Тест-система для выявления мутации в гене btpkd собаки домашней (canis lupus familiaris), вызывающей поликистоз почек

Авторы патента:

G01N33/00 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

C12Q1/686 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

Владельцы патента RU 2763933:

Мукий Юлия Викторовна (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система для выявления мутации мутации (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак. Тест-система включает в себя смесь для проведения полимеразной цепной реакции, с использованием разработанных праймеров, Taqman зондов диагностируемой аллели и олигонуклеотидов-«заглушек» для другой аллели, представленных ниже:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH₂

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH₂.

Изобретение расширяет арсенал средств для выявлений мутаций, вызывающих поликистоз почек у собак. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной генетики и биотехнологии.

Известна мутация в гене BTPKD (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) собаки домашней (Canis lupus familiaris), вызывающая поликистоз почек.

Однако для детекции этой мутации необходимо создание тест-ситемы на определение собак-носителей данной мутации или собак, больных поликистозом.

Техническим результатом является обеспечение достоверной диагностики поликистоза почек у собак, вызванной мутацией в гене BTPKD.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления мутации в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак включающую амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из 1х буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида используют разработанные праймеры, Taqman зонды диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели, имеющими следующие последовательности:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH₂

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH₂,

а также контрольные образцы на дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD.

В качестве контролей созданы две генетические конструкции - плазмиды, содержащие дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD. Положительный контроль для дикотипных диагностических систем получили путем амплификации фрагмента гена, полученный из ДНК здоровой собаки и его клонирования в вектор pJet1.2, мутантный вариант изготовили путем синтеза синтетической последовательности ДНК с последующим клонированием ее в вектор pJet1.2. ДНК гетерозиготы по мутации имитирована путем эквимолярного смешивания плазмид обоих типов после измерения их концентрации на электрофорезе в агарозном геле.

В качестве матрицы использовали 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (исходная плазмида 50 гн/мкл разбавлялась 1:10000) с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. «Преимущества клонирования ПЦР-продукта в вектор» заключается в устойчивом долговременном хранении контрольных матриц в виде плазмиды внутри бактериального штамма, с неограниченной возможностью копирования и наработки.

Реакционная смесь для ПЦР-РВ в варианте с «заглушками» разделена на два объема, каждый из которых содержит: Праймер прямой (F), Праймер обратный (R), Зонд, комплементарный одной из аллелей (wt - дикий тип, mut - мутантная аллель), Олигонуклеотид - заглушку, комплементарный другой аллели. В качестве контроля используют 2 вида матриц: для дикой аллели, для мутантной аллели. Детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда. Применение «заглушек» и раздельная детекция аллелей в двух независимых реакционных объемах дает возможность достижения наилучшего баланса между специфичностью и эффективностью системы и точной подстройки специфичности с помощью изменения соотношения концентраций зонда и «заглушки». Такая постановка ПЦР-РВ позволяет быстро установить в изучаемых образцах ДНК наличие трех вариантов генотипов, и, следовательно, выявить наличие или отсутствие мутантной аллели и определить наличие, отсутствие патологии или носительство.

Использование разных видов контроля в виде матриц, специфических праймеров, зондов и «звглушек» к разным вариантам генома (на мутантную и дикую аллели) позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирке.

При конструировании праймеров, зондов и заглушек выполнены требования: высокая степень гомологии с исследуемыми вариантами мутации гена, отсутствие участков отжигающихся «сами на себя», отсутствие «шпилек», что подтверждено результататами програмной проверки специфичности связывания праймеров и гибридизационных зондов, программной проверки олигонуклеотидов на возможность образования шпилек и димеров.

Конструирование специфических праймеров, зондов и «заглушек» осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей, опубликованный на ресурсе GeneBank и подбора условий для проведения РВ-ПЦР с применением разработанных праймеров, зондов, несущих флуорохром и гаситель флуоресценции и «заглушек» комплементарных части амплифицируемого фрагмента.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательный уровень».

Сущность изобретения поясняется фиг. 1 «Результаты ПЦР-РВ для детекции мутантной аллели BTPKD (3:1)» и фиг. 2 «Результаты ПЦР-РВ для детекции дикотипной аллели BTPKD (3:1)», где представлен скриншот результатов ПЦР-РВ в виде графиков, отражающих варианты детекции дикотипной, мутантной аллели и варианта гетерозиготного генотипа.

Пример конкретного использования тест-системы для выявления мутации в гене BTPKD у собак.

Исследование состоит из трех этапов:

1. Выделение ДНК из биоматериала (соскобов энетеробуккального эпителия).

2. Проведение ПЦР-РВ.

3. Интерпретация полученных результатов.

1. Для исследования у собак берут пробу энтеробуккального эпителия. Выделение тотальной ДНК собаки домашней производилось методом, с применением бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ).

Состав буфера: 1,4 М NaCl, 0,02 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,1М Трис - HCl с рН=8,0 (гидроксиметиламинометана гидрохлорид), дистиллированная вода.

Материал (соскоб буккального эпителия) переносили в пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, с добавлением 1 мл экстрагирующего буфера. После чего образец инкубировали на +56°C в течение 40 минут, с периодическим перемешиванием содержимого. После инкубации в пробирку добавляли 0,5 мл хлороформа, выдерживали 40 минут при комнатной температуре, содержимое пробирки постоянно перемешивали. Центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 2/3 объема изопропилового спирта, перемешивали. Далее выдерживали при комнатной температуре 30 минут для преципитации ДНК. Центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Супернатант сливали и промывали осадок 80% этанолом. Повторно центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. После удаления супернатанта, осадок нуклеиновой кислоты высушивали при комнатной температуре, затем растворяли его в 60 мкл стерильной деионизированной воды, хранили полученный образец ДНК при -20°C.

2. Апробацию диагностической системы производили в ПЦР-РВ анализаторе нуклеиновых кислот АНК-16 (Сертификат соответствия № РОСС RU.ME01. Н00423, Институт аналитического приборостроения РАН, Россия). Реакцию проводили в объеме 20 мкл. Амплификационная смесь содержит: 2 мкл 10 х буфер с сульфатом аммония для Taq-полимеразы, 0,125 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 0,25 мкМ праймер прямой, 0,25 мкМ праймер обратный, 0,125е.а/мкл Taq-полимераза, 2,5 мМ магния хлорид, 0,125 мкМ Taqman зонда диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели в объеме 0,250 мкМ. Все используемые реактивы производства ООО «Бигль», Россия. В качестве матрицы в смесь добавляли 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. После первоначальной денатурации при 94°C в течение 200 с 40 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: денатурация - 94°C, 18 с, отжиг праймеров - 60°C, 40 с, элонгация - 72°C, 40 с.

Тест-система позволяет специфически амплифицировать фрагмент гена BTPKD, для установления генотипа собаки в мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Система состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР и комплекта контрольных образов.

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, включая пробирки с матрицами и отрицательным контролем. Во все пробирки вносят реакционную смесь и добавляют исследуемые образцы ДНК в количестве 1 мкл, в отдельные пробироки вносят 1 мкл матрицы - разбавленного раствора контрольной плазмиды с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена. В пробирку для отрицательного контроля вносят 1 мл дистиллированной воды.

3. Интерпретация результатов анализа.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала - анализируются с помощью программного обеспечения используемого генетического анализатора для проведения ПЦР-РВ АНК-16, согласно прилагаемой инструкции производителя.

В таблице 1 представлены данные, по которым можно установить существенную разницу в эффективности специфической и неспецифической реакции. Эффективность рассчитана ПО прибора АНК-16.

Таким образом, для выявления собак-носителей (генотип GA) мутации в гене BTPKD(SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A), а также животных, больных поликистозом (гнотип АА) можно использовать разработанную тест систему. При наличии генотипа дикого типа (GG), т.е. животное здоровое на графике фиг. 2 результат будет отображаться в виде графика wt/wt. Если собака является носителем мутантной аллели (генотип GA), то результат детекции будет соответствовать графику mut/wt, представленном на фиг. 1 и фиг. 2. При наличии мутации в гомозиготном состоянии (поликистоз, генотип АА), график будет соответствовать, представленному на фиг. 1 и фиг. 2 как mut/ mut.

Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в ветеринарной генетике, а именно к средствам выявления носительства или диагностики заболевания поликистоз почек, вызванный мутацией в гене BTPKD у собак породы английский бультерьер, керн-терьер, вест-хайленд-вайт терьер или малинуа, что соответствует уровню «промышленная применимость».

Тест-система для выявления мутации (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) в гене BTPKD (Bull Terriers Polycystic Kidney Disease), вызывающей поликистоз почек у собак, включающая амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из десятикратного (10х) буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида, а также разработанных праймеров, разработанных Taqman зондов диагностируемой аллели и разработанных олигонуклеотидов-«заглушек» для другой аллели, представленных ниже:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH₂

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH₂.

Изобретение относится к медицине и касается способа многофакторного прогноза рака молочной железы, в ходе которого в образцах опухоли, отобранных у пациентов с диагнозом рак молочной железы, определяют комплекс прогностических факторов, включающий уровень экспрессии белков СК14, E-cadherin, р53, EGFR, осуществляют оценку каждого из прогностических факторов и используют полученные данные для формирования прогноза рака молочной железы, при этом у пациента дополнительно определяют стадию заболевания, степень дифференцировки опухоли, уровень экспрессии белка FOXP3, уровень экспрессии рецепторов HER-2, количество Т-лимфоцитов CD8+, количество Т-лимфоцитов CD4+, каждому фактору присваивают количество баллов в соответствии с предварительно полученной 100-бальной прогностической шкалой, суммируют полученные баллы и используют суммарное значение баллов в качестве прогностического параметра, при сумме баллов менее 40 прогноз расценивают как благоприятный, причем благоприятным считают прогноз со сроком выживаемости пациентов не менее 10 лет.

Способ прогнозирования исхода острого периода ишемического инсульта, ассоциированного с covid-19 // 2763834

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода острого периода ишемического инсульта у пациентов с лабораторно-подтвержденной коронавирусной инфекцией COVID-19. Проводят определение содержания С-реактивного белка в венозной крови, тяжести состояния пациента по шкале инсульта национального института здоровья NIHSS.

Способ прогнозирования перехода инфильтративной формы зооантропонозной трихофитии в нагноительную форму заболевания у детей // 2763826

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для прогнозирования перехода инфильтративной формы зооантропонозной трихофитии в нагноительную форму заболевания у детей. Проводят определение содержания иммунологического показателя в сыворотке венозной крови на 1-5-й день лечения.

Способы выделения, культивирования и генетической инженерии популяций клеток иммунной системы для адоптивной терапии // 2763795

Настоящая группа изобретений относится к клеточной биологии. Предложен способ обогащения CD4+- и CD8+-T-клеток, который предусматривает проведение в замкнутой системе отбора CD4+-клеток и отбора CD8+-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, и комбинирование этих клеток в необходимом соотношении, составляющем приблизительно от 10:1 до 1:10.

Способ прогнозирования исхода вирусной пневмонии при covid-19 // 2763764

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной и лучевой диагностике, и может быть использовано для прогнозирования исхода вирусной пневмонии при COVID-19. Определяют уровень альбумина, лактатдегидрогеназы в крови, пораженный и функционирующий объемы легких (мл), определяют коэффициент К1, характеризующий отношение пораженного к функционирующему объему легких.

Устройство для определения качественных характеристик пены // 2762778

Изобретение относится к масложировой и парфюмерно-косметической отраслям, в частности к определению качества пены моющих, косметико-гигиенических средств и средств для ванн. Устройство для определения объемной массы пены, включающее основание со съемной емкостью для сбора жидкости и опору, на которой установлен электродвигатель и редуктор, который посредством вала соединяется с маховиком кривошипно-шатунного механизма, который через шатун сообщается со штангой, закрепленной на опоре посредством направляющих втулок, с возможностью возвратно-поступательного движения, на которой закреплена с помощью лапок измерительная воронка, имеющая цилиндрическую форму с градуировкой и сферическим днищем с патрубком и краном для слива анализируемого образца, и пробкой с пришлифованным соединением в верхней части, и которая заключена в двойную обечайку с патрубком для подвода воды заданной температуры в нижней части, и патрубком для отвода отработанной воды в верхней ее части.

Способ прогнозирования рецидива туберкулеза легких // 2762671

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным исследованиям во фтизиатрии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива туберкулеза легких путем исследования сыворотки крови. Больным туберкулезом легких, вызванным лекарственно-устойчивыми штаммами M.tuberculosis, определяют в разгар болезни в сыворотке крови методом ИФА концентрации интерферона-γ, интерлейкина-10, аутоантител к коллагену I типа и аутоантител к коллагену III типа и определяют высокий, средний, низкий риск развития рецидива или полное отсутствие данного риска, согласно предложенному алгоритму.

Способ определения уровня железа в печени свиней // 2762614

Изобретение относится к животноводству, ветеринарии, экологии. Способ определения уровня железа в печени свиней включает анализ биосубстрата.

Способ определения необходимости назначения антибактериальной терапии при увеите // 2762492

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и клинической фармакологии, и может быть использовано для определения необходимости назначения антибактериальной терапии при увеите. Проводят определение показателя индекса сдвига лейкоцитов у лиц, имеющих воспалительную патологию сосудистой оболочки глаза.

Способ ранней диагностики острого деструктивного холецистита // 2762491

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для диагностики деструктивных форм острого калькулезного холецистита. Проводят определение в сыворотке крови концентрации иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, расчет общего иммуноглобулина по сумме концентраций IgG, IgA, IgM.

Генетическая конструкция для повышения радиационной устойчивости культуры клеток насекомого p. vanderplanki // 2763049

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области молекулярной биологии. Сущностью заявленного технического решения является генетическая конструкция для повышения радиационной устойчивости культуры клеток насекомого P.