Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего zo-1 в тканях глаза кролика oryctolagus cuniculus и набор для его определения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области медицины, а именно, иммунологии и молекулярной биологии, и касается способа определения уровня экспрессии гена, кодирующего ZO-1 в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени и набора для его определения. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно, иммунологии, патофизиологии и молекулярной биологии, и касается способа определения уровня экспрессии гена, кодирующего белок плотных контактов ZO-1 в тканях кролика (Oryctolagus cuniculus), с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии, а также на этапе доклинических исследований для оценки состояния барьерных систем глаза и воздействия на них лекарственных препаратов, разрабатываемых для лечения глазных заболеваний.

Плотные контакты (Tight junction, TJ) - межклеточные структуры, расположенные преимущественно на апикальной поверхности эпителиальных, эндотелиальных и мезотелиальных клеток, и осуществляющие барьерную функцию, регулируя поток молекул и ионов из межклеточного вещества через цитоплазматическую мембрану.

Нарушения функции плотных контактов в ретинальном пигментном эпителии (РПЭ) наблюдается при возрастной макулярной дегенерации и наследственных дегенеративных заболеваниях сетчатки, поражение TJ эндотелия ретинальных сосудов отмечено при диабетической ретинопатии, ангиитах и вазоокклюзионных заболеваниях сетчатки. Показано, что воздействие инфекционных агентов, применение ряда лекарственных препаратов, кератопластика ведут к изменению экспрессии белков плотных контактов в эндотелии роговицы. Имеются данные о роли плотных контактов в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток РПЭ.

В комплекс плотных контактов входят три группы белков: интегральные (трансмембранные), каркасные (scaffolding proteins) и сигнальные.

ZO-1 (Zonula occludens-1 ZO-1) или TJP-1 (Tight junction protein-1) является каркасным мембраноассоциированным белком, взаимодействующим со стороны N-конца с трансмембранными белками плотных контактов, регулируя их функцию, а со стороны С-конца - с сигнальными белками (транскрипционными факторами, киназами и фосфатазами) и актиновым цитоскелетом клетки. ZO-1 также ингибирует клеточную пролиферацию путем связывания с транскрипционным фактором ZONAB (ZO-1 associated nucleic acid binding protein), предотвращая его перемещение в ядро.

Метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) один из самых востребованных методов молекулярной биологии, позволивший не только исследовать геном РНК - содержащих микроорганизмов, изучить их роль в развитии инфекционных болезней, но и определять уровень экспрессии генов экспериментальных животных и человека, что обеспечило возможность молекулярной оценки состояния органов и тканей. [Reverse-transcription PCR (RT-PCR) - Bachman J. - Methods Enzymol. 2013; 530:67-74. doi: 10.1016/В978-0-12-420037-1.00002-6]. В настоящее время исследования транскрипции генов, кодирующих белки с широким спектром биологической активности - цитокины, факторы роста, хемоаттрактантные медиторы, рецепторы, структурные белки, гормоны и т.д. применяются в различных областях медицины, ветеринарии и молекулярной биологии и являются перспективным направлением ПЦР-диагностики.

Постановка ОТ-ПЦР включает несколько основных этапов: выделение молекул мРНК из биоматериала, обработку ДНКазой проб с мРНК, синтез молекул кДНК при помощи обратной транскриптазы, определение уровня экспрессии исследуемого гена методом ПЦР, проверку специфичности ПЦР-продукта с помощью электрофореза и анализ полученных результатов.

Количество кДНК в анализируемой пробе зависит от наличия веществ, ингибирующих обратную транскрипцию, скорости разрушения мРНК и др. Для учета всех факторов и их влияния на ход реакции требуется параллельное измерение уровня экспрессии конститутивных генов или генов домашнего хозяйства (housekeeping gene), обычно используемых для нормализации, из которых наиболее стабильной экспрессией обладают гены гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), b - актина [Foss D.L., Baarsch М. J., Murtaugh М.Р. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyl transferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P. 67-78.], а так же субъединицы А сукцинатдегидрогеназы [Nachar W., Busseuil D., Shi Y., Mihalache-Avram Т., Mecteau M., Rheaume E., Tardif J.C. Optimisation of reference genes for gene-expression analysis in a rabbit model of left ventricular diastolic dysfunction. PLoS One. 2014 Feb 18; 9(2)].

Способ оценки уровня экспрессии гена, кодирующего ZO-1 в эпителии роговицы кроликов, описан в работах Localization and expression of zonula occludins-1 in the rabbit corneal epithelium following exposure to benzalkonium chloride [Wensheng Chen, Jiaoyue Hu, Zhenhao Zhang, Lelei Chen, Hui Xie, Nuo Dong, Yongxiong Chen, Zuguo Liu PLoS One. 2012; 7(7):e40893.. Epub 2012 Jul 18] и Benzalkonium chloride suppresses rabbit corneal endothelium intercellular gap junction communication [Zhenhao Zhang, Yue Huang, Hui Xie, Juxin Pan, Fanfei Liu, Xuezhi Li, Wensheng Chen, Jiaoyue Hu, Zuguo Liu PLoS One 2014 Oct 9; 9(10):e109708.. eCollection 2014]. Авторами исследуется влияние бензалкония хлорида (консерванта некоторых лекарственных препаратов, применяемых в офтальмологии) на активность межклеточных взаимодействий через TJ в эндотелии роговицы, а также уровень экспрессии ZO-1 в эпителии роговицы кролика. В этих работах для оценки результатов ПЦР используется метод электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием - более трудоемкий и менее информативный способ, чем ПЦР в реальном времени. Авторами представлены последовательности олигонуклеотидных праймеров к исследуемому и референсному генам, протокол реакции, но отсутствует состав реакционной смеси, что не позволяет воссоздать эксперимент в рамках другой лаборатории.

Известен способ определения уровня экспрессии ZO-1 у мышей в работе по изучению влияния бусульфана на морфологию придатка яичка и гематоэнцефалический барьер [Busulfan administration produces toxic effects on epididymal morphology and inhibits the expression of ZO-1 and vimentin in the mouse epididymis Fang Fang, Ke Ni, Yiting Cai, Qian Zhao, Jin Shang, Xiaoke Zhang, Shiliang Shen, and Chengliang Xiong Biosci Rep.2017 Dec 22; 37(6): BSR20171059]. Авторами представлены последовательности олигонуклеотидных праймеров к исследуемому и референсному генам, но не раскрыты детали постановки - состав реакционной смеси и протокол реакции. Использование мышей для моделирования опыта, в том числе в офтальмологии, широко распространено, однако малый размер глазного яблока не позволяет в полной мере произвести дифференцированную сепарацию тканей и получить качественный биоматериал для анализа.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, доступного, легко воспроизводимого и экономичного способа оценки экспрессии гена ZO-1 в тканях глаза кроликов.

Техническим результатом является получение протокола пробоподготовки, постановки и расчетов результатов ОТ-ПЦР с оптимально подобранным для этого комплектом реагентов, позволяющих с высокой точностью воспроизвести реакцию в условиях ПЦР - лабораторий, для дальнейшего использования в экспериментальной офтальмологии, в доклинических исследованиях медицинских изделий и, в частности, для оценки состояния барьерных систем глаза и воздействия на них лекарственных препаратов, разрабатываемых для лечения глазных заболеваний.

Технический результат достигается за счет:

1) Подбора оригинальных пар праймеров для ZO-1 и GAPDH, обеспечивающих специфическую амплификацию без образования побочных структур.

2) Определения компонентов реакционной смеси - концентраций пары прямого и обратного праймеров, установки оптимальных температур элонгации, денатурации и отжига (методом градиента) и количества циклов амплификации.

3) Использования одного нормировочного гена GAPDH, как наиболее универсального, стабильно экспрессируемого практически всеми клетками организма.

4) Подбора наиболее доступных и экономичных реагентов, их минимального количества без потери эффективности реакции.

5) Снижения временных затрат для каждого этапа постановки.

При выборе пар праймеров в электронной базе данных NCBI Gen Bank с использованием программного обеспечения: Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST отбирались наиболее перспективные последовательности олигонуклеотидов для исследуемых генов. Выбранные последовательности праймеров синтезировались на автоматическом синтезаторе ДНК («Евроген»). В результате были получены 2 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии GAPDH и 3 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии ZO-1.

Заданные параметры конструкции (последовательность и молекулярная масса) праймеров требуют индивидуального подбора количества вспомогательных компонентов реакции, а также определения параметров постановки амплификации на всех этапах реакции (элонгация, отжиг и т.д.).

Для определения оптимальных условий проведения реакции осуществлялся ряд постановок с разной компоновкой реагентов по концентрации и объему, позволившим в итоге опытным путем выбрать наиболее удачный и эффективный вариант. Температура отжига олигонуклеотидных праймеров и продолжительность этапов реакции определялись в режиме выполнения температурного градиента, где ряд пробирок с одинаковым содержимым подвергался одновременной амплификации, но с индивидуальной температурой отжига для каждой пробы, отличающихся между собой на 0,5°С.

Для проведения ОТ-ПЦР использовался термоциклер с оптическим блоком для детекции флуоресценции в режиме реального времени (амплификатор) CFX96 Touch (Bio-Rad). Реакция проводилась в течение 2 часов, одновременно фиксировался флуоресцентный сигнал, полученные данные, обработанные в программе Bio-Rad CFX Manager, в дальнейшем представлялись в таблицах и графиках.

Эффективность реакции амплификации определялась построением калибровочной кривой.

Изобретение осуществляется следующим образом.

С помощью программного обеспечения Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST подобраны 2 пары праймеров для измерения экспрессии GAPDH и 3 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии ZO-1. Ткани кролика О. cuniculus гомогенизируют в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин., с последующим выделением мРНК из образцов. В пробы с полученной мРНК добавляют 1 мкл ингибитора РНКаз, а затем синтезируют кДНК методом обратной транскрипции.

Для амплификации исследуемого и референсного генов при помощи ПЦР в режиме реального времени используют следующие пары праймеров:

GAPDH_F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'

GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'

ZO1_1F-5'-GGTGAAACCTTGCTAAGCCC-3'

ZO1_1R-5'-TTAGGATCACAGTGTGGCAAG-3'

Реакционная смесь для амплификации гена ZO-1 содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер ZO-1_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер ZO-1_1R (концентрация 1 мкМ; Mw 64,90 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Реакционная смесь для амплификации гена GAPDH содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер GAPDH_F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер GAPDH_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Протокол реакции амплификации генов ZO-1 и GAPDH, включает:

- первичная денатурация - 3 минуты 95°С

- амплификационный цикл (х45)

- денатурация - 15 секунд 95°С

- отжиг праймеров - 20 секунд 63,4°С

- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С

Эффективность реакции ОТ-ПЦР определяется уравнением калибровочной кривой, построенной при амплификации образца с известной концентрацией ДНК пятикратно разведенного в 4 раза. Значение эффективности используется в формуле расчета нормированной экспрессии исследуемого гена.

Пример.

Материал исследования - 16 образцов тканевого комплекса сетчатка - хориоидея кроликов, 12 из которых были получены при моделировании атрофии ретинального пигментного эпителия. Образцы забираются в чистые эппендорфы и замораживаются в камере глубокой заморозки при температуре -70°С.

Для получения мРНК замороженная ткань глаза предварительно доводится до однородного дисперсного состояния на гомогенизаторе (например, Silent Crusher S (Heidolph) в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин. мРНК из образцов ткани выделяется по протоколу (Part 1) коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Затем к образцам добавляется 1 мкл ингибитора РНКаз RNase Inhibitor (Qiagen) и обрабатывается ДНКазой DNase Max Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя.

Контроль количества полученной мРНК осуществлялся при помощи спектрофотометра длине волны 260 нм; в нашем случае - мультирежимный имиджер марки Cytation 5 imaging reader (Biotek). Набор iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) используется для следующего этапа - синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции. Для этого в эппендорф вносятся и смешиваются: 9 мкл воды свободной от нуклеаз (Nuclease-free water); 4 мкл 5х iScript Reaction Mix; 1 мкл iScript Reverse Transcriptase; 5 мкл мРНК; 1 мкл RNase Inhibitor (Qiagen).

Общий объем смеси (20 мкл) обрабатывается по протоколу производителя набора iScript cDNA Synthesis Kit на амплификаторе, в нашем случае используется CFX96 Touch (Bio-Rad).

Амплификация кДНК гена ZO-1 проводится так же с помощью термоциклера. Флуоресценция регистрируется за счет добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя SYBR Green I (Евроген).

Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер ZO-1_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер ZO-1_1R (концентрация 1 мкМ; Mw 64,90 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Для амплификации используются праймеры ZO-1

F-5'-GGTGAAACCTTGCTAAGCCC-3'

R-5'-TTAGGATCACAGTGTGGCAAG-3'

Амплификация кДНК гена GAPDH проводится в объеме 15 мкл, реакционная смесь содержит:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер GAPDH_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер GAPDH_1R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)

Для амплификации используются олигонуклеотиды GAPDH

F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'

R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'

Протокол реакции:

первичная денатурация - 3 минуты 95°С

- амплификационный цикл (х45)

- денатурация - 15 секунд 95°С

- отжиг праймеров - 20 секунд 63,4°С

- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С

Дополнительный контроль амплификации осуществляют методом электрофореза в 2% агарозном геле, куда вносят 10 мкл ампликонов смешанных с 6-кратным буфером для загрузки. Анализ результатов ОТ-ПЦР.

Для каждой из тест-проб при помощи программы Bio-Rad CFX Manager определяется пороговый цикл (C_t), при котором количество кДНК во всех реакционных пробирках достигало одинаковой пороговой величины (задавалась программным обеспечением). Воспроизводимость реакции амплификации исследуемого и референсного гена оценивалась постановкой каждой пробы в тройном повторе, где разница между пороговыми циклами составляет не более 0,5 цикла.

Для определения реакционной эффективности праймеров репрезентативный образец пятикратно последовательно разводился в 4 раза, с последующим измерением количества кДНК при каждом разведении на спектрофотометре (например, Cytation 5 imaging reader (Biotek) (фиг. Концентрация кДНК (нг/мкл) в репрезентативной пробе, пятикратно последовательно разведенной в 4 раза) при длине волны 260 нм. Эффективность амплификации образцов, отраженная в калибровочной кривой, рассчитывалась в программе Bio-Rad CFX Manager согласно формулам:

E=10^[-1/m], Е%=(Е-1)×100%, где Е - эффективность, m - наклон стандартной кривой.

Уравнение калибровочной кривой представляет логарифмическую зависимость значения показателя порогового цикла (C_t) пяти образцов разведения репрезентативной пробы от количества кДНК в каждом образце. На фиг. 2 приведены график калибровочной кривой, который показывает зависимость значений C_t, полученных при амплификации пяти стандартных образцов, и значений lg (X_o) этих образцов (А) и график изменения интенсивности свечения репрезентативной пробы при амплификации гена ZO-1 для 5 образцов с последовательно уменьшающейся в 4 раза концентрацией кДНК (Б).

Анализ результатов исследования выполнен методом расчета относительной величины (ΔС) исследуемого образца (ZO-1) по формуле:

Где:

Е - эффективность набора праймеров и зондов.

C_{t (контроля)} - среднее значение C_t для нормировочного гена (GAPDH)

C_{t (образца)} - среднее значение C_t исследуемого образца (ZO-1)

Нормированная экспрессия (ΔΔС) - относительная величина экспрессии исследуемого гена, нормированная к величине экспрессии референсного гена в образце биоматериала, вычислялась по формуле:

Полученное в ходе расчетов значение ΔΔС использовано для оценки экспрессии гена ZO-1.

Таким образом, предложенный способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего ZO-1 кролика Oryctolagus cuniculus методом ПЦР в режиме реального времени и набор для определения позволяют при помощи доступных и экономичных реагентов, используя один референсный ген, сделать вывод о характере экспрессируемого профиля ZO-1 в исследуемой ткани.

1. Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего ZO-1 в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), методом ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем, что включает:

а) использование одного референсного гена GAPDH для нормирования полученных результатов,

б) использование оригинальных пар праймеров для гена ZO-1 кролика Oryctolagus cuniculus

ZO1_1F-5'-GGTGAAACCTTGCTAAGCCC-3'

ZO1_1R-5'-TTAGGATCACAGTGTGGCAAG-3'

и для гена GAPDH кролика Oryctolagus cuniculus

GAPDH_F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'

GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3',

в) гомогенизацию тканей глаза в течение 90 секунд при скорости 45000 об/мин;

г) выделение мРНК из образцов с последующим добавлением к пробе 1 мкл ингибитора РНКаз,

д) синтез кДНК методом обратной транскрипции,

е) амплификацию исследуемого и референсного генов при помощи ПЦР в режиме реального времени с фиксацией флуоресценции при помощи интеркалирующего красителя SYBR Green (Евроген),

ж) определение относительного количества гена ZO-1 и референсного гена GAPDH при помощи калибровочной кривой, построенной при амплификации образца с известной концентрацией ДНК, пятикратно разведенного в 4 раза, эффективность амплификации, определяемая уравнением калибровочной кривой, используется в расчетах относительной величины и нормированной экспрессии исследуемого гена.

2. Набор для определения уровня экспрессии гена, кодирующего ZO-1 кролика Oryctolagus cuniculus по п. 1, включающий:

а) оригинальные олигонуклеотидные праймеры для гена ZO-1 кролика Oryctolagus cuniculus

ZO1_1F-5'-GGTGAAACCTTGCTAAGCCC-3'

ZO1_1R-5'-TTAGGATCACAGTGTGGCAAG-3',

б) оригинальные олигонуклеотидные праймеры для гена GAPDH кролика Oryctolagus cuniculus

GAPDH_F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'

GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3',

в) реакционную смесь ПЦР в режиме реального времени для амплификации гена ZO-1, содержащую:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер ZO-1_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер ZO-1_1R (концентрация 1 мкМ; Mw 64,90 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан),

г) реакционную смесь ПЦР в режиме реального времени для амплификации гена GAPDH, содержащую:

- вода дистиллированная 9,4 мкл

- буфер 1,5 мкл (Евроген)

- прямой праймер GAPDH_F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл

- обратный праймер GAPDH_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл

- dNTP 0,5 мкл

- кДНК 1 мкл

- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл

- Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан),

д) протокол реакции амплификации генов ZO-1 и GAPDH, включающий

- первичная денатурация - 3 минуты 95°С

- амплификационный цикл (х45)

- денатурация - 15 секунд 95°С

- отжиг праймеров - 20 секунд 63,4°С

- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С.