Терапевтические соединения и способы

Группа изобретений относится к конструированию и использованию молекул триспецифических привлекающих киллеры средств. Предложено соединение для лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует опухолевый антиген, которое содержит привлекающий NK домен, содержащий аминокислотные остатки 1-240 SEQ ID No.1 или аминокислотные остатки 19-140 SEQ ID No.14; активирующий NK домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No.15 или аминокислотную последовательность SEQ ID No.15, содержащую аминокислотную замену N72D или аминокислотную замену N72A; первый фланкирующий полипептид, связывающий привлекающий NK домен и активирующий NK домен; направляющий домен, который специфично связывается с указанным опухолевым антигеном; и второй фланкирующий полипептид, связывающий активирующий NK домен и направляющий домен. В частности, предложено соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID No.1 или SEQ ID No.14. Триспецифические привлекающие киллеры средства индуцируют пролиферацию NK-клеток и их пролонгированную выживаемость и могут служить в качестве медиатора ADCC и позволяют растить NK-клетки без необходимости экстракорпоральной генетической модификации и генной терапии. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 22 ил., 3 табл., 4 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННУЮ ЗАЯВКУ

По данной заявке испрашивают приоритет предварительной патентной заявки США № 62/237,835, поданной 6 октября 2015 года, которая включена в настоящее описание посредством ссылки.

ПРАВИТЕЛЬСТВЕННОЕ ФИНАНСИРОВАНИЕ

Это изобретение выполнено при правительственной поддержке по CA111412 и CA65493, выданным National Institutes of Health, и по CA36725, CA72669 и CA197292, выданным National Cancer Institute. Правительство имеет определенные права на изобретение.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит список последовательностей, поданный в электронной форме через EFS-Web в United States Patent and Trademark Office в виде ASCII текстового файла, озаглавленного «2016-10-06-SequenceListing_ST25.txt», который имеет размер 85 килобайтов и создан 6 октября 2016 года. Информация, содержащаяся в списке последовательностей, включена в настоящее описание посредством ссылки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ

Это раскрытие относится к разработке, конструированию и использованию молекул триспецифических привлекающих киллеры средств (TriKE).

В одном из аспектов в этом раскрытии описана молекула, сконструированная так, чтобы содержать привлекающий NK домен, активирующий NK домен, функционально связанный с привлекающим NK доменом, и направляющий домен, который избирательно связывается с клеткой-мишенью и функционально связан с активирующим NK доменом и привлекающим NK доменом.

В некоторых вариантах осуществления активирующий NK домен может содержать по меньшей мере часть цитокина.

В некоторых вариантах осуществления привлекающий NK домен может содержать фрагмент, который избирательно связывается с NK клеткой. Фрагмент, который избирательно связывается с NK клеткой, может активировать NK клетки и/или блокировать ингибирование NK клеток. В некоторых вариантах осуществления привлекающий NK домен может содержать антитело или его фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень может представлять собой опухолевую клетку или клетку, инфицированную вирусом. В некоторых вариантах осуществления направляющий домен может содержать антитело или его фрагмент. В других вариантах осуществления направляющий домен может содержать лиганд или низкомолекулярное соединение, которое избирательно связывается с клеткой-мишенью.

В некоторых вариантах осуществления молекулу можно разрабатывать для того, чтобы включать второй направляющий домен, второй активирующий NK домен или второй привлекающий NK домен.

В другом аспекте этого раскрытия описана молекула, сконструированная для того, чтобы содержать привлекающий T-клетки домен, активирующий T-клетки домен, функционально связанный с привлекающим T-клетки доменом, и направляющий домен, который избирательно связывается с клеткой-мишенью и функционально связан с активирующим T-клетки домен и привлекающим T-клетки доменом.

В некоторых вариантах осуществления активирующий T-клетки домен может содержать по меньшей мере часть цитокина.

В некоторых вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может содержать фрагмент, который избирательно связывается с T-клеткой. Фрагмент, который избирательно связывается с T-клеткой, может активировать T-клетки и/или блокировать ингибирование T-клеток. В некоторых вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может содержать антитело или его фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень может представлять собой опухолевую клетку или клетку, инфицированную вирусом. В некоторых вариантах осуществления направляющий домен может содержать антитело или его фрагмент. В других вариантах осуществления направляющий домен может содержать лиганд или низкомолекулярное соединение, которое избирательно связывается с клеткой-мишенью.

В некоторых вариантах осуществления молекулу можно разрабатывать для того, чтобы включать второй направляющий домен, второй активирующий T-клетки домен или второй привлекающий T-клетки домен.

В некоторых вариантах осуществления любого аспекта молекула может содержать фланкирующую последовательность между любыми двумя из доменов, приведенных непосредственно выше. В некоторых случаях, молекула может иметь больше чем одну фланкирующую последовательность.

В другом аспекте этого раскрытия описан способ, который включает введение любого варианта осуществления сконструированной молекулы, приведенного выше, субъекту в количестве, эффективном для того, чтобы индуцировать NK-опосредованное уничтожение клетки-мишени или опосредованное T-клетками уничтожение клетки-мишени, как может подходить для конкретной молекулы, которую вводят.

Приведенное выше краткое изложение настоящего изобретения не предназначено для того, чтобы описывать каждый раскрытый вариант осуществления или каждую реализацию настоящего изобретения. Описание, которое следует далее, более конкретно поясняет иллюстративные варианты осуществления. В нескольких местах на всем протяжении заявки в списках примеров приведены указания о том, какие примеры можно использовать в различных комбинациях. В каждом случае перечисленный список служит только в качестве репрезентативной группы, и его не следует интерпретировать в качестве исключительного списка.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1. Триспецифическое привлекающее киллеры средство (TriKE) 161533 (SEQ ID № 1) проявляет превосходящие свойства очистки относительно биспецифического привлекающего киллеры средства (BiKE) 1633 (SEQ ID № 2). (A) Схема размещения кодирующих областей для доменов BiKE (слева) и TriKE (справа) в экспрессирующем векторе pET. (B) Кривая поглощения для 1633 BiKE (слева), элюированного из ионообменной колонки в качестве первой фазы при очистке лекарственного средства с использованием протокола трехступенчатого элюирования. Первый пик, элюированный из колонки, представляет продукт. В случае 161533 TriKE (справа), поглощение пика 1 почти удвоено, что указывает на превосходящий выход. Схожее количество телец включения повторно укладывали и очищали. Весь белок удаляли из колонки. (C) Гель SDS-PAGE и окрашивание кумаси синим после второй стадии очистки на эксклюзионной колонке. Денситометрический анализ указывает на то, что продукт имеет чистоту более 95%.

Фиг. 2. 161533 TriKE вызывает превосходящую функцию NK клеток против мишеней. Высвобождение изотопа хрома-51 (⁵¹Cr) часто используют для того, чтобы измерять функцию NK клеток (уничтожение). (A) Свежие выделенные PBMC культивировали с нагруженными хромом клетками HL-60 в течение 4 ч при соотношениях E:T 20:1, 6,6:1 и 2:1. Указанные реактивы добавляли в начале совместной культуры в концентрации 20 нМ. Данные представлены в виде % цитолитической активности NK клеток. С учетом многих условий, значимость отмечена только между молекулами 1633 и 161533. n=3. (B) Для того чтобы оценивать специфичность 161533 TriKE, анализ высвобождения ⁵¹Cr осуществляли против мишеней CD33-EpCAM+ HT29. EpCAM1533 TriKE использовали в качестве положительного контроля. n=2. (C) Обогащали NK клетки из PBMC нормального донора с использованием магнитных бус, и помещали их в культуру с мишенями HL-60 (10:1) отдельно или в присутствии 1633 BiKE или 161533 TriKE в течение 24 часов. В конце инкубации супернатанты брали из каждой из культур и замораживали для дальнейшей оценки секретируемых IFNγ, TNFα, GM-CSF и MIP1a через мультиплексный анализ Luminex (n=5). Точки и столбцы представляют среднее±SEM.

Фиг. 3. 161533 TriKE опосредует пролиферацию и размножение NK клеток. PBMC пациента после трансплантации нагружали пролиферативным красителем CELLTRACE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) и совместно культивировали с мишенями HL-60 при соотношении (E:T) 5:1 в течение 7 суток в присутствии 50 нМ 1633 BiKE или 161533 TriKE. В конце инкубации CD56+CD3- NK клетки оценивали на жизнеспособность посредством окрашивания Live/Dead Near IR. (A) Индивидуальная гистограмма и (B) объединенный анализ жизнеспособности в популяции NK клеток, которую обрабатывали с использованием 1633 BiKE (серый) или 161533 TriKE (черный). (C) Затем пролиферацию оценивали посредством разведения CELLTRACE в живых CD56-CD3+ T-клетках (серый) и CD56+CD3- NK клетках (черный) в пределах группы TriKE. (D) Объединенный анализ показывает % делившихся клеток (вверху) и показатель размножения (внизу), который представляет собой вычисление кратности размножения в популяции, принимая во внимание количество разведения CELLTRACE. Индивидуальные точки представляют отдельные образцы после трансплантации (n=8).

Фиг. 4. 161533 TriKE мощно восстанавливает функцию NK клеток в образцах после трансплантации. PBMC пациента после трансплантации оттаивали и оставляли в покое в течение ночи. В следующую ночь их инкубировали без лекарственного средства, с 1633 BiKE (50 нМ) или 161533 TriKE (50 нМ). На следующее утро их промывали и проводили ту же обработку, что и ночью ранее (чтобы гарантировать, что имеют место проблемы с интернализацией молекул). (A) PBMC с указанными группами обработки инкубировали с нагруженными хромом HL-60 в течение 4 ч и вычисляли % цитолитической активности. Точки и столбцы обозначают среднее±SEM (n=9). (B) Репрезентативные гистограммы и (C) объединенные данные об экспрессии CD107a (левая часть), IFNγ (центральная часть) и TNFα (правая часть) в CD56+CD3- NK клетках после 4 ч инкубации с мишенями HL-60. Точки обозначают индивидуальные образцы пациентов (n=10).

Фиг. 5. 161533 TriKE усиливает функцию NK клеток против первичных AML бластов по сравнению с BiKE. PBMC пациента после трансплантации оттаивали и оставляли в покое в течение ночи. В следующую ночь их инкубировали с 1633 BiKE (50 нМ) или 161533 TriKE (50 нМ). На следующее утро их промывали и осуществляли ту же обработку, что и ночью ранее (чтобы гарантировать, что отсутствуют проблемы с интернализацией молекул). Первичные AML бласты из продуктов афереза двух отдельных пациентов оттаивали и оставляли в покое в течение ночи. Обработанные PBMC пациента после трансплантации (n=6) инкубировали с двумя различными первичными AML бластами (в сумме n=12) в течение 4 ч, и оценивали функцию NK клеток посредством проточной цитометрии. Функцию NK можно оценивать посредством измерения литической дегрануляции в форме CD107a. (A) Репрезентативные гистограммы, представляющие экспрессию CD107a (слева), IFNγ (середина) и TNFα (справа) на NK клетках пациента после трансплантации, которые обрабатывали с использованием 1633 BiKE (серый) или 161533 TriKE (черный) после 4 ч инкубации с первичными AML бластами. (B) Объединенные данные для экспрессии CD107a (слева), IFNγ (середина) и TNFα (справа) на NK клетках пациента после трансплантации, которые обрабатывали с использованием 1633 BiKE и 161533 TriKE и инкубировали с первичными AML бластами. Каждый прямоугольник представляет отдельный образец пациента после трансплантации, который инкубировали с двумя отдельными AML бластами-мишенями пациента, которые обозначены закрашенными и не закрашенными прямоугольниками (всего n=12).

Фиг. 6. 161533 TriKE ограничивает опухолевый рост HL-60 in vivo лучше, чем 1633 BiKE. Клетки HL-60-luc инъецировали iv (7,5×10⁵ клеток/мышь) NSG мышам и через 3 суток инфузировали один миллион NK клеток человека, активированных в течение ночи с использованием IL-15. Группы 1633 BiKE и 161533 TriKE получали HL-60-luc и NK клетки, тогда как контрольная группа получала только клетки HL-60-luc. Лекарственное средство (50 мкг/кг) вводили MWF на всем протяжении исследования. (A) Индивидуальная фотолюминесценция мышей в сутки 14 (вверху) и сутки 21 (внизу) исследования при экспозиции 2 минуты (n=5 на одну обработку (до гибели мышей), репрезентативно для двух отдельных экспериментов). (B) Количественное определение люминесценции у мышей из трех групп обработки в сутки 14 (слева) и сутки 21 (справа). Каждая точка представляет отдельную мышь и столбцы обозначают среднее±SEM (n=5, репрезентативно для двух отдельных экспериментов). (C) Кровь у мышей брали в сутки 20 в каждой из экспериментальных групп обработки. С помощью проточной цитометрии количественно определяли циркулирующие CD56+CD3- NK клетки человека. События регистрировали в течение 60 с и вычисляли число событий с NK клетками человека. Представлены репрезентативные точечные диаграммы, показывающие число событий с NK (CD56+.CD3-) клетками в пределах CD45+ субпопуляции. (D) Агрегированные данные, демонстрирующие число событий с NK клетками человека в каждой группе обработки в сутки 20. Индивидуальные точки представляют различных мышей и столбцы обозначают среднее±SEM (n=3 для группы HL-60-luc [2 мыши погибли], n=5 для групп 1633 BiKE и 161533 TriKE).

Фиг. 7. Как фланкирующие последовательности, так и ориентация молекулы TriKE влияют на ее функцию. Для того чтобы тестировать влияние фланкирующих последовательностей, конструировали вариант 161533 (161533NL, SEQ ID № 5), который не содержал фланкирующие последовательности (PSGQAGAAASESLFVSNHAY, SEQ ID № 3; и EASGGPE, SEQ ID № 4) по любую сторону от домена IL-15 в конструкции 161533. Свежие выделенные PBMC (содержащие 3,5% NK клеток для этого примера) от двух независимых доноров (PB1 и PB2) культивировали с нагруженными хромом клетками HL-60 в течение 4 ч при соотношении E:T 20:1. Указанные реактивы добавляли в начале совместной культуры в концентрации 20 нМ. Данные представлены в виде % цитолитической активности NK клеток. 161533 отражает конструкцию, которая содержит модифицированный активирующий NK домен IL-15 с интактными фланкирующими последовательностями. Данные показывают, что активирующий NK домен IL-15 с фланкирующими последовательностями усиливает функцию TriKE. Для того чтобы исследовать эффект ориентации, синтезировали конструкцию с IL-15 или на N-конце (151633; SEQ ID № 6) или на C-конце (163315; SEQ ID № 7) и сравнивали с 161533 дикого типа с IL-15 в качестве сшивателя. Сгенерированные данные IL-15 в центре молекулы оптимизирует NK цитолитическую активность.

Фиг. 8. 1615EpCAM TriKE (SEQ ID № 8) обеспечивает превосходящие свойства очистки относительно EpCAM16 BiKE. (A) Схема размещения кодирующих областей для доменов TriKE (1615EpCAM) в экспрессирующем векторе pET. (B) Схема размещения кодирующих областей для доменов BiKE (16EpCAM) в экспрессирующем векторе pET. (C) Кривая поглощения для TriKE (1615EpCAM), элюированного из ионообменной колонки в виде первой фазы при очистке лекарственного средства с использованием протокола трехступенчатого элюирования. Первый пик, элюированный из колонки, представляет продукт. (D) Кривая поглощения BiKE (16EpCAM), элюированного из ионообменной колонки в виде первой фазы при очистке лекарственного средства с использованием протокола трехступенчатого элюирования. Первый пик, элюированный из колонки, представляет продукт, полученный с более низким выходом, чем TriKE. (F) Гель SDS-PAGE и окрашивание кумаси синим после второй стадии очистки (E) на эксклюзионной колонке. Денситометрический анализ указывает на то, что продукт имеет чистоту более 95%.

Фиг. 9. Оценка активности 1615EpCAM TriKE (SEQ ID № 8) в анализах высвобождения хрома. Свежие выделенные естественные киллерные (NK) клетки добавляли к клеткам HT-29 (клеточная линия карциномы толстой кишки человека) с соответствующими соотношениями эффектор:мишень, как указано. Выбирали доноров с различными от природы уровнями циркулирующих NK клеток (A) мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) с 3,8% NK клеток, (B) PBMC с 6,4% NK клеток, (C) 15% и (D) > 80% NK клеток, обогащенных из PBMC. (E) Более высокие уровни уничтожения с 1615EpCAM коррелировали с донорами с более высокими от природы уровнями NK уничтожения. В (E) только кривые для 1615EpCAM сравнивали для четырех доноров, что подчеркивает прямую корреляцию между присутствием NK и цитолитической активностью, индуцированной лекарственным средством. (F) Показано, что в случае 16EpCAM такая корреляция отсутствует.

Фиг. 10. Литическая дегрануляция в различных экспрессирующих EpCAM клеточных линиях злокачественных опухолей-мишеней. Как отмечено, функцию NK можно измерять посредством количественного определения экспрессии CD107a в качестве меры литической дегрануляции. Экспрессирующие CD107a клетки оценивали в CD56+CD3- субпопуляции NK клеток. Эффекторные PBMC инкубировали с различными несущими EpCAM клеточными линиями-мишенями, включая (A) BT-474, (B) SK-BR-3, (C) PC-3, (D) DU145, (E) UMSCC-11B, (F) NA и (G) SKOV-1. TriKE, добавленный к эффекторам и клеткам-мишеням, индуцировал более высокие процентные доли CD107a-экспрессирующих клеток по сравнению с контролями, а также по сравнению с биспецифическим 16EpCAM. P-значения оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и представляли вместе с SD. *оценка в сравнении с контролями; #оценка 1615EpCAM в сравнении с EpCAM16.

Фиг. 11. Пролиферационные возможности 1615EpCAM TriKE. (A) Для того чтобы оценивать размножение NK клеток, мононуклеарные клетки периферической крови обрабатывали с использованием 1615EpCAM TriKE или EpCAM16 BiKE. Дискретные пики в гистограммах обозначают последовательные поколения NK клеток после клеточного деления, которое ведет к повторяющемуся легкому снижению интенсивности флуоресценции. Тогда как NK клетки демонстрируют типичный паттерн пролиферации, T-клетки не демонстрируют его. Приведены репрезентативные данные пяти независимых экспериментов. (B) PBMC клетки совместно культивировали с TriKE и BiKE и оценивали пролиферацию NK клеток. Приведены репрезентативные данные пяти независимых экспериментов. (C) PBMC клетки совместно культивировали с TriKE, BiKE, scFv против CD16 [CD16], интерлейкином (IL)-15, scFv против EpCAM [EpCAM] и DT2219, направленным токсином, состоящим из энтеротоксина дифтерии, связанным с scFv против CD22 и против CD19. Оценка показателя размножения NK клеток демонстрировала значительно (p<0,001) повышенный показатель в конструкции 1615EpCAM и с IL-15 отдельно, который обозначен *, (n=5). (D) Очищенные NK клетки экспонировали для TriKE и BiKE. После 7 суток реакционноспособный краситель использовали для того, чтобы дифференцировать живые и погибшие клетки. Реакционноспособный краситель проникает через ослабленные мембраны погибших клеток, что ведет к более интенсивному окрашиванию (правый пик), но не способен проникать через мембраны живых клеток, что ведет к более слабому окрашиванию (левый пик).

Фиг. 12. Литическая дегрануляция и экспрессия IFN-γ в клетках HT-29. Для того чтобы исследовать активность NK клеток, CD107a-экспрессирующие клетки оценивали в CD56+/CD3- субпопуляции NK клеток. (A) Клетки, которые обрабатывали с использованием 1615EpCAM TriKE (SEQ ID № 8), демонстрировали резко повышенную дегрануляцию EpCAM-экспрессирующих клеток-мишеней HT-29, тогда как контроли не демонстрировали этого. E:T отдельно, E:T+scFv против EpCAM без 1615, E:T+против CD16 отдельно и E:T+комбинация IL-12 и IL-18 (которая не увеличивает литическую дегрануляцию) не оказывают какого-либо эффекта. (B) Анализировали продуцирование IFN-γ той же CD56+/CD3- популяцией NK клеток. Только 1615EpCAM демонстрировала повышенную процентную долю экспрессирующих IFN-γ клеток. Значения не приближались к значениям, которые наблюдали при использовании комбинации IL12+IL18, которая, как известно, стимулирует продуцирование цитокинов на сверхфизиологических уровнях. (C) Не наблюдали экспрессирующих CD107a клеток, когда исследовали NK клетки, которые инкубировали с EpCAM- клетками-мишенями миелолейкоза HL-60. (D) Только E:T контроли, которые обрабатывали с использованием IL12+IL18, демонстрировали высокую экспрессию IFN-γ.

Фиг. 13. Схема размещения полинуклеотида, кодирующего домены 1615EpCAM133 (SEQ ID № 9), в экспрессирующем векторе pET. Синтез и сборку гибридного полинуклеотида, кодирующего 1615EpCAM133, осуществляли с использованием способов перетасовки ДНК и лигирования ДНК. Полностью собранная кодирующая область имеет, от 5'-конца к 3'-концу, участок рестрикции NcoI; инициирующий кодон ATG; кодирующие области, которые кодируют области V_H и V_L CD16 человека (NM3E2), полученные из библиотеки фагового дисплея, сегмент в 20 аминокислот (PSGQAGAAASESLFVSNHAY; SEQ ID № 3), модифицированный IL-15, сегмент в 7 аминокислот (EASGGPE; SEQ ID № 4), гуманизированный scFv против EpCAM из антитела MOC-31, мутантную шарнирную область IgG1 человека в 15 аминокислот и scFv против CD133 из клона 7; и, наконец, участок рестрикции NotI. Получаемый полинуклеотид фрагмента NcoI/NotI 2715 п. о. сплайсировали в экспрессирующий вектор pET28c под управлением индуцибельного изопропил-βD-тиогалактопиранозидом (IPTG) (FischerBiotech, Fair Lawn, NJ) промотора T7. Анализ секвенирования ДНК (Biomedical Genomics Center, University of Minnesota, MN, USA) использовали для того, чтобы верифицировать, что полинуклеотид имел правильную последовательность и его клонировали с сохранением рамки считывания.

Фиг. 14. Активность 1615EpCAM133. Дополнительный scFv, распознающий CD133, экспрессируемый на злокачественных стволовых клетках, добавляли в 1615EpCAM для получения 1615EpCAM133 TetraKE. (A) и (B) показана активность 1615EpCAM133, которую оценивали с использованием анализов высвобождения ⁵¹Cr. Свежие выделенные NK клетки от двух доноров (PT1 и PT2) добавляли в клеточную линию карциномы толстой кишки человека Caco-2 (CD133+, EpCAM+). Клетки совместно культивировали с мишенями при указанных соотношениях эффекторов и мишеней (E:T) в течение 4 ч и затем оценивали высвобождение ⁵¹Cr. В (C) и (D) NK клетки от двух доноров экспонировали для клеточной линии карциномы толстой кишки человека HT-29 (EpCAM+, CD133-) и высвобождение ⁵¹Cr измеряли аналогичным образом, как описано выше.

Фиг. 15. Подобно 1615EpCAM, 1615EpCAM133 демонстрирует усиленное размножение из-за присутствия IL-15. (A) Анализы связывания с клетками HT-29 и (B) клетками Caco-2 осуществляли с использованием FITC-меченного 1615EpCAM133 TetraKE (200 нМ), конкурирующего с избытком немеченных указанных scFv (1000 нМ). Эксперименты повторяли с 200 нМ 1615EpCAM133, и более низкий блок с 500 нМ scFv. Результаты были воспроизводимыми. (C) Очищенные NK клетки окрашивали с использованием CELLTRACE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) для того, чтобы измерять пролиферацию, и совместно культивировали с scFv против CD16 [CD16], scFv против CD133 [CD133], 1615EpCAM133 TetraKE, DT2219 (мутантным дифтерийным токсином, связанным с scFv против CD22 и против CD19), scFv против EpCAM [EpCAM], EpCAM16 BiKE или IL-15 [IL15] в течение 7 суток (n=5). На графике представлены объединенные данные показателя размножения для каждой из групп. (D) Репрезентативная гистограмма PBMC, окрашенных красителем CELLTRACE и совместно культивированных с 30 нМ 1615EpCAM133 TetraKE или EpCAM16 BiKE в течение 7 суток. (E) Репрезентативная гистограмма со сравнением пролиферации CD56+CD3- NK клеток с CD56-CD3+ T-клетками. (F) Репрезентативная гистограмма, иллюстрирующая выживаемость (по исключению красителя Live/Dead) очищенных NK клеток, которые экспонировали для 1615EpCAM133 TetraKE или EpCAM16 BiKE в течение 7 суток. Погибшие клетки демонстрируют включение красителя (высокий пик), тогда как живые клетки исключают его (низкий пик). P-значения оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и представляли со стандартным отклонением.

Фиг. 16. Схема размещения кодирующих областей для 1615133 (SEQ ID № 10) в экспрессирующем векторе pET. Гибридный полинуклеотид, кодирующий 1615133, синтезировали с использованием способов перетасовки ДНК и лигирования ДНК. Полностью собранный полинуклеотид имеет, от 5'-конца к 3'-концу, участок рестрикции NcoI; инициирующий кодон ATG; кодирующие области, кодирующие scFv против CD16 человека, сегмент в 20 аминокислот (PSGQAGAAASESLFVSNHAY; SEQ ID № 3), мутантный IL-15 человека, линкер в 7 аминокислот (EASGGPE; SEQ ID № 4) и scFv против CD133; и участок рестрикции NotI. Получаемый полинуклеотид фрагмента NcoI/NotI в 1884 пар оснований сплайсировали в экспрессирующий вектор pET28c под управлением индуцибельного изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) T7 промотора.

Фиг. 17. Высвобождение ⁵¹Cr и связывание 1615133 TriKE. (A, B) Для оценки активности осуществляли анализы высвобождения ⁵¹Cr с использованием двух доноров. 1615133 TriKE, 16133 BiKE, scFv против CD16 [CD16] или scFv против CD133 [CD133] совместно культивировали с CD133+ клетками Caco-2 и PBMC при помеченных соотношениях E:T. (C) PBMC и клетки Caco-2 экспонировали для различных концентраций TriKE (1 нМ, 5 нМ, 10 нМ) и титровали при их соотношении E:T (20:1, 6,6:1, 2,2:1, 0,75:1, 0,23:1, 0,08:1). (D) FITC-меченный 1615133 TriKE инкубировали при помеченных концентрациях с клетками Caco-2. В том же эксперименте то же количество FITC-меченного 1615133 добавляли в 200 нМ мономерных CD133 scFv для блокирования.

Фиг. 18. Размножение и выживаемость. (A) Очищенные NK клетки экспонировали для scFv против CD16 (CD16), scFv против CD133 (CD133), 16133 BiKE, 1615133 TriKE, DT2219 (направленного токсина, состоящего из scFv против CD22 и против CD19, связанных с дифтерийным токсином) или полученным из NCI IL-15. Только TriKE и IL-15 значительно увеличивали пролиферацию (n=5). На графике представлены объединенные данные показателя размножения, вычисленного в программном обеспечении Flowjo, для каждой из групп. (B) Очищенные NK клетки экспонировали для 1615133 TriKE и 16133 BiKE и инкубировали в течение 7 суток. Репрезентативная гистограмма иллюстрирует более высокое количество живых клеток с использованием конструкции TriKE по сравнению с BiKE без фрагмента IL-15. Значимость оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и представляли со стандартным отклонением.

Фиг. 19. Анализы высвобождения ⁵¹Cr осуществляли с использованием нескольких различных новых TriKE, чтобы показывать, что любой scFv, который направлен на клетки злокачественной опухоли, можно превращать в функциональные TriKE. (A) EpCAM+CD133+NG2+ клетки немелкоклеточной злокачественной опухоли легких NCI-H460+NK клетки инкубировали с 1615EPCAM133 TriKE или 1615NG2 TriKE (глиальный антиген нейронов 2 или CSPG4). Как 1615NG2, так и 1615EpCAM133 имел активность при нескольких различных соотношениях E:T (20:1, 10:1 и 5:1). (B) Мезотелин+EpCAM-CD133-NG2 клетки меланомы MDA-435A инкубировали с 1615EPCAM TriKE (SEQ ID № 8) или 1615Meso TriKE (SEQ ID № 11) TriKE. Только 1615Meso имел активность. (C) Мезотелин+NG2+ клетки злокачественной опухоли яичника (клетки Ovcar3) инкубировали с 1615NG2 TriKE или 1615SS1 TriKE. 1615Meso и 1615NG2 имели активность. (D) Клетки Raji культивировали с NK клетками и исследовали в анализах высвобождения ⁵¹Cr. TriKE 16152219 (SEQ ID № 12) одновременно направлен на B-клеточные маркеры CD19 и CD22. Только 16152219, 162219 и ритуксимаб уничтожали CD22+CD19+ мишени. Контроли - нет.

Фиг. 20. Синтезировали TriKE, которые работают с IL-2 и стимулируют размножение T-клеток вместо NK клеток. Для того чтобы определять, работают ли другие цитокины вместо IL-15, CD3-IL-2-EpCAM (SEQ ID № 13) конструировали с использованием тех же фланкирующих последовательностей по обе стороны от IL-2, которые использовали по обе стороны от домена IL-15 в NK-активирующих конструкциях TriKE. PBMC метили CELLTRACE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) и помещали в культуру без обработки (отрицательный контроль), с 1615EpCAM TriKE (положительный контроль), CD3EpCAM BiTE, CD3-IL-2-EpCAM TriKE, 10 нг/мл IL-2 или 100 нг/мл IL-2. CD3-IL2-EpCAM TriKE стимулировали CD3+ T-клетки значительно сильнее, чем 1615EpCAM TriKE, CD3EpCAM BiTE или IL-2 при 10 нг/мл или 100 нг/мл.

Фиг. 21. Тестировали интактную часть CD3 из CD3-IL2-EpCAM. (A) и (B): тот же scFv против CD3 сплайсировали в дифтерийный токсин и инкубировали с CD3+ клетками-мишенями HPBMLT. CD3-IL2-EpCAM добавляли, чтобы видеть, блокировал ли он способность DT3 (CD3-направленного токсина) уничтожать клетки HPB-MLT. Блокирующая активность CD3-IL-2-EpCAM зависела от дозы в присутствии 0,1 нМ DT3 (A) и 1,0 нМ DT3 (B), что указывает на то, что фрагмент CD3 из CD3-IL2-EpCAM был интактным. (C) и (D): способность CD3-IL2-EpCAM блокировать уничтожение CD3- клеток Raji отрицательного контроля с помощью DT2219 (направленный токсин против CD22 и CD19).

Фиг. 22. Из опубликованного нанотела ламы (последовательность GeneBank EF561291) получали нанотело к CD16. Нанотело к CD16 сплайсировали в CD19 для того, чтобы тестировать способность этого CD16 привлекающего средства управлять уничтожением NK клетками. (A) Нанотело к CD16 демонстрировало цитолитическую NK активность подобно опосредованному ритуксимабом уничтожению в анализе высвобождения хрома с CD19+Raji мишенями. (B) CD16 CDR клонировали в гуманизированный каркас камелид для того, чтобы создавать HuEF91, гуманизированное CD16 привлекающее средство. Связывание HuEF91 было эквивалентно связыванию CD16scFv, что указывает на то, что гуманизированный HuEF91 не имеет более высокой специфичности к указанной молекуле. (C) llama161533 TriKE (SEQ ID № 14) способен к росту NK клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Естественные киллерные (NK) клетки представляют собой цитотоксические лимфоциты врожденной иммунной системы, способные к иммунному надзору. Подобно цитотоксическим T-клеткам, NK клетки доставляют запас гранул гранзимов и перфоринов, которые проникают через мембрану и индуцируют апоптоз. В отличие от T-клеток, NK клеткам не требуется примирование антигеном, они распознают мишени посредством привлечения активирующих рецепторов в отсутствие MHC распознавания.

NK клетки экспрессируют CD16, рецептор активации, который связывается с Fc частью антител IgG и вовлечен в антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). NK клетки регулирует IL-15, который может индуцировать повышенную антигензависимую цитотоксичность, активированную лимфокинами киллерную активность и/или опосредовать ответы, связанные с интерферонами (IFN), фактором некроза опухоли (TNF) и/или гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF). Все эти IL-15-активированные функции вносят вклад в усовершенствованную защиту от злокачественных опухолей.

Терапевтически адоптивный перенос NK клеток может индуцировать, например, ремиссию у пациентов с рефракторным острым миелолейкозом (AML), когда его комбинируют с лимфоистощающей химиотерапией и IL-2 для того, чтобы стимулировать выживаемость и размножение NK клеток in vivo. Эту терапию может ограничивать отсутствие антигенной специфичности и IL-2-опосредованной индукции регуляторных T (Treg) клеток, которое подавляет пролиферацию и функцию NK клеток. Создание реактива, который управляет антигенной специфичностью, размножением и/или персистенцией NK клеток, при этом обходя негативные эффекты ингибирования Treg, может усиливать иммунотерапию на основе NK-клеток.

В этом раскрытии описано создание триспецифической молекулы, которая содержит два домена, способные управлять опосредованным NK-клетками уничтожением опухолевых клеток (например, CD33+ опухолевых клеток и/или EpCAM+ опухолевых клеток), и внутримолекулярный активирующий NK домен, способный создавать самоподдерживающийся сигнал NK клеток. Триспецифическая молекула может управлять пролиферацией NK клеток и/или усиливать NK-клеточную цитотоксичность, например, против мишеней HL-60, клеток злокачественных опухолей или клеточных линий, полученных из клеток злокачественных опухолей.

Создавали биспецифические слитые конструкции, которые содержат scFv против CD16 человека, полученный по технологии библиотеки фагового дисплея человека (McCall et al., 1999. Mol Immunol. 36:433-445). NK клетки опосредуют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) через рецептор CD16 (FcγRIII). Передача сигнала через рецептор CD16 индуцирует кальциевые токи и фосфорилирование ITAM, запуская высвобождение литических гранул и цитокинов, таких как интерферон (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNFα). Биспецифическая молекула разработана для того, чтобы запускать рецептор CD16 в сочетании с другими направленными молекулами (Gleason et al. Blood. 2014 (19):3016-26), так называемое биспецифическое привлекающее киллеры средство (BiKE). Используя один scFv, распознающий NK клетки, и второй scFv, распознающий опухолевый антиген, BiKE могут заметно усиливать цитотоксическое уничтожение в различных злокачественных опухолях человека. Один образцовый BiKE направлен на CD33 и усиливает ответы NK клеток на острый миелолейкоз (AML) и миелодиспластический синдром (MDS). MDS представляет собой клональное гетерогенное нарушение стволовых клеток, которое отличается нормальным или гиперцеллюлярным костным мозгом (BM) с цитопениями периферической крови (PB) и повышенным риском прогрессирования в AML.

NK клетки отвечают на различные цитокины, в том числе, например, IL-15, который вовлечен в гомеостаз, пролиферацию, выживаемость, активацию и/или развитие NK клеток. IL-15 и IL-2 имеют несколько общих компонентов передачи сигналов, в том числе IL-2/IL-15Rβ (CD122) и общую γ-цепь (CD132). В отличие от IL-2, IL-15 не стимулирует Treg, допуская активацию NK клеток, при этом обходя Treg ингибирование иммунного ответа. Помимо содействия гомеостазу и пролиферации NK клеток, IL-15 может восстанавливать функциональные дефекты NK клеток, которые могут возникать в условиях после трансплантации. IL-15 также может стимулировать функцию CD8+ T-клеток, что дополнительно усиливает иммунотерапевтический потенциал. Кроме того, на основании доклинических исследований, профили токсичности IL-15 могут быть значительно более благоприятными, чем у IL-2 при низких дозах.

IL-15 играет роль в развитии, гомеостазе, пролиферации, выживаемости и активации NK клеток. IL-15 и IL-2 имеют несколько общих компонентов передачи сигналов, включая IL-2/IL-15Rβ (CD122) и общую γ-цепь (CD132). IL-15 также активирует NK клетки и может восстанавливать функциональные дефекты при пересадке NK клеток после трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSCT).

В этом раскрытии описаны, в одном из аспектов, молекулы триспецифических привлекающих киллеры средств (TriKE), которые в целом содержат один или более доменов привлекающего NK клетки средства (например, CD16, CD16+CD2, CD16+DNAM, CD16+NKp46), один или более направляющих доменов (которые направлены, например, на опухолевую клетку или инфицированную вирусом клетку) и один или более активирующих NK доменов цитокинов (например, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 или другой усиливающий NK клетки цитокин, хемокин и/или активирующая молекула), где каждый домен функционально связан с другими доменами. Как используют в настоящем описании, термин «функционально связан» относится к непосредственной или опосредованной ковалентной связи. Таким образом, два домена, которые функционально связаны, могут быть ковалентно связаны непосредственно друг с другом. Наоборот, два функционально связанных домена можно соединять посредством совместного ковалентного связывания с промежуточным фрагментом (например, и фланкирующей последовательностью). Два домена можно считать функционально связанными, например, если их разделяет третий домен, с одной или более промежуточными фланкирующими последовательностями или без них.

Привлекающий NK домен может содержать любой фрагмент, который связывается с NK клеткой и/или активирует ее, и/или любой фрагмент, который блокирует ингибирование NK клетки. В некоторых вариантах осуществления привлекающий NK домен может содержать антитело, которое избирательно связывается с компонентом поверхности NK клетки. В других вариантах осуществления привлекающий NK домен может содержать лиганд или низкомолекулярное соединение, которое избирательно связывается с компонентом поверхности NK клетки. Как используют в настоящем описании, термин «избирательно связывает» относится к способности различать две или больше альтернатив, например, такой как наличие дифференциальной аффинности, до любой степени, к конкретной мишени. Как используют в настоящем описании, «антитело» относится в целом к иммуноглобулину или его фрагменту и, таким образом, охватывает моноклональное антитело, его фрагмент (например, scFv, Fab, F(ab')2, Fv или другие модифицированные формы), комбинацию моноклональных антител и/или их фрагментов и/или комбинацию поликлональных антител. Таким образом, для краткости, упоминание об антителе, которое избирательно связывается с компонентом поверхности NK клетки, включает любой фрагмент антитела, который проявляет описанный характер связывания. Аналогичным образом, упоминание о лиганде, который избирательно связывается с компонентом поверхности NK клетки, включает любой фрагмент лиганда, который проявляет описанный характер связывания.

В некоторых вариантах осуществления привлекающий NK домен может избирательно связываться с рецептором, по меньшей мере частично расположенным на поверхности NK клетки. В определенных вариантах осуществления привлекающий NK домен может выполнять функцию связывания NK клетки и, тем самым, приводить NK в пространственную близость с мишенью, с которой направляющий домен, описанный более подробно далее, избирательно связывается. Однако в определенных вариантах осуществления привлекающий NK домен может избирательно связываться с рецептором, который активирует NK клетку и, следовательно, также обладает активирующей функцией. Как описано выше, активация рецептора CD16 может вызывать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Таким образом, в определенных вариантах осуществления привлекающий NK домен может содержать по меньшей мере часть антитела против рецептора CD16, эффективную для избирательного связывания с рецептором CD16. В других вариантах осуществления домен привлекающего NK клетки средства может нарушать механизмы, которые ингибируют NK клетки. В таких вариантах осуществления NK домен привлекающего средства может содержать, например, домен против PD1/PDL1, против NKG2A, против TIGIT, против иммуноглобулинового рецептора киллеров (KIR) и/или любой другой блокирующий ингибирование домен.

Можно разрабатывать привлекающий NK домен, который обладает желаемой степенью NK избирательности и, следовательно, желаемым характером иммунного привлечения. Например, CD16 идентифицирован как Fc-рецепторы FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIIb (CD16b). Эти рецепторы связываются с Fc-частью антител IgG, которая затем активирует NK клетки на антителозависимую клеточную цитотоксичность. Антитела против CD16 избирательно связываются с NK клетками, но также могут связываться с нейтрофилами. Антитела против CD16a избирательно связываются с NK клетками, но не связываются с нейтрофилами. Вариант осуществления TriKE, содержащий привлекающий NK домен, включающий антитело против CD16a, может связываться с NK клетками, но не связывается с нейтрофилами. Таким образом, в условиях, когда желательно привлекать NK клетки, но не привлекать нейтрофилы, можно разрабатывать привлекающий NK домен TriKE, который содержит антитело против CD16a.

Хотя в настоящем описании описан в контексте различных вариантов осуществления, в которых привлекающий NK домен содержит scFv против рецептора CD16, привлекающий NK домен может содержать любое антитело или другой лиганд, который избирательно связывается с рецептором CD16. Кроме того, привлекающий NK домен может содержать антитело или лиганд, которые избирательно связываются с любым рецептором NK клеток, например, таким как рецептор клеточной цитотоксичности 2B4, низкоаффинный Fc-рецептор CD16, иммуноглобулиноподобные рецепторы киллеров (KIR), CD2, NKG2A, TIGIT, NKG2C, LIR-1 и/или DNAM-1.

Направляющий домен может содержать любой фрагмент, который избирательно связывается с планируемой мишенью, например, такой как опухолевая клетка, мишень в строме злокачественной опухоли, мишень на ингибирующих клетках, таких как супрессорные клетки миелоидного происхождения, которые являются CD33+, или мишень на инфицированной вирусом клетке. Таким образом, направляющий домен может содержать, например, противоопухолевое антитело, такое как ритуксимаб (против CD20), афутузумаб (против CD20), трастузумаб (против HER2/neu), пертузумаб (против HER2/neu), лабетузумаб (против CEA), адекатумумаб (против EpCAM), цитатузумаб богатокс (против EpCAM), эдреколомаб (против EpCAM), аркитумомаб (против CEA), бевацизумаб (против VEGF-A), цетуксимаб (против EGFR), нимотузумаб (против EGFR), панитумумаб (против EGFR), залутумумаб (против EGFR), гемтузумаб озогамицин (против CD33), линтузумаб (против CD33), этарацизумаб (против интегрина αvβ3), интетумумаб (против CD51), ипилимумаб (против CD152), ореговомаб (против CA-125), вотумумаб (против опухолевого антигена CTAA16.88) или пемтумумаб (против MUC1), против CD19, против CD22, против CD133, против CD38, против мезотелина, против ROR1, CSPG4, SS1 или IGFR1.

В других вариантах осуществления направляющий домен может избирательно связываться с мишенью на клетке, инфицированной вирусом, например, таким как аденовирус, HIV, CMV и/или HPV.

В некоторых конкретных вариантах осуществления направляющий домен может содержать антитело против CD33. В других конкретных вариантах осуществления направляющий домен может содержать антитело против молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM).

Активирующий NK домен может содержать аминокислотную последовательность, которая активирует NK клетки, содействует поддержанию NK клеток или иным образом содействует активности NK клеток. Активирующий NK домен может представлять собой или может быть получен из одного или более цитокинов, которые могут активировать и/или поддерживать NK клетки. Как используют в настоящем описании, термин «полученный из» относится к аминокислотному фрагменту цитокина (например, IL-15), которого достаточно для обеспечения активности по поддержанию и/или активации NK клеток. В вариантах осуществления, которые содержат больше чем один активирующий NK домен, активирующие NK домены можно предоставлять последовательно или в любой другой комбинации. Дополнительно, каждый активирующий NK домен на основе цитокина может содержать или полную аминокислотную последовательность цитокина или может представлять собой аминокислотный фрагмент, независимо от свойств других активирующих NK доменов, включенных в молекулу TriKE. Образцовые цитокины, на которых может быть основан активирующий NK домен, включают, например, IL-15, IL-18, IL-12 и IL-21. Таким образом, хотя в настоящем описании описано подробно в контексте образцового модельного варианта осуществления, в котором активирующий NK домен получают из IL-15, TriKE можно разрабатывать с использованием активирующего NK домена, который представляет собой любой подходящий цитокин или который получают из него.

Для краткости этого описания, упоминание об активирующем NK домене посредством идентификации цитокина, на котором он основан, включает полную аминокислотную последовательность цитокина, любой подходящий аминокислотный фрагмент цитокина и/или модифицированную версию цитокина, которая содержит одну или более замен аминокислот. Таким образом, упоминание об активирующем NK домене «IL-15» включает активирующий NK домен, который содержит полную аминокислотную последовательность IL-15, активирующий NK домен, который содержит фрагмент IL-15, или активирующий NK домен, например, такой как IL-15N72D или IL-15N72A, который содержит замену аминокислоты по сравнению с аминокислотной последовательностью IL-15 дикого типа.

Использование активирующего NK домена IL-15 в TriKE может обеспечивать длительную активность NK клеток, как свидетельствует модель на мышах, которая показывает значительно повышенные NK клетки человека и уменьшенную злокачественную опухоль, даже после трех недель. У мышей происходит активация NK клеток для продуцирования ряда факторов против злокачественных опухолей и цитокинов. Кроме того, на фиг. 1 представлено, что активирующий NK домен IL-15 как-либо изменяет химические свойства этих молекул с тем, чтобы они повторно укладывались более легко и/или их можно извлекать с более высоким выходом, таким образом делая молекулы TriKE более подходящими для клинического масштабирования.

В некоторых вариантах осуществления молекула дополнительно может содержать фланкирующую последовательность, которая может связывать два из описанных выше доменов. В некоторых вариантах осуществления присутствие фланкирующей последовательности может дополнительно увеличивать активацию NK клеток. Одна образцовая фланкирующая последовательность содержит 20 аминокислот из SEQ ID № 3. Другая образцовая фланкирующая последовательность содержит 7 аминокислот из SEQ ID № 4. Определенные варианты осуществления (например, 161533 TriKE, SEQ ID № 1) могут содержать больше чем одну фланкирующую последовательность. В качестве одного из примеров, SEQ ID № 1 содержит фланкирующую последовательность SEQ ID № 3 для того, чтобы связывать привлекающий NK домен (например, scFv против рецептора CD16) с активирующим NK доменом (например, IL-15). SEQ ID № 1 также содержит фланкирующую последовательность SEQ ID № 4 для того, чтобы связывать активирующий NK домен с направляющим доменом (например, scFv против CD33). На фиг. 7 представлены данные, которые демонстрируют, что конструкции, в которых отсутствует фланкирующая последовательность, проявляют сниженную активность по сравнению с конструкциями, которые содержат фланкирующую последовательность.

Синтез и чистота 161533 TriKE

Для того чтобы создавать образцовый модельный терапевтический TriKE, который является антиген-специфическим и поддерживает ответ NK клеток на лейкоз, сшиватель из модифицированного IL-15 человека вводили в 1633 BiKE, создавая 161533 TriKE (фиг. 1A). FPLC профиль TriKE показывал высокий выход продукта из бактериальной экспрессирующей системы, который требовал повторной укладки (фиг. 1B). Активирующий NK домен IL-15 снижал изоэлектрическую точку на две единицы pH, создавая более благоприятные условия для очистки и увеличения выхода. Несмотря на то, что очистку начинали с идентичными количествами телец включения, конечный выход 161533 TriKE был в два раза выше выхода сравнимого BiKE (1633, без активирующего NK домена IL-15), что указывает на более благоприятную динамику очистки. Продукты имели чистоту >95% в анализе на геле SDS-PAGE с окрашиванием кумаси синим (фиг. 1C). Для того чтобы верифицировать, что связывание и специфичность оставались интактными в новой молекуле TriKE, избирательность измеряли посредством проточных цитометрических анализов с прямым связыванием и блокированием на CD33+ EpCAM- клетках HL-60 и CD33- EpCAM+ клетках HT-29 (таблица 1 и таблица 2).

Таблица 1. Связывание BiKE и TriKE, измеренное с помощью проточной цитометрии

Реактив	Клеточная линия	Количество лекарственного средства (мкг)	% Положительных клеток
Без окрашивания	HL-60	-	0,1
161533-FITC	HL-60	10	63
161533-FITC	HL-60	20	75
161533-FITC	HL-60	40	78
161533-FITC	HT-29	10	4
EpCAM-FITC	HL-60	20	1,4
EpCAM-FITC	HT-29	2	100
1633-FITC	HT-29	4	1
1633-FITC	HL-60	4	62
1633-FITC	HL-60	15	74
16-FITC	HL-60	20	0,1
33-FITC	HL-60	20	98

Таблица 2. Специфичность, которую определяли посредством блокирования антигена

Реактив	Клеточная линия	Блокирующее средство	% Положительных клеток
1633-FITC	HL-60	нет	52
1633-FITC	HL-60	против CD33	1
161533-FITC	HL-60	Нет	85
161533-FITC	HL-60	против CD33	4
161533-FITC	HL-60	против CD45	73

161533 TriKE повышает функцию NK клеток

Для того чтобы определять, сохранялась ли при включении IL-15 способность биоинженерного 1633 опосредовать ADCC, 1633 и 161533 сравнивали в 4 ч анализе высвобождения хрома, где PBMC от здоровых доноров тестировали на их способность уничтожать CD33+ мишени HL-60 (фиг. 2A). 161533 TriKE индуцировал более выраженное опосредованное NK клетками уничтожение, чем BiKE, в частности в соотношении 20:1 (58,3±2,3% против 33±4%, P=0,0184). Контрольные образцы средств против CD16 и против CD33 не усиливают ответ по сравнению с необработанными контролями, что указывает на отсутствие активности отдельно у этих компонентов. Для того чтобы тестировать специфичность в цитотоксическом анализе, 161533 TriKE инкубировали с NK клетками и CD33- клетками-мишенями HT-29 (фиг. 2B). 161533 TriKE не показывал значительного увеличения уничтожения клеток HT-29 по сравнению с необработанным контролем. Чтобы гарантировать, что клетки-мишени HT-29 не являются просто более устойчивыми, в качестве объяснения специфичности, клетки HT-29 инкубировали с новым IL-15 TriKE, содержащим scFv против EpCAM, а не против CD33. TriKE устойчиво уничтожал EpCAM+ клетки HT-29, что подчеркивает универсальность платформы TriKE с активирующим NK доменом IL-15 как против гематологических злокачественных новообразований, так и против злокачественных новообразований солидных опухолей.

Помимо перенаправленной цитотоксичности, другая функция NK клеток состоит в продуцировании цитокинов и хемокинов при распознавании клетки-мишени. Для того чтобы тестировать, усиливает ли TriKE этот процесс, NK клетки и мишени HL-60 инкубировали без молекул, с 1633 BiKE или с 161533 TriKE, и супернатанты собирали после 24 ч и анализировали на воспалительные цитокины и хемокины (фиг. 2C). По сравнению с отсутствием лекарственного средства или с BiKE, TriKE значительно индуцировал секрецию IFNγ, TNFα, GM-CSF и MIP-1α. Эти данные показывают, что молекула IL-15 в TriKE может индуцировать секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов, которые могут увеличивать противоопухолевую активность NK клеток.

161533 TriKE индуцирует выживаемость и размножение NK клеток после трансплантации

Одно терапевтическое преимущество IL-15 состоит в том, что он участвует в гомеостазе и размножении NK клеток. Таким образом, 161533 TriKE тестировали для того, чтобы оценивать, остаются ли эти биологические функции активными в молекуле TriKE. Для того чтобы тестировать это в физиологически релевантном контексте, использовали ранние образцы пациентов после трансплантации. Эти образцы обеспечивают ситуацию, в которой восстановление NK клеток необходимо для того, чтобы опосредовать реакции противоопухолевого трансплантата против лейкоза (GvL). Оценка моментов времени вскоре после трансплантации представляет особый интерес из-за дефектов в опосредованном NK-клетками индуцированном клетками-мишенями продуцировании цитокинов в те же самые моменты времени, которые могут объяснять ранний рецидив (Foley et al., 2014. Immunol Rev 258(1):45-63). PBMC пациента после трансплантации (или сутки 100 [n=5] или более ранние 20-44 [n=5] после трансплантации) метили красителем CELLTRACE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) для того, чтобы измерять пролиферацию, инкубировали с мишенями HL-60 и 1633 BiKE или 161533 TriKE в течение 7 суток и затем метили красителем Live/Dead для того, чтобы измерять выживаемость NK клеток. В PBMC, которые инкубировали с 1633 BiKE, большинство NK клеток встраивало краситель Live/Dead, что указывает на низкую выживаемость. В отличие от этого, PBMC пациентов, которые инкубировали с 161533 TriKE, подтверждали превосходную выживаемость NK клеток (фиг. 3A и 3B; 96,9±0,5% против 21±5,4%; P < 0,0001). Чтобы понять, управляет ли фрагмент IL-15 в 161533 TriKE также пролиферацией, оценивали разведение красителя CELLTRACE в жизнеспособной популяции NK клеток. Неожиданно 161533 TriKE индуцировал устойчивую и специфическую пролиферацию NK клеток в образцах пациентов после трансплантации, при минимальной пролиферации T-клеток (фиг. 3C и 3D) в том же образце (делилось 79,1±2,5% NK клеток против 2,3±1,1% T-клеток, P < 0,0001). NK клетки также имели значительно более высокий показатель размножения, чем цельные T-клетки (7,2±0,8% против 1,1±0,1%, P < 0,0001), который представляет общую кратность размножения. Это подсказывает, что активность IL-15 в 161533 TriKE может быть более специфичной к NK клеткам в результате фланкирующих молекул scFv в конструкции. Кроме того, инкубация NK клеток с 161533 TriKE вела к устойчивой пролиферации, которая отражала размножение, опосредованное насыщающей концентрацией IL-15. Таким образом, активирующий NK домен IL-15 в TriKE является функционально активным и способным доставлять сигнал самоподдержания в NK клетки здоровых доноров и/или может управлять выживаемостью и пролиферацией NK клеток пациента после трансплантации, условий, при которых восстановление NK клеток является дефектным.

161533 TriKE восстанавливает дефектную функцию NK клеток вскоре после трансплантации

После аллогенной трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, возрастало число NK клеток, а также их ответ на стимуляцию IL-12 и IL-18, но проявлялась гипореактивность в течение больше чем 6 месяцев при экспозиции клеточным линиям злокачественных опухолей-мишеней. В этой ситуации кратковременная экспозиция инкубацией в течение ночи с IL-15 может восстанавливать функцию NK клеток против мишеней K562 (Foley et al., 2011, Blood 118(10):2784-2792). Принимая во внимание возможную клиническую разработку образцовой молекулы 161533 TriKE в качестве посттрансплантационной иммунотерапии, молекулы TriKE и сравнимые BiKE (1633) тестировали на PBMC после трансплантации от реципиентов трансплантата аллогенных сибсовых гематопоэтических стволовых клеток (фиг. 4). 1633 BiKE или 161533 TriKE инкубировали с NK клетками в течение ночи для того, чтобы сделать возможным функциональное восстановление, и на следующее утро клетки инкубировали с мишенями HL-60 и анализировали функцию. Несмотря на то, что инкубация с 1633 BiKE вела к удвоению уничтожения мишеней HL-60 по сравнению с просто NK клетками против мишеней HL-60 (18,9±2,1% против 9±1,5%, P < 0,0001), инкубация с 161533 TriKE мощно восстанавливала опосредованную NK клетками цитотоксическую функцию в значительно более высокой степени (52,1±3,5%), чем с использованием BiKE (фиг. 4A). Увеличение цитотоксичности хорошо коррелировало с повышенной дегрануляцией, измеряемой по экспрессии CD107a (фиг. 4B и 4C, левая часть). По сравнению с BiKE, TriKE мощно восстанавливал продуцирование IFNγ (BiKE=2,6±0,5% против TriKE=21,7±4,4%, P=0,0012) и TNFα (BiKE=6,1±1% против TriKE=29,9±3,8%, P < 0,0001) (фиг. 4B и 4C, центральные и правые части). Во всех анализах, TriKE индуцировал повышенную функциональность по сравнению с BiKE. Величина этих изменений ясно иллюстрирует иммунотерапевтический потенциал 161533 TriKE в ситуации сразу после трансплантации.

161533 TriKE увеличивает функцию NK клеток против первичных AML бластов

Для того чтобы сравнивать активность 1633 BiKE и 161533 TriKE против первичных AML бластов, PBMC от пациентов после трансплантации инкубировали с первичными AML бластами от двух различных пациентов (AML1 и AML2). Индуцирование CD107a, IFNγ и TNFα снижалось в случае первичных бластов по сравнению с мишенями HL-60 (фиг. 5 и фиг. 4). Снижение функции можно отчасти объяснять сниженной экспрессией CD33 на первичных бластах, но экспрессия ингибирующих лигандов или отсутствие лигандов активирующих рецепторов также может вносить вклад в сниженную функцию. Хотя не наблюдали значимые различия в активации NK клеток между AML1 и AML2 в одних и тех же условиях, PBMC из образцов пациентов после трансплантации, которые инкубировали с 161533 TriKE, значительно (p<0,05) индуцировали повышенную дегрануляцию (CD107a) и продуцирование цитокинов (IFNγ и TNFα) относительно PBMC, которые инкубировали с 1633 BiKE (фиг. 5A и фиг. 5B), что подсказывает, что комбинация активации, комбинированной с IL-15, эффективна против первичных AML мишеней. Взятые вместе, эти данные in vitro показывают, что 161533 TriKE может делать NK клетки антиген-специфическими против первичных опухолевых клеток.

161533 TriKE индуцирует усиленную выживаемость и функцию NK клеток in vivo

Сравнение активности BiKE и TriKE in vivo требовало создания модели мышиного ксенотрансплантата, которая одновременно приспособлена к прогрессированию CD33+ лейкоза и NK клеток человека. Клетки HL-60, содержащие репортер люциферазы, инъецировали внутривенно (7,5×10⁵ клеток/мышь) и затем через 3 суток инфузировали 1 миллион NK клеток человека, активированных в течение ночи с IL-15. На фиг. 6 представлены данные визуализации, которые изображают опухолевый груз HL-60-luc в каждой из групп лечения. Тогда как контрольная группа получала только клетки HL-60-luc, но не лекарственное средство или NK клетки, группы 1633 BiKE и 161533 TriKE получали клетки HL-60-luc и NK клетки. Лекарственное средство (50 мкг/кг) вводили MTWThF на всем протяжении исследования. В сутки 14 (фиг. 6B) группы BiKE и TriKE значительно (p<0,05) отличались от контрольной группы, но не друг от друга, что указывает на то, что в ранние моменты времени как BiKE, так и TriKE влияет на прогрессирование опухоли аналогичным образом. Однако в сутки 21 не удавалось найти значимых различий в выживании между группой без лекарственного средства и группой BiKE, несмотря на то, что две мыши в группе без лекарственного средства погибли к этому моменту. С другой стороны, группа TriKE значительно (p<0,05) отличалась от контрольной группы и также в этот момент времени отличалась от группы BiKE, что указывает на превосходящий контроль опухолевой нагрузки HL-60 на более поздних стадиях с использованием терапии 161533 TriKE.

Принимая во внимание результаты выживаемости и пролиферации NK клеток, отмеченные в экспериментах in vitro на фиг. 3, увеличенный контроль опухоли HL-60-luc, создаваемый с помощью TriKE in vivo, может быть опосредован, по меньшей мере отчасти, увеличенным сохранением и размножением перенесенной популяции NK клеток через фрагмент IL-15 в молекуле 161533 TriKE. Таким образом, у мышей брали кровь (20 мкл) в сутки 20 и оценивали число событий с NK клетками (CD56+CD3-), полученных в течение фиксированного времени регистрации (60 с). Ни контроль, ни животные, которых лечили 1633 BiKE, не демонстрировали значимых свидетельств циркулирующих CD56+CD3- NK клеток человека, что указывает на слабую выживаемость и размножение при этих условиях (фиг. 6C и 6D). В отличие от этого, все животные, которых лечили 161533 TriKE, показывали высокие уровни NK клеток человека (4261±410,6 события). Мыши, которых лечили с использованием 161533 TriKE, имели уровни NK клеток, которые почти в 200 раз превышали BiKE NK уровни, что указывает на устойчивый биологический вклад молекулы IL-15 в качестве активирующего NK домена в молекулу TriKE. Таким образом, использование активирующего NK домена IL-15 в TriKE может снижать необходимость терапии, чтобы включать предоставление экзогенного IL-15 для поддержания числа NK клеток.

Влияние фланкирующих последовательностей и ориентации на активность TriKE

Разрабатывали вариант конструкции 161533 без фланкирующих последовательностей по обе стороны от IL-15 для того, чтобы тестировать влияние фланкирующих последовательностей на функциональность молекулы. Новый вариант, идентифицированный в настоящем описании как 161533NL (SEQ ID № 5), сравнивали с конструкцией 161533 (SEQ ID № 1) в анализах уничтожения с высвобождением хрома. На фиг. 7 показано, у двух независимых доноров (PB1 и PB2), что фланкирующие последовательности влияют на активность TriKE. Также конструировали ориентационные варианты с IL-15 в положениях N-конца (151633; SEQ ID № 6) и C-конца (163315; SEQ ID № 7). На фиг. 7 также показано, что конструкция 161533, которая содержит IL-15 в центральном положении в качестве сшивателя и имеет фланкирующие последовательности, ведет к более высокой цитолитической активности NK клеток. Без фланкирующих последовательностей 161533NL демонстрировал цитотоксичность при соотношении E:T 20:1 25% по сравнению с исходным 161533 дикого типа (57%), что подтверждает, что фланкирующие последовательности в целом увеличивают цитолитическую активность NK клеток, индуцированную конструкциями TriKE.

1615EpCAM TriKE

Для того чтобы конструировать самоподдерживающееся гибридное иммунное привлекающее средство, 1615EpCAM TriKE (фиг. 8A, SEQ ID № 8) собирали посредством встраивания IL-15 человека в EpCAM16 BiKE (фиг. 8B). Конструкция TriKE содержит фрагменты ДНК, кодирующие области V_H и V_L из scFv против CD16, сплайсированные с IL-15 и затем с областями V_H и V_L из scFv против EpCAM. Фрагмент ДНК IL-15 фланкирован с любой стороны сегментом в 20 аминокислот (а. о.) (SEQ ID № 3) и EASGGPE (SEQ ID № 4). Кривая поглощения для 1615EpCAM TriKE и EpCAM16 BiKE, элюированных из ионообменной колонки FFQ в виде первой фазы при очистке лекарственного средства с использованием протокола трехступенчатого элюирования, представлена на фиг. 8C и 8D, соответственно. Первый пик, элюированный из колонки, представляет продукт, представляющий интерес. Когда осуществляли повторную укладку и очистку схожего количества телец включения, выход неожиданно улучшался при добавлении сшивателя IL-15. По сравнению с EpCAM16 BiKE, в 1615EpCAM TriKE поглощение возрастало почти втрое, что указывает на превосходящий выход. Гель SDS-PAGE и окрашивание кумаси синим показывают чистоту после очисток как на ионообменной, так и на эксклюзионной колонке (фиг. 8E и 8F), которые вели к продукту с чистотой более 90% при размере приблизительно 68860 кДа. Таким образом, точно как наблюдали при использовании 161533 TriKE (SEQ ID № 1), встраивание IL-15 непосредственно в гибрид TriKE дает превосходящие свойства очистки в сравнении с соответствующим BiKE, в этом случае EpCAM16, который не содержит IL-15.

1615EpCAM TriKE индуцирует высвобождение хрома-51

Для того чтобы определять функциональную активность 1615EpCAM, его способность к уничтожению измеряли в стандартных анализах высвобождения хрома-51 (фиг. 9). Для того чтобы определять эффект встраивания IL-15 в каркас EpCAM16, опосредованную NK клетками цитотоксичность оценивали у широкого спектра доноров, имеющих различные содержания NK клеток. Свежие выделенные PBMC добавляли в клетки HT-29 при соотношениях эффектор(E):мишень(T) 20:1, 6,6:1 и 2,2:1 и создавали цитолитические кривые. Сконструированные реактивы добавляли в концентрации 30 нМ (максимальная эффективная доза после экспериментов по титрованию). Доноры с 3,8%, 6,4%, 15% и обогащенными NK клетками >80% (как определяют с помощью проточной цитометрии) показывали, что компонент IL-15 в целом усовершенствует способности NK клеток к уничтожению (фиг. 9A, 9B, 9C и 9D, соответственно). На фиг. 9E приведены только кривые доноров для 1615EpCAM, подчеркивающие прямую корреляцию между увеличением присутствия NK и цитолитической активностью. На фиг. 9F показано, что для EpCAM16 такой корреляции не существует. Из-за вариаций базового уровня воспроизводимость обеспечивали посредством повторения с использованием различных доноров. Вместе данные показывают, что чем выше число NK клеток в анализе, тем выше наблюдаемая цитолитическая активность NK.

1615EpCAM TriKE индуцирует литическую дегрануляцию и экспрессию IFN-γ в различных клеточных линиях

Для того чтобы определять, индуцировали ли другие экспрессирующие EpCAM клеточные линии-мишени схожую опосредованную 1615EpCAM TriKE активацию NK клеток, как линия-мишень HT-29, функцию NK клеток тестировали на различных мишенях в сочетании с обработкой различными лекарственными средствами. Исследовали клеточные линии злокачественной опухоли молочной железы (фиг. 10A и 10B), злокачественной опухоли предстательной железы (фиг. 1C и 10D), злокачественной опухоли головы и шеи (фиг. 10E и 10F) и злокачественной опухоли яичников (фиг. 10G). Все линии EpCAM+ карцином, которые обрабатывали с использованием 1615EpCAM (SEQ ID № 8), индуцировали значительно повышенную дегрануляцию NK клеток (p<0,001) по сравнению с различными контролями, включая отдельно E:T, E:T+IL-15, E:T+CD16CD133 (нерелевантный BiKE), и E+IL-12/IL-18. E:T+EpCAM16 BiKE также демонстрировали заметные процентные доли клеток, экспрессирующих CD107a и цитотоксическую активность, поскольку BiKE обладает цитотоксической активностью, но не обладает способностью к росту. Таким образом, во всех случаях значения, наблюдаемые с использованием EpCAM16 BiKE, значительно меньше значений, наблюдаемых для 1615EpCAM (p<0,001).

1615EpCAM TriKE индуцирует пролиферацию NK клеток

Способность 1615EpCAM TriKE (SEQ ID № 8) индуцировать пролиферацию NK клеток показана на фиг. 11. Когда PBMC доноров экспонировали для TriKE, NK клетки, но не T-клетки, демонстрировали специфический паттерн пролиферации, как измеряли посредством проточной цитометрии (фиг. 11A). Результаты идентичны у трех из четырех доноров. Когда экспонировали для TriKE, NK клетки подвергались более устойчивой пролиферации, чем T-клетки. На фиг. 11B представлено непосредственное сравнение NK-пролиферации, индуцированной с использованием EpCAM16 BiKE и 1615EpCAM TriKE. TriKE индуцирует пролиферацию и размножение, а BiKE - нет. Для того чтобы исключать возможность других факторов, которые могут индуцировать пролиферацию NK клеток, PBMC экспонировали для TriKE, BiKE, отдельно scFv против CD16, отдельно IL-15, отдельно scFv против EpCAM или DT2219 (направленного токсина, содержащего дифтерийный токсин, связанный с scFv против CD22 и scFv против CD19). Только обработанные TriKE группы и обработанные IL-15 группы демонстрировали значительную пролиферацию NK клеток, как показывали изменения показателя размножения (фиг. 11C), который отражает кратность размножения клеток. Группа, стимулированная с использованием TriKE, демонстрировала более высокую выживаемость NK клеток, тогда как группа, которую экспонировали для BiKE, содержала преимущественно погибшие клетки, как подтверждали проточной цитометрией прямого/бокового рассеяния (фиг. 11D) и окрашиванием трипановым синим. Эти данные показывают, что помимо увеличения примирования клеток, фрагмент IL-15 в 1615EpCAM TriKE также индуцирует размножение и поддержание NK клеток.

1615EpCAM TriKE индуцирует литическую дегрануляцию и экспрессию IFN-γ против клеток-мишеней HT-29

Для того чтобы исследовать литическую дегрануляцию в качестве параметра активности NK клеток, экспрессию CD107a измеряли в CD56+/CD3- популяции NK клеток, которую инкубировали с экспрессирующими EpCAM мишенями HT-29. Клетки, которые инкубировали с EpCAM16 BiKE, демонстрировали повышенную экспрессию CD107a по сравнению с отдельно эффекторами, эффекторами+мишенями без лекарственного средства или эффекторами+мишенями с scFv против EpCAM. 1615EpCAM TriKE индуцировал значительно большую экспрессию CD107a, чем BiKE (фиг. 12A). 1615EpCAM также индуцировал значительно повышенную дегрануляцию по сравнению с исчерпывающей панелью контролей (в том числе отдельно E:T, E:T плюс scFv против EpCAM, свободный от 1615, отдельно E:T плюс scFv против CD16, CD2219 и E:T плюс комбинация IL-12 и IL-18), которые не оказывали какого-либо эффекта. Два различных источника обособленного IL-15, когда его комбинировали с E:T, также не смогли усиливать литическую дегрануляцию (сам IL-15, линкерный белок; IL-15 NCI, полученный из NCI). Продуцирование IFN-γ также усиливали в обработанных 1615EpCAM TriKE NK клетках по сравнению с NK клетками, которые обрабатывали с использованием BiKE отдельно или BiKE плюс IL-15, что указывает на биологическую способность фрагмента IL-15 внутри TriKE индуцировать примирование для секреции цитокинов (фиг. 12B). Как и ранее, TriKE тестировали против исчерпывающей панели контролей, в которой только сверхфизиологическая стимуляция IL-12/IL-18 превосходила TriKE.

На фиг. 12C не наблюдали экспрессию CD107a, когда NK клетки инкубировали с контрольными EpCAM- клетками миелолейкоза HL-60. Не наблюдали повышения экспрессии IFN-γ, как ожидали, с использованием мишеней HL-60 отрицательного контроля, за исключением контрольных клеток, которые обрабатывали с использованием IL-12/IL-18, что показывает, что анализ IFN-γ работал (фиг. 1D).

1615EpCAM133 индуцирует высвобождение хрома-51

Схема сконструированного тетраспецифического 1615EpCAM133 (SEQ ID № 9) показана на фиг. 13. Активность 1615EpCAM133 оценивали в анализе высвобождения хрома для того, чтобы измерять уничтожение NK клетками. Анализ осуществляли с использованием мишеней Caco-2 (CD133+, EpCAM-) и HT-29 (CD133-, EpCAM+) и свежих выделенных NK клеток двух доноров (PT1 и PT2) для каждой клеточной линии злокачественной опухоли, без антитела (без Ab), с scFv против CD16, scFv против CD133, scFv против EpCAM, IL-15 отдельно и EpCAM16 BiKE в качестве контролей. У всех доноров и в клетках злокачественных опухолей обоих типов 1615EpCAM133 демонстрировал превосходящее уничтожение при увеличении соотношений E:T (фиг. 14A-D). Контроли демонстрировали минимальную активность. Эти данные показывают, что возможно направленное воздействие на два различных фрагмента на опухолевой клетке. В этом случае один представляет собой более широкую мишень эпителиального маркера (EpCAM) и другой представляет собой более специфическую мишень CD133 против злокачественных стволовых клеток.

1615EpCAM133 индуцирует пролиферацию NK клеток

Способность 1615EpCAM133 к избирательному связыванию представлена на фиг. 15A и 15B. Способность фрагмента IL-15 в молекуле индуцировать пролиферацию и выживаемость представлена на фиг. 15C-F. Очищенные NK клетки экспонировали для scFv против CD16, scFv против CD133, 1615EpCAM133, DT2219 (мутантный дифтерийный токсин, связанный с scFv против CD22 и против CD19), scFv против EpCAM, EpCAM16 BiKE или IL-15 отдельно (NCI). Показатель размножения, который определяет общее размножение культуры, показывал значительно усиленное размножение в группах 1615EpCAM133 и IL-15 (p<0,001) (фиг. 15C). Для того чтобы сравнивать способность линкера IL-15 индуцировать пролиферацию, PBMC или очищенные NK клетки культивировали после окрашивания реакционноспособным красителем и экспонировали для EpCAM16 BiKE или тетраспецифической молекулы 1615EpCAM133. После инкубации осуществляли проточную цитометрию на CD56+ CD3- субпопуляции клеток для того, чтобы оценивать NK клетки, и на CD56-CD3+ клетках для того, чтобы оценивать T-клетки. На фиг. 15D только NK клетки, которые обрабатывали с использованием 1615EpCAM133, демонстрировали существенную пролиферацию. Обработка с использованием EpCAM16 BiKE - нет. Способность индуцировать специфическую пролиферацию в NK клетку представлена на фиг. 15E; T-клетки не пролиферировали после экспозиции для 1615EpCAM133.

Для того чтобы исследовать способность 1615EpCAM133 усиливать выживаемость NK клеток, очищенные NK клетки совместно культивировали в течение 7 суток и обрабатывали с использованием 1615EpCAM133 или EpCAM16 BiKE. После окрашивания живых-погибших через проточную цитометрию, в группе 1615EpCAM133 наблюдали значительно более высокие процентные доли живых NK клеток (фиг. 15F).

1615133 индуцирует высвобождение хрома-51

Схема сконструированного 1615133 представлена на фиг. 16. Для того чтобы оценивать функциональную активность 1615133 TriKE, осуществляли стандартный анализ высвобождения хрома-51. Для того чтобы определять эффект встраивания IL-15 в каркас 16133, цитотоксичность оценивали с использованием NK клеток двух отдельных доноров и опухолевых мишеней Caco-2 при различных соотношениях E:T (20:1, 10:1 и 5:1) и сравнивали активность между обработкой 1615133 TriKE, 16133 BiKE, scFv против CD16, scFv против CD133 и без обработки лекарственным средством (фиг. 17A и 17B). Уничтожение мишеней Caco-2 было повышено в TriKE по сравнению с контролями. Дозозависимое титрование 1615133 TriKE (1 нМ, 5 нМ и 10 нМ) с более широким диапазоном соотношений E:T (20:1, 6,6:1, 2,2:1, 0,7:1, 0,23:1 и 0,08:1) демонстрировало наивысшее влияние активности лекарственного средства при наивысших дозах (фиг. 17C). Для того чтобы оценивать специфичность связывания, измеряли интенсивность флуоресценции на основе проточной цитометрии после инкубации клеток Caco-2 с FITC-меченным 1615133 TriKE в различных концентрациях (1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ или 500 нМ). Когда не меченный scFv против CD133 (200 нМ) добавляли наряду с 1615133 TriKE, происходило резкое снижение связывания (фиг. 17D), что указывает на то, что 1615133 TriKE связывается с клетками-мишенями специфически через взаимодействие с CD133. Вместе эти данные показывают, что ADCC, опосредованная TriKE, направлена на антиген.

1615133 индуцирует пролиферацию NK клеток

Пролиферацию, индуцируемую с помощью 1615133 (SEQ ID № 10), измеряли посредством разведения красителя CELLTRACE в популяциях жизнеспособных NK и T-клеток. Когда PBMC донора экспонировали для 1615133 TriKE или 16133 BiKE, только группа TriKE индуцировала пролиферацию (фиг. 18A). Что важно, сравнение с другими контрольными средствами, включая scFv против CD16, scFv против CD133, DT2219 (направленный токсин, состоящий из scFv против CD22 и против CD19, связанных с дифтерийным токсином) и IL-15, полученный из NCI, показывало, что только 1615133 TriKE и NCI IL-15 индуцировали пролиферацию. Чтобы показать потенциал 1615133 TriKE к индуцированию пролонгированной выживаемости, очищенные NK клетки инкубировали в течение 7 суток с 1615133 или 16133 BiKE. Реакционноспособный краситель использовали для того, чтобы количественно определять гибель клеток в различных группах обработки. Группа TriKE показывала более высокое количество живых клеток, в которые реакционноспособный краситель не встраивался, по сравнению с BiKE (фиг. 18B). Вместе результаты показывают, что IL-15, присутствующий в 1615133 TriKE, индуцирует пролиферацию NK клеток и их пролонгированную выживаемость.

TriKE в целом индуцируют высвобождение хрома-51

Анализы высвобождения ⁵¹Cr осуществляли с использованием нескольких различных TriKE, чтобы показывать, что любой scFv, который направлен на клетки злокачественной опухоли, можно встраивать в функциональный TriKE. Клетки немелкоклеточной злокачественной опухоли легких (NCI-H460) инкубировали с 1615EPCAM133 TriKE (SEQ ID № 9) или 1615NG2 TriKE. Как 1615NG2, так и 1615EpCAM133 имел активность при нескольких различных соотношениях E:T (20:1, 10:1 и 5:1). На фиг. 19B показаны клетки меланомы, которые инкубировали с 1615EPCAM133 TriKE. Мезотелин+EpCAM-NG2 клетки меланомы MDA-435A инкубировали с 1615EPCAM TriKE или 1615Meso TriKE (SEQ ID № 11). Только 1615Meso имел активность. Клетки злокачественной опухоли яичника (клетки Ovcar3) инкубировали с 1615NG2 TriKE или 1615Meso TriKE. Оба TriKE индуцировали NK цитолитическую активность. Также создавали TriKE против лейкоза, распознающий маркеры лейкоза CD19 и CD22. 16152219 TriKE тестировали на CD22+CD19+ клетках Raji, и он уничтожал их очень хорошо (а также ритуксимаб). Вместе эти данные показывают, что любые scFv можно вставлять в обобщенную структурную платформу TriKE 1615X, и получаемые TriKE могут направлять NK клетки для того, чтобы отвечать на мишень scFv и расти. Дополнительные образцовые молекулы TriKE перечислены в таблице 3.

Таблица 3. Образцовые молекулы TriKE

Молекула TriKE	Мишень(и)	ADCC*	Размножение**	Активация***
161533	CD33	+	+	+
1615EpCAM	EpCAM	+	+	+
1615EpCAM133	EpCAM/CD133	+/+	+/+	+/+
1615133	CD133	+	+	+
1615NG2	NG2	+	+	+
1615Meso	Мезотелин	+	+	+
1615ROR-1	ROR-1	+	+	+
16a1538	CD38	+	+	+
1615IGF-1	IGF1	+	+	+
1615Her2	Her2/neu	+	+	+
16152219	CD22/CD19	+/+	+/+	+/+
Llama161533	CD33	+	+	+
1615HIV	HIV	+	+	+

*ADCC или цитотоксическую активность усиливали на 30% с помощью платформы TriKE

**Размножение: TriKE усиливает размножение NK клеток, BiKE - нет.

***Активация: TriKE усиливает продуцирование различных цитокинов против злокачественных опухолей, включая INFγ и TNFα.

Идентичным образом получали и тестировали несколько TriKE, направленных на различные маркеры злокачественных опухолей. CD33 или Siglec-3 (иммуноглобулиноподобный лектин 3, связывающий сиаловую кислоту, SIGLEC3, SIGLEC-3, gp67, p67) представляет собой трансмембранный рецептор, экспрессируемый на клетках миелоидной линии дифференцировки. Обычно его считают миелоидоспецифичным. EpCAM, молекула адгезии эпителиальных клеток, представляет собой трансмембранный гликопротеин, опосредующий Ca²⁺-независимую гомотипическую адгезию между клетками в эпителии. CD133, также известный как проминин-1, представляет собой гликопротеин, который у человека кодируется геном PROM1 и является членом пентаспановых трансмембранных гликопротеинов (5-трансмембранных, 5-TM), которые специфически локализованы в клеточных выпячиваниях. NG2 представляет собой хондроитинсульфатный протеогликан 4, также известный как ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатный протеогликан (MCSP) или нейроглиальный антиген 2 (NG2). Он представляет интегрированный мембранный хондроитинсульфатный протеогликан, экспрессируемый клетками злокачественной опухоли меланомы человека. Мезотелин представляет собой белок в 40 кДа, присутствующий на нормальных мезотелиальных клетках и сверхэкспрессированный в нескольких опухолях человека, в том числе мезотелиоме и аденокарциноме яичников и поджелудочной железы. ROR-1 представляет собой рецепторную тирозинкиназу, которая модулирует рост невритов. Она представляет собой мембранный белок I типа, относящийся к подсемейству ROR рецепторов клеточной поверхности, и в настоящее время идут исследования его роли в метастазировании клеток злокачественной опухоли. HER2 является членом семейства рецептора эпидермального фактора роста человека (HER/EGFR/ERBB). CD38 (кластер дифференцировки 38), также известный как гидролаза циклической ADP рибозы, представляет собой гликопротеин, найденный на поверхности многих клеток иммунной системы. IGF-1 представляет собой инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), также называемый соматомедином C. IGF-1 представляет собой белок, который у человека кодируется геном IGF1 и связан со злокачественной опухолью молочной железы. Вирус иммунодефицита человека (HIV) представляет собой лентивирус (подгруппа ретровирусов), который вызывает ВИЧ-инфекцию и с течением времени синдром приобретенного иммунодефицита (AIDS) и саркому Капоши.

CD3-IL2-EpCAM TriKE избирательно усиливает пролиферацию T-клеток

Синтезировали TriKE, которые работают с IL-2 вместо IL-15, с теми же фланкирующими последовательностями. Они стимулируют размножение T-клеток вместо NK клеток. TriKE CD3-IL-2-EpCAM, направленное на T-клетки (SEQ ID № 13), синтезировали и тестировали на его способность стимулировать T-клетки вместо NK клеток (фиг. 20). Известно, что IL-2 является более хорошим стимулятором T-клеточной пролиферации, чем IL-15. PBMC метили CELLTRACE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) и помещали в культуру. Гистограмма показывает, что CD3-IL-2-EpCAM вызывал устойчивую пролиферацию T-клеток, но не NK клеток. CD3-IL-2-EpCAM демонстрировал более хорошую стимуляцию, чем любое другое средство, которое тестировали, включая 1615EpCAM TriKE (положительный контроль), CD3EpCAM BiTE, CD3-IL-2-EpCAM, IL-2 или отсутствие лечения. Эти данные показывают, что IL-2 работает аналогичным образом, как IL-15, когда его используют в качестве сшивателя на этой платформе.

Таким образом, в этом раскрытии описана разработка и использование триспецифического привлекающего киллеры средства (TriKE), способного создавать иммунологические синапсы между NK клетками и мишенью. CD33+ миелоидную мишень использовали в качестве модельной мишени для модельного TriKE, которое содержало антитело против CD16 в качестве модельного привлекающего NK домена, антитело против CD33 в качестве модельного направляющего домена, который направлен на CD33+ миелоидную мишень, модельный активирующий NK домен на основе IL-15 и фланкирующие последовательности по обе стороны от активирующего NK домена, связывающие активирующий NK домен с остальными доменами. Фланкирующие последовательности представляют собой PSGQAGAAASESLFVSNHAY (SEQ ID № 3) выше активирующего NK домена и EASGGPE (SEQ ID № 4) ниже активирующего NK домена. Фланкирующие последовательности влияют на функциональную активность молекул TriKE и являются полностью неожиданной находкой.

Одно образцовое модельное TriKE (161533, SEQ ID № 1) проявляло повышенную функцию относительно сравнимого биспецифического привлекающего киллеры средства (1633 BiKE, SEQ ID № 2) в анализах цитотоксичности, CD107a дегрануляции и продуцирования цитокинов при опосредованных NK-клетками ответах на мишени HL-60. Активность образцового модельного TriKE в физиологическом контексте оценивали с использованием NK клеток пациентов, собранных вскоре после аллогенной трансплантации стволовых клеток, в контексте, в котором функция NK клеток является дефектной. По сравнению с 1633 BiKE, TriKE, содержащее активирующий NK домен IL-15, индуцировало выживаемость и пролиферацию NK клеток, но не T-клеток. Образцовая модельная молекула TriKE также индуцировала гипочувствительные NK клетки пациента на опосредование мощных ответов на мишени первичного острого миелолейкоза. Наконец, образцовая модельная молекула TriKE проявляла превосходящую противоопухолевую активность по сравнению со сравнимым BiKE и индуцировала персистенцию и выживаемость NK клеток человека in vivo в течение по меньшей мере 3 недель в ксеногенной модели с использованием HL-60-Luc и NK клеток человека.

Данные, представленные в настоящем описании, подтверждают полезность образцовой молекулы TriKE и предоставляют основание для разработки и конструирования альтернативных молекул TriKE. Как подробно описано выше, молекулу TriKE можно разрабатывать с использованием любого подходящего привлекающего NK домена и/или любого подходящего направляющего домена.

Образцовое 161533 TriKE (SEQ ID № 1) использовали в качестве модели, поскольку CD16 экспрессирован на поверхности NK клеток. Таким образом, scFv, который избирательно связывается с NK клетками, можно использовать в качестве привлекающего домена NK клеток. CD33 экспрессирован на клетках острого миелолейкоза AML (обычная форма лейкоза взрослых), но также встречается на миелодиспластических клетках, что может сигнализировать о предрасположенности к AML. Таким образом, и scFv против CD33 можно использовать в качестве направляющего домена.

Однако в альтернативном варианте осуществления антитело против EpCAM можно использовать в направляющем домене TriKE. EpCAM представляет собой маркер эпителиальных злокачественных опухолей, экспрессируемый на карциномах большинства типов, включая, например, злокачественные опухоли легких, молочной железы, ободочной и прямой кишки, предстательной железы, поджелудочной железы, ЖКТ, почек и яичников. Данные, показывающие, что TriKE (1615EpCAM, SEQ ID № 8), которое содержит scFv против EpCAM, усиливает уничтожение клеток злокачественной опухоли толстой кишки, указывают на то, что любой подходящий направляющий домен (например, любой подходящий scFv) можно включать в TriKE на основании платформы против CD16/IL15 со схожим успехом. 1615EpCAM TriKE содержит scFv против CD16 в качестве привлекающего NK домена и активирующий NK домен IL-15 и scFv против EpCAM в качестве направляющего домена.

В еще одном другом альтернативном варианте осуществления известно, что CD38 экспрессирован на множестве миеломных клеток. Данные, показывающие, что TriKE (16a1538, SEQ ID № 16), который содержит scFv против CD38, усиливает уничтожение множества миеломных клеток in vitro, кроме того, указывают на общую модульность платформы TriKE. 16a1538 TriKE содержит scFv против CD16a в качестве привлекающего NK домена, активирующий NK домен IL-15 и scFv против CD38 в качестве направляющего домена. Наконец, можно создавать TetraKE (тетрамер) посредством разработки молекулы, которая содержит второй направляющий домен. Например, можно разрабатывать TetraKE, которое содержит scFv против CD133 (SEQ ID № 17), например, в 1615EpCAM TriKE (SEQ ID № 8), чтобы формировать образцовое TetraKE (1615EpCAM133, SEQ ID № 9). CD133 является установленным маркером на злокачественных стволовых клетках. Злокачественные стволовые клетки представляют небольшую популяцию стволовых клеток в опухоли, которые отвечают за возникновение, обновление и химиотерапевтическую устойчивость опухоли.

В некоторых вариантах осуществления в этом раскрытии описано иммунное привлекающее средство, которое одновременно опосредует ADCC и обеспечивает сигнал самоподдержания, индуцирующий размножение и поддержание эффекторных NK клеток. Несмотря на то, что BiKE, которое содержит scFv против CD16, сплайсированный с scFv против EpCAM, содействовало формированию иммунного синапса между эффекторными NK клетками и экспрессирующими EpCAM клетками карциномы, что приводило к достижению цитотоксической дегрануляции в ADCC клетках-мишенях, как цитотоксическая активность, так и долговечность NK могут выиграть от добавления костимуляторного сигнала, который усиливает размножение эффекторных клеток непосредственно в месте иммунного привлечения. В некоторых вариантах осуществления этот костимуляторный сигнал обеспечивают посредством добавления средства, хорошо подходящего для роста NK клеток. Например, для того, чтобы содействовать избирательному размножению NK, IL-15 сшивали с EpCAM16 BiKE. Как показано в примере 2, добавление молекулы IL-15 в иммунное привлекающее средство может опосредовать пролиферацию NK, может вызывать длительную ADCC активность и может усовершенствовать литическую дегрануляцию и секрецию цитокинов посредством иммунного привлекающего средства.

В некоторых вариантах осуществления привлекающее NK клетки средство может включать использование гуманизированного CD16 привлекающего средства, полученного из нанотела животного. Хотя scFv имеет вариабельный компонент тяжелой цепи и вариабельный компонент легкой цепи, соединенные линкером, нанотело состоит из одной мономерной вариабельной цепи, т.е. вариабельной тяжелой цепи или вариабельной легкой цепи, которая способна специфически привлекать мишень. Нанотело можно получать из антитела любого подходящего животного, например, такого как верблюдовое (например, лама или верблюд) или хрящевая рыба. Нанотело может обеспечивать превосходящую физическую стабильность, способность связывать глубокие канавки и увеличенный выход продуцирования по сравнению с более крупными фрагментами антител.

В одном образцовом варианте осуществления молекула привлекающего NK средства на основе нанотела может содержать гуманизированное нанотело к CD16, полученное из опубликованного нанотела ламы (последовательность GeneBank EF561291; Behar et al., 2008. Protein Eng Des Sel. 21(1):1-10), называемого EF91. EF91 ламы изначально встраивали в BiKE, содержащее CD19, чтобы тестировать способность этого CD16 привлекающего средства управлять активацией NK клеток. Оно демонстрировало функциональность, схожую с опосредованным ритуксимабом уничтожением в анализе высвобождения хрома с мишенями Raji (фиг. 22A). После подтверждения функциональности молекулы, CDR клонировали в гуманизированный каркас верблюдовых (Vincke et al., 2009. J Biol Chem. 284(5):3273-3284), чтобы гуманизировать CD16 привлекающее средство, сейчас называемое HuEF91. Связывание HuEF91 представлено на фиг. 22B, и оно эквивалентно связыванию, которое наблюдали с использованием стандартного CD16 scFv, что указывает на то, что встраивание вариабельной тяжелой цепи нанотела ламы в гуманизированный остов не создает пространственного затруднения для специфичности молекулы. Использование HuEF91 в качестве привлекающего NK средства в молекулах TriKE, описанных в настоящем описании, позволяет увеличивать лекарственный выход, повышать стабильность и/или увеличивать опосредованный NK клетками ADCC эффект.

В некоторых вариантах осуществления иммунное привлекающее средство, как раскрыто в настоящем описании, можно использовать для того, чтобы стимулировать собственную иммунную систему пациента для элиминации опухолевых клеток. Несмотря на то, что исследования показывают, что T-клетки, генетически модифицированные для того, чтобы экспрессировать химерные антигенные рецепторы (CAR), являются мощными клиническими медиаторами противоопухолевой активности, производство T-CAR является дорогим и сложным. Другие недостатки включают риск цитокиновой токсичности и долгосрочной персистенции T-CAR, что ведет ко взаимодействию со здоровой тканью или неопластической трансформации. Как раскрыто в настоящем описании, триспецифическое привлекающее киллеры средство может служить в качестве медиатора ADCC и позволяет растить NK клетки без необходимости экстракорпоральной генетической модификации и генной терапии, что дает потенциальное преимущество над системой T-CAR. Поскольку иммунное привлекающее средство быстро выводится, ответ не может поддерживаться неограниченно, что, возможно, снижает риск цитокиновой токсичности иммунных привлекающих средств по сравнению с T-CAR.

В некоторых вариантах осуществления триспецифическое привлекающее киллеры средство включает цитокин. В некоторых вариантах осуществления триспецифическое привлекающее киллеры средство предпочтительно включает IL-15. IL-15 не индуцирует Treg, и IL-15 является регулятором NK клеток. В дополнение к усовершенствованию активации и цитотоксичности, IL-15 может регулировать и инициировать антиапоптозные и пролиферативные сигналы на NK клетках, что ведет к увеличенным размножению NK клеток и выживаемости. Эти характеристики могут быть полезны во время использования триспецифического привлекающего киллеры средства при лечении злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления включение IL-15 в триспецифическое привлекающее киллеры средство позволяет опосредовать направленную доставку TriKE в синапс NK/клетка-мишень, что потенциально вызывает накопление IL-15 в локализации опухоли более эффективно, чем системный IL-15.

В некоторых вариантах осуществления триспецифическое привлекающее киллеры средство предпочтительно содержит IL-15, scFv против CD16 и scFv против EpCAM (1615EpCAM TriKE). В некоторых вариантах осуществления IL-15 выполняет функцию сшивателя между scFv против CD16 и scFv против EpCAM.

В некоторых вариантах осуществления иммунное привлекающее средство увеличивает секрецию цитокина, опосредованного клеткой иммунной системы. В некоторых вариантах осуществления секреция цитокинов предпочтительно является антиген-специфической. В некоторых вариантах осуществления этот цитокин может включать IFN-γ, GM-CSF, IL-6, IL-8 и/или TNF-α. В некоторых вариантах осуществления это продуцирование цитокинов предпочтительно находится на физиологических уровнях. В некоторых вариантах осуществления это продуцирование цитокинов находится на уровне, который ниже уровня, наблюдаемого в стимулированной IL-12/IL-18 NK клетке (Papadakis et al., 2004. J Immunol. 172:7002-7007). Как показано в примере 2, измерение отличительных воспалительных цитокинов, включая GM-CSF, IL-6, IL-8, TNF-α, с использованием анализа цитокинов Luminex демонстрирует статистически значимую разницу в секреции GM-CSF между BiKE и TriKE, но не разницу в секреции других цитокинов.

В некоторых вариантах осуществления иммунное привлекающее средство усиливает пролиферацию лимфоцита. Лимфоцит может включать, например, NK клетку, γδ-T-клетку и/или CD8 T-клетку.

Аналогично молекуле 1615EpCAM133 TetraKE, которая содержит больше чем один направляющий домен, можно разрабатывать TetraKE или более крупную молекулу, которая содержит больше чем один домен привлекающего NK клетки средства и/или больше чем один активирующий NK домен.

В другом аспекте этого раскрытия описаны способы уничтожения клетки-мишени у субъекта. В целом, способ включает введение субъекту молекулы TriKE в количестве, эффективном для того, чтобы индуцировать NK-опосредованное уничтожение клеток-мишеней. «Лечить» или его вариации относятся к снижению, ограничению прогрессирования, улучшению или разрешению, в любой мере, симптомов или признаков, связанных с состоянием. Как используют в настоящем описании, «улучшать» относится к любому снижению степени, тяжести, частоты и/или вероятности характеристики симптома или клинического признака конкретного состояния; «симптом» относится к любому субъективному свидетельству заболевания или состояния пациента; и «признак» или «клинический признак» относится к объективной физической находке, связанной с конкретным состоянием, которую может найти некто, отличный от пациента.

«Лечение» может быть терапевтическим или профилактическим. «Терапевтическое» и его вариации относятся к лечению, которое улучшает один или более существующих симптомов или клинических признаков, связанных с состоянием. «Профилактическое» и его вариации относятся к лечению, которое ограничивает, в любой мере, развитие и/или возникновение симптома или клинического признака состояния. В целом, «терапевтическое» лечение начинают после манифестации состояния у субъекта, тогда как «профилактическое» лечение начинают до манифестации состояния у субъекта. Таким образом, в определенных вариантах осуществления способ может включать профилактическое лечение субъекта с риском развития состояния. «С риском» относится к субъекту, который фактически может или не может иметь описанный риск. Таким образом, например, субъектом «с риском» развития точно определенного состояния является субъект, который имеет один или более признаков повышенного риска наличия или развития точно определенного состояния по сравнению с индивидуумами, которые не имеют один или более признаков, независимо от того, происходит ли у субъекта манифестация любого симптома или клинического признака наличия или развития состояния. Образцовые признаки состояния могут включать, например, генетическую предрасположенность, семейный анамнез, возраст, пол, географическое местоположение, образ жизни или медицинский анамнез. Лечение также можно продолжать после разрешения симптомов, например, для того, чтобы предотвращать или задерживать их рецидив.

В некоторых случаях лечение может включать введение молекулы TriKE субъекту с тем, чтобы молекула TriKE могла стимулировать эндогенные NK клетки in vivo. Использование молекулы TriKE в качестве части in vivo позволяет делать NK клетки антиген-специфическими при одновременной совместной стимуляции, увеличении выживаемости и размножения, которые могут быть антиген-специфическими. В других случаях TriKE можно использовать in vitro в качестве адъюванта для терапии адоптивным переносом NK клеток.

В другом аспекте TriKE можно разрабатывать для того, чтобы активировать T-клетки вместо NK клеток. В этом аспекте TriKE в целом может содержать один или более привлекающих T-клетки доменов, один или более активирующих T-клетки доменов и один или более направляющих доменов (которые направлены, например, на опухолевую клетку или инфицированную вирусом клетку) и один или более активирующих T-клетки доменов (например, IL-2 или другой усиливающий T-клетки цитокин, хемокин и/или активирующую молекулу), причем каждый домен функционально связан с другими доменами.

Привлекающий T-клетки домен может содержать любой фрагмент, который связывается с T-клеткой и/или активирует ее, и/или любой фрагмент, который блокирует ингибирование T-клеток. В некоторых вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может содержать антитело или его фрагмент, которые избирательно связываются с компонентом поверхности T-клетки. В других вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может содержать лиганд или низкомолекулярное соединение, которые избирательно связываются с компонентом поверхности T-клетки.

В некоторых вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может избирательно связываться с рецептором, по меньшей мере частично расположенным на поверхности T-клетки. В определенных вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может выполнять функцию связывания T-клетки и, тем самым, приведения T-клетки в пространственную близость с мишенью, с которой направляющий домен, описанный более подробно далее, избирательно связывается. Однако в определенных вариантах осуществления привлекающий T-клетки домен может избирательно связываться с рецептором, который активирует T-клетку и, следовательно, также обладает активирующей функцией.

Хотя описан в настоящем описании в контексте различных вариантов осуществления, в которых привлекающий T-клетки домен содержит scFv против рецептора CD3, привлекающий T-клетки домен может содержать любое антитело или другой лиганд, которые избирательно связываются с рецептором CD3. Кроме того, привлекающий T-клетки домен может содержать антитело или лиганд, которые избирательно связываются с любым T-клеточным рецептором, например, такое как антитело против CD4, антитело против CD8, антитело против LFA-1, антитело против LFA-2, антитело против CTLA4, антитело против TCR, антитело против CD28, антитело против CD25, антитело против PD1, PD-1L, B7-1, B7-2, молекулы MHC, CD80, CD86, B7H, антитело против SLAM или антитело против BTLA.

Направляющий домен может содержать любой фрагмент, который избирательно связывается с планируемой мишенью, такой как, например, опухолевая клетка, мишень в строме злокачественной опухоли, мишень на ингибирующей клетке, такой как супрессорные клетки миелоидного происхождения, которые являются CD33+, или мишень на инфицированной вирусом клетке. Таким образом, направляющий домен может содержать, например, любой один из направляющих доменов, описанных выше в контексте NK-активирующих молекул TriKE.

Активирующий T-клетки домен может содержать аминокислотную последовательность, которая активирует T-клетки, содействует поддержанию T-клеток или иным образом содействует активности T-клеток. Активирующий T-клетки домен может представлять собой или может быть получен из одного или более цитокинов, которые могут активировать и/или поддерживать T-клетки. Как используют в настоящем описании, термин «полученный из» относится к аминокислотному фрагменту цитокина (например, IL-2), которого достаточно для того, чтобы обеспечивать активацию и/или поддержание активности T-клеток. В вариантах осуществления, которые включают больше чем один T-активирующий домен, T-активирующие домены можно предоставлять последовательно или в любой другой комбинации. Дополнительно, каждый T-активирующий домен на основе цитокина может содержать или полную аминокислотную последовательность цитокина или может представлять собой аминокислотный фрагмент, независимо от природы других активирующих T-клетки доменов, включенных в молекулу TriKE. Образцовые цитокины, на которых может быть основан активирующий T-клетки домен, включают, например, IL-2 или любой цитокин семейства IL-2, который имеет общую цепь с рецептором IL-2, например, такой как IL-15, IL-4, IL-7, IL-9, IL-21 и IL-13. Таким образом, хотя в настоящем описании описано подробно в контексте образцового модельного варианта осуществления, в котором активирующий T-клетки домен получают из IL-2, TriKE можно разрабатывать с использованием активирующего T-клетки домена, который представляет собой любой подходящий цитокин или который получают из него.

Для краткости этого описания, упоминание об активирующем T-клетки домене посредством идентификации цитокина, на котором он основан, включает как полную аминокислотную последовательность цитокина, так и любой подходящий аминокислотный фрагмент цитокина. Таким образом, упоминание об активирующем T-клетки домене «IL-2» включает активирующий T-клетки домен, который содержит полную аминокислотную последовательность IL-2, или активирующий T-клетки домен, который содержит фрагмент IL-2. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления активирующий T-клетки домен может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID № 18.

В другом аспекте этого раскрытия описаны способы уничтожения клетки-мишени у субъекта. В целом, способ включает введение субъекту молекулы TriKE в количестве, эффективном для того, чтобы индуцировать опосредованное T-клетками уничтожение клеток-мишеней. Здесь также лечение может быть терапевтическим или профилактическим, как описано выше в контексте способов, которые включают использование NK-активирующего TriKE.

Соответственно, молекулу TriKE, будь то NK-активирующее TriKE или активирующее T-клетки TriKE, можно вводить до, во время или после того, как субъект впервые проявит симптом или клинический признак состояния. Лечение, начинаемое до того, как субъект впервые проявит симптом или клинический признак, связанный с состоянием, может вести к снижению вероятности того, что субъект перенесет клиническое свидетельство состояния, по сравнению с субъектом, которому молекулу TriKE не вводят, что снижает тяжесть симптомов и/или клинических признаков состояния и/или полностью разрешает состояние. Лечение, начинаемое после того, как субъект впервые проявит симптом или клинический признак, связанный с состоянием, может вести к снижению тяжести симптомов и/или клинических признаков состояния по сравнению с субъектом, которому композицию не вводят, и/или полному разрешению состояния.

Молекула TriKE может представлять собой любой вариант осуществления молекулы TriKE, описанной выше, которая имеет направляющий домен, который избирательно связывается с популяцией подходящих клеток-мишеней. В некоторых случаях клетка-мишень может включать опухолевую клетку с тем, чтобы способ мог включать лечение злокачественной опухоли, связанной с опухолевыми клетками. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способ может включать улучшение по меньшей мере одного симптома или клинического признака опухоли.

В вариантах осуществления, в которых клетка-мишень включает опухолевую клетку, способ дополнительно может включать хирургическую резекцию опухоли и/или уменьшение размера опухоли с помощью химической (например, химиотерапии) и/или лучевой терапии. Образцовые опухоли, которые можно лечить, включают опухоли, связанные со злокачественной опухолью предстательной железы, злокачественной опухолью легких, злокачественной опухолью ободочной кишки, злокачественной опухолью прямой кишки, злокачественной опухолью мочевого пузыря, меланомой, злокачественной опухолью почки, почечной злокачественной опухолью, злокачественной опухолью ротовой полости, злокачественной опухолью глотки, злокачественной опухолью поджелудочной железы, злокачественной опухолью матки, злокачественной опухолью щитовидной железы, злокачественной опухолью кожи, злокачественной опухолью головы и шеи, злокачественной опухолью шейки матки, злокачественной опухолью яичников и/или гематопоэтической злокачественной опухолью.

В различных вариантах осуществления направляющий домен TriKE может содержать полипептид, который избирательно связывается, например, с EGFR, HER2/neu EpCAM, CSPG4, HSPG2, IGF-1, CD38, CD19, CD20, CD22, CD30, CD52, CD33, ROR-1, UPAR, VEGFR, CD33, LIV-1, SGN-CD70A, CD70, IL-3, IL-4R, CD133, мезотелином, эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT), TRAIL, CD38, CD45, CD74, CD23 или вирусными маркерами злокачественных опухолей, такими как HIV.

Как используют в настоящем описании, «субъект» может представлять собой любое животное, например, такое как млекопитающее (например, собака, кошка, лошадь, корова, овца, коза, обезьяна и т. д.). В определенных вариантах осуществления субъектом может являться человек.

Молекулу TriKE, описанную в настоящем описании, можно формулировать с фармацевтически приемлемым носителем. Как используют в настоящем описании, «носитель» включает любой растворитель, дисперсионную среду, несущую среду, покрытие, разбавитель, антибактериальное и/или противогрибковое средство, изотоническое средство, задерживающее абсорбцию средство, буфер, раствор носителя, суспензию, коллоид и т. п. Использование таких сред и/или средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда любые стандартные среды или средства несовместимы с активным ингредиентом, предусмотрено их использование в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также включать в композиции. Как используют в настоящем описании, «фармацевтически приемлемый» относится к материалу, который не является биологически или иным образом нежелательным, т. е. материал можно вводить индивидууму наряду с молекулой TriKE, не вызывая каких-либо нежелательных биологических эффектов или взаимодействия вредным образом с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в которой он содержится.

Следовательно, молекулу TriKE можно формулировать в фармацевтической композиции. Фармацевтическую композицию можно формулировать в различных формах, адаптированных для предпочтительного пути введения. Таким образом, композицию можно вводить через известные пути, включая, например, оральный, парентеральный (например, внутрикожный, чрескожный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, интраперитонеальный и т.д.) или топический (например, интраназальный, внутрилегочный, интрамаммарный, интравагинальный, внутриматочный, внутрикожный, чрескожный, ректальный и т.д.). Фармацевтическую композицию можно вводить на поверхность слизистой, например, посредством введения, например, на слизистую носа или дыхательных путей (например, с помощью спрея или аэрозоля). Композицию также можно вводить через замедленное или отсроченное высвобождение.

Таким образом, молекулу TriKE можно предоставлять в любой подходящей форме, включая в качестве неограничивающих примеров раствор, суспензию, эмульсию, спрей, аэрозоль или любую форму смеси. Композицию можно доставлять в составе с любым фармацевтически приемлемым эксципиентом, носителем или несущей средой. Например, состав можно доставлять в стандартной топической дозированной форме, например, такой как крем, мазь, аэрозольный состав, неаэрозольный спрей, гель, лосьон и т.п. Состав дополнительно может содержать одну или более добавок, включая, например, такие как адъювант, усилитель проникновения через кожу, красящее вещество, ароматизатор, отдушка, увлажнитель, загуститель и т.п.

Состав в целях удобства можно представлять в стандартной дозированной форме, и его можно получать способами, хорошо известными в области фармацевтики. Способы получения композиции с фармацевтически приемлемым носителем включают стадию приведения молекулы TriKE в связь с носителем, который составляет один или более вспомогательных ингредиентов. В целом, состав можно получать посредством единообразного и/или тщательного приведения активной молекулы в связь с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или обоими, и затем, в случае необходимости, придания продукту формы желаемых составов.

Вводимое количество молекулы TriKE может варьировать в зависимости от различных факторов, включая в качестве неограничивающих примеров, конкретную используемую молекулу TriKE, массу, физическое состояние и/или возраст субъекта и/или путь введения. Таким образом, абсолютная масса молекулы TriKE, входящей в заданную стандартную дозированную форму, может широко варьировать и зависит от таких факторов, как биологический вид, возраст, масса и физическое состояние субъекта и/или способ введения. Соответственно, не практично в целом задавать количество, которое составляет количество молекулы TriKE, эффективное для всех возможных применений. Однако средние специалисты в данной области могут без труда определять подходящее количество с учетом таких факторов.

В некоторых вариантах осуществления способ может включать введение достаточной молекулы TriKE для того, чтобы предоставлять субъекту дозу, например, приблизительно от 100 нг/кг приблизительно до 50 мг/кг, несмотря на то, что в некоторых вариантах осуществления способы можно осуществлять посредством введения молекулы TriKE в дозе за пределами этого диапазона. В некоторых из этих вариантов осуществления способ включает введение достаточной молекулы TriKE, чтобы предоставлять субъекту дозу приблизительно от 10 мкг/кг приблизительно до 5 мг/кг, например, дозу приблизительно от 100 мкг/кг приблизительно до 1 мг/кг.

Альтернативно, дозу можно вычислять с использованием фактической массы тела, получаемой прямо перед началом курса лечения. Для доз, вычисляемых таким образом, площадь поверхности тела (м²) вычисляют перед началом курса лечения с использованием способа Дюбуа: м²=(масса, кг^0,425 × рос, см^0,725) × 0,007184.

В некоторых вариантах осуществления способ может включать введение достаточной молекулы TriKE для предоставления дозы, например, приблизительно от 0,01 мг/м² приблизительно до 10 мг/м².

В некоторых вариантах осуществления молекулу TriKE можно вводить, например, от однократной дозы до нескольких доз в неделю, хотя в некоторых вариантах осуществления способ можно осуществлять посредством введения молекулы TriKE с частотой вне этого диапазона. В определенных вариантах осуществления молекулу TriKE можно вводить приблизительно от одного раза в месяц приблизительно до пяти раз в неделю.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение одного или более дополнительных терапевтических средств. Одно или более дополнительных терапевтических средств можно вводить до, после и/или совместно со введением молекулы TriKE. Молекулу TriKE и дополнительные терапевтические средства можно вводить совместно. Как используют в настоящем описании, «совместно вводимые» относится к двум или больше компонентам комбинации, вводимой с тем, чтобы терапевтические или профилактические эффекты комбинации могли быть больше терапевтических или профилактических эффектов любого компонента, вводимого отдельно. Два компонента можно вводить совместно одновременно или последовательно. Одновременно совместно вводимые компоненты можно предоставлять в одной или более фармацевтических композициях. Последовательное совместное введение двух или больше компонентов включает случаи, в которых компоненты вводят с тем, чтобы каждый компонент мог присутствовать в месте лечения в одно и то же время. Альтернативно, последовательное совместное введение двух компонентов может включать случаи, в которых по меньшей мере один компонент выведен из места лечения, но по меньшей мере один клеточный эффект от введения компонента (например, продуцирование цитокинов, активация определенной популяции клеток и т.д.) сохраняется в месте лечения до введения одного или более дополнительных компонентов в место лечения. Таким образом, совместно вводимая комбинация, в определенных обстоятельствах, может содержать компоненты, которые никогда не существуют в химической смеси друг с другом. В других вариантах осуществления молекулу TriKE и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в качестве части смеси или коктейля. В некоторых аспектах, введение молекулы TriKE может допускать эффективность более низкой дозы других терапевтических модальностей по сравнению с введением другого терапевтического средства или средств отдельно, тем самым снижая вероятность, тяжесть и/или степень токсичности, наблюдаемой при введении более высокой дозы другого терапевтического средства или средств.

Дополнительные образцовые терапевтические средства включают алтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, коласпазу, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитофосфан, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, фторурацил, флударабин, фотемустин, ганцикловир, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митомицин C, нимустин, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, прокарбазин, ралтитрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, тиотепу, топотекан, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

В некоторых вариантах осуществления способ может включать введение достаточной молекулы TriKE, как раскрыто в настоящем описании, и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, которые демонстрируют терапевтический синергизм. В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению, измерение ответа на лечение, наблюдаемого после введения как молекулы TriKE, как раскрыто в настоящем описании, так и дополнительного терапевтического средства, улучшено относительно того же измерения ответа на лечение, наблюдаемого после отдельного введения или молекулы TriKE или дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может включать дополнительное средство, которое направлено на EpCAM, включая, например, EpCAM-специфическое моноклональное антитело, такое как, например, катумаксомаб, моноклональное гибридное антитело, направленное на EpCAM и CD3.

В предшествующем описании и последующей формуле изобретения термин «и/или» обозначает один или все из перечисленных элементов или комбинацию из любых двух или больше из перечисленных элементов; термины «содержит», «содержащий» и их вариации следует толковать в качестве открытых, т. е. дополнительные элементы или стадии возможны и могут присутствовать или не присутствовать; если не указано иное, взаимозаменяемо используют форму единственного числа и «по меньшей мере один», которые обозначают один или больше чем один; и изложения числовых диапазонов с помощью конечных точек включают все числа, включенные в этот диапазон (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и т. д.).

В предшествующем описании конкретные варианты осуществления могут быть описаны изолированно для прозрачности. Пока в иных случаях в явной форме не определено точно, что признаки конкретного варианта осуществления несовместимы с признаками другого варианта осуществления, определенные варианты осуществления могут включать комбинацию совместимых признаков, описанных в настоящем описании, в связи с одним или более вариантами осуществления.

Для любого способа, раскрытого в настоящем описании, который включает отдельные стадии, стадии можно осуществлять в любом возможном порядке. И, в зависимости от ситуации, любую комбинацию двух или больше стадий можно осуществлять одновременно.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и процедуры следует интерпретировать широко в соответствии с объемом и сущностью изобретения, как указано в настоящем описании.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Выделение клеток, пациенты и образцы

PBMC от нормальных доноров одного возраста выделяли из крови взрослых, полученной из Memorial Blood Center (Minneapolis, MN). посредством центрифугирования с использованием градиента Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и криосохраняли. Для исследования образца пациента после трансплантации использовали образцы аллогенных гематопоэтических клеточных трансплантатов совпадающих доноров-сибсов из банка тканей для иммуновосстановительной терапии. PBMC реципиентов собирали в сутки 100 [n=5] или раньше (сутки 20-44) [n=5] после трансплантации и криосохраняли для будущего использования. Все образцы получали после информированного согласия, используя руководства, одобренные Committee on the Use of Human Subjects in Research в University of Minnesota в соответствии с Хельсинской декларацией.

Клеточные линии

HL-60, CD33+ клеточную линию острого промиелоцитарного лейкоза человека (ATCC, Manassas, VA), культивировали в среде Искова (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавлением 20% FBS (Gibco-Invitrogen) и 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (Invitrogen, Carlsbad, CA) при 37°C и 5% CO₂. Контрольную клеточную линию карциномы толстой кишки человека HT-29 (ATCC) культивировали при 37°C с 5% CO₂ в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высокой глюкозой (Invitrogen, Carlsbad, CA) и добавлением 10% FBS и 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина.

Конструирование, экспрессия и очистка BiKE и TriKE

Гибридный полинуклеотид, кодирующий 161533 (SEQ ID № 1), синтезировали с использованием способов перетасовки ДНК и лигирования ДНК (Vallera et al., 2013 Cancer Biother Radiopharm 4:274-482; Vallera et al., 2009. Leuk Res 33(9):1233-1242). Кодирующие области для V_L и V_H каждого scFv соединяли с помощью фрагмента, кодирующего линкер G4S. В его конечной конфигурации полинуклеотид 161533 NcoI/XhoI имеет инициирующий кодон, за которым сначала следуют кодирующие области для scFv против CD16 человека (McCall et al., 1999. Mol Immunol. 7:433-445), фланкирующий полипептид в 20 аминокислот (PSGQAGAAASESLFVSNHAY; SEQ ID № 3), IL-15N72D человека, фланкирующий полипептид в 7 аминокислот (EASGGPE; SEQ ID № 4) и затем scFv против CD33. Полинуклеотид сплайсировали в экспрессирующий вектор pET28c и экспрессировали тельца включения. Анализ секвенирования ДНК (Biomedical Genomics Center, University of Minnesota) использовали для того, чтобы верифицировать, что полинуклеотид имел правильную последовательность и клонирован с сохранением рамки считывания.

Те же компоненты использовали для конструирования гибридного полинуклеотида, кодирующего 163315 (SEQ ID № 7), за исключением того, что порядок компонентов представлял собой CD16scFv, фланкирующий полипептид PSGQAGAAASESLFVSNHAY (SEQ ID № 3), scFv против CD33, фланкирующий полипептид EASGGPE (SEQ ID № 4), затем IL-15 человека.

Плазмидой трансформировали штамм BL21(DE3) Escherichia coli (EMD, Madison WI). Бактерии выращивали в 600 мл бульона Лурии с добавлением 100 мкг/мл канамицина в 2 л колбе при 37°C и встряхивании. Экспрессию гибридного полинуклеотида индуцировали посредством добавления изопропил-b-D-тиогалактопиранозида (IPTG, FisherBiotech Fair Lawn, NJ). Через два часа после индукции, бактерии собирали центрифугированием. Клеточные осадки суспендировали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора Polytron. После обработки ультразвуком и центрифугирования, осадки экстрагировали с использованием 0,3% дезоксихолата натрия, 5% Triton X-100, 10% глицерина, 50 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, pH 8,0 и тщательно промывали тельца включения для того, чтобы удалять эндотоксин.

Осуществляли повторную укладку белков с использованием способа окисления N-лауроилсаркозина натрия (SLS) воздухом, модифицированного относительно ранее опубликованной процедуры для выделения scFv (Vallera et al., 2005. Leuk Res 29(3):331-341). Повторно уложенный 161533 очищали посредством FPLC ионообменной хроматографии (Q Sepharose Fast Flow, Sigma, St. Louis, MO) с использованием ступенчатого градиента от 0,2 M до 0,5 M NaCl в 20 мМ Tris-HCl, pH 9,0 в четырех объемах колонки.

Проточная цитометрия

Иммунофенотипирование клеток осуществляли с использованием следующих флуоресцентно-меченных моноклональных антител (mAb) против: PE-Cy7-конъюгированного CD56 (HCD56; BioLegend, Inc., San Diego, CA), ECD/PE-CF594-конъюгированного CD3 (UCHT1; Beckman Coulter, Brea, CA), APC-Cy7-конъюгированного CD16 (3G8; BioLegend, Inc.), Pacific Blue-конъюгированного CD45 (HI30; BioLegend, Inc.), PerCP-Cy5.5/FITC-конъюгированного против CD107a человека (LAMP-1) (H4A3; BioLegend, Inc.), Pacific Blue/BV421-конъюгированного против IFN-γ человека (4S.B3; BioLegend, Inc.), FITC/Alexa Fluor 647-конъюгированного TNF-α (MAb11; BioLegend, Inc.), FITC/PE-конъюгированного CD33 (P67,6; BD Biosciences) и APC-конъюгированного CD45 (HI30; BioLegend, Inc.), FITC-конъюгированного EpCAM; (BioLegend, Inc.). Регистрацию фенотипа клеток осуществляли на LSRII (BD Biosciences) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR).

Функциональный проточный анализ CD107a и IFNγ/TNFα

PBMC пациента после трансплантации или первичные AML бласты оттаивали и помещали в RPMI-10 в течение ночи. Следующей ночью PBMC инкубировали с 50 нМ 1633 BiKE или 161533 TriKE. На следующее утро промывали клетки и добавляли другой раунд 50 нМ 1633 BiKE или 161533 TriKE, чтобы учесть любые возможные проблемы с интернализацией молекул. Сразу после этого добавляли мишени HL-60 или первичные AML бласты для того, чтобы создавать соотношение эффекторов и мишеней 5:1. PBMC, мишени HL-60 или первичные AML бласты и молекулы BiKE или TriKE совместно культивировали в течение 4 ч и оценивали экспрессию CD107a и внутриклеточное продуцирование IFN-γ и TNF-α, как описано ранее (Vallera et al., 2013 Cancer Biother Radiopharm 4:274-282).

Анализ пролиферации

PBMC от пациентов после трансплантации (сутки 100 или раньше [сутки 20-44]) метили с использованием CELLTRACE Violet Cell Proliferation Dye (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), по протоколу производителя, помещали в культуральную среду с клетками мишенями HL-60 при соотношении (E:T) 5:1 и обрабатывали с использованием 50 нМ 1633 BiKE или 161533 TriKE. Затем через 7 суток клетки собирали и анализировали на жизнеспособность, через окрашивание Live/Dead, и пролиферацию, через разведение CELLTRACE, в популяции NK клеток (CD56+CD3-).

Анализ цитотоксичности с высвобождением хрома-51

Цитотоксичность оценивали посредством анализа высвобождения ⁵¹Cr в течение 4 ч. В кратком изложении, покоящиеся PBMC от нормальных доноров, которые обрабатывали с использованием 1633 BiKE (10 мкг/мл), контрольного реактива scFvCD16 (10 мкг/мл) или без реактива, совместно культивировали в течение 4 ч с меченными ⁵¹Cr или HL-60 мишенями при различных соотношениях E:T. Для исследования после трансплантации, клетки PBMC находились с мишенями HL-60 в соотношении (E:T) 20:1 в присутствии 50 нМ 1633 BiKE или 50 нМ 161533 TriKE. Высвобождение ⁵¹Cr измеряли с помощью гамма-сцинтилляционного счетчика (Perkin Elmer, Walthman, MA) и определяли специфический лизис мишеней (Vallera et al., 2013. Cancer Biother Radiopharm 4:274-282).

Исследование и визуализация мышей in vivo

Мышей NSG (n=5/группа) кондиционировали с использованием 275 сГр и инъецировали им IV 0,75×10⁵ HL-60-luc S4, пересеянных для инвазивности опухоли. Лечение лекарственным средством начинали в сутки 3. Один курс лечения состоял из интраперитонеальной (IP) инъекции 20 мкг лекарственного средства, которую давали каждые сутки в течение недели (MTWThF), и мышей лечили в течение трех недель. Контрольная группа не получала NK клетки, тогда как группы 1633 BiKE и 161533 TriKE получали 1×10⁶ NK клеток, подсчитанных в CD3/CD19 магнитно обедненном продукте, через 3 суток после инъекции клеток HL-60-luc. Клетки HL-60-luc содержат репортер люциферазы, который делает возможной визуализацию мышей каждую неделю для того, чтобы определять их биолюминесцентную активность и осуществлять мониторинг прогрессирования злокачественной опухоли лейкоза, как описано ранее (Waldron et al., 2011. Mol Cancer Ther 10(10):1829-1838.). В кратком изложении, мышам инъецировали 100 мкл 30 мг/мл субстрата люциферина за 10 минут до визуализации и затем вводили анестезию через ингаляцию газообразного изофлурана. Затем мышей визуализировали с использованием системы визуализации Xenogen Ivis 100 и анализировали с использованием программного обеспечения Living Image 2.5 (Xenogen Corporation, Hopkington MA). В сутки 20 у всех животных брали кровь и осуществляли двухминутную экспозицию и для областей, представляющих интерес (ROI), выражали в единицах фотоны/с/см²/ср. Кровь анализировали посредством проточной цитометрии на присутствие CD45+CD56+CD3- NK клеток человека. Второй эксперимент осуществляли для того, чтобы верифицировать воспроизводимость данных.

Статистический анализ

Сгруппированные данные выражали в виде среднего±стандартная ошибка среднего (SEM). Различия между двумя группами анализировали с помощью критерия Стьюдента. Множество сравнений анализировали с помощью парного однофакторного дисперсионного анализа с коррекцией Тьюки. Анализ осуществляли в программном обеспечении Graphpad Prism.

Пример 2

Конструкция 1615EpCAM TriKE

Синтез и сборку гибридного полинуклеотида, кодирующего 1615EpCAM TriKE (SEQ ID № 8), осуществляли с использованием способов перетасовки и лигирования ДНК. Полностью собранный полинуклеотид 1615EpCAM имеет, от 5'-конца к 3'-концу, участок рестрикции NcoI; инициирующий кодон ATG; кодирующие области, которые кодируют области V_H и V_L из CD16 человека (NM3E2), полученные из библиотеки фагового дисплея, полученной McCall et al. (Mol Immunol., 1999, 36:433-445), сегмент в 20 аминокислот (PSGQAGAAASESLFVSNHAY; SEQ ID № 3), модифицированный IL-15N72D, линкер в 7 аминокислот (EASGGPE; SEQ ID № 4) и гуманизированный scFv против EpCAM из антитела MOC-31; и, наконец, участок рестрикции XhoI. Получаемый NcoI/XhoI полинуклеотид 1914 п. о. сплайсировали в экспрессирующий вектор pET21c под контролем T7 промотора, индуцибельного изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG). Анализ секвенирования ДНК (Biomedical Genomics Center, University of Minnesota, MN, USA) использовали для того, чтобы верифицировать, что полинуклеотид имел правильную последовательность и клонирован с сохранением рамки считывания. Другие конструкции, использованные в этом исследовании, создавали схожим образом, но они содержали кодирующие области для моноспецифического scFv против CD16 и scFv против EpCAM.

Выделение телец включения

Бактериальную экспрессию белка осуществляли с использованием штамма BL21 (DE3) Escherichia coli (Novagen, Madison, WI, USA) посредством трансформации плазмидой. После культивирования в течение ночи, бактерии выращивали в 800 мл бульона Лурии, содержащего 50 мг/мл канамицина. Индукция экспрессии гена происходила, когда среды для культивирования достигали оптической плотности (OD) 600, равной 0,65, при добавлении IPTG (FischerBiotech, Fair Lawn, NJ, USA). Через 2 часа после индукции бактерии собирали (из 5 л культуральных сред выделяли 43 г бактериального осадка). Затем осадок гомогенизировали в буферном растворе (50 мМ Tris, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA pH 8,0), обрабатывали звуком и центрифугировали. Осадки экстрагировали с использованием 0,3% дезоксихолата натрия, 5% Triton X-100, 10% глицерина, 50 ммоль/л Tris, 50 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л EDTA (pH 8,0) и промывали (конечная масса осадка: 12,5 г).

Повторная укладка и очистка

Повторную укладку и очистку осуществляли, как описано ранее (Schmohl et al., 2016. Target Oncol. 11(3):353-361). В кратком изложении, для повторной укладки белки из телец включения (IB) растворяли в 20:1 (мг влажной массы/мл) в буфере для солюбилизации (7 M гуанидингидрохлорид, 50 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA и 50 мМ DTT, pH 8,0). После 1 ч инкубации при 37°C осадки удаляли посредством центрифугирования. Супернатант разводили (20-кратно) с использованием буфера для повторной укладки (50 мМ Tris-HCl, 50 мМ NaCl, 0,8 мМ L-аргинин, 20% глицерин, 5 мМ EDTA и 1 мМ GSSG, pH 8,0) при 4°C на двое суток. Буфер удаляли посредством 10-кратного диализа против 20 мМ Tris-HCl, pH 9,0 в 20 мМ Tris-HCl, pH 9,0 в четырех объемах колонки. Анализ SDS-PAGE осуществляли для того, чтобы оценивать чистоту. Слитые белки окрашивали с использованием SimplyBlue LifeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). Размер TriKE составлял приблизительно 68860 Да.

Выделение и очистка NK клеток

Градиент Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и пробирки SEPMATE (Stemcell Technologies, Inc., Vancouver, Canada) использовали для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из крови взрослых (Memorial Blood Center, Minneapolis, MN, USA) здоровых добровольцев и для получения обогащенных NK клеток через негативный отбор с использованием магнитных бус по протоколу производителя (Stemcell Technologies, Inc., Vancouver, Canada). Образцы получали после информированного согласия и в соответствии с University of Minnesota human subjects Institutional Review Board и Хельсинской декларацией.

Тканевая культура

Из American Type Culture Collection получали следующие клеточные линии: клеточные линии злокачественной опухоли молочной железы BT-474, SK-BR-3; клеточные линии злокачественной опухоли предстательной железы PC-3, DU145; клеточные линии злокачественных опухолей головы и шеи UMSCC-11B, NA; клеточная линия злокачественной опухоли яичников SKOV-1; клеточная линия карциномы ободочной кишки HT-29; клеточная линия злокачественной опухоли легких Calu-3; клеточная линия лимфомы Беркитта Daudi; клеточная линия острого миелолейкоза HL-60; клеточная линия глиобластомы человека U87. Клеточные линии карциномы и глиобластомы выращивали в монослоях с использованием тканевых колб (Fogh et al., 1977. J Natl Cancer Inst 59:221-226), клеточные линии HL-60 и Daudi (Klein et al., 1968. Cancer Res 28:1300-1310) выращивали в суспензии. Клетки поддерживали в RPMI 1640 (BT-474, SK-BR-3, PC-3, DU-145, HT-29, Daudi, HL60, Calu-3), DMEM (UMSCC-11B, NA, SK-OV-3, U87) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 ммоль/л L-глутамина. В дополнение к предшествующим добавкам, среды BT-474 содержали 10 МЕ/мл инсулина. Клетки инкубировали в увлажненной постоянной 37C° атмосфере, содержащей 5% CO₂. Когда клетки достигали 90% конфлюентности, их пассировали с использованием трипсин-EDTA для открепления. Подсчет клеток осуществляли с использованием стандартного гемоцитометра. Для экспериментов использовали только клетки с жизнеспособностью >95%, как определяли по исключению трипанового синего.

Анализ связывания/блокирования

Для того чтобы оценивать связывание, 4×10⁵ соответствующих клеток злокачественной опухоли (BT-474, PC-3, UMSCC-11B, Calu-3, Daudi, U87) промывали и инкубировали при 4°C с 10 нМ меченного флуоресцеинизотиоциатом (FITC) scFv против EpCAM в течение 30 минут. Для анализа блокирования 200 нМ меченного FITC 1615EpCAM TriKE добавляли в 500 нМ scFv против EpCAM или конструкции scFv против CD22-CD19 и инкубировали в течение 30 минут при 4°C с клетками карциномы ободочной кишки HT-29. После промывания интенсивность окрашивания оценивали с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Анализ CD107a дегрануляции

Анализ проточной цитометрии с измерением цитолитической дегрануляции через экспрессию CD107a и присутствие IFN-γ осуществляли, как сообщалось ранее (Gleason et al., 2012. Mol Cancer Ther 11:2674-2684). PBMC инкубировали в течение ночи (37°C, 5% CO₂) в RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и с рекомбинантным IL-12 10 нг/мл (PeproTech, Rocky Hill, NJ) и IL-18 100 нг/мл (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) в качестве положительного контроля. Клетки промывали в 1× PBS, обрабатывали с использованием 30 нМ 1615EpCAM TriKE или других лекарственных средств и инкубировали в течение 10 минут при 37°C с 5% CO₂. Добавляли FITC-конъюгированное моноклональное антитело против CD107a человека (mAb) (LAMP-1) (BD Biosciences, San Jose, CA) и дополнительно инкубировали в течение одного часа с соответствующими клетками-мишенями (BT-474, SK-BR-3, PC-3, DU-145, HT-29, HL60, UMSCC-11B, NA, SK-OV-3). Добавляли GolgiStop (1:1500) (BD Biosciences, San Jose, CA) и GolgiPlug (1:1000) (BD Biosciences, San Jose, CA) и клетки дополнительно инкубировали в течение трех часов. Клетки промывали в 1× PBS и окрашивали PE/Cy7-конъюгированным mAb против CD56, APC/Cy7-конъюгированным mAb против CD16 и PE-CF594-конъюгированным mAb против CD3 (BioLegend, Inc., San Diego, CA), инкубировали в течение 15 минут и затем фиксировали в 2% параформальдегиде. Затем клетки подготавливали для внутриклеточного окрашивания с использованием пермеабилизационного буфера (BD Biosciences, San Jose, CA). Клетки инкубировали с Pacific Blue-конъюгированным средством против IFN-γ человека (BioLegend, Inc., San Diego, CA) в течение 20 минут, промывали и оценивали посредством FACS анализа с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA). Для компенсации CompBead Plus Anti-Mouse Ig использовали частицы κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7,5 мкм) (BD Biosciences, San Jose, CA).

Анализ цитотоксичности с высвобождением хрома-51

Клетки-мишени HT-29 метили в течение 1 часа с использованием 1 мкКи ⁵¹Cr на 1×10⁵ клеток-мишеней при 37°C, 5% CO₂. Процедуры промывания осуществляли для того, чтобы удалять избыток ⁵¹Cr. Меченные клетки-мишени добавляли в лунки 96-луночных круглодонных планшетов (5×10³ клеток). В планшеты добавляли покоящиеся эффекторные NK клетки, обработанные с использованием 1615EpCAM TriKE, EpCAM16 BiKE или отрицательных контролей. Соотношение E:T находилось в диапазоне между 20:1 и 0,08:1. Количество высвобожденного ⁵¹Cr, которое соответствует гибели клеток-мишеней, измеряли с помощью гамма-сцинтилляционного счетчика, и процент лизиса клеток-мишеней вычисляли следующим образом: [(экспериментальный лизис - самопроизвольный лизис)/(максимальный лизис - самопроизвольный лизис)] × 100. Для того чтобы определять максимальный лизис, меченные ⁵¹Cr клетки-мишени обрабатывали с использованием 3% Triton X в течение 4 ч.

Luminex

Для анализа хемокинов и цитокинов, очищенные NK клетки от 6 здоровых добровольцев совместно инкубировали в 96-луночных планшетах в течение 24 часов с клетками карциномы ободочной кишки HT-29 при соотношении E:T 2:1 и соответствующим лекарственным средством в концентрации 50 нМ при 37°C, 5% CO₂. После 24 ч времени инкубации, центрифугировали клетки и собирали супернатанты, которые хранили при -80°C до анализа. GM-CSF, IL-6, IL-8 и TNF-α (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) определяли с использованием системы Luminex (MAGPIX, Luminex, Austin, TX). Значения, представленные в пг/мл, интерполировали по калибровочным кривым рекомбинантных белков человека с использованием программного обеспечения Xponent 4.2 (Luminex, Austin, TX).

Анализы пролиферации и жизнеспособности

PBMC или обогащенные NK клетки от здоровых доноров метили с использованием CELLTRACE Violet Cell Proliferation Dye (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) в соответствии с протоколом производителя. После мечения, клетки культивировали с соответствующими лекарственными средствами в концентрациях 50 нМ. Клетки собирали после 7 суток, окрашивали на жизнеспособность с использованием реактива Live/Dead (Invitrogen, Carlsbad, CA) и окрашивали поверхность на средство против CD56 PE/Cy7 (BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA) и против CD3 PE-CF594 (BD Biosciences, San Jose, CA), чтобы определять жизнеспособную CD3-CD56+ субпопуляцию. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo версии 7.6.5. (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA).

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего±стандартное отклонение. Различия между двумя группами анализировали с помощью критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа. Анализ и представление данных выполняли с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Пример 3

Конструкция EF91(средство ламы против IL16 человека)-IL15-CD33

Синтез и сборку гибридного полинуклеотида, кодирующего TriKE EF91(средство ламы против IL16 человека)-IL15-CD33 (SEQ ID № 14) осуществляли с использованием способов перетасовки и лигирования ДНК. Полностью собранный полинуклеотид имеет, от 5'-конца к 3'-концу, участок рестрикции NcoI; инициирующий кодон ATG; кодирующие области, которые кодируют области V_H и V_L из EF91 (средство ламы против IL16 человека), сегмент в 20 аминокислот (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; аминокислоты 142-161 SEQ ID № 14), модифицированный IL-15, линкер в 18 аминокислот (GSTSGSGKPGSGEGSTKG; аминокислоты 277-294) и гуманизированный scFv против CD33; и, наконец, участок рестрикции XhoI. Получаемый NcoI/XhoI полинуклеотид сплайсировали в экспрессирующий вектор pET21d под управлением индуцибельного изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) T7 промотора.

Пример 4

Конструкция 1615 против HIV

Поскольку 1615x представляет собой платформенную технологию, также возможно использовать scFv против вирусов, которые связаны или не связаны с развитием злокачественных опухолей. Синтез и сборку гибридного полинуклеотида, кодирующего TriKE 1615 против HIV (SEQ ID № 19) осуществляли с использованием способов перетасовки и лигирования ДНК. Полностью собранный полинуклеотид имеет, от 5'-конца к 3'-концу, участок рестрикции NcoI; инициирующий кодон ATG; области V_H и V_L из scFv против CD16, сегмент в 20 аминокислот (PSGQAGAAASESLFVSNHAY; SEQ ID № 3), модифицированный IL-15, линкер в 7 аминокислот (EASGGPE; SEQ ID № 4) и scFv против HIV; и, наконец, участок рестрикции XhoI.

Полное раскрытие всех патентов, патентных заявок и публикаций, а также материалы, доступные в электронной форме, (включая, например, нуклеотидные последовательности, поданные, например, в GenBank и RefSeq, и аминокислотные последовательности, поданные, например, в SwissProt, PIR, PRF, PDB, и трансляции с аннотированных кодирующих областей в GenBank и RefSeq), цитируемые в настоящем описании, включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме. В том случае, если имеет место любое противоречие между раскрытием настоящей заявки и раскрытием(ями) любого документа, включенного в настоящее описание посредством ссылки, раскрытие настоящей заявки имеет определяющее значение. Вышеуказанное подробное описание и примеры приведены лишь для прозрачности понимания. Не следует понимать их как излишние ограничения. Изобретение не ограничено конкретными подробностями, которые представлены и описаны, в отношении вариаций, очевидных специалисту в данной области, которые включены в изобретение, которое определено формулой изобретения.

Если не указано иное, все числа, выражающие количества компонентов, молекулярные массы и так далее, используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, приведенные в описании и формуле изобретения, представляют собой приближения, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, которые стремятся получить с помощью настоящего изобретения. Как минимум, и не в качестве попытки ограничить принцип эквивалентов объемом формулы изобретения, каждый числовой параметр следует по меньшей мере толковать в свете числа приведенных значимых цифр и с применением обычных способов округления.

Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, в которых изложен широкий объем изобретения, представляют собой приближения, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, приведены настолько точно, насколько возможно. Однако все числовые значения неотъемлемо включают определенный диапазон, являющийся неизбежным результатом стандартного отклонения, которое находят при соответствующих им тестовых измерениях.

Все заголовки приведены для удобства читателя, и их не следует использовать для ограничения значения текста, который следует за заголовком, пока иное не определено конкретно.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПРОИЗВОЛЬНЫМ ТЕКСТОМ

SEQ ID № 1

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EQVQLVQSGA EVKKPGSSVK VSCKASGYTF TDYNMHWVRQ APGQGLEWIG YIYPYNGGTG YNQKFKSKAT ITADESTNTA YMELSSLRSE DTAVYYCARG RPAMDYWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASES VDNYGISFMN WFQQKPGKAP KLLIYAASNQ GSGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPDDFA TYYCQQSKEV PWTFGQGTKV EIK

SEQ ID № 2

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWIGY IYPYNGGTGY NQKFKSKATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAVYYCARGR PAMDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASESV DNYGISFMNW FQQKPGKAPK LLIYAASNQG SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPDDFAT YYCQQSKEVP WTFGQGTKVE IK

SEQ ID № 3

PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY

SEQ ID № 4

EASGGPE

SEQ ID № 5

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSQVQLVQ SGAEVKKPGS SVKVSCKASG YTFTDYNMHW VRQAPGQGLE WIGYIYPYNG GTGYNQKFKS KATITADEST NTAYMELSSL RSEDTAVYYC ARGRPAMDYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SESVDNYGIS FMNWFQQKPG KAPKLLIYAA SNQGSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPD DFATYYCQQS KEVPWTFGQG TKVEIK

SEQ ID № 6

MENWVNVISD LKKIEDLIQS MHIDATLYTE SDVHPSCKVT AMKCFLLELQ VISLESGDAS IHDTVENLII LANDSLSSNG NVTESGCKEC EELEEKNIKE FLQSFVHIVQ MFINTSPSGQ AGAAASESLF VSNHAYEVQL VESGGGVVRP GGSLRLSCAA SGFTFDDYGM SWVRQAPGKG LEWVSGINWN GGSTGYADSV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARGRSLLF DYWGQGTLVT VSRGGGGSGG GGSGGGGSSE LTQDPAVSVA LGQTVRITCQ GDSLRSYYAS WYQQKPGQAP VLVIYGKNNR PSGIPDRFSG SSSGNTASLT ITGAQAEDEA DYYCNSRDSS GNHVVFGGGT KLTVLEASGG PEQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGYT FTDYNMHWVR QAPGQGLEWI GYIYPYNGGT GYNQKFKSKA TITADESTNT AYMELSSLRS EDTAVYYCAR GRPAMDYWGQ GTLVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCRASE SVDNYGISFM NWFQQKPGKA PKLLIYAASN QGSGVPSRFS GSGSGTDFTL TISSLQPDDF ATYYCQQSKE VPWTFGQGTK VEIK

SEQ ID № 7

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWIGY IYPYNGGTGY NQKFKSKATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAVYYCARGR PAMDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASESV DNYGISFMNW FQQKPGKAPK LLIYAASNQG SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPDDFAT YYCQQSKEVP WTFGQGTKVE IKEASGGPEN WVNVISDLKK IEDLIQSMHI DATLYTESDV HPSCKVTAMK CFLLELQVIS LESGDASIHD TVENLIILAN DSLSSNGNVT ESGCKECEEL EEKNIKEFLQ SFVHIVQMFI NTS

SEQ ID № 8

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRSTKSL LHSNGITYLY WYQQKPGKAP KLLIYQMSNL ASGVPSRFSS SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCAQNLEI PRTFGQGTKV ELKRATPSHN SHQVPSAGGP TANSGTSGEV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVKQAPG KGLEWMGWIN TYTGESTYAD SFKGRFTFSL DTSASAAYLQ INSLRAEDTA VYYCARFAIK GDYWGQGTLL TVSS

SEQ ID № 9

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRSTKSL LHSNGITYLY WYQQKPGKAP KLLIYQMSNL ASGVPSRFSS SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCAQNLEI PRTFGQGTKV ELKRATPSHN SHQVPSAGGP TANSGTSGEV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVKQAPG KGLEWMGWIN TYTGESTYAD SFKGRFTFSL DTSASAAYLQ INSLRAEDTA VYYCARFAIK GDYWGQGTLL TVSSEPKSSD KTHTSPPSPD IVLSQSPAIM SASPGEKVTI SCSASSSVSY MYWYQQKPGS SPKPWIYRTS NLASGVPARF SGSGSGTSYS LTISSMEAED AATYYCQQYH SYPPTFGAGT KLELKSSGGG GSGGGGGGSS RSSLEVKLVE SGPELKKPGE TVKISCKASG YTFTDYSMHW VNQAPGKGLK WMGWINTETG EPSYADDFKG RFAFSLETSA STAYLQINNL KNEDTATYFC ATDYGDYFDY WGQGTTLTVS SAKTTPPSVT S

SEQ ID № 10

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EDIVLSQSPA IMSASPGEKV TISCSASSSV SYMYWYQQKP GSSPKPWIYR TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ YHSYPPTFGA GTKLELKSSG GGGSGGGGGG SSRSSLEVKL VESGPELKKP GETVKISCKA SGYTFTDYSM HWVNQAPGKG LKWMGWINTE TGEPSYADDF KGRFAFSLET SASTAYLQIN NLKNEDTATY FCATDYGDYF DYWGQGTTLT VSS

SEQ ID № 11

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EQVQLVQSGA EVKKPGASVK VSCKASGYSF TGYTMNWVRQ APGQGLEWMG LITPYNGASS YNQKFRGKAT MTVDTSTSTV YMELSSLRSE DTAVYYCARG GYDGRGFDYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS SGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCSA SSSVSYMHWY QQKSGKAPKL LIYDTSKLAS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQWSKHPL TFGQGTKLEI K

SEQ ID № 12

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL EPKSSDKTHT SPPSPNWVNV ISDLKKIEDL IQSMHIDATL YTESDVHPSC KVTAMKCFLL ELQVISLESG DASIHDTVEN LIILANDSLS SNGNVTESGC KECEELEEKN IKEFLQSFVH IVQMFINTSP SGQAGAAASE SLFVSNHAYD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRSTKSLLH SNGITYLYWY QQKPGKAPKL LIYQMSNLAS GVPSRFSSSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCAQNLEIPR TFGQGTKVEL KRATPSHNSH QVPSAGGPTA NSGTSGEASG GPEDIQMTQT TSSLSASLGD RVTISCRASQ DISNYLNWYQ QKPDGTVKLL IYYTSILHSG VPSRFSGSGS GTDYSLTISN LEQEDFATYF CQQGNTLPWT FGGGTKLEIK GSTSGSGKPG SGEGSTKGEV QLVESGGGLV KPGGSLKLSC AASGFAFSIY DMSWVRQTPE KRLEWVAYIS SGGGTTYYPD TVKGRFTISR DNAKNTLYLQ MSSLKSEDTA MYYCARHSGY GTHWGVLFAY WGQGTLVTVS AGGGGSDILL TQTPASLAVS LGQRATISCK ASQSVDYDGD SYLNWYQQIP GQPPKLLIYD ASNLVSGIPP RFSGSGSGTD FTLNIHPVEK VDAATYHCQQ STEDPWTFGG GTKLEIKRGS TSGSGKPGSG EGSTKGQVQL QQSGAELVRP GSSVKISCKA SGYAFSSYWM NWVKQRPGQG LEWIGQIWPG DGDTNYNGKF KGKATLTADE SSSTAYMQLS SLASEDSAVY FCARRETTTV GRYYYAMDYW GQGTSVTVSS

SEQ ID № 13

MDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQDI RNYLNWYQQK PDGTVKLLIY YTSRLHSGVP SKFSGSGSGT DYTLTISNLE QEDIATYFCQ QGNTLPWTFA GGTKLEIKRG GGGSGGGGSG GGGSGGREVQ LVQSGAELVK PGATMKISCK ASGYSFTGYT MNWVKQSHGK NLEWMGLINP YKGVSTYNQK FKDKATLTVD TSTDTAYMEL LSLTSEDSAV YYCARSGYYG DSDWYFDVWG AGTTVTVSSP SGQAGAAASE SLFVSNHAYP TSSSTKKTQL QLEHLLLDLQ MILNGINNYK NPKLTRMLTF KFYMPKKATE LKHLQCLEEE LKPLEEVLNL AQSKNFHLRP RDLISNINVI VLELKGSETT FMCEYADETA TIVEFLNRWI TFCQSIISTL TEASGGPEDI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRSTKSLLHS NGITYLYWYQ QKPGKAPKLL IYQMSNLASG VPSRFSSSGS GTDFTLTISS LQPEDFATYY CAQNLEIPRT FGQGTKVELK RATPSHNSHQ VPSAGGPTAN SGTSGEVQLV QSGPGLVQPG GSVRISCAAS GYTFTNYGMN WVKQAPGKGL EWMGWINTYT GESTYADSFK GRFTFSLDTS ASAAYLQINS LRAEDTAVYY CARFAIKGDY WGQGTLLTVS S

SEQ ID № 14

MKWVTFISLL FLFSSAYSQV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGLTFSSY NMGWFRQAPG QGLEAVASIT WSGRDTFYAD SVKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAANPWP VAAPRSGTYW GQGTLVTVSS SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SGNWVNVISD LKKIEDLIQS MHIDATLYTE SDVHPSCKVT AMKCFLLELQ VISLESGDAS IHDTVENLII LANNSLSSNG NVTESGCKEC EELEEKNIKE FLQSFVHIVQ MFINTSGSTS GSGKPGSGEG STKGQVQLVQ SGAEVKKPGS SVKVSCKASG YTFTDYNMHW VRQAPGQGLE WIGYIYPYNG GTGYNQKFKS KATITADEST NTAYMELSSL RSEDTAVYYC ARGRPAMDYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SESVDNYGIS FMNWFQQKPG KAPKLLIYAA SNQGSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPD DFATYYCQQS KEVPWTFGQG TKVEIKVDE

SEQ ID № 15

NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

SEQ ID № 16

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EAKVQLQESG PSLVQPSQRL SITCTVSGFS LISYGVHWVR QSPGKGLEWL GVIWRGGSTD YNAAFMSRLS ITKDNSKSQV FFKMNSLQAD DTAIYFCAKT LITTGYAMDY WGQGTTVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSDIEL TQSPSSFSVS LGDRVTITCK ASEDIYNRLA WYQQKPGNAP RLLISGATSL ETGVPSRFSG SGSGKDYTLS ITSLQTEDVA TYYCQQYWST PTFGGGTKLE IKR

SEQ ID № 17

MDIVLSQSPA IMSASPGEKV TISCSASSSV SYMYWYQQKP GSSPKPWIYR TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ YHSYPPTFGA GTKLELKSSG GGGSGGGGGG SSRSSLEVKL VESGPELKKP GETVKISCKA SGYTFTDYSM HWVNQAPGKG LKWMGWINTE TGEPSYADDF KGRFAFSLET SASTAYLQIN NLKNEDTATY FCATDYGDYF DYWGQGTTLT VSS

SEQ ID № 18

PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFCQSIIST LT

SEQ ID № 19

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARG RSLLFDYWGQ GTLVTVSRGG GGSGGGGSGG GGSSELTQDP AVSVALGQTV RITCQGDSLR SYYASWYQQK PGQAPVLVIY GKNNRPSGIP DRFSGSSSGN TASLTITGAQ AEDEADYYCN SRDSSGNHVV FGGGTKLTVL PSGQAGAAAS ESLFVSNHAY NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTSEASGGP EMGWSCIILF LVATATGVHS QVRLSQSGGQ MKKPGDSMRI SCRASGYEFI NCPINWIRLA PGKRPEWMGW MKPRHGAVSY ARQLQGRVTM TRDMYSETAF LELRSLTSDD TAVYFCTRGK YCTARDYYNW DFEHWGQGTP VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK

SEQ ID № 20

MKWVTFISLL FLFSSAYSQV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGLTFSSY NMGWFRQAPG QGLEAVASIT WSGRDTFYAD SVKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAANPWP VAAPRSGTYW GQGTLVTVSS

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA

Vallera, Daniel

Miller, Jeffrey

<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ

<130> 110.04990201

<150> US 62/237,835

<151> 2015-10-06

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 623

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 1

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gln Val Gln

370 375 380

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys

385 390 395 400

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His

405 410 415

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

420 425 430

Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys

435 440 445

Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu

450 455 460

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly

465 470 475 480

Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

485 490 495

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

500 505 510

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

515 520 525

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

530 535 540

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

545 550 555 560

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

565 570 575

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

580 585 590

Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

595 600 605

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

610 615 620

<210> 2

<211> 502

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 2

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

260 265 270

Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

290 295 300

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr

305 310 315 320

Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr

325 330 335

Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

340 345 350

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

385 390 395 400

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

405 410 415

Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln

420 425 430

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn

435 440 445

Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

450 455 460

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr

465 470 475 480

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly

485 490 495

Thr Lys Val Glu Ile Lys

500

<210> 3

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 3

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

1 5 10 15

Asn His Ala Tyr

20

<210> 4

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 4

Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu

1 5

<210> 5

<211> 596

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 5

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

245 250 255

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

260 265 270

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

275 280 285

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

290 295 300

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

305 310 315 320

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

325 330 335

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

340 345 350

Thr Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

355 360 365

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

370 375 380

Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

385 390 395 400

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln

405 410 415

Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr

420 425 430

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

435 440 445

Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

450 455 460

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

465 470 475 480

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

485 490 495

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu

500 505 510

Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys

515 520 525

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly

530 535 540

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

545 550 555 560

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

565 570 575

Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

580 585 590

Val Glu Ile Lys

595

<210> 6

<211> 624

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 6

Met Glu Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp

1 5 10 15

Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp

20 25 30

Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu

35 40 45

Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

50 55 60

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly

65 70 75 80

Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys

85 90 95

Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe

100 105 110

Ile Asn Thr Ser Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser

115 120 125

Leu Phe Val Ser Asn His Ala Tyr Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

145 150 155 160

Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

165 170 175

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly

180 185 190

Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe

225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr

260 265 270

Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr

275 280 285

Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln

290 295 300

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg

305 310 315 320

Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr

325 330 335

Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

340 345 350

Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly

355 360 365

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gln Val

370 375 380

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val

385 390 395 400

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met

405 410 415

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

420 425 430

Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser

435 440 445

Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu

450 455 460

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

465 470 475 480

Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

485 490 495

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

500 505 510

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

515 520 525

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn

530 535 540

Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

545 550 555 560

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro

565 570 575

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

580 585 590

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

595 600 605

Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

610 615 620

<210> 7

<211> 623

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 7

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

260 265 270

Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

290 295 300

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr

305 310 315 320

Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr

325 330 335

Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

340 345 350

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

385 390 395 400

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

405 410 415

Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln

420 425 430

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn

435 440 445

Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

450 455 460

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr

465 470 475 480

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly

485 490 495

Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Asn Trp Val

500 505 510

Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met

515 520 525

His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys

530 535 540

Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser

545 550 555 560

Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile

565 570 575

Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser

580 585 590

Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe

595 600 605

Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

610 615 620

<210> 8

<211> 634

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 8

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Asp Ile Gln

370 375 380

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

385 390 395 400

Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile

405 410 415

Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

420 425 430

Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

435 440 445

Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

450 455 460

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile

465 470 475 480

Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr

485 490 495

Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala

500 505 510

Asn Ser Gly Thr Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly

515 520 525

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly

530 535 540

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly

545 550 555 560

Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser

565 570 575

Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr

580 585 590

Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

595 600 605

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp

610 615 620

Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser

625 630

<210> 9

<211> 901

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 9

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Asp Ile Gln

370 375 380

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

385 390 395 400

Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile

405 410 415

Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

420 425 430

Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

435 440 445

Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

450 455 460

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile

465 470 475 480

Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr

485 490 495

Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala

500 505 510

Asn Ser Gly Thr Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly

515 520 525

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly

530 535 540

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly

545 550 555 560

Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser

565 570 575

Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr

580 585 590

Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

595 600 605

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp

610 615 620

Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp

625 630 635 640

Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser

645 650 655

Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys

660 665 670

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

675 680 685

Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

690 695 700

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

705 710 715 720

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

725 730 735

Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

740 745 750

Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

755 760 765

Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu

770 775 780

Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly

785 790 795 800

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly

805 810 815

Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro

820 825 830

Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr

835 840 845

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp

850 855 860

Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

865 870 875 880

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro

885 890 895

Pro Ser Val Thr Ser

900

<210> 10

<211> 623

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 10

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Asp Ile Val

370 375 380

Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val

385 390 395 400

Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr

405 410 415

Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Arg Thr Ser

420 425 430

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

435 440 445

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

450 455 460

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala

465 470 475 480

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

485 490 495

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val Lys Leu Val Glu

500 505 510

Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys

515 520 525

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn

530 535 540

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu

545 550 555 560

Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe

565 570 575

Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu

580 585 590

Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Tyr Gly Asp

595 600 605

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

610 615 620

<210> 11

<211> 621

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 11

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gln Val Gln

370 375 380

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

385 390 395 400

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn

405 410 415

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile

420 425 430

Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys

435 440 445

Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

450 455 460

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly

465 470 475 480

Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

485 490 495

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly

500 505 510

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

515 520 525

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val

530 535 540

Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu

545 550 555 560

Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

565 570 575

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

580 585 590

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His

595 600 605

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

610 615 620

<210> 12

<211> 1040

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 12

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Asn

245 250 255

Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln

260 265 270

Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro

275 280 285

Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val

290 295 300

Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn

305 310 315 320

Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr

325 330 335

Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys

340 345 350

Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr

355 360 365

Ser Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val

370 375 380

Ser Asn His Ala Tyr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

385 390 395 400

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys

405 410 415

Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln

420 425 430

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu

435 440 445

Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp

450 455 460

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr

485 490 495

Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val

500 505 510

Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Glu Ala

515 520 525

Ser Gly Gly Pro Glu Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

530 535 540

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

545 550 555 560

Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

565 570 575

Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro

580 585 590

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

595 600 605

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

610 615 620

Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

625 630 635 640

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

645 650 655

Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro

660 665 670

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser

675 680 685

Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu

690 695 700

Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp

705 710 715 720

Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

725 730 735

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr

740 745 750

Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Thr His Trp Gly Val Leu Phe

755 760 765

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly

770 775 780

Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser

785 790 795 800

Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp

805 810 815

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln

820 825 830

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile

835 840 845

Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn

850 855 860

Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln

865 870 875 880

Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

885 890 895

Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly

900 905 910

Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val

915 920 925

Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala

930 935 940

Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly

945 950 955 960

Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr

965 970 975

Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser

980 985 990

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala

995 1000 1005

Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr

1010 1015 1020

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

1025 1030 1035

Ser Ser

1040

<210> 13

<211> 661

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 13

Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn

20 25 30

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Thr

130 135 140

Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr

145 150 155 160

Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly

165 170 175

Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

180 185 190

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met

195 200 205

Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

225 230 235 240

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala

245 250 255

Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn His Ala Tyr Pro Thr Ser

260 265 270

Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp

275 280 285

Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu

290 295 300

Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu

305 310 315 320

Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu

325 330 335

Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp

340 345 350

Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu

355 360 365

Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu

370 375 380

Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu

385 390 395 400

Thr Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

405 410 415

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

420 425 430

Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp

435 440 445

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met

450 455 460

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser

465 470 475 480

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

485 490 495

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly

500 505 510

Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro Ser His Asn Ser

515 520 525

His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser

530 535 540

Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly

545 550 555 560

Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn

565 570 575

Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

580 585 590

Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser

595 600 605

Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala

610 615 620

Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

625 630 635 640

Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

645 650 655

Leu Thr Val Ser Ser

660

<210> 14

<211> 539

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 14

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Ala Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp

165 170 175

Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp

180 185 190

Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu

195 200 205

Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

210 215 220

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly

225 230 235 240

Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys

245 250 255

Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe

260 265 270

Ile Asn Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

275 280 285

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

290 295 300

Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

305 310 315 320

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

325 330 335

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr

340 345 350

Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu

355 360 365

Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

370 375 380

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp

385 390 395 400

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

405 410 415

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

420 425 430

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

435 440 445

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp

450 455 460

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

465 470 475 480

Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

485 490 495

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe

500 505 510

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly

515 520 525

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Val Asp Glu

530 535

<210> 15

<211> 114

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 15

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 16

<211> 623

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 16

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Ala Lys Val

370 375 380

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Ser Gln Arg Leu

385 390 395 400

Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Gly Val

405 410 415

His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val

420 425 430

Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg

435 440 445

Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met

450 455 460

Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Thr

465 470 475 480

Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

485 490 495

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

500 505 510

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser

515 520 525

Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp

530 535 540

Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro

545 550 555 560

Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser

565 570 575

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr

580 585 590

Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp

595 600 605

Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

610 615 620

<210> 17

<211> 243

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 17

Met Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

20 25 30

Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile

35 40 45

Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val

115 120 125

Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met

145 150 155 160

His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp

165 170 175

Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

195 200 205

Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr

210 215 220

Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 18

<211> 132

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 18

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 19

<211> 630

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 19

Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val

130 135 140

Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser

210 215 220

Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

245 250 255

Asn His Ala Tyr Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

260 265 270

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

275 280 285

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

305 310 315 320

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

325 330 335

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

340 345 350

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

355 360 365

Met Phe Ile Asn Thr Ser Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu Met Gly Trp

370 375 380

Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser

385 390 395 400

Gln Val Arg Leu Ser Gln Ser Gly Gly Gln Met Lys Lys Pro Gly Asp

405 410 415

Ser Met Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ile Asn Cys

420 425 430

Pro Ile Asn Trp Ile Arg Leu Ala Pro Gly Lys Arg Pro Glu Trp Met

435 440 445

Gly Trp Met Lys Pro Arg His Gly Ala Val Ser Tyr Ala Arg Gln Leu

450 455 460

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Met Tyr Ser Glu Thr Ala Phe

465 470 475 480

Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

485 490 495

Thr Arg Gly Lys Tyr Cys Thr Ala Arg Asp Tyr Tyr Asn Trp Asp Phe

500 505 510

Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

515 520 525

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

530 535 540

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

545 550 555 560

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

565 570 575

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

580 585 590

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

595 600 605

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

610 615 620

Pro Lys Ser Cys Asp Lys

625 630

<210> 20

<211> 140

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Полипептид

<400> 20

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Ala Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<---

1. Соединение для лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует опухолевый антиген, которое содержит:

привлекающий NK домен, содержащий аминокислотные остатки 1-240 SEQ ID No.1 или аминокислотные остатки 19-140 SEQ ID No.14;

активирующий NK домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No.15 или аминокислотную последовательность SEQ ID No.15, содержащую аминокислотную замену N72D или аминокислотную замену N72A;

первый фланкирующий полипептид, связывающий привлекающий NK домен и активирующий NK домен;

направляющий домен, который специфично связывается с указанным опухолевым антигеном; и

второй фланкирующий полипептид, связывающий активирующий NK домен и направляющий домен.

2. Соединение по п. 1, в котором привлекающий NK домен блокирует ингибирование NK клетки.

3. Соединение по любому предшествующему пункту, в котором направляющий домен содержит фрагмент, который избирательно связывается с опухолевой клеткой.

4. Соединение по п. 3, в котором фрагмент направляющего домена содержит антитело или его фрагмент.

5. Соединение по п. 4, в котором фрагмент антитела содержит scFv.

6. Композиция для лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует опухолевый антиген, которая содержит:

соединение по любому предшествующему пункту; и

фармацевтически приемлемый носитель.

7. Способ лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует опухолевый антиген, который включает:

введение субъекту соединения по любому из пп. 1-5 в количестве, эффективном для того, чтобы индуцировать NK-опосредованное уничтожение клеток злокачественной опухоли, которые экспрессируют указанный опухолевый антиген.

8. Способ по п. 7, в котором соединение содержит SEQ ID No. 1.

9. Способ стимуляции размножения NK клеток in vivo, включающий:

введение субъекту количества соединения по любому из пп. 1-5, эффективного для того, чтобы стимулировать размножение NK клеток у субъекта.

10. Способ по п. 9, в котором соединение содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1.

11. Способ лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует опухолевый антиген, у субъекта, где способ включает:

введение субъекту количества соединения по любому из пп. 1-5, эффективного для лечения злокачественной опухоли, которая экспрессирует указанный опухолевый антиген.

12. Способ по п. 11, в котором соединение содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1.

13. Способ по п. 11, в котором злокачественная опухоль включает злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль ободочной кишки, злокачественную опухоль прямой кишки, злокачественную опухоль мочевого пузыря, меланому, злокачественную опухоль почки, почечную злокачественную опухоль, злокачественную опухоль ротовой полости, злокачественную опухоль глотки, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль матки, злокачественную опухоль щитовидной железы, злокачественную опухоль кожи, злокачественную опухоль головы и шеи, злокачественную опухоль шейки матки, злокачественную опухоль яичников или гематопоэтическую злокачественную опухоль.

14. Способ по п. 11, который дополнительно включает введение композиции до, одновременно с или после химиотерапии, хирургической резекции опухоли или лучевой терапии.

15. Способ по п. 14, в котором химиотерапия содержит алтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, коласпазу, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитофосфан, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, фторурацил, флударабин, фотемустин, ганцикловир, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митомицин C, нимустин, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, прокарбазин, ралтитрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, тиотепу, топотекан, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

16. Соединение по п. 1, в котором активирующий NK домен содержит замену аминокислоты N72D или N72A по сравнению с SEQ ID No. 15.

17. Соединение по п. 1, в котором привлекающий NK домен и активирующий NK домен связаны посредством фланкирующего полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID No.3.

18. Соединение по п. 1, в котором активирующий NK домен и направляющий домен связаны посредством фланкирующего полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID No.4.

19. Соединение для лечения злокачественной опухоли, содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.1 или SEQ ID No.14.

20. Соединение по п. 1, в котором направляющий домен содержит:

аминокислотные остатки 382-620 SEQ ID No.1; или

аминокислотные остатки 295-537 SEQ ID No.14.

21. Соединение по п. 1, в котором первый фланкирующий полипептид содержит:

аминокислотную последовательность SEQ ID No.3;

аминокислотную последовательность SEQ ID No.4;

аминокислоты 119-133 SEQ ID No.5;

аминокислоты 494-518 SEQ ID No.8;

аминокислоты 241-255 SEQ ID No.12;

аминокислоты 488-506 SEQ ID No.10;

аминокислоты 277-294 SEQ ID No.14; или

аминокислоты 142-161 SEQ ID No.14.

22. Соединение по п. 1, в котором второй фланкирующий полипептид содержит:

аминокислотную последовательность SEQ ID No.3;

аминокислотную последовательность SEQ ID No.4;

аминокислоты 119-133 SEQ ID No.5;

аминокислоты 494-518 SEQ ID No.8;

аминокислоты 241-255 SEQ ID No.12;

аминокислоты 488-506 SEQ ID No.10;

аминокислоты 277-294 SEQ ID No.14; или

аминокислоты 142-161 SEQ ID No.14.

23. Соединение по п. 1, в котором первый фланкирующий полипептид содержит аминокислоты SEQ ID No.3; и второй фланкирующий полипептид содержит аминокислоты SEQ ID No.4.

24. Соединение по п. 1, в котором первый фланкирующий полипептид содержит аминокислоты 142-161 SEQ ID No.14; и второй фланкирующий полипептид содержит аминокислоты 277-294 SEQ ID No.14.