Способ получения частиц рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора (raav)

Настоящее изобретение относится к способу получения частиц рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора (rAAV) с высоким уровнем выделения или с высоким титром. Способ включает: сбор клеток и/или супернатанта культуры клеток, содержащих частицы вектора rAAV; необязательную их концентрацию; лизис; фильтрацию; подвергание полученного осветленного лизата ионообменной хроматографии на колонке и необязательно концентрацию полученного элюата; смешивание элюата с колонки или концентрированного элюата с колонки с хлоридом цезия и подвергание полученной смеси градиентному ультрацентрифугированию для отделения частиц полноценного вектора rAAV от частиц пустого капсида AAV и других связанных с вектором AAV примесей; сбор частиц полноценного вектора rAAV, отделенных на предыдущей стадии, и получение состава частиц полноценного вектора rAAV в буфере с неионным поверхностно-активным веществом; подвергание частиц полноценного вектора rAAV, полученных на предыдущей стадии, обмену буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока с последующей фильтрацией. Осуществление изобретения обеспечивает улучшение извлечения и/или повышение титра частиц полноценного вектора rAAV после проведения процесса очистки. 51 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США серийный No. 62/365312, поданной 21 июля 2016 г. Полное содержание предшествующей заявки приведено в настоящем описании в качестве ссылки, включая весь текст, таблицы, список последовательностей и чертежи.

ВВЕДЕНИЕ

[0002] Проточная фильтрация вдоль потока (TFF) представляет собой способ, используемый в биотехнологической промышленности для концентрирования продуктов посредством способа ультрафильтрации (UF) и для обмена буфера посредством диафильтрации (DF) для получения составов продуктов. Однако, когда TFF использовали для проведения UF/DF для рекомбинантных аденоассоциированных вирусных (rAAV) векторов, значительные количества векторов rAAV теряли в процессе. Когда векторы rAAV являются высоко концентрированными, даже больше векторов может быть потеряно. Количество вектора, теряемое в процессе UF/DF, делает почти невозможным получение препаратов вектора rAAV с высокой концентрацией, что является очень желательным при разработке продуктов для связанной с rAAV генотерапии.

[0003] Другим феноменом, часто наблюдаемым при получении векторов rAAV, является то, что векторы rAAV имеют тенденцию к агрегации в процессе UF/DF, в частности, когда препараты векторов являются высоко концентрированными, такими как 1E+13 гв на мл (1×1013 геномов вектора/мл; гв: геном вектора) или выше. Агрегация вектора rAAV, по-видимому, является зависимой от титра, и чем выше титр, тем больше агрегация вектора. Агрегация вектора также приводит к потере вектора в ходе получения. Кроме того, агрегированные векторы вызывают опасения в отношении безопасности пациента при использовании в клинике.

[0004] Проблемы с агрегацией вектора rAAV и потерей вектора в процессе UF/DF при использовании способов TFF, описанные выше, представляют значительные проблемы для способа получения и/или очистки векторов rAAV. Настоящее изобретение нацелено на эти проблемы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] По многим различным гипотезам, агрегация вектора rAAV и потеря вектора в процессе UF/DF с использованием способов TFF может зависеть от способа и/или зависеть от состава. На основании такой гипотезы, разработаны новые составы и новые рабочие параметры, созданные для способа UF/DF для улучшения выделения вектора и уменьшения, минимизации или предотвращения агрегации вектора rAAV. В составах и при рабочих параметрах для способа UF/DF по изобретению, выделение вектора rAAV улучшается, и агрегация вектора rAAV уменьшается. Данные, описанные в настоящем описании, показывают, что новые составы и рабочие параметры, разработанные для способа UF/DF, отдельно или в комбинации, обеспечивают значительное увеличение общего количества вектора rAAV, выделенного из первоначального препарата вектора rAAV. Фактически, векторы rAAV можно концентрировать до 5E+13 гв/мл (5×1013 геномов вектора/мл) без значительной потери вектора, и векторы преимущественным образом представляют собой мономеры, что указывет на уменьшение агрегации.

[0006] Составы и/или рабочие параметры по изобретению, описанные в настоящем описании, могут обеспечить концентрацию векторов rAAV до высокой концентрации, например, вплоть до 5E+13 (5×1013) геномов вектора на миллилитр (гв/мл), с небольшим количеством агрегатов rAAV, если они вообще присутствуют. Кроме того, составы и/или рабочие параметры по изобретению, описанные в настоящем описании, могут улучшать выделение вектора rAAV после обмена буфера или концентрирование векторов с использованием способов проточной фильтрации вдоль потока (TFF). Составы и/или рабочие параметры по изобретению, описанные в настоящем описании, могут поддерживать любое клиническое применение генотерапии с использованием векторов rAAV, такое как опосредованная rAAV генотерапия для заболеваний с накоплением лизосом, таких как нейрональный цероидный липофусциноз 2 (CLN2), опосредованная rAAV генотерапия для нарушений свертываемости крови (гемофилии A и гемофилии B) и т.д., когда является желательной высокая концентрация препаратов rAAV. Улучшенное выделение вектора в процессе ультрафильтрации (UF) и диафильтрации (DF) с использованием TFF может также уменьшать стоимость материалов для получения вектора rAAV, а также обеспечивать более надежные и единообразные векторы rAAV или клинические применения.

[0007] Соответственно, изобретение относится к различным преимуществам способа получения rAAV. В одном варианте осуществления, выделение вектора rAAV улучшено, и может быть улучшено значительно, таким образом, обеспечивая улучшенный выход от начала до конца (например, выход вектора rAAV 70% или более, от начала до конца). В другом варианте осуществления, агрегацию rAAV уменьшают, минимизируют или предотвращают, в частности, когда вектор rAAV концентрируют до высоких титров вектора rAAV. В следующем варианте осуществления, вектор rAAV получают с высокой концентрацией (например, по меньшей мере при 1E+12, 5E+12, 1E+13 или 5E+13 гв/мл), пригодной для клинических применений, в которых высокий титр и/или небольшой объем при введении (например, инъекции или инфузии) вектора rAAV является желательным. В дополнительных вариантах осуществления, изобретение относится к одному или нескольким из следующего, отдельно, или в любой комбинации друг с другом, или в любой комбинации с другими вариантами осуществления, описанными в настоящем описании:

(1) Высоко надежный/единообразный способ UF/DF для получения векторов rAAV, который может уменьшать производственные риски, основанные на изменчивости процесса производства;

(2) Эффективное выделение вектора rAAV по способу UF/DF, обеспечивающее общее увеличение выхода вектора rAAV (например, 70% или более, от начала до конца);

(3) Избегание значительных потерь вектора rAAV;

(4) Уменьшение, минимизация или предотвращение агрегации вектора rAAV (например, агрегация вектора rAAV не поддается детекции такими способами, как эксклюзионная хроматография и/или динамическое светорассеяние);

(5) Обеспечение концентрирования вектора rAAV до высокой концентрации, например, 5E+13 гв/мл, с уменьшенной, минимизированной или небольшой, или не поддающейся детекции агрегации вектора rAAV (посредством таких способов, как эксклюзионная хроматография и/или динамическое светорассеяние); и/или

(6) Получение препаратов вектора rAAV с высоким титром для обеспечения введения в небольшом объеме при клинических применениях.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0008] На фигуре 1 показано, как увеличение скорости сдвига в процессе TFF значительно увеличивало выделение вектора rAAV. Векторы AAV2-hTPP1v1 (2,5E+14 гв) после ультрацентрифугирования с CsCl сначала разводили до 50 мл (5,0E+12 гв/мл) с использованием буфера для диафильтрации. Для одного цикла диафильтрации, 25 мл буфера для диафильтрации добавляли в 50 мл разведенных векторов, и затем начинали диафильтрацию, пока объем не уменьшался до 50 мл. Стадию диафильтрации повторяли 24 раза. Векторы подвергали ультрафильтрации до 5 мл после 25 циклов процесса диафильтрации. 5 мл векторов собирали для анализа. (A) Анализ qПЦР показал, что титр вектора составлял 4,81E+13 гв/мл, когда более высокую скорость сдвига (~10000 с-1) использовали в процессе TFF, что позволяет предполагать более 90% выделение вектора; в то время как 1,38E+13 гв/мл достигали при низкой скорости сдвига (~3000 с-1), что представляет приблизительно 30% выделение вектора. (B) Анализ динамического светорассеяния (DLS) показал, что диаметры векторов либо при более высокой скорости сдвига (~10000 с-1), либо при низкой скорости сдвига (~3000 с-1), являлись сходными.

[0009] На фигуре 2 показано, как трансмембранное давление (TMP) влияет на выделение rAAV в процессе TFF. Векторы AAV2-hTPP1v1 (2,5E+14 гв) после ультрацентрифугирования с CsCl сначала разводили до 50 мл (5,0E+12 гв/мл) с использованием буфера для диафильтрации, и начинали процесс DF, для каждого цикла диафильтрации, 25 мл буфера для диафильтрации добавляли к 50 мл разведенных векторов, и объем уменьшали до 50 мл. Стадию диафильтрации проводили 25 раз для достижения достаточного обмена буфера. Затем векторы подвергали ультрафильтрации до 5 мл. Анализ q-ПЦР (A) показал, что титр вектора составлял 3,43E+13 гв/мл при использовании TMP (~10,5 фунтов на кв. дюйм (72,4 кПа)), и титр составлял 2,90E+13 гв/мл при более высоком TMP (~15,5 фунтов на кв. дюйм (106,9 кПа)). Анализ DLS показал, что диаметры в препаратах векторов составляли 29,07 нм и 38,2 нм для низкого TMP (~10 фунтов на кв. дюйм (69 кПа)) и относительно высокого TMP (~15,5 фунтов на кв. дюйм (106,9 кПа)), соответственно. Больший диаметр представляет более агрегированные векторы rAAV в препарате.

[0010] На фигуре 3 показаны данные, показывающие, что сбор векторов после процесса UF/DF исключает выделение агрегированных частиц rAAV в препарате вектора. Векторы AAV2-hTPP1v1 (2,5E+14 гв) после ультрацентрифугирования с CsCl разводили до 50 мл (5,0E+12 гв/мл) с использованием буфера для диафильтрации и подвергали процессу UF/DF. Векторы собирали либо с помощью непосредственного удаления концентрированных векторов (выдавливанием), либо посредством удаления концентрированных векторов после нескольких минут циркуляции с меньшей скоростью потока, чем при UF/DF. Анализ q-ПЦР (A) показал, что титры вектора являлись сходными для двух различных способов выделения вектора. Однако, анализ DLS (B) показал, что диаметр векторов был значительно выше в препаратах после циркуляции, что позволяет предполагать более агрегированные векторы rAAV.

[0011] На фигуре 4 показаны данные, показывающие, что разведение вектора с низким титром (~5E+12 гв/мл) значительно уменьшало агрегацию вектора в процессе UF/DF. Векторы AAV2-hTPP1v1 (2,5E+14 гв) после ультрацентрифугирования с CsCl либо напрямую подвергали диафильтрации, либо сначала разводили с использованием буфера для диафильтрации, затем подвергали диафильтрации в течение 25 циклов. Оба вида диафильтрованных векторов подвергали ультрафильтрации до 5 мл после процесса диафильтрации. Анализ DLS показал, что диаметр векторов (левый столбец), выделенных после процесса диафильтрации без разведения, был значительно выше, чем диаметр векторов (правый столбец) с использованием разведения.

[0012] На фигуре 5 показаны данные, показывающие, что плюроник F-68 уменьшает, минимизирует или предотвращает формирование более крупных частиц (т.е., агрегатов) векторов rAAV. Пустые частицы AAV2-hTPP1v1 после ультрацентрифугирования с CsCl, в качестве модели вирусных частиц, сначала разводили буфером для диафильтрации, содержащим плюроник F-68 (названным буфером 1) или не содержащим плюроник F-68 (названным буфером 2). Затем разведенные пустые частицы подвергали диафильтрации в течение 25 циклов с использованием одного из буфера 1 или буфера 2 для диафильтрации для каждого цикла. Пустые частицы подвергали ультрафильтрации до 5 мл после процесса диафильтрации. 5 мл пустых частиц собирали для анализа. (A) Анализ DLS показал, что среднее количество (тысяч импульсов в секунду) пустых частиц с плюроником F-68 (правый столбец) было значительно выше, чем без плюроника F-68 (левый столбец), что позволяет предполагать, что лучшего выделения достигали в присутствии плюроника F-68. (B) Диаметры пустых частиц без плюроника F-68 (левый столбец) были выше, чем диаметры пустых частиц с плюроником F-68 (правый столбец).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0013] Проточная фильтрация вдоль потока является широко используемым способом для выполнения обмена буфера (диафильтрации, DF) и для концентрирования (ультрафильтрации, UF) для биопродуктов. Однако, когда способ TFF использовали для обмена буфера вектора rAAV и получения конечного состава, обнаружено, что значительное количество векторов теряли в процессе UF/DF. Высокие титр/концентрация вектора rAAV часто являются необходимыми для лечения конкретных заболеваний человека. Однако, с современными составом и рабочими параметрами для UF/DF невозможно получать вектор rAAV в желательной концентрации, такой как титр вектора 1E+13 гв/мл или выше. Кроме того, векторы rAAV имеют тенденцию к агрегации при концентрирования до уровня 1E+13гв/мл или выше.

[0014] Для преодоления этих значительных технических ограничений для получения векторов rAAV с высоким титром, по этому изобретению разработан новый состав для способа TFF для векторов rAAV. Кроме того, по этому изобретению разработаны новые рабочие параметры для способа TFF. Когда новый разработанный состав использовали в новом разработанном способе TFF (с новыми разработанными параметрами), чтобы проводить конечный процесс UF/DF для получения составов препаратов векторов rAAV, обнаружили, что выделение вектора rAAV значительно улучшалось, и векторы rAAV оставались в форме мономеров. В частности, с использованием нового состава TFF в комбинации с новым способом выполнения TFF, векторы rAAV концентрировали без значительной агрегации вектора rAAV, даже при концентрировании вплоть до 5E+13 гв/мл. Кроме того, выделение вектора rAAV (общий выход) было значительно улучшено.

[0015] Это изобретение относится к решению для обеспечения возможности концентрации продуктов вектора rAAV до высокой концентрации без поддающейся детекции агрегации вектора rAAV, вплоть до 5E+13 гв/мл без поддающейся детекции агрегации rAAV. Это изобретение также относится к решению для проведения процесса UF/DF с использованием способа TFF для вектора rAAV без потери значительного количества вектора, например, количество вектора rAAV, выделенного в способе UF/DF, лежит в диапазоне от 70% до 95%, от начала до конца. Это изобретение обеспечивает возможность TFF в качестве эффективного способа получения rAAV, в частности, когда необходимо получение концентрированных векторов rAAV.

[0016] Термин «вектор» относится к небольшой молекуле нуклеиновой кислоты - переносчику, плазмиде, вирусу (например, вектору AAV), или другому переносчику, поддающемуся манипуляциям посредством вставки или включения нуклеиновой кислоты. Такие векторы можно использовать для генетических манипуляций (т.е., «клонирующие векторы»), для введения/переноса полинуклеотидов в клетки, и для транскрипции или трансляции вставленного полинуклеотида в клетках. «Экспрессирующий вектор» представляет собой вектор, содержащий ген или последовательность нуклеиновой кислоты с необходимыми регуляторными областями, нужными для экспрессии в клетке-хозяине. Последовательность нуклеиновой кислоты вектора, как правило, содержит по меньшей мере точку начала репликации для размножения в клетке, и необязательно, дополнительные элементы, такие как трансген, элемент для контроля экспрессии (например, промотор, энхансер), интрон, ITR (несколько ITR), сигнал полиаденилирования.

[0017] Вирусный вектор получают из или на основе одного или нескольких элементов нуклеиновой кислоты, содержащих вирусный геном. Конкретные вирусные векторы включают аденоассоциированные вирусные векторы (AAV).

[0018] Термин «рекомбинантный», в качестве определения вектора, такого как рекомбинантные вирусные, например, парвовирусные (например, rAAV), векторы, так же как в качестве определения последовательностей, таких как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что эти композиции подвергали манипуляции (т.е., конструированию) таким образом, какой, как правило, не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора, такого как вектор rAAV, является вектор, в котором полинуклеотид, который в норме не присутствует в геноме вируса (например, AAV) дикого типа, вставлен в вирусный геном. Хотя термин «рекомбинантный» не всегда используют в настоящем описании применительно к векторам, таким как векторы AAV, так же как к последовательностям, таким как полинуклеотиды, рекомбинантные формы включены в явной форме, несмотря на любое такое опущение.

[0019] Рекомбинантный вирусный «вектор» или «вектор rAAV» получен из генома вируса дикого типа, такого как AAV, с использованием способов на молекулярной основе для удаления генома дикого типа из вируса (например, AAV) и замены на неприродную нуклеиновую кислоту. Как правило, в случае AAV, последовательности одного или обоих инвертированных концевых повторов (ITR) из генома AAV сохраняют в векторе rAAV. «Рекомбинантный» вирусный вектор (например, rAAV) отличается от генома вируса (например, AAV), поскольку вирусный геном, полностью или частично, заменен на неприродную последовательность по отношению к нуклеиновой кислоте генома вируса (например, AAV). Включение неприродной последовательности, таким образом, определяет вирусный вектор (например, AAV) как «рекомбинантный» вектор, который в случае AAV можно обозначать как «вектор rAAV».

[0020] Рекомбинантный вектор может являться упакованным - обозначенным в настоящем описании как «частица», для последующей инфекции (трансдукции) клетки, ex vivo, in vitro или in vivo. Когда последовательность рекомбинантного вектора является инкапсидированной или упакованной в частицу AAV, частицу можно также обозначать как «rAAV». Такие частицы включают белки, инкапсидирующие или упаковывающие геном вектора. Конкретные примеры включают белки вирусной оболочки, и в случае AAV, белки капсида.

[0021] «Геном» вектора или, как сокращено для удобства, «гв», относится к части последовательности рекомбинантной плазмиды, которую в конечном счете упаковывают или инкапсидируют для формирования частицы вируса (например, rAAV). В случаях, когда рекомбинантные плазмиды используют для конструирования или получения рекомбинантных векторов, геном вектора не включает часть «плазмиды», которая не соответствует последовательности генома вектора из рекомбинантной плазмиды. Эту не относящуюся к геному вектора часть рекомбинантной плазмиды обозначают как «остов плазмиды», который является важным для клонирования и амплификации плазмиды, процесса, необходимого для размножения и продукции рекомбинантного вектора AAV, но который сам не подвергается упаковке или инкапсидированию в частицы вируса (например, AAV). Таким образом, «геном» вектора относится к нуклеиновой кислоте, упакованной или инкапсидированной посредством вируса (например, AAV).

[0022] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Полинуклеотиды включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, и подвергнутую или не подвергнутую сплайсингу мРНК, рРНК, тРНК и ингибирующие ДНК или РНК (РНКи, например, малую или короткошпилечную (кш)РНК, микроРНК (мкРНК), малую или короткую интерферирующую (ми)РНК, РНК для транс-сплайсинга или антисмысловую РНК). Полинуклеотиды включают природные, синтетические и преднамеренно модифицированные или измененные полинуклеотиды (например, варианты нуклеиновой кислоты). Полинуклеотиды могут является одноцепочечными, двухцепочечными или трехцепочечными, линейными или кольцевыми, и могут иметь любую длину. При обсуждении полинуклеотидов, последовательность или структура конкретного полинуклеотида могут быть описаны в настоящем описании в соответствии с соглашением о предоставлении последовательности в направлении от 5' до 3'.

[0023] «Трансген» применяют в настоящем описании для удобного обозначения полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, предназначенных для введения или введенных в клетку или организм. Трансгены включают любую нуклеиновую кислоту, такую как ген, кодирующий полипептид или белок.

[0024] «Полипептиды», «белки» и «пептиды», кодируемые последовательностями «нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотида», или «трансгенов», включают полноразмерные нативные последовательности, как у природных белков дикого типа, так же как функциональные подпоследовательности, модифицированные формы или варианты последовательности, при условии, что подпоследовательность, модифицированная форма или вариант сохраняет до некоторой степени функциональность нативного полноразмерного белка. Такие полипептиды, белки и пептиды, кодированные последовательностями нуклеиновой кислоты, могут, но не обязательно, являться идентичными эндогенному белку, который является дефектным, или экспрессия которого является недостаточной или дефектной у подвергаемого лечению млекопитающего.

[0025] Рекомбинантный вектор AAV включает любой вирусный штамм или серотип. В качестве неограничивающего примера, вектор rAAV может быть основан на любом геноме AAV или капсиде AAV, например, таком как AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10 или AAV-2i8. Такие векторы могут быть основаны на одном и том же штамме или серотипе (или подгруппе, или варианте), или могут являться отличными друг от друга. В качестве неограничивающего примера, рекомбинантный вектор AAV на основе генома одного серотипа, может являться идентичным одному или нескольким из ITR или белков капсида, упаковывающих вектор. Кроме того, рекомбинантный геном вектора AAV может быть основан на геноме серотипа AAV (например, AAV2), отличном от одного или нескольких из ITR AAV или белков капсида, упаковывающих вектор. Например, геном вектора AAV может быть основан на AAV2, в то время как по меньшей мере один из трех белков капсида может представлять собой, например, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 или его вариант.

[0026] В конкретных вариантах осуществления, векторы rAAV включают AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 и AAV-2i8, так же как их варианты (например, варианты ITR и капсида, такие как вставки, добавления, замены и делеции аминокислот), например, как указано в WO 2013/158879 (Международная заявка PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (Международная заявка PCT/US2014/047670) и US 2013/0059732 (Патентная заявка США No. 13/594773, описывает LK01, LK02, LK03 и т.д.).

[0027] Варианты AAV включают варианты и химеры ITR и капсидов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 и AAV-2i8. Соответственно, включены векторы AAV и варианты AAV (например, варианты ITR и капсида).

[0028] В различных иллюстративных вариантах осуществления, вектор AAV, родственный эталонному серотипу, имеет полинуклеотид (например, ITR), или полипептид (например, капсид), включающий последовательность или состоящий из последовательности, по меньшей мере на 80% или более (например, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д.) идентичной одному или нескольким AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 (например, таким как последовательности ITR или VP1, VP2, и/или VP3).

[0029] В рамках изобретения, фраза «полноценный вектор AAV» или «полноценный вектор rAAV» относится к векторам AAV, содержащим представляющий интерес трансген, которые являются способными инфицировать клетки-мишени. Эта фраза исключает пустые векторы AAV (без присутствия трансгена), и векторы AAV, лишенные полноразмерных вставок (например, фрагменты трансгена), или векторы AAV, содержащие нуклеиновые кислоты клетки-хозяина.

[0030] Термин «выделенный», при использовании в качестве определения композиции, означает, что композиции получены человеком и/или являются выделенными, полностью или по меньшей мере частично, из их природного окружения in vivo. Как правило, выделенные композиции являются в основном свободными от одного или нескольких материалов, с которыми они в норме ассоциированы в природе, например, одного или нескольких белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, мембран клетки. Например, «выделенная нуклеиновая кислота» может содержать молекулу ДНК или кДНК, вставленную в вектор, такой как вектор rAAV.

[0031] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, пригодные способы и материалы описаны в настоящем описании.

[0032] Полное содержание всех патентов, патентных заявок, публикаций и других ссылок, ссылок на GenBank и ссылок на ATCC, процитированных в настоящем описании, приведено в качестве ссылки. В случае несоответствия, это описание, включая определения, имеет преимущество.

[0033] Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам по изобретению, используют в настоящем описании выше, а также на протяжении описания и формулы изобретения.

[0034] Все признаки, описанные в настоящем описании, можно комбинировать в любой комбинации. Каждый признак, описанный в этом описании, можно заменять альтернативным признаком, служащим для такой же, эквивалентной или сходной цели. Таким образом, если явно не указано иное, описанные признаки являются примером рода эквивалентов или сходных признаков.

[0035] В рамках изобретения, неконкретизированные и конкретизированные формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на «нуклеиновую кислоту» включает множество таких нуклеиновых кислот, ссылка на «вектор» включает множество таких векторов, и ссылка на «вирус» или «частицу» включает множество таких вирусов/частиц.

[0036] В рамках изобретения, все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа внутри таких диапазонов, и дроби значений или целых чисел внутри диапазонов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на 80% или более идентичности включает 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% и т.д., так же как 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д., и т.д.

[0037] Ссылка на целое число с более (больше) или менее, чем, включает любое количество, большее или меньшее, чем упомянутое число, соответственно. Таким образом, например, ссылка на менее, чем 100, включает 99, 98, 97 и т.д., все снижение до числа один (1); и менее, чем 10, включает 9, 8, 7 и т.д., все снижение до числа один (1).

[0038] В рамках изобретения, все числовые значения или диапазоны включают дроби значений и целые числа внутри таких диапазонов, и дроби целых чисел внутри таких диапазонов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на числовой диапазон, такой как 1-10 включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, так же как 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., и т.д. Ссылка на диапазон 1-50, таким образом, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., вплоть до и включая 50, так же как 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д., и т.д.

[0039] Ссылка на серии диапазонов включает диапазоны, объединяющие значения границ различных диапазонов в сериях. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на серии диапазонов, например, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-850, включает диапазоны 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 100-500, 150-250, 150-300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500 и т.д.

[0040] Изобретение в общем описано в настоящем описании с использованием утвердительных выражений для описания многочисленных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также конкретно включает варианты осуществления, в которых конкретный объект изобретения исключен, полностью или частично, такой как вещества или материалы, стадии способа и условия, протоколы или процедуры. Например, в конкретных вариантах осуществления или аспектах изобретения, материалы и/или стадии способа исключены. Таким образом, даже несмотря на то, что изобретение в общем не сформулировано в настоящем описании в отношении того, что изобретение не включает, аспекты, которые не исключены явно из изобретения, тем не менее, описаны в настоящем описании.

[0041] Описан ряд вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, специалист в данной области, без отклонения от сущности и объема изобретения, может осуществлять различные изменения и модификации изобретения для его адаптации к различным применениям и условиям. Соответственно, следующие примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения, каким-либо образом, объема заявленного изобретения.

ПРИМЕРЫ

[0042] Пример 1 Одной из множества гипотез, которые могут объяснять потерю и/или агрегацию вектора rAAV, является то, что гелеобразный слой может образовываться в устройстве для TFF при неоптимизированном способе UF/DF, который может являться причиной потери вектора rAAV. Эта гипотеза образования гелеобразного слоя может также объяснять тот феномен, что больше вектора rAAV теряли, когда вектор rAAV концентрировали до высокой концентрации, поскольку более выраженный гелеобразный слой может образовываться, когда вектор является более концентрированным. Образованный гелеобразный слой может вызывать также агрегацию rAAV, феномен, наблюдаемый достаточно часто в процессе UF/DF, в частности, когда векторы rAAV концентрируют до высокой концентрации.

[0043] Пример 2 В дополнение к рабочим параметрам TFF, одной из множества гипотез является то, что состав может играть важную роль в уменьшении гелеобразного слоя, а также в предотвращении агрегации rAAV, для большинства растворов/буферов, используемых в современном способе UF/DF, химические вещества, используемые в буферах/растворах, представляют собой соли, и химические вещества контролируют pH. Если поверхностно-активное вещество использовали в растворе для UF/DF в ходе процесса, это могло уменьшать ассоциацию между векторами rAAV и ассоциацию между векторами rAAV и поверхностью устройства для UF/DF. Это, в свою очередь уменьшает или предотвращает образование гелеобразного слоя вектора rAAV в процессе UF/DF. Кроме того, поверхностно-активное вещество может дополнительно уменьшать ассоциацию rAAV посредством уменьшения или предотвращения гидрофобного взаимодействия при прохождении процесса UF/DF, таким образом, уменьшая, минимизируя или предотвращая агрегацию rAAV. Дополнительными гипотезами являются то, что увеличение скорости сдвига и контроль трансмембранного давления (TMP) в процессе UF/DF может уменьшать образование гелеобразного слоя. На основании всех из этих гипотез, проводили серии исследований, приведшие к конкретным составам и рабочим параметрам по изобретению, описанным в настоящем описании.

[0044] Пример 3 По изобретению, являются желательными новые рабочие параметры UF/DF, которые уменьшают, минимизируют или предотвращают агрегацию rAAV и уменьшенное выделение (общий выход) векторов rAAV, которые являются особенно подходящими, когда препараты вектора rAAV с высоким титром являются желательными. Первым рабочим параметром является начало процесса UF/DF с низким титром rAAV, особенно когда препараты вектора rAAV содержат высокую концентрацию rAABV, например, при градиентном центрифугировании с CsCl до стадии UF/DF. Высоко концентрированный rAAV в CsCl сначала разводили до титра 5E+12 гв/мл или ниже с использованием разработанного буфера для диафильтрации, содержащего 10 мМ фосфат натрия, 180 мМ NaCl и 0,001% плюроник F-68, при pH 7,3. Следует проводить процесс DF с использованием разработанного буфера для диафильтрации при скорости потока со скоростью сдвига приблизительно 8000 с-1 или выше. Завершать процесс диафильтрации для достижения эффективного обмена буфера, затем начинать процесс UF для концентрации вектора rAAV до желательного титра.

[0045] Одним из компонентов для наличия в новом разработанном составе для UF/DF является плюроник F-68, который обеспечивает высокий титр препаратов rAAV. Несмотря на нежелание быть связанными с теорией, считают, что этот новый состав (буфер для диафильтрации) уменьшает образование гелеобразного слоя.

[0046] Когда этот новый состав комбинировали с новыми рабочими параметрами в процессе UF/DF, вектор rAAV концентрировали до 5E+13 гв на мл без поддающейся детекции агрегации вектора. Кроме того, выделение вектора rAAV являлось значительным, как правило, на уровне 70% или выше.

1. Способ получения частиц рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора (rAAV), включающий стадии:

(a) сбора клеток и/или супернатанта культуры клеток, содержащих частицы вектора rAAV;

(b) необязательно, концентрации указанных клеток и/или супернатанта указанной культуры клеток, собранного на стадии (a), необязательно, посредством проточной фильтрации вдоль потока, для получения концентрированного собранного материала;

(c) лизиса указанного собранного материала, полученного на стадии (a), или указанного концентрированного собранного материала, полученного на стадии (b), необязательно, посредством микрофлюидизации, для получения лизата;

(d) фильтрации указанного лизата, полученного на стадии (c), для получения осветленного лизата;

(e) подвергания указанного осветленного лизата, полученного на стадии (d), ионообменной хроматографии на колонке для получения элюата с колонки, содержащего очищенные частицы вектора rAAV, и необязательно, концентрации указанного элюата с колонки посредством проточной фильтрации вдоль потока для получения концентрированного элюата с колонки;

(f) смешивания указанного элюата с колонки или указанного концентрированного элюата с колонки, полученного на стадии (e), с хлоридом цезия для получения смеси и подвергания указанной смеси градиентному ультрацентрифугированию для отделения, в основном, частиц полноценного вектора rAAV от частиц пустого капсида AAV и других связанных с вектором AAV примесей;

(g)(1) сбора указанных частиц полноценного вектора rAAV, отделенных на стадии (f), и (g)(2) получения состава указанных частиц полноценного вектора rAAV в буфере с неионным поверхностно-активным веществом;

(h) подвергания указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (g)(2) обмену буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока для получения состава вектора AAV; и

(i) фильтрации указанного состава вектора AAV, полученного на стадии (h), таким образом, получения состава частиц полноценного вектора rAAV.

2. Способ по п.1, где указанный буфер со стадии (g)(2) содержит хлорид натрия и/или фосфат натрия.

3. Способ по п.1, где указанный буфер со стадии (g)(2) содержит хлорид натрия от концентрации 10 мМ до концентрации 500 мМ.

4. Способ по п.1, где указанный буфер со стадии (g)(2) содержит фосфат натрия от концентрации 5 мМ до концентрации 50 мМ.

5. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) содержит полиалкиленгликоль.

6. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) содержит блок-сополимер, содержащий один блок полиэтиленгликоля и по меньшей мере один блок полипропиленгликоля.

7. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) включает алкилполигликозид, цетостеариловый спирт, цетиловый спирт, кокамид DEA, кокамид MEA, децилглюкозид, этоксилат, IGEPAL CA-630, изоцетет-20, глюкозиды, мальтозиды, монолаурин, нонидет P-40, ноноксинолы, такие как ноноксинол-9, NP-40, монододециловый эфир октаэтиленгликоля, N-октил-бета-D-тиоглюкопиранозиды, октилглюкозиды, олеиловый спирт, PEG-10 глицериды подсолнечника, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, полоксамеры, такие как полоксамер 407, полоксамер 188 (сополимер(этиленоксида-полипропиленоксида)), полирицинолеат полиглицерина, сорбитаны, стеариловый спирт, тритон X-100 и твин 80.

8. Способ по п.7, где указанный этоксилат включает этоксилированную жирную кислоту, этоксилат спирта, этоксилат тристирилфенола или этоксилированный сложный эфир сорбитана и жирной кислоты.

9. Способ по п.7, где указанный сорбитан включает моностеарат сорбитана или тристеарат сорбитана.

10. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) включает цетомакрогол 1000, полисорбаты, такие как полисорбат 20 (монолаурат полиоксиэтилен(20)сорбитана), полисорбат 40 (монопальмитат полиоксиэтилен(20)сорбитана), полисорбат 60 (моностеарат полиоксиэтилен(20)сорбитана), полисорбат 80 (моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбитана); полирицинолеат полиглицерина, [2-[(2R,3S,4R)-3,4-дигидрокси-2-тетрагидрофуранил]-2-гидроксиэтиловый] сложный эфир октадекановой кислоты, [(2R,3S,4R)-2-[1,2-бис(1-оксооктадецокси)этил]-4-гидрокси-3-тетрагидрофураниловый] сложный эфир октадекановой кислоты; спирты с длиной цепи C8-C22, такие как 1-октадеканол, цетилстеариловый спирт, гексадекан-1-ол и цис-9-октадецен-1-ол; замещенный или незамещенный октилфенол, в котором заместители включают полиэтоксиэтанольную группу или любой другой заместитель, образующий неионное поверхностно-активное вещество с октилфенолом; моноизогексадециловый эфир полиэтиленгликоля; 2,3-дигидроксипропиловый эфир додекановой кислоты; глюкозиды включают лаурилглюкозид, октилглюкозид и децилглюкозид; амиды жирных кислот, такие как кокамид диэтаноламина и кокамид моноэтаноламина; и неионные поверхностно-активные вещества, имеющие гидрофильную цепь полиэтиленоксида и липофильную или гидрофильную ароматическую группу углеводорода, такие как ноноксинол-9 и тритон X-100.

11. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) включает полиэтиленгликоль-блок-полипропиленгликоль-блок-полиэтиленгликоль или триблок-сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилен(поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилен(поли(этиленоксида)).

12. Способ по п.11, где указанный полиэтиленгликоль-блок-полипропиленгликоль-блок-полиэтиленгликоль или триблок-сополимер включает SYNPERONIC F108 (Aldrich).

13. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) имеет концентрацию от 0,0001% до концентрации 0,1%.

14. Способ по п.1, где указанное неионное поверхностно-активное вещество со стадии (g)(2) имеет концентрацию от 0,0001% до концентрации 0,01%.

15. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV присутствуют в указанном составе, полученном на стадии (i), при концентрации от 1015 частиц на мл до концентрации 1018 частиц полноценного вектора rAAV на мл.

16. Способ по п.1, где выход указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере 5×1012 частиц полноценного вектора rAAV/мл.

17. Способ по п.1, где выход указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере 1×1013 частиц полноценного вектора rAAV/мл.

18. Способ по п.1, где выход указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере 5×1013 частиц полноценного вектора rAAV/мл.

19. Способ по п.1, где выделение указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере 60% от общего количества частиц вектора rAAV со стадии (a).

20. Способ по п.1, где выделение указанных частиц полноценного вектора rAAV на стадии (i) составляет по меньшей мере 70% от общего количества частиц вектора rAAV со стадии (a).

21. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV получены из AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и Rh74.

22. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного rAAV содержат трансген, который кодирует ингибирующую нуклеиновую кислоту.

23. Способ по п.22, где указанная ингибирующая нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из миРНК, антисмысловой молекулы, мкРНК, рибозима и кшРНК.

24. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного rAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), паратиреоидного гормона (PTH), фактора, высвобождающего гормон роста (GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (EPO), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), фактора роста тромбоцитов (PDGF), инсулиновых факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, морфогенетического белка кости BMP (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейтрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора линии глиальных клеток (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.

25. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного rAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (TPO), интерлейкинов (IL1-IL-17), моноцитарного хемоаттрактантного белка, ингибирующего лейкоз фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, лиганда Fas, факторов некроза опухолей α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, T-клеточных рецепторов, химерных T-клеточных рецепторов, одноцепочечных T-клеточных рецепторов, молекул MHC класса I и класса II.

26. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV содержат трансген, кодирующий белок для коррекции врожденных ошибок метаболизма, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргиносукцинатсинтетазы, аргиносукцинатлиазы, аргиназы, фумарилацетоацетатгидролазы, фенилаланингидроксилазы, альфа-1-антитрипсина, глюкозо-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, фактора V, фактора VIII, фактора IX, цистатион-бета-синтазы, декарбоксилазы кетокислот с разветвленной цепью, альбумина, изовалерил-coA-дегидрогеназы, пропионил-CoA-карбоксилазы, метилмалонил-CoA-мутазы, глутарил-CoA-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, киназы фосфорилазы, глициндекарбоксилазы, RPE65, H-белка, T-белка, последовательности трансмембранного регулятора кистозного фиброза (CFTR) и последовательности кДНК дистрофина.

27. Способ по п.26, где указанный белок представляет собой фактор VIII или фактор IX.

28. Способ по п.1, где указанные частицы полноценного вектора rAAV содержат трансген, кодирующий белок для коррекции нейродегенеративных заболеваний.

29. Способ по п.28, где указанный белок представляет собой трипептидилпептидазу 1 (TPP1).

30. Способ по п.1, включающий сбор частиц пустого капсида отдельно на стадии (f).

31. Способ по п.1, где чистота указанных частиц полноценного вектора rAAV в указанном фильтрате со стадии (i) составляет по меньшей мере 80%.

32. Способ по п.1, где чистота указанных частиц полноценного вектора rAAV в указанном фильтрате со стадии (i) составляет по меньшей мере 90%.

33. Способ по п.1, где чистота указанных частиц полноценного вектора rAAV в указанном фильтрате со стадии (i) составляет по меньшей мере 95%.

34. Способ по п.1, где указанные частицы пустого капсида присутствуют в указанном фильтрате со стадии (i) в количестве 10% или менее.

35. Способ по п.1, где указанные частицы пустого капсида присутствуют в указанном фильтрате со стадии (i) в количестве 5% или менее.

36. Способ по п.1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет не более чем 10% агрегированных частиц rAAV.

37. Способ по п.1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет не более чем 5% агрегированных частиц rAAV.

38. Способ по п.1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет менее чем 3% агрегированных частиц rAAV.

39. Способ по п.1, где указанный фильтрат со стадии (i) имеет 1-3% агрегированных частиц rAAV.

40. Способ по п.1, где указанное центрифугирование на стадии (f) проводят за одну стадию.

41. Способ по п.1, где указанное центрифугирование на стадии (f) представляет собой ультрацентрифугирование в градиенте плотности.

42. Способ по п.1, где указанный элюат с колонки на стадии (e) концентрируют посредством проточной фильтрации вдоль потока для получения концентрированного элюата с колонки.

43. Способ по п.1, дополнительно включающий добавление нуклеазы в лизат, полученный на стадии (c).

44. Способ по любому из пп.1-43, обеспечивающий получение частиц вектора rAAV, имеющих более высокий уровень выделения, чем частицы вектора rAAV, полученные, когда неионное поверхностно-активное вещество добавляют к составу вектора AAV после замены буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока со стадии (h).

45. Способ по любому из пп.1-43, обеспечивающий получение частиц вектора rAAV, имеющих более высокий титр, чем частицы вектора rAAV, полученные, когда неионное поверхностно-активное вещество добавляют к составу вектора AAV после замены буфера посредством проточной фильтрации вдоль потока со стадии (h).

46. Способ по любому из пп.1-43, где собранные частицы полноценного вектора rAAV со стадии (g)(1) разводят до концентрации менее чем 5×1012 частиц вектора rAAV/мл, до, по существу во время или после стадии (g)(2).

47. Способ по любому из пп.1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при трансмембранном давлении между 2-15 фунтов на кв. дюйм (14-103 кПа).

48. Способ по любому из пп.1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при трансмембранном давлении между 4-12 фунтов на кв. дюйм (28-83 кПа).

49. Способ по любому из пп.1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига более чем 3000 с-1.

50. Способ по любому из пп.1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига более чем 5000 с-1.

51. Способ по любому из пп.1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига межу 5000-15000 с-1.

52. Способ по любому из пп.1-43, где проточную фильтрацию вдоль потока со стадии (b), (e) и/или (h) проводят при скорости сдвига 8000-12000 с-1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению соединения со сладким вкусом. Предложен способ получения соединения 1, включающий контакт могрозида IIIE с ферментом, способным катализировать получение соединения 1 из могрозида IIIE, в присутствии глюкозы.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения аллозы из сахарида, включающий: превращение фруктозо–6–фосфата (F6P) в псикозо–6–фосфат (P6P), катализируемое псикозо–6–фосфат–3–эпимеразой (P6PE); превращение P6P в аллозо–6–фосфат (A6P), катализируемое аллозо–6–фосфат–изомеразой (A6PI); и превращение A6P в аллозу, катализируемое аллозо–6–фосфат–фосфатазой (A6PP).

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к области технологии белковой инженерии, которая увеличивает ферментативную активность и термическую стабильность гиалуронидазы человека, которая представляет собой фермент, гидролизующий гиалуроновую кислоту; и более конкретно к вариантам гиалуронидазы PH20 или их фрагментам, которые содержат одну или несколько замен аминокислотных остатков в области, соответствующей области альфа-спирали и ее линкерной области в аминокислотной последовательности PH20 дикого типа из SEQ ID NO: 1, и в которых выборочно один или несколько аминокислотных остатков на N-конце и/или C-конце дополнительно отщеплены.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ удлинения теломер.

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности. Способ получения ребаудиозида D4 осуществляют следующим образом.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий β-маннаназу ЕС 3.2.1.78 из Bacillus subtilis, содержащий в составе хромосомы оптимизированный синтетический ген, кодирующий указанную β-маннаназу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептида химозина, имеющего одну или более следующих замен: S164G, L12M, V51L, R61S, E83S, L105E, D144Q, Q162S, M165E, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D или G251W, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L и/или V317L; или одну или более следующих замен: V32L, I45V, N50K, G70D или G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q, N292H, L295K и/или K321P относительно верблюжьего химозина.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой применение материала из трансгенного растения кукурузы, включающего кукурузные гранулы, кукурузное зерно, кукурузный силос, кукурузные ядра сухого плющения, хлопья из обработанных паром кукурузных ядер, цельные кукурузные ядра, грубодробленые кукурузные ядра, кукурузу с высоким содержанием влажности или любую их комбинацию, в качестве корма для животных, в котором материал из трансгенного растения кукурузы содержит рекомбинантную альфа-амилазу, где указанная рекомбинантная α-амилаза содержит полипептид, по меньшей мере на 80% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения предшественников для получения синтетического гепарина в лабораторных условиях, что может быть применимо в медицине. В настоящем изобретении предложен новый подход к получению синтетического гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину натрия USP, из гепаросана через последовательное получение трех промежуточных соединений – гликозаминогликанов с различным содержанием сульфатированных групп (NS-, NS2S-, NS6S- и/или NS2S6S-групп) в своем составе.
Группа изобретений относится к модифицированному микроорганизму для получения орнитина и к способу получения орнитина с использованием этого микроорганизма. Предложен модифицированный микроорганизм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий орнитин, с пониженной активностью регулятора транскрипции метаболизма сахара (SugR) по сравнению с эндогенной активностью Corynebacterium glutamicum и повышенной активностью цитратсинтазы (GltA) по сравнению с эндогенной активностью Corynebacterium glutamicum, где этот Corynebacterium glutamicum обладает способностью продуцировать орнитин.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептида химозина, имеющего одну или более следующих замен: S164G, L12M, V51L, R61S, E83S, L105E, D144Q, Q162S, M165E, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D или G251W, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L и/или V317L; или одну или более следующих замен: V32L, I45V, N50K, G70D или G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q, N292H, L295K и/или K321P относительно верблюжьего химозина.
Наверх