Способ фабрикации трехмерных биопленок микроорганизмов

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов, не связанных с субстратом, и биопленкоподобный агрегат микроорганизмов, не связанных с субстратом, полученный этим способом. Способ включает культивирование указанных микроорганизмов, помещенных в парамагнитную среду для культивирования соответствующих микроорганизмов, содержащую парамагнетик в количестве, достаточном для обеспечения левитации микроорганизмов в неоднородном магнитном поле, в условиях магнитной левитации в центральной области неоднородного магнитного поля с наименьшими параметрами напряженности поля. Изобретения обеспечивают получение модельных биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов, не связанных с какими-либо поверхностями или другими субстратами и имеющих трехмерную структуру, для использования при разработке лекарственных препаратов, асептических средств. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 4 пр.

 

Область техники

Настоящая группа изобретений относится к микробиологии, более конкретно, к способу создания трехмерных биопленок микроорганизмов. Предлагаемая технология может быть полезна для изучения свойств микроорганизмов, для разработки лекарственных средств против хронических инфекций и для других применений, которым требуется модель из неприкрепленных биопленкоподобных агрегатов.

Уровень техники

Общеизвестно, что бактерии существуют в двух состояниях: единичные плавающие планктонные клетки и связанные с поверхностью клеточные агрегаты, известные как биопленки [Costerton, J. W. et al., Annu. Rev. Microbiol 49(1):711 (1995)]. Биопленки представляют собой связанные с поверхностью трехмерные многослойные структуры, образованные бактериями или другими микроорганизмами (такими как археи (архебактерии), грибы, микроводоросли, простейшие) или их консорциумами и самопродуцируемой матрицей, состоящей из экзополисахаридов, белков, внеклеточной ДНК и липидов [ Flemming, H. & Wingender, J. Nat Rev Microbiol 8, 623–633 (2010); Zhang R. et al. N. Biotechnol 51:21-30.. (2019)]. Обычно биопленки описываются как структуры, образованные на твердой поверхности и реже – на поверхности жидкости [Gilbert, P et al. J Appl Microbiol, 92 Suppl, 98S-110S (2002)]. Это биопленки, связанные с твердой поверхностью, которые лучше всего изучены с использованием нескольких моделей in vitro. Наиболее популярными моделями биопленок являются системы микротитровальных планшетов и ферментеры с постоянным потоком [McBain, A. J. Advances in Applied Microbiology (2009)]. Эти модели сыграли ключевую роль в понимании основных этапов роста и созревания биопленок и механизмов, которые ими управляют. Большинство исследований, в которых установлена исключительная роль биопленок в защите бактерий от антибиотиков и других вредных внешних воздействий, проводились с использованием in vitro моделей биопленок, связанных с поверхностью [Jass, J. et al.J. Ind. Microbiol. (1995)]. Образование биопленки усиливает устойчивость бактерий к антибиотикам в сотни раз по сравнению с одноклеточными планктонными бактериями [Høiby, N et al. Int J Antimicrob Agents, 35 (4), 322-32 Apr (2010)]. Механизмы защиты, обеспечиваемые биопленками, включают ограниченную диффузию некоторых антибиотиков через матрицу, накопление антибиотико-модифицирующих ферментов в матрице, и дифференциальный метаболический статус микробной популяции, включая наличие в популяции так называемых голодных бактерий, генерирующих строгий ответ, обеспечивающий выживание бактериальных клеток в неблагоприятных условиях за счёт экономии ресурсов, а также наличие метаболически инертных клеток, известных как персисторы [Walters, M. C., et al. Antimicrob. Agents Chemother Jan; 47(1): 317–323 (2003)].

Биопленки, образованные патогенными микроорганизмами, особенно бактериями, играют важную роль в клинической патологии. Помимо известной роли в развитии внутрибольничных инфекций, связанных с формированием биопленок на медицинских устройствах, имплантатах, катетерах и др., биопленки участвуют в развитии хронических инфекций [Gominet, M et al. APMIS 125 (4), 365-375 (2017)]. Биопленки, образованные бактериальными патогенами, являются доказанным фактором развития хронического бронхита, отита и риносинусита [Høiby, N et al. Future Microbiology 5 (11), 1663-74 (2010)]. Бактерии в биопленках защищены от гуморального и клеточного иммунного ответа, поскольку диффузия растворимых факторов ограничена матрицей, а иммунные клетки не способны прорываться через биопленки [Alhede, M. et al.. Microbiology 155(Pt 11):3500-8 (2009)].

Между тем, разработка методов микроскопии позволила проводить анализ биопленок in vivo в образцах тканей. Во многих случаях было показано, что связанные с хроническими заболеваниями биопленки не связаны с поверхностями тканей человека, а скорее левитируют в физиологических жидкостях [Alhede, M. et al. PLoS One 6(11): e27943 (2011)]. Это различие указывает на ограничения существующих in vitro моделей биопленок [Roberts, A. E. L. J Mol Biol, 427 (23), 3646-61 (2015)]. Несмотря на то, что морфологические особенности биопленок, сформированных на абиотических поверхностях и in vivo, оказались сходными, механизмы, лежащие в основе образования прикрепленных к поверхности биопленок и неприкрепленных биопленкоподобных агрегатов, и особенно начальных стадий этих процессов, могут, если не отличаться, то иметь иной характер. Важность исследований неприкрепленных биопленкообразных агрегатов еще более возросла с описанием агрегатов, образующихся бактериями, выращенными в условиях микрогравитации [Zea, L. et al. Front. Microbiol. 8, 1598 (2017)].

Поскольку модели in vitro поверхностно прикрепленных биопленок не всегда полно и точно моделируют процессы, происходящие в формируемых микроорганизмами биопленках в реальных условиях, для исследователей, работающих в области микробиологии и связанных с ней областях, весьма актуальным является создание моделей биопленок, максимально приближенных к реальным.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка метода и создание трехмерных биопленокоподобных агрегатов микроорганизмов, не прикрепленных к субстрату, свойства которых приближены к свойствам микроорганизмов в биопленках, образуемых микроорганизмами в реальных условиях.

Для этого предлагается новый подход к созданию in vitro агрегатов микроорганизмов, в частности бактерий. Не связанные с субстратом (т.е. неприкрепленные к субстрату) агрегаты формируются микроорганизмами, выращенными в условиях магнитной левитации, которая достигается путем помещения микроорганизмов в парамагнитной питательной среде в неоднородное магнитное поле, созданное специально разработанными постоянными магнитами, подробно описанными в статье Parfenov V.A. et al. Scaffold-free, label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly, 10(3):034104. Biofabrication (2018).

Более подробно, предлагается способ получения биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов, не связанных с субстратом, включающий их культивирование в условиях магнитной левитации в неоднородном магнитном поле.

В некоторых вариантах воплощения способ характеризуется тем, что микроорганизмы культивируют в центральной области неоднородного магнитного поля с наименьшими параметрами напряженности поля.

В некоторых вариантах воплощения неоднородное магнитное поле создают с использованием магнитной системы, состоящей из, по меньшей мере, двух кольцевых неодимовых магнитов, обращенных одноименными полюсами друг к другу.

В некоторых вариантах воплощения неоднородное магнитное поле создают с использованием магнитов Биттера.

В некоторых вариантах воплощения микроорганизмы представляют собой простейшие, грибы, микроводоросли, грамположительные или грамотрицательные бактерии, и/или их консорциумы.

В некоторых вариантах воплощения микроорганизмы помещают в неоднородное магнитное поле в емкости для культивирования в виде суспензии в парамагнитной питательной среде, представляющей собой среду для культивирования микроорганизмов, содержащую парамагнетик.

В некоторых частных вариантах воплощения парамагнитные свойства среды обеспечиваются за счет присутствия в среде гадолиния (Gd³⁺).

В некоторых частных вариантах воплощения гадолиний добавляют в среду в виде гадобутрола.

Микроорганизмы культивируют в условиях магнитной левитации в неоднородном магнитном поле в течение времени, необходимого для формирования биопленкоподобных агрегатов. В некоторых вариантах воплощения микроорганизмы культивируют до появления первых признаков формирования агрегатов, в других вариантах воплощения микроорганизмы культивируют до образования стойких биопленкоподобных агрегатов, в зависимости от поставленных целей. Длительность культивирования также зависит от вида и штамма микроорганизмов или их консорциумов и может составлять от нескольких минут, часов до суток, недель и более.

В некоторых вариантах воплощения условия культивирования выбирают в зависимости от вида и штамма микроорганизмов или их консорциумов так, чтобы обеспечить оптимальные параметры культивирования для роста и размножения культур. В некоторых других вариантах воплощения условия культивирования подбирают неоптимальным так, чтобы изучить/проанализировать влияние условий культивирования на образование биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов.

В некоторых вариантах воплощения в парамагнитную среду добавляют тестируемые соединения, биологически активные вещества, препараты и/или их смеси (например, тестируемые лекарственные препараты, антисептики и др.) так, чтобы изучить влияние таких препаратов на образование биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов.

Выбор параметров культивирования и добавляемых препаратов, как это указано выше, может осуществляться независимо. Он также может изменяться в процессе культивирования, при необходимости.

В некоторых частных вариантах воплощения микроорганизмы культивируют в закрытой пробирке или закрытом шприце.

В некоторых вариантах воплощения по мере роста микроорганизмов в емкость с культивируемыми микроорганизмами вносят дополнительное количество парамагнитной среды. В некоторых частных вариантах воплощения по мере роста микроорганизмов обеспечивается постоянное поступление в емкость с культивируемыми микроорганизмами дополнительного количества парамагнитной среды.

В некоторых вариантах воплощения микроорганизмы предварительно (до их помещения в условия магнитной левитации в неоднородном магнитном поле) культивируют в парамагнитной питательной среде в течение времени, необходимого для их адаптации к среде культивирования. В некоторых частных вариантах воплощения время предварительного культивирования может составлять от 0 часов до нескольких суток, более предпочтительно, - от 1 до 24 часов, еще более предпочтительно, - от 5 до 12 часов.

Поставленная задача решается также путем создания трехмерных биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов, полученных описанным выше способом.

В частных вариантах воплощения биопленкоподобные агрегаты микроорганизмов по изобретению образованы такими микроорганизмами как простейшие, грибы, микроводоросли, грамположительные или грамотрицательные бактерии, и/или их консорциумами.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- впервые разработан способ, позволяющий создавать в условиях in vitro несвязанные с поверхностью (т.е. неприкрепленные к поверхности) биопленки (биопленкоподобные агрегаты) микроорганизмов;

- получаемые биопленкоподобные агрегаты не связаны с какими-либо поверхностями или другими субстратами и имеют трехмерную структуру, образованную микроорганизмами (в частности, бактериями) и внеклеточным матриксом;

- получаемые биопленкоподобные агрегаты по своим свойствам похожи на биопленки. Эти свойства включают:

(i) образование биопленкоподобных агрегатов происходит в результате размножения и роста микроорганизмов; это свойство аналогично образованию микроколоний, как важного этапа формирования биопленок;

(ii) образуемые агрегаты представляют собой трехмерные структуры, образованные микроорганизмами и внеклеточным матриксом, при этом внеклеточный матрикс является продуктом микроорганизмов, формируемым по мере их роста и развития, а не образован белками питательной среды;

- получаемые биопленкоподобные агрегаты обладают высокой стабильностью и жизнеспособностью и пригодны для их использования при тестировании и разработке лекарственных средств против инфекций, вызываемых микроорганизмами, в патогенезе которых участвует биопленкообразование, в том числе хронических и не поддающихся лечению инфекций, при разработке антисептических препаратов и/или растворов в целях обработки различных поверхностей, а также для других применений, в которых требуется модель биопленок или неприкрепленных биопленкоподобных агрегатов; результаты тестов антибиотиков и других противомикробных средств и препаратов на таких культурах намного ближе к ситуации in vivo по сравнению с двумерными биопленкоподобными агрегатами;

- предлагаемый способ может быть использован в земных условиях для моделирования роста микроорганизмов в условиях микрогравитации;

- предлагаемым способом могут быть созданы биопленкоподобные агрегаты практически любого требуемого размера, при этом макроскопический размер бактериальных агрегатов позволяет в реальном времени отслеживать процессы роста и развития агрегатов, а также влияние на их развитие различных условий и внесения тестируемых препаратов;

- предлагаемый способ пригоден для его масштабирования путем обеспечения постоянного пополнения/притока парамагнитной среды культивирования.

Подробное описание изобретения

Ранее был описан целый ряд моделей in vitro, обеспечивающих левитацию бактерий. Так, для создания условий диамагнитной левитациии использовался сверхпроводящий магнит, который генерировал высокоградиентное магнитное поле высокой интенсивности (17 Тл) [Dijkstra, C. E. et al. Journal of the Royal Society Interface (2011)]. В указанных условиях наблюдался повышенный рост бактерий, однако образования агрегатов не наблюдалось.

В статье Sriramulu, et al. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-76 (2005) описано моделирование поведения P. aeruginosa в альвеолах пациентов с муковисцидозом (МВ) - наследственным заболеванием, вызванным мутациями, вызывающими дефицит секреции хлорида, с последующим накоплением густой застойной слизи в альвеолах легких. В данной работе патогены были выращены в высоковязкой синтетической слизистой среде ASM, включающей муцин и внеклеточную ДНК. Бактерии P. aeruginosa, выращенные в этих условиях, образовывали стабильные не прикрепленные к поверхности полистирола или стекла биопленкоподобные структуры, имитирующие структуры, наблюдаемые в условиях in vivo, однако при этом микроорганизмы росли в плотных микроколониях, прикрепленных к компонентам мокроты. Полученные таким образом биопленкоподобные структуры являются примером двумерных биопленок, тестирование антибиотиков с помощью которых показывает завышенную эффективность, не подтверждаемую в дальнейшем при проведении клинических исследований.

Сосуд с вращающейся стенкой (Rotating Wall Vessel), разработанный в Космическом Центре Джонсона (Хьюстон, Техас), который является наиболее популярной моделью микрогравитации на Земле, обеспечивает образование неприкрепленных бактериальных агрегатов в условиях постоянного вращения [Nickerson, C. A., et al. Mol. Biol. Rev. (2004)]. Однако Rotating Wall Vessel не может обеспечить образование стабильных трехмерных биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов по причине турбулентности и гемодинамического напряжения, возникающих вследствие постоянного перемещения жидкости в сосуде.

Магнитная левитация широко используется в промышленности и исследованиях для создания условий, в которых объект подвешен без какой-либо опоры, кроме магнитных полей, противодействующих гравитации [Sadiku, M. & Akunjuobi, C. IEEE Potentials 25, 41–42 (2006)]. Для достижения эффекта обычно используется комбинация постоянных магнитов и диамагнетиков или сверхпроводников. В биологии магнитная левитация используется в микрофлюидных исследованиях для разработки систем сбора и анализа клеток [Wang, Z. M. et al. Sci. Rep. (2016)].

Способ, предлагаемый по изобретению, основан на росте бактерий в условиях магнитной левитации, где магнитная сила уравновешивает гравитационную силу. Магнитная левитация достигается путем помещения растущей бактериальной культуры в магнитную ловушку. Эффект улавливания основан на дифференциальных магнитных свойствах клеток, которые являются диамагнитными, и содержащей гадолиний среды, которая является парамагнитной, в неоднородном магнитном поле. Находясь в градиенте магнитного поля, бактерии собираются в области магнитного поля с самой высокой интенсивностью, в то время как среда занимает область магнитного поля с самой низкой интенсивностью. Далее приведено подробное описание методики, которая позволяет получить in vitro биопленкоподобные агрегаты микроорганизмов, не связанные с субстратом, а также продемонстрировано, что такие агрегаты обладают основными характеристиками, присущими биопленкам.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1

А - Схема магнитного биопринтера: 1 - корпус, 2 - магнитный блок, 3 – глазок (окно для наблюдений), 4 - портал для установки кюветы;

В - Направление размещения кюветы в биопринтере;

С - Комбинация постоянных магнитов с учетом градиента магнитного поля: 1 - два магнитных кольца, объединенных полюсами одинаковой полярности, 2 - металлическая коробка, 3 - крепление коробки с крышкой;

D - Внутренняя часть биопринтера, где размещена кювета;

Е - Магнитное поле, формируемое внутри биопринтера. Цифрой 1 обозначена область, в которой происходит сборка агрегатов в «магнитной ловушке».

Фиг. 2. Поведение бактерий в условиях магнитной левитации:

A – Накануне вечером в культуру E. coli ATCC 43890 добавили 0,2 М гадобутрола, и на следующий день культуру поместили в биопринтер. Снимки были сделаны через специальный глазок (см. Фиг. 1) сразу (0 ч), через 9 часов и 24 часа, размеры популяции бактерий измерялась в те же моменты времени;

B – Накануне вечером в культуру E. coli ATCC 43890 добавили 0,1 М гадобутрола, и на следующий день культуру поместили в биопринтер. Снимки были сделаны через 24 часа;

C - Накануне вечером культуру E. coli ATCC 43890 развели в соотношении 1:100 0,1М парамагнитной питательной средой (LB с добавлением 0,1 М гадобутрола), на следующий день культуру поместили в биопринтер и инкубировали при 37 °С в течение 24 часов. Снимки были сделаны сразу после того, как кювета была извлечена из биопринтера;

D – К культуре, представленной на Фиг. 2С, добавили парамагнетик до концентрации 0,2 М гадобутрола и инкубировали при 37 °С в течение 24 часов.

Фиг. 3. Культуры бактерий выращивали в условиях магнитной левитации. Накануне вечером культуры бактерий развели в соотношении 1:100 0,2 М парамагнитной питательной средой и на следующий день культуру поместили в биопринтер и инкубировали при 37 °С в течение 24 часов.

А. Изображения маленьких шариков, образованных различными штаммами бактерий внутри биопринтера, полученные через глазок биопринтера.

B. Высота и ширина шариков. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD) в трех экспериментах.

Фиг. 4. Жизнеспособность бактерий, выращенных в магнитной ловушке:

A. (1) Культура бактерий E. coli ATCC 43890, выращенных на бульоне LB на протяжении ночи, (2) культура бактерий, выращенных на бульоне LB и затем инкубированных с добавлением 0,2 М гадобутрола в магнитном биопринтере в течение 24 часов и (3) культура бактерий, выращенных в парамагнитной питательной среде, содержащей 0,2 М гадобутрола, в магнитном биопринтере в течение 24 часов; бактерии высевали в десятичных разведениях; на диаграмме показаны концентрации, рассчитанные по трем независимым экспериментам.

B. Относительное количество живых (зеленый) и мертвых (красный) бактерий в культурах, выращенных в магнитной ловушке в течение 24 часов.

С. Пример микрофотографий бактерий E. coli ATCC 43890, использованных для автоматического подсчета клеток. Данные представляют собой среднее значение (± SD), рассчитанное по 10 фотографиям, сделанным в трех независимых экспериментах.

Фиг. 5. Микроскопическое изображение агрегатов, образованных E. coli ATCC 43890. Бактерии были выращены в магнитной ловушке в течение 7 дней и зафиксированы 2,5% глутаровым альдегидом. После этого часть образца окрашивали SYBR Green и FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biopilm Matrix Stain (A и B), а другую часть подготовили для СЭМ (SEM)-анализа.

A – По результатам КЛСМ (CLSM)-анализа было показано, что бактериальные агрегаты образованы бактериями и внеклеточным матриксом; детектируются удлиненные, а также нормальные бактериальные клетки;

В - 3D реконструкция образца;

C - СЭМ (SEM)-анализ подтверждает мнение, что агрегаты образованы бактериями (небольшие стрелки) и матрицей с везикулярной структурой (наконечник большой стрелки).

Фиг. 6. Биопленки, прикрепленные к субстрату, сформированные тремя штаммами E. coli (ATCC 43890, M-17 и JM109), тестировали в эксперименте на микротитровальных планшетах.

А. Биомассу биопленок определяли в течение 48 часов. Штамм ATCC 43890 не образовывал репрезентативных биопленок, которые могли бы быть обнаружены применяемым методом.

B. Подвижность бактерий определяли через 16 часов после посева бактерий в полужидкий агар. Данные представляют собой среднее значение (± SD) из трех независимых экспериментов.

C. E. coli выращивали на агаре с добавлением красителя Конго красный. Штаммы М-17 (посередине) и JM109 (справа), но не ATCC 43890 (слева), были окрашены в красный цвет, что характерно для бактерий, продуцирующих карлин.

Определения и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

В данном контексте термин «среда» («среда для культивирования», «питательная среда», «бульон») относится к любой среде, предназначенной для культивирования микроорганизмов. Среда может быть твердой (агар), полужидкой ((гелеобразной) – полужидкий агар) и жидкой. Как известно, основными требованиями к питательным средам являются питательность (т.е. должны содержать все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов вещества), значение рН, оптимальное для конкретных микроорганизмов, буферность (содержание веществ, нейтрализующих продукты обмена, для поддержания оптимальных значений рН в процессе культивирования), изотоничность (осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки), стерильность (для получения чистых культур), наличие достаточного количества воды (для обеспечения осмоса и диффузии питательных веществ и продуктов жизнедеятельности), прозрачность и др. Например, для выращивания штаммов Escherichia coli в качестве питательной среды может быть использована Среда LB.

«Парамагнитная среда» («парамагнитная питательная среда») - среда для культивирования микроорганизмов, содержащая парамагнетик. В качестве парамагнетиков могут быть использованы любые соединения, обладающие парамагнитными свойствами, т.е. такие, которые при помещении их во внешнее магнитное поле приобретают намагниченность, направленную вдоль вектора напряжённости магнитного поля. Согласно изобретению, наиболее предпочтительны парамагнетики, не оказывающие токсического воздействия на культивируемые микроорганизмы, такие как, например, соли и хелаты гадолиния, сульфат меди, хлорид марганца и др. Выбирается минимальная концентрация парамагнетика, позволяющая обеспечить левитацию микроорганизмов в неоднородном магнитном поле. Данная концентрация зависит от вида микроорганизмов, параметров магнитного поля, состава среды культивирования, условий культивирования и др.

«Емкость для культивирования» представляет собой, не ограничиваясь, кювету, колбу, сосуд, флакон, шприц, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения предусмотрено, что емкость для культивирования может герметично закрываться. В некоторых вариантах изобретения емкость для культивирования предусматривает возможность добавления парамагнитной питательной среды в процессе культивирования, в том числе с использованием биореакторов. При этом в процессе культивирования микроорганизмов также обеспечиваются и другие необходимые условия для их роста (культивирования, размножения), такие как, не ограничиваясь, атмосфера культивирования (состав газовой среды, в том числе кислородсодержащая среда или, наоборот, бескислородная среда), наличие полноценной питательной среды, температура, давление и др. Условия культивирования подбираются оптимальными в зависимости от вида и штамма микроорганизма (или консорциума микроорганизмов), используемого для получения биопленкоподобных агрегатов (или, наоборот, неоптимальными, в зависимости от поставленных целей). В некоторых вариантах в конструкции емкости для культивирования может быть предусмотрена газопроницаемая мембрана на одной из сторон, обеспечивающая постоянный воздухообмен по мере культивирования микроорганизмов.

«Биоплёнка» - обладающее пространственной и метаболической структурой сообщество (колония) микроорганизмов, расположенных на поверхности раздела сред и погружённых во внеклеточный полимерный самопродуцирующийся матрикс, в состав которого входят полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, гликопротеины и др. Структура биопленки неоднородна и динамична. Биопленки могут быть образованы как одним штаммом микроорганизмов, так и консорциумом микроорганизмов, состоящим, например, из бактерий разных видов или из совокупности различных микроорганизмов (полимикробные биопленки).

«Биопленкоподобные агрегаты (структуры)» (biofilm-Like aggregates (structures)) - сообщества микроорганизмов, погружённых во внеклеточный полимерный матрикс, по своим основным свойствам и характеристикам обладающие свойствами и характеристиками биопленок. В аспекте настоящего изобретения, биопленкоподобные агрегаты получают в результате магнитной левитационной сборки.

«Карлин» – основной белковый компонент сложной внеклеточной матрицы, образуемой многими энтеробактериями; имеет амилоидное происхождение. Волокна карлина ответственны за адгезию, клеточную агрегацию и образование биопленок (Barnhart M.M., Chapman M.R. Annu Rev Microbiol. 60:131-47(2006)).

«Субстрат» («поверхность») - место обитания и развития микроорганизмов, в том числе, например, бактерий, грибов, простейших и др. Субстраты служат местом прикрепления микроорганизмов и могут выполнять роль питательной среды. Субстрат может включать в себя как живые, так и неживые материалы, а также может быть твердым, гелеобразным, жидким.

«Магнитная ловушка» - пространственная конфигурация магнитного поля, созданная для ограничения движения какого-либо объекта. Согласно изобретению, «магнитная ловушка» образуется в центральной области неоднородного магнитного поля и характеризуется увеличением напряжённости поля при удалении объекта от магнитной ловушки в любом направлении. В процессе образования биопленкоподобных агрегатов по изобретению микроорганизмы не могут покинуть магнитную ловушку. «Магнитная ловушка» характеризуется наименьшими параметрами напряженности магнитного поля, обеспечивающими перемещение и последующую сборку в магнитной ловушке левитирующих живых агрегатов (биопленок), состоящих из диамагнитных микроорганизмов, таких как простейшие, грибы, микроводоросли, грамположительные или грамотрицательные бактерии, и/или любые их консорциумы.

Магнитная левитация широко используется в промышленности и научных исследованиях для создания условий, в которых объект подвешен без какой-либо опоры, кроме магнитных полей, противодействующих гравитационному. Для достижения эффекта обычно используется комбинация постоянных магнитов и диамагнетиков или сверхпроводников. В биологии магнитная левитация используется в микрофлюидных исследованиях для разработки систем для сбора и анализа клеток. В настоящем изобретении используется новая система магнитной левитации, разработанная для обеспечения биофабрикации тканевых сфероидов без использования каркасов, описанная ранее в статье Parfenov V.A. et al. Scaffold-free, label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly, 10(3):034104. Biofabrication (2018). Используя эту систему, достигается формирование левитирующих агрегатов микроорганизмов. Эти агрегаты имеют признаки, характерные для бактериальных биопленок. Тем не менее, было продемонстрировано важное различие в механизмах, лежащих в основе образования биопленок на примере E. coli и биопленкоподобных агрегатов.

Поскольку формирование биопленкоподобных агрегатов по изобретению запускает процессы синтеза и накопления внеклеточного матрикса, это стабилизирует трехмерную структуру и постепенно делает ее независимой от наличия внешнего поддерживающего магнитного поля, обеспечивая высокую стабильность и жизнеспособность биопленкоподобных агрегатов.

Описанные методики применимы для создания не связанных с поверхностью агрегатов микроорганизмов, таких как грамотрицательные, и грамположительные бактерии, простейшие, грибы, микроводоросли и их консорциумы, и могут быть использованы при проведении исследований независимых от поверхности (т.е. неприкрепленных к субстрату) биопленок, для тестирования и разработки лекарственных средств против хронических и не поддающихся лечению инфекций, при разработке антисептических препаратов и/или растворов в целях обработки различных поверхностей, а также для других применений, в которых требуется модель биопленок или неприкрепленных биопленкоподобных агрегатов. Результаты тестов антибиотиков и других противомикробных средств и препаратов на таких культурах намного ближе к ситуации in vivo по сравнению с двумерными прикрепленными биопленками, которые во многих случаях показывают слишком высокий эффект, который потом не подтверждается при клинических исследованиях.

Материалы и методы

Магнитная установка

Магнитная установка состоит из так называемого магнитного биопринтера и кюветы, заполненной парамагнитной питательной средой. Магнитный биопринтер показан на рисунке 1А. Основными элементами биопринтера являются магнитный блок (поз.2 на Фиг.1А), портал для установки кюветы (поз.4) и корпус (поз.1 на Фиг.1А). Магнитный биопринтер создает неоднородное магнитное поле в рабочей зоне, где находится кювета (Фиг.1Е). Такая структура магнитного поля формируется за счет специальной конструкции, состоящей из двух магнитных колец NdFeB (N52), соединенных полюсами одинаковой полярности (поз.1 Фиг.1С). В представленном (но не ограничивающем) варианте реализации внешний диаметр магнитов составляет 85 мм; внутренний диаметр - 18 мм; толщина (высота) - 24 мм. Магниты собраны таким образом, что они ориентированы друг на друга одинаковыми полюсами. Неоднородное магнитное поле создается в осевом отверстии магнитной установки (рабочей зоны). Распределение значений магнитной индукции в вертикальном и горизонтальном сечении рабочей зоны показано на диаграмме 3D-модели (Фиг. 1Е). Для фиксации процесса в ходе экспериментов был организован глазок (окно для наблюдений) (поз.3 на Фиг.1А). Магнитная установка включает в себя также ферромагнитный экран, экранирующий магнитное поле.

Принцип действия магнитной установки предполагает создание локальной зоны микрогравитации, в которой компенсируются воздействия всех сил, действующих на объекты. Магнитофоретическая сила появляется только в том случае, если магнитное поле неоднородно. Это вызывает движение частиц от областей, где магнитное поле сильное. Магнитофоретическая сила применима для частиц с нейтральными зарядами, которые имеют относительную проницаемость, отличную от фоновой жидкости. Тогда эффективная магнитофоретическая сила F, действующая на объект в неоднородном магнитном поле, будет описываться следующим соотношением:

F ,

где H - магнитное поле, µ_f - относительная проницаемость жидкости, µ_p - относительная проницаемость частицы (частиц), µ_{0 –} магнитная постоянная, а K определяется как:

.

В том случае, когда относительная проницаемость жидкости и частиц очень близка к 1, магнитофоретическая сила, действующая на частицы, приблизительно линейна с разницей между ними. Поскольку µ> 1 для парамагнетиков и µ <1 для диамагнетиков, разница µ_p - µ_f определяет направление действия магнитной силы. В результате объекты будут выталкиваться в область с меньшей напряженностью поля («магнитную ловушку») под действием магнитофоретической силы. В условиях гравитации Земли уравновешивание объектов происходит на определенном расстоянии от локального минимума магнитного поля.

При проведении экспериментов качестве кюветы использовали стерильные шприцы объемом 5 мл. Шприц наполняли суспензией микроорганизмов (например, бактерий) в парамагнитной питательной среде. Заполненный шприц помещали в рабочую зону магнитного биопринтера.

Для создания парамагнитной питательной среды в питательный бульон добавляли 10 или 20% (по объему) Гадовист® (Gadovist®, Bayer). Гадовист® - это парамагнитная жидкость, используемая для диагностических целей в исследованиях методом МРТ. Действующим веществом Гадовиста® является 1 М гадобутрол ([10-[2,3-дигидрокси-1-(гидроксиметил)пропил]-1,4,7,10-тетраазациклододексан-1,4,7-триацето(3-)-N¹,N⁴,N⁷,N¹⁰,O¹,O⁴,O⁷]гадолиний). 10% или 20% Гадовиста® соответствуют 0,1 М или 0,2 М раствору гадобутрола, соответственно.

Магнитная сила обеспечивает сборку бактериальных клеток или любых других биологических частиц в центре магнитной ловушки (см. поз.1 на Фиг.1E и Фиг.2). Магнитная сила возникает из-за разницы в магнитной проницаемости клеток микроорганизмов, которые являются диамагнитными, и поэтому магнитное поле свободно проходит через них, и парамагнитной питательной средой, которая деформирует магнитное поле, когда систему помещают в неоднородное магнитное поле.

Бактериальные штаммы и условия роста

Некоторые штаммы бактерий, с которыми проводились эксперименты, перечислены в таблице 1. Бактерии обычно культивировали при 37 °С в питательной среде LB (Lysogeny Broth) или BHI (Brain Heart Infusion Agar) (бульон или агар) для грамотрицательных и грамположительных бактерий, соответственно.

Таблица 1. Штаммы бактерий

Вид/ штамм	Окраска по Граму	Общая характеристика	Серотип и другие характеристики
Escherichia coli
JM109	Gram-negative	Лабораторный штамм	O-rough:H48; recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi Δ(lac-proAB) F′ [traD36 proAB+lacIqlacZΔM15]
M-17	Gram-negative	Пробиотик	O2:H6
ATCC 43890	Gram-negative	Вирулентный штамм	O157:H7, продуцент Шига-подобного токсина 1 типа
Listeria monocytogenes
EGDe	Gram-positive	Тип вирулентного штамма	1/2a
Staphylococcus aureus
	Gram-positive	Вирулентный штамм	Нет данных

Согласно изобретению, способ получения биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов, не связанных с субстратом, включает в себя следующие основные этапы:

- культуру микроорганизмов помещают в парамагнитную среду, представляющую собой среду для культивирования микроорганизмов, содержащую парамагнетик;

- культивируют микроорганизмы в течение времени, необходимого для их адаптации к среде культивирования, при этом время культивирования может составлять от 0 часов до нескольких суток, в частности, 1-24 часа, например, 5-12 часов, в зависимости от вида микроорганизма, конкретного штамма и его чувствительности к присутствию парамагнетика; этот этап также может быть пропущен, если адаптация не требуется;

- далее культуру помещают в центральную область неоднородного магнитного поля с наименьшими параметрами напряженности поля, обеспечивая условия магнитной левитации; другие условия культивирования (состав питательной среды, температура, давление, атмосфера культивирования и др.) выбирают в зависимости от вида и штамма микроорганизмов или их консорциумов так, чтобы обеспечить оптимальные параметры культивирования для роста и размножения культур в зависимости от поставленных целей; длительность культивирования зависит от штамма, конечной цели эксперимента и может составлять от нескольких часов до суток, недель и более.

Предлагаемый способ пригоден для масштабирования процесса получения биопленок путем обеспечения постоянного пополнения/притока парамагнитной среды культивирования и поддержания оптимальных условий культивирования.

Примеры

Пример 1. Характеристика поведения бактерий в условиях магнитной левитации в зависимости от исходных параметров культуры и концентрации гадобутрола

Для анализа поведения бактерий в магнитной ловушке в культуру бактерий E. coli штамма ATCC 43890 в бульоне LB вечером накануне исследования добавили Гадовист® в концентрации 20% по объему. Таким образом, концентрация парамагнитного вещества гадобутрола в питательном бульоне составила 0,2 М. На следующий день шприц, содержащий культуру бактерий E. coli штамма ATCC 43890 в парамагнитной питательной среде, поместили в магнитный биопринтер (Фиг. 1). В течение первого часа наблюдения макроскопических изменений в распределении бактерий по объему не было (Фиг. 2А). Начиная со 2-го часа наблюдался клиренс периферических областей. Дальнейшие наблюдения показали, что клиренс, по-видимому, связан с медленным перемещением бактерий от периферии к центру. Через 9 часов после начала эксперимента периферические области были чистыми, в то время как центр кюветы был занят довольно большим шариком, образованным бактериями (Фиг. 2А). Через 24 часа после начала эксперимента шарик уменьшился в объеме по сравнению с 9-часовым моментом времени, но все еще поднимался в шприце, в то время как отдаленные области были на 100% чистыми и, казалось, были свободны от бактерий. Эти наблюдения показали, что бактерии не могут покинуть магнитную ловушку. Длительная инкубация не вызывала дальнейших изменений, что свидетельствует о том, что силы, действующие на бактерии, находились в равновесии. Такой же эксперимент был проведен с 0,1 М гадобутролом. При использовании меньшей концентрации гадобутрола процесс был cхожим, хотя диаметр шарика после 24 часов наблюдения был больше, а его положение было ближе к нижней части шприца (Фиг. 2В).

Затем, с целью обеспечения роста бактерий, условия эксперимента были изменены. Накануне вечером культуру E. coli ATCC 43890 развели в соотношении 1:100 парамагнитной питательной средой, содержащей 0,1 М гадобутрол, и на следующий день культуру поместили в биопринтер и инкубировали при 37 °С в течение 24 часов (Фиг. 2C). Затем концентрацию гадобутрола увеличили до 0,2 М. Через 24 часа после начала эксперимента в центре шприца, заполненного парамагнитной питательной средой (питательная среда, дополненная 0,2 М гадобутролом), находился в левитирующем состоянии небольшой шарик, в то время как периферические области были свободны от бактерий (Фиг. 2D).

После этого сравнивали поведение грамотрицательных и грамположительных бактерий, выращенных в магнитном биопринтере. Три штамма E. coli, включая лабораторный штамм JM109, пробиотический штамм M-17 и патогенный штамм-продуцент токсина Шига ATCC 43890, использовали в качестве модельных грамотрицательных бактерий. Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes были использованы в качестве модельных грамположительных бактерий. Бактерии выращивали в соответствующей парамагнитной питательной среде, содержащей 0,2 М гадобутрола, помещая в магнитный биопринтер на 24 часа. Все протестированные бактерии образовывали шарики, левитирующие в столбе жидкости (Фиг. 3). Геометрические параметры шариков были различными в зависимости от штамма (Фиг. 3Б). Среди 3-х штаммов E. coli шарик, образованный лабораторным штаммом JM109, был значительно больше шариков, образованных патогенным штаммом ATCC 43890 и пробиотическим штаммом M17 (р<0,05). E. coli ATCC 43890 и S. aureus образовали шарики удлиненной формы, в то время как E. coli M-17 и, в особенности, L. monocytogenes образовали более круглые шарики.

Пример 2. Оценка жизнеспособности бактерий в магнитной ловушке

Определение жизнеспособности бактерий

Жизнеспособность бактерий в агрегатах определяли путем окрашивания клеток с помощью набора молекулярных зондов для оценки жизнеспособности бактерий LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes). Бактерии культивировали в течение трех дней в соответствующей парамагнитной питательной среде в условиях магнитного поля. После трех дней культивирования in vitro агрегаты трижды промывали PBS и разрушали встряхиванием в течение 30 секунд для получения суспензии клеток. Суспензии клеток инкубировали в течение 15 минут в PBS, содержащем флуоресцентный краситель SYTO™ 9 (2,5 мкМ) и йодид пропиди (4 мкМ). Окрашенные клетки наблюдали с использованием микроскопа Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon Corporation, Япония) и объективом CFI Plan Apo VC 20 ×/0,75. Для количественной оценки живых и мертвых бактерий был использована нейронная сеть U-Net свёрточной архитектуры, учитывающая функцию потерь с мерой симметричности Дайса [Ronneberger, O. et al. U-net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. in Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics) (2015)]. Сеть была обучена на 100 микроскопических изображениях с микроорганизмами, которые были обработаны человеком. Предсказание сети представляло собой матрицу с вероятностью расположения микроорганизма для каждого пикселя исходного изображения. Затем области с вероятностью, превышающей 0,98, были подсчитаны по алгоритму Сузуки-Абэ (Suzuki-Abe) [Suzuki, S. & be, K. A. Topological structural analysis of digitized binary images by border following. Comput. Vision, Graph. Image Process (1985)].

Анализ клеточной подвижности

Анализ подвижности проводили следующим образом. Для посева в пробирки (шприцы) объемом 50 мл, наполненные бульоном LB, были использованы культуры E. coli, культивированные на стандартных чашках Петри в LB и на протяжении ночи. Посев проводился с помощью бактериальных игл. Подвижность рассчитывали как средний диаметр пятна, измеренный на разных глубинах через 16 часов после посева. Средние значения, взятые из каждого из трех экспериментов, использовались для расчета среднего значения и стандартного отклонения.

Для анализа жизнеспособности бактерий в присутствии гадобутрола оценивали концентрации E. coli ATCC 43890, выращенных в различных условиях. Исходный посев показал концентрации 2,3х10⁹, 2,1х10⁹ и 1,9х10⁸ КОЕ/мл для свежей ночной культуры, выращенной на бульоне LB на протяжении ночи (1), для культуры, выращенной на бульоне LB на протяжении ночи, и далее инкубированной с 0,2 М гадобутролом в биопринтере в течение еще 24 часов (2), и для культуры, выращенной в условиях магнитной левитации в парамагнитной питательной среде (3), соответственно (Фиг. 4А). Полученные результаты продемонстрировали, что после инкубации с 0,2 М гадобутролом бактерии выживали без потери жизнеспособности. Более того, результаты показали, что бактерии размножались в парамагнитной питательной среде, что было видно по увеличению концентрации в процессе культивирования: начальная концентрация бактерий, разведенных в свежей парамагнитной питательной среде, составляла 2,3×10⁷ КОЕ/мл (1/100 от свежей ночной культуры), в то время как конечная концентрация составляла 1,9x10⁸ КОЕ/мл.

Анализ бактериального посева показал, что маленькие шарики, образованные E. coli ATCC 43890, выращенные в магнитном биопринтере, содержали, по меньшей мере, в 10 раз меньше колониеобразующих единиц, чем ночная культура, выращенная в стандартных условиях на мешалке (Фиг. 4А). Это различие может быть вызвано ограниченным ростом в магнитной ловушке или гибелью части популяции бактерий в условиях магнитной левитации. Чтобы выявить мертвые клетки, к бактериальным шарикам, образованным E. coli ATC43890 и другими штаммами в условиях магнитной левитации, было применено дифференциальное окрашивание (методика Live/Dead Assay) (Фиг. 4B). Приблизительно 16% бактерий ATCC 43890 были мертвыми. Мертвые клетки были обнаружены в шариках, образованных всеми штаммами, хотя процент мертвых клеток различался для разных штаммов (Фиг. 4C). L. monocytogenes показали лучшие результаты - только 0,77% мертвых клеток, а результаты для ATCC 43890 и JM109 были худшими (16,58 и 14,3% мертвых клеток соответственно). Тем не менее, это составило лишь небольшой процент от общей популяции, что свидетельствует в пользу других ограничений размножения бактерий в магнитной ловушке, помимо прямой летальности.

Пример 3. Визуализация с помощью электронной микроскопии структур, выращенных в магнитной ловушке, выявила агрегаты с признаками, характерными для биопленок

Визуализация биопленкоподобных агрегатов

Бактерии, выращенные в магнитной ловушке, фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом и промывали PBS 3 раза в течение 10 минут. Структуру агрегатов анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (CLSM и SEM). Клеточные нуклеоиды визуализировались с помощью красителя SYBR Green I. Компоненты матрицы биопленки визуализировались с помощью красителя FilmTracer ™ SYPRO® Ruby Biopilm Matrix Stain. Для получения изображений использовались конфокальный микроскоп Zeiss LSM 510Meta (Carl Zeiss, Германия) и объектив Plan-Apochromat 63/1.4 Oil DIC. Изображения были обработаны с использованием программного обеспечения Zeiss LSM 510Meta версии 3.2. Для СЭМ (SEM) образцы агрегатов готовили в соответствии со стандартной процедурой, используемой для биопленок [Maricarmen Iñiguez-Morenoa et al. Int J Food Microbiol , 303, 32-41 (2019)], и покрывали распылением платиной толщиной 20 нм. Для получения изображений использовался сканирующий электронный микроскоп Camscan S2 (Cambridge Instruments, Великобритания) в режиме SEI с оптическим разрешением 10 нм и рабочим напряжением 20 кВ. Изображения были получены с использованием программного обеспечения MicroCapture (SMA, Российская Федерация).

Первоначальные попытки получить шарики, образованные агрегированными бактериями, в магнитном биопринтере, показали, что инкубированные в течение 24 ч. бактериальные шарики были хрупкими и легко ломались, когда их извлекали из шприца. Инкубация была продлена до 5 и 7 дней. 5- и 7-дневные шарики не были настолько хрупкими и поддерживали макроскопические агрегаты, которые сохраняли свою структуру, что предполагает, что бактерии были каким-то образом связаны между собой. Самый хрупкий шарик, который распался на мелкие осколки, был сформирован лабораторным штаммом E. coli JM109. Наиболее стабильные шарики, которые распадались на большие фрагменты или даже не распадались, а сохраняли стабильную макроскопическую трехмерную структуру длительное время, были сформированы E. coli ATCC 43890 и S. aureus.

7-дневный шарик, образованный E. coli ATCC 43890, выращенный в условиях магнитной левитации, фиксировали глутаровым альдегидом, извлекали из шприца, и сохранившие свою структуру агрегаты подвергали микроскопическим исследованиям. Фиксированный образец метили флуоресцентным красителем, связывающим нуклеиновую кислоту, SYBR Green и красителем FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biopilm Matrix Stain и исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). SYBR Green, который преимущественно окрашивает ядерную ДНК, демонстрировал присутствие множества одиночных бактериальных клеток (Фиг. 5A). Некоторые из клеток были удлинены и достигали 4- или 5-кратной длины нормальной клетки. Бактериальные клетки были погружены в матрицу, окрашенную Ruby Biofilm Matrix Stain, образуя трехмерную структуру (Фиг. 5B).

Чтобы лучше охарактеризовать морфологию бактериальных агрегатов, образованных в условиях магнитной левитации, штамм E. coli ATCC 43890 изучили с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наблюдаемая трехмерная структура подтвердила, что агрегаты образованы бактериальными клетками и продуцируемой ими внеклеточной матрицей. С помощью CLSM внутри агрегатов были обнаружены окруженные внеклеточным матриксом длинные бактериальные клетки, а с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) были выявлены окруженные внеклеточным матриксом короткие и почти овальные клетки.

Пример 4. Карлин, который строго необходим для формирования двумерных прикрепленных биопленок E. coli , не имел значения для формирования биопленкоподобных агрегатов в условиях магнитной левитации

Сходство между левитирующими агрегатами, полученными в магнитной ловушке, и двумерными прикрепленными биопленками позволяет предположить, что формирование агрегатов может быть вызвано механизмами, подобными образованию биопленок. Кишечная палочка является одной из наиболее изученных моделей с точки зрения формирования биопленок. Как показано выше, размер и стабильность агрегатов, образованных в магнитной ловушке, были разными для различных штаммов E. coli, использованных в исследовании. Чтобы продолжить сравнение левитирующих агрегатов с двумерными прикрепленными биопленками, изучали образование двумерных прикрепленных биопленок на абиотических поверхностях тремя штаммами E. coli.

Микропланшетный анализ динамики формирования биопленок

Для тестирования образования биопленок, прикрепленных к субстрату, использовали стандартный анализ на микротитровальном планшете [Merritt, J. H., Kadouri, D. E. & O’Toole, G. A. Curr. Protoc. Microbiol. (2011)]. Инкубированную в течение ночи культуру E. coli разводили 1:100 в свежем бульоне LB и инкубировали в 96-луночном микротитровальном планшете в течение 48 часов. Затем лунки промывали PBS и окрашивали 0,1% раствором кристаллического фиолетового в течение 10 минут. Для оценки биомассы биопленки краситель солюбилизировали путем добавления 95% этанола в каждую окрашенную лунку с последующим переносом раствора в 96-луночный планшет с плоским дном для измерения оптической плотности на длине волны 500 нм с использованием спектрофотометра iMark (BioRad).

Анализ продукции карлина (curli)

Для выявления продукции карлина использовали анализ связывания с Конго красным (CR) [Reichhardt, C. et al. PLoS One (2015)]. Конго красный добавляли в агар LB до конечной концентрации 25 мкг/мл. Бактерии высевали и инкубировали 24 часов при 37 °С. Связывание выявлялось как красное окрашивание бактериальной культуры вследствие связывания Конго красного с амилоидными структурами карлина.

Прежде всего, сравнивали образование двумерных прикрепленных биопленок различными штаммами E. coli. Для оценки эффективности образования биопленки был использован стандартный анализ с помощью планшетов для микротитрования. Патогенный штамм ATCC 43890 был худшим с точки зрения образования биопленки в этом тесте (Фиг. 6А). Даже через 48 ч. в стандартных условиях этот штамм не образовывал репрезентативных биопленок. Два других штамма E. coli, JM109 и M-17, образовали биопленки более эффективно. Затем мы сравнивали моторику бактерий и производство ими карлина. В ранее проведенных исследованиях было показано, что сама по себе подвижность, жгутики и карлин важны для формирования биопленки E. coli (см. Pratt и Kolter, 1998; Prigent-Combaret et al., 2000; Wood et al., 2006). Исследования роста бактерий в полужидком агаре показали, что штамм JM109 был наименее подвижным среди трех штаммов, в то время как ATCC 43890 был наиболее подвижным (Фиг. 6B). Для анализа производства карлина был использован тест на связывание с красителем Конго красным. Штаммы JM109 и M-17 эффективно связывали Конго красный, что позволяет подтвердить продукцию ими карлина (Фиг. 6C). Патогенный штамм ATCC 43890 не связывал краситель Конго красный, что свидетельствовало об отсутствии карлина на его поверхности. Последний результат соответствовал низкому производству биопленки этим штаммом в модели микротитрования. Интересно, однако, что штамм ATCС 43890 при этом эффективно образовывал агрегаты в магнитной ловушке.

Полученные данные свидетельствуют о том, что способность образовывать трехмерные неприкрепленные биопленкоподобные агрегаты и способность образовывать биопленки на абиотической поверхности не всегда полностью коррелируют и являются скорее совпадением, а не обусловлены идентичными механизмами формирования.

Таким образом, впервые был разработан способ, позволяющий создавать в условиях in vitro несвязанные с поверхностью (т.е. неприкрепленные к поверхности) биопленки (биопленкоподобные агрегаты) микроорганизмов. Было продемонстрировано, что в результате осуществления предлагаемого способа различные микроорганизмы, в том числе, но не ограничиваясь, например, грамотрицательные и грамположительные бактерии, образуют трехмерные неприкрепленные биопленкоподобные агрегаты. Получаемые биопленкоподобные агрегаты не связаны с какими-либо поверхностями или другими субстратами и имеют трехмерную структуру, образованную микроорганизмами (в частности, бактериями) и внеклеточным матриксом. При этом рост микроорганизмов является необходимым условием для формирования агрегатов. Получаемые биопленкоподобные агрегаты обладают высокой стабильностью и жизнеспособностью. В экспериментах было показано, что после 3-дневного роста жизнеспособность бактерий в агрегатах варьировала от 83,4 до 99,7% в зависимости от штамма. При этом показано, что получаемые биопленкоподобные агрегаты по своим свойствам похожи на биопленки, образуемые микроорганизмами в естественных условиях. Показано, что образование биопленкоподобных агрегатов при осуществлении предлагаемого способа происходит в результате размножения и роста микроорганизмов; это свойство аналогично образованию микроколоний, как важного этапа формирования биопленок.

Биопленкоподобные агрегаты, образованные штаммом E. coli ATCC 43890, изучали с помощью CLSM и SEM. Было показано, что образуемые агрегаты представляют собой трехмерные структуры, образованные микроорганизмами и внеклеточным матриксом, при этом внеклеточный матрикс является продуктом микроорганизмов, формируемым по мере их роста и развития, а не образован белками питательной среды. Некоторые клетки E. coli в биопленкоподобных агрегатах имели удлиненную морфологию. SEM-анализ подтвердил результаты CLSM и продемонстрировал везикулярную морфологию матрикса. Сравнение двумерных прикрепленных биопленок и неприкрепленных биопленкоподобных агрегатов по изобретению выявило разницу в механизмах, лежащих в основе их образования. В частности, карлин, который необходим для формирования двумерных прикрепленных биопленок E. coli, не требовался для образования неприкрепленных агрегатов.

Дополнительными преимуществами метода, предлагаемого настоящим изобретением, над существующими являются отсутствие ограничений по размеру аппарата и составу среды. Кроме того, макроскопический размер получаемых биопленкоподобных агрегатов позволяет в реальном времени отслеживать процессы роста агрегатов. Масштабирование процесса получения биопленок возможно при использовании магнитной установки с обеспечением постоянного пополнения/притока парамагнитной среды культивирования, в которую дополнительно также могут быть включены антибиотики, специальные маркеры и другие компоненты, в зависимости от поставленных целей. Предлагаемая простая схема может быть полезна для моделирования поведения различных микроорганизмов, а также влияния на их развитие различных условий и внесения тестируемых препаратов, например, моделирования поведения бактерий при развитии хронических инфекций, таких как хронический бронхит, отит и риносинусит, у пациентов без МВ и соответствующего накопления слизи, а также для моделирования роста микроорганизмов в условиях микрогравитации в земных условиях.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Так, при подборе оптимальных условий культивирования, без внесения каких-либо существенных модификаций, предлагаемый способ может быть успешно использован для получения биопленкоподобных агрегатов таких микроорганизмов как простейшие, грибы, микроводоросли, грамположительные или грамотрицательные бактерии, или любых их консорциумов.

1. Способ получения биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов, не связанных с субстратом, включающий культивирование указанных микроорганизмов, помещенных в парамагнитную среду, представляющую собой среду для культивирования соответствующих микроорганизмов, содержащую парамагнетик в количестве, достаточном для обеспечения левитации микроорганизмов в неоднородном магнитном поле, в условиях магнитной левитации в центральной области неоднородного магнитного поля с наименьшими параметрами напряженности поля,

при этом микроорганизмы представляют собой бактерии или их консорциумы, в том числе консорциумы бактерий с грибами и/или микроводорослями.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что неоднородное магнитное поле создают с использованием магнитной системы, состоящей из по меньшей мере двух кольцевых постоянных магнитов, обращенных одноименными полюсами друг к другу.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что неоднородное магнитное поле создают с использованием магнитов Битера.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что неоднородное магнитное поле создают с использованием сверхпроводящих магнитов.

5. Способ по п.1, в котором бактерии представляют собой грамположительные или грамотрицательные бактерии.

6. Способ по п.1, в котором микроорганизмы помещают в неоднородное магнитное поле в емкости для культивирования в виде суспензии в парамагнитной среде, представляющей собой среду для культивирования микроорганизмов, содержащую парамагнетик.

7. Способ по п.6, в котором парамагнитные свойства среды обеспечиваются за счет присутствия в среде гадолиния.

8. Способ по п.7, в котором гадолиний добавляют в среду в виде гадобутрола.

9. Способ по п.7, в котором по мере роста микроорганизмов обеспечивается поступление в емкость с культивируемыми микроорганизмами дополнительного количества парамагнитной среды.

10. Способ по п.1, в котором условия культивирования подбирают в зависимости от выбранных микроорганизмов так, чтобы обеспечить оптимальные условия и/или изучить влияние условий культивирования на образование биопленкоподобных агрегатов микроорганизмов.

11. Способ по п.7, в котором в парамагнитную среду добавляют тестируемые соединения, биологически активные вещества, препараты и/или их смеси.

12. Способ по п.1, в котором микроорганизмы предварительно, до помещения в условия магнитной левитации, культивируют в среде культивирования в присутствии парамагнетика в течение времени, необходимого для адаптации микроорганизмов к среде культивирования.

13. Способ по п.12, в котором время предварительного культивирования составляет от 0 часов до нескольких суток.

14. Способ по п.12, в котором время предварительного культивирования составляет от 1 до 24 ч.

15. Способ по п.12, в котором время предварительного культивирования составляет от 5 до 12 ч.

16. Биопленкоподобный агрегат микроорганизмов, не связанных с субстратом, полученный способом по любому из пп.1-15, при этом микроорганизмы представляют собой бактерии или их консорциумы, в том числе консорциумы бактерий с грибами и/или микроводорослями.

17. Биопленкоподобный агрегат микроорганизмов по п.16, в котором бактерии представляют собой грамположительные или грамотрицательные бактерии.