данном документе, плазмида может содержать один или более промоторов (подходящие примеры которых описаны) для управления экспрессией одной или более кшмиР согласно раскрытию.

В одном примере вектор экспрессии представляет собой миникольцевую ДНК. Миникольцевая ДНК описана в патентной публикации США № 2004/0214329. Миникольцевые ДНК полезны для сохранения высоких уровней транскрипции нуклеиновых кислот. Кольцевые векторы характеризуются отсутствием бактериальных последовательностей, подавляющих экспрессию. Например, миникольцевые векторы отличаются от бактериальных плазмидных векторов тем, что у них отсутствует точка начала репликации и отсутствуют маркеры устойчивости к лекарственному средству, обычно обнаруживаемые в бактериальных плазмидах, например, β-лактамаза, tet и тому подобное. Следовательно, миникольцевая ДНК становится меньше по размеру, обеспечивая более эффективную доставку.

В одном примере вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор.

Вирусный вектор на основе любого подходящего вируса может быть использован для доставки днРНКи согласно раскрытию. Кроме того, гибридные вирусные системы могут быть полезны. Выбор вирусной системы доставки будет зависеть от различных параметров, таких как ткань, предназначенная для доставки, эффективность трансдукции системы, патогенность, проблемы иммунологии и токсичности, и тому подобное.

Обычно используемые классы вирусных систем, используемых в генной терапии, могут быть разделены на две группы в зависимости от того, интегрируются ли их геномы в клеточный хроматин хозяина (онкоретровирусы и лентивирусы) или сохраняются в ядре клетки преимущественно как внехромосомные эписомы (аденоассоциированный вирус, аденовирусы и герпесвирусы). В одном примере вирусный вектор согласно раскрытию интегрируется в хроматин клетки-хозяина. В другом примере вирусный вектор согласно раскрытию сохраняется в ядре клетки-хозяина как внехромосомная эписома.

В одном примере вирусный вектор представляет собой аденовирусный (AdV) вектор. Аденовирусы представляют собой двухцепочечные безоболочечные ДНК-вирусы среднего размера с линейными геномами, которые составляют от 26 до 48 т.п.н. Аденовирусы попадают в целевую клетку за счет рецептор-опосредованного связывания и интернализации, проникая в ядро как в неделящихся, так и в делящихся клетках. Аденовирусы в значительной степени зависят от клетки-хозяина в отношении выживания и репликации и способны реплицироваться в ядре клеток позвоночных с использованием механизма репликации хозяина.

В одном примере вирусный вектор относится к семейству Parvoviridae. Parvoviridae представляет собой семейство небольших одноцепочечных безоболочечных ДНК-вирусов с геномами длиной около 5000 нуклеотидов. В число членов семейства входит аденоассоциированный вирус (AAV). В одном примере вирусный вектор согласно раскрытию представляет собой AAV. AAV представляет собой зависимый парвовирус, который обычно нуждается в совместном инфицировании с другим вирусом (обычно аденовирусом или герпесвирусом) для инициации и поддержания продуктивного инфекционного цикла. В отсутствии такого вируса-помощника AAV по-прежнему способен инфицировать или трансдуцировать целевую клетку путем рецептор-опосредованного связывания и интернализации, проникая в ядро как в неделящихся, так и в делящихся клетках. Поскольку потомство вируса не продуцируется инфекцией AAV в отсутствии вируса-помощника, степень трансдукции ограничивается только исходными клетками, инфицированными вирусом. Именно эта особенность делает AAV желательным вектором для данного раскрытия. Кроме того, в отличие от ретровируса, аденовируса и вируса простого герпеса, AAV, по-видимому, не обладает патогенностью и токсичностью для человека (Kay, et al., Nature. 424: 251 (2003)). Поскольку геном обычно кодирует только два гена, неудивительно, что в качестве средства доставки AAV ограничен упаковочной емкостью в 4,5 тысяч нуклеотидов (т.н.) в одной цепи. Однако, хотя это ограничение по размеру может ограничивать гены, которые могут быть доставлены для заместительной генной терапии, оно не оказывает негативного влияния на упаковку и экспрессию более коротких последовательностей, таких как кшмиР и кшРНК.

Другой вирусной системой доставки, пригодной для конструктов днРНКи согласно раскрытию, является система, основанная на вирусах из семейства Retroviridae. Ретровирусы включают одноцепочечные РНК-вирусы животных, которые характеризуются двумя уникальными признаками. Во-первых, геном ретровируса является диплоидным, состоящим из двух копий РНК. Во-вторых, данная РНК транскрибируется обратной транскриптазой, связанной с вирионом, в двухцепочечную ДНК. Данная двухцепочечная ДНК или провирус может затем интегрироваться в геном хозяина и передаваться из исходной клетки в потомство клеток в качестве стабильно интегрированного компонента генома хозяина.

В некоторых примерах вирусный вектор представляет собой лентивирус. Лентивирусные векторы часто псевдотипируются гликопротеином вируса везикулярного соматита (VSV-G) и получают из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ); вируса висна-маэди, вызывающего энцефалит (висна) или пневмонию у овец; вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), вызывающего аутоиммунную гемолитическую анемию и энцефалопатию у лошадей; вируса кошачьего иммунодефицита (FIV), вызывающего иммунодефицита у кошек; вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вызывающего лимфаденопатию и лимфоцитоз крупного рогатого скота; и вируса иммунодефицита обезьян (SIV), который вызывает иммунодефицит и энцефалопатию у приматов, отличных от человека. Векторы, основанные на ВИЧ, обычно сохраняют <5% исходного генома, и <25% генома включается в упаковочные конструкты, что сводит к минимуму возможность генерации способного к обратной репликации ВИЧ. Биобезопасность была дополнительно повышена за счет разработки самоинактивирующихся векторов, которые содержат делеции регуляторных элементов в последующей последовательности длинных концевых повторов, исключая транскрипцию сигнала упаковки, который требуется для мобилизации вектора. Одним из основных преимуществ использования лентивирусных векторов является то, что перенос гена является стойким в большинстве тканей или типов клеток, даже после деления трансдуцированной клетки.

Конструкт на основе лентивируса, используемый для экспрессии кшмиР и/или кшРНК из нуклеиновых кислот и конструктов днРНКи согласно раскрытию, содержит последовательности из 5' и 3' длинных концевых повторов (LTR) лентивируса. В одном примере вирусный конструкт содержит инактивированную или самоинактивирующуюся 3'-LTR из лентивируса. 3'-LTR может быть самоинактивирован любым способом, известным в данной области техники. Например, элемент U3 3'-LTR содержит делецию своей энхансерной последовательности, например, TATA-бокса, сайтов Sp1 и ядерного фактора «каппа-би». Благодаря самоинактивирующемуся 3'-LTR провирус, который интегрирован в геном хозяина, будет содержать инактивированный 5'-LTR. Последовательности LTR могут быть последовательностями LTR из любого лентивируса из любого вида. Конструкт на основе лентивируса также может включать последовательности для генов MMLV или MSCV, RSV или млекопитающих. Кроме того, последовательность U3 из лентивирусного 5' LTR может быть заменена промоторной последовательностью в вирусном конструкте. Это может увеличить титр вируса, извлеченного из пакующей клеточной линии. Также может быть включена энхансерная последовательность.

Другие вирусные или невирусные системы, известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы для доставки днРНКи или нуклеиновой кислоты согласно данному раскрытию в представляющие интерес клетки, включая, но не ограничиваясь ими, векторы на основе транспозонов-аденовирусов с удаленным геном (см. Yant, et al., Nature Biotech. 20:999-1004 (2002)); системы, полученные из вируса Синдбис или вируса леса Семлики (см. Perri, et al, J. Virol. 74(20):9802-07 (2002)); системы, полученные из вируса болезни Ньюкасла или вируса Сендай.

Тестирование кшмиР или конструкта днРНКи согласно раскрытию

Модели клеточных культур

Примером клеточной линии, полезной в качестве модели клеточной культуры для ОФМД, является клеточная линия HEK293T (HEK293T, ATCC, Манассас, США), которая была трансфицирована вектором, экспрессирующим нормальный Ala10-humanPABPN1-FLAG (Ala10) или мутантный Ala17-humanPABPN1-FLAG (Ala17), последний является отличительной чертой ОФМД.

Другими примерами клеточных линий, используемых в качестве моделей клеточных культур для ОФМД, являются мышечные клетки мыши C2C12 и клетки сетчатки человека ARPE-19, например, как описано в Примере 5.

Другим примером клеточной линии, полезной в качестве модели клеточной культуры для ОФМД, является первичная клеточная линия миобластов мыши (IM2), стабильно трансфицированная для экспрессии или нормального Ala10-humanPABPN1-FLAG (Ala10), или мутантного Ala17-humanPABPN1-FLAG (Ala17). Иллюстративная клеточная линия, полученная из IM2, которая стабильно экспрессирует мутантный Ala17-humanPABPN1-FLAG (Ala17), представляет собой клеточную линию H2kB-D7e. Клеточная линия H2kB-D7e также описана в Raz et al., (2011) American Journal of Pathology,179(4):1988-2000.

В данной области техники известны другие клеточные линии, подходящие для моделей клеточной культуры ОФМД, такие как описанные в Fan et al., (2001) Human Molecular Genetics, 10:2341-2351, Bao et al., (2002) The Journal of Biological Chemistry, 277:12263-12269, и Abu-Baker et al., (2003) Human Molecular Genetics, 12:2609-2623.

Как проиллюстрировано в данном документе, активность кшмиР согласно раскрытию определяется путем введения в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей кшмиР, или конструкт днРНКи, или вектор экспрессии, содержащей их, и последующего измерения уровня экспрессии РНК или белка, кодируемого геном PABPN1. Например, внутриклеточную экспрессию гена PABPN1 можно анализировать с помощью любой одной или более из ОТ-ПЦР, количественной ПЦР, полуколичественной ПЦР или гибридизации in-situ в жестких условиях с использованием одного или более зондов или праймеров, которые специфичны для PABPN1. мРНК или ДНК PABPN1 также можно анализировать с помощью ПЦР с использованием одного или более зондов или праймеров, которые специфичны для PABPN1, или можно использовать ИФА для обнаружения белка PABPN1.

Полинуклеотиды, которые можно использовать в методах ОТ-ПЦР, количественной ПЦР или полуколичественной ПЦР для выявления экспрессии PABPN1, известны и коммерчески доступны (Thermo Fisher). Однако полинуклеотиды, полезные для способов обнаружения на основе ПЦР, могут быть разработаны на основе информации о последовательности, доступной для PABPN1, с использованием метода и/или программного обеспечения, известного в данной области техники. В одном примере присутствие или отсутствие мРНК PABPN1 может быть обнаружено с использованием ОТ-ПЦР с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. В одном примере присутствие или отсутствие, или относительное количество полипептида или белка PABPN1 может быть обнаружено с использованием любого одного или более из вестерн-блоттинга, ИФА или других стандартных количественных или полуколичественных методов, доступных в данной области техники, или комбинации таких методов. В данном документе описаны и рассмотрены способы, основанные на распознавании антител против PABPN1, например, в Примере 4. В одном примере присутствие или отсутствие, или относительное содержание полипептида PABPN1 можно обнаружить с помощью методов, которые включают захват антителами полипептидов PABPN1 в комбинации с электрофоретическим разделением захваченных полипептидов PABPN1, например, с использованием анализа Isonostic™ (Target Discovery, Inc.). Антитела являются коммерчески доступными для белка PABPN1.

В данной области техники известны различные средства для нормализации различий в эффективности трансфекции или трансдукции и извлечения образца.

Нуклеиновая кислота, конструкт днРНКи или вектор экспрессии согласно раскрытию, который снижает экспрессию мРНК или белка, кодируемого PABPN1, или который уменьшает присутствие ядерных агрегатов белка PABPN1, относительно уровня экспрессии мРНК или белка, кодируемого PABPN1, или количества ядерных агрегатов белка PABPN1 в отсутствии РНК согласно раскрытию считается полезным для применения в терапевтических целях, например, таких как лечение ОФМД путем снижения экспрессии эндогенного PABPN1 и замены части или всего эндогенного PABPN1 белком PABPN1, который не является причиной ОФМД, как описано в данном документе.

Животные модели

Для изучения ОФМД доступно несколько моделей на небольших животных, примеры которых описаны в Uyama et al., (2005) Acta Myologica, 24(2):84-88 и Chartier and Simonelig (2013) Drug Discovery Today: technologies, 10:e103-107. Иллюстративная животная модель представляет собой модель трансгенной мыши A17.1, которая была описана ранее в Davies et al., (2005) Nature Medicine, 11:672-677 и Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19(11):2191-2207.

Любая из вышеупомянутых животных моделей может быть использована для определения эффективности кшмиР или конструкта днРНКи согласно раскрыти. в отношении нокдауна, снижения или ингибирования экспрессии РНК или белка, кодируемого геном PABPN1.

Способы анализа экспрессии гена PABPN1 были описаны в данном документе в отношении клеточных моделей и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

Агенты для замены функционального PABPN1

В одном примере данное раскрытие обеспечивает агент для замены функционального белка PABPN1, например, в клетке или животном. Функциональный белок PABPN1 не будет причиной ОФМД и не будет кодироваться транскриптом мРНК, на которую нацелены кшмиР или кшРНК согласно раскрытию.

В одном примере агент для замены функционального белка PABPN1 в клетке или животном представляет собой нуклеиновую кислоту, например, такую как ДНК или кДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, может быть оптимизирована по кодонам, например, содержать одно или более вырожденных или неоднозначных оснований относительно нуклеиновой кислоты PABPN1 дикого типа, но которая кодирует идентичные аминокислоты, так что соответствующая последовательность мРНК, кодирующая последовательность функциональный белок PABPN1 не распознается кшмиР или кшРНК согласно раскрытию. Например, кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, может содержать одно или более вырожденных или неоднозначных оснований относительно нуклеиновой кислоты PABPN1 дикого типа в пределах области, на которую нацелены кшмиР или кшРНК согласно раскрытию. В одном примере одно или более вырожденных или неоднозначных оснований находятся в затравочной области эффекторной последовательности кшмиР или кшРНК согласно раскрытию.

В одном примере нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, оптимизирована по кодонам, так что соответствующая ей последовательность мРНК не распознается кшмиР или кшРНК согласно раскрытию. Предпочтительно, функциональный белок PABPN1, кодируемый кодон-оптимизированной последовательностью нуклеиновой кислоты, содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 74, то есть аминокислотную последовательность человеческого белка PABPN1 дикого типа. Квалифицированному специалисту будет понятно, что существует ряд комбинаций нуклеотидных последовательностей, которые можно использовать для кодирования функционального белка PABPN1, и выбор нуклеотидной последовательности в конечном итоге будет зависеть от эффекторной последовательности кшмиР или кшРНК, т.е. такой, что кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота не будет распознаваться кшмиР или кшРНК. В одном примере агент для замены функционального белка PABPN1 представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 73. В одном примере нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, также может содержать последовательность Козак.

В одном примере кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, функционально связана с промотором, подходящим для экспрессии функционального белка PABPN1. Промоторы, подходящие для экспрессии функционального белка PABPN1 в ткани, глазе или мышце, могут быть наиболее подходящими. Один иллюстративный промотор, подходящий для применения с нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1, представляет собой промотор Spc512. Другой иллюстративный промотор, подходящий для применения с нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1, представляет собой промотор CK8. Однако любой подходящий промотор, известный в данной области техники, может быть использован. Например, другие подходящие промоторы для применения с нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1, описаны в US 20110212529 A1.

Как описаны в данном документе промоторы, полезные в некоторых примерах данного раскрытия, могут быть тканеспецифическими или клеточноспецифическими.

В одном примере кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, может дополнительно содержать один или более энхансеров для увеличения экспрессии функционального белка PABPN1 и его соответствующего мРНК-транскрипта. Энхансеры, подходящие для применения в этом примере данного раскрытия, будут известны специалистам в данной области техники.

Нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, может содержаться в векторе экспрессии. Иллюстративные векторы экспрессии были описаны в контексте нуклеиновой кислоты и конструктов днРНКи согласно раскрытию, и их следует применять mutatis mutandis к данному примеру.

Соответственно, в одном примере агент для замены функционального белка PABPN1 в клетке или животном может представлять собой вектор экспрессии, содержащий кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1. Например, вектор экспрессии согласно раскрытию может содержать кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1, и промотор для его экспрессии, например, промотор SpC512 или промотор CK8. В одном примере кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, также может содержать последовательность Козак.

В одном примере нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, как описано в данном документе, может быть включена в плазмидный вектор экспрессии. Подходящие плазмидные векторы экспрессии были описаны в данном документе и будут известны в данной области техники. В одном примере подходящий плазмидный вектор экспрессии представляет собой вектор pAAV, например, плазмидный вектор pscAAV или плазмидный вектор pssAAV.

В одном примере вектор экспрессии представляет собой миникольцевую ДНК. Векторы на основе миникольцевой ДНК были описаны в данном документе.

В одном примере вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор. Например, вирусный вектор на основе любого подходящего вируса может быть использован для доставки кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию. Кроме того, гибридные вирусные системы могут быть полезны. Выбор вирусной системы доставки будет зависеть от различных параметров, таких как ткань, предназначенная для доставки, эффективность трансдукции системы, патогенность, проблемы иммунологии и токсичности, и тому подобное.

Иллюстративные вирусные системы для доставки генетического материала в клетку или животное были описаны в контексте РНК и конструктов днРНКи согласно раскрытию и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру.

В одном примере вирусный вектор представляет собой AAV.

В одном примере вирусный вектор представляет собой вектор на основе AdV.

В одном примере вирусный вектор представляет собой лентивирус.

Другие вирусные или невирусные системы, известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы для доставки кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, в представляющие интерес клетки, включая, но не ограничиваясь этим, векторы на основе транспозонов-аденовирусов с удаленным геном (см. Yant, et al., Nature Biotech. 20:999-1004 (2002)); системы, полученные из вируса Синдбис или вируса леса Семлики (см. Perri, et al, J. Virol. 74(20):9802-07 (2002)); системы, полученные из вируса болезни Ньюкасла или вируса Сендай.

В соответствии с примером, в котором кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, как описано в данном документе, обеспечена нуклеиновой кислотой, конструктом днРНКи или вектором экспрессии согласно раскрытию, кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1 может содержаться в том же векторе экспрессии, что и нуклеиновая кислота или конструкт днРНКи. Таким образом, кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, и нуклеиновая кислота или конструкт днРНКи согласно раскрытию, могут быть представлены в виде единого конструкта ДНК, например, внутри вектора экспрессии.

В альтернативном примере, в котором кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, и нуклеиновая кислота или конструкт днРНКи согласно раскрытию должны быть представлены вместе, кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, и нуклеиновая кислота или конструкт днРНКи могут содержаться в разных векторах экспрессии. Когда кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, и нуклеиновая кислота или конструкт днРНКи содержатся в разных векторах экспрессии, соответствующие векторы экспрессии могут представлять собой вектор одного и того же типа или векторы разных типов.

Исследование на функциональный PABPN1

Модели клеточных культур

Иллюстративные модели клеточных культур ОФМД были описаны в данном документе, в том числе в рабочих примерах, например, в Примерах 4 и 5. Такие модели клеточных культур ОФМД можно использовать для оценки способности агента согласно раскрытию заменять функциональный белок PABPN1 в присутствии одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих кшмиР согласно раскрытию, нацеленных на эндогенный PABPN1.

Иллюстративные способы обнаружения присутствия или отсутствия, или относительного количества белка PABPN1 также были описаны и применяются mutatis mutandis к данному примеру. Для примера присутствие или отсутствие, или относительное количество белка PABPN1 может быть обнаружено с использованием любого одного или более из вестерн-блоттинга, ИФА или других стандартных количественных, или полуколичественных методов, доступных в данной области техники, или комбинации таких способов. В данном документе описаны и рассмотрены способы, основанные на распознавании антител против PABPN1. Мутантные и функциональные белки PABPN1 могут быть экспрессированы с помощью соответствующих белковых меток, например, myc или flag-метки, для облегчения дифференциального обнаружения мутантных и функциональных белков PABPN1 с использованием соответствующих антител, которые являются коммерчески доступными. Например, мутантный человеческий белок PABPN1 может быть экспрессирован с помощью метки FLAG. Таким образом, присутствие или отсутствие, или относительное количество как мутантного, так и функционального белка PABPN1 может быть независимо обнаружено в клетке после трансфекции или трансдукции клетки одной или более нуклеиновой кислотой(ами), конструктом(ами) днРНКи или вектором(ами) экспрессии согласно раскрытию и агентом для замены функционального белка PABPN1 согласно раскрытию (который может быть обеспечен отдельно или вместе, как описано в данном документе).

В одном примере присутствие или отсутствие, или относительное содержание полипептида PABPN1 можно обнаружить с помощью методов, которые включают захват антителами полипептидов PABPN1 в комбинации с электрофоретическим разделением захваченных полипептидов PABPN1, например, с использованием анализа Isonostic™ (Target Discovery, Inc.). Антитела являются коммерчески доступными для белка PABPN1.

Агент согласно раскрытию, который экспрессирует белок PABPN1, который не является причиной ОФМД в клетке, в присутствии нуклеиновой кислоты (кислот), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию (экспрессирующих одну или более кшмиР согласно раскрытию) считается полезным для лечения ОФМД.

Животные модели

Были описаны иллюстративные животные модели для изучения ОФМД.

Любая из вышеупомянутых моделей на животных может быть использована для определения эффективности агента согласно раскрытию для замены функционального белка PABPN1 in vivo в присутствии одной или более нуклеиновых кислот(ы), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию (экспрессирующих одну или более кшмиР согласно раскрытию).

Способы анализа экспрессии PABPN1 были описаны в данном документе в отношении клеточных моделей и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру раскрытия.

В одном примере гистологический и морфологический анализы могут быть использованы для определения эффективности агента согласно раскрытию для замены функционального белка PABPN1 in vivo в присутствии одной или более нуклеиновых кислот(ы), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию (экспрессирующих одну или более кшмиР согласно раскрытию). Дополнительные анализы, которые можно использовать для определения эффективности агента согласно раскрытию для замены функционального белка PABPN1 in vivo описаны в Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19(11): 2191-2207.

Единые конструкты ДНК для днРНКи и замены функциональных PABPN1

Данное раскрытие также обеспечивает единый конструкт ДНК, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1, как описано в данном документе, и один или более конструктов днРНКи согласно раскрытию. Иллюстративный конструкт ДНК, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1, и конструкт днРНКи согласно раскрытию, описан в Примере 7. В одном примере конструкт ДНК может содержать один конструкт днРНКи, как описано в данном документе, в комбинации с нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1. В другом примере конструкт ДНК может содержать множество конструктов днРНКи в комбинации с нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1. В каждом примере конструкта ДНК последовательность ДНК, кодирующую функциональный белок PABPN1, оптимизируют по кодонам, так что ее мРНК-транскрипт не нацеливается на кшмиР конструкта(ов) днРНКи.

В одном примере функциональный белок PABPN1 представляет собой человеческий белок PABPN1 дикого типа, например, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 74. Понятно, что кодон-оптимизированная последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, может изменяться в зависимости от кшмиР, кодируемых конструктом днРНКи. То есть конкретные кодоны в мРНК-транскрипте PABPN1, подлежащие модификации, могут варьироваться в зависимости от эффекторной последовательности(ей) кшмиР, кодируемой конструктом днРНКи. В одном примере кодон-оптимизированная последовательность ДНК, кодирующая функциональный белок PABPN1, указана в SEQ ID NO: 73.

Конструкт ДНК также может содержать один или более промоторов, например, для управления экспрессией функционального белка PABPN1 и/или кшмиР, кодируемых конструктом днРНКи. Промоторы, полезные в некоторых примерах данного раскрытия, могут быть тканеспецифическими или клеточноспецифическими. Иллюстративные промоторы для использования в конструктах ДНК согласно раскрытию представляют собой мышечно-специфические промоторы, такие как, например, Spc512 и CK8. Однако любой подходящий промотор, известный в данной области техники, рассматривается для использования в конструкте ДНК, описанном в данном документе, например, в таких как те, которые описаны в US 20110212529 A1.

Конструкт ДНК может быть представлен в форме вектора экспрессии или может содержаться в векторе экспрессии. Подходящие векторы экспрессии были описаны в данном документе и будут известны в данной области техники.

В одном примере вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор. Например, вирусный вектор на основе любого подходящего вируса может быть использован для доставки единого конструкта ДНК согласно раскрытию. Кроме того, гибридные вирусные системы могут быть полезны. Выбор вирусной системы доставки будет зависеть от различных параметров, таких как ткань, предназначенная для доставки, эффективность трансдукции системы, патогенность, проблемы иммунологии и токсичности, и тому подобное.

В другом примере подходящий плазмидный вектор экспрессии представляет собой вектор pAAV, например, плазмидный вектор pscAAV или плазмидный вектор pssAAV. Другие иллюстративные вирусные системы для доставки генетического материала в клетку или животное были описаны в контексте конструктов днРНКи согласно раскрытию и должны применяться mutatis mutandis к данному примеру.

В одном примере конструкт ДНК обеспечивают в форме вектора экспрессии pAAV, содержащего в направлении от 5' к 3' мышечно-специфический промотор, например, промотор Spc512, конструкт днРНКи, как описано в данном документе, и конструкт PABPN1, описанный в данном документе, например, в котором конструкт днРНКи расположен в 3'-нетранслируемой области (НТО) нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок PABPN1. Конструкт ДНК в соответствии с этим примером продемонстрирован на Фиг. 12А.

Иллюстративный конструкт ДНК в соответствии с этим примером представляет собой вектор экспрессии pAAV, содержащий в направлении от 5' к 3':

(a) мышечно-специфический промотор, например, Spc512;

(c) конструкт днРНКи согласно раскрытию, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР17, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР13, как описано в данном документе.

В соответствии с этим примером конструкт ДНК может содержать или состоять из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 72.

Другой иллюстративный конструкт ДНК в соответствии с этим примером представляет собой вектор экспрессии pAAV, содержащий в направлении от 5' к 3':

(a) мышечно-специфический промотор, например, Spc512;

В соответствии с этим примером конструкт ДНК может содержать или состоять из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 71.

В другом примере конструкт ДНК обеспечивают в форме вектора экспрессии pAAV, содержащего в направлении от 5' к 3' первый мышечно-специфический промотор, например, промотор CK8, конструкт PABPN1, как описано в данном документе, второй мышечно-специфический промотор, например, промотор Spc512 и конструкт днРНКи, как описано в данном документе, причем первый и второй мышечно-специфические промоторы находятся в функциональной связи с конструктом PABPN1 и конструктом днРНКи, соответственно. Конструкт ДНК в соответствии с этим примером продемонстрирован на Фиг. 12B. Например, промотор, который находится в функциональной связи с конструктом PABPN1, будет функционально связан с последовательностью ДНК, кодирующей функциональный белок PABPN1, содержащийся в ней, промотор, который находится в функциональной связи с конструктом днРНКи, будет функционально связан с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими кшмиР согласно раскрытию. Конструкт ДНК в соответствии с этим примером продемонстрирован на Фиг. 12А.

(a) мышечно-специфический промотор, например, промотор CK8, расположенный в прямом направлении от конструкта днРНКи согласно раскрытию, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР17, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР13, как описано в данном документе; и

В соответствии с этим примером конструкт ДНК может содержать или состоять из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 70.

(a) мышечно-специфический промотор, например, промотор CK8, расположенный в прямом направлении от конструкта днРНКи согласно раскрытию, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР3, как описано в данном документе, и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую кшмиР14, как описано в данном документе; и

В соответствии с этим примером конструкт ДНК может содержать или состоять из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 69.

Иллюстративный конструкт днРНКи, кодирующий кшмиР13 и кшмиР17 для включения в конструкт ДНК согласно раскрытию, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (кшмиР13), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38 (кшмиР17). Например, конструкт днРНКи в соответствии с этим примером конструкта ДНК может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 64 (кшмиР13), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 68 (кшмиР17).

Иллюстративный конструкт днРНКи, кодирующий кшмиР3 и кшмиР14 для включения в конструкт ДНК согласно раскрытию, содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (кшмиР3), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, кодирующей кшмиР, содержащую эффекторную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и эффекторную комплементарную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, например, эффекторную комплементарную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34 (кшмиР14); Например, конструкт днРНКи в соответствии с этим примером конструкта ДНК может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 57 (кшмиР3), и нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, указанной в SEQ ID NO: 65 (кшмиР14).

Хотя некоторые примеры были описаны, следует понимать, что конструкт ДНК в соответствии с данным раскрытием может включать любой конструкт днРНКи, описанный в данном документе, кодирующий одну или более кшмиР. Например, конструкты днРНКи, кодирующие кшмиР, описанные в Примерах 1-5, могут быть наиболее подходящими для включения в конструкт ДНК согласно раскрытию.

Композиции и носители

В некоторых примерах нуклеиновая кислота(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию представляют в композиции. В некоторых примерах нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, обеспечивают в композиции. В некоторых примерах нуклеиновая кислота(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию представлены в композиции вместе с нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию. В некоторых примерах одна или более нуклеиновых кислот(ы) или конструкт(ов) днРНКи и нуклеиновая кислота, кодирующая функциональный белок PABPN1, представлены в одном и том же векторе экспрессии в композиции.

Как описано в данном документе, вектор экспрессии может содержать конструкт днРНКи согласно раскрытию отдельно или в комбинации с кодон-оптимизированной нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию. Ссылка в данном документе на вектор экспрессии и/или композицию, содержащую его, следовательно, будет пониматься как включающая: (i) вектор экспрессии, содержащий конструкт днРНКи согласно раскрытию, или композицию, содержащую его; (ii) вектор экспрессии, содержащий как конструкт днРНКи согласно раскрытию, так и кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, или композицию, содержащую его; или (iii) вектор экспрессии, содержащий кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, или композицию, содержащую его.

Соответственно, композиция согласно раскрытию может содержать (i) вектор экспрессии, содержащий конструкт днРНКи согласно раскрытию, и (ii) вектор экспрессии, содержащий кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию. Альтернативно, композиция согласно раскрытию может содержать единый вектор экспрессии, содержащий конструкт днРНКи согласно раскрытию и кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию.

В еще одном примере вектор экспрессии, содержащий конструкт днРНКи согласно раскрытию, может быть представлен в одной композиции, и вектор экспрессии, содержащий кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, может быть представлен в другой композиции, например, которые объединяют вместе.

Композиция согласно раскрытию также может содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей. Например, композиция может содержать носитель, подходящий для доставки нуклеиновой кислоты (кислот), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию в мышцу субъекта после введения в него.

В некоторых примерах носитель представляет собой носитель на основе липидов, катионный липид или комплекс нуклеиновой кислоты с липосомами, липосому, мицеллу, виросому, липидную наночастицу или их смесь.

В некоторых примерах носитель представляет собой носитель на основе биоразлагаемого полимера, так что образуется комплекс катионный полимер-нуклеиновая кислота. Например, носитель может представлять собой микрочастицу катионного полимера, подходящую для доставки одной или более нуклеиновых кислот(ы), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию в мышечные клетки или ткань глаза. Применение катионных полимеров для доставки композиций к клеткам известно в данной области техники, например, как описано в Judge et al. Nature 25: 457-462 (2005), содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Иллюстративный носитель на основе катионного полимера представляет собой катионный ДНК-связывающий полимер, такой как полиэтиленимин. Другие катионные полимеры, подходящие для комплексообразования и доставки нуклеиновой кислоты (кислот), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию, включают поли(L-лизин) (PLL), хитозан, ПАМАМ-дендримеры и поли(2-диметиламино)этилметакрилат (pDMAEMA). Другие полимеры включают сложные поли-бета-аминоэфиры. Эти другие подходящие катионные полимеры известны в данной области техники и описаны в Mastrobattista and Hennink, Nature Materials, 11:10-12 (2012), WO/2003/097107 и WO/2006/041617, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. Такие составы носителей были разработаны для различных путей доставки, включая парентеральную подкожную инъекцию, внутривенную инъекцию и ингаляцию.

В дополнительном примере носитель представляет собой носитель на основе циклодекстрина, такой как комплекс циклодекстриновый полимер-нуклеиновая кислота.

В дополнительном примере носитель представляет собой носитель на основе белка, такой как комплекс катионный пептид-нуклеиновая кислота.

В другом примере носитель представляет собой липидную наночастицу. Иллюстративные наночастицы описаны, например, в US 7514099.

В некоторых примерах нуклеиновую кислоту(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию составляют из композиции липидных наночастиц, содержащей катионный липид/холестерин/PEG-C-DMA/DSPC (например, в соотношении 40/48/2/10), катионный липид/холестерин/PEG-DMG/DSPC (например, в соотношении 40/48/2/10) или катионный липид/холестерин/PEG-DMG (например, в соотношении 60/38/2). В некоторых примерах катионный липид представляет собой октил CL в DMA, DL в DMA, L-278, DLinKC2DMA или MC3.

В другом примере нуклеиновую кислоту(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию составляют с любым составов из катионных липидов, описанных в WO 2010/021865; WO 2010/080724; WO 2010/042877; WO 2010/105209 или WO 2011/022460.

В другом примере нуклеиновая кислота(ы) или конструкт(ы) днРНКи, или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию конъюгированы или образуют комплекс с другим соединением, например, для облегчения доставки нуклеиновой кислоты (кислот), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии. Неограничивающие примеры таких конъюгатов описаны в US 2008/0152661 и US 2004/0162260 (например, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG, и т.п.).

В другом примере полиэтиленгликоль (PEG) ковалентно присоединен к РНК или днРНКи или вектору экспрессии согласно раскрытию. Прикрепленный PEG может иметь любую молекулярную массу, например от около 100 до около 50000 дальтон (Да).

В еще одном другом примере нуклеиновую кислоту(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию составляют с носителем, содержащим поверхностно-модифицированные липосомы, содержащие полиэтиленгликоль-липиды (PEG-модифицированные, или долгоциркулирующие липосомы, или липосомы-невидимки), такие как те, что раскрыты, например, в WO 96/10391; WO 96/10390; или WO 96/10392.

В некоторых примерах нуклеиновая кислота(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию также могут быть составлены или образованы в комплексе с полиэтиленимином или его производным, таким как производные полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамина (PEI-PEG-GAL) или полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамина (PEI-PEG-triGAL).

В других примерах нуклеиновая кислота(ы), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию образуют комплекс с разрушающими мембрану агентами, такими как описанные в публикации заявки на патент США № 2001/0007666.

Другие носители включают циклодекстрины (см., например, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; или WO 03/46185), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) и микросферы PLCA (см., например, US 2002130430).

Композиции желательно включают материалы, которые увеличивают биологическую стабильность нуклеиновой кислоты (кислот), конструкта(ов) днРНКи или вектора(ов) экспрессии согласно раскрытию, и/или материалы, которые увеличивают способность композиций локализоваться в и/или проникать в мышечные клетки селективно. Терапевтические композиции согласно раскрытию могут вводиться в фармацевтически приемлемых носителях (например, физиологическом растворе), которые выбираются на основе способа и пути введения и стандартной фармацевтической практики. Специалист в данной области техники может легко составить фармацевтическую композицию, которая содержит одну или более нуклеиновую кислоту (кислот), конструкт(ы) днРНКи или вектор(ы) экспрессии согласно раскрытию. В некоторых случаях используется изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как фосфатно-солевой буферный раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых примерах к составу добавляют сосудосуживающее средство. Композиции согласно данному раскрытию являются стерильными и апирогенными. Подходящие фармацевтические носители, а также фармацевтические средства для применения в фармацевтических составах описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (ранее называвшийся Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., стандартный текст ссылки в данной области, а также в USP/NF (Фармакопея Соединенных Штатов Америки).

Объем, концентрация и состав фармацевтической композиции, а также схема приема могут быть специально адаптированы для максимизации клеточной доставки при минимизации токсичности, такой как воспалительный ответ, например, при желании можно использовать относительно большие объемы (5, 10, 20, 50 мл или более) с соответствующими низкими концентрациями активных ингредиентов, а также с включением противовоспалительного соединения, такого как кортикостероид.

Композиции согласно раскрытию могут быть составлены для введения любым подходящим способом. Например, пути введения включают, но не ограничиваются ими, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутриокулярный и пероральный, а также трансдермальный или путем ингаляции или при помощи суппозитория. Иллюстративные пути введения включают внутривенный (в/в), внутримышечный (в/м), пероральный, внутрибрюшинный, внутрикожный, внутриартериальный и подкожную инъекцию. В одном примере композицию согласно раскрытию составляют для внутримышечного введения. Такие композиции полезны для фармацевтических применений и могут быть легко приготовлены в подходящем стерильном апирогенном носителе, например, забуференном физиологическом растворе для инъекций, для парентерального введения, например, внутримышечно (включая внутривенную инфузию), п/к и для внутрибрюшинного введения. Некоторые пути введения, такие как в/м, внутривенная инъекция или инфузия, могут обеспечить эффективную доставку в мышечную ткань и трансфекцию конструктов днРНКи и/или кодон-оптимизированных нуклеиновых кислот, кодирующих PABPN1 согласно раскрытию, и экспрессию РНК и/или кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты в ней.

Способы лечения

В одном примере одну или более нуклеиновых кислот(ы), конструкт(ов) днРНКи, вектор(ов) экспрессии или композицию(ий), содержащую их, как описано в данном документе, используют для ингибирования экспрессии эндогенного белка PABPN1, включая белок PABPN1, который является причиной ОФМД у субъекта.

В одном примере одна или более нуклеиновая кислота (кислот), конструкт(ов) днРНКи, вектор(ов) экспрессии или композиция(й), содержащая их, как описано в данном документе, могут быть использованы для лечения ОФМД у субъекта, страдающего от нее. Аналогично, одна или более нуклеиновых кислот(а), конструктов (конструкт) днРНКи, векторов (вектор) экспрессии или композиций(я), содержащие их, как описано в данном документе, могут быть использованы для предотвращения развития или прогрессирования одного или более симптомов ОФМД у субъекта, страдающего от этого или предрасположенного к ней.

В каждом из приведенных выше примеров вектор экспрессии и/или композиция согласно раскрытию может содержать как конструкт днРНКи согласно раскрытию, так и кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию. Соответственно, введение вектора или композиции экспрессии может быть эффективным для (i) ингибирования, снижения или подавления экспрессии эндогенного PABPN1, включая белок PABPN1, содержащий увеличенный полиаланиновый участок, который является причиной ОФМД, и (ii) для обеспечения экспрессии функционального белка PABPN1, на который не нацелены кшмиР или кшРНК, которые ингибируют, уменьшают или подавляют экспрессию эндогенного PABPN1. Таким образом, композиция согласно раскрытию может восстанавливать функцию белка PABPN1, например, посттранскрипционный процессинг РНК в клетке или животном, которым она вводится.

В другом примере лечение ОФМД может включать введение субъекту отдельно (i) одного или более агентов для ингибирования экспрессии белка PABPN1, который является причиной ОФМД, и (ii) вектора экспрессии, содержащего кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно ракрытию, или композицию, содержащую его. Как описано в данном документе, один или более агентов для ингибирования экспрессии белка PABPN1, который является причиной ОФМД, могут представлять собой нуклеиновую кислоту, конструкт днРНКи, вектор экспрессии или композицию, содержащую их, как описано в данном документе, или множество любого одного или более из них. Субъекту могут вводить компоненты (i) и (ii) вместе, одновременно или последовательно.

Например, лечение ОФМД может включать введение субъекту кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, причем субъекту ранее вводили один или более агентов для ингибирования экспрессии белка PABPN1, который является причиной ОФМД, но не ингибирует экспрессию кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты. Например, субъекту ранее можно было вводить нуклеиновую кислоту, конструкт днРНКи, вектор экспрессии или композицию, содержащую их, как описано в данном документе, или множество из любого одного или более из них.

Как обсуждалось выше, пути введения включают, но не ограничиваются ими, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутриокулярный и пероральный, а также трансдермальный или путем ингаляции или при помощи суппозитория. Иллюстративные пути введения включают внутривенный (в/в), внутримышечный (в/м), пероральный, внутрибрюшинный, внутрикожный, внутриартериальный и подкожную инъекцию. Некоторые пути введения, такие как в/м, внутривенная инъекция или инфузия, могут обеспечить эффективную доставку в мышечную ткань и трансфекцию конструктов днРНКи и/или кодон-оптимизированных нуклеиновых кислот, кодирующих PABPN1 согласно раскрытию, и экспрессию кшмиР или кшРНК и/или кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты в ней.

Специалист в данной области техники сможет путем обычных экспериментов определить эффективное нетоксичное количество нуклеиновой кислоты, конструкта днРНКи, вектора экспрессии или композиции, содержащей то же, что описано в данном документе, или множество любых одного или более из них, что необходимо для лечения субъекта, страдающего от ОФМД. Терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая: используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; время введения; способ введения; скорость разрушения нуклеиновой кислоты, конструкта днРНКи, вектора экспрессии или композиции, содержащей то же, что описано в данном документе, или множество любого одного или более из них, продолжительность лечения вместе с другими связанными факторами, хорошо известными в медицине.

Эффективность нуклеиновой кислоты, конструкта днРНКи, вектора экспрессии или композиции, содержащей их согласно раскрытию, для снижения или ингибирования экспрессии белка PABPN1, вызывающего ОФМД, и для экспрессии функционального белка PABPN1, который не является причиной ОФМД, в количестве, достаточном для восстановления функции PABPN1 можно определить путем оценки сократительные свойства мышц и/или затруднения при глотании у субъекта, которого лечат. Способы проверки способности к глотанию и сократительных свойств мышц известны в данной области техники. Например, затруднения при глотании могут быть оценены с помощью видеофлюороскопии, эндоскопии верхних отделов желудочно-кишечного тракта или эзофагеальной манометрии и исследования сопротивления. Другие методы оценки клинических особенностей ОФМД описаны в et al,. (2005) Swiss Medical Weekly, 135:574-586.

Наборы

Данное раскрытие также обеспечивает одну или более нуклеиновых кислот (кислоту), конструктов (конструкт) днРНКи, векторов (вектор) экспрессии или композицию, содержащую то же самое согласно раскрытию, в форме набора. Набор может содержать контейнер. Набор обычно содержит одну или более нуклеиновых кислот (кислоту), конструктов (конструкт) днРНКи, векторов (вектор) экспрессии или композицию, содержащую то же самое согласно раскрытию, с инструкциями по ее или их введению. В некоторых примерах набор содержит более одной нуклеиновой кислоты, конструкта днРНКи, вектора экспрессии или композиции, содержащей то же самое согласно раскрытию. В одном примере набор содержит (i) первый компонент набора для снижения или ингибирования экспрессии белка, вызывающего ОФМД, PABPN1, содержащий одну или более нуклеиновых кислот(у), конструкт(ов) днРНКи, вектор(ов) экспрессии или композицию, содержащую то же самое согласно раскрытию, и (ii) вектор экспрессии, содержащий кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок PABPN1 согласно раскрытию, или композицию, содержащую его, в качестве второго компонента набора. Первый и второй компоненты набора могут быть объединены вместе в набор.

Таблица 1 - Целевые области в PABPN1

Идентификатор области	Последовательность области (5'-3')	SEQ ID NO:
Область 2	GAGAAGCAGAUGAAUAUGAGUCCACCUC	SEQ ID NO: 1
Область 3	GAACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUG	SEQ ID NO: 2
Область 4	GAAGCUGAGAAGCUAAAGGAGCUACAGA	SEQ ID NO: 3
Область 5	GGGCUAGAGCGACAUCAUGGUAUUCCCC	SEQ ID NO: 4
Область 6	CUGUGUGACAAAUUUAGUGGCCAUCCCA	SEQ ID NO: 5
Область 7	GACUAUGGUGCAACAGCAGAAGAGCUGG	SEQ ID NO: 6
Область 9	CGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU	SEQ ID NO: 7
Область 11	CAGUGGUUUUAACAGCAGGCCCCGGGGU	SEQ ID NO: 8
Область 13	AGAGCGACAUCAUGGUAUUCCCCUUACU	SEQ ID NO: 9
Область 14	GAACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUG	SEQ ID NO: 10
Область 15	AUUGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAUGCCC	SEQ ID NO: 11
Область 16	GGAGGAAGAAGCUGAGAAGCUAAAGGAG	SEQ ID NO: 12
Область 17	GAACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUG	SEQ ID NO: 13

Таблица 2 - эффекторные и эффекторные комплементарные последовательности кшмиР

Идентификатор кшмиР	Эффекторная комплементарная последовательность (5'-3')	SEQ ID NO:	Эффекторная последовательность (5’ – 3’)	SEQ ID NO:
кшмиР2	AGCAGAUGAAUAUGAGUCCA	SEQ ID NO: 14	UGGACUCAUAUUCAUCUGCUU	SEQ ID NO: 15
кшмиР3	GAGGUAGAGAAGCAGAUGAA	SEQ ID NO: 16	UUCAUCUGCUUCUCUACCUCG	SEQ ID NO: 17
кшмиР4	CUGAGAAGCUAAAGGAGCUA	SEQ ID NO: 18	UAGCUCCUUUAGCUUCUCAGC	SEQ ID NO: 19
кшмиР5	UAGAGCGACAUCAUGGUAUU	SEQ ID NO: 20	AAUACCAUGAUGUCGCUCUAG	SEQ ID NO: 21
кшмиР6	GUGACAAAUUUAGUGGCCAU	SEQ ID NO: 22	AUGGCCACUAAAUUUGUCACA	SEQ ID NO: 23
кшмиР7	AUGGUGCAACAGCAGAAGAG	SEQ ID NO: 24	CUCUUCUGCUGUUGCACCAUA	SEQ ID NO: 25
кшмиР9	GUAGAGAAGCAGAUGAAUAU	SEQ ID NO: 26	AUAUUCAUCUGCUUCUCUACC	SEQ ID NO: 27
кшмиР11	GGUUUUAACAGCAGGCCCCG	SEQ ID NO: 28	CGGGGCCUGCUGUUAAAACCA	SEQ ID NO: 29
кшмиР13	CGACAUCAUGGUAUUCCCCU	SEQ ID NO: 30	AGGGGAAUACCAUGAUGUCGC	SEQ ID NO: 31
кшмиР14	GAGAAGCAGAUGAAUAUGAG	SEQ ID NO: 32	CUCAUAUUCAUCUGCUUCUCU	SEQ ID NO: 33
кшмиР15	AGGAGAAGAUGGAGGCUGAU	SEQ ID NO: 34	AUCAGCCUCCAUCUUCUCCUC	SEQ ID NO: 35
кшмиР16	GAAGAAGCUGAGAAGCUAAA	SEQ ID NO: 36	UUUAGCUUCUCAGCUUCUUCC	SEQ ID NO: 37
кшмиР17	AGGUAGAGAAGCAGAUGAAU	SEQ ID NO: 38	AUUCAUCUGCUUCUCUACCUC	SEQ ID NO: 39

Таблица 3 - последовательности кшмиР

Идентификатор кшмиР	последовательности кшмиР (5'–3')	SEQ ID NO:
кшмиР2	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGUAGCAGAUGAAUAUGAGUCCAACUGUGAAGCAGAUGGGUUGGACUCAUAUUCAUCUGCUUCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 43
кшмиР3	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAACUGUGAAGCAGAUGGGUUUCAUCUGCUUCUCUACCUCGCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 44
кшмиР4	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGACUGAGAAGCUAAAGGAGCUAACUGUGAAGCAGAUGGGUUAGCUCCUUUAGCUUCUCAGCCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 45
кшмиР5	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAUAGAGCGACAUCAUGGUAUUACUGUGAAGCAGAUGGGUAAUACCAUGAUGUCGCUCUAGCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 46
кшмиР6	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGUGACAAAUUUAGUGGCCAUACUGUGAAGCAGAUGGGUAUGGCCACUAAAUUUGUCACACGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 47
кшмиР7	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAAUGGUGCAACAGCAGAAGAGACUGUGAAGCAGAUGGGUCUCUUCUGCUGUUGCACCAUACGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 48
кшмиР9	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUACUGUGAAGCAGAUGGGUAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 49
кшмиР11	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGGUUUUAACAGCAGGCCCCGACUGUGAAGCAGAUGGGUCGGGGCCUGCUGUUAAAACCACGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 50
кшмиР13	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGACGACAUCAUGGUAUUCCCCUACUGUGAAGCAGAUGGGUAGGGGAAUACCAUGAUGUCGCCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 51
кшмиР14	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGUGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGACUGUGAAGCAGAUGGGUCUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 52
кшмиР15	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAAGGAGAAGAUGGAGGCUGAUACUGUGAAGCAGAUGGGUAUCAGCCUCCAUCUUCUCCUCCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 53
кшмиР16	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGAAGAAGCUGAGAAGCUAAAACUGUGAAGCAGAUGGGUUUUAGCUUCUCAGCUUCUUCCCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 54
кшмиР17	GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUACUGUGAAGCAGAUGGGUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUCCGCCUACUGCCUCGGACUUCAA	SEQ ID NO: 55

Таблица 4 - Shmir-кодирующие кассеты

Идентификатор кшмиР	Shmir-кодирующие кассеты (5'-3')	SEQ ID NO:
кшмиР2	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGTAGCAGATGAATATGAGTCCAACTGTGAAGCAGATGGGTTGGACTCATATTCATCTGCTTCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 56
кшмиР3	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGAGGTAGAGAAGCAGATGAAACTGTGAAGCAGATGGGTTTCATCTGCTTCTCTACCTCGCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 57
кшмиР4	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGAGAAGCTAAAGGAGCTAACTGTGAAGCAGATGGGTTAGCTCCTTTAGCTTCTCAGCCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 58
кшмиР5	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGATAGAGCGACATCATGGTATTACTGTGAAGCAGATGGGTAATACCATGATGTCGCTCTAGCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 59
кшмиР6	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGTGACAAATTTAGTGGCCATACTGTGAAGCAGATGGGTATGGCCACTAAATTTGTCACACGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 60
кшмиР7	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAATGGTGCAACAGCAGAAGAGACTGTGAAGCAGATGGGTCTCTTCTGCTGTTGCACCATACGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 61
кшмиР9	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGTAGAGAAGCAGATGAATATACTGTGAAGCAGATGGGTATATTCATCTGCTTCTCTACCCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 62
кшмиР11	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGGTTTTAACAGCAGGCCCCGACTGTGAAGCAGATGGGTCGGGGCCTGCTGTTAAAACCACGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 63
кшмиР13	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACGACATCATGGTATTCCCCTACTGTGAAGCAGATGGGTAGGGGAATACCATGATGTCGCCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 64
кшмиР14	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGTGAGAAGCAGATGAATATGAGACTGTGAAGCAGATGGGTCTCATATTCATCTGCTTCTCTCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 65
кшмиР15	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGAGAAGATGGAGGCTGATACTGTGAAGCAGATGGGTATCAGCCTCCATCTTCTCCTCCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 66
кшмиР16	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGAAGAAGCTGAGAAGCTAAAACTGTGAAGCAGATGGGTTTTAGCTTCTCAGCTTCTTCCCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 67
кшмиР17	GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGTAGAGAAGCAGATGAATACTGTGAAGCAGATGGGTATTCATCTGCTTCTCTACCTCCGCCTACTGCCTCGGACTTCAA	SEQ ID NO: 68

Пример 1 - Дизайн кшмиР, нацеленных на PABN1

Последовательности, представляющие потенциальные мишени для конструирования конструктов киРНК, были идентифицированы из последовательности мРНК PABPN1 с использованием общедоступных алгоритмов конструирования киРНК (включая Ambion, Promega, Invitrogen, Origene и MWG): выбранные последовательности были консервативными у людей, приматов, отличных от человека, быков и видов мышей. Последовательности, кодирующие кандидатные киРНК, были включены в каркас pre-miR30a, чтобы создать последовательность, кодирующую короткую шпилечную микроРНК (кшмиР), содержащую 5'-фланкирующую область (SEQ ID NO: 41), последовательность смысловой цепи киРНК (эффекторную комплементарную последовательность), последовательность соединения стебель/петля (SEQ ID NO: 40), антисмысловую цепь киРНК (эффекторную последовательность) и 3'-фланкирующую область (SEQ ID NO: 42). Спрогнозированная вторичная структура репрезентативного кшмиР продемонстрирована на Фиг. 1. Целевые области мРНК-транскрипта PABPN1 для сконструированных кшмиР представлены в Таблице 1, и соответствующие эффекторные последовательности кшмиР (антисмысловая цепь) представлены в Таблице 2.

Пример 2 - Активность кшмиР в анализе репортерного гена двойной люциферазы

Чтобы проверить эффективность кшмиР согласно раскрытию в отношении нокдауна экспрессии транскриптов PABPN1, на клетках HEK293 проводили анализы репортерного гена двойной люциферазы.

Были сконструированы векторы pGL3 с люциферазным репортером. Люциферазные репортеры генерировали путем вставки полной кодирующей последовательности PABPN1 дикого типа или кодон-оптимизированной (wtPABPN1 или optPABPN1) в контрольный вектор pGL3 (Promega, Мэдисон, Висконсин). Вставки субклонировали в 3'-НТО репортерного гена люциферазы с использованием сайтов рестриктазы FseI и XbaI. Конструкты, содержащие нацеленные на PABPN1 последовательности кшмиР (перечисленные в Таблице 3), управляемые промотором pol III U6, были синтезированы в DNA2.0 (Ньюарк, Калифорния) и субклонированы в остов плазмиды псайленсер.

Клеточная линия HEK293 была приобретена у ATCC (Манассас, Вирджиния). Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глютамина, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) вj влажном инкубаторе при 37°С с 5% СО2. Вкратце, клетки HEK293 высевали с плотностью 2×10⁴ клеток на лунку в 96-луночный культуральный планшет за один день до трансфекции.

Конструкты, экспрессирующие кшмиР PABPN1, и их соответствующие антисмысловые или смысловые люциферазные репортерные и контрольные репортерные конструкты Renilla были совместно трансфицированы в клетки HEK293 с использованием Fugene 6 (Promega, Мэдисон, Висконсин) в соответствии с инструкциями производителя. Для каждой лунки трансфекции 100 нг одной из кшмиР PABPN1, 10 нг соответствующего люциферазного репортерного конструкта и 1 нг контрольного репортерного конструкта Renilla (который служит в качестве контроля трансфекции) совместно трансфицировали с использованием 0,3 мкл Fugene 6. Через 48 часов после трансфекции клеточные лизаты собирали и анализировали с использованием системы анализа репортерного гена двойной люциферазы (Promega, Мэдисон, Висконсин). Соотношения активности светлячка/Renilla определяли для каждой лунки, а эффективность ингибирования кшмиР рассчитывали путем нормализации к ненацеливающей киРНК, контролю пСайленсер (Thermo Fisher, США). Процент ингибирования репортерных конструктов wtPABPN1 или optPABPN1 в клетках HEK293 для смысловой и антисмысловой цепей каждого из кшмиР относительно контроля пСайленсер продемонстрирован на Фиг. 2 и 3.

Как видно на Фиг. 2 и 3, все, кроме одного из иллюстративных кшмиР (кшмиР11), обозначенных в Таблице 2, снижают уровень люциферазы, экспрессируемой из репортерного вектора люциферазы wtPABPN1 (Фиг. 2), но не снижают экспрессию из репортера coPABPBN1 (Фиг. 3). В частности, было показано, что кшмиР-3, кшмиР-4, кшмиР-13, кшмиР-14, кшмиР-16 и кшмиР-17 обладают сильной ингибирующей активностью (определяемой как ингибирование активности люциферазы более чем на 70% по сравнению с клетками, обработанными неродственной кшРНК в качестве отрицательного контроля) против целевых последовательностей мРНК PABPN1, в то же время обладая слабой активностью (ингибирование менее 35%) против их когнатных репортеров, содержащих целевую последовательность, распознаваемую сопровождающей цепью.

Пример 3 - In vitro снижение уровня синтеза белка PABPN1

На основании снижения уровня экспрессии PABPN1, измеренного с помощью анализа активности люциферазы, описанного выше, кшмиР 2, 3, 5, 9, 13, 14, 16 и 17 были отобраны для дальнейшего анализа. Чтобы исследовать их способность снижать уровень PABPN1 in vitro, использовали кшмиР-содержащие плазмиды, управляемые промотором U6, описанным в примере 2, вместе с двумя дополнительными плазмидами экспрессии. Одна кодирует FLAG-меченный человеческий wtPABPN1 (wt-дикого типа) (wt-PABPN1-FLAG; SEQ ID NO: 75), а другая содержит кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую человеческий PABPN1 с FLAG-меткой (co-PABPN1-FLAG; SEQ ID NO: 76).

Клетки

Человеческие эмбриональные клетки почек (HEK293T, ATCC, Манассас, США) выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 20 мМ HEPES, 2 мМ глютамина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1X Penstrep.

Обработка

Вкратце, клетки HEK293T высевали в количестве 1×10⁶ клеток/лунка и трансфицировали на следующие сутки одной из кшмиР-плазмид, описанных выше (300 нг/лунка), с плазмидами, экспрессирующими человеческий PABPN1 дикого типа (wt-PABPN1-FLAG) (100 нг/лунка) (SEQ ID NO: 75) или кодон-оптимизированный PABPN1 (co-PABPN1-FLAG) (100 нг/лунка) (SEQ ID NO: 76), или без них. В качестве контроля клетки HEK293T трансфицировали контрольной плазмидой пСайленсер, экспрессирующей ненацеливающую последовательность киРНК (Thermo Fisher, США). Клетки HEK293T инкубировали при 37°C в полной среде DMEM в течение 72 часов, после чего клетки собирали и лизаты клеток анализировали при помощи вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг

Клеточные лизаты готовили путем инкубации клеток в буфере RIPA, содержащем: 0,15 М NaCl, 0,1% ДСН, 50 мМ Трис (рН 8), 2 мМ ЭДТА и 10% Тритон-Х-100 со смесью ингибиторов протеаз (Complete, Roche Diagnostics).

Белки разделяли на 4-12% геле Bis-Tris (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием системы для сухого блоттинга iBlot 2 (Life Technologies). Блоты блокировали и исследовали с использованием первичных и вторичных антител с применением системы для вестерн-блоттинга iBind Western System (Invitrogen). Первичные антитела (анти-flag (GenScript) и анти-Hsp90 (Sigma)) использовали в разведении 1: 500, тогда как вторичные АР-конъюгированные антитела (AP-щелочная фосфатаза) (анти-мышиное и анти-кроличье, Sigma) использовали в разведении 1: 6000. Полосы были обнаружены с использованием красителя DDAO и визуализированы с использованием сканера FLA-3000 (Fuji).

Полученные блоты и количественное определение процента ингибирования экспрессии PABPN1 относительно контроля с использованием ImageJ продемонстрированы на Фиг. 4 и 5. Как видно из Фиг. 4, все выбранные кшмиР из Примера 3 снижали экспрессию PABPN1 дикого типа с процентом ингибирования >90%, а 7 из 8 протестированных кшмиР ингибировали экспрессию белка PABPN1 дикого типа на уровнях >95%. Напротив, кшмиР не ингибируют экспрессию кодон-оптимизированного конструкта PABPN1 (Фиг. 5).

Пример 4 - кшмиР-нацеленный сайленсинг гена PABPN1 в клетках HEK293T

Данный пример демонстрирует способность плазмид PABPN1 кшмиР подавлять эндогенную экспрессию PABPN1 in vitro.

Клетки

Обработка

Вкратце, клетки HEK293T высевали в количестве 1×10⁶ клеток/лунка и трансфицировали на следующие сутки одной из кшмиР-плазмид, описанных в Примере 2 (300 нг/лунка). В качестве контроля клетки HEK293T трансфицировали плазмидой пСайленсер, экспрессирующей ненацеливающую последовательность киРНК (Thermo Fisher, США). Клетки HEK293T инкубировали при 37°С в полной среде DMEM в течение 72 часов, после чего клетки собирали и экстрагировали РНК, обратно транскрибировали и анализировали с помощью количественной ПЦР.

Анализ методом количественной ПЦР

Анализ методом количественной ПЦР проводили на образцах экстрагированной РНК для количественного определения уровня ингибирования PABPN1 на уровне мРНК с помощью кшмиР, описанных выше.

Чтобы дифференцировать кодон-оптимизированный PABPN1 от PABPN1 дикого типа, были разработаны праймеры и зонды TaqMan для специфической амплификации PABPN1 дикого типа или кодон-оптимизированного PABPN1. Праймеры были разработаны с использованием инструмента для конструирования праймеров TaqMan GenScript (https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)

Полученные последовательности праймеров, использованных для количественной ОТ-ПЦР, являются следующими:

wtPABPN1-Fwd 5'-ATGGTGCAACAGCAGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 77)

wtPABPN1-Rev 5'-CTTTGGGATGGCCACTAAAT-3' (SEQ ID NO: 78)

wtPABPN1-Probe 5'-CGGTTGACTGAACCACAGCCATG-3' (SEQ ID NO: 79)

optPABPN1-Fwd 5'-ACCGACAGAGGCTTCCCTA-3' (SEQ ID NO: 80)

optPABPN1-Rev 5'-TTCTGCTGCTGTTGTAGTTGG-3' (SEQ ID NO: 81)

optPABPN1-Probe 5'-TGGTCCGGGCTCTGTACCTAGCC-3' (SEQ ID NO: 82)

Общую РНК выделяли из клеточных лизатов с использованием тризола (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы РНК определяли количественно с использованием спектрофотометра ND-1000 NanoDrop (NanoDrop Technologies). РНК (100 нг) обратно транскрибировали с использованием обратной транскриптазы Multiscribe (ABI) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК использовали для количественной ПЦР с использованием Taqman мастер-микса для количественной ПЦР в общем объеме реакционной смеси 10 мкл. Реакцию ПЦР проводили следующим образом: 2 минуты при 50°C, 10 минут при 95°C с последующими 40 циклами: 15 секунд при 95°С, 1 минута при 60°С.

Уровень экспрессии каждой мРНК был нормализован к GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназа). Уровни экспрессии рассчитывали по общему количеству копий, как определено по стандартной кривой, и переводили в процент ингибирования относительно контроля пСайленсер.

Итоговый процент ингибирования экспрессии PABPN1 дикого типа в клетках HEK293 с помощью представленных в качестве примера кшмиР представлен на Фиг. 6. Как показано на Фиг. 6, кшмиР снижали уровень экспрессии PABPN1 с процентом ингибирования в диапазоне от 16,4% до 49,1% (в среднем 35,5%).

Пример 5 - кшмиР-нацеленный сайленсинг гена PABPN1 в мышечных клетках мыши C2C12 и клетках сетчатки человека ARPE-19

Чтобы определить, был ли низкий процент ингибирования иллюстративными кшмиР по экспрессии PABPN1 в клетках HEK293, измеренной с помощью количественной ПЦР, из-за изменчивости клеточной линии в экспрессии гена PABPN1, для анализа были выбраны дополнительные клеточные линии, которые относятся к ОФМД, а именно мышечные клетки мыши C2C12 и клетки сетчатки человека ARPE-19.

Клетки

Мышечные клетки мыши C2C12 выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 20 мМ HEPES, 2 мМ глютамина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1X Penstrep.

Клетки сетчатки человека ARPE-19 выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла /питательной смеси Хэма F-12 (DMEM/F12), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1X Penstrep.

Обработка

Вкратце, 2×10⁵ клеток C2C12 подвергали электропорации с использованием системы для электропорации Neon (импульсное напряжение: 1650, длительность импульса: 10, количество импульсов: 3). Анализировали как отдельные кшмиР, так и комбинации двух кшмиР, описанных выше (2 мкг/лунка). В качестве контроля клетки C2C12 подвергали электропорации с плазмидой пСайленсер, экспрессирующей ненацеливающую последовательность киРНК (Thermo Fisher, США). Клетки C2C12 инкубировали при 37°С в полной среде DMEM в течение 24 часов, после чего добавляли 50 мкг/мл гигромицина для замедления роста нетрансфицированных клеток с последующим добавлением еще 100 мкг/мл через 48 часов после электропорации. Через 72 часа клетки собирали и общую РНК экстрагировали для количественной ПЦР.

5×10⁶ клеток ARPE-19 подвергали электропорации с помощью системы для электропорации Neon, используя следующие условия: Импульсное напряжение: 1350, Длительность импульса: 20, Количество импульсов: 2. Клетки обрабатывали, как указано выше, для клеток C2C12, за исключением того, что 50 мкг/мл гигромицина добавляли через 24 часа без дополнительных добавок. Клетки ARPE-19 собирали через 48 и 72 часа для выделения РНК и анализа методом количественной ПЦР.

Анализ методом количественной ПЦР

Количественную ПЦР с обратной транскриптазой проводили, как описано для клеток HEK293 из Примера 4, с праймерами и зондами wtPABPN1, используемыми для измерения экспрессии эндогенного PABPN1 в ответ на ингибирование с помощью кшмиР, выбранных в Примере 3. Количественную ПЦР проводили трижды для кшмиР 3, 13 , 14, 17 и в двух экземплярах для кшмиР 2, 5, 9, 16 в клетках C2C12. В двух временных точках (48 и 72 часа) для клеток ARPE-19 использовали одно измерение.

Как показано на Фиг. 7 все отдельные кшмиР, за исключением кшмиР 16 (процент ингибирования ~43%), подавляли экспрессию PABPN1 в клетках C2C12 со средним процентом ингибирования приблизительно 80% по сравнению с контролем пСайленсер.

Наиболее эффективные кшмиР, измеренные в процентах ингибирования PABPN1, были отобраны для анализа их способности ингибировать экспрессию PABPN1 в комбинации. Комбинации кшмиР 13/17 и кшмиР 3/14 совместно электропорировали в клетки, и экспрессию PABPN1 измеряли с помощью количественной ПЦР, как описано выше для отдельных кшмиР.

На Фиг. 8 показано влияние этих комбинаций кшмиР на экспрессию PABPN1 в клетках C2C12. Совместная трансфекция кшмиР 13/17 привела к проценту ингибирования экспрессии PABPN1 равному 84,4% по сравнению с 92,5% и 76,7% для отдельных кшмиР 13 и 17, соответственно. Совместная трансфекция кшмиР 3/14 привела к ингибированию в 79,0% по сравнению с 76,2% и 80,4% для отдельных кшмиР 3 и 14, соответственно.

Те же комбинации кшмиР, что и выше, были протестированы на их способность ингибировать экспрессию PABPN1 в клеточной линии человека, а именно в клетках ARPE-19. Клетки обрабатывали, как описано выше, и итоговое ингибирование экспрессии PABPN1, измеренное с помощью количественной ПЦР через 48 и 72 часа, показано на Фиг. 9. После 72 часов совместная трансфекция кшмиР 13/17 привела к проценту ингибирования экспрессии PABPN1 равному 87,9% по сравнению с 83,9% и 89,8% для отдельных кшмиР 13 и 17, соответственно. Совместная трансфекция кшмиР 3/14 привела к ингибированию в 87,4% по сравнению с 82,2% и 81,6% для отдельных кшмиР 3 и 14. В среднем процент ингибирования экспрессии PABPN1 увеличился в 1,14 раза между 48 и 72 часами в клетках ARPE-19.

Пример 6 - Измерение экспрессии кшмиР с помощью количественной ПЦР

Для определения общего количества кшмиР, экспрессируемых в клетках C2C12, трансфицированных наилучшими кшмиР, как описано выше, был разработан анализ miScript.

Продукцию кшмиР 3, 13, 14 и 17 конструктами экспрессии U6 кшмиР измеряли с использованием ПЦР-системы Qiagen miScript PCR (Валенсия, Калифорния). Для каждого анализа методом количественной ПЦР с обратной транскриптазой 50 нг общей РНК превращали в кДНК с использованием набора Qiagen miScript II RT. Затем проводили количественную ПЦР кшРНК с использованием набора Qiagen miScript SYBR green PCR со специально созданными прямыми праймерами, приведенными ниже:

кшмиР3-FWD 5'-TTCATCTGCTTCTCTACCTCG-3' (SEQ ID NO: 83)

кшмиР13-FWD 5'-AGGGGAATACCATGATGTCGC-3' (SEQ ID NO: 84)

кшмиР14-FWD 5'-CTCATATTCATCTGCTTCTCT-3' (SEQ ID NO: 85)

кшмиР17-FWD 5'-ATTCATCTGCTTCTCTACCTC-3' (SEQ ID NO: 86)

Обратные праймеры были обеспечены в наборе Qiagen miScript SYBR green PCR. Использовали следующие условия ПЦР в реальном времени: начальная денатурация при 95°С в течение 15 минут с последующими 40 циклами при 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 30 с и 70°С в течение 30 с.

Стандартные кривые для этих анализов были получены путем амплификации известных количеств выбранных кшмиР и представлены на Фиг. 10. кшмиР3 (Фиг. 10B) давала нелинейную стандартную кривую и изменялась в зависимости от используемого буфера для количественной ПЦР.

Количество копий РНК на клетку рассчитывали на основе оценки 10 нг общей РНК в 333 клетках C2C12. Копии кшмиР на клетку определяли для каждой из кшмиР3, кшмиР13, кшмиР14 и кшмиР17 при экспрессии по отдельности. Как показано на Фиг. 11, уровни экспрессии отдельных кшРНК в клетках C2C12, трансдуцированных кшмиР-векторами, оцениваются в 51663, 13826, 11576 и 14791 копий на клетку для кшмиР 3, 13, 14 и 17, соответственно.

Пример 7 - Генерация векторов для одновременного сайленсинга гена эндогенного PABPN1 и замены кодон-оптимизированным PABPN1.

Для того чтобы направить одновременный сайленсинг гена эндогенного PABN1 дикого типа (wtPABN1) и замену кодон-оптимизированной PABPN1 (coPABN1), создавали плазмиду на основе одноцепочечного аденоассоциированного вируса 2-ого типа (ssAAV2), экспрессирующую одну или более выбранных кшмиР в комбинации с последовательностью optPABPN1. Две альтернативные конструкты представлены на Фиг. 12А и 12В.

Первый конструкт версии 2 (Фиг. 12А) получают путем субклонирования двух кшмиР, нацеленных на wtPABPN1, в 3'-нетранслируемую область транскрипта optPABPN1 в остове вектора на основе pAAV2. Экспрессия как optPABPN1, так и двух кшмиР в одном транскрипте управляется мышечно-специфическим промотором Spc512. Второй конструкт версит 1 (Фиг. 12B) получают путем субклонирования двух кшмиР, нацеленных на wtPABPN1, в последовательность в прямом направлении от транскрипта optPABPN1. В данном конструкте экспрессируются два транскрипта: первый кодирует два кшмиР под контролем промотора CK8, а второй кодирует optPABPN1 под контролем промотора Spc512.

Генерируются группы рекомбинантных векторов на основе псевдотипированного AAV. Вкратце, клетки HEK293T культивируют в клеточных фабриках в модифицированной Дульбекко среде Игла, дополненной 10% FBS, и инкубируют при 37°C и 5% CO2. В соответствии с инструкциями производителя получают комплексы вирусных плазмид pAAV-кшмиР, как описано в данном примере, и плазмиды pAAVhelper и pAAVrepcap8 или плазмиды pAAVhelper и pAAV repcap9 с фосфатом кальция. Затем проводят тройную трансфекцию клеток HEK293T с каждой из плазмид pAAV-кшмиР в комбинации с pAAVhelper и pAAVrepcap8 или pAAVrepcap9. Клетки HEK293T культивируют в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2, после чего клетки лизируют и частицы, экспрессирующие кшмиР ssAAV, для каждой из вирусных плазмид очищают при помощи ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте йодиксанола (Sigma-Aldrich) с последующим ультрацентрифугированием в градиенте хлорида цезия. Количество векторных геномов определяли количественно с помощью количественной полимеразной цепной реакции (Q-PCR).

Пример 8 - Исследования эффективности in vivo в мышиной модели ОФМД.

Животные

Доклинические исследования эффективности проводились на самой распространенной мышиной модели ОФМД, мышиной модели A17. Эту мышиную модель получали в фоне FvB путем сверхэкспрессии бычьего увеличенного (17 аланиновых остатков) PABPN1. Экспрессия этого мутантного PABPN1 в скелетных мышцах находилась под контролем мышечно-специфического промотора альфа-актина человека (HSA1). Оба эндогенных аллеля мышиной PABPN1 являются функциональными и экспрессируют нормальный мышиный PABPN1. Следовательно, фенотип мыши был обусловлен сверхэкспрессией мутантного PABPN1 по сравнению с нормальным белком. Что наиболее важно, мыши A17 демонстрируют многие клинические признаки ОФМД, включая наличие внутриядерных включений (INI), фиброз и утрату мышечной силы. Исследования эффективности in vivo в отношении мышей были сосредоточены на дозировании и анализе мышц передней большеберцовой кости (TA), среди самых больших мышц, которыми можно легко манипулировать и/или иссекать у мышей, что облегчает наблюдение за фенотипическими улучшениями.

Обработка

Капсид аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9) был выбран для введения рекомбинантных конструктов экспрессии посредством локальной внутримышечной инъекции. В дополнение к AAV9 был протестирован ряд капсидов различных серотипов AAV, включая AAV8, AAVRh74. Мышечную трансдукцию оценивали с использованием конструкта рекомбинантного AAV9, который экспрессировал флуоресцентный белок GFP под контролем синтетического мышечного промотора Spc512 (AAV9-eGFP). Мышам обоих полов инъецировали в каждую мышцу TA 50 мкл одноцепочечного вектора в дозе 2e11 общих векторных геномов. Через двадцать суток мышей умерщвляли и инъецированные конечности исследовали с помощью визуализации in vivo.

Результаты

Как показано на Фиг. 13, прямая инъекция в мышцу TA конструкта AAV9-eGFP приводила к значительному количеству локальной флуоресценции, обнаруживаемой в конечности, что указывает на то, что оба вектора эффективны для трансдукции мышечных клеток и приводят к экспрессии трансгена после прямой инъекции.

Пример 9 - Генерация единого «конструкта для сайленсинга и замены» для одновременного сайленсинга гена эндогенного PABPN1 и замены кодон-оптимизированным PABPN1.

Создана плазмида на основе одноцепочечного аденоассоциированного вируса типа 2 (ssAAV2), экспрессирующая кшмиР17 и кшмиР13 (например, как описано в Таблицах 3 и 4) в комбинации с последовательностью optPABPN1.

Конструкт для сайленсинга и замены (далее «SR-конструкт») генерировали путем субклонирования последовательностей ДНК, кодирующих кшмиР17 и кшмиР13 (как описано в Таблице 4), в 3'-нетранслируемую область транскрипта optPABPN1 в остов вектора на основе pAAV2 (вирусная плазмида pAAV-кшмиР). Экспрессия как optPABPN1, так и двух кшмиР в одном транскрипте управляется мышечно-специфическим промотором Spc512. Схематическое изображение SR-конструкта представлено на Фиг. 14.

Были созданы группы рекомбинантных векторов на основе псевдотипированного AAV. Вкратце, клетки HEK293T культивировали в клеточных фабриках в модифицированной Дульбекко среде Игла, дополненной 10% FBS, и инкубировали при 37°C и 5% CO2. В соответствии с инструкциями производителя получали комплексы вирусной плазмиды pAAV-кшмиР и плазмиды pAAVhelper и pAAVrepcap8, или плазмиды pAAVhelper и pAAV repcap9 или pAAVhelper и pAAVRH74 с фосфатом кальция. Затем проводили тройную трансфекцию клеток HEK293T с плазмидой pAAV-кшмиР в комбинации с pAAVhelper и одним из следующих капсидов; pAAVrepcap8, pAAVrepcap9 или pAAVRH74. Затем клетки HEK293T культивировали в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2, после чего клетки лизировали и частицы, экспрессирующие кшмиР ssAAV, очищали при помощи ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте йодиксанола (Sigma-Aldrich) с последующим ультрацентрифугированием в градиенте хлорида цезия. Количество векторных геномов определяли количественно с помощью количественной полимеразной цепной реакции (Q-PCR).

Пример 10 - Исследования эффективности in vivo с использованием подхода с одиночным вектором для «сайленсинга и замены».

Обработка

Чтобы протестировать in vivo эффективность SR-конструкта, описанного в Примере 9, на соответствующей модели заболевания ОФМД, SR-конструкт вводили по отдельности, в высокой и низкой дозе, посредством внутримышечной инъекции в мышцу TA 10-12-недельных мышей A17. Низкая доза была установлена на уровне 1×10¹⁰ векторных геномов на мышцу. Высокая доза была установлена на уровне 6×10¹⁰ векторных геномов на мышцу. Мыши A17 соответствующего возраста, которым инъецировали физиологический раствор, служили в качестве не получавшей лечение группы, тогда как мышей FVB дикого типа также включали в качестве группы сравнения из здоровых мышей. В дополнение к изучению влияния различных доз SR-конструкта на заболевание, отдельные когорты мышей умерщвляли через 14 или 20 недель после лечения для оценки эффективности, связанной с различными временными точками. При умерщвлении мышцы TA отбирали и экстрагировали РНК и белки.

Анализ методом количественной ПЦР

Для подтверждения снижения уровней PABPN1, РНК, выделенную из мышц TA, оценивали при помощи анализа методом количественной ПЦР. Используемые праймеры для количественной ПЦР не могли различить транскрипты PABPN1 дикого типа и мутантного PABPN1, но не распознавали и не амплифицировали последовательности, соответствующие кодон-оптимизированным типам PABPN1. Устойчивый нокдаун наблюдали при использовании SR-конструкта как в высоких, так и в низких дозах, что приводило к снижению уровней транскриптов PABPN1 на 88,3% и 68,3%, соответственно (Фиг. 15). Дополнительные анализы из этих тканей продемонстрировали присутствие трансгенов кшмиР в соотношениях, соответствующих различным уровням вводимых векторов.

Аналогичным образом, анализ методом количественной ПЦР с использованием набора праймеров, которые могут селективно амплифицировать кодон-оптимизированные последовательности PABPN1 и различать нормальные последовательности дикого типа и мутантные последовательности PABPN1, использовали для проверки экспрессии фрагмента кодон-оптимизированного PABPN1.

Эти анализы методом количественной ПЦР показали, что у животных, которым вводили SR-конструкт, экспрессирующий уровни кодон-оптимизированного PABPN1, которые в среднем составляли 90,9% и 13,7% от нормальных уровней PABPN1 у мышей FvB при высокой и низкой дозах, соответственно (Фиг. 16).

В совокупности анализы подтверждают, что один транскрипт может продуцировать функциональные кшмиР, которые способны снижать уровни PABPN1, включая мутантную форму, в мышиной модели A17. Аналогичным образом, эти векторы одновременно продуцируют достаточные уровни кодон-оптимизированного PABPN1 в качестве замены для восстановления функции PABPN1.

Внутриядерные включения (INI)

Влияние SR-конструкта на сохранение внутриядерных включений (INI) было проверено на животных через 14 недель. Как видно из Фиг. 17, почти 35% всех мышечных клеток TA у мышей A17 демонстрировали зеленое точечное окрашивание, представляющее собой INI. Контрастные красители красный ламинин (белок, распространенный во внеклеточном матриксе мышечных клеток) и голубой DAPI были использованы для определения формы клеток и ядер, соответственно (Фиг. 18). Методом ряда серийных срезов было продемонстрировано значительное снижение INI при помощи лечения как высокими, так и низкими дозами SR-конструкта.

Мышечная масса

Влияние SR-конструкта на восстановление мышечной массы было также проверено на животных через 20 недель.

Мышечные клетки TA от мышей A17 весят примерно на 25% меньше, чем аналогичные мышцы от мышей FvB дикого типа. При обеих испытанных дозах SR-конструкт продемонтрировал значительное восстановление мышечной массы до уровней, близких для животных FVB дикого типа (Фиг. 19).

Мышечная сила

Наконец, влияние SR-конструкт на восстановление мышечной силы у животных на 20 неделе оценивали путем измерения максимальной силы.

Используя частоту 150 мГц в качестве калибровочной точки, максимальная сила у мышей A17 была примерно на 30% меньше, чем у мышей FvB дикого типа при 1050 нм против 1500 нм, соответственно. Лечение SR-конструктом приводило к умеренному увеличению максимальной силы, восстанавливая примерно 66% разницы в уменьшенной силе, отмеченной у мышей A17 по сравнению с животными FVB дикого типа (Фиг. 20). Статистические данные на Фиг. 20 представлены в виде непарного t-критерия Стьюдента относительно мышей A17, получавших физиологический раствор (*p <0,05, **p <0,01).

В совокупности данные, представленные в данном документе из этого исследования in vivo, демонстрируют, что лечение SR-конструктами оказывает влияние на дифференциальный физиологический признак заболевания ОФМД в модельной системе A17.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в вышеописанные варианты осуществления могут быть внесены многочисленные изменения и/или модификации без выхода за рамки общего объема данного раскрытия. Следовательно, данные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Benitec Biopharma Limited

<120> Реагенты для лечения окулофарингеальной мышечной дистрофии

(ОФМД) и их применение

<130> 180511

<150> US 62/434312

<151> 2016-12-14

<160> 86

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

gagaagcaga ugaauaugag uccaccuc 28

<210> 2

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

gaacgaggua gagaagcaga ugaauaug 28

<210> 3

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

gaagcugaga agcuaaagga gcuacaga 28

<210> 4

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

gggcuagagc gacaucaugg uauucccc 28

<210> 5

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

cugugugaca aauuuagugg ccauccca 28

<210> 6

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

gacuauggug caacagcaga agagcugg 28

<210> 7

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 7

cgagguagag aagcagauga auaugagu 28

<210> 8

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

cagugguuuu aacagcaggc cccggggu 28

<210> 9

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 9

agagcgacau caugguauuc cccuuacu 28

<210> 10

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

gguagagaag cagaugaaua ugagucca 28

<210> 11

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 11

auugaggaga agauggaggc ugaugccc 28

<210> 12

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 12

ggaggaagaa gcugagaagc uaaaggag 28

<210> 13

<211> 28

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 13

aacgagguag agaagcagau gaauauga 28

<210> 14

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR2

<400> 14

agcagaugaa uaugagucca 20

<210> 15

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR2

<400> 15

uggacucaua uucaucugcu u 21

<210> 16

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR3

<400> 16

gagguagaga agcagaugaa 20

<210> 17

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR3

<400> 17

uucaucugcu ucucuaccuc g 21

<210> 18

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR4

<400> 18

cugagaagcu aaaggagcua 20

<210> 19

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR4

<400> 19

uagcuccuuu agcuucucag c 21

<210> 20

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR5

<400> 20

uagagcgaca ucaugguauu 20

<210> 21

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR5

<400> 21

aauaccauga ugucgcucua g 21

<210> 22

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR6

<400> 22

gugacaaauu uaguggccau 20

<210> 23

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR6

<400> 23

auggccacua aauuugucac a 21

<210> 24

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR7

<400> 24

auggugcaac agcagaagag 20

<210> 25

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR7

<400> 25

cucuucugcu guugcaccau a 21

<210> 26

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR9

<400> 26

guagagaagc agaugaauau 20

<210> 27

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR9

<400> 27

auauucaucu gcuucucuac c 21

<210> 28

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR11

<400> 28

gguuuuaaca gcaggccccg 20

<210> 29

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR11

<400> 29

cggggccugc uguuaaaacc a 21

<210> 30

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR13

<400> 30

cgacaucaug guauuccccu 20

<210> 31

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR13

<400> 31

aggggaauac caugaugucg c 21

<210> 32

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR14

<400> 32

gagaagcaga ugaauaugag 20

<210> 33

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR14

<400> 33

cucauauuca ucugcuucuc u 21

<210> 34

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR15

<400> 34

aggagaagau ggaggcugau 20

<210> 35

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR15

<400> 35

aucagccucc aucuucuccu c 21

<210> 36

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR16

<400> 36

gaagaagcug agaagcuaaa 20

<210> 37

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR16

<400> 37

uuuagcuucu cagcuucuuc c 21

<210> 38

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная последовательность для shmiR17

<400> 38

agguagagaa gcagaugaau 20

<210> 39

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эффекторная комплементарная последовательность для shmiR17

<400> 39

auucaucugc uucucuaccu c 21

<210> 40

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> стебель-петля

<400> 40

acugugaagc agaugggu 18

<210> 41

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5'-фланкирующая последовательность остова pri-miРНК

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n представляет собой u или a

<400> 41

gguauauugc uguugacagu gagcgn 26

<210> 42

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3'-фланкирующая последовательность остова pri-miРНК

<400> 42

cgccuacugc cucggacuuc aa 22

<210> 43

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR2

<400> 43

gguauauugc uguugacagu gagcguagca gaugaauaug aguccaacug ugaagcagau 60

ggguuggacu cauauucauc ugcuucgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 44

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR3

<400> 44

gguauauugc uguugacagu gagcgagagg uagagaagca gaugaaacug ugaagcagau 60

ggguuucauc ugcuucucua ccucgcgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 45

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR4

<400> 45

gguauauugc uguugacagu gagcgacuga gaagcuaaag gagcuaacug ugaagcagau 60

ggguuagcuc cuuuagcuuc ucagccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 46

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR5

<400> 46

gguauauugc uguugacagu gagcgauaga gcgacaucau gguauuacug ugaagcagau 60

ggguaauacc augaugucgc ucuagcgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 47

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR6

<400> 47

gguauauugc uguugacagu gagcgaguga caaauuuagu ggccauacug ugaagcagau 60

ggguauggcc acuaaauuug ucacacgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 48

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR7

<400> 48

gguauauugc uguugacagu gagcgaaugg ugcaacagca gaagagacug ugaagcagau 60

gggucucuuc ugcuguugca ccauacgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 49

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR9

<400> 49

gguauauugc uguugacagu gagcgaguag agaagcagau gaauauacug ugaagcagau 60

ggguauauuc aucugcuucu cuacccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 50

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR11

<400> 50

gguauauugc uguugacagu gagcgagguu uuaacagcag gccccgacug ugaagcagau 60

gggucggggc cugcuguuaa aaccacgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 51

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR13

<400> 51

gguauauugc uguugacagu gagcgacgac aucaugguau uccccuacug ugaagcagau 60

ggguagggga auaccaugau gucgccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 52

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR14

<400> 52

gguauauugc uguugacagu gagcgugaga agcagaugaa uaugagacug ugaagcagau 60

gggucucaua uucaucugcu ucucucgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 53

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR15

<400> 53

gguauauugc uguugacagu gagcgaagga gaagauggag gcugauacug ugaagcagau 60

ggguaucagc cuccaucuuc uccuccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 54

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR16

<400> 54

gguauauugc uguugacagu gagcgagaag aagcugagaa gcuaaaacug ugaagcagau 60

ggguuuuagc uucucagcuu cuucccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 55

<211> 107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность РНК, кодирующая shmiR17

<400> 55

gguauauugc uguugacagu gagcgaaggu agagaagcag augaauacug ugaagcagau 60

ggguauucau cugcuucucu accuccgccu acugccucgg acuucaa 107

<210> 56

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR2

<400> 56

ggtatattgc tgttgacagt gagcgtagca gatgaatatg agtccaactg tgaagcagat 60

gggttggact catattcatc tgcttcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 57

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR3

<400> 57

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagagg tagagaagca gatgaaactg tgaagcagat 60

gggtttcatc tgcttctcta cctcgcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 58

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR4

<400> 58

ggtatattgc tgttgacagt gagcgactga gaagctaaag gagctaactg tgaagcagat 60

gggttagctc ctttagcttc tcagccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 59

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR5

<400> 59

ggtatattgc tgttgacagt gagcgataga gcgacatcat ggtattactg tgaagcagat 60

gggtaatacc atgatgtcgc tctagcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 60

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR6

<400> 60

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtga caaatttagt ggccatactg tgaagcagat 60

gggtatggcc actaaatttg tcacacgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 61

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR7

<400> 61

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaatgg tgcaacagca gaagagactg tgaagcagat 60

gggtctcttc tgctgttgca ccatacgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 62

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR9

<400> 62

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtag agaagcagat gaatatactg tgaagcagat 60

gggtatattc atctgcttct ctacccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 63

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR11

<400> 63

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaggtt ttaacagcag gccccgactg tgaagcagat 60

gggtcggggc ctgctgttaa aaccacgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 64

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR13

<400> 64

ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgac atcatggtat tcccctactg tgaagcagat 60

gggtagggga ataccatgat gtcgccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 65

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR14

<400> 65

ggtatattgc tgttgacagt gagcgtgaga agcagatgaa tatgagactg tgaagcagat 60

gggtctcata ttcatctgct tctctcgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 66

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR15

<400> 66

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaagga gaagatggag gctgatactg tgaagcagat 60

gggtatcagc ctccatcttc tcctccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 67

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR16

<400> 67

ggtatattgc tgttgacagt gagcgagaag aagctgagaa gctaaaactg tgaagcagat 60

gggttttagc ttctcagctt cttcccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 68

<211> 107

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК, кодирующая shmiR17

<400> 68

ggtatattgc tgttgacagt gagcgaaggt agagaagcag atgaatactg tgaagcagat 60

gggtattcat ctgcttctct acctccgcct actgcctcgg acttcaa 107

<210> 69

<211> 2532

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Двойной конструкт версии 1, кодирующий shmiR3, shmiR14

и кодон-оптимизированный PABPN1

<400> 69

cgatcgcgcg cagatctgtc atgatgatcc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc 60

ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 120

ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct 180

gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 240

ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 300

ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 360

ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420

cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480

cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540

tgctgttgac agtgagcgag aggtagagaa gcagatgaaa ctgtgaagca gatgggtttc 600

atctgcttct ctacctcgcg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660

ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720

agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgtg agaagcagat 780

gaatatgaga ctgtgaagca gatgggtctc atattcatct gcttctctcg cctactgcct 840

cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900

gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960

tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020

tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080

ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140

gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200

tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260

gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320

catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380

ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440

tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500

gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560

ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620

agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680

agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740

gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800

catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860

ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920

ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980

cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040

gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100

cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160

ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220

ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280

ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520

tgggctctat gg 2532

<210> 70

<211> 2532

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Двойной конструкт версии 1, кодирующий shmiR17, shmiR13

и кодон-оптимизированный PABPN1

<400> 70