Способ диагностики степени пародонтита по определению протеинолитической активности микроорганизмов ротовой жидкости

Авторы патента:

Давыдов Алексей Борисович (RU)

Лебедев Сергей Николаевич (RU)

Червинец Вячеслав Михайлович (RU)

Червинец Юлия Вячеславовна (RU)

Леонтьева Аурелия Валерьевна (RU)

Стулов Никита Михайлович (RU)

Беляев Всеволод Станиславович (RU)

G01N33/48735 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

G01N33/487 - жидких биологических материалов

C12Q1/37 - использующие пептидазу или протеиназу

Владельцы патента RU 2768493:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики степени пародонтита по определению протеинолитической активности микроорганизмов ротовой жидкости, характеризующегося тем, что ротовую жидкость собирают натощак в стерильный флакон, слюну вносят в центрифужные пробирки, приливают к пробе хлороформ, центрифугируют и вносят полученный супернатант в лунки с приготовленной, содержащей казеин питательной средой, инкубируют, зоны протеолиза проявляют внесением на агар водного раствора соляной кислоты и оценивают результат по размеру зон протеолиза, при этом размер зоны протеолиза 5,3 ± 0,2 мм расценивают как естественный фон условно-патогенной микробиоты, 8,37 ± 0,3 мм – легкая степень пародонтита, 13,3 ± 0,4 мм – средняя степень, 16,58 ± 0,2 мм – тяжелая степень пародонтита. Изобретение обеспечивает диагностику степени пародонтита. 1 ил., 15 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, микробиологии и биохимии.

Среди важнейших проблем современной стоматологии кариес, пульпит, воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Главной причиной потери зубов в средней и старшей возрастных группах населения нашей страны является пародонтит. Известно, что при патологических состояниях полости рта и в норме выделяются одни и те же микроорганизмы, но с измененными свойствами и более выраженными признаками патогенности. В связи с большим количеством признаков, влияющих на развитие и прогрессирование заболеваний зубов, пародонта и слизистой оболочки полости рта, трудно понять, в результате каких процессов происходит инициирование и прогрессирование заболевания. Патогенная и условно-патогенная микрофлора обладает многими факторами патогенности (токсины, ферменты агрессии, инвазии, факторы адгезии и др.), однако обязательным является наличие у них протеинолитических ферментов, которые разрушают эпителиальные клетки, эритроциты и другие ткани слизистой оболочки и пародонта.

Прототип

В медицинской практике для определения микробиоценозов полости рта используется, как правило, классический бактериологический анализ, требующий наличия большого количества дорогостоящих питательных сред и длителен во времени (не менее 5 дней). Исследуемый материал - ротовая жидкость в количестве 1-2 мл. Готовят ряд разведений и посев на питательные среды: Эндо, Симмонса, желточно-солевой агар, азидовый агар, кровяной агар, лактоагар, Сабуро, анаэробный агар Шедлера, среда Блаурокка, среда Вильсон-Блера. Культивирование проводят в аэробных и анаэробных условиях 1-2 суток. Идентификацию осуществляют по ряду свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных и др. с использованием дорогостоящих идентификационных систем и серологических реакций. Следует отметить, что в полости рта человека обитают более 300 видов микроорганизмов нормальной микрофлоры. При этом соотношение анаэробов к аэробам 100:1 и учесть все столь отдаленные в таксономическом отношении микроорганизмы при классическом бактериологическом анализе практически невозможно. Для выявления основных патогенов прибегают к дорогостоящим методам ПЦР диагностики.

Для скрининговых исследований на дисбактериоз требуется разработка достаточно быстрых биохимических методов, легко осуществляемых на практике.

Аналогом, по мнению авторов, является способ определения казеинолитической (протеолитической) активности микробов на казеиново-агаровых пластинках, предложенный В.М. Никитиным (Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев, 1986, с. 117-119.).

При взаимодействии протеиназ бактериальных культур с казеином, содержащимся в агаровой среде, происходит его расщепление. При добавлении коагулянта белка на мутном фоне агара выявляются зоны просветления вокруг роста казеинолитически активных микроорганизмов.

Исследуемые суточные культуры микробов на МПБ или МПА; раствор 1% казеина на 1/15 М фосфатном буфере рН 7,2; 2% агар на физ. растворе, рН 7,2 в пробирке или колбочку; проявители для белка (казеина): а) 10% раствор трихлоруксусной кислоты во флаконе с притертой пробкой или б) ледяная уксусная кислота 1 г, метиловый спирт 4,5 мл, дист. вода 4,5 мл; красители для белка (казеина) - амидочерный 10 В или кумаси ярко-синий R-250 во флаконах из темного стекла с притертой стеклянной пробкой; пробирки, пипетки, чашки Петри, предметные стекла, пробойники для создания лунок (колодцев) в агаре и др. лабораторное оборудование.

Приготовление раствора-красителя, используемого для окраски белковых преципитатов казеина: амидочерный 10 В (или кумаси ярко-синий R-250) 50,0 г + этиловый спирт 96° 4,5 л + ледяная уксусная кислота 1,0 л + дист. вода 4,5 л. Краску растворяют и раствор оставляют на ночь при комнатной температуре, затем фильтруют и используют. Применение красителя повышает чувствительность метода.

В 10 мл расплавленного и охлажденного до 60-65°С 2% агара в пробирке приливают 1 мл 1% раствора казеина, перемешивают и содержимое быстро выливают в стерильную чашку Петри или на поверхность двух предметных стекол. После застывания агара в нем проделывают лунки диаметром 5-7 мм. В каждую лунку вносят густую взвесь испытуемых микробов, заполняя ее до краев. Чашки (предметные стекла) с посевами помещают в термостат при 37°С. Через 6-12 ч на поверхность агара с пробами наносят проявитель «а» или «б» в объеме 4-5 мл (пробы на предметном стекле опускают в чашку с проявителем), выдерживают 7-10 мин и удаляют.

Регистрация результатов осуществляется визуально. На мутном фоне казеинового агара при положительном результате отмечаются зоны просветления с казеинолитическими микробными культурами. При отрицательной реакции агаровая среда вокруг лунки остается равномерно мутной. Применение красителей способствует повышению чувствительности методики, поскольку мутные преципитаты казеина становятся более контрастными, приобретая черно-синий цвет, а зоны лизиса, наоборот, бывают неокрашенными и светлыми и лучше выявляются, особенно слабые степени бактериального казеинолизиса.

Некоторыми недостатками предлагаемого способа являются:

- плохая растворимость казеина в фосфатном буфере,

- неравномерное его введение в питательную среду.

В качестве прототипа авторы предлагают биохимический экспресс-метод, разработанный в лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Лучшев Л.И., Бондаренко В.М., Исаева Н.П., Земскова Л.Н., Шахмарданов М.З., Грицевская Н.Ю. Косвенный метод экспресс диагностики дисбактериозов кишечника у больных сальмонеллезом и дизентерией. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996, 1: 52-54), основанный на определении протеолитической (казеинолитической) активности содержимого толстой кишки, что позволяет в общей сложности оценить состояние микробного биоценоза и дать ориентировочный ответ через 18 часов от начала исследования.

Тестирование казеинолитической активности проводили на чашках Петри с казеиновым агаром после 18 часовой инкубации в термостате. Зоны протеолиза проявляли добавлением 5% трихлоруксусной кислоты.

Активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-15 мм и высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм.

Недостатками прототипа является отсутствие данных о заборе материала для исследований, о способе внесения в питательную среду казеина, о приготовлении питательной среды для определения казеинолитической активности.

Авторы предлагают способ экспресс диагностики степени пародонтита по определению протеинолитической активности микроорганизмов в ротовой жидкости.

Для анализа ротовую жидкость собирали натощак в количестве 1-2 мл в стерильную посуду (флакон на 10 мл). До отправки в лабораторию образцы можно хранить в течение нескольких дней при +4-8°С.

Исследование протеолитической (казеинолитической) активности ротовой жидкости осуществляли следующим образом. Слюну вносили в центрифужные пробирки, приливали к пробе не более 0,05 мл (1 каплю) хлороформа (для лизиса бактерий и обеззараживания), центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 минут и вносили в лунки (не более 9 на чашке) со специально приготовленной питательной средой по 20 мкл. В одну из лунок для контроля вносили казеинолитически активную пробу с известной степенью протеолиза.

Способ приготовления питательной среды с казеином состоит из следующих этапов. Вначале готовили 100 мл 3,5% стандартного питательного агара, содержащего дрожжевой или рыбный экстракт и другие ингредиенты (производство г. Махачкала и др.), предназначенного для 5 чашек Петри и доводили до кипения. Затем готовили 1,5% раствор казеина на 0,2 Н NaOH (0,15 г казеина на 10 мл щелочи). При этом добивались полного растворения казеина в щелочном растворе. После этого питательный агар и раствор казеина смешивали, автоклавировали при 121°С 15 мин, доводили рН до 7,2-7,4 и разливали в стерильные чашки Петри. После охлаждения чашек на ровной поверхности в агаре делали лунки диаметром 6 мм специальным пробойником или штампом. Таким образом, питательная среда с казеином была готова для внесения в лунки ротовой жидкости для определения в них казеинолитической (протеинолитической) активности (Патент на изобретение № 2235324 от 25 августа 2004 г. Изобретения. Полезные модели. 2004, № 24, III ч., с. 549. (7 G01N 33/48).

После культивирования в термостате при 37°С 6-18 ч, зоны протеолиза проявляли внесением на агар 5 мл 5% водного раствора соляной кислоты. При этом не требуется дополнительно подкрашивать агар для проявления зон протеолиза, что сокращает количество этапов и делает способ более экономичным.

Способ позволяет оценить состояние микробного биоценоза, обладает быстротой и легкостью осуществления, что позволяет использовать его в скрининговых исследованиях.

При микробиологическом исследовании в ротовой жидкости 126 здоровых людей в возрасте от 17 до 60 лет в 92% случаев выявляли бактерии рода Staphylococcus, Peptostreptococcus, в 88% - Streptococcus, 48% - Veillonella, Peptococcus, в 44% - аэробные энтеробактерии, грибы рода Candida, в 40% - лактобациллы, в 36% - микрококки, в 20% - бациллы, в 16% - нейссерии, в 12% - стоматококки, в 4% - порфиромонады. Количество микроорганизмов в среднем составляло 4 lg КОЕ/мл. Признаки патогенности, такие как гемолитическая, лецитиназная, протеазная активность, обнаруживались у 6-12% стафилококков и стрептококков.

В результате определения казеинолитической активности ротовой жидкости этих здоровых людей установлено, что диаметры зон протеолиза соответствует в среднем 5,3±0,213437 мм (фиг. 1), это можно расценивать как естественный фон условно-патогенной микробиоты.

У 170 пациентов с патологией пародонта в мазках, окрашенных по методу Грама обнаружили представителей грамположительной, грамотрицательной микрофлоры, извитые формы бактерий. На поверхности языка и в пародонтальном кармане встречались Грам+ стафилококки, стрептококки, палочки, Грам- палочки, нити, спирохеты, лептотрихии, фузобактерии. Причем количество микроорганизмов в пародонтальном кармане было от 2-х до 100 раз больше, чем на поверхности языка.

При бактериологическом исследовании ротовой жидкости и содержимого пародонтального кармана больных с пародонтитами обнаружено, что как в качественном, так и в количественном составе микрофлора отличалась от микрофлоры здоровых людей. В 100% случаев выделялись микроорганизмы рода Streptococcus и Peptostreptococcus, в 96% случаев - Staphylococcus, в 68% - Micrococcus, Peptococcus и Lactobacillus, в 26% - Actinomyces, в 14-16% - Bacteroides, Porphiromonas, Bacillus, Bifidobacterium, Candida. Количество микроорганизмов превышало 4 lg КОЕ/мл и в среднем составляло 5,8 lg КОЕ/мл. Факторы патогенности обнаруживались у 24-82% стафилококков, стрептококков, пептококков, пептострептококков, грамположительных палочек. Микроорганизмы выделялись в ассоциации от 4 до 8 в исследуемом материале.

При исследовании казеинолитической (протеолитической) активности по диаметру зон протеолиза в ротовой жидкости у 18 пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта легкой степени выявлено, что у лиц с ограниченными проявлениями воспаления слизистой оболочки полости рта диаметры зон были в среднем 7,6±0,67 мм (фиг. 1).

Казеинолитическая активность ротовой жидкости 19 пациентов с парадонтитом средней степени тяжести в среднем была 9,3±0,83 мм (фиг. 1). У 11 пациентов с пародонтитом тяжелой степени - 11,1±0,77 мм (фиг. 1).

Примеры

1. Больной С. М.А., 29 лет. Жалобы на неприятные ощущения и чувство дискомфорта в полости рта, кровоточивость десен и подвижность зубов при чистке и откусывании твердой пищи. Объективно: межзубные сосочки и краевая десна цианотичны. Определяются зубодесневые карманы глубиной не более 3,5 мм, над- и поддесневые твердые и мягкие зубные отложения. Патологическая подвижность зубов I степени. Индекс гигиены по Грин-Вермиллиону - 1,7. Рентгенологически высота межзубной перегородки уменьшена на 1/3 длины корня, очаги остеопороза, расширение периодонтальной щели.

Диагноз: хронический генерализованный пародонтит, легкая степень тяжести.

Диаметр зоны протеолиза составляет 7 мм.

2. Больная М. А.А., 28 лет. Жалобы на неприятные ощущения и чувство дискомфорта в полости рта, кровоточивость десен при чистке зубов и откусывании твердой пищи. Объективно: межзубные сосочки и краевая десна цианотичны. Определяются зубодесневые карманы глубиной не более 3,3 мм, над- и поддесневые твердые и мягкие зубные отложения. Патологической подвижности зубов не наблюдается. Индекс гигиены по Грин-Вермиллиону - 1,9. Рентгенологически высота межзубной перегородки уменьшена на 1/3 длины корня, очаги остеопороза, расширение периодонтальной щели.

Диагноз: хронический генерализованный пародонтит, легкая степень тяжести.

Диаметр зоны протеолиза составляет 8 мм.

3. Больная И. В.Р., 35 лет. Жалобы на кровоточивость десен при чистке зубов и откусывании твердой пищи. Объективно: межзубные сосочки и краевая десна цианотичны. Определяются зубодесневые карманы глубиной не более 2,7 мм, над- и поддесневые твердые и мягкие зубные отложения. Патологической подвижности зубов не наблюдается. Индекс гигиены по Грин-Вермиллиону - 2,0. Рентгенологически высота межзубной перегородки уменьшена на 1/3 длины корня, очаги остеопороза, расширение периодонтальной щели.

Диагноз: хронический генерализованный пародонтит, легкая степень тяжести.

Диаметр зоны протеолиза составляет 7 мм.

4. Больная З. B.C., 37 лет. Жалобы на кровоточивость десен при чистке зубов и откусывании твердой пищи. Объективно: межзубные сосочки и краевая десна цианотичны. Определяются зубодесневые карманы глубиной не более 3 мм, над- и поддесневые твердые и мягкие зубные отложения. Патологической подвижности зубов не наблюдается. Индекс гигиены по Грин-Вермиллиону - 1,8. Рентгенологически высота межзубной перегородки уменьшена на 1/3 длины корня, очаги остеопороза, расширение периодонтальной щели.

Диагноз: хронический генерализованный пародонтит, легкая степень тяжести.

Диаметр зоны протеолиза составляет 8 мм.

5. Больная К. А.П., 33 года. Жалобы на неприятные ощущения и чувство дискомфорта в полости рта, кровоточивость десен и подвижность зубов при чистке и откусывании твердой пищи. Объективно: межзубные сосочки и краевая десна цианотичны. Определяются зубодесневые карманы глубиной не более 3,5 мм, над- и поддесневые твердые и мягкие зубные отложения. Патологическая подвижность зубов I степени. Индекс гигиены по Грин-Вермиллиону - 1,7. Рентгенологически высота межзубной перегородки уменьшена на 1/3 длины корня, очаги остеопороза, расширение периодонтальной щели.

Диагноз: хронический генерализованный пародонтит, легкая степень тяжести.

Диаметр зоны протеолиза составляет 7 мм.

6. Больная Н. Е.П., 28 лет. Жалобы на значительную кровоточивость десен при приеме пищи, запах изо рта, подвижность и смещение зубов. Объективно: отек и гиперемия десны, изменение ее конфигурации, выявлены над- и поддесневые зубные отложения. При зондировании определяются пародонтальные карманы глубиной 5 мм. Патологическая подвижность зубов II степени. Индекс гигиены по Грин-Вермиллиону - 2,2. Рентгенологически высота межзубной перегородки уменьшена на 1/2 длины корня.