Центральные т-клетки памяти для адоптивной т-клеточной терапии

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой популяцию человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, экспрессирующим химерный антигенный рецептор, для лечения глиомы/глиобластомы. Более 50% трансдуцированных клеток в указанной популяции представляют собой центральные Т-клетки памяти, в частности CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra- Т-клетки. Указанную популяцию используют для приготовления фармацевтической композиции для лечения глиомы/глиобластомы. Настоящее изобретение позволяет получить средство для опухолеспецифичной терапии с более долговременным противоопухолевым функционированием. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 табл., 9 пр., 15 ил.

 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В отношении противоопухолевого лечения исследовали иммунотерапии на основе опухолеспецифичных Т-клеток, включая терапии с использованием генетически модифицированных Т-клеток. В некоторых случаях Т-клетки, используемые в таких терапиях, не остаются активными in vivo в течение достаточно длительного периода времени. В некоторых случаях опухолеспецифичность Т-клеток является относительно низкой. Следовательно, в данной области существует потребность в опухолеспецифичных противораковых терапиях с более долговременным противоопухолевым функционированием.

Адоптивная Т-клеточная терапия (ACT) с использованием генетически модифицированных Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR) может обеспечивать безопасный и эффективный способ уменьшения частоты рецидивов MG (злокачественная глиома), так как Т-клетки с CAR могут быть генетически модифицированы для специфичного распознавания антигенно отличных популяций опухолей (Cartellieri et al. 2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304; Ahmed et al. 2010 Clin Cancer Res 16:474; Sampson et al. 2014 Clin Cancer Res 20:972; Brown et al. 2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199; Chow et al. 2013 Mol Ther 21:629), и Т-клетки могут мигрировать через паренхиму мозга к мишени и умерщвлять инфильтрирующие злокачественные клетки (Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Brown et al. 2007 J Immunol 1799: 3332; Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Yaghoubi 2009 Nat Clin PRact Oncol 6:53). Доклинические исследования продемонстрировали то, что Т-клетки CAR+, нацеленные на IL13Rα2, демонстрируют мощную, независимую от главного комплекса гистосовместимости (МНС), IL13Rα2-специфическую цитолитическую активность против как стволоподобных, так и дифференцированных глиомных клеток, и индуцируют регрессию прижившихся глиомных ксенотрансплантатов in vivo (Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64: 9160; Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18: 2199).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны популяции клеток, которые содержат центральные Т-клетки памяти (T_СМ). Данные популяции клеток включают и Т-клетки CD4+, и Т-клетки CD8+. Клетки в данных популяциях клеток являются полезными для экспрессии химерных трансмембранных иммунорецепторов (химерные антигенные рецепторы или «CAR»), которые содержат внеклеточный домен (например, scFv, который связывается с выбранной мишенью), трансмембранную область и внутриклеточный домен сигнализации, например, внутриклеточный домен, который включает домен сигнализации из зета цепи комплекса человеческого CD3 (CD3ζ) и один или более чем один костимулирующий домен, например, костимулирующий домен 4-1ВВ. Внеклеточный домен обеспечивает то, что CAR, при экспрессии на поверхности Т-клетки, направляет активность Т-клетки на те клетки, которые экспрессируют мишень, распознаваемую внеклеточным доменом. Включение костимулирующего домена, такого как костимулирующий домен 4-1BB (CD137), расположенного последовательно с CD3ζ во внутриклеточную область, обеспечивает принятие Т-клеткой костимулирующих сигналов.

Клетки T_СМ, описанные в данном документе, например, специфичные для пациента аутологические или аллогенные клетки T_СМ, могут быть генетически модифицированы для экспрессии желательного CAR, и данные генетически модифицированные клетки можно размножать и использовать в ACT. Популяция клеток T_СМ представляет собой CD45RO+CD62L+ и включает клетки CD4+ и CD8+.

В разных воплощениях популяция человеческих Т-клеток содержит вектор, экспрессирующий химерный антигенный рецептор; популяция человеческих центральных Т-клеток памяти (клетки T_СМ) содержит по меньшей мере 10% клеток CD4+ и по меньшей мере 10% клеток CD8+ (например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки T_СМ; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток T_СМ представляют собой CD4+, и по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток T_СМ представляют собой клетки CD8+).

Также описан способ лечения рака у пациента, включающий введение популяции аутологических или аллогенных человеческих Т-клеток (например, аутологических или аллогенных Т-клеток, включающих клетки Tcm, например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки Tcm; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой CD4+; и по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой клетки CD8+), трансдуцированных вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор.

В данном документе описана популяция человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, экспрессирующим химерный антигеный рецептор, где по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой центральные Т-клетки памяти. В разных воплощениях по меньшей мере 10% трансдуцированных центральных Т-клеток памяти представляют собой CD4+; по меньшей мере 10% трансдуцированных центральных Т-клеток памяти представляют собой CD8+; по меньшей мере 15% центральных Т-клеток памяти представляют собой CD4+, и по меньшей мере 15% представляют собой CD8+; и по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой CD4+/CD8+/CD62L+.

В данном документе также описана популяция человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, экспрессирующим химерный антигенный рецептор, где по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 10% клеток представляют собой CD4+, и по меньшей мере 10% клеток представляют собой CD4+. В разных воплощениях по меньшей мере 10% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+, и по меньшей мере 10% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD8+; и по меньшей мере 15% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+, и по меньшей мере 15% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+.

Также описан способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей описанные в данном документе центральные Т-клетки памяти. Данные Т-клетки могут быть аутологическими по отношению к пациенту или аллогенными по отношению к пациенту.

Также описан способ получения популяции центральных Т-клеток памяти, включающий: получение популяции Т-клеток от субъекта-человека; обеднение популяции Т-клеток клетками, которые экспрессируют CD25, клетками, которые экспрессируют CD14, и клетками, которые экспрессируют CD45+, с получением популяции обедненных Т-клеток; обогащение популяции обедненных Т-клеток клетками, экспрессирующими CD62L, получая, посредством этого, популяцию центральных Т-клеток памяти, где данный способ не включает стадию обеднения популяции клеток клетками, экспрессирующими CD4, и не включает стадию обеднения популяции клеток клетками, экспрессирующими CD8+. В разных воплощениях по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95%) клеток в популяции центральных Т-клеток памяти являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 10% клеток являются CD4+, и по меньшей мере 10% клеток являются CD4+; по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95%) клеток в популяции центральных Т-клеток памяти являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 15% клеток являются CD4+, и по меньшей мере 15% клеток являются CD4+; по меньшей мере 50% клеток в популяции центральных Т-клеток памяти являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, 40% или 50%) клеток являются CD4+, и по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, 40% или 50%) клеток являются CD4+. Данный способ может дополнительно включать стимулирование популяции центральных Т-клеток памяти (например, посредством приведения в контакт данной популяции центральных Т-клеток памяти с CD3 и/или CD28); может включать трансдуцирование данных клеток вектором, экспрессирующим рекомбинантный белок для создания популяции генетически модифицированных центральных Т-клеток памяти; и может включать размножение популяции генетически модифицированных центральных Т-клеток памяти (например, размножение популяции генетически модифицированных центральных Т-клеток памяти посредством подвергания клеток воздействию одного или обоих из IL-2 и IL-15.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение CAR IL13(E13Y)-зетакин (слева), состоящего из варианта человеческого IL-13, специфичного в отношении IL13Rα2 (huIL-13(E13Y)), спейсера на основе Fc человеческого lgG4 (huγ₄Fc), части в виде человеческого трансмембранного CD4 (huCD4 tm) и цитоплазматической части цепи человеческого CD3ζ (huCD3ζ cyt), как указано. Также показан CAR IL13(EQ)BBζ, который является таким же как и IL13(E13Y)-зетакин, за исключением двух точечных мутаций - L235E и N297Q, указанных красным, которые располагаются в домене СН2 спейсера на основе lgG4, и добавления костимулирующего цитоплазматического домена 4-1BB (4-1BB cyt).

На Фиг. 2А-В показаны открытые рамки считывания определенных векторов. А представляет собой диаграмму открытой рамки считывания кДНК из 2670 нуклеотидов конструкции IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t, где показаны последовательности IL13Rα2-специфичного лиганда IL13(E13Y), шарнира Fc lgG4(EQ), трансмембранного CD4, цитоплазматического домена сигнализации 4-1BB, трехглицинового линкера и цитоплазматического домена сигнализации CD3ζ CAR IL13(EQ)BBZ, а также перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19. Также показаны сигнальные последовательности человеческого рецептора альфа GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и CD19, которые управляют поверхностной экспрессией CAR IL13(EQ)BBζ и CD19t. Б представляет собой диаграмму последовательностей, фланкированных длинными концевыми повторами (показанными как «R»), которые будут интегрированы в геном хозяина. В представляет собой карту плазмиды IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.

На Фиг. 3 показана конструкция pHIV7.

На Фиг. 4 показаны элементы pHIV7.

На Фиг. 5 показана схема получения IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM.

На Фиг. 6А-В показаны результаты анализа экспрессии поверхностного трансгена и маркера Т-клеток посредством проточной цитометрии. IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_см HD006.5 и HD187.1 совместно окрашивали антителом против IL13-PE (фикоэритрин) и антителом против CD8-FITC (флуоресцеина изотиоцианат) для выявления клеток CD8+ CAR+ и CD4+ (т.е. CD8-негативных) CAR+(А), или антителом против CD19-PE и антителом против CD4-FITC для выявления клеток CD4+ CD19t+ и CD8+ (т.е. CD4-негативных) CAR+ (Б). IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM HD006.5 и HD187.1 окрашивали антителами против CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L и CD28, конъюгированными с флуорохромом (серые гистограммы) или изотипическими контролями (черные гистограммы) (В). Во всех случаях процентные доли основаны на жизнеспособных лимфоцитах (негативных в отношении DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол)), которые окрашивались сильнее, чем изотипический контроль.

На Фиг. 7А-Б показана функциональная характеризация in vitro эффекторной функции IL13Rα2-специфичного IL13(EQ)BBZ+T_CM. IL13(EQ)BBZ/CD19t+ T_CM. HD006.5 и HD187.1 использовали в качестве эффекторов в 6-часовом анализе высвобождения ⁵¹Cr с использованием соотношения Е:T (эффектор: мишень) 10:1 на основе экспрессии CD19t. IL13Rα2-позитивными опухолями-мишенями были K562, генетически модифицированная для экспрессии IL13Rα2 (K562-IL13Rα2), И линия первичной глиомы РВТ030-2, а IL13Rα2-негативной контрольной опухолью-мишенью была родительская линия K562 (А). IL13(EQ)BBZ/CD19t+ T_CM HD006.5 и HD187.1 оценивали на антигензависимую продукцию цитокинов после совместной культуры в течение ночи при соотношении Е:Т 10:1 с использованием IL13Rα2-позитивных и негативных мишеней. Уровни цитокинов измеряли с использованием набора для анализа Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2, и приводится уровень IFN-γ (Б).

На Фиг. 8А-В показан результат исследований, демонстрирующих регрессию прижившихся ксенотрансплантатов глиомной опухоли после адоптивного переноса IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM. Опухолевые клетки EGFP-ffLuc+РВТ030-2 (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 5 мыши получали либо 2×10⁶ IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM (1,1×10⁶ CAR+; n равно 6), либо 2×10⁶ имитации T_CM (без CAR; n равно 6), либо PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n равно 6). Репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image (А). Количественное измерение потока ffLuc (фотоны/с) показывает то, что IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM индуцирует регрессию опухоли по сравнению с T_CM с имитацией трансдукции и с PBS (# р меньше 0,02; * р меньше 0,001, ANOVA (дисперсионный анализ) с повторными измерениями) (Б). Кривая выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу), демонстрирующая значимо улучшенное выживание (р равно 0,0008; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM (В).

На Фиг. 9А-В показаны результаты исследований, сравнивающих противоопухолевую эффективность клонов IL13(EQ)BBZ T_CM и CTL (цитолитический Т-лимфоцит) IL13-зетакин. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 8 мыши получали либо 1,6×10⁶ имитации трансдукции T_CM (без CAR), либо 1,0×10⁶ CAR+IL13(EQ)BBζ T_CM (всего 1,6×10⁶ Т-клеток; 63% CAR), либо 1,0×10⁶ CTL IL13-зетакин CD8+, клон 2D7 (клональный CAR+), либо не получали обработки (n равно 6 на группу). Репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image (А). Линии линейной регрессии натурального log потока ffLuc (фотоны/с) с течение времени, значения Р приводятся для сравнений взаимодействия групп по времени (Б). Анализ выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу) демонстрирует значимо улучшенное выживание (р равно 0,02; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBζ T_CM по сравнению с CTL IL13-зетакин CD8+, клон 2D7 (В).

На Фиг. 10А-В показаны результаты исследований, сравнивающих противоопухолевую эффективность клонов IL13(EQ)BBζ T_CM и CTL IL13-зетакин. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 8 мыши получали либо 1,3×10⁶ T_CM с имитацией трансдукции (без CAR; n равно 6), либо 1,0, 0,3 или 0,1×10⁶ CAR+IL13(EQ)BBζ T_CM (78% CAR+; n равно 6-7), либо 1,0, 0,3 или 0,1×10⁶ клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ (клональный CAR+; n равно 6-7), либо не получали обработки (n равно 5). Xenogen Imaging репрезентативных мышей из каждой группы, демонстрирующее относительную опухолевую нагрузку (А). Линии линейной регрессии натурального log потока ffLuc (фотоны/с) показывают то, что IL13(EQ)BBζ T_CM достигают превосходящей регрессии опухоли по сравнению с первым поколением клона 2D7 CTL IL13-зетакин, T_CM с имитацией трансдукции и только опухолью (Б). Средний поток на группу в сутки 27 после инъекции опухоли, демонстрирующий то, что доза 0,1×10⁶ IL13(EQ)BBζ T_CM превосходит по эффективности в десять раз большую дозу клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ - 1,0×10⁶ (р равно 0,043; двухвыборочный t-критерий Уелча) (В).

На Фиг. 11 показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что IL13(EQ)BBζ T_CM показывают лучшую стойкость по сравнению с клонами CTL IL13-зетакин. Иммуногистохимия CD3, оценивающая стойкость Т-клеток в сайте опухоли через 7 суток после инфузии Т-клеток. Значительное число Т-клеток выявляется для IL13(EQ)BBζ T_CM (верхняя панель). В отличие от этого выявляется очень мало жизнеспособных Т-клеток CD3+ IL13-зетакин (нижняя панель).

На Фиг. 12А-Г показаны результаты экспериментов, сравнивающих путь доставки Т-клеток CAR+ (в.ч. (внутричерепно) по сравнению с в.в. (внутривенно)) для больших установившихся опухолей. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 19 и 26 мышам в.в. инъецировали через хвостовую вену либо 5×10⁶ CAR+ IL13(EQ)BBζ + T_CM (всего 11,8×10⁶ клеток; n равно 4), либо T_CM с имитацией трансдукции (11,8×10⁶ клеток; n равно 4). В качестве альтернативы, в сутки 19, 22, 26 и 29 мышам в.ч. инъецировали либо 1×10⁶ CAR+ IL13(EQ)BBζ + T_CM (всего 2,4×10⁶ клеток; n равно 4), либо T_CM с имитацией трансдукции (2,4×10⁶ клеток; n равно 5). Средний поток ffLuc (фотоны/с) с течением времени показывает то, что IL13(EQ)BBζ T_CM, доставленные в.ч., опосредует регрессию опухоли 19-суточных опухолей. В отличие от этого, Т-клетки, доставленные в.в., не демонстрируют уменьшения опухолевой нагрузки по сравнению с необработанными или имитирующими T_CM контролями (А). Кривая выживания Каплана-Мейера демонстрирует улучшенное выживание для мышей, обработанных в.ч. IL13(EQ)BBZ T_CM, по сравнению с мышами, обработанными в.в. введенными T_CM CAR+ (р равно 0,0003, логранговый критерий) (Б). Репрезентативное окрашивание Н&Е (гематоксилином и эозином) и IHC (иммуногистохимия) CD3 мышей, обработанных IL13(EQ)BBZ+ T_CM в.в. (В) по сравнению с в.ч. (Г). Т-клетки CD3+ выявляли только в группе, обработанной в.ч., при отсутствии клеток CD3+, выявленных в опухоли или в окружающей паренхиме мозга для мышей, обработанных в.в.

На Фиг. 13А-Б показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что Т-клетки CAR+, инъецированные внутричерепно, либо внутриопухолево (в.о.), либо внутрижелудочково (в.ж.), могут транспортироваться в опухоли на противоположном полушарии. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую и левую части переднего мозга мышей NSG. В сутки 6 мышам в.ч. инъецировали в место правой опухоли 1,0×10⁶ IL13(EQ)BBζ + T_CM (всего 1,6×10⁶ клеток; 63% CAR; n равно 4). Схема экспериментальной модели множественной глиомы (A). IHC CD3, демонстрирующая Т-клетки, инфильтрующие и правый, и левый сайты опухолей (Б).

На Фиг. 14 показана аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t+(SEQ ID NO: 10).

На Фиг. 15 показано сравнение последовательности IL13(EQ)41BBζ [IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) и CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).

Выделение желтым показывает область IL-13 с оптимизированными кодонами, включающую сигнальную последовательность GMCSF (IL13op).

выделение показывает область lgG4 с оптимизированными кодонами (lgG4op [L235E, N297Q]).

выделение показывает две предполагаемые замены аминокислот в пределах шарнирной области lgG4 (L235E и N297Q).

выделение показывает область трансмембранного CD4 с оптимизированными кодонами.

выделение показывает цитоплазматическую область сигнализации 41ВВ (41ВВ cyto).

выделение показывает 3-глициновые линкеры (g3).

Выделение серым показывает область CD3 зета с оптимизированными кодонами (zeta op).

Выделение показывает последовательность Т2А (Т2А).

Выделение показывает последовательность усеченного CD19 (CD19t).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже описана популяция клеток T_CM, которая включает клетки CD4+ и клетки CD8+ (популяция клеток «T_CM CD4+/CD8+). Клетки популяции клеток T_CM CD4+/CD8+ могут быть активированы с использованием антител против CD3/CD28 и трансдуцированы, например, лентивирусным вектором SIN, который управляет экспрессией CAR, с созданием генетически модифицированных клеток. Активированные/генетически модифицированные клетки можно размножать in vitro с использованием IL-2/IL-15 и затем использовать или криоконсервировать и использовать позднее. Описан пример применения популяции клеток T_CM CD4+/CD8+ для экспрессии CAR, нацеленного на IL13Rα2.

CAR, используемый в приведенных ниже примерах, называется IL13(EQ)BBζ. Данный CAR включает целый ряд важных элементов, включая: лиганд IL13α2, имеющий аминокислотную замену, которая улучшает специфичность связывания с IL13Rα2; домен CD137 (4-1ВВ) последовательно с CD3ζ, для обеспечения полезной костимуляции; и область Fc lgG4, которая мутирована в двух сайтах в пределах области СН2 (L235E; N297Q) таким способом, который уменьшает связывание рецепторами Fc (FcR). Данный CAR и другие могут быть получены с использованием вектора, в котором после открытой рамки считывания CAR следует последовательность перескакивания рибосомы Т2А и усеченный CD19 (CD19t), у которого отсутствует цитоплазматический сигнальный хвост (усеченный в аминокислоте 323). При данной организации коэкспрессия CD19t дает инертный неиммуногенный маркер поверхности, который обеспечивает точное измерение генно-модифицированных клеток и делает возможными позитивную селекцию генно-модифицированных клеток, а также эффективное отслеживание и/или визуализацию терапевтических Т-клеток in vivo после адоптивного переноса. Коэкспрессия CD19t дает маркер иммунологического нацеливания трансдуцированных клеток in vivo с использованием клинически доступных антител и/или реактивов на основе иммунотоксинов для селективного удаления терапевтических клеток и, посредством этого, функционирования в качестве суицидного переключателя.

Глиомы экспрессируют рецепторы IL13 и, в частности, высокоаффинные рецепторы IL13. Однако, в отличие от рецептора IL13, глиомные клетки сверхэкспрессируют уникальную цепь IL13Rα2, способную к связыванию IL13 независимо от требования IL4Rβ или γc44. Подобно его гомологу - IL4, IL13 имеет плеотропную иммунорегуляторную активность вне ЦНС.И IL13, и IL4 стимулируют продукцию IgE В-лимфоцитами и подавляют продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами.

Подробные исследования с использованием ауторадиографии с радиоактивно меченым IL13 продемонстрировали обильное связывание IL13 почти на всех исследованных злокачественных глиомных тканях. Это связывание является высокогомогенным в пределах срезов опухоли и при анализе одиночных клеток. Однако анализ с молекулярным зондом, специфичным в отношении мРНК IL13Rα2 не выявил экспрессии глиомоспецифичного рецептора элементами нормального мозга, и авторадиография с радиоактивно меченым IL13 также не могла выявить специфичное связывание IL13 в нормальной ЦНС. Данные исследования свидетельствуют о том, что общий рецептор IL13Rα1/IL4β/γc не экспрессируется выявляемо в нормальной ЦНС. Следовательно, IL13Rα2 является очень специфичной мишенью поверхности клетки для глиомы и является подходящей мишенью для CAR, разработанных для лечения глиомы.

Связывание терапевтических молекул на основе IL13 с широко экспрессируемым рецепторным комплексом IL13Rα1/IL4β/γc, однако, имеет потенциал опосредования нежелательных токсичностей в отношении нормальных тканей вне ЦНС, и, таким образом, ограничивает системное введение данных агентов. Замена аминокислоты - нативной глутаминовой кислоты на тирозин в альфа-спирали A IL13 в аминокислотном остатке 13 селективно уменьшает аффинность IL13 в отношении рецептора IL13Rα1/IL4β/γc. Связывание данного мутанта (названного IL13(E13Y)) с IL13Rα2, однако, увеличивается относительно IL13 дикого типа. Таким образом, данный минимально измененный аналог IL13 одновременно увеличивает специфичность и аффинность IL13 в отношении глиомных клеток. Следовательно, описанный в данном документе CAR включает IL13, содержащий мутацию (от Е до Y или от Е до некоторой другой аминокислоты, такой как K или R, или L, или V) в аминокислотном остатке 13 (согласно нумерации Debinski et al. 1999 Clin Cancer Res 5: 3143s). Однако IL13, имеющий природную последовательность, также можно использовать, и он может быть полезным, особенно в ситуациях, когда модифицированные Т-клетки подлежат местному введению, как, например, посредством инъекции непосредственно в опухолевую массу.

CAR, описанный в данном документе, может быть получен любыми способами, известными в данной области, хотя предпочтительно его получают с использованием методик генной инженерии. Нуклеиновые кислоты, кодирующие несколько областей химерного рецептора, можно получать и собирать в полную кодирующую последовательность стандартными методиками молекулярного клонирования, известными в данной области (скрининг геномной библиотеки, ПЦР (полимеразная цепная реакция), лигирование с помощью праймеров, сайт-направленный мутагенез и т.д.), в зависимости от того, что является удобным. Образующаяся кодирующая область предпочтительно вставляется в экспрессионный вектор и используется для трансформации подходящей экспрессионной линии клетки-хозяина, предпочтительно линии клеток Т-лимфоцитов и наиболее предпочтительно аутологической линии клеток Т-лимфоцитов.

Пример 1: конструирование и структура IL13Rα2- специфичного CAR

Структура полезного IL13Rα2-специфичного CAR описывается ниже. Последовательность CAR с оптимизированными кодонами содержит связанный с мембраной лиганд - IL13, мутированный в одном сайте (E13Y) для уменьшения потенциального связывания с IL13Rα1, спейсер на основе Fc lgG4, содержащий две мутации (L235E; N297Q), которые значительно ослабляют модели распознавания, опосредованные рецептором Fc, трансмембранный домен CD4, костимулирующий цитоплазматический домен сигнализации 4-1ВВ и цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ. Последовательность перескакивания рибосомы Т2А отделяет эту последовательность CAR IL13(EQ)BBζ от CD19t - инертного, неиммуногенного маркера поверхности клетки для выявления/селекции. Эта Т2А-связка приводит к координированной экспрессии и IL13(EQ)BBζ, и CD19t от одного транскрипта. Фиг. 1А представляет собой схематический рисунок открытой рамки считывания из 2670 нуклеотидов, кодирующей конструкцию IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t. На этом рисунке показаны все: IL13Rα2- специфичного лиганд - IL13(E13Y), Fc lgG4(EQ), трансмембранный домен CD4, цитоплазматический домен сигнализации 4-1ВВ, трехглициновый линкер и цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ CAR IL13(EQ)BBZ, а также последовательности перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19. Также показаны сигнальные последовательности человеческого рецептора GM-CSF альфа и CD19, которые управляют поверхностной экспрессией CAR IL13(EQ)BBZ и CD19t. Таким образом, конструкция IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t включает последовательность IL13Rα2- специфичного, оптимизированного в отношении шарнирной области, костимулирующего химерного иммунорецептора (обозначенного IL13(EQ)BBZ), последовательность перескакивания рибосомы Т2А и последовательность CD19t.

Последовательность IL13(EQ)BBZ получали посредством слияния лидерного пептида человеческого рецептора GM-CSF альфа с последовательностями лиганда - IL13(E13Y), L235E/N297Q-модифицированного шарнира Fc lgG4 (где двойная мутация препятствует распознаванию FcR), трансмембранного CD4, цитоплазматического домена сигнализации 4-1BB и цитоплазматического домена сигнализации CD3ζ. Данную последовательность синтезировали de novo после оптимизации кодонов. Последовательность Т2А получали в результате расщепления плазмиды, содержащей Т2А. Последовательность CD19t получали из последовательности, охватывающей последовательность лидерного пептида с трансмембранными компонентами (т.е. пары оснований 1-972) плазмиды, содержащей CD19. Все три фрагмента: 1) IL13(EQ)BBZ, 2) Т2А и 3) CD19t клонировали в сайт множественного клонирования лентивирусного вектора epHIV7. При трансфекции в подходящие клетки данный вектор интегрирует в геном клеток-хозяев последовательность, схематически показанную на Фиг. 1Б. На Фиг. 1В приведен схематический рисунок 9515 пар оснований самой плазмиды IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.

Как схематически показано на Фиг. 2, CAR IL13(EQ)BBZ отличается в нескольких важных аспектах от описанного ранее IL13Rα2- специфичного CAR, названного IL13(E13Y)-зетакин (Brown et al. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199). IL13(E13Y)-зетакин состоит из IL13Rα2-специфичного мутеина человеческого IL-13 (hulL-13(E13Y)), спейсера на основе Fc человеческого lgG4 (huγ4Fc), части в виде трансмембранного человеческого CD4 (huCD4 tm) и цитоплазматической части цепи человеческого CD3ζ (huCD3ζ cyt), как показано. В отличие от него, IL13(EQ)BBζ имеет две точечные мутации - L235E и N297Q, которые расположены в домене СН2 спейсера на основе lgG4, и костимулирующий цитоплазматический домен 4-1ВВ (4-1ВВ cyt).

Пример 2: конструирование и структура epHIV7, используемого для экспрессии IL13Rα2- специфичного CAR

Плазмида pHIV7 представляет собой родительскую плазмиду, из которой был получен клинический вектор IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 в исследовательской лаборатории терапевтических средств на основе Т-клеток (TCTRL) в City of Hope (СОН). Вектор epHIV7, используемый для экспрессии CAR, получали из вектора pHIV7. Важно то, что в данном векторе для управления экспрессией CAR используется человеческий промотор EF1. И 5', и 3' последовательности данного вектора получали из pv653RSN, полученного ранее из провируса НХВс2. Вытесняемые последовательности ДНК полипуринового участка (рРРТ) происходили из штамма pNL4-3 HIV-1 (вирус иммунодефицита человека-1) из репозитория реактивов СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита человека) NIH (Национальный институт здравоохранения США). Последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента лесного сурка (WPRE) была описана ранее.

Конструирование pHIV7 схематически показано на Фиг. 3. Вкратце, pv653RSN, содержащую 653 п. о. из gag-pol плюс 5' и 3' длинных концевых повторов (LTR) с находящимся между ними геном SL3-неомицинфосфотрансферазы (Neo), субклонировали в pBluesript следующим образом: на стадии 1 из последовательностей от 5' LTR до отвечающего элемента rev (RRE) создавали p5'HIV-1 51, и затем 5' LTR модифицировали посредством удаления последовательностей, расположенных выше ТАТА-бокса, и лигировали сначала с энхансером CMV (цитомегаловирус) и затем с репликатором SV40 (p5'HIV-2). На стадии 2 после клонирования 3' LTR в pBluesript с получением p3'HIV-1 делали делецию 400 п. о. в 3' LTR энхансера/промотора с удалением цис-регуляторных элементов в U3 HIV и образованием p3HIV-2. На стадии 3 фрагменты, выделенные из p5'HIV-3 и p3'HIV-2, лигировали с получением pHIV-3. На стадии 4 p3'HIV-2 дополнительно модифицировали посредством удаления дополнительных, расположенных выше последовательностей HIV с получением p3'HIV-3, и к p3'HIV-3 добавляли фрагмент из 600 п. о. BamHI-Sall, содержащий WPRE, с получением p3'HIV-4. На стадии 5 уменьшали размер RRE pHIV-3 посредством ПЦР и лигировали с 5' фрагментом из pHIV-3 (не показано) и с p3'HIV-4 с получением pHIV-6. На стадии 6 фрагмент из 190 п. о. BgIII-BamHI, содержащий вытесняемую последовательность ДНК рРРТ из pNL4-3 (55) HIV-1, амплифицировали из pNL4-3 и размещали между последовательностями RRE и WPRE в pHIV6 с получением pHIV-7. Эту родительскую плазмиду pHIV7-GFP (GFP - зеленый флуоресцентный белок) использовали для упаковки родительского вектора с использованием четырехплазмидной системы.

Упаковочный сигнал - пси ψ - требуется для эффективной упаковки вирусного генома в вектор. RRE и WPRE усиливают транспорт РНК-транскрипта и экспрессию трансгена. Было продемонстрировано, что вытесняемая последовательность в комбинации с WPRE усиливает эффективность трансдукции лентивирусного вектора в клетках млекопитающих.

Хелперные функции, требующиеся для получения вирусного вектора, разделены на три отдельные плазмиды для уменьшения вероятности получения лентивируса, компетентного к репликации, посредством рекомбинации: 1) pCgp кодирует белок gag/pol, требующийся для сборки вирусного вектора; 2) pCMV-Rev2 кодирует белок Rev, который действует на последовательность RRE, помогая транспорту вирусного генома для эффективной упаковки и 3) pCMV-G кодирует гликопротеин вируса везикулостоматита (VSV), который требуется для инфективности вирусного вектора.

Имеется минимальная гомология последовательности ДНК между геномом вектора, кодируемого pHIV7, и хелперными плазмидами. Области гомологии включают область упаковочного сигнала из приблизительно 600 нуклеотидов, расположенную в последовательности gag/pol хелперной плазмиды pCgp; последовательность промотора CMV во всех трех хелперных плазмидах и последовательность RRE в хелперной плазмиде pCgp. Весьма маловероятно, что компетентный к репликации рекомбинантный вирус мог бы быть генерирован из-за гомологии в данных областях, так как потребовались бы многие события рекомбинации. Кроме того, у любых образующихся в результате рекомбинантов отсутствовали бы функциональные LTR и последовательности tat, требующиеся для репликации лентивируса.

Промотор CMV заменяли промотором EF1α-HTLV (EF1p), и новую плазмиду называли epHIV7 (Фиг. 4). EF1p имеет 563 п.о., и его вводили в epHIV7 с использованием Nrul и Nhel после вырезания промотора CMV.

Лентивирусный геном, исключая gag/pol и rev, которые необходимы для патогенности вируса дикого типа и требуются для продуктивной инфекции клеток-мишеней, удаляли из данной системы. Кроме того, конструкция вектора IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 не содержит интактный промотор 3'LTR, таким образом, образующийся экспрессируемый и подвергающийся обратной транскрипции в клетках-мишенях провирусный геном на основе ДНК будет иметь неактивные LTR. В результате этой конструкции из провируса не будут транскрибироваться последовательности, происходящие из HIV-I, и от их соответствующих промоторов будут экспрессироваться только терапевтические последовательности. Ожидается, что удаление активности промотора LTR в векторе SIN значительно уменьшает вероятность ненамеренной активации генов хозяина (56). В Таблице 4 обобщены разные регуляторные элементы, присутствующие в IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7.

Пример 3: получение векторов для трансдукции Т-клеток пациента

Для каждой плазмиды (IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7, pCgp, pCMV-G и pCMV-Rev2) генерируется семенной банк, который используется для инокуляции ферментера для продукции достаточных количеств плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК тестируют на идентичность, стерильность и уровень эндотоксинов до ее применения в продуцировании лентивирусного вектора.

Вкратце, клетки размножали от рабочей клетки 293Т (WCB), которая была протестирована на соответствие стерильности и отсутствию вирусного загрязнения. Флакон с клетками 293Т из WCB 293Т оттаивали. Клетки выращивали и размножали до тех пор, пока не образовалось достаточное число клеток для посева в подходящее число 10-слойных клеточных фабрик (CF) для продукции вектора и поддержания линии клеток. Для продукции можно использовать одну линию клеток.

Лентивирусный вектор продуцировали в подпартиях из вплоть до 10 CF. В ту же самую неделю можно продуцировать две подпартии, что приводит к продукции приблизительно 20 л лентивирусного супернатанта/неделю. Материал, продуцированный из всех подпартий, объединяли во время фазы последующей переработки для того, чтобы получить одну партию продукта. Клетки 293Т высевали в CF в среду 293Т (DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) с 10% FBS (фетальная телячья сыворотка)). Фабрики помещали в инкубатор при 37°C выравнивали горизонтально для того, чтобы получать равномерное распределение клеток на всех слоях CF. Через двое суток клетки трансфицировали четырьмя лентивирусными плазмидами, описанными выше, с использованием способа с CaPO₄, который включает смесь Tris:EDTA, 2 М CaCl₂, 2× HBS и четырех ДНК-плазмид. В сутки 3 после трансфекции собирали супернатант, содержащий секретированные лентивирусные векторы, очищали и концентрировали. После удаления супернатанта из CF из каждой CF отбирали клетки конечной продукции. Клетки из каждой фабрики трипсинизировали и собирали центрифугированием. Клетки ресуспендировали в среде для замораживания и криоконсервировали. Данные клетки позднее использовали для тестирования лентивируса, компетентного в отношении репликации (RCL).

Для очистки и приготовления векторов неочищенный супернатант осветляли фильтрованием через мембрану для удаления клеточных обломков. ДНК клетки-хозяина и остаточную плазмидную ДНК деградировали эндонуклеазным расщеплением (Benzonase®). Вирусный супернатант осветляли от клеточных обломков с использованием 0,45 мкм фильтра. Осветленный супернатант собирали в предварительно взвешенный контейнер, в который добавляли Benzonase® (конечная концентрация 50 U(единиц)/мл). Эндонуклеазное расщепление остаточной плазмидной ДНК и геномной ДНК хозяина проводится при 37°C в течение 6 ч. Для удаления из неочищенного супернатанта остаточных низкомолекулярных компонентов использовали концентрирование обработанного эндонуклеазой супернатанта с использованием исходной ультрафильтрации с тангенциальным потоком (TFF), концентрируя вирус ~ в 20 раз. Осветленный вирусный супернатант, обработанный эндонуклеазой, циркулировал через картридж на основе полых волокон с порогом отсечения молекулярной массы 500 кДа, и скорость тока продумывали так, чтобы поддерживать скорость сдвига ~ 4000 с^-1 или менее при максимизации скорости тока. Диафильтрацию супернатанта, обработанного нуклеазой, инициировали во время процесса концентрирования для поддержания эффективности работы картриджа. Устанавливали скорость замены пермеата 80% с использованием 4% лактозы в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в качестве диафильтрационного буфера. Вирусный супернатант доводили до намеченного объема, обеспечивая 20-кратное концентрирование неочищенного супернатанта, и диафильтрацию продолжали с использованием 4 дополнительных замен объемов со скоростью замены пермеата 100%.

Дополнительное концентрирование вирусного продукта осуществляли с использованием методики высокоскоростного центрифугирования. Каждую подпартию лентивируса осаждали с использованием центрифуги Sorvall RC-26 plus при 6000 об./мин (RCF 6088) при 60°C в течение 16-20 ч. Вирусный осадок из каждой подпартии затем растворяли в объеме 50 мл с использованием 4% лактозы в PBS. Растворенный в данном буфере осадок представляет собой конечную композицию препарата вируса. Весь способ концентрирования вектора приводил приблизительно к 200-кратному уменьшению объема. После завершения получения всех подпартий материал затем помещали при -80°C, в то время как образцы из каждой подпартии тестировали на стерильность. После подтверждения стерильности образцов подпартии быстро оттаивали при 37°C с частым втряхиванием. Данный материал затем объединяли и вручную делили на аликвоты в боксе микробиологической безопасности класса II типа A/B3 в кабинете для получения вирусных векторов. Использовали конфигурацию заполнения 1 мл концентрированного лентивируса в стерильных криофлаконах класса 6 USP (фармакопея Соединенных Штатов) с наружной резьбой и О-кольцом. Системы контроля качества (QS) Центра разработки прикладных технологий (CATD) в СОН выпускали все материалы согласно политике и стандартному регламенту работы для CBG и в соответствии с современной надлежащей производственной практикой (cGMP).

Для обеспечения чистоты препарата лентивирусного вектора его тестировали на остаточные загрязнения ДНК хозяина и перенос остаточной ДНК хозяина и плазмиды. Среди других анализов идентичность вектора оценивали посредством ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) для того, чтобы убедиться, что присутствует правильный вектор. Для вектора, предназначенного для применения в данном исследовании, удовлетворяются все критерии выпуска.

Пример 4: получение популяции клеток T_CM CD4+/CD8+, подходящих для применения в ACT

Краткий обзор стратегии изготовления популяции клеток T_CM CD4+/CD8+ проиллюстрирован на Фиг. 8 (схема изготовления IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM). В частности, продукты афереза, полученные от участников исследования, подписавших информированное согласие, разделяли на фиколе, промывали и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обедняли популяциями моноцитов, регуляторных Т-клеток и наивных Т-клеток с использованием реактивов на основе антитела против CD14, антитела против CD25 и антитела против CD45RA уровня качества GMP (Miltenyi Biotec) и прибора для разделения CliniMACS™. После обеднения негативные фракции клеток обогащаются в отношении клеток Т_См CD62L+ с использованим DREG56-биотина (клинический уровень качества СОН) и микрошариков против биотина (Miltenyi Biotec) на приборе для разделения CliniMACSTM. Клетки не обедняются ни в отношении клеток CD4+, ни в отношении клеток CD8+.

После обогащения клетки T_CM CD4+/CD8+ готовят в виде препарата в полной X-Vivo15 плюс 50 IU (Международные единицы)/мл IL-2 и 0,5 нг/мл IL-15 и переносят в тефлоновый мешок для культуры клеток, где они стимулируются шариками Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28. Вплоть до пяти суток после стимулирования клетки трансдуцируются желательным вектором, экспрессирующим CAR (например, лентивирусным вектором IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7) при множественности инфекции (MOI), например, от 1,0 до 0,3. Культуры поддерживаются в течение вплоть до 42 суток с добавлением полной X-Vivo15 и цитокина IL-2 и IL-15 по мере необходимости для размножения клеток (поддерживая плотность клеток от 3×10⁵ до 2×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и осуществляя дополнение цитокинами каждый понедельник, среду и пятницу культуры). При данных условиях клетки типично размножаются до приблизительно 10⁹ клеток в пределах 21 суток. В конце периода культивирования клетки отбирают, дважды промывают и готовят в криоконсервирующей среде клинического уровня качества (Cryostore CS5, BioLife Solutions).

В сутки инфузии Т-клеток криоконсервированный и высвобожденный продукт оттаивают, промывают и готовят для повторной инфузии. Криоконсервированные флаконы, содержащие высвобожденный клеточный продукт, удаляют из хранилища с жидким азотом, оттаивают, охлаждают и промывают промывочным буфером на основе PBS/2% человеческого сывороточного альбумина (HSA). После центрифугирования супернатант удаляется и клетки ресуспендируются в инфузионном разбавителе на основе нормального физиологического раствора, не содержащего консерванты (PFNS)/2% HSA. Образцы удаляются для тестирования для контроля качества.

Два квалификационных прогона на клетках, полученных от здоровых доноров, осуществляли с использованием производственной платформы, описанной выше. Каждому продукту доклинического квалификационного прогона присваивали номер донора-человека (HD) - HD006.5 и HD187.1. Важно то, что как показано в Таблице 5, данные клетки квалификационных прогонов размножались более чем 80 раз в пределах 28 суток, и размноженные клетки экспрессировали трансгены IL13(EQ)BBγ/CD19t.

Пример 5: анализ экспрессии трансгена поверхности и маркера Т-клеток в IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM посредством проточной цитометрии

В доклинических исследованиях использовали продукты двух доклинических квалификационных прогонов, описанные в Примере 4, как описано ниже. На Фиг. 6А-В показаны результаты анализа экспрессии трансгена поверхности и маркера Т-клеток посредством проточной цитометрии. IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM HD006.5 и HD187.1 совместно окрашивали антителом против IL13-PE и антителом против CD8-FITC для выявления клеток CD8+ CAR+ и CD4+ (т.е. CD8-негативных) CAR+ (Фиг. 6А), или антителом против CD19-PE и антителом против CD4-FITC для выявления клеток CD4+ CD19t+ и CD8+ (т.е. CD4-негативных) CAR+ (Фиг. 6Б). IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM HD006.5 и HD187.1 окрашивали антителами против CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L и CD28, конъюгированными с флуорохромом (серые гистограммы), или изотипическими контролями (черные гистограммы). (Фиг. 6В). На каждой из Фиг. 6А-В указанные процентные доли основаны на жизнеспособных лимфоцитах (негативных в отношении DAPI), которые окрашивались сильнее, чем изотипический контроль.

Пример 6: Эффекторная активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM

Оценивали эффекторную активность IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM, и результаты данного анализа показаны на Фиг. 7А-Б. Вкратце, IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM HD006.5 и HD187.1 использовали в качестве эффекторов в 6-часовом анализе высвобождения ⁵¹ Cr с использованием соотношения 10Е:1Т на основе экспрессии CD19t. IL13Rα2-позитивными опухолями-мишенями были K562, генетически модифицированная для экспрессии IL13Rα2 (K562-IL13Rα2), и линия первичной глиомы РВТ030-2, а IL13Rα2-негативной контрольной опухолью-мишенью была родительская линия K562 (Фиг. 7А). IL13(EQ)BBγ/CD19t+ HD006.5 и HD187.1 оценивали на антигензависимую продукцию цитокинов после совместной культуры в течение ночи при соотношении 10Е:1Т с использованием таких же IL13Rα2-позитивных и негативных мишеней, как описано выше. Уровни цитокинов измеряли с использованием набора для анализа Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2, и показаны уровени IFN-γ (Фиг. 7Б).

Пример 7: противоопухолевая активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM in vivo

Описанные ниже исследования демонстрируют то, что IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM показывают противоопухолевую эффективность в мышиных моделях in vivo. В частности, авторы изобретения оценили противоопухолевую эффективность IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM против линии РВТ030-2 IL13Rα2+ сфер первичной глиобластомной опухоли с малым числом пассажей, которую генетически модифицировали для экспрессии репортерных генов: и EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), и люциферазы светляка (ffLuc) (РВТ030-2 EGFP:ffLuc) (6). Ряд первичных линий (РВТ) из образцов глиобластомы пациента выращивали в виде сфер опухоли (TS) в бессывороточных средах. Данные размноженные линии TS демонстрируют характеристики, подобные стволовым клеткам, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, многолинейную дифференциацию и способность к инициации ортотопических опухолей у иммунодефицитных мышй (NSG) при малом числе клеток. Модель TS-инициированного ксенотрансплантата РВТ030-2 EGFP:ffLuc (0,1×10⁶ клеток; 5 суток после приживления) ранее использовали для оценки противоопухолевой активности in vivo Т-клеток, экспрессирующих IL13Rα2-специфичный CAR, у мышей NSG, при этом было показано, что три инъекции 2×10⁶ цитолитических Т-лимфоцитов (CTL) на протяжении 2 недель уменьшают рост опухоли. Однако в данных экспериментах большинство опухолей РВТ030-2 в конечном счете давали рецидив. По сравнению с этим однократная инъекция IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM (1,1×10⁶ CAR+ T_CM; общее число Тcм 2×10⁶) демонстрировала надежную противоопухолевую активность против TS-инициированных опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc (0,1×10⁶ клеток; 5 суток после приживления), как показано на Фиг. 8А-В. По сравнению с мышами NSG, обработанными либо PBS, либо T_CM с имитацией трансдукции (без CAR), IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM значимо уменьшают поток ffLuc (р меньше 0,001 в моменты времени больше, чем 18 суток) и значительно улучшают выживание (р равно 0,0008).

Вкратце, опухолевые клетки EGFP-ffLuc+РВТ030-2 (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 5 мыши получали либо 2×10⁶ IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM (1,1×10⁶ CAR+; n равно 6), либо 2×10⁶ имитации трансдукции T_CM (без CAR; n равно 6), либо PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n равно 6). На Фиг. 8А показаны репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image. Количественное измерение потока ffLuc (фотоны/с) показывает то, что IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM индуцируют регрессию опухоли по сравнению с T_CM с имитацией трансдукции и с PBS (# р меньше 0,02; * р меньше 0,001, ANOVA с повторными измерениями) (Фиг. 8Б). Как показано на Фиг. 8В, кривая выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу) демонстрирует значимо улучшенное выживание (р равно 0,0008; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM.

Пример 8: сравнение клонов IL13(EQ)BBCζ+ T_CM и CTL, не являющихся T_CM, IL13-зетакин CD8+ по противоопухолевой эффективности и стойкости Т-клеток

В исследованиях, описанных ниже, сравниваются IL13(EQ)BBζ+ T_CM и созданные ранее IL13Rα2-специфичные человеческие CTL CD8+ (CTL IL13-зетакин CD8+ (описанные в Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18: 2199 и Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64: 9160). В IL13-зетакин используется стимулирующий домен CD3ζ, отсутствует костимулирующий домен и используется тот же самый вариант IL13, что и в IL13(EQ)BBζ+.

Получали ряд первичных линий (РВТ) из образцов глиобластомы пациента, выращенных в виде сфер опухолей (TS) в бессывороточных средах (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199; Brown et al. 2009 Cancer Res 69:8886). Данные размноженные линии TS демонстрируют характеристики, подобные стволовым клеткам, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, многолинейную дифференциацию и способность к инициации ортотопических опухолей у иммунодефицитных мышй (NSG) при малом числе клеток. Для экспериментов, описанных ниже, использовали IL13Rα2+ линию TS первичной глиобластомы с малым числом пассажей РВТ030-2, которая была генетически модифицирована для экспрессии репортерных генов: и EGFP, и люциферазы светляка (ffLuc) (РВТ030-2 EGFP: ffLuc) (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199).

Сначала сравнивали одну дозу (1×10⁶ Т-клеток CAR) продукта IL13(EQ)BBζ+ T_CM с клонами CTL IL13-зетакин CD8+, оцениваемыми относительно TS-инициированных ксенотрансплантатов РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 8 (0,1×10⁶ клеток). В то время как и Т-клетки с IL13Rα2-специфичным CAR (CTL с IL13-зетакин и IL13(EQ)BBζ+ T_CM) демонстрировали противоопухолевую активность против прижившихся опухолей РВТ030-2 по сравнению с необработанным контролем или контролем в виде T_CM с имитацией трансдукции (CAR-негативным) (Фиг. 9А и 9Б), IL13(EQ)BBZ+ T_CM опосредовали значимо улучшенное выживание и надежную ремиссию опухоли с мышами, живущими больше 150 суток, по сравнению с первым поколением клонов CTL IL13-зетакин CD8+ авторов изобретения (Фиг. 9В).

Для дальнейшего сравнения терапевтических эффективностей данных двух Т-клеточных продуков IL13Rα2-CAR осуществляли титрование дозы - 1,0, 0,3 и 0,1×10⁶ Т-клеток с CAR относительно TS-инициированных опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 8 (Фиг. 10А-В). Наивысшая доза (1×10⁶) клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ опосредовала противоопухолевые ответы при измерении потока посредством Xenogen у 3 из 6 животных (Фиг. 10В), но при меньших дозах Т-клеток с CAR не наблюдали значимых противоопухолевых ответов. По сравнению с этим, инъекция продукта IL13(EQ)BBζ+ T_CM опосредовала полную регрессию опухоли у большинства мышей при всех уровнях дозы, включая обработку всего-лишь 0,1×10⁶ Т-клеток с CAR. Эти данные демонстрируют то, что IL13(EQ)BBζ+ T_CM являются по меньшей мере в 10 раз более эффективными по противоопухолевой эффективности, чем клоны CTL IL13-зетакин CD8+. Улучшенная противоопухолевая эффективность обусловлена улучшенной стойкостью Т-клеток в микроокружении опухоли. Оценка Т-клеток CD3+ через 7 суток после в.ч. инъекции выявила значимое число IL13(EQ)BBζ+ T_CM в микроокружении опухоли, тогда как присутствовало очень мало CTL первого поколения IL13-зета (Фиг. 11).

Пример 9: сравнение пути доставки Т-клеток с CAR для лечения больших, РВТ опухолей, инициированных TS

Ниже описаны исследования, в которых сравнивается влияние пути доставки - внутривенного (в.в.) или внутричерепного (в.ч.) - на противоопухолевую активность против линий инвазивных первичных РВТ. В пилотных исследованиях (данные не показаны) неожиданно наблюдали то, что в.в. введенные IL13(EQ)BBζ+ T_CM не давали терапевтической пользы по сравнению с PBS для лечения маленьких (сутки 5) опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc. Это отличается от надежной терапевтической эффективности, наблюдаемой с в.ч. введенными Т-клетками CAR+. Обоснованием является то, что в сутки 5 опухоли РВТ030-2 возможно были слишком маленькими для рекрутирования терапевтических Т-клеток с периферии -делали сравнение в.в. относительно в.ч. доставки против больших опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 19. Для этих исследований мышей с прижившимися РВТ030-2 обрабатывали либо двумя в.в. инфузиями (5×10⁶ CAR+ T_CM; сутки 19 и 26), либо четырьмя в.ч. инфузиями (1×10⁶ CAR+ T_CM; сутки 19, 22, 26 и 29) IL13(EQ)BBZ+ T_CM, или T_CM с имитацией трансдукции (без CAR). Здесь также не отслеживали терапевтической пользы посредством визуализации Xenogen или анализом выживания Каплана-Мейера в отношении в.в. введенных Т-клеток CAR+ (Фиг. 12А и 12Б). В отличие от этого, для в.ч. введенных IL13(EQ)BBζ+ T_CM наблюдали мощную противоопухолевую активность (Фиг. 12А-Б). Затем отбирали мозги из когорты мышей 7 суток после инъекции Т-клеток и оценивали на человеческие клетки CD3+ посредством IHC. Неожиданно, для мышей, обработанных в.в. либо T_CM с имитацией трансдукции, либо IL13(EQ)BBζ+ T_CM, в опухоли или в других областях мозга мыши, где типично находятся человеческие Т-клетки (т.е. мягкая и паутинная оболочки мозга), не было выявляемых человеческих Т-клеток CD3+ (Фиг. 12В), свидетельствуя о недостатке в тропизме в опухоль. Это отличается от значительного числа Т-клеток, выявленного у мышей, обработанных в.ч. (Фиг. 12Г).

Цитокины, происходящие из опухоли, в частности, MCP-1/CCL2, являются важными в рекрутировании Т-клеток в опухоль. Таким образом, оценивали клетки опухоли РВТ030-2, и обнаружили, что данная линия продуцирует высокие уровни MCP-1/CCL2, сравнимые с клетками U251T (данные не показаны) - линией глиомы, для которой ранее было показано, что она привлекает в.в. введенные эффекторные Т-клетки CD8+ к в.ч. прижившимся опухолям. Злокачественные глиомы представляют собой высокоинвазивные опухоли и часто являются множественными по проявлению. В исследованиях, описанных выше, установлено то, что IL13BBZ T_CM могут устранять инфильтрующие опухоли, такие как РВТ030-2, и опосредовать долговременную надежную противоопухолевую активность. Также проверили способность Т-клеток с CAR, доставленных внутричерепно, к транспорту в многоочаговое заболевание. Для этого исследования TS РВТ030-2 EGFP:ffLuc имплантировали как в левое, так и в правое полушария (Фиг. 13А), и Т-клетки CAR+ инъецировали только сайт правой опухоли. Ободряющим было то, что для всех оцененных мышей (n равно 3) авторы изобретения выявили Т-клетки посредством IHC против CD3 через 7 суток после инфузии Т-клеток как в месте инфекции (т.е. в правой опухоли), так и в опухоли на левом полушарии (Фиг. 13Б). Эти данные дают доказательство того, что Т-клетки CAR+ способны транспортироваться к и инфильтровать очаги опухоли в удаленных сайтах. Аналогичные данные также наблюдали во второй модели опухоли с использованием линии клеток глиомы U251T (данные не показаны).

Пример 10: последовательности IL13(EQ)BBζ/CD19t

Полная аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t показана на Фиг. 17. Полная последовательность (SEQ ID NO:1) включает: сигнальный пептид GMCSF из 22 аминокислот (SEQ ID NO:2), последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), трансмембранную последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5), последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6), 3-аминокислотный Gly линкер; последовательность CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7), последовательность Т2А из 24 аминокислот (SEQ ID NO:8) и последовательность CD19t из 323 аминокислот (SEQ ID NO:9).

Последовательность зрелого химерного антигенного рецептора (SEQ ID NO:10) включает: последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5), последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6), 3-аминокислотный Gly линкер и последовательность CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7). В пределах данной последовательности CAR (SEQ ID NO:10) присутствует последовательность IL-13/lgG4/CD4t/41-BB (SEQ ID NO: 11), которая включает: последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5) и последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6). Последовательность IL-13/lgG4/CD4t/4-1BB (SEQ ID NO:11) может быть соединена с последовательностью CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7) посредством линкера, такого как GlyGlyGly линкер. Последовательности CAR (SEQ ID NO:10) может предшествовать сигнальный пептид GMCSF из 22 аминокислот (SEQ ID NO:2). На Фиг. 18 показано сравнение последовательностей IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ; T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) и CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CITY OF HOPE

<120> ЦЕНТРАЛЬНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПАМЯТИ ДЛЯ АДОПТИВНОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

<130> 40056-0002WO2

<140> PCT/US2015/051280

<141> 2015-09-21

<150> 62/053,068

<151> 2014-09-19

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 889

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

260 265 270

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val

355 360 365

Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe

370 375 380

Phe Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

385 390 395 400

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

405 410 415

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val

420 425 430

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

435 440 445

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

450 455 460

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

465 470 475 480

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

485 490 495

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

500 505 510

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

515 520 525

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu

530 535 540

Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

545 550 555 560

Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu

565 570 575

Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val

580 585 590

Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr

595 600 605

Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu

610 615 620

Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His

625 630 635 640

Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln

645 650 655

Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala

660 665 670

Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe

675 680 685

Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn

690 695 700

Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro

705 710 715 720

Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu

725 730 735

Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln

740 745 750

Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val

755 760 765

Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His

770 775 780

Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg

785 790 795 800

Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg

805 810 815

Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu

820 825 830

Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His

835 840 845

Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala

850 855 860

Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln

865 870 875 880

Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

885

<210> 2

<211> 22

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 3

<211> 112

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 3

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

<210> 4

<211> 229

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 22

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 5

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 6

<211> 42

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 6

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 7

<211> 112

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 7

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 24

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 8

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 9

<211> 323

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 9

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg

<210> 10

<211> 867

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 10

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly

340 345 350

Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys

355 360 365

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

370 375 380

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

385 390 395 400

Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

405 410 415

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

435 440 445

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

450 455 460

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

465 470 475 480

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

485 490 495

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

500 505 510

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg

515 520 525

Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

530 535 540

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

545 550 555 560

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

565 570 575

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

580 585 590

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

595 600 605

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

610 615 620

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

625 630 635 640

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

645 650 655

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

660 665 670

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

675 680 685

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

690 695 700

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro

705 710 715 720

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

725 730 735

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

740 745 750

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

755 760 765

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

770 775 780

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

785 790 795 800

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

805 810 815

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

820 825 830

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

835 840 845

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

850 855 860

Arg Lys Arg

865

<210> 11

<211> 405

<212> ПТР

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 11

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly

340 345 350

Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys

355 360 365

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

370 375 380

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

385 390 395 400

Gly Gly Cys Glu Leu

405

<210> 12

<211> 7754

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 12

gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60

tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120

taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180

aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360

attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420

acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480

aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540

agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600

agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660

gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720

ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780

aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840

ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900

gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960

agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020

tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080

gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140

aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200

ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260

tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320

aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380

agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440

ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500

aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560

gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620

ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680

tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 1740

caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800

cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860

cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 1920

accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 1980

ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040

cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac 2100

cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccctg gccccgtgcc 2160

ccctagcacc gccctgcgct acctgatcga ggaactggtg aacatcaccc agaaccagaa 2220

agcccccctg tgcaacggca gcatggtgtg gagcatcaac ctgaccgccg gcatgtactg 2280

tgccgccctg gaaagcctga tcaacgtgag cggctgcagc gccatcgaga aaacccagcg 2340

gatgctgtcc ggcttctgcc cccacaaggt gtccgccgga cagttcagca gcctgcacgt 2400

gcgggacacc aagatcgagg tggcccagtt cgtgaaggac ctgctgctgc acctgaagaa 2460

gctgttccgg gagggccggt tcaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg acagcgacgg 2520

cagcttcttc ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc cggtggcagg aaggcaacgt 2580

ctttagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgtc 2640

cctgagcctg ggcaagcggg tgaagttcag ccggtccgcc gacgcccctg cctaccagca 2700

gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcagg cgggaggaat acgacgtgct 2760

ggacaagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga agaaccccca 2820

ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg 2880

catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac 2940

cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa ggtctagacc 3000

cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg 3060

tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 3120

tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 3180

taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt 3240

ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca 3300

gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc 3360

ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 3420

gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 3480

cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 3540

cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat 3600

ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta gccgtacctt taagaccaat 3660

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 3720

gctaattcac tcccaaagaa gacaagatct gctttttgcc tgtactgggt ctctctggtt 3780

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 3840

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 3900

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagaa ttcgatatca 3960

agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg ggcccggtac ccaattcgcc ctatagtgag 4020

tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 4080

acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 4140

gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gaaattgtaa 4200

gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc 4260

aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga 4320

gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag 4380

ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt 4440

ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta 4500

gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag 4560

cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg 4620

cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 4680

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 4740

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 4800

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 4860

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 4920

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4980

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 5040

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 5100

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 5160

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 5220

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 5280

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 5340

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 5400

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 5460

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 5520

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 5580

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 5640

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 5700

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 5760

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 5820

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5880

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 5940

agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 6000

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 6060

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 6120

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 6180

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 6240

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 6300

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 6360

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 6420

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 6480

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 6540

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 6600

ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 6660

aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 6720

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6780

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcga aattaaccct cactaaaggg 6840

aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gcctcgaggt cgagatccgg tcgaccagca 6900

accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 6960

tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 7020

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 7080

cttcgacggt atcgattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga 7140

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 7200

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 7260

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 7320

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 7380

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 7440

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 7500

ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 7560

gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 7620

gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 7680

tacggaattc ggagtggcga gccctcagat cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt 7740

actgggtctc tctg 7754

<210> 13

<211> 8732

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 13

gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60

tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120

taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180

aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360

attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420

acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480

aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540

agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600

agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660

gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720

ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780

aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840

ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900

gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960

agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020

tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080

gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140

aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200

ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260

tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320

aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380

agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440

ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500

aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560

gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620

ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680

tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 1740

caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800

cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860

cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 1920

accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 1980

ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040

cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac 2100

cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccccg acatccagat 2160

gacccagacc acctccagcc tgagcgccag cctgggcgac cgggtgacca tcagctgccg 2220

ggccagccag gacatcagca agtacctgaa ctggtatcag cagaagcccg acggcaccgt 2280

caagctgctg atctaccaca ccagccggct gcacagcggc gtgcccagcc ggtttagcgg 2340

cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac catctccaac ctggaacagg aagatatcgc 2400

cacctacttt tgccagcagg gcaacacact gccctacacc tttggcggcg gaacaaagct 2460

ggaaatcacc ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa 2520

gggcgaggtg aagctgcagg aaagcggccc tggcctggtg gcccccagcc agagcctgag 2580

cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gcccgactac ggcgtgagct ggatccggca 2640

gccccccagg aagggcctgg aatggctggg cgtgatctgg ggcagcgaga ccacctacta 2700

caacagcgcc ctgaagagcc ggctgaccat catcaaggac aacagcaaga gccaggtgtt 2760

cctgaagatg aacagcctgc agaccgacga caccgccatc tactactgcg ccaagcacta 2820

ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag 2880

cagcgagagc aagtacggcc ctccctgccc cccttgccct gcccccgagt tcctgggcgg 2940

acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc 3000

cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg 3060

gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggaag agcagttcaa 3120

cagcacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa 3180

agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc agcatcgaga aaaccatcag 3240

caaggccaag ggccagcctc gggagcccca ggtgtacacc ctgccccctt cccaggaaga 3300

gatgaccaag aatcaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat 3360

cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt 3420

gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaggctg accgtggaca agagccggtg 3480

gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac 3540

ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa gatggccctg atcgtgctgg gcggcgtggc 3600

cgggctgctg ctgttcatcg gcctgggcat ctttttccgg gtgaagttca gccggtccgc 3660

cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag 3720

gcgggaggaa tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa 3780

gcccaggcgg aagaaccctc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc 3840

cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg gccacgacgg 3900

cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc 3960

cctgcccccc aggtgacccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc 4020

tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4080

gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 4140

cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 4200

tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 4260

cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 4320

ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 4380

tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 4440

tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 4500

ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 4560

ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactagc 4620

cgtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga 4680

aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatctgc tttttgcctg 4740

tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 4800

cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 4860

gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 4920

tagcagaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc 4980

aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 5040

tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 5100

tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 5160

ggcgaatgga aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 5220

tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 5280

agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 5340

tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 5400

catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 5460

aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 5520

ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 5580

taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc 5640

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 5700

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 5760

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 5820

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 5880

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 5940

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 6000

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 6060

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 6120

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 6180

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 6240

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 6300

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 6360

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 6420

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 6480

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 6540

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 6600

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 6660

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 6720

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 6780

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 6840

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 6900

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 6960

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 7020

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 7080

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 7140

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 7200

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 7260

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 7320

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 7380

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 7440

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 7500

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 7560

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 7620

acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 7680

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 7740

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctcgaaa 7800

ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctccaccg cggtggcggc ctcgaggtcg 7860

agatccggtc gaccagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact 7920

ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag 7980

gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc 8040

ctaggctttt gcaaaaagct tcgacggtat cgattggctc atgtccaaca ttaccgccat 8100

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 8160

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 8220

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 8280

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 8340

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 8400

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 8460

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 8520

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 8580

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 8640

aaatgggcgg taggcgtgta cggaattcgg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag 8700

cagctgcttt ttgcctgtac tgggtctctc tg 8732

30

<---

1. Популяция человеческих Т-клеток для лечения глиомы/глиобластомы, где указанные клетки трансдуцированы вектором, экспрессирующим химерный антигенный рецептор SEQ ID NO:10, и где по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой центральные Т-клетки памяти.

2. Популяция человеческих Т-клеток по п. 1, в которой все трансдуцированные человеческие Т-клетки представляют собой центральные Т-клетки памяти.

3. Популяция человеческих Т-клеток по п. 1, в которой по меньшей мере 10% трансдуцированных центральных Т-клеток памяти являются CD4+.

4. Популяция человеческих Т-клеток по п. 1, в которой по меньшей мере 10% трансдуцированных центральных Т-клеток памяти являются CD8+.

5. Популяция человеческих Т-клеток по п. 1, в которой по меньшей мере 15% центральных Т-клеток памяти являются CD4+, и по меньшей мере 15% являются CD8+.

6. Популяция человеческих Т-клеток по п. 1, в которой по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток являются CD4+/CD8+/CD62L+.

7. Популяция человеческих центральных Т-клеток памяти для лечения глиомы/глиобластомы, где указанные клетки трансдуцированы вектором, экспрессирующим химерный антигенный рецептор SEQ ID NO:10, и по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 10% клеток являются CD4+, и по меньшей мере 10% клеток являются CD4+.

8. Популяция человеческих Т-клеток по п. 7, в которой по меньшей мере 10% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+, и по меньшей мере 10% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD8+.

9. Популяция человеческих Т-клеток по п. 7, в которой по меньшей мере 15% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+, и по меньшей мере 15% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+.

10. Способ лечения глиомы/глиобластомы, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей человеческие Т-клетки по любому из пп. 1-9.

11. Способ по п. 10, в котором популяция человеческих Т-клеток является аутологической по отношению к пациенту.

12. Способ по п. 10, в котором популяция человеческих Т-клеток является аллогенной по отношению к пациенту.