Средство для заместительной клеточной терапии

Изобретение относится к биологии, медицине, косметологии и ветеринарии и может быть использовано для заместительной клеточной терапии при лечении ожогов, ран различной этиологии и костных тканей. Изобретение представляет собой средство, содержащее биополимерный носитель и клетки, нанесенные на указанный носитель, отличающееся тем, что в качестве биополимерного носителя оно содержит коллаген-хитозановую пленку, или крошку коллаген-хитозановой пленки, или высокополимерный гель в виде 5%-ного раствора макрогола-1500, а в качестве клеток оно содержит клетки диплоидного штамма легкого человека ФЭЧ 16-1 или клетки диплоидного штамма кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2 в концентрации 2,0-3,0×10⁵ на 1 см² на носителе в виде пленки или крошки или 1,0×10⁶ на 1 миллилитр на носителе в виде 5%-ного раствора макрогола в форме высокополимерного геля. Изобретение обеспечивает получение новых средств для заместительной терапии на основе стандартного аттестованного клеточного материала, получение возможности подбора оптимальной формы средства, что позволяет сократить сроки лечения и расширить область его применения в заместительной терапии. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к биологии, медицине, косметологии и ветеринарии и может быть использовано для заместительной терапии при лечении глубоких и обширных ожогов, отморожений, травм опорно-двигательного аппарата, трофических язв на фоне хронической венозной недостаточности, хронических ран после длительных нагноительных процессов, трофических язв на фоне сахарного диабета, гнойно-некротических процессов, хронических незаживающих ран различного генеза (чистые раны, раны с гнойным или серозным отделяемым), угревой болезни и ее последствий, келоидных, атрофических и гепертрофических рубцов кожи, трещин, ссадин, пролежней, а также длительно незаживающих ран различной этиологии.

Восстановление целостности тканевых покровов является одной из актуальных проблем современной медицины. В настоящее время в мировой практике для замещения дефектов кожи созданы аналоги кожи с использованием фибробластов человека для лечения ожоговых и трофических ран. Фибробласты ускоряют механизм регенерации кожи за счет вырабатываемых ими факторов роста: основной фактор роста фибробластов (β-FGF) влияет на рост всех типов клеток в ране, стимулирует продукцию внеклеточного матрикса (коллаген, эластин, фибронектин); β-трансформирующий фактор роста (β-TGF) стимулирует хемотаксис фибробластов и выработку ими новых волокон коллагена, эластина и фибронектина; эпидермальный фактор роста (EGF) усиливает пролиферацию и миграцию кератиноцитов; фактор роста кератиноцитов (KGF) ускоряет заживление и эпителизацию ран; α-трансформирующий фактор роста (α-TGP) активно влияет на ангиогенез. Фибробласты продуцируют компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан, коллаген 1, 2, 3 и 4 типов. Сочетание этих факторов вызывает рост грануляций и появление краевой и островковой эпителизации, а также способствует заживлению ран различной этиологии. Диплоидные фибробласты имеют ограниченный срок жизни (40-55 пассажей), фаза активного роста - 10-30 пассажей. Культивированные диплоидные фибробласты сохраняют стабильные свойства в течение десятков пассажей, легко поддаются пассированию, при котором частично утрачивают поверхностные антигены гистосовместимости.

Известен препарат Transcyte® производства компании «Smith and Nephew Wound Management Largo» (США), который представляет собой двухслойную модель заменителя кожи и состоит из синтетической основы (наружный слой - силикон, внутренний слой - нейлон) и посаженых во внутреннем слое неонатальных фибробластов (Патент США №5450939, МПК A61L 27/60, опубликован 24.10.1995). Данный препарат относится к временным заменителям кожи, выполняет барьерную функцию и защищает от вторичного инфицирования, снижает боль и дает биоактивные дермальные компоненты (коллаген I типа, фибронектин, гликозаминогликаны).

Недостатками данного препарата являются:

- синтетическая основа препарата не оптимальна для пролиферации и функциональной активности клеток;

- препарат хранится в условиях глубокой заморозки при температуре минус 70°С;

- транспортировка препарата требует условий глубокой заморозки;

- перед использованием препарат нуждается в восстановлении;

- относится к дорогостоящим препаратам.

В США лицензирован и разрешен к применению в клинической практике тканевой комплекс «Apligraf», который состоит из биодеградируемой коллагеновой матрицы, аллогенных донорских кератиноцитов и фибробластов (Brem H. and Kirsner R. Use of Graftskin (Apligraf®) in the treatment of pressure ulcers and acute wounds. Wounds. 2000; 12 (5Suppl A):72A-77A.). Существенным недостатком данного комплекса является его высокая стоимость, а также транспортировка на дальние расстояния требует соблюдения необходимого температурного режима.

Известен препарат «Клеточная культура для заместительной терапии» (Патент РФ №2213775, МПК С12N 5/08, опубликован 10.10.2003 г.). Согласно данному изобретению клеточную культуру ЛЭЧ-4(81) используют в виде взвеси или в виде клеток на синтетической подложке для лечения ожеговых больных, больных с травмами опорно-двигательного аппарата, при восстановлении и коррекции функции поврежденных тканей и органов.

Недостатками данного препарата являются:

- активный компонент - диплоидная культура клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), полученная в 1985 году (Авторское свидетельство СССР №1147448, МПК С12N 7/00, опубликован 30.03.1985 г.) имеет ограниченный срок жизни, который составляет не более 45-50 генераций. За 24-летний «срок жизни» штамма диплоидных клеток ЛЭЧ-4(81), вначале используемого для диагностики вирусных инфекций, а сейчас - для заместительной терапии (примерно с 1982 по 2006 г.), ресурс его в настоящее время крайне ограничен;

- формы препарата в виде взвеси клеток или в виде клеток на синтетической подложке недостаточно эффективны и имеют узкий спектр использования (только для ожоговых больных, больных с травмами опорно-двигательного аппарата).

Известен дермальный эквивалент живой кожи в виде монослоя клеток фибробластов на хитозановых пленках (Патент США №4572906, опубликован в 1986 г.). Хитозан относится к природным полимерам, обладает бактериостатическими, фунгицидными, гемостатическими свойствами и высокой гигроскопичностью, что позволяет успешно применять его в качестве биологически активного вещества при лечении ран. Однако по данным некоторых исследований культивирование фибробластов на хитозановой пленке приводит к частичному апоптозу клеток (Biomacromolecules, 2003, 4(2): 224-231).

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению - прототипом является дермальное раневое покрытие на основе нейтрализованной коллаген-хитозановой губки с посаженными на нее человеческими дермальными фибробластами, которые используют на первом пассаже (международная заявка №WO 00/16817, МПК А61L 15/28, опубликована 30.03.2000).

Коллаген-хитозановая губка - природный биодеградируемый материал. Достоинства этой формы субстрата определяются совокупностью не только биологических свойств хитозана, но и активного ранозаживляющего эффекта коллагена, который является природным субстратом для культивирования различных типов клеток. Раневое покрытие обладает высокой адгезивной способностью, индуцирует миграцию эпителиальных клеток в рану, за счет высокого содержания основных аминокислот обеспечивает восполнение матриксного компонента дермы.

К основным недостаткам можно отнести губчатое строение раневого покрытия. Известно, что для культивирования клеток используют питательные среды с добавлением сыворотки крови животных. Губка имеет большую сорбционную емкость, и оставшаяся в ней сыворотка несет угрозу инфицирования и аллергических реакций, а плоская поверхность губки затрудняет лечение ран с неровной поверхностью. Кроме того, для приготовления готовой формы препарата используют нестандартный материал: дермальные фибробласты первого пассажа, при этом время культивирования клеток составляет 7 суток. Необходимо отметить также дороговизну зарубежной продукции и трудности транспортировки.

Техническим результатом изобретения является получение новых препаратов для заместительной терапии на основе стандартного аттестованного клеточного материала, получение возможности подбора оптимальной формы препарата (пленка, или крошка, или гель с клетками фибробластов), что сокращает сроки лечения и расширяет область его применения в заместительной терапии.

Указанный технический результат достигается тем, что в средстве для заместительной терапии, содержащем биополимерный носитель и клетки, нанесенные на указанный носитель, согласно изобретению в качестве биополимерного носителя средство содержит коллаген-хитозановую пленку, или крошку коллаген-хитозановой пленки, или высокополимерный гель, а в качестве клеток оно содержит аттестованные клетки диплоидного штамма легкого человека ФЭЧ 16-1 или аттестованные клетки диплоидного штамма кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2.

Концентрация клеток диплоидных штаммов на носителе в виде пленки или крошки составляет 2,0-3,0×10⁵ на 1 см² или на носителе в виде геля составляет до 1,0×10⁶ на 1 миллилитр.

Клетки диплоидных штаммов нанесены с одной или двух сторон коллаген-хитозановой пленки или ее крошки.

В качестве коллаген-хитозановой пленки или ее крошки средство содержит коллаген-хитозановую пленку (или крошку) типа «Коллахит ФА», а в качестве высокополимерного геля содержит 5%-ный раствор макрогола-1500.

Коллаген-хитозановая пленка на основе водорастворимого хитозана, сшитого с коллагеном глутаровым альдегидом, является отечественным зарегистрированным пленочным раневым покрытием. Коллаген и хитозан являются естественными природными компонентами, обладающими регенераторными свойствами. Пленка толщиной 0,5-1 мм, размером 5 см × 8 см, коллаген-хитозановая пленка в виде крошки размером 1 мм × 1 мм или 2 мм × 2 мм. Срок деградации пленки составляет 10-28 дней.

Макрогол-1500 является высокомолекулярным веществом, представляющим собой длинные линейные полимеры, которые с помощью водородных связей способны связывать молекулы воды. 5%-ный раствор макрогола-1500 - бесцветная гелеобразная масса, рН 5,7, термостабилен.

Активным компонентом препаратов являются новые штаммы диплоидных клеток легкого человека ФЭЧ 16-1 и кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2, которые защищены патентом РФ (Патент РФ №22850405, МПК С12N 5/08, опубликован 10.10.2006 г.). Штаммы диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 имеют высокую пролиферативную активность; типичную морфологию; кариотип и энзимограмму, характерную для клеток донора; не содержат посторонних агентов; являются онкогенно безопасными; сохраняют стабильность биологических свойств. Штаммы аттестованы в соответствии с национальными требованиями и требованиями ВОЗ, рекомендованы Комитетом МИБП РФ и ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора для использования в заместительной терапии. Созданы запасы стандартного аттестованного материала клеток в виде посевных и рабочих банков, заложенных на хранение в достаточном количестве (250 и более ампул в каждом) для использования в заместительной терапии.

Диплоидные клетки человека нанесены с одной или двух сторон коллаген-хитозановой пленки или крошки. Пленка или крошка, покрытая с двух сторон клетками, не требует выбора «активной стороны».

Заявляемое средство для заместительной терапии было испытано на специфическую активность в опытах in vivo и in vitro, а также в клинических условиях при лечении ран различной этиологии. Проведенные испытания показали, что разработанное средство для заместительной терапии обладает выраженным ранозаживляющим действием и может быть рекомендовано как перспективное лекарственное средство.

Новым по сравнению с прототипом является:

- использование в качестве активного компонента новых штаммов диплоидных клеток легкого человека ФЭЧ 16-1 и кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2;

- использование стандартного материала клеток, аттестованного в соответствии с национальными требованиями и требованиями ВОЗ;

- сокращение времени культивирования клеток до 2 суток и, как следствие, сокращение времени получения готовой формы препарата;

- использование в составе препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» в качестве биополимерного носителя дешевого и доступного материала - коллаген-хитозановой пленки на основе водорастворимого хитозана, сшитого с коллагеном глутаровым альдегидом;

- использование в составе препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» в качестве носителя - крошки коллаген-хитозановой пленки;

- применение измельченной коллаген-хитозановой пленки «Коллахит-ФА» в виде крошки позволяет избежать затруднения оттока отделяемого и аэрации раны и снизить риск гнойных осложнений в случае наличия инфекции в ране;

- использование в составе препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» в качестве биополимерного носителя дешевого и доступного материала - макрогола-1500;

- расширение спектра применения препарата: лечение глубоких и обширных ожогов, отморожений, травм опорно-двигательного аппарата, трофических язв на фоне хронической венозной недостаточности, хронических ран после длительных нагноительных процессов, трофических язв на фоне сахарного диабета, гнойно-некротических процессов, хронических незаживающих ран различного генеза (чистые раны, раны с гнойным или серозным отделяемым), угревой болезни и ее последствий, келоидных, атрофических и гипертрофических рубцов кожи, трещин, ссадин, пролежней, а также длительно незаживающих ран различной этиологии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами рецептур, получения, способа применения, изучения специфической активности и использования в клинической практике средства для заместительной терапии при лечении ран различной этиологии.

Ниже приведены примеры составов заявляемых препаратов.

Пример 1. Препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная.:

- слой диплоидных клеток человека ФЭЧ 16-1 в концентрации 2,0×10⁵ клеток на 1 см²;

- коллаген-хитозановая пленка в виде листа размером 5 см × 8 см.

Пример 2. Препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная.:

- слой диплоидных клеток человека ФЭЧ 16-2 в концентрации 3,0×10⁵ клеток на 1 см²;

- коллаген-хитозановая пленка в виде листа размером 5 см × 8 см.

Пример 3. Препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная.:

- слой диплоидных клеток человека ФЭЧ 16-1 в концентрации 2,0×10⁵ клеток на 1 см²;

- коллаген-хитозановая пленка в виде крошки размером 1 мм × 1 мм.

Пример 4. Препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная.:

- слой диплоидных клеток человека ФЭЧ 16-2 в концентрации 3,0×10⁵ клеток на 1 см²;

- коллаген-хитозановая пленка в виде крошки размером 2 мм × 2 мм;

Пример 5. Препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» в 1 мл:

- суспензия диплоидных клеток человека ФЭЧ 16-1 - 1×10⁶ клеток;

- 5%-ный раствор макрогола-1500 - остальное до 1 мл.

Пример 6. Препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» в 1 мл:

- суспензия диплоидных клеток человека ФЭЧ 16-2 - 1×10⁶ клеток;

- 5%-ный раствор макрогола-1500 - остальное до 1 мл.

Ниже приведены описания технологий получения заявляемых препаратов (составы по примерам 1-6), реализуемых с соблюдением правил асептики.

Пример 7. Получение заявляемого средства на основе пленки.

В бутылку или чашку Петри помещают коллаген-хитозановую пленку в виде листа, вносят 15 мл суспензии диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 или ФЭЧ 16-2 в концентрации 1×10⁵ или 2×10⁵ клеток в 1 мл, добавляют ростовую питательную среду, состоящую из 90% питательной среды Игла MEM и 10% сыворотки крови плодов коровы, инкубируют при температуре 37°С. Через 2 суток сливают ростовую питательную среду, добавляют питательную среду Игла MEM, бутылки закрывают резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками, чашки Петри герметично укупоривают пленкой «Parafilm».

Пример 8. Получение заявляемого средства на основе измельченной пленки в виде крошки.

В бутылку помещают коллаген-хитозановую пленку в виде крошки и ростовую питательную среду (90% питательной среды Игла MEM и 10% сыворотки крови плодов коровы) в соотношении 1:1, вносят суспензию диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 или ФЭЧ 16-2 в концентрации 1×10⁶ клеток в 1 мл, инкубируют при температуре 37°С течение 2 суток. Через 2 суток сливают ростовую питательную среду, добавляют питательную среду Игла MEM, бутылки закрывают резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками.

Пример 9. Получение заявляемого средства на основе геля.

Суспензию диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 или ФЭЧ 16-2 вносят в бутылку вместимостью 0,5 л, добавляют 5%-ный раствор макрогола-1500 из расчета 1×10⁶ клеток в 1 мл. Бутылки закрывают резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками.

Пример 10. Способ применения препаратов по примерам 1-4.

Перед применением препарата (примеры 1-4) «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» бутылку или чашку Петри вскрывают, осторожно сливают среду в стерильный лоток. Заливают в бутылку или чашку Петри физиологический раствор, осторожно сливают его в стерильный лоток. Процедуру повторяют дважды. Отмытую пленку или крошку помещают на поверхность раны.

После обработки раны или операции некрэктомии препарат (примеры 1, 2) распределяют из расчета 6-12 пленок на 1000-2000 см² раневой поверхности. Сверху рану закрывают раневым покрытием или стерильной салфеткой, фиксируют марлевой повязкой. На следующие сутки после трансплантации у ожоговых больных можно проводить аутодермопластику расщепленным аутолоскутом перфорированным в соотношении 1:4. Перед проведением аутодермопластики необходимо удалить с поверхности раны пленку. Пленку удаляют стерильным зажимом, в случае сильного прикрепления к поверхности раны проводят промывание поверхности раны физиологическим раствором из шприца или промывают рану салфеткой, обильно смоченной физиологическим раствором. Количество аппликаций препарата на отдельный участок ожоговой поверхности - однократно.

При лечении трофических поражений кожи и ран различной этиологии препарат (примеры 1, 2) накладывают на рану, обрезая края пленки по форме раны стерильными ножницами. Препарат (примеры 3, 4) равномерно с помощью шпателя наносят на рану. Сверху рану закрывают раневым покрытием или стерильной салфеткой, фиксируют марлевой повязкой. Количество аппликаций препарата - от 2 до 5 с интервалом 3-7 дней.

Пример 11. Способ применения препаратов по примерам 5-6.

Перед применением препарата (примеры 5, 6) «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» флакон или бутылку с содержимым интенсивно встряхивают. После операции некрэктомии на раневую поверхность равномерно с помощью шпателя наносят препарат, сверху рану закрывают стерильной салфеткой или раневым покрытием и фиксируют повязкой. На следующие сутки после трансплантации удаляют с поверхности раны оставшееся количество препарата салфеткой, обильно смоченной физиологическим раствором. После удаления препарата у ожоговых больных можно проводить аутодермопластику расщепленным аутолоскутом, перфорированным в соотношении 1:4. Аутодермопластику больным с хроническими ранами проводят по показаниям.

Рекомендуемая доза препарата при лечении ожогов 30-60 мл препарата на 1000-2000 см² поверхности, при лечении ран различной этиологии 1 мл препарата на 5-10 см². Количество аппликаций при лечении глубоких ожогов (в качестве подготовки ожоговых ран к аутодермопластике) - однократно. При лечении ран различной этиологии, поверхностных ожоговых и донорских ран количество аппликаций от 2 до 5 с интервалом 3-7 дней.

Пример 12. Изучение специфической активности препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная».

Исследование проводили на беспородных мышах массой 18-20 г. Животным под действием хлороформа в области спины делали контактный ожог раскаленным железом до IIIa, б степени, площадью 4 см². Животные в зависимости от используемого для лечения препарата были разделены на опытную и контрольные группы по 5 голов в каждой. На следующие сутки после моделирования ожога и на 7 сутки после хирургического удаления струпа животным наносили препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная». В качестве контроля использовали препарат актовегин или раневое покрытие «Коллахит-ФА».

Оценку процесса заживления проводили по следующим параметрам: экссудация, грануляция, краевая эпителизация, планиметрия. На 31 сутки наблюдения животных взвешивали, забивали посредством дислокации шейных позвонков, производили вскрытие, забор и взвешивание органов.

При гистологическом исследовании изучали раневую поверхность и подлежащие мягкие ткани, печень, селезенку, поджелудочную железу, почки, лимфатические узлы. Кусочки органов фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли ксилолом, заливали в парафин. Срезы толщиной до 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по методу ван Гизона.

В первые сутки у животных отмечали симптомы, характерные для общей клинической картины течения ожогового шока, к 7 суткам во всех группах отмечали краевое отхождение струпа. При использовании препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» к 10 суткам наблюдали образование грануляций и начало краевой эпителизации, а к 14 суткам раны интенсивно гранулировали, отмечена более быстрая краевая эпителизация по сравнению со стандартным препаратом актовегином. К 17 суткам во всех группах отсутствовали экссудация, процессы гранулирования и краевой эпителизации протекали более быстро в опытной группе и более медленно в группе с нанесением препарата «Коллахит-ФА» по сравнению с актовегином. В дальнейшем наблюдалась та же тенденция в заживлении ожеговых ран.

К 31 суткам в группе с нанесением препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» отмечали полную эпителизацию ожоговых ран. Процент заживления ожоговых ран представлен в таблице 1.

Таблица 1.
Данные заживления ожоговых ран во 2-3 фазе заживления при использовании заявляемого монослоя клеток фибробластов на пленке «Коллахит ФА»
Группа	Сутки наблюдения, сутки
10	14	17	21	24	28	31
Опытная - препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная»	38,0%	64,0%	84,4%	91,9%	95,9%	98,7%	100%
Контрольная - актовегин	14,3%	41,1%	74,4%	83,8%	90,5%	95,5%	98,8%
Контрольная - «Коллахит-ФА»	26,3%	28,8%	63,3%	78,3%	88,3%	92,8%	96,9%

При вскрытии животных макроскопических изменений серозных оболочек и внутренних органов не выявлено. Достоверных различий в массе тела и внутренних органов опытной и контрольных животных с ожогами не обнаружено.

В результате гистологических исследований было установлено, что при моделировании термической раны заживление раны сопровождалось формированием соединительно-тканного рубца с признаками гипертрофии эпидермиса, сохранением воспалительных изменений в дерме во всех группах наблюдения. Степень изменений кожи при применении препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» была выше, при этом регенерация в ране сопровождалась пролиферацией эпидермиса. Реакция паренхиматозных органов соответствовала признакам ожоговой болезни, отражающей реакцию «шоковых» органов и интоксикацию продуктами распада тканей, что проявлялось в дистрофически-некротических изменениях паренхиматозных органов и иммунопатологических реакциях во всех группах животных.

Таким образом, препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» способствовал эпителизации ожоговых ран в более короткие сроки по сравнению с контрольными препаратами, ускоряющим регенерацию.

Заявляемые препараты (препараты по примерам 1-6) были испытаны на стерильность, онкогенность, пирогенность, анафилактогенность, местно-раздражающее действие, острую и хроническую токсичность, специфическую активность. Проведенные испытания показали, что разработанные препараты стерильны, не содержат посторонних агентов; являются онкогенно безопасным, не обладают аллергенными, пирогенными и токсическими свойствами, не вызывают местно-раздражающего действия, эффективны при лечении ожогов и ран различной этиологии.

Пример 13. Использование препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная».

Больной М., 7 лет. Диагноз: ожог пламенем II-IIIб-IV степени туловища, верхних и нижних конечностей. Общая площадь ожога 80%, глубокие ожоги составляли 60%. Ожоговая болезнь.

Применяли химическую некрэктомию с использованием 40% салициловой мази, общее лечение ожоговой болезни. По мере очищения ожоговых поверхностей и формирования гранулирующих ран на 21 сутки была проведена трансплантация препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная». Препарат в виде пленки (примеры 1, 2) распределяли на 1500 см² раневой поверхности. На следующие сутки выполнена трансплантация аутокожи, перфорированной 1:4. Через 7 суток была проведена повторная трансплантация препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» на площади 1900 см² с последующей (на следующие сутки) трансплантацией аутокожи, перфорированной 1:4.

Приживление аутолоскутов 100%. Перфорированные ячейки эпителизовались на 7 сутки. Далее проводили этапные трансплантации аутокожи. Больной выписан на 106 сутки с полностью восстановленным кожным покровом. Осложнений не было.

Пример 14. Использование препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная».

Больной Д., 29 лет. Диагноз: ожог пламенем III a, б-IV степени головы, шеи, туловища, верхних и нижних конечностей, ягодиц. Общая площадь ожога 60% поверхности тела, 40% глубоких ожогов. Закрытый пневмоторакс справа. Ожоговый шок III степени.

Местно применяли химическую некрэктомию. После очищения ран и формирования грануляций на 29 сутки выполнена трансплантация препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» (с предварительным тенгенциальным иссечением грануляционной ткани) на площади 1700 см². Препарат в виде пленки (примеры 1, 2) распределяли на раневой поверхности. На следующие сутки была выполнена аутодермопластика на площади 1900 см² с коэффициентом перфорации 1:4. Через 7 суток трансплантаты полностью жизнеспособны, наступила полная эпителизация ячеек лоскута. Далее были выполнены этапные аутодермопластики с перфорацией 1:2.

Больной выписан на 71 сутки с полностью восстановленным кожным покровом. Осложнений не было.

Пример 15. Использование препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная».

Больная П., 54 года. Сахарный диабет 2 тип. Тяжелое течение. Облитерирующий атеросклероз сосудов правой нижней конечности. Диабетическая стопа. Трофическая язва 5 пальца правой стопы.

В течение месяца проводили местное лечение репаративными и антимикробными средствами (актовегин, левомеколь). Рана имела вид узкого канала шириной 0,3 см, длиной 0,5 см. При введении в канал препарата в виде крошки (примеры 3, 4), препарат легко распределялся в полости раны. При перевязке на следующие сутки отмечено образование розовых грануляций. После повторной трансплантации препарата через сутки наблюдалось сужение канала раны. Полная эпителизация произошла на 14 сутки.

Пример 16. Использование препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения».

Больной Ч., 52 года. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, нейропатическая диабетическая стопа, трофическая язва культи 1 пальца стопы. Сопутствующий диагноз: остеомиелит 1 плюсневой кости слева. Длительность диабета: 10 лет. Длительность диабетической стопы: 2 месяца. Уровень гликемии: 13,7 ммоль/л. Коррекция гликемии: простой инсулин. Тип кровотока в нижних конечностях: магистральный. Операция: некрэктомия, резекция 1 плюсневой кости.

Таблица 2.
Данные, полученные при лечении гелем
Показатели	Сроки наблюдения, сутки
до воздействия	3	5	10	15
внешний вид	свежая, глубокая, кратерообразная рана, глубиной 4 см с подлежащей культей плюсневой кости	плоская рана, выполненная гелеобразной массой, похожей на грануляционную ткань	чистая плоская рана, выполненная грануляционной тканью	плоская рана, поверхность представляет рыхлую соединительную ткань, полоска краевой эпителизации	то же
площадь раны	5 см кв.	5 см кв.	5,3 см кв.	5 см кв.	4,6 см кв
цитограмма	в поле зрения эритроциты и нейтрофилы	гель, нейтрофилы, округлые фибробласты 1-3 в поле зрения, волокнистые структуры	обилие палочно-кокковой флоры, активные и разрушенные лейкоциты, масса гистеоидных клеток и волокнистых структур, единичные фибробласты	много фиброцитов и волокнистых структур на чистом фоне	то же
микробиологический посев	обильный рост смешанной аэробно-анаэробной микрофлоры	обильный рост смешанной микрофлоры	обильный рост микрофлоры	обильный рост микрофлоры

Непосредственно после операции некрэктомии на свежую рану был нанесен препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения». В таблице 2 представлены данные, полученные при лечении.

Рана на 2 сутки после операции некрэктомии и трансплантации препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» имела плоский вид и выполнена массой, напоминающей рыхлую грануляционную ткань, что сохранялось в течение всего периода наблюдения (до 10 суток). В мазках-отпечатках, наряду с нейтрофилами, определялись фибробласты, волокнистые структуры. К 10 суткам наблюдали обилие микрофлоры. На 15 сутки значительно улучшилось состояние раны, много фиброцитов и волокон на чистом фоне.

Пример 17. Использование препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения».

Больной Д., 58 лет. Диагноз основной: сахарный диабет, диабетическая некропатическая стопа. Трофическая язва культи 1 пальца правой стопы. Сопутствующий диагноз: остеомиелит 1 плюсневой кости. Длительность диабета: впервые выявленный. Длительность диабетической стопы: 3 месяца.

Уровень гликемии: 6-8 ммоль/л. Коррекция гликемии: маннинил. Тип кровотока: магистральный. Операция: некрэктомия. Эпиневролиз большеберцового нерва справа. После некрэктомии проведена аппликация препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения». В таблице 3 представлены данные, полученные при лечении.

У больного без значительных изменений кровообращения в нижних конечностях наступила полная эпителизация раны.

Таким образом, препарат «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, культура клеток монослойная» для лечения глубоких ожогов был эффективен при подготовке больного к аутодермопластике. При этом приживление аутолоскутов достигало 90-100%, а сроки заживления перфорированных ячеек сокращались до 7 суток (без использования препарата сроки заживления составляли 21 сутки, при этом лоскут лизировался в 20-30 случаев).

Таблица 3
Данные, полученные при лечении гелем
Показатели	Сроки наблюдения, сутки
до воздействия	3	5	10	50
внешний вид	на месте ампутированного пальца стопы вяло гранулирующая рана с подлежащей плюсневой костью	гранулирующая рана	чистая гранулирующая рана	чистая гранулирующая рана с ободком новообразованного эпителия	рубец
площадь раны	5,5 см кв.	5,5 см кв.	5,5 см кв.	2,2 см кв.	0
цитограмма	нейтрофилы, детрит	нейтрофилы, детрит	фибробласты 3-5 в поле зрения, волокнистые структуры	небольшое количество лейкоцитов, единичные фибробласты, гистиоциты и волокнистые структуры	-
микробиологический посев	обильный рост микрофлоры	обильный рост микрофлоры	умеренный рост микрофлоры	-	-

При трансплантации препарата больным с обширными ожогами при гранулирующих, но слабо эпителизирующихся ранах отмечен положительный эффект и сокращение сроков эпителизации на 5-6 суток. Сроки закрытия и эпителизации ожоговых ран влияют на выраженность рубцовых изменений: чем раньше закрыты ожоговые поверхности, тем менее выражены рубцовые деформации.

При лечении трофических ран различной этиологии и гнойно-некротических процессов использование препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» после операции некрэктомии на «свежую» рану» позволяло обортировать 1-ю фазу раневого процесса - гидратации и очищения, при этом ускорялся процесс заживления в целом. На слабо гранулирующих ранах, а также на трофических язвах с практически отсутствующими грануляциями применение препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, гель для наружного применения» усиливало рост грануляций и эпителизацию ран. При длительно существующих трофических язвах с большими размерами, а также при наличии заболеваний, осложняющих течение трофических язв, наблюдали значительное улучшение в виде очищения ран, сокращения размеров, появление грануляций и краевой эпителизации.

1. Средство для заместительной клеточной терапии при лечении ожогов, ран различной этиологии и костных тканей, содержащее биополимерный носитель и клетки, нанесенные на указанный носитель, отличающееся тем, что в качестве биополимерного носителя оно содержит коллагенхитозановую пленку, или крошку коллагенхитозановой пленки, или высокополимерный гель в виде 5%-ного раствора макрогола-1500, а в качестве клеток оно содержит клетки диплоидного штамма легкого человека ФЭЧ 16-1 или клетки диплоидного штамма кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2 в концентрации 2,0-3,0·10⁵ на 1 см² на носителе в виде пленки или крошки или 1,0·10⁶ на 1 мл на носителе в виде 5%-ного раствора макрогола в форме высокополимерного геля.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что клетки диплоидных штаммов нанесены с одной или двух сторон коллагенхитозановой пленки или ее крошки.

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве коллагенхитозановой пленки или крошки оно содержит коллагенхитозановую пленку или крошку типа «Коллахит ФА».