Способ обеззараживания псевдотуберкулезного микроба

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу обеззараживания микроорганизмов, и может быть использовано для обеззараживания псевдотуберкулезного микроба. Сущность: клетки псевдотуберкулезного микроба культивируют при 28°С в течение 48 ч на плотной питательной среде, смывают забуференным (рН 7,2) физиологическим раствором и получают взвесь концентрацией 1×10⁹-90×10⁹ микробных клеток в 1 мл. В микробную взвесь добавляют раствор мочевины в концентрации от 6 до 8 М в соотношении по объему 1:1 и инкубируют в течение 24 ч при температуре 20-25°С. Способ позволяет расширить арсенал способов обеззараживания псевдотуберкулезного микроба. 4 пр.

 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам обеззараживания микроорганизмов, и может быть использовано для обеззараживания псевдотуберкулезного микроба.

Для обеззараживания микроорганизмов широко используются физические методы (термическое воздействие, механическое, воздействие газов), химические (органические и неорганические растворители, детергенты), их сочетания и т.д. Однако применяемые физические и химические методы чаще ведут к потере нативных свойств обрабатываемых клеток, а химические вещества зачастую вредны для исследователя и оказывают негативное воздействие на окружающую среду. Поэтому разработка простых в исполнении, экологичных, эффективных способов обеззараживания микроорганизмов, в том числе псевдотуберкулезного микроба, остается актуальной задачей.

Работа с микроорганизмами III-IV групп патогенное™, к которым относится псевдотуберкулезный микроб, предполагает биологическую защиту исследователя и окружающей среды (Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28 января 2008 г. №4), что предусматривает обеззараживание патогенного материала с помощью общепринятых способов использования высоких температур, воздействия формальдегида, фенола и других химических веществ.

В качестве одного из общепринятых способов обеззараживания микробных клеток Yersinia pseudotuberculosis используется кипячение при 100°С (Псарева Е.К., Ермолаева С.А., Тимченко Н.Ф. ПЦР-система для детекции Yersinia pseudotuberculosis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2018. - №2. - С. 89-93), но, в этом случае, белки бактериальной клетки необратимо денатурируют.

Известен способ обеззараживания псевдотуберкулезного микроба путем обработки микробных клеток 1% раствором фенола (Бахолдина С.И., Санина Н.М., Шубин Ф.Н., Попова О.Б., Соловьева Т.Ф. Термо-тропное поведение липидов и морфология клеток Yersinia pseudotuberculosis с высоким содержанием лизофосфотидилэтаноламина // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - №3. - С. 321-328). Однако фенол очень токсичен для окружающей среды, относится к высоко опасным веществам, при попадании на кожу или при вдыхании он вызывает ожоги, оказывает нейротоксическое действие.

В ряде случаев культуры клеток обеззараживают ацетоном в течение 20 минут (Новикова О.Д., Хоменко В.А., Емельяненко В.И., Лихацкая Г.Н., Зелепуга Е.А., Ким Н.К., Исаева М.П., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Сидорова О.В., Соловьева Т.Ф. OmpC-подобный порин из Yersinia pseudotuberculosis: молекулярная характеристика, физико-химические и функциональные свойства // Биологические мембраны. -2011. - Т. 28. - №2. - С. 95-110). Однако, ацетон относится к веществам, обладающим наркотическим действием, он медленно выводится из организма, разрушает нервную систему, оказывает эмбриотоксическое действие (Майорова Л.П., Соболевская Л.А. Совершенствование методик определения ацетона и метанола в пробах природных и сточных вод // Ученые заметки ТОГУ. - 2015. - Т. 6.- №1.-С. 57-63).

Наиболее близким к предлагаемому является способ обеззараживания псевдотуберкулезного микроба с помощью 0,2% формалина (Патент РФ №2084522, МПК⁶ C12N 1/20, A61K 39/02, Опубл. 20.07.1997). Чистую культуру Yersinia pseudotuberculosis выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 18-24 часов, смывают стерильным физиологическим раствором и дважды отмывают тем же раствором путем центрифугирования при 5000 g в течение 15 минут с последующим ресус-пендированием осадка. По стандартному образцу мутности доводят концентрацию микробных клеток до 2×10⁹, добавляют формалин до конечной концентрации 0,2%, выдерживают в течение 20-24 часов при +15°С, +25°С.

Однако, обработка бактериальных клеток формалином приводит к образованию стабильных межмолекулярных поперечных связей между аминокислотами и основаниями нуклеиновых кислот, происходят существенные необратимые конформационные изменения полипептидной цепи белка, что может приводить к деформации антигенных эпитопов микроорганизма. (Ласкавый В.Н. Формальдегид: метаболизм, антибактериальные, терапевтические и иммуномодулирующие свойства (обзор) // Аграрная наука. - 2005. - №10. - С. 21-25). Также формалин - это токсичное соединение, которое опасно как для исследователя, так и для окружающей среды, относится ко второму классу опасности (ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия). При попадании формалина в организм теплокровных происходят значительные клеточные и органные повреждения.

Задачей изобретения является расширение арсенала способов обеззараживания псевдотуберкулезного микроба, разработка безопасного как для исследователя, так и для окружающей среды способа обеззараживания псевдотуберкулезного микроба, сохранение без изменений полипептидной цепи белка клеток микроба.

Технический результат изобретения достигается тем, что клетки псевдотуберкулезного микроба (Yersinia pseudotuberculosis) культивируют при 28°С в течение 48 часов на плотной питательной среде, смывают забуференным (рН 7,2) физиологическим раствором (ЗФР) и получают взвесь концентрацией 1×10⁹ - 90×10⁹ микробных клеток в 1 мл. В микробную взвесь добавляют при постоянном перемешивании раствор мочевины в концентрации от 6 М до 8 М в соотношении по объему 1:1 и выдерживают в течение 24 часов при температуре 20-25°С.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что клетки псевдотуберкулезного микроба культивируют при 28°С в течение 48 часов на плотной питательной среде, смывают забуференным (рН 7,2) физиологическим раствором и получают взвесь концентрацией 1×10⁹ - 90×10⁹ микробных клеток в 1 мл. В микробную взвесь добавляют при постоянном перемешивании раствор мочевины в концентрации от 6 М до 8 М в соотношении по объему 1:1 и выдерживают в течение 24 часов при температуре 20-25°С.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «новизна».

Предлагаемые концентрации мочевины и другие предлагаемые режимы способа позволяют эффективно обеззараживать псевдотуберкулезный микроб, при этом не приводят к необратимым конформационным изменениям полипептидной цепи белка (т.е. обратимо денатурируют белки). При уменьшении концентрации мочевины снижается эффективность обеззараживания, а при повышении - усложняется способ, так как мочевина при высоких (насыщенных) концентрациях раствора плохо растворяется и требуются дополнительные манипуляции. Кроме того, при очень высоких концентрациях мочевины происходят необратимые изменения белков микробной клетки. Мочевина является природным агентом, который не загрязняет окружающую среду, более того, мочевина является источником азота для растений, используется в сельском хозяйстве, медицине и безопасна для человека. Таким образом, предлагаемый способ эффективен, прост в исполнении и экологичен.

Предлагаемый способ может использоваться в микробиологических лабораториях для обеззараживания псевдотуберкулезного микроба.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом: живые клетки псевдотуберкулезного микроба культивируют при 28°С в течение 48 часов на плотной питательной среде, смывают забуференным (рН 7,2) физиологическим раствором (ЗФР) и получают взвесь (по стандартному образцу мутности) концентрацией 1×10⁹ - 90×10⁹ микробных клеток в 1 мл. В микробную взвесь добавляют при постоянном перемешивании раствор мочевины в концентрации от 6 М до 8 М в соотношении по объему 1:1 и затем инкубируют смесь в течение 24 часов при температуре 20-25°С. Для подтверждения обеззараживания псевдотуберкулезного микроба проводят бактериологический контроль стерильности.

Пример 1. Клетки псевдотуберкулезного микроба (штамм Y. pseudotuberculosis 3704 (О:1b)) культивируют на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 28°С в течение 48 часов. После культивирования бактериальную массу стерильно смывают ЗФР (рН 7,2) и по стандартному образцу мутности доводят концентрацию до 1×10⁹ м. к./мл. В полученную микробную взвесь добавляют при постоянном помешивании 8 М раствор мочевины в соотношении по объему 1:1. После инкубации в течение 24 часов при температуре 20°С достигается полное обеззараживание бактериальной массы, что подтверждается отрицательным бактериологическим контролем стерильности.

Пример 2. Клетки псевдотуберкулезного микроба (штамм Y. pseudotuberculosis 3704 (0:1b)) культивируют как описано в примере 1 и по стандартному образцу мутности доводят концентрацию до 1×10⁹ м. к./мл. В полученную микробную взвесь добавляют при постоянном помешивании 6 М раствор мочевины в соотношении по объему 1:1. После инкубации в течение 24 часов при температуре 25°С достигается полное обеззараживание бактериальной массы, что подтверждается отрицательным бактериологическим контролем стерильности.

Пример 3. Клетки псевдотуберкулезного микроба (штамм Y. pseudotuberculosis 3704 (O:1b)) культивируют как описано в примере 1 и по стандартному образцу мутности доводят концентрацию до 90×10⁹ м. к./мл. В полученную микробную взвесь добавляют при постоянном помешивании 8 М раствор мочевины в соотношении по объему 1:1. После инкубации в течение 24 часов при температуре 25°С достигается полное обеззараживание бактериальной массы, что подтверждается отрицательным бактериологическим контролем стерильности.

Пример 4. Клетки псевдотуберкулезного микроба (штамм Y. pseudotuberculosis 3704 (O:1b)) культивируют как описано в примере 1 и по стандартному образцу мутности доводят концентрацию до 90×10⁹ м. к./мл. В полученную микробную взвесь добавляют при постоянном помешивании 6 М раствор мочевины в соотношении по объему 1:1. После инкубации в течение 24 часов при температуре 20°С достигается полное обеззараживание бактериальной массы, что подтверждается отрицательным бактериологическим контролем стерильности.

Таким образом, предложенный способ обеззараживания псевдотуберкулезного микроба является эффективным, доступным, надежным, простым в постановке и воспроизводимым. Обеззараживающий агент безопасен для окружающей среды и для исследователя.

Способ обеззараживания псевдотуберкулезного микроба, включающий выращивание клеток псевдотуберкулезного микроба на плотной питательной среде, сбор бактериальной массы, получение микробной взвеси, добавление к микробной взвеси обеззараживающего вещества и инкубацию смеси, отличающийся тем, что получают взвесь концентрацией 1×10⁹-90×10⁹ микробных клеток в 1 мл, к бактериальной взвеси добавляют раствор мочевины от 6 до 8 М концентрации в соотношении по объему 1:1 и инкубируют в течение 24 ч при температуре 20-25°С.