Конъюгаты антител с лекарственными средствами, характеризующиеся высокой in vivo переносимостью

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и может быть использована для лечения рака. Конъюгат антитела с лекарственным средством содержит антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один C-конец константной области легкой цепи, и малую молекулу на основе антрациклина. При этом антитело, фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, нацелены на антиген, экспрессируемый на опухолевых клетках, а молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с C-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного посредством линкера, содержащего пептидную последовательность, включающую: (i) пептидный мотив, являющийся результатом расщепления мотива распознавания фермента сортазы, и (ii) олигоглициновую последовательность Glyn, где указанный мотив распознавания фермента сортазы представляет собой пентапептид и где n в указанной олигоглициновой последовательности представляет собой 1, 2, 3, 4 или 5. Малая молекула на основе антрациклина выбрана из PNU-159682, или из его производных, содержащих структуру согласно формуле (i)

Группа изобретений относится также к вариантам конъюгата, способу его получения, фармацевтической композиции, содержащей конъюгат, и применению конъюгата для изготовления лекарственного средства для лечения неопластического заболевания. Конъюгат обладает улучшенной переносимостью in vivo. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил, 12 табл., 10 пр.

 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитела с лекарственным средством, несущим сильнодействующие лекарственные средства и проявляющим улучшенные свойства in vivo и особенно улучшенную переносимость in vivo.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Ковалентные конъюгаты токсинов с малой молекулярной массой (токсичные «малые молекулы», молекулярная масса <2500 Дальтон) со связывающими белками, в частности с антителами, специфическими по отношению к опухолевым клеткам, являются мощными инструментами для специфического нацеливания на раковые клетки для их разрушения. Такие конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC) представляют большой медицинский и коммерческий интерес для терапии рака. Для разработки эффективных и безопасных ADC для терапии рака необходимо рассмотреть несколько аспектов: во-первых, антитело должно быть специфическим в отношении данного опухолеспецифического антигена (TSA), который должен крайне незначительно экспрессироваться или в идеале не экспрессироваться клетками нормальной или здоровой ткани. Во-вторых, ковалентная связь или соединение между лекарственным средством и антителом/связывающим белком должна являться достаточно стабильной в системе кровообращения, чтобы предотвратить нежелательное высвобождение токсической нагрузки в кровотоке, при этом эффективно высвобождать лекарственное средство при связывании и/или интернализации в раковые клетки. В-третьих, ADC должен интернализоваться в существенных количествах. В-четвертых, токсическая нагрузка должна высвобождаться из антитела и поступать в соответствующий клеточный компартмент для проявления своей токсичности. В-пятых, токсическая нагрузка должна обладать достаточно высокой токсичностью или эффективностью, чтобы вызвать разрушение раковых клеток, даже если на раковых клетках экспрессируются потенциально ограниченные количества TSA и, следовательно, интернализуются только ограниченные количества ADC, или если высвобождение токсической нагрузки не осуществляется с достаточно высокой эффективностью при связывании с раковыми клетками или при интернализации в раковую клетку.

Однако в равной степени ADC должны также избегать возникновения побочных эффектов, как правило, опосредованных через (а) целевое связывание в нецелевых тканях вследствие экспрессии TSA на здоровых клетках, (b) нецелевое связывание вследствие связывания антигенов помимо предусмотренного TSA и/или (с) общую токсичность, которая может быть вызвана преждевременным выделением нагрузки лекарственным средством в кровоток, выделенной нагрузкой из лизированных целевых клеток или выделенными метаболитами.

Эти многочисленные ограничения на разработку ADC делают этот тип терапевтических средств одним из наиболее сложных для клинической оценки. Кроме того, из-за высоких затрат на получение и испытание таких биологических продуктов специалист в настоящей области техники не может беспрепятственно систематически испытывать все возможные варианты и комбинации антител, линкеров и токсинов, а также конкретный(е) сайт(ы) конъюгации и соотношение токсина к антителу.

Действительно, в литературе сообщается о множестве возможных нагрузок токсинами и линкеров (см., например, Jain et al., 2015) и, более того, о множестве возможных сайтов конъюгации и способов конъюгации.

В «Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates» (Strop et al., Chemistry & Biology, 20, 2013), авторы сообщают о ADC, конъюгированных трансглутаминазами микроорганизмов. Токсины MMAD, конъюгированные с С-концами их тяжелой и легкой цепей антитела, проявляли сходные эффективности как in vivo, так и in vitro. Дозы, составляющие 10 и 25 мг/кг ADC, являлись одинаково хорошо переносимыми у крыс.

Автор настоящей заявки неожиданно обнаружил, что ADC, несущие токсины антрациклина, связанные в одном или нескольких специфических сайтах, а именно исключительно на С-концах одной или обеих легких цепей антитела (или производного антитела), не только являются терапевтически эффективными, но, что примечательно, являются в высокой степени переносимыми in vivo по сравнению с сопоставимыми ADC с антрациклиновыми токсинами, связанными на альтернативных сайтах, т.е. на С-концах одной или обеих тяжелых цепей антитела или на комбинации С-концов тяжелой и легкой цепей антитела. Такая идея нигде не встречается в международной патентной публикации WO 2016/150564 (содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки), которая относится к токсинам того же класса, но только к их прикреплению к комбинации С-концов тяжелой и легкой цепей антитела.

Идеи, относящиеся к средству прикрепления токсина к С-концам антитела, а именно в международной патентной публикации WO 2014/140317 (содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки), также не содержат ссылки на преимущественное прикрепление токсинов антрациклина к С-концам легких цепей.

Следовательно, целью настоящего изобретения является создание конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), который обладает улучшенными свойствами in vivo и, в частности, обладает высокой переносимостью in vivo. В частности, целью настоящего изобретения является создание конъюгата антитела с лекарственным средством, который лучше переносится in vivo, чем его аналог, содержащий такое же количество тех же токсинов, но прикрепленных к альтернативным С-концам.

Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей такой конъюгат антитела с лекарственным средством.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа получения такого конъюгата антитела с лекарственным средством.

Другой целью настоящего изобретения является получение конъюгата антитела с лекарственным средством для применения при лечении субъекта, который страдает от неопластического заболевания, подвержен риску его развития и/или у которого диагностировано неопластическое заболевание.

Другой целью настоящего изобретения является получение конъюгата антитела с лекарственным средством для применения при лечении субъекта, который страдает от иммунного заболевания или нарушения, подвержен риску его развития и/или у которого диагностировано иммунное заболевание или нарушение.

Эти и другие цели решаются с помощью способов и средств согласно независимым пунктам формулы настоящего изобретения. Зависимые пункты формулы изобретения относятся к конкретным вариантам осуществления.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитела с лекарственным средством, проявляющим улучшенные свойства in vivo, включая в себя улучшенные свойства переносимости in vivo. Настоящее изобретение и общие преимущества его признаков будут подробно обсуждаться ниже.

Описание фигур

На фигуре 1 изображен общий содержащий антрациклин ADC согласно настоящему изобретению, где Ab относится к антителу, или фрагменту или производному, присоединенному на одном или обоих С-концах его константных областей легких цепей к линкеру, содержащему пептидную последовательность, ведущую к токсину - молекуле антрациклина.

На фигуре 2 изображен предпочтительный вариант осуществления содержащего молекулу антрациклина ADC согласно настоящему изобретению, где:

- молекула антрациклина соответствует производному PNU согласно формуле (i)

- L1 представляет собой необязательный линкер, который может представлять собой расщепляемый линкер

- m больше или равно 1 и меньше или равно 11 и предпочтительно m составляет 2

- n больше или равно 1 и меньше или равно 21 и предпочтительно n составляет 1, 2, 3, 4 или 5

- последовательность распознавания сортазы здесь представляет продукт (например, LPXT) специфического расщепления мотива распознавания фермента сортазы (например, LPXTG) (изображен в ориентации от С-конца к N-концу на фигуре), где X представляет собой любую аминокислоту

- последовательность спейсера является необязательной (изображена в ориентации от С-конца к N-концу на фигуре)

- Ab представляет собой антитело, присоединенное на одном или обоих из С-концов его константных областей легкой цепи к последовательности спейсера (если он присутствует) или к последовательности распознавания сортазы (если последовательность спейсера отсутствует).

На фигуре 3 (А) изображено модифицированное пентаглицином производное PNU (G5-PNU), (В) модифицированное триглицином производное PNU (G3-PNU) и (С) модифицированное диглицином производное PNU (G2-PNU), как использовано в примерах.

На фигуре 4 показана кривая зависимости ответа от дозы в анализах уничтожения клеток in vitro на клеточных линиях (A) SKBR3 (HER2-положительный рак молочной железы человека) и (В) Karpas-299 (HER2-отрицательная Т-клеточная лимфома человека) с помощью следующих ADC: Tras-HC-PNU (нацеленный на HER2 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его тяжелых цепей), и Tras-LC-PNU (нацеленный на HER2 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его легких цепей). ADC, содержащие нагрузки антрациклином исключительно на тяжелой цепи или исключительно на легкой цепи, обладают сопоставимой эффективностью in vitro, которая опосредована антигеном.

На фигуре 5 показана кривая зависимости ответа от дозы в анализах уничтожения клеток in vitro на клеточной линии SKOV3 (HER2-положительный рак яичника человека) с помощью следующих ADC: Tras-HC-PNU (нацеленный на HER2 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его тяжелых цепей), и Tras-LC-PNU (нацеленный на HER2 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его легких цепей), Ac10-HC-PNU (нацеленный на CD30 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его тяжелых цепей), и Ac10-LC-PNU (нацеленный на CD30 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его легких цепей). ADC, содержащие нагрузки антрациклином исключительно на тяжелой цепи или исключительно на легкой цепи, обладают сопоставимой эффективностью in vitro, которая опосредована антигеном.

На фигуре 6 показана концентрация IgG и антрациклинового токсина ADC в сыворотке в зависимости от времени у самок мышей CD1, получавших лечение с помощью (A) hu4-2-17-PNU (нацеленный на ROR1 ADC с нагрузками антрациклина, связанными с С-концами как тяжелой, так и легкой цепей), (В) hu4-2-17-HC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC с нагрузками антрациклина, связанными с С-концами его тяжелых цепей), или (С) hu4-2-17-LC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC с нагрузками антрациклина, связанными с С-концами его легких цепей).

На фигуре 7 показан анализ FACS экспрессии ROR1 человека на сконструированных мышиных клетках рака молочной железы ЕМТ-6. Клон 14 ЕМТ-6-ROR1, отобранный для исследований in vivo, анализировали путем окрашивания FACS в отношении экспрессии ROR1 с помощью флуоресцентно меченного клона 2А2 антитела к ROR1. Отрицательный контроль показывает окрашивание тех же клеток флуоресцентно меченным контрольным антителом, совпадающим по изотипу.

На фигуре 8 оказана кривая зависимости ответа от дозы в анализах уничтожения клеток in vitro на (А) избыточно экспрессирующих ROR1 клетках клона 14 ЕМТ6 и (В) CS1-положительных клетках L363 (плазмоклеточный лейкоз человека) с помощью следующих ADC: huERCS-409-LC-PNU (нацеленный на CS1 ADC, содержащий G3-PNU, связанный с С-концами его легких цепей), huERCS-409-HC-PNU (нацеленный на CS1 ADC, содержащий G3-PNU, связанный с С-концами его тяжелых цепей), huERCS-409-LC-PNU (нацеленный на CS1 ADC, содержащий, содержащий G2-PNU, связанный с С-концами его легких цепей), huERCS-409-HC-PNU (нацеленный на CS1 ADC, содержащий G2-PNU, связанный с С-концами его тяжелых цепей), hu4-2-17-LC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC, содержащий G3-PNU, связанный с С-концами его легких цепей), hu4-2-17-HC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC, содержащий G3-PNU, связанный с С-концами его тяжелых цепей), hu4-2-17-LC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC, содержащий G2-PNU, связанный с С-концами его легких цепей), и hu4-2-17-HC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC, содержащий G2-PNU, связанный с С-концами его тяжелых цепей). Эти результаты показывают, что ADC, содержащие нагрузки антрациклином исключительно на тяжелой цепи или исключительно на легкой цепи, обладают сопоставимой эффективностью in vitro, которая опосредована антигеном.

На фигуре 9 показано изменение объема опухоли ЕМТ-6 с избыточной экспрессией ROR1 (клон 14) (по измерениям с помощью штангенциркуля; среднее по группе с планками погрешностей, соответствующими стандартной ошибке среднего) самок мышей BALB/c, которым имплантировали ортотопически опухолевые клетки и которые получали лечение с помощью следующего: контроль - несущая среда, 0,5 мг/кг ADC изотопического контроля (нацеленный на CD30 ADC, содержащий молекулу антрациклина, связанную с обоими С-концами его тяжелых цепей); 0,5 мг/кг hu4-2-17-PNU (нацеленный на ROR1 ADC с нагрузками антрациклина, связанными с С-концами как тяжелой, так и легкой цепей), 1,0 мг/кг hu4-2-17-HC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC с нагрузками антрациклина, связанными с С-концами его тяжелых цепей), и 1,0 мг/кг hu4-2-17-LC-PNU (нацеленный на ROR1 ADC с нагрузками антрациклина на С-концах его легких цепей). При одинаковой нагрузке токсином нацеленные на ROR1 ADC с токсинами только на С-концах тяжелой или только легкой цепей обладают превосходной эффективностью in vivo по сравнению с нацеленными на ROR1 ADC с токсинами на С-концах как тяжелой, так и легкой цепей. Нацеленные на ROR1 ADC с токсинами только на С-концах тяжелых цепей или только легкой цепи характеризуются по существу одинаковой эффективностью in vivo.

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, следующие определения предоставлены, чтобы помочь читателю в практической реализации настоящего изобретения.

Термин «антитело» относится к полипептидной(ым) цепи(ям), которые демонстрируют сильное одновалентное, двухвалентное или поливалентное связывание с данным антигеном, эпитопом или эпитопами. Если не указано иное, антитела можно получить с использованием любой подходящей технологии, например гибридомной технологии, рибосомного дисплея, фагового дисплея, библиотек перестановки генов, полусинтетических или полностью синтетических библиотек или их комбинаций. Антитела согласно настоящему изобретению представляют собой интактные антитела (например, антитела IgG1, приведенные в качестве примеров в настоящем документе). Если не указано иное в настоящем документе, все пептидные последовательности, включая в себя все последовательности антител и антигенсвязывающих фрагментов, указаны в порядке N - >С.

Интактное антитело, как правило, содержит по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи (приблизительно 45-70 кДа) и две легкие (L) цепи (приблизительно 20-25 кДа), связанные между собой дисульфидными связями. Установленные гены иммуноглобулина, кодирующие цепи антитела, включают в себя гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Каждая тяжелая цепь антитела состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. В случае IgG константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител опосредуют связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая в себя различные клетки иммунной системы, экспрессирующие рецепторы FC, и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Моноклональные антитела (mAb) состоят из идентичных (по отношению к их кодированным аминокислотным последовательностям) молекул антител.

Области VH и VL антитела можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, также называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые перемежаются с более консервативными каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Определены местоположения областей CDR и FR и система нумерации, например, система IMGT и система Kabat.

Более того, антитело может относиться к любому изотипу, включая в себя без ограничения IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Таким образом, например, антитело может представлять собой любой IgA, такой как IgA1 или IgA2, или любой IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или синтетический IgG.

Более того, антитело может содержаться в формате производного («производное антитела»), таком как формат иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig) и слияния одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) с IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Одноцепочечный вариабельный фрагмента (scFv) представляет собой одноцепочечное антитело, т.е. он представляет собой полипептид, содержащий домен VH и домен VL в полипептидной связи, как правило, связанные через спейсерный пептид. Слияния scFv осуществляют с N- или С-концом тяжелой цепи или с N-концом легкой цепи. Формат DVD-Ig состоит из Ig-подобного антитела, в котором каждая пара VL/VH несет на N-конце другую пару VL/VH. Две пары VL/VH характеризуются одинаковой или разной специфичностью связывания антигена. Также антитело может присутствовать во фрагменте типичного формата антитела, например, F(ab), F(ab')2 или одноцепочечный FV (scFv). Во избежание неопределенности оба термина «производное антитела» и «фрагмент антитела» относятся к вариантам осуществления, которые сохраняют способность связываться с мишенью, т.е. исключают варианты осуществления, которые больше не способны связывать мишень.

Термины «химерное антитело» относятся к антителу, которое содержит антигенсвязывающие области (VH и VL), нацеленные на антиген одного вида, и константную область, соответствующую последовательности иммуноглобулина другого вида.

«Не относящееся к человеку антитело» относится к антителу, которое не содержит константную область, соответствующую последовательности иммуноглобулина человека.

Термины «гуманизированное антитело» относятся к химерному антителу, которое содержит последовательности, происходящие из человеческих и не относящихся к человеку (например, кроличьих) иммуноглобулинов, так что некоторые или все (например, сохраняются только не относящиеся к человеку последовательности CDR3 легкой и тяжелой цепей как в Rader С. et al., 1998) или по существу все области CDR относятся к человеку по своему происхождению, тогда как по существу все области FR соответствуют областям последовательности иммуноглобулина человека.

Описанное в настоящем документе антитело, или фрагмент или производное, можно получить путем ферментативной или химической модификации интактных антител или синтезировать de novo с использованием методик рекомбинантной ДНК, или идентифицировать с использованием библиотек фагового дисплея. Способы получения этих антител или производных антител хорошо известны в настоящей области техники.

Антитело, или фрагмент или производное согласно настоящему изобретению можно получить с помощью любой подходящей техники, например, с использованием любой подходящей эукариотической или неэукариотической системы экспрессии или бесклеточной системы. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, или фрагмент или производное, получают с использованием системы экспрессии млекопитающего. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, или фрагмент или производное, получают с использованием системы экспрессии насекомого.

«Терапевтически активные соединения» согласно настоящему изобретению относятся к соединениям, оказывающим терапевтически положительный эффект, и включают в себя, в частности, конъюгаты антитела с лекарственным средством. Терапевтически активные соединения часто составляют в виде композиции, например, в физиологически приемлемом буфере.

«Переносимость» относится к степени, в которой неблагоприятные эффекты введенной композиции (содержащей или состоящей из терапевтически активного соединения) могут переноситься человеком или другим животным, например мышью, крысой, кроликом, обезьяной и т.д., или группой людей или других животных. Согласно одному варианту осуществления переносимость можно определить относительно показателя смертности.

«Неблагоприятные эффекты или явления» представляют собой нежелательные эффекты или явления, возникающие в результате введения терапевтически активного соединения. В частности, неблагоприятные эффекты включают в себя потерю массы тела, в частности потерю массы тела, превышающую 10%, 15% или 20% от исходной массы тела в день лечения терапевтически активным соединением. В частности, неблагоприятные эффекты включают в себя смерть (в моделях с использованием животных, будь то в естественных условиях или после выполнения критериев эвтаназии). В частности, неблагоприятные эффекты, связанные со смертью, следует оценивать на моделях с использованием животных (например, группах мышей, крыс и т.д.) после однократной или многократной (постоянной или повышающейся) дозы терапевтически активного соединения по сравнению с альтернативным терапевтически активным соединением и/или с контролем - буфером. В частности, переносимость следует оценивать на моделях с использованием животных в отношении максимально переносимой дозы, т.е. в отношении количества смертей в группах животных, получавших лечение с помощью терапевтически активного соединения, причем данные группы лечили данной дозой соединения в диапазоне доз.

Используемые в настоящем документе термины «лечить», «осуществлять лечение», «лечение» и «терапевтически эффективный» не обязательно означают 100% или полное лечение. Скорее, существуют различные степени лечения, признанные специалистом в настоящей области техники как характеризующиеся потенциальным положительным эффектом или терапевтическим эффектом. В этом отношении заявляемый способ может обеспечить любое количество любого уровня лечения. Кроме того, лечение, обеспечиваемое способом согласно настоящему изобретению, может включать в себя лечение одного или нескольких состояний или симптомов заболевания, подлежащего лечению.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными элементами описанных устройств или стадиями процесса описанных способов, поскольку такие устройства и способы варьируются. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя определяемые объекты единственного и/или множественного числа, если контекст явно не предписывает иное. Кроме того, следует понимать, что, если заданы диапазоны параметров, которые ограничены числовыми значениями, считается, что диапазоны включают в себя эти ограничивающие значения.

Кроме того, следует понимать, что варианты осуществления, раскрытые в настоящем документе, не должны пониматься как отдельные варианты осуществления, которые не относятся друг к другу. Подразумевается, что признаки, обсуждаемые в отношении одного варианта осуществления, раскрыты также в связи с другими вариантами осуществления, показанными в настоящем документе. Если в одном случае конкретный признак не раскрыт в одном варианте осуществления, но раскрыт в другом, специалист поймет, что это не обязательно означает, что указанный признак не предназначен для раскрытия в указанном другом варианте осуществления. Специалисту будет понятно, что суть настоящей заявки состоит в том, чтобы раскрыть указанный признак и в отношении другого варианта осуществления, но просто для целей ясности и для того, чтобы объем настоящего описания изобретения не выходил за разумные рамки, это не было сделано.

Более того, содержание документов предшествующего уровня техники, упомянутых в настоящем документе, включено посредством ссылки. Это относится, в частности, к документам предшествующего уровня техники, в которых раскрыты стандартные или рутинные способы. В этом случае включение путем ссылки имеет целью обеспечить достаточное раскрытие информации и избежать длительных повторений.

Конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC)

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

причем молекула(ы) антрациклина исключительно связана(ы) с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

причем малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным.

"Малая молекула на основе антрациклина" в настоящем документе также называется "молекула антрациклина".

Относительно ADC согласно настоящему изобретению подразумевается, что никакие молекулы антрациклина ковалентно не присоединяются к антителу в сайтах, отличных от одного или обоих С-концов константных областей легких цепей антитела, фрагмента или производного.

Наглядное изображение ADC согласно настоящему изобретению представлено на фигуре 1.

Аспекты настоящего изобретения, относящиеся к антителу

Антитело согласно настоящему изобретению может относиться к любому изотипу, включая в себя без ограничения IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Таким образом, например, антитело может представлять собой любой IgA, такой как IgA1 или IgA2, или любой IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или синтетический IgG.

Более того, антитело может содержаться в форматах производных ("производное антитела"), таких как формат иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами и слияния одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) с IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Согласно предпочтительному варианту осуществления производное антитела относится к формату DVD-Ig.

Антитело, или фрагмент или производное, могут представлять собой одновалентное и двухвалентное и мультивалентное антитело.

Антитело, или фрагмент или производное, могут являться моно- или мультиспецифическими. Термин «мультиспецифический» означает антитело, или фрагмент или производное, которое обладает специфичностью к двум или более различным эпитопам данного антигена или обладает специфичностью по меньшей мере к двум различным антигенам.

Согласно предпочтительному варианту осуществления антитело представляет собой антитело IgG.

Антитело, или фрагмент или производное, нацелено (или связывается с) любым антигеном, но преимущественно нацелено на антиген, который является опухолеспецифическим или который экспрессируется в повышенной степени на опухолевой ткани по сравнению со здоровой тканью.

Используемая в настоящем документе фраза "экспрессируемый в повышенной степени" означает экспрессируемый по меньшей мере на 10% выше, предпочтительно по меньшей мере на 20% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 30% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 40% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 50% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 60% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 70% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 80% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 90% выше и даже более предпочтительно по меньшей мере на 100% выше. Степень экспрессии можно определить с помощью способов в настоящей области техники, известных специалисту, таких как ОТ-ПЦР или иммуногистохимия.

В частности, антиген представляет собой антиген человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления антиген представляет собой ROR1, ROR2, CS1, мезотелин или HER2 и более предпочтительно ROR1, CS1 или HER2 и даже более предпочтительно представляет собой ROR1 или HER2. В частности, антиген может представлять собой ROR1 человека (на основании последовательности NP_005003 из GenBank), ROR2 человека (на основании последовательности NP_004551.2 из GenBank), CS1 человека (на основании последовательности NM_021181.3 из GenBank), мезотелин человека (на основании последовательности NP_037536 из GenBank) или HER2 человека (на основании последовательности NP_004439 из GenBank). Согласно одному варианту осуществления антитело, или фрагмент или производное, не связывается с CS1 человека и/или мыши, и согласно этому варианту осуществления предпочтительно антитело, или фрагмент или производное, не связывается с CS1 человека.

Согласно предпочтительному варианту осуществления антитело, или фрагмент или производное, содержит CDR антител или производных антител, представленных в примерах. В частности, антитело, или фрагмент или производное, может содержать CDR трастузумаба (на основании нумерации согласно Kabat с использованием программного обеспечения abYsis):

В частности, антитело, или фрагмент или производное, может содержать CDR hu4-2-17 (на основании нумерации согласно Kabat):

В частности, антитело, или фрагмент или производное, может содержать CDR huERCS-409 (на основании нумерации согласно Kabat):

Согласно предпочтительному варианту осуществления антитело, или фрагмент или производные, содержат вариабельные домены антител, представленных в примерах. В частности, антитело, или фрагмент или производное, может содержать вариабельные домены трастузумаба (вариабельные домены согласно SEQ ID NO. 1/2 согласно таблице 2). В частности, антитело, или фрагмент или производное, может содержать вариабельные домены hu4-2-17 (вариабельные домены согласно SEQ ID NO. 4/5 согласно таблице 2). В частности, антитело, или фрагмент или производное, может содержать вариабельные домены huERCS-409 (вариабельные домены согласно SEQ ID NO. 7/8 согласно таблице 2).

Аспекты настоящего изобретения, относящиеся к токсину

ADC согласно настоящему изобретению содержит одну или две малые молекулы на основе антрациклина ("молекула антрациклина"), причем каждая молекула антрациклина соединена, посредством линкера, содержащего пептидную последовательность, с указанным антителом или производным антитела на С-конце константной области легкой цепи.

Антрациклины представляют собой чрезвычайно интересный класс интеркалирующих ДНК токсинов для использования в качестве нагрузок для ADC из-за их доказанной клинической валидации в качестве химиотерапевтических лекарственных средств при лечении рака (Minotti, 2004). Антрациклины представляют собой поликетиды красного цвета с высокой противоопухолевой активностью, первоначально полученные из видов Streptomyces. Многие производные были описаны в течение последних 40 лет, включая в себя те, которые обычно используют в качестве химиотерапевтического лекарственного средства при различных солидных и гематологических злокачественных заболеваниях, например доксорубицин (также называемый адриамицином), даунорубицин, эпирубицин, идарубицин, пирарубицин, зорубицин, акларубицин, каминомицин и валрубицин. Новое антрациклиновое производное, названное PNU-159682, было описано как метаболит неморубицина (Quintieri, 2005), который, как сообщалось, проявляет чрезвычайно высокую активность в отношении уничтожения клеток in vitro в пико- и фемтомолярном диапазоне с одной клеточной линией рака яичника (А2780) и одной клеточной линией рака молочной железы (MCF7) (международная патентная публикация WO 2012/073217).

Согласно одному варианту осуществления ADC согласно настоящему изобретению содержит одну молекулу антрациклина, которая связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, или фрагментом или производным, на С-конце константной области легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления ADC содержит две молекулы антрациклина, каждая из которых связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, или фрагментом или производным, на каждом из двух С-концов константных областей легких цепей.

Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере одна малая молекула на основе антрациклина не представляет собой доксорубицин.

Согласно одному варианту осуществления малая молекула на основе антрациклина выбрана из PNU-159682, или из его производных, содержащих структуру согласно формуле (i), или его производных, содержащих структуру согласно формуле (i) ниже. Согласно предпочтительному варианту осуществления токсин, присоединенный к линкеру по его волнистой линии, соответствует формуле (i), как описано в международной патентной публикации WO 2016/102679, которая включена в настоящий документ посредством ссылки:

формула (i)

PNU-159682, как описано в Quintieri et al. (2005).

Токсин, который не является молекулой антрациклина, может представлять собой молекулу растения, грибка или бактерии. Согласно некоторым вариантам осуществления токсин, который не является молекулой антрациклина, представляет собой низкомолекулярный клеточный токсин, пептидный токсин или белковый токсин. Многие конкретные примеры этих токсинов хорошо известны в настоящей области техники. См., например, Dyba et al., Curr. Pharm. Des. 10:2311-34, 2004; Kuyucaket al., Future Med. Chem. 6:1645-58, 2014; Beraud et al., Inflamm. Allergy Drug Targets. 10:322-42, 2011; и Middlebrook et al., Microbiol. Rev. 48:199-221, 1984. Согласно некоторым вариантам осуществления токсин, который не является молекулой антрациклина, может представлять собой майтансиноид (например, майтансинол или мейтансиноид DM1), таксан, калихеамицин, цемадотин, монометилауристатин (например, монометилауристатин Е или монометилауристатин F) или пирролбензодиазепин (PBD). Токсин, который не является молекулой антрациклина, также может представлять собой винкристин и преднизон. Согласно различным вариантам осуществления токсин, который не является молекулой антрациклина, может представлять собой антиметаболит (например, антифолат, такой как метотрексат, фтор пиримидин, такой как 5-фторурацил, цитозина арабинозид или аналог пурина или аденозина); митомицин-С, дактиномицин или митрамицин или другие неантрациклиновые интеркалирующие средства, такие как пирролбензодиазепин; ДНК-реактивное средство, такой как калихеамицины, тианцимицины и другие ендиины; производное платины (например, цисплатин или карбоплатин); алкилирующее средство (например, азотистый иприт, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, циклофосфамид, ифосфамид, нитрозомочевины или тиотепа); ингибитор РНК-полимеразы, такой как α-аманитин; антимитотическое средство (например, алкалоид барвинка, такой как винкристин, или таксоид, такой как паклитаксел или доцетаксел); ингибитор топоизомеразы (например, этопозид, тенипозид, амсакрин, топотекан); ингибитор клеточного цикла (например, флавопиридол); или микротрубочковое средство (например, эпотилон, тубулизин, пре-тубулизин, аналог дискодермолида или аналог элеутеробина). Токсин, который не является молекулой антрациклина, может представлять собой ингибитор протеосом, ингибитор топоизомеразы, такой как бортезомиб, амсакрин, этопозид, этопозид фосфат, тенипозид или доксорубицин или радиоактивный изотоп, включая в себя йод (131I), иттрий (90Y), лютеций (177Lu), актиний (225Ас), празеодим, астатин (At), рений (Re), висмут (Bi или Bi) и родий (Rh).

Токсин, который не является молекулой антрациклина, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из следующего:

- майтансиноиды, включая в себя майтансин,

- ауристатины, включая в себя монометил ауристатин ММАЕ и монометил ауристатин MMAF,

- калихеамицины,

- тубулизины,

- дуокармицины,

- радиоактивные изотопы,

- липосомы, содержащие нагрузку токсином,

- белковые токсины,

- таксаны и/или

- пирролбензодиазепины.

Кроме того, ADC может содержать метку или краситель, особенно для обеспечения возможности визуализации. Эта метка или краситель может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из следующего: флуоресцентная метка (включая в себя флуоресцентный краситель или флуоресцентный белок), хромофорная метка, радиоизотопная метка, содержащая йод (например, 125I), галлий (67Ga), индий (111In), технеций (99mTc), фосфор (32Р), углерод (14С), тритий (3Н), другой радиоактивный изотоп (например, радиоактивный ион) и/или белковая метка, такая как авидин или стрептавидин.

Аспекты настоящего изобретения, относящиеся к линкеру

Настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

где молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

где малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанная пептидная последовательность указанного линкера содержит или состоит из пептидного мотива, являющегося результатом специфического расщепления мотива распознавания фермента сортазы, причем указанный мотив распознавания фермента сортазы предпочтительно содержит пентапептид.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный мотив распознавания фермента сортазы выбран из группы, состоящей из: -LPXTG-, -LPXAG-, -LPXSG-, -LAXTG-, -LPXTG-, -LPXTA- и -NPQTG-, где X представляет собой любую аминокислоту, и предпочтительно X представляет собой Е или Q.

Как раскрыто в другом месте в настоящем документе, а также в международной патентной публикации WO 2014140317, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, сортазы (также называемые сортазными транспептидазами) образуют группу прокариотических ферментов, которые модифицируют поверхностные белки путем распознавания и расщепления специфического сигнала сортировки, содержащего конкретный пептидный мотив. Этот пептидный мотив также называют в настоящем документе «мотивом распознавания фермента сортазы», «мотивом распознавания сортазы», «меткой сортазы» или «меткой распознавания сортазы». Как правило, данный фермент сортаза характеризуется одним или несколькими мотивами распознавания фермента сортазы, которые распознаются.

Ферменты сортазы могут встречаться в природе или подвергаться генной инженерии (Doerr et al., 2014). Классы сортазы и их соответствующие последовательности распознавания в общем обсуждаются в Spirig et al. (2011). Сконструированные сортазы, включая в себя А 2А-9 и A 4S-9 из Staphylococcus aureus, описаны в Dorr et al. (2014) и в Chenetal. (2011).

В качестве основных сведений и в качестве примера общей концепции транспептидации сортазы, например, сортаза А использует олигоглициновую последовательность в качестве нуклеофила, чтобы катализировать транспептидацию, посредством которой концевая аминогруппа олигоглицина осуществляет нуклеофильную атаку на пептидную связь, соединяющую два последних С-концевых остатка последовательности распознавания сортазы. Это приводит к разрыву этой пептидной связи и образованию новой пептидной связи между предпоследним с С-конца остатком сортазной метки и N-концевым глицином олигоглицинового пептида, т.е. приводит к транспептидации.

В следующей таблице приведены неограничивающие примеры мотивов распознавания фермента сортазы и полученных пептидных мотивов после специфического расщепления, причем последние содержатся в линкере ADC (в ориентации от N-конца к С-концу):

До опосредованной сортазой конъюгации мотив распознавания фермента сортазы на своем С-конце может, помимо этого, нести другие метки, такие как His-метки, Мус-метки или Strep-метки (см. фиг. 4а международной патентной публикации WO 2014140317, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Тем не менее, поскольку пептидная связь между 4-й и 5-й аминокислотами мотива распознавания фермента сортазы разрывается при опосредованной сортазой конъюгации, эти дополнительные метки не появляются в конъюгированном продукте.

Мотивы распознавания фермента сортазы могут быть слиты с С-концом(ами) легкой цепи антитела посредством генетического слияния и коэкспрессированы с ним. Мотив распознавания фермента сортазы может быть присоединен к последней встречающейся в природе С-концевой аминокислоте одной или обеих легких цепей иммуноглобулина, которая в случае легкой цепи каппа иммуноглобулина человека представляет собой С-концевой остаток цистеина. Упомянутое слияние или присоединение можно осуществить прямо или косвенно с помощью дополнительных линкерных элементов, описанных в другом месте в настоящем документе.

Ранее авторы настоящего изобретения описали, что в некоторых случаях (например, на С-конце легких цепей каппа Ig, см. Beerli et al. (2015)) благоприятно добавлять дополнительные аминокислоты (в настоящем документе называемые «последовательностью спейсера») между С-концом связывающего белка и мотивом распознавания фермента сортазы. Было показано, что это улучшает эффективность опосредованной ферментом сортазой конъюгации нагрузок со связывающим белком. В случае легких цепей каппа Ig было обнаружено, что добавление 5 аминокислот между последней С-концевой аминокислотой цистеином легкой цепи каппа Ig и последовательностью распознавания сортазы улучшало кинетику конъюгации (см. Beerli et al. (2015)). Следовательно, это представляет собой другой предпочтительный вариант осуществления, в котором необязательно ≥1 и ≤11 аминокислот («последовательность спейсера») добавляют между последней С-концевой аминокислотой антитела и последовательностью распознавания сортазы. Согласно предпочтительному варианту осуществления пептидную последовательность GqS, где q предпочтительно составляет от 1 до 10 и более предпочтительно 4 или 5, добавляют между последней С-концевой аминокислотой легкой цепи и мотивом распознавания фермента сортазы.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанная пептидная последовательность указанного линкера содержит или состоит из олигоглициновой последовательности ("метка"), обозначенной Gn или Glyn, где n составляет от 1 до 21 и предпочтительно n составляет 1, 2, 3, 4 или 5.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанная пептидная последовательность указанного линкера содержит или состоит из пептидного мотива, являющегося результатом специфического расщепления мотива распознавания фермента сортазы, и олигоглициновой последовательности, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из следующего: -LPXTGn-, -LPXAGn-, -LPXSGn-, -LAXTGn-, -LPXTGn- и -NPQTGn-, где X представляет собой любую аминокислоту, и предпочтительно X представляет собой Е или Q, и где n составляет от 1 до 21 и предпочтительно n составляет 1, 2, 3, 4 или 5. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанная пептидная последовательность указанного линкера содержит или состоит из -LPXTGn-, где X представляет собой любую аминокислоту, и предпочтительно X представляет собой Е или Q, и где n составляет от 1 до 21 и предпочтительно n составляет 1, 2, 3, 4 или 5.

Согласно одному варианту осуществления, где молекула антрациклина характеризуется формулой (i), предпочтительно, чтобы линкер дополнительно содержал алкилдиаминогруппу в форме NH2-(CH2)m-NH2, где m≥1 и ≤11, предпочтительно m=2. Согласно этому варианту осуществления предпочтительно, чтобы одна аминогруппа в NH2-(CH2)m-NH2 была непосредственно связана по волнистой линии формулы (i) с образованием амидной связи.

Согласно другому варианту осуществления, где молекула антрациклина характеризуется формулой (i), и линкер дополнительно содержит алкилдиаминогруппу в форме NH2-(CH2)m-NH2, где m≥1 и ≤11, предпочтительно m=2, одна аминогруппа может быть связана с волнистой линией формулы (i) через линкерный элемент L1.

Более того, предпочтительно, чтобы вторая аминогруппа указанной алкилдиаминогруппы была связана с олигопептидным линкером, который более предпочтительно представляет собой олигоглицин (Glyn). Предпочтительно олигоглицин характеризуется длиной от 1 до 21 остатка глицина (т.е. n составляет от 1 до 21), предпочтительно с длиной, составляющей 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот.

Наглядные изображения некоторых неограничивающих вариантов осуществления ADC согласно настоящему изобретению приведены на фигуре 2.

Согласно другому варианту осуществления линкер может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный расщепляемый или нерасщепляемый линкер, который предпочтительно выбирают из группы, состоящей из следующего: гидразиновый линкер, тиомочевинный линкер, саморасщепляющийся линкер, сукцинимидил-транс-4-(малеимидилметил)циклогексан-1-карбоксилатный (SMCC) линкер, дисульфидный линкер, селеноэфирный линкер, амидный линкер, тиоэфирный линкер и/или малеимидный линкер.

Специалисту понятно, что подходящими могут быть дополнительные линкеры. Такие линкеры могут являться нерасщепляемыми или могут расщепляться за счет изменений рН, окислительно-восстановительного потенциала или специфических внутриклеточных/внеклеточных ферментов. Расщепляемые олигопептидные линкеры включают в себя расщепляемые протеазой или матриксной металлопротеазой линкеры. Понятно, что линкер может содержать комбинации вышеуказанного. Например, линкер может представлять собой валин-цитрулиновый РАВ-линкер.

Аспекты настоящего изобретения, относящиеся к отношению лекарственного средства к антителу (DAR)

Согласно предпочтительному варианту осуществления ADC согласно настоящему изобретению, разработанный для того, чтобы молекула антрациклина была связана с каждым С-концом константной области легкой цепи, характеризуется стехиометрическим соотношением между антителом и нагрузкой, составляющим любое значение от ≥1 до ≤2, предпочтительно от ≥1,75 до ≤2, более предпочтительно от ≥1,9 до ≤2. Это соотношение может также называться отношением лекарственное средство к антителу («DAR»). Способы определения DAR хорошо известны специалисту и включают в себя способы с использованием обращенно-фазовой хроматографии или ВЭЖХ-МС. Следует понимать, что опосредованная сортазой реакция транспептидации не является завершенной на 100%, что приводит к получению препаратов ADC с описанным DAR.

Согласно вариантам осуществления, где ADC содержит дополнительные неантрациклиновые токсины, DAR может представлять собой любое значение от ≥1 до ≤4.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления ADC согласно настоящему изобретению, разработанный для того, чтобы молекула антрациклина была связана с одним С-концом константной области легкой цепи, характеризуется стехиометрическим соотношением между антителом и нагрузкой, составляющим любое значение от ≥0,5 до ≤1, и предпочтительно от ≥0,75 до ≤1, более предпочтительно от ≥0,9 до ≤1.

Аспекты настоящего изобретения, относящиеся к функциональным свойствам

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

где молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

где малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным,

где указанное ADC проявляет улучшенную переносимость in vivo, предпочтительно относительно сопоставимых ADC с тем же количеством и типом молекулы антрациклина, но в которых молекула(ы) антрациклина связана(ы) с С-концом константной области тяжелой цепи или со смесью С-концов константных областей как тяжелой, и так легкой цепей.

Относительно этого варианта осуществления предпочтительно, чтобы переносимость оценивали относительно уровня смертности для данной дозы в течение периода от 7 до 14 дней на модели с использованием мышей. Относительно этого варианта осуществления предпочтительно, чтобы переносимость оценивали с использованием дозы ADC в диапазоне от 2,5 до 40 мг/кг.

В то время как сопоставимые ADC показали очень сходную активность по уничтожению клеток in vitro, неожиданно, ADC с антрациклином, связанным исключительно с легкой цепью антитела, не показали смертности in vivo при двух протестированных эквивалентных уровнях дозы по сравнению со сравнимыми ADC со связью либо исключительно с тяжелой цепью, либо с тяжелой и легкой цепями, причем более низкая доза ведет к смерти каждой 1 из 5 мышей, более высокая ведет к смерти 5 из 5 мышей (см. таблицу 5). Аналогичным образом, в отдельном эксперименте наблюдали переносимость ADC с антрациклином, связанным исключительно с легкой цепью, при значительно более высоких дозах по сравнению с ADC с токсином, связанным только с тяжелой цепью или с тяжелой и легкой цепями. Очевидно, что более высокая переносимость как показатель количества, которое можно безопасно вводить пациенту, является благоприятной для фармацевтических средств.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

где молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

где малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным,

где указанный ADC обладает более высоким терапевтическим индексом in vivo по сравнению с сопоставимыми ADC с таким же количеством и типом молекулы антрациклина, но в которых молекула(ы) антрациклина связана(ы) с С-концом константной области тяжелой цепи или со смесью С-концов константной области как тяжелой, так и легкой цепей. Терапевтический индекс представляет собой сравнение количества терапевтического средства, которое вызывает терапевтический эффект, с количеством, которое вызывает токсичность. Настоящее изобретение неожиданно показало, что одинаковое количество токсина, связанного с С-концами легких цепей, по сравнению с С-концами тяжелых цепей при той же дозе приводит к более высокой эффективности in vivo (см. фиг. 9).

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

где молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

где малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным,

где для той же терапевтической эффективности указанный ADC требует пониженной частоты введения дозы и/или более низкого количества дозы in vivo, предпочтительно относительно сопоставимых ADC с тем же количеством и типом молекулы антрациклина, но в которых молекула(ы) антрациклина связана(ы) с С-концом константной области тяжелой цепи или смесью С-концов константных областей как тяжелой, так и легкой цепей.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

где молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

где малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным,

где указанный ADC обладает пониженной гидрофобностью, предпочтительно по сравнению с сопоставимыми ADC с тем же количеством и типом молекулы антрациклина, но в которых молекула(ы) антрациклина связана(ы) с С-концом константной области тяжелой цепи или со смесью С-концов константных областей как тяжелой, так и легкой цепей. Такое снижение гидрофобности может улучшить обращение с ADC и состав ADC.

Фармацевтические композиции

Согласно некоторым связанным аспектам настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат терапевтически эффективное количество описанного в настоящем документе конъюгата антитела с лекарственным средством и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей, других вспомогательных веществ или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения человеку или субъекту в ветеринарии (например, физиологически приемлемый носитель или фармакологически приемлемый носитель). Термин «носитель» обозначает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым активный ингредиент объединен для облегчения использования активного ингредиента, например, введения активного ингредиента субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель можно смешивать с одним или несколькими активными компонентами, например, с гибридной молекулой, и друг с другом, когда в композиции присутствует более одного фармацевтически приемлемого носителя, таким образом, чтобы по существу не ухудшить требуемую фармацевтическую эффективность. Фармацевтически приемлемые материалы, как правило, можно вводить субъекту, например пациенту, без значительных нежелательных физиологических эффектов, таких как тошнота, головокружение, сыпь или расстройство желудка. Например, желательно, чтобы композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель, не была иммуногенной при введении пациенту - человеку в терапевтических целях.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать подходящие буферные средства, включая в себя, например, уксусную кислоту в соли, лимонную кислоту в соли, борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли. Композиции могут также необязательно содержать подходящие консерванты, такие как хлорид бензалкония, хлорбутанол, парабены и тиомерсал. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в единичной лекарственной форме и могут быть получены любым подходящим способом, многие из которых хорошо известны в области фармации. Такие способы включают в себя стадию объединения антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению с носителем, который составляет один или несколько дополнительных ингредиентов. Как правило, композицию получают путем равномерного и тесного объединения активного средства с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или обоими, и затем, если необходимо, придания формы продукту.

Композиция, подходящая для парентерального введения, как правило, содержит стерильный водный препарат композиции согласно настоящему изобретению, который предпочтительно является изотоническим по отношению к крови реципиента. Этот водный препарат может быть составлен в соответствии с известными способами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств. Стерильный инъекционный препарат также может представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых несущих сред и растворителей, которые можно использовать, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, такое как синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, можно использовать при получении инъекционных препаратов. Составы носителей, подходящие для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и т.д. введения, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Получение фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению и их различные пути введения можно осуществлять в соответствии со способами, хорошо известными в настоящей области техники. Системы доставки, применимые в контексте настоящего изобретения, включают в себя системы с постоянным высвобождением, с отсроченным высвобождением и с пролонгированным высвобождением, так что доставка композиции согласно настоящему изобретению происходит до и в течение достаточного времени, чтобы вызвать сенсибилизацию участка, подлежащего лечению. Композицию согласно настоящему изобретению можно использовать в сочетании с другими терапевтическими средствами или видами терапии. Такие системы могут избежать повторных введений композиции согласно настоящему изобретению, увеличивая тем самым удобство для субъекта и лечащего врача, и могут являться особенно подходящими для определенных композиций согласно настоящему изобретению.

Многие типы систем доставки с высвобождением доступны и известны специалистам в настоящей области техники. Подходящие системы доставки с высвобождением включают в себя системы на полимерной основе, такие как поли(лактид-гликолид), сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы вышеуказанных полимеров, содержащие лекарственные средства, описаны, например, в патенте США №5075109. Системы доставки также включают в себя неполимерные системы, которые представляют собой липиды, включая в себя стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; гидрогелевые системы высвобождения; силастические системы; системы на основе пептидов; восковые покрытия; прессованные таблетки с использованием общепринятых связующих и вспомогательных веществ; частично слитые имплантаты; и тому подобное. Конкретные примеры включают в себя без ограничения следующее: (а) эрозионные системы, в которых активная композиция содержится в форме в пределах матрицы, такие как описано в патентах США №№4452775, 4667014, 4748034 и 5239660 и (b) диффузионные системы в причем активный компонент проникает с контролируемой скоростью из полимера, такие как описано в патентах США №№3832253 и 3854480. Кроме того, можно использовать системы доставки в аппаратах на основе насоса, некоторые из которых адаптированы для имплантации.

Как правило, ADC или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению соответствующим образом упакованы, например, во флакон, пакет, ампулу и/или в любой контейнер, подходящий для терапевтического способа. Компоненты могут быть предоставлены в виде концентратов (включая в себя лиофилизированные композиции), которые могут быть дополнительно разбавлены перед использованием, или они могут быть предоставлены в концентрации использования. Для применения ADC согласно настоящему изобретению in vivo единичные дозы могут быть предоставлены в стерилизованных контейнерах, содержащих желаемое количество и концентрацию компонентов.

ADC, полученные с помощью средств и способов получения ADC

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к конъюгату антитела с лекарственным средством (ADC), содержащему следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один С-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

где молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с С-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

где малая молекула на основе антрациклина связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным.

Согласно одному варианту осуществления конъюгат антитела с лекарственным средством согласно настоящему изобретению можно получить посредством сайт-специфической опосредованной ферментом сортазой конъюгации следующего:

a) антитело, или фрагмент или производное, несущие мотив распознавания фермента сортазы на С-концах легких цепей, и

b) одна или несколько малых молекул на основе антрациклина, каждая из которых несет олигоглициновую метку.

Настоящее изобретение также относится к способу получения ADC согласно настоящему изобретению, причем способ предусматривает следующие стадии:

a) получение антитела или производного антитела, несущих мотив распознавания фермента сортазы на С-конце(ах) легкой цепи,

b) получение одной или нескольких малых молекул на основе антрациклина, каждая из которых несет олигоглициновую метку, и

c) конъюгирование антитела или производного антитела и одной или нескольких малых молекул на основе антрациклина посредством опосредованной сортазой конъюгации с использованием фермента сортазы, который распознает указанный мотив распознавания фермента сортазы.

Предпочтительно, согласно всем вариантам осуществления, обсуждаемым в настоящем документе, мотив распознавания фермента сортазы представлен исключительно на С-конце(ах) легкой цепи.

Важно понимать, что согласно всем вариантам осуществления, обсуждаемым в настоящем документе (где используют сортазу A Streptococcus pyogenes), олигоглицин Glyn можно необязательно заменить олиго-аланином Alan.

Все ранее упомянутые ограничения в отношении антитела, или фрагмента или производного, малых молекул на основе антрациклина, линкера и сортазы, а также любые другие ограничения, указанные в настоящем документе, представляют собой предпочтительные варианты осуществления вариантов осуществления, относящихся к ADC согласно настоящему изобретению, который получают посредством сайт-специфической опосредованной ферментом сортазой конъюгации, и к способам получения ADC.

Медицинские применения и способы лечения

Настоящее изобретение дополнительно относится к ADC, как описано в настоящем документе, для применения при лечении субъекта, который страдает от неопластического заболевания, подвержен риску его развития и/или у которого диагностировано неопластическое заболевание.

Настоящее изобретение также относится к ADC, как описано в настоящем документе, для применения при лечении субъекта, который страдает от иммунного заболевания или нарушения, подвержен риску его развития и/или у которого диагностировано иммунное заболевание или нарушение. Альтернативно, предусмотрен способ лечения пациента, страдающего от неопластического заболевания, подверженного риску его развития и/или у которого диагностировано неопластическое заболевание, причем способ предусматривает введение конъюгата антитела с лекарственным средством в соответствии с приведенным выше описанием в терапевтически эффективном количестве или дозировке.

Используемые в настоящем документе термины «осуществление лечения» или «лечение» не обязательно означают 100% или полное лечение. Скорее, существуют различные степени лечения, признанные специалистом в настоящей области техники как характеризующиеся потенциальным положительным эффектом или терапевтическим эффектом. В этом отношении заявляемый способ может обеспечить любое количество любого уровня лечения. Кроме того, лечение, обеспечиваемое способом согласно настоящему изобретению, может включать в себя лечение одного или нескольких состояний или симптомов заболевания, подлежащего лечению. В частности, лечение можно вводить в виде внутривенной инфузии.

Согласно одному варианту осуществления ADC вводят в виде монотерапии. Согласно альтернативному варианту осуществления ADC вводят вместе или параллельно с дополнительными терапевтическими средствами.

В частности, ADC можно вводить в дозировке, составляющей приблизительно 0,1-20 мг/кг.

Термин «субъект» относится к человеку и животным, не являющимся человеком (особенно млекопитающим, не являющимся человеком), и предпочтительно к животным - людям.

ПРИМЕРЫ

Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано и подробно описано в графических материалах и в предшествующем описании, такие иллюстрацию и описание следует рассматривать как иллюстративные или примерные, а не ограничивающие; настоящее изобретение не ограничено раскрытыми вариантами осуществления. Специалистам в настоящей области техники могут быть поняты, и они могут осуществить другие вариации раскрытых вариантов осуществления на основе изучения графических материалов, настоящего раскрытия и прилагаемой формулы изобретения. В формуле изобретения слово «содержащий» не исключает другие элементы или стадии, а формы единственного числа не исключают множества. Сам факт того, что определенные параметры изложены во взаимно различных зависимых пунктах формулы изобретения, не означает, что комбинация этих параметров не может быть использована для получения преимущества. Любые ссылочные обозначения в формуле изобретения не должны рассматриваться как ограничивающие объем.

Все аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем документе, показаны от N-конца к С-концу (за исключением фиг. 1, где ориентация изображена от С-конца к N-концу); все последовательности нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем документе, показаны в ориентации 5' - >3'.

Пример 1: Экспрессия и очистка антител

Экспрессионные векторы: последовательности Fab, определенные выше для связывания CS1 человека, оптимизировали по кодонам для экспрессии человека; вариабельные домены синтезировали в виде ДНК с помощью GenScript (Пискатауэй, США) и включали в экспрессионный вектор, содержащий подходящие сайты рестрикции и соответствующий константный домен (согласно Waldmeier et al., 2016, для экспрессии в клетках HEK293T и согласно Beerli et al., 2015, для экспрессии в клетках СНО).

Экспрессия в HEK и очистка: Экспрессионные векторы трансфицировали в клетки HEK293T с использованием реагента Lipofectamine® LTX с реагентом PLUS ™ (Thermo Fisher Scientific, Райнах, Швейцария, 15388100); после 1-дневной инкубации (37°С, 5% СО2, среда для выращивания: модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с L-глутамином с 10% (об./об.) фетальной телячьей сывороткой (FCS), 100 МЕ/мл реагента пенициллин-стрептомицин-фунгизон и 2 мМ L-глутамина (все Bioconcept, Альшвиль, Швейцария)), клетки размножали в условиях селекции (2 мкг/мл пуромицина (Sigma-Aldrich, Buchs SG, Швейцария), P8833-25 мг исходный раствор в концентрации, составляющей 2 мг/мл)). Клетки разделяли и дополнительно размножали (37°С, 5% СО2); после достижения конфлюентности чашки для тканевых культур покрывали 20 мкг/мл поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, P1524) в течение 2 часов при 37°С и дважды промывали PBS. Затем клетки трипсинизировали и разделяли 1:3 на планшеты, покрытые поли-L-лизином. После достижения конфлюентности клетки промывали PBS с последующей заменой среды на среду для продуцирования (DMEM/F-12, Gibco/Thermo Fisher Scientific, 31330-03) с добавлением 1 мкг/мл пуромицина (Sigma, Р8833), 100 МЕ/мл реагента пенициллин-стрептомицин-фунгизон (Bioconcept), 161 мкг/мл N-ацетил-L-цистеина (Sigma-Aldrich, А8199) и 10 мкг/мл восстановленного L-глутатиона (Sigma-Aldrich, G6529). Супернатант, собираемый раз в две недели и отфильтрованный (0,22 мкм) для удаления клеток, хранили при 4°С до очистки.

Для очистки отфильтрованный супернатант загружали в уравновешенную PBS колонку с белком А и промывали PBS; элюирование проводили с использованием 0,1 М глицина (рН 2,5) на приборе pure (GE Healthcare). Фракции немедленно нейтрализовали с помощью 1 М трис-HCl-буфера (рН 8,0) и анализировали на чистоту и целостность белка с помощью SDS-PAGE. Белоксодержащие фракции объединяли и подвергали замене буфера с использованием фильтровальных установок Amicon (Millipore, Шаффхаузен, Швейцария, UFC901008) для достижения разбавления 1:100, а затем стерильно фильтровали с использованием фильтра с низкой задерживающей способностью (0,20 мкм, Carl Roth, Карлсруэ, Германия, РА49.1).

Экспрессия в СНО и очистка: Экспрессионные векторы, кодирующие каждую из полноразмерных тяжелых и легких цепей, собирали в экспрессионном векторе млекопитающего. Антитела транзиентно экспрессировали в клетках СНО способами, известными в настоящей области техники, и рекомбинантные антитела очищали путем стандартной очистки с использованием белка А от супернатантов клеток СНО, как известно в настоящей области техники. Вкратце, супернатанты клеток СНО собирали центрифугированием и стерильно фильтровали (0,2 мкм) перед аффинной очисткой на основе FPLC с использованием колонок с белком А. Связанное антитело элюировали в 0,1 М глицине (рН от 2,5 до 3,5) и немедленно нейтрализовали 1 М трис-HCl-буфером (рН 7,5). Замена буфера на желаемый буфер для получения конечного состава проводили, как известно в настоящей области техники (например, диализ или TFF). Чистоту и целостность рекомбинантных антител анализировали с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), SEC (гель-проникающая хроматография) и MS (масс-спектрометрия).

В таблице 3 перечислены протоколы, используемые для экспрессии и очистки партий антител, использованных в последующих примерах, а также их конечная концентрация и буфер.

Сортаза А. Рекомбинантный и аффинно-очищенный фермент сортаза А из Staphylococcus aureus получали в Е. coli, как описано в международной патентной публикации WO 2014140317 A1.

Получение глицин-модифицированных токсинов. Модифицированное пентаглицином производное EDA-антрациклина (G5-PNU), модифицированное триглицином производное EDA-антрациклина (G3-PNU) и модифицированное диглицином производное EDA-антрациклина (G2-PNU) производили Concortis/Levena (фигура 3 (А), (В) и (С) соответственно). Идентичность и чистоту глицин-модифицированных токсинов подтверждали масс-спектрометрией и ВЭЖХ. Каждый из Gly-модифицированных токсинов показал чистоту >95%, что определяли по одному пику на хроматограмме ВЭЖХ.

Опосредованная сортазой конъюгация антител. Вышеупомянутые токсины конъюгировали с антителами в соответствии с таблицей 4 путем инкубации меченых mAb [10 мкМ] с модифицированным глицином токсином [200 мкМ] и 3-4 мкМ сортазы А в буфере для конъюгации (50 мМ HEPES, рН 7,5, 1 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl, 10 об.% глицерина) в течение не менее 3,5 ч при 25°С. Реакцию останавливали, пропуская ее через колонку с белком А (колонка rProtein A Gravitrap, GE Healthcare). Связанный конъюгат элюировали 5 объемами колонки буфера для элюирования (0,1 М глицин, рН 2,5, 50 нМ NaCl), фракции с объемом 1 колонки собирали в пробирки, содержащие до 25% об./об. трис- или HEPES-основания (рН 8), для нейтрализации кислоты. Фракции, содержащие белок, объединяли и смешивали в буфере для получения состава согласно таблице 4.

Аналитика ADC. DAR оценивали с помощью обращенно-фазовой хроматографии, выполненной на колонке Polymer Labs PLRP 2,1 мм × 5 см, 5 мкм при 1 мл/мин/80°С с 25-минутным линейным градиентом от 0,05 до 0,1% TFA/H2O и от 0,04 до 0,1% TFA/CH3CN. Образцы сначала восстанавливали путем инкубации с DTT при рН 8,0 при 37°С в течение 15 минут. DAR, определенный методом обращенно-фазовой хроматографии, обобщенно представлен в таблице 4 ниже.

Пример 2:

Все оценки переносимости проводили в Aurigon. ADC согласно таблице 5 (составленные в PBS) вводили в указанных дозах дважды в течение 14 дней (в дни 1 и 8 путем внутривенного введения посредством болюса) группам из пяти самок мышей CD-1 (5-6 недель; от Charles River, Зульцфельд, Германия). Мышей содержали в группах по 5 животных на клетку, и им давали воду и гранулированный корм ad libitum. Параметры, которые подвергали мониторингу два раза в день в течение всего исследования, включали в себя смертность и клинические наблюдения у клетки.

Результаты согласно таблице 5 показывают значительно более низкий уровень смертности при эквивалентной дозе ADC у мышей, получавших ADC, содержащий нагрузку антрациклином на С-концах легких цепей (Tras-LC-PNU), по сравнению с мышами, получавшими ADC, содержащим нагрузку антрациклином на С-концах тяжелых цепей (Tras-HC-PNU) или с ADC, содержащим нагрузку антрациклином на С-концах как тяжелой, так и легкой цепей (Tras-PNU).

Пример 3:

ADC согласно таблице 6 (составленные в PBS) вводили в указанных дозах в день 1 (внутривенным введением посредством болюса) группам из трех самок мышей CD-1 (4-6 недель; из Charles River, Зульцфельд, Германия) и проводили наблюдения в течение 14 дней (для доз, составляющих 2,5 и 5 мг/кг) или в течение 28 дней (для доз, составляющих 10, 15 и 20 мг/кг). Мышей содержали в группах по 3 животных на клетку, и им давали воду и гранулированный корм ad libitum. Параметры, подвергаемые мониторингу два раза в день в течение всего исследования, включали в себя смертность и клинические наблюдения у клетки.

Результаты согласно таблице 6 показывают значительно более низкую дозу, вызывающую смертность у мышей, получавших лечение с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-концах тяжелых цепей (Tras-HC-PNU), или с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-концах как тяжелой, так и легкой цепей (Tras-PNU), в отличие от мышей, получавших лечение с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-конце легкой цепи (Tras-LC-PNU).

Пример 4:

Цитотоксичность нацеленных на HER2 ADC согласно таблице 7 исследовали с использованием HER2-положительной линии клеток SKBR3 человека. HER2-отрицательную клеточную линию человека Karpas-299 использовали в качестве контроля. Для этого 5000 клеток SKBR3 и 5000 клеток Karpas-299 на лунку высевали на 96-луночные планшеты (за исключением краевых лунок, которые содержали воду) в 75 мкл DMEM или RPMI, соответственно, с добавлением 10 об.% FCS, 100 МЕ/мл реагента пенициллин-стрептомицин-фунгизон и 2 мМ L-глутамина при плотности, составляющей 6,66×104 клеток на лунку, и выращивали при 37°С во влажной камере в атмосфере с 5% CO2. После 1-дневной инкубации каждый ADC добавляли в соответствующие лунки в количестве 25 мкл 3,5-кратных серийных разведений в среде для выращивания (начальная концентрация ADC, составляющая 80 мкг/мл, давая конечные концентрации ADC в диапазоне от 20 мкг/мл до 0,89 нг/мл). Через 4 дополнительных дня планшеты вынимали из инкубатора и уравновешивали до комнатной температуры. Приблизительно через 30 минут в каждую лунку добавляли 50 мкл люминесцентного раствора CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, G9243). После встряхивания планшетов при 750 об/мин в течение 5 минут с последующей 10-минутной инкубацией без встряхивания измеряли люминесценцию на устройстве для прочтения планшетов Spark 10М со временем интегрирования, составляющим 1 с на лунку. Кривые зависимости люминесценции от концентрации ADC (нг/мл) устанавливали с помощью программного обеспечения Graphpad Prism. Значения IC50, определенные с использованием встроенной в программное обеспечение Prism функции определения IC50 «log(ингибитор) в зависимости от реакции - изменяемый наклон (четыре параметра)», приведены в таблице 7.

На фигуре 4 показана кривая зависимости ответа от дозы в анализах уничтожения клеток in vitro на клеточных линиях SKBR3 и Karpas-299 с ADC согласно таблице 7. Согласно фигуре и таблице сопоставимые ADC, содержащие нагрузки антрациклином исключительно на тяжелой цепи или исключительно на легкой цепи демонстрируют сравнимую in vitro эффективность.

Пример 5:

Цитотоксичность нацеленных на HER2 ADC согласно таблице 8 исследовали с использованием HER2-положительной линии клеток SKOV3 человека. В качестве изотипического контроля использовали сопоставимый нацеленный на CD30 ADC. Для этого следовали протоколу примера 4, но посевы по 2000 клеток SKOV3 на лунку высевали на 96-луночные планшеты (исключая краевые лунки, которые содержали воду) в 75 мкл DMEM с добавлением 10 об.%. FCS, 100 МЕ/мл реагента пенициллин-стрептомицин-фунгизон и 2 мМ L-глутамина при плотности, составляющей 2,66×104 клеток на лунку.

На фигуре 5 показана кривая зависимости ответа от дозы в анализах уничтожения клеток in vitro на клеточной линии SKOV3 с помощью ADC согласно таблице 8. Согласно фигуре и таблице сопоставимые ADC, содержащие нагрузки антрациклином исключительно на тяжелой цепи или исключительно на легкой цепи, демонстрируют сравнимую in vitro эффективность и она опосредована антигеном.

Пример 6:

ADC согласно таблице 9 (составленные в PBS) вводили в указанных дозах в день 1 (внутривенным введением посредством болюса) группам из трех или шести самок мышей CD-1 (4-6 недель; из Charles River, Зульцфельд, Германия) и проводили наблюдения в течение 7-10 дней. Мышей содержали в группах по 3 животных на клетку, и им давали воду и гранулированный корм ad libitum. Параметры, подвергаемые мониторингу два раза в день в течение всего исследования, включали в себя смертность и клинические наблюдения у клетки.

Результаты согласно таблице 9 показывают значительно более низкую дозу, вызывающую смертность у мышей, получавших лечение с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-концах тяжелых цепей, или с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-концах как тяжелой, так и легкой цепей, в отличие от мышей, получавших лечение с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-конце легкой цепи.

Пример 7:

ADC согласно таблице 10 (составленные в PBS) вводили в дозе, составляющей 1 мг/кг (однократным внутривенным введением посредством болюса) группам из 15 самок домовых беспородных мышей CD1 (масса тела 21-26 г; из Janvier, Сен-Бертвен, Франция), распределенных по группам простым случайным распределением). Мышей содержали в группах по 3 животных на клетку, и им давали воду и гранулированный корм ad libitum. Группы по 3 мыши на группу лечения подвергали эвтаназии путем терминального кровотечения после глубокой анестезии через 1 час, 24 часа, 3 дня, 7 дней и 14 дней после введения ADC. Сыворотку из данной группы и в определенный момент времени собирали для анализа ELISA.

Серии разведений образцов сыворотки (коэффициент разведения 3,5) захватывали на планшетах для ELISA, покрытых 2 мкг/мл антигена huROR1. Связанный ADC обнаруживали с помощью разработанного авторами настоящего изобретения мышиного моноклонального антитела к PNU (полученного путем иммунизации мышей конъюгатом IgG человека с PNU и скрининга с помощью конъюгата BSA-PNU), в то время как связанный общий IgG обнаруживали с помощью разведения 1:2500 HRP-конъюгированного ослиного антитела к IgG человека (Jackson Immunoresearch, 709-035-149). Концентрации ADC в сыворотке и общие IgG рассчитывали из полумаксимальных значений титрований образца путем сравнения с образцом того же ADC известной концентрации. На фигуре 6 показаны кривые зависимости концентрации сыворотки во времени; их проанализировали с использованием функции AUC Prism для определения площади под кривой (AUC), как показано в таблице 10.

Результаты согласно таблице 10 показывают значительно более высокое воздействие (AUC) у мышей, получавших лечение с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-концах легких цепей, чем у мышей, получавших лечение с помощью ADC, содержащего нагрузку антрациклином на С-концах как тяжелой, так и легкой цепей, или нагрузку антрациклином на С-концах тяжелых цепей. Кроме того, в таблице 10 указано, что ADC, содержащий нагрузку антрациклином на С-концах тяжелых цепей, в значительной степени теряет нагрузку.

Пример 8:

Клетки рака молочной железы ЕМТ-6 мыши культивировали в полной среде DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с L-глутамином с 10% (об./об.) фетальной сывороткой теленка (FCS), 100 МЕ/г), 100 МЕ/мл реагента пенициллин-стрептомицин-фунгизон и 2 мМ L-глутамина (все от Bioconcept, Альшвиль, Швейцария)) при 37°С и 5% СО2. Клетки сконструировали для избыточной экспрессии ROR1 путем транспозиции следующим образом: клетки центрифугировали (6 мин, 1200 об/мин, 4°С) и ресуспендировали в среде RPMI-1640 (5×106 клеток/мл). 400 мкл клеточной суспензии добавляли к 400 мкл RPMI, содержащей 13,3 мкг мобильного вектора pPB-PGK-Puro-ROR1 (направляющего коэкспрессию полноразмерного ROR1 (NP_005003.2) вместе с геном устойчивости к пуромицину) и 6,6 мкг содержащего транспозазу вектора pCDNA3.1_hy_mPB. Смесь ДНК/клеток ЕМТ-6 переносили в кюветы для электропорации (щель 0,4 см, 165-2088, BioRad, Cressier, Швейцария) и подвергали электропорации с использованием Biorad Gene Pulser II с расширителем емкости при 300 В и 950 мкФ. Затем клетки инкубировали в течение 5-10 минут при комнатной температуре. После инкубации клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 6 минут, один раз промывали и затем ресуспендировали в DMEM до завершения инкубации при 37°С во влажной камере в атмосфере с 5% СО2. Через один день после электропорации пулы клеток, стабильно экспрессирующие ROR1 человека, отбирали путем добавления 3 мкг/мл пуромицина (Sigma-Aldrich, Р8833). Одноклеточные клоны, экспрессирующие ROR1, получали из отобранных с помощью антибиотика клеток EMT-6-ROR1. Затем клетки инкубировали с антителом к ROR1, 2А2, в течение 30 минут (4°С, конечная концентрация 2 мкг/мл) с последующим центрифугированием и промывкой. Затем клетки ресуспендировали, как описано ранее, и инкубировали с антителом к IgG человека (Fc-гамма-специфическим) РЕ (eBioscience, Вена, Австрия, 12-4998-82) с разведением 1:250 в темноте (30 минут, 4°С), промывали один раз в буфере и хранили на льду до сортировки отдельных антигенсвязывающих клеток с помощью FACS с использованием инструмента FACSAriaII (BD Biocsiences, Сан-Хосе, США). Экспрессию ROR1 на клоне 14, использованном в эксперименте ниже, определяли с помощью FACS (фигура 7).

Пример 9:

Цитотоксичность нацеленных на CS1 и нацеленных на ROR1 ADC согласно таблице 11 исследовали с использованием избыточно экспрессирующих ROR1 клеток клона 14 ЕМТ6 из примера 8 и CS1-положительной клеточной линии L363. Для этого следовали протоколу примера 4, но высевали 1000 клонов 14 ЕМТ6 и 10000 клеток L363 на лунку в 75 мкл DMEM с добавлением 10 об.% FCS, 100 МЕ/мл реагента пенициллин-стрептомицин-фунгизон и 2 мМ L-глутамин при плотности, составляющей 1,3×104 клеток на лунку и 1,3×105 соответственно.

На фигуре 8 показана кривая зависимости ответа от дозы в анализах уничтожения клеток in vitro на избыточно экспрессирующих ROR1 клетках клона 14 ЕМТ6 и клетках L363 с ADC согласно таблице 11. Согласно фигуре и таблице сопоставимые ADC, содержащие нагрузки антрациклином исключительно на тяжелой цепи или исключительно на легкой цепи, демонстрируют сравнимую in vitro эффективность, которая является антиген-опосредованной.

Пример 10:

Следующее исследование проводили на ProQinase. В день 0 1×106 опухолевых клеток клона 14 EMT-6-ROR1 (из примера 8) в 100 мкл PBS ортопически имплантировали в жировое тело молочной железы каждой самке мыши BALB/c 5-6-недельного возраста. При достижении среднего объема опухоли, составляющего приблизительно 30-80 мм3 (измерено с помощью штангенциркуля) в день 3, мышей рандомизировали в группы по 6 животных в зависимости от размера опухоли. ADC согласно таблице 12 (составленные в PBS) вводили в день 3 в указанных дозах (путем внутривенного введения посредством болюса). Мышам давали воду и гранулированный корм ad libitum. Постепенное изменение объема опухоли (среднее для каждой группы и планки погрешностей, соответствующие стандартной ошибке среднего), оцененное штангенциркулем два раза в неделю, представлено на фигуре 9.

Результаты на фигуре 9 показывают, что ADC согласно настоящему изобретению, содержащие молекулы антрациклина только на С-концах тяжелых цепей или только на С-концах легких цепей, по существу одинаково эффективны in vivo; их следы демонстрируют по существу полное наложение.

В соответствии с представленными в настоящем документе примерами ADC согласно настоящему изобретению, содержащие молекулы антрациклина на С-концах легких цепей, являются равными с точки зрения эффективности в отношении опухолевых клеток и опухолей по сравнению с ADC, содержащими молекулы антрациклина на С-концах тяжелых цепей; однако ADC согласно настоящему изобретению, содержащие молекулы антрациклина на С-концах легких цепей, обладают замечательными преимущественными свойствами in vivo, включая в себя переносимость и стабильность.

ССЫЛКИ

Beerli et al., "Sortase Enzyme-Mediated Generation of Site-Specifically Conjugated Antibody Drug Conjugates with High In Vitro and In Vivo Potency"; PloS One 10, e131177, 2015.

Chen et al., "A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display"; PNAS, 108(28), 2011.

Dorr et al., "Reprogramming the specificity of sortase enzymes"; PNAS, 2014.

Dorywalska et al., "Site-Dependent Degradation of a Non-Cleavable Auristatin-Based Linker-Payload in Rodent Plasma and its Effect on ADC Efficacy"; PLOS ONE, 2015.

Drake et al., "Aldehyde Tag Coupled with HIPS Chemistry Enables the Production of ADCs Conjugated Site-specifically to Different Antibody Regions with Distinct In vivo Efficacy and PK Outcomes"; Bioconjugate Chemistry, 25, 2014.

Jain et al., "Current ADC Linker Chemistry"; Pharma Res, 32, 2015.

Quintieri et al., "Formation and Antitumor Activity of PNU-159682, A Major Metabolite of Nemorubicin in Human Liver Microsomes"; Clin Cancer Res, 11, 2005.

Spirig et al., "Sortase enzymes in Gram-positive bacteria"; Molecular Microbiology, 82(5), 2011.

Strop et al., "Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates"; Chemistry & Biology, 20, 2013.

Waldmeier et al., "Transpo-mAb display: Transposition-mediated В cell display and functional screening of full-length IgG antibody libraries"; mAbs, 8(4), 2016.

Swindells, et al., "abYsis: Integrated Antibody Sequence and Structure-Management, Analysis, and Prediction"; J. Mol. Biol. 429, 356-364, 2017.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Следующие последовательности составляют часть раскрытия настоящей заявки. С настоящей заявкой также предоставлен электронный перечень последовательностей, совместимый со стандартом WIPO ST 25. Во избежание неопределенности, если существуют расхождения между последовательностями в следующей таблице и электронном перечне последовательностей, последовательности в этой таблице считаются правильными.

Аминокислотная последовательность (с подчеркнутым константным доменом, CDR, идентифицированными на основе системы Kabat с использованием программного обеспечения abYsis, Swindells et al., 2017, выделено жирным шрифтом) НС: тяжелая цепь, LC: легкая цепь

1. Конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), содержащий следующее:

- антитело, или фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, содержащие по меньшей мере один C-конец константной области легкой цепи, и

- малая молекула на основе антрациклина,

причем антитело, фрагмент или производное антитела, сохраняющие свойства связывания с мишенью, нацелены на антиген, экспрессируемый на опухолевых клетках, и

причем молекула(ы) антрациклина связана(ы) исключительно с C-концом(ами) константной области легкой цепи антитела, фрагмента или производного, и

причем малая молекула на основе антрациклина связана, посредством линкера, содержащего пептидную последовательность, с указанным антителом, фрагментом или производным, и

причем пептидная последовательность указанного линкера содержит (i) пептидный мотив, являющийся результатом расщепления мотива распознавания фермента сортазы, и (ii) олигоглициновую последовательность Glyn, где указанный мотив распознавания фермента сортазы представляет собой пентапептид и где n в указанной олигоглициновой последовательности представляет собой 1, 2, 3, 4 или 5, и

причем малая молекула на основе антрациклина выбрана из PNU-159682, или из его производных, содержащих структуру согласно формуле (i)

формула (i).

2. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п. 1, в котором антитело, или фрагмент или производное, связывается с антигеном, который является

- опухолеспецифическим или

- экспрессируемым в повышенной степени на опухолевой ткани по сравнению со здоровой тканью.

3. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, в котором антитело, или фрагмент или производное, не связывается с CS1 человека и/или мыши.

4. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, в котором антитело, или фрагмент или производное, содержит CDR (на основании нумерации согласно Kabat)

- HC CDR1: SYYMS

- HC CDR2: AIGISGNAYYASWAKS

- HC CDR3: DHPTYGMDL

- LC CDR1: EGNNIGSKAVH

- LC CDR2: DDDERPS и

- LC CDR3 QVWDSSAYV

и где CDR содержатся в подходящем каркасном регионе, чтобы быть способными связываться с мишенью антитела.

5. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из пп. 1 или 2, в котором антитело, или фрагмент или производное, содержит CDR (на основании нумерации согласно Kabat)

- HC CDR1: SYGVI

- HC CDR2: IIGSSGNTYYASSVKG

- HC CDR3: YYGDSGFDS

- LC CDR1: RASQSIGSWLS

- LC CDR2: GASNLAS и

- LC CDR3: LGASPNGWA

и где CDR содержатся в подходящем каркасном регионе, чтобы быть способными связываться с мишенью антитела.

6. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, в котором антитело, или фрагмент или производное, содержит по меньшей мере одно из перечня, состоящего из следующего:

- вариабельные домены трастузумаба последовательностей SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2,

- вариабельные домены последовательностей SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5, и/или

- вариабельные домены последовательностей SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8.

7. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п. 6, в котором указанный мотив распознавания фермента сортазы выбран из группы, состоящей из LPXTG, LPQTG, LPETG, LPXAG, LPXSG, LAXTG, LPXTA, NPQTG, NPQTN, LPLTG, LAFTG и LPNTA, где X представляет собой любую аминокислоту, и предпочтительно X представляет собой Е или Q, причем предпочтительно пептидная последовательность указанного линкера содержит последовательность LPETG или LPQTG или состоит из нее.

8. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеуказанных пунктов, в котором в указанной олигоглициновой последовательности Glyn n составляет 2.

9. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из пп. 1-8, в котором линкер дополнительно содержит алкилдиаминогруппу в форме NH2-(CH2)m-NH2, где m ≥ 1 и ≤ 11, предпочтительно m=2.

10. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, в котором линкер дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительно расщепляемый или нерасщепляемый линкер, причем линкер предпочтительно выбран из группы, состоящей из следующего: гидразиновый линкер, тиомочевинный линкер, саморасщепляющийся линкер, сукцинимидил-транс-4-(малеимидилметил)циклогексан-1-карбоксилатный (SMCC) линкер, дисульфидный линкер, селеноэфирный линкер, амидный линкер, тиоэфирный линкер и/или малеимидный линкер.

11. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, в котором пептидный линкер дополнительно содержит последовательность спейсера, предпочтительно в котором пептидный линкер содержит последовательность спейсера, состоящую, в направлении от N-конца к C-концу, из четырех остатков глицина и одного остатка серина, обозначенную как G4S.

12. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, который характеризуется стехиометрическим соотношением между (i) антителом, фрагментом или производным и (ii) малой молекулой на основе антрациклина, составляющим любое значение от ≥ 1 до ≤ 2.

13. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п. 1, который можно получить посредством сайт-специфической опосредованной ферментом сортазой конъюгации следующего:

a) антитело, или фрагмент или производное, несущие мотив распознавания фермента сортазы на C-конце(ах) легкой цепи, и

b) одна или несколько малых молекул на основе антрациклина, каждая из которых несет олигоглициновую метку,

причем малая молекула на основе антрациклина выбрана из PNU-159682, или из его производных, содержащих структуру согласно формуле (i)

формула (i).

14. Конъюгат антитела с лекарственным средством, содержащий:

антитело, образованное двумя тяжелыми цепями, где каждая тяжелая цепь образована аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO 4, и двумя легкими цепями, где каждая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 5, причем указанное антитело связывается с ROR1 человека; и

малую молекулу на основе антрациклина,

причем малая молекула на основе антрациклина исключительно связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с C-концом константной области легкой цепи антитела,

причем указанная малая молекула на основе антрациклина состоит из производного PNU-159682 формулы (i),

и причем указанный линкер состоит из спейсерной пептидной последовательности, состоящей, в направлении от N-конца к C-концу, из четырех остатков глицина и одного остатка серина, обозначенных как G4S, пептидного мотива LPQT, являющегося результатом специфического расщепления сортазой, двух остатков глицина, обозначаемых как G2, и алкилдиаминогруппы в форме NH2-(CH2)2-NH2.

15. Конъюгат антитела с лекарственным средством, содержащий:

- антитело, образованное двумя тяжелыми цепями, где каждая тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и двумя легкими цепями, где каждая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, где антитело связывается с ROR1 человека;

и

- малую молекулу на основе антрациклина,

где малая молекула на основе антрациклина исключительно связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с C-концом(ами) константной области легкой цепи антитела,

где указанная малая молекула на основе антрациклина состоит из производного PNU-159682 формулы (i),

и

где указанный линкер представляет собой линкер, состоящий из пептидной последовательности, состоящей из, в порядке указания от N-конца к C-концу, [последовательности] GGGGSLPQTGG и алкилдиаминогруппы формулы NH2-(CH2)2-NH2.

16. Конъюгат антитела с лекарственным средством, содержащий:

антитело, образованное двумя тяжелыми цепями, где каждая тяжелая цепь образована аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 7, и двумя легкими цепями, где каждая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем указанное антитело связывается с ROR1 человека; и

малую молекулу на основе антрациклина,

причем малая молекула на основе антрациклина исключительно связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с C-концом константной области легкой цепи антитела,

причем указанная малая молекула на основе антрациклина состоит из производного PNU-159682 формулы (i),

и причем указанный линкер состоит из спейсерной пептидной последовательности, состоящей, в направлении от N-конца к C-концу, из четырех остатков глицина и одного остатка серина, обозначенных как G4S, пептидного мотива LPQT или LPET, являющегося результатом специфического расщепления сортазой, двух остатков глицина, обозначаемых как G2, и алкилдиаминогруппы в форме NH2-(CH2)2-NH2.

17. Конъюгат антитела с лекарственным средством, содержащий:

- антитело, образованное двумя тяжелыми цепями, где каждая тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 (huERCS-409 HC), и двумя легкими цепями, где каждая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (huERCS-409 LC), где указанное антитело связывается с ROR1 человека;

и

- малую молекулу на основе антрациклина,

где малая молекула на основе антрациклина исключительно связана через линкер, содержащий пептидную последовательность, с C-концом(ами) константной области легкой цепи антитела,

где указанная малая молекула на основе антрациклина состоит из производного PNU-159682 формулы (i),

и

где указанный линкер представляет собой линкер, состоящий из пептидной последовательности, состоящей из, в порядке указания от N-конца к C-концу, [последовательности] GGGGSLPQTGG и алкилдиаминогруппы формулы NH2-(CH2)2-NH2.

18. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из пп. 14-17, где соотношение между указанным производным PNU-159682 и указанным антителом составляет не менее 1,9 и не более 2.

19. Конъюгат антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов для применения при лечении субъекта, который страдает от неопластического заболевания, подвержен риску его развития и/или у которого диагностировано неопластическое заболевание, где, предпочтительно, указанное неопластическое заболевание представляет собой рак молочной железы.

20. Фармацевтическая композиция для лечения рака у млекопитающих или человека, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.

21. Способ получения конъюгата антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов, причем способ предусматривает следующие стадии:

a) получение антитела, или фрагмента или производного, несущих мотив распознавания фермента сортазы на C-конце(ах) легкой цепи,

b) получение одной или нескольких малых молекул на основе антрациклина, каждая из которых несет олигоглициновую метку, и

с) конъюгирование антитела, или фрагмента или производного, и одной или нескольких малых молекул на основе антрациклина посредством опосредованной сортазой конъюгации с использованием фермента сортазы, который распознает указанный мотив распознавания фермента сортазы.

22. Применение конъюгата антитела с лекарственным средством по любому из вышеупомянутых пунктов для изготовления лекарственного средства для лечения неопластического заболевания.

23. Применение конъюгата антитела с лекарственным средством по п. 22, где указанное неопластическое заболевание представляет собой рак молочной железы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны гуманизированное моноклональное антитело, селективно связывающееся с опухолевым антигеном PRAME человека, а также фрагменты ДНК, кодирующие участки легкой и тяжелой цепей указанного антитела и антиген-связывающий фрагмент указанного гуманизированного моноклонального антитела.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело IgM, IgA, IgG/IgM или IgG/IgA, которое является биспецифичным или мультиспецифичным и содержит модифицированную J-цепь.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биспецифической антигенсвязывающей молекуле, связывающейся с ОХ40 и FAP, которая содержит по меньшей мере один Fab-фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с ОХ40, и по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фибробласт-активирующим белком (FAP), а также к содержащей ее композиции.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный рецептор антигена, нацеленный на PSCA (антиген стволовой клетки простаты), популяцию человеческих Т-клеток для лечения рака, экспрессирующего PSCA, композицию, содержащую популяцию аутологичных или аллогенных человеческих Т-клеток, для применения в способе лечения рака, экспрессирующего PSCA у пациента и химерный рецептор антигена, нацеленный на PSCA.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения антител. Изобретение направлено на оптимизацию получения селективно кэпированных и некэпированных цистеинов в антителах путем манипуляции условиями роста клеток, включая намеренное истощение цистеина и/или цистина в процессе культивирования клеток с помощью компонентов среды, продолжительности культивирования партии или плотности клеток, для достижения эффективного продуцирования белка.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с MUC16, конъюгаты, химерный антигенный рецептор, Т-клетка, полинуклеотиды.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфически связывается с белком MELK (материнской эмбриональной киназой с лейциновой молнией) или его частичным пептидом, способу его получения, а также к содержащему его реагенту и меченому телу.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, которое специфически распознает человеческий IL-13RA2, а также многофункциональный иммуноконъюгат и химерный антигенный рецептор на основе такого антитела.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым конъюгатам иммуноглобулинов с различными агентами. Изобретение раскрывает способ получения конъюгированных иммуноглобулинов через химию аминокислотных остатков цистеина в особых положениях вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина («Cys80»).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к конъюгату типа антитело-лекарственное средство, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить конъюгат антитела (или его Fab-фрагмента) к рецептору фолиевой кислоты альфа с эрибулином — противоопухолевым агентом, ингибирующим фазу роста микротрубочек в ходе митотического деления клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3 аденоассоциированного вируса (AAV), содержащие модифицированную последовательность Козак, выбранную из SEQ ID NO: 2-11, SEQ ID NO: 13-32 или SEQ ID NO: 34-45.
Наверх