Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса

Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса, включает осуществление среза расщепленного свиного дермального трансплантата без эпидермального слоя толщиной 1,0 мм, промывание его в дистиллированной воде и нарезание на равные квадраты размерами 3×3 см с последующим выдерживанием в растворе хлористого натрия 0,9% в течение 8-10 минут, полученные образцы подвергают ультразвуковому воздействию мощностью 900 Ватт в течение 10-15 секунд и последующему воздействию изостатическим давлением до 180-200 МПа в течение 2-3 минут, после чего осуществляют сушку образцов. Вышеописанный способ позволяет устранить антигенность дермального матрикса при сохранении нативной трехмерной белковой структуры дермы, что важно для воспроизведения свойств интактной кожи. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, может быть использовано для хирургического лечения глубоких и обширных ожогов кожного покрова у пострадавших.

Летальность при критических (обширных) ожогах составляет от 60% до 94%. Сложную категорию составляют пострадавшие с глубокими ожогами более 30% поверхности тела из-за дефицита донорских областей для пересадки кожи. Доступным и высокоэффективным ресурсом для преодоления этого ограничения, могло бы быть применение донорской (трупной) кожи. В РФ в настоящее время применение трупной кожи юридически не разрешено. В этой связи представляется весьма актуальным разработка и апробация технологии (методики) получения и консервирования (хранения) ацелюлярного дермального матрикса (АДМ) (каркаса клеток) из свиной кожи для лечения глубоких и обширных ожогов кожного покрова у пострадавших Альтернативные эффективные способы консервативного лечения патологии едва ли можно указать.

В последние десятилетия у пострадавших от ожоговой травмы, благодаря раннему хирургическому лечению удается быстро удалить ожоговый струп, предотвратить ранний сепсис, развитие ожоговой болезни. Тяжелой проблемой при этом является временное замещение кожного покрова, поскольку темп иссечения мертвых тканей всегда превышает возможности оперативного восстановления собственного кожного покрова. Несмотря на широкое применение имеющихся ксеногенных (лиофилизированная свиная кожа - Ксенодерм) и синтетических временных раневых покрытий, глубокие ожоги свыше 40-50% поверхности тела практически предопределяют летальный исход. Несмотря на совершенствование применяемых хирургических техник закрытия ожоговых ран после некрэктомии консенсус в отношении превосходства того или иного подхода не достигнут.

Дермальные матриксы («скаффолды») в контексте клеточных технологий представляют собой трехмерную подложку или временный каркас для клеток, они протезируют дермальный слой кожи и позволяют на своей основе сформироваться полноценному кожному покрову. По происхождению скаффолды классифицируются на биологические, синтетические и генно-инженерные, последние являются инновационным биотехническим продуктом, наименее отторгаемы (более приживляемы), безопасны и эффективны. Их применение позволит на стационарном этапе оказания медицинской помощи пострадавшим с ожоговой травмой сократить сроки лечения и кратно повысить выживаемость.

В последние десятилетия за решение этой проблемы взялась тканевая инженерия. Целью работ является создание биологически совместимого, имеющего устойчивую трехмерную структуру, способного к полному приживлению заменителя дермы. Кожные тканеинженерные аналоги как бесклеточные, так и на основе клеток являются примером технологий, прочно укрепившихся на рынке передовых средств. Впервые появившиеся 30 лет назад данные продукты уже доказали свою эффективность и безопасность в лечении обширных ожогов и хронических ран, неподдающихся традиционным методам воздействия. Кожные заместители можно разделить на бесклеточные и содержащие клетки кожи.

Многие компании используют бесклеточные, различным образом обработанные алло или ксенотрансплантаты. Такие продукты объединены термином "бесклеточные дермальные матриксы" (accelular dermal matrix - ADM), они лишены эпидермального слоя и играют роль матриц, обеспечивающих формирование новой ткани на месте раневой поверхности и стимулируют реэпителизацию. Удаление клеточного материала значительно снижает антигенные свойства, обеспечивая постоянное приживление такого покрытия к раневому ложу с прорастанием сосудов и постепенным заполнением собственными клетками реципиента (Garfein 2003). Благодаря входящим в структуру нативной дермы биоактивным компонентам они оказывают стимулирующее влияние на ангиогенез и миграцию клеток (Greaves 2015). Наличие собственной биологической активности отличает препараты бесклеточной дермы от поколения синтетических дермальных эквивалентов, полученных из отдельных ее компонентов: коллагена, гликозаминогликанов, гиалуроновой кислоты путем химической сшивки. Наличие хороших механических свойств, устойчивость к инфекции, по сравнению с синтетическими имплантатами, привели к широкому использованию препаратов бесклеточной дермы в реконструктивной хирургии брюшной стенки и молочной железы, ринопластике и хирургии пародонта. В перспективе децеллюляризированные дермальные матриксы рассматриваются, как один из основных вариантов каркаса для создания биоинженерного аутологичного эквивалента кожи (Shevchenko 2010, Debels 2015).

Требования, предъявляемые к дермальным матрицам: дермальные заместители должны воспроизводить основные свойства и функции дермы, а именно:

1. Создание защиты от потери влаги и проникновения инфекции;

2. Восстановление анатомической структуры и механических свойств кожи;

3. Биосовместимость - дермальные матрицы не должны вызывать иммунного ответа, способствовать клеточной адгезии, миграции и васкуляризации;

4. Биорезорбируемость - со временем такие матрицы должны постепенно деградировать с замещением вновь образованной тканью.

Преимущества бесклеточных натуральных дермальных матриц:

1. Сохранение нативной 3D структуры коллагеново-эластиновых компонентов и пористости обеспечивает водо-газопроницаемость и механическую прочность;

2. Сохранение базальной мембраны обеспечивает адгезию кератиноцитов и формирование эпидермиса;

3. Элиминация клеток обеспечивает снижение антигенных свойств кожи.

Недостатки бесклеточных натуральных дермальных матриц:

1. Риск передачи инфекций;

2. Частичное сохранение антигенных свойств;

3. Зачастую сложные процедуры получения и высокая стоимость.

Коммерческие продукты на основе децелюляризированных дермальных матриксов:

Аллогенные - на основе донорской кожи человека

- AlloDerm® (Life Corporation, ТХ, US) - наиболее широко используемый продукт представляет собой химически обработанную донорскую кожу (Ralston 1999).Свежая донорская кожа обрабатывается солевым раствором для удаления эпидермального слоя и экстракции клеток, затем подвергается процедуре заморозки- высушивания. Применяется для лечения ожогов с 1992 г. Как показала практика, продукт хорошо приживается, заселяется собственными клетками пациента и снижает степень рубцевания (Jones 2002).

- GLYADERM® - Глиадерм производится EuroSkin Bank (Netherland) из глицеринезированной кожи путем ее длительной обработки в щелочи (Richters2008). Глицерин используется в качестве консервирующего средства. Также глицерин обладает бактерицидным свойством и процедура глицеринизации в ростворах глицерина высокой концентрации (до 85%) приводит к постепенной инактивации микроорганизмов. Глицеринезированная кожа теряет свою эластичность и становится более жесткой, при данной процедуре все клетки погибают, но вместе с ними снижается и имунногенность продукта, что продлевает сроки приживления. При обработке щелочью происходит удаление всех клеточных компонентов волос и, соответсвенно, антигенных структур, удаление всех связанных с матриксом ростовых факторов, резко ухудшаются физико-химические свойства дермы, но сохраняются коллагеновые и эластические волокна, обеспечивающие механические свойства дермы. Глиадерм может использоваться в качестве заместителя дермы.

Ксеногенные - на основе кожи животных.

Дермальные матрицы на основе свиной кожи очень похожи по своим свойствам на аллогенные и представляют собой первый пример натурального тканевого заместителя на основе материала животного происхождения. Доступность исходного сырья позволяет значительно упростить и удешевить производство продуктов на его основе, также снижается риск передачи таких вирусных агентов, как HIV и НерВ. Несмотря на все недостатки, связанные с использованием ксеногенного материала, многие исследователи предполагают,что в будущем подобные продукты будут преобладать на рынках биоматериалов (Ge 2009, Shahrokhi 2014).

На сегодняшний день на коммерческом рынке представлено несколько ксеногенных матриц:

- Permacol® - децелюлизированная свиная дерма, состоящая из химически сшитых коллагеновых и эластиновых волокон (Parker 2006). Предназначена для абдоминальной пластики, имеет сниженные свойства биоинтеграции и васкуляризации.

- MatriDerm® (Medskin solutions Dr. Suwelack AG, Germany) - продукт бычьего происхождения, представляет собой коллагеновый матрикс покрытый гидролизатом эластина, лиофилизованный (Kolokythas 2008, Haslik 2010).

- Strattice® (Kinetic Concept Inc) децелюляризированная свиная дерма, предназначена для реконструктивной хирургии молочных желез.

- Xenoderm® - лиофилизованная свиная кожа.

- Ксенодерм (ЗАО «АБ Медикал») - отечественное биологическое покрытие из лиофилизированной свиной кожи, разработанное и прошедшее клинические испытания в России. Для его изготовления используется расщепленная кожа молодых особей, прошедших ветеринарный контроль на отсутствие инфекционных и паразитарных заболеваний. Покрытие стерилизуется ионизирующим излучением и консервируется лиофильным способом путем замораживания и высушивания в вакууме. Оно изготавливается в виде сплошных или перфорированных пластин белого или желтоватого «слоновой кости» цвета, размером 10 на 10 см и 10 на 15 см. Основным показанием к применению покрытия «Ксенодерм» являются: раны после хирургической некрэктомии при невозможности их одномоментного закрытия и гранулирующие раны, очищенные от некроза в период подготовки их к ау то дермопластике. Кроме того, покрытия «Ксенодерм» используют для защиты пересаженных расщепленных перфорированных аутодермотрансплантатов и донорских ран.

Использование бесклеточных матриксов на основе донорской кожи в тканевой инженерии и регенеративной медицине с каждым годом растет, в настоящее время разработаны методики получения таких продуктов как для отдельных тканей (дермы, мезотелия, перикарда), так и для целых органов (сердце, почка, трахея, мочевой пузырь) (Atala 2012, Ashkan and Atala 2017). Бесклеточные матриксы за счет сохранения трехмерной архитектоники структурных компонентов и связанных с ними ростовых факторов, молекул адгезии, мембранных компонентов способны стимулировать различные биологические процессы: пролиферацию, миграцию и ремоделирование. Несмотря на то, что ВКМ существенно стимулируют репарацию ткани, успех их применения находится в сильной зависимости от способа их получения (метода децеллюляции). Методы, применяемые для децеллюляризации, воздействуют параллельно на элементы внеклеточного матрикса и приводят к изменению механические и биологические свойства ткани. Между этими двумя свойствами существуют прямая зависимость, поэтому важно найти такой баланс, при котором сохранение основных механических и биологических свойств сочеталось бы с максимальным удалением антигенных детерминант.

Методы, применяемые для получения тканевых, в том числе дермальных матриксов по своей природе делятся на:

- химические

- биологические

- физические

Каждый из методов имеет свои преимущества и ограничения, на практике, в зависимости от вида ткани (толщины, состава) применяют комбинированные методики.

В Таблице 1 приведены характеристики основных методов децелюляризации ткани:

по материалам http://www.regmedgrant.com/files/review2_rus.pdf

Известен также способ получения ацеллюлярного дермального матрикса, в котором осуществляют забор свиной дермы толщиной 3 мм после предварительного снятия эпидермиса дерматомом, далее образцы замораживают до температуры -80°С, после разморозки образцы заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов; на втором этапе образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона XI00 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5. После каждого детергента образцы промывают в деионизированной воде в течение 10 минут. На третьем этапе следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I (2000 ЕД растворяли в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов. Завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов. После этого подтверждают качество децеллюляризации методами гистологического исследования, молекулярно-биологического анализа и культуральными методами. (Патент на ИЗ РФ №2717088 от 28.10.2019, опубл. 18.03.20 Бюл. №8)

Способ позволяет сократить время экспозиции воздействия децеллюляризирующих растворов, снизить уровень остаточной ДНК в ткани до 60 нг/мг ткани во влажном образце.

Наиболее близких аналогов заявленному из области техники не выявлено.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является устранение антигенности дермального матрикса, приводящей к иммунному ответу и реакции отторжения трансплантата в результате комплексного воздействия физических и химических факторов на дерму, приводящих к максимально полной элиминации антигенных детерминант при сохранении нативной трехмерной белковой структуры дермы, что важно для воспроизведения свойств интактной кожи.

Технический результат достигается тем, что в способе получения ацеллюлярного дермального матрикса осуществляют срез расщепленного свиного дермального трансплантата без эпидермального слоя толщиной 1,0 мм, далее образец промывают в дистиллированной воде, нарезают на равные квадраты размерами 3×3 см с последующим выдерживанием в растворе хлористого натрия 0,9% в течение 8-10 минут. Полученные образцы подвергают ультразвуковому воздействию в течение 10-15 секунд и последующему воздействию изостатическим давлением от 180 до 200 МПа течение 2-3 минут, после чего осуществляют сушку образцов.

Осуществление среза расщепленного свиного дермального трансплантата без эпидермального слоя толщиной 1,0 мм выбирается из условия обеспечения использования только дермального слоя кожи

Выбор размера квадратов трансплантата 3×3 см обусловлен техническими характеристиками аппарата для срезания кожи (электрического дерматома) и удобствами использования как хирургического импланта для закрытия раневых дефектов кожного покрова.

Время и величина воздействия ультразвука и изостатического давления обусловлены экспериментальными исследованиями оценки и анализа взаимоотношения между временем и величиной ультразвука и изостатического давления и дермой толщиной 1,0 мм свиной кожи, что позволяет удалить клеточные элементы дермы без разрушения коллагеновых и эластиновых волокон, таким образом сохранив матрицу АДМ (скаффолда).

Изобретение поясняется рисунками, где на Фиг. 1 - схематично изображена установка для обработки образцов изостатическим давлением, на Фиг. 2 - полученная дерма свиной кожи.

Для проведения обработки свиной кожи для получения целлюлярного дермального матрикса изготовлен и испытан установки для создания изостатического давления до 200 МПа. Установка работает следующим образом. Прессуемые образцы 1 размещаются в рабочей камере цилиндра 3 мультипликатора, который заполняется рабочей жидкостью 2, закрывается поршнем 4 и помещается в автоклав 5 и закрывается стопорным кольцом 6. Установка снабжена манометром 7.

Таким образом, в способе получения ацеллюлярного дермального матрикса использован комбинированный подход, включающий этапы обработки трансплантата : физический - воздействие ультразвуком, химический способ обработки - в солевом растворе (NaCl) с последующим воздействием избыточным изостатическим давлением.

Заявляемый способ получения ацеллюлярного дермального матрикса реализуется следующим образом:

Шаг 1. Электрическим дерматомом срезается расщепленный свиной дермальный трансплантат без эпидермального слоя толщиной 1,0 мм.

Шаг 2. Тщательно промывается в дистиллированной воде.

Шаг 3. Дерма свиная толщиной 1 мм нарезается на равные квадраты размерами 3×3 см.

Шаг 4. Дерма свиная толщиной 1 мм размерами 3×3 см (образец) выдерживается в растворе хлористого натрия 0,9%. В течение 8-10 минут

Шаг 5 Образцы подвергают изостатическому давлению от 180 - до 200 МПа течение 2-3 минут, для обеспечения прессования образцов.

Шаг 6 Образцы помещаются в лиофильную сушку.

Таким образом, предлагаемый способ получения ацеллюлярного дермального матрикса по сравнению с другими известными подходами обеспечивает следующие преимущества:

• применения источника ультразвука,

• комбинированный подход (ультразвуковое воздействие + гипертонический раствор),

• компактность установки,

• доступность,

• процесс воздействия изостатическим давлением (прессование) может быть организован в любом месте, оборудованном воздушной магистралью давлением 0,6 МПа для работы гидравлического насоса. Может быть использован ручной насос, в этом случае наличие воздуха не потребуется.

• получение ацеллюлярного дермального матрикса без антигенных свойств.

Проведенные опыты воздействия ультразвуком показали высокую степень очищения материала от антигенов при сохранении белкового каркаса дермы, т.е. получение целевых свойств ацеллюлярного дермального матрикса. В первой серии экспериментов комбинированного подхода использовалась максимальная мощность ультразвука - 900 Ватт и варьировалось время обработки образцов при постоянной мощности от одной до десяти минут. Результаты второй серии экспериментов:

Применение ультразвука (УЗ) приводит к разной степени разрушения клеток внутридермальных структур (кровеносные сосуды, железы, волосы, нервы). Степень разрушения никак не коррелирует со временем воздействия УЗ и определяется характеристиками самого кожного образца (толщина, наличие придатков). Образец ацеллюлярной дермы представлен на Фиг. 2. - дерма кожи свиньи. Коллагеновые волокна. Отсутствие других структурных компонентов дермы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 100.

Заявляемый способ получения ацеллюлярного дермального матрикса может найти широкое применение в комбустиологии, общей хирургии, пластической хирургии, урологии, челюстно-лицевой хирургии, бариатрической хирургии. Способ предназначен для специалистов, владеющих навыками реконструктивных вмешательств на кожном покрове, тазовом дне, ректоцеле, герниопластик, т.е. специалистов различного хирургического профиля отделений ЛПУ городского, областного и федерального уровня.

Заявляемый способ получения ацеллюлярного дермального матрикса обеспечивает достижение нового технологического медицинского результата в решении поставленной задачи, в повышении эффективности лечения, являясь при этом универсальным, простым в применении и доступным широкому кругу хирургов.

Предлагаемый способ поясняется примером реализации.

Пример.

Образец (свиная кожа толщиной 1 мм) помещается в стеклянный стакан с раствором хлористого натрия 0,9%. Три стакана с образцами устанавливаются на сетку, помещенную в ультразвуковую ванну на заданном расстоянии от ее излучающей поверхности. Ванна заполняется водой таким образом, чтобы стаканы с образцами погружались в воду на треть их высоты и выдерживают образцы в течение 8-10 минут. После обработки образцы вынимают и помещают в установку для воздействия изостатическим давлением для обеспечения прессования.

Прессуемые образцы 1 размещаются в рабочей камере цилиндра 3 мультипликатора, который заполняется рабочей жидкостью 2, закрывается поршнем 4 и помещается в автоклав 5 и закрывается стопорным кольцом 6. Установка снабжена манометром 7. При достижении давления 100-200 МПа процесс прессования считается законченным. Далее образцы извлекают и помещают в лиофильную сушку. Процесс завершен.

Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса, включающий осуществление среза расщепленного свиного дермального трансплантата без эпидермального слоя толщиной 1,0 мм, промывание его в дистиллированной воде и нарезание на равные квадраты размерами 3×3 см с последующим выдерживанием в растворе хлористого натрия 0,9% в течение 8-10 минут, полученные образцы подвергают ультразвуковому воздействию мощностью 900 Ватт в течение 10-15 секунд и последующему воздействию изостатическим давлением до 180-200 МПа в течение 2-3 минут, после чего осуществляют сушку образцов.