Способ выделения лактоферрина верблюда
Владельцы патента RU 2763552:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения лактоферрина верблюда, включающий центрифугирование молока верблюда и удаление образовавшейся жировой фракции. Далее проводят термическую обработку безжировой фракции молока верблюда, полученную фракцию подвергают центрифугированию, а надосадочную жидкость подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине бодяги речной, для чего через колонку лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl (рН=8,0) буфером, пропускают весь объем фракции, полученной на предшествующей стадии. Далее колонку промывают 1 М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером (рН=8,0), а затем элюируют связанный на колонке лактоферрин верблюда 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализуют и концентрируют. Способ позволяет получить электрофоретически и хроматографически гомогенный препарат лактоферрина верблюда. 2 ил., 1 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выделения лактоферрина верблюда.
В практике известен способ получения очищенного препарата лактоферрина верблюда, основанный на сочетании методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной-масс-спектроскопии ( Xia Li , Zengmei Li , Enmin Xu , Ling Chen , Hua Feng , Lu Chen 1, Ligang Deng,Dongliang Guo. Determination of Lactoferrin in Camel Milk by Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Using an Isotope-Labeled Winged Peptide as Internal Standard. Molecules 2019-v.24, p.4199=4208; doi:10.3390/molecules24224199) или известен способ (прототип), основанный на сочетании методов центрифугирования и различных видов хроматографии (Redwan EM, El-Fakharany EM, Uversky VN, Linjawi MH Screening the anti infectivity potentials of native N- and C-lobes derived from the camel lactoferrin against hepatitis C virus.BMC Complement Altern Med. 2014 Jul 3;14:219. doi: 10.1186/1472-6882-14-219.).
Недостатками известных способов являются:
-низкая чистота продукта
-низкая эффективность и невысокий выход продукта;
-длительность проведения;
- использование дорогостоящего оборудования
Изобретение направлено на повышение степени очистки, ускорение и удешевление способа очистки лактоферрина верблюда.
Указанный технический результат достигается тем, что проводят термическую обработку безжировой фракции молока верблюда при 75-77°С в течение 30 минут, полученную фракцию подвергают центрифугированию, а надосадочную жидкость подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине бодяги речной, для чего через колонку лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl (рН=8,0) буфером, пропускают весь объем фракции, полученной на предшествующей стадии, далее колонку промывают 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером (рН=8,0), а затем элюируют, связанный на колонке лактоферрин верблюда 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0, полученный элюат диализуют и концентрируют.
Очистку лактоферрина проводили по предлагаемому способу. В работе использовали молоко верблюдиц с оптимальной концентрацией лактоферрина (7-28 дни лактации). В работе использовано 93 образца молока верблюдиц, которые получали с верблюдоводческих ферм Красноярского и Харабалинского районов Астраханской области в октябре-ноябре 2018 года, общим объёмом 550,0 мл. На первом этапе образцы молока центрифугировали при 8000 об\мин в течение 40-45 минут и затем удаляли, образовавшуюся жировую фракцию. Безжировую фракцию маркировали, определяли концентрацию лактоферрина и хранили при -18°С. На следующей стадии 450 мл. безжировой фракции молока верблюдиц подвергали термической обработке всего используемого объёма безжировой фракции молока верблюдиц при 75-77°С в течение 30 минут в термостатируемой ячейке автотермостата АМ-208. Далее полученная фракция подвергалась центрифугированию при 8000 об\мин в течение 40 мин на центрифуге ЦЛС-32. Надосадочная жидкость собиралась и использовалась в дальнейшей работе. Заключительная стадия очистки CLF представляет собой аффинную хроматографию лактоферрина верблюдиц на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl (рН=8,0) буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером (рН=8,0), а затем элюировали, связанный на колонке CLF 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объёма 26,0 мл.
Ниже, в таблице 1 приведены сведения сравнительного исследования выделения лактоферрина верблюдиц методом прототипа (1 способ) и аффинной хроматографии с лектином бодяги речной (2 способ). Анализ полученных результатов показал, что аффинная хроматография на лектине бодяги речной не только значительно упростила и сократила время выделения и очистки лактоферрина верблюдиц, но и достоверно повысила выход целевого продукта с 27,31% до 69,3%. Также возросла степень чистоты
препарата с 91,1% до 98,3%. Объективно эти цифры подтверждает
электрофорез в полиакриламидном геле (фиг.1). На препарате видно наличие белковых примесей в лактоферрине, полученном методом прототипа.
Степень очистки лактоферрина верблюдиц составила 36,8, а выход около 70 %. Всего из 550 мл молока верблюдиц получено 321,0мг чистого лактоферрина, который до дальнейшего использования хранился при -24°С.
Сущность поясняется рисунками, где:
Фиг.1. Электрофорез в полиакриламидном геле. 1 – безжировая фракция молока верблюдиц; 2 – лактоферрин верблюда полученный по способу прототипа; 3 – лактоферрин верблюда полученный по предлагаемому способу.
Фиг.2. Обращеннофазная высокоэффективная жидкостная хроматография очищенного препарата лактоферрина верблюда. Колонка силосорб С-8 115,0х3,5 мм Элюция 0.1% ТФУ и градиент ацетонитрила от 0 до 60%.
Ниже приводятся результаты исследования.
Пример №1
На первом этапе образцы молока объёмом 500,0 мл центрифугировали при 8000 об\мин в течение 45 минут и затем удаляли, образовавшуюся жировую (масляную) фракцию. Безжировую фракцию маркировали, определяли концентрацию лактоферрина и хранили при -18°С. На следующей стадии 450 мл. безжировой фракции молока верблюдиц подвергали термической обработке всего используемого объёма безжировой фракции молока верблюдиц при 77°С в течение 30 минут в термостатируемой ячейке автотермостата АМ-208. Далее полученная фракция подвергалась центрифугированию при 8000 об\мин в течение 40 мин на центрифуге ЦЛС-32. Надосадочная жидкость собиралась и использовалась в дальнейшей работе. Заключительная стадия очистки CLF представляет собой аффинную хроматографию лактоферрина верблюдиц на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl (рН=8,0) буфером, пропускали весь объем фракции, полученной на предшествующей стадии. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером (рН=8,0), а затем элюировали, связанный на колонке CLF 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объёма 22,0 мл.
Пример №2
На первом этапе образцы молока объёмом 400,0 мл центрифугировали при 8000 об\мин в течение 40 минут и затем удаляли, образовавшуюся жировую (масляную) фракцию. Безжировую фракцию маркировали, определяли концентрацию лактоферрина и хранили при -18°С. На следующей стадии 360 мл. безжировой фракции молока верблюдиц подвергали термической обработке всего используемого объёма безжировой фракции молока верблюдиц при 75°С в течение 30 минут в термостатируемой ячейке автотермостата АМ-208. Далее полученная фракция подвергалась центрифугированию при 8000 об\мин в течение 40 мин на центрифуге ЦЛС-32. Надосадочная жидкость собиралась и использовалась в дальнейшей работе. Заключительная стадия очистки CLF представляет собой аффинную хроматографию лактоферрина верблюдиц на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl (рН=8,0) буфером, пропускали весь объем фракции, полученной на предшествующей стадии. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером (рН=8,0), а затем элюировали, связанный на колонке CLF 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объёма 20,0 мл.
Предложенный способ:
- позволяет получить электрофоретически и хроматографически гомогенный препарат лактоферрина верблюда;
-повышает эффективность (повышает выход конечного продукта на 42%),
-сокращает время выделения лактоферрина верблюда
-удешевляет процедуру очистки
Способ выделения лактоферрина верблюда, включающий центрифугирование молока верблюда при 8000 об/мин в течение 40-45 мин и затем удаление образовавшейся жировой фракции, отличающийся тем, что далее проводят термическую обработку безжировой фракции молока верблюда при 75-77°С в течение 30 мин, полученную фракцию подвергают центрифугированию, а надосадочную жидкость подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине бодяги речной, для чего через колонку лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl (рН=8,0) буфером, пропускают весь объем фракции, полученной на предшествующей стадии, далее колонку промывают 1 М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером (рН=8,0), а затем элюируют связанный на колонке лактоферрин верблюда 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0, полученный элюат диализуют и концентрируют.
