Способ постадийного моделирования неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы у крыс

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной гастероэнтерологии, и может быть использовано для изучения механизмов формирования, прогрессирования и терапии заболеваний поджелудочной железы неинфекционного генеза. Способ постадийного моделирования неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы (НАЖБ ПЖ) у крыс включает скармливания экспериментальным животным патогенного корма. При этом в течение 24 недель ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела. По истечении 4 недель от начала кормления проводят гистологическое исследование и при обнаружении жировой инфильтрации панкреатических клеток судят о формировании модели НАЖБ ПЖ в стадии стеатоза. По истечении 12 недель от начала кормления при обнаружении на гистологических срезах жировых перерождений ткани и некроза клеток с воспалительной инфильтрацией судят о формировании модели НАЖБ ПЖ в стадии стеатопанкреонекроза. По истечении 24 недель от начала кормления при обнаружении на гистологических срезах областей некроза клеток с замещением паренхимы соединительнотканными структурами судят о формировании модели НАЖБ ПЖ в стадии стеатопанкреонекроза с фиброзом поджелудочной железы. Изобретение позволяет получить новую экспериментальную модель неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы, наиболее точно отражающую структурно-функциональную реорганизацию органа, сопровождающуюся гипергликемией, гиперферментемией, дислипидемией. 4 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной гастроэнтерологии и может быть использовано для изучения механизмов формирования, прогрессирования и терапии заболеваний поджелудочной железы, вызванных ожирением. В модели используется не инвазивный метод воздействия на животных с помощью алиментарного фактора.

Потребление продуктов с высоким содержанием жиров и малоподвижный образ жизни сформировали эпидемию 21 века - ожирение. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2016 году более 1,9 миллиарда взрослых старше 18 лет имели избыточный вес. Из них свыше 650 миллионов страдали ожирением [Бенца Т.М. Ожирение: современные подходы к рациональной терапии // Лики Украины. 2019. Т. 229, №3. С. 4-9]. Увеличение численности населения с ожирением сформировало тенденцию к росту ассоциированных с ожирением заболеваний. Помимо заболеваний сердечно сосудистой системы, органы пищеварения становятся мишенями метаболических нарушений, вызванных ожирением. Поскольку печень является ключевым органом метаболизма, ее жировая инфильтрация наиболее изучена. Многочисленные работы подтверждают гипотезу неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) как причину и следствие метаболического синдрома, вызванного ожирением [Ефимова О.В., Григорьева И.Н., Тов Н.Л. и др. Липиды, печень и поджелудочная железа на перекрестке эпидемий метаболического синдрома и ожирения // Атеросклероз. 2020. Т. 16, №4. С. 77-84; Кытикова О.Ю., Новгородцева Т.П., Денисенко Ю.К. и др. Метаболические и генетические детерминанты нарушения липидного обмена при неалкогольной жировой болезни печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2020. Т. 30, №.2. С. 15-25].

Хотя поджелудочная железа также является важным органом метаболизма, эффекты жирового повреждения ее менее изучены. В последние годы сформирован термин, характеризующий изменения в поджелудочной железе, вызванные жировым повреждением. Неалкогольная жировая болезнь поджелудочной железы (НАЖБ ПЖ), формирующаяся при жировом поражении органа, наравне с НАЖБП входит в обиход специалистов в области гастроэнтерологии. Она включает в себя весь спектр жировых поражений поджелудочной железы - развитие стеатоза, стеатопанкреанекроза и фиброза [Губергриц Н.Б., Беляева Н.В., Можина Т.Л. Параллели между неалкогольной жировой болезнью печени и неалкогольной жировой болезнью поджелудочной железы: в поисках точек соприкосновения или взгляд сквозь призму метаболического синдрома // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2020. Т. 183, №11. С.80-101; Бацков С.С., Инжеваткин Д.И., Пронина Г.А. Хронический неалкогольный стеатопанкреатит как продвинутая стадия течения неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2016. Т. 1. С. 15-20].

Изучение НАЖБ ПЖ является актуальным вопросом, так как до сих пор остается много «белых пятен» в патогенезе этого заболевания. Это объясняется тем, что биопсия тканей поджелудочной железы выполняется очень редко, а инструментальные методы визуализации не дают полной картины гистологического строения тканей органа, сложно дифференцировать степень жирового перерождения в клетках и выявить фиброзные изменения. Исследование при помощи ультразвука не дифференцирует повышенную эхогенность поджелудочной железы возникающую как при стеатозе, так и при фиброзе. Кроме того, у пациентов с ожирением может быть затруднена визуализация поджелудочной железы методом УЗИ. Компьютерная томография не позволяет выявить легкую степени стеатоза поджелудочной железы. Современная МРТ-техника в состоянии определить размеры органа и гомогенные изменения структуры при стеатозе [Anand R., Narula M.K., Chaudhary V., Agrawal R. Total pancreatic lipomatosis with malabsorption syndrome // Indian journal of endocrinology and metabolism. 2011. Vol. 15 (1). P. 51-53]. Вместе с тем исследований по данной проблеме очень мало и нет общепринятых критериев МРТ-диагностики стеатоза поджелудочной железы.

Кроме того, сложность вызывает бессимптомность протекания заболевания особенно на ранних стадиях. Как известно, поджелудочная железа обладает большим функциональным резервом: достаточно сохранения 10% нормально функционирующей паренхимы, чтобы удовлетворить потребности пищеварения в липазе и других ферментах панкреатического сока [Пиманов С.И. Стеатоз поджелудочной железы - «белое пятно» панкреатологии // Медицинский совет. 2014. №11. С. 22-26]. При резко выраженном стеатозе появляется внешнесекреторная недостаточность со стеатореей. В случае если болезнь зашла далеко и пищеварительных ферментов образуется недостаточно, формируется дефицит питательных веществ и истощение, однако, как правило, у пациентов жалоб нет. В то же время, стеатоз поджелудочной железы - очень коварное заболевание. С одной стороны, оно не причиняет большинству людей сильного беспокойства, с другой - способно привести к развитию опасного заболевания - острого панкреатита. При этом может начаться стеатопанкреонекроз, т.е. отмирание тканей поджелудочной, что в 10-30% случаев может привести к летальному исходу. Кроме того известно, что жировое перерождение ткани может происходить с фиброзной трансформацией на месте некротизированных клеток [Ивашкин В.Т., Шифрин О.С., Соколина И.А. Хронический панкреатит, стеатоз поджелудочной железы и стеатопанкреатит. М.: Литтерра, 2014. 240 с.].

Таким образом, создание модели способной передать структурно-функциональные изменения поджелудочной железы свойственные заболеваниям у человека является актуальным предметом экспериментальной патофизиологии.

Экспериментальная модель НАЖБ ПЖ послужит для изучения механизмов формирования, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в становлении патологических процессов в поджелудочной железе, что необходимо для открытия новых терапевтических и профилактических стратегий. Изучение обратимости структурных изменений, после прекращения влияния повреждающего фактора позволят провести классификацию степени жировой инфильтрации, липоматоза, воспаления и фиброзной трансформации поджелудочной железы при жировом повреждении органа.

Патентный поиск и обзор литературы не выявил специальной модели формирования неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы. Однако, существует широкий спектр экспериментальных моделей формирования некроза клеток и воспаления поджелудочной железы (панкреатита) не связанные с жировым повреждением [Gorelick F. Lerch M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease? // Cellular and molecular gastroenterology and hepatology. 2017. Vol. 4 (2). Р. 251-262]. Следует отметить, что все известные экспериментальные модели острого и хронического панкреатита можно объединить, в зависимости от повреждающего фактора, в несколько групп: каналикулярно-гипертензивные, травматические, ишемические, сосудисто-аллергические, токсико-инфекционные и комбинированные [Колешко С.В., Лис Р.Е. Моделирование патологических процессов в поджелудочной железе, максимально приближенных к клинической практике // Журнал ГрГМУ. 2009. №2. С. 159-162]. Большинство моделей технически сложно выполнимы, весьма травматичны для животного, непредсказуемы в развитии. Данные модели не отвечают поставленным задачам для формирования НАЖБ ПЖ, соответствующей заболеванию у людей.

Другой вариант экспериментальных моделей приводящих к формированию НАЖБ ПЖ относятся - модели метаболического синдрома и ожирения [Wong S., Chin K., Suhaimi F., Fairus A., Ima-Nirwana S. Animal models of metabolic syndrome: a review // Nut. Metab. 2016. Vol. 13 (1). P 1-12. doi:10.1186/s12986-016-0123-9]. Но все существующие модели ожирения не учитывают изменения в поджелудочной железе. Опубликована единственная работа, выполненная Фраулоб Х.К. с соавторами, в которой он рассматривает поджелудочную железу как орган-мишень при метаболическом синдроме и констатирует развитие стеатоза поджелудочной железы [Fraulob J.C., Ogg-Diamantino R., Fernandes-Santos C., et al. A mouse model of metabolic syndrome: insulin resistance, fatty liver and non-alcoholic fatty pancreas disease (NAFPD) in c57bl/6 mice fed a high fat diet // J. Clin. Biochem. Nutr. 2010. Vol. 46(3). P. 212-223]. Согласно описанному в этой работе способу, экспериментальных мышей содержали в течение 16 недель на рационе с высоким содержанием жиров и уменьшением углеводного компонента в пище. В результате у животных происходило отложение избытка жира в поджелудочной железе и формировался стеатоз. К недостаткам данного способа можно отнести отсутствие развития глубоких структурных повреждений поджелудочной железы, способствующих формированию некроза клеток, воспаления и фиброза.

Развития экспериментального панкреатита возможно и у животных, уже имеющих ожирение. При таком способе моделирования НАЖБ ПЖ формирующиеся патогенетические механизмы не будут соответствовать этиологии заболевания у людей. Поскольку в клинической практике основным инициатором неинфекционных заболеваний поджелудочной железы является неправильное питание.

Существуют трудности в экстраполяции экспериментальных данных по изучению механизмов развития патологии поджелудочной железы на человека. В связи с этим, для изучения механизмов формирования заболеваний поджелудочной железы, вызванных жировым повреждением, и разработки новых подходов в профилактике и лечении, исследователям требуются экспериментальные модели НАЖБ ПЖ наиболее приближенные к реальным клиническим условиям.

Задача изобретения состоит в том, чтобы создать более простой способ моделирования НАЖБ ПЖ у животных. Способ должен отличаться высокой воспроизводимостью, с минимальной смертностью животных, а главное максимально приближенный к клиническому течению заболевания поджелудочной железы.

Для решения поставленной задачи триггерным фактором, запускающим цепочку структурно-функциональных изменений, приводящих к развитию НАЖБ ПЖ был выбран высокожировой патогенный рацион, как наиболее соответствующий патогенезу заболеваний у людей. Длительность воздействия экспериментального рациона выбиралась с учетом возможности формирования последовательных этапов структурных преобразований в поджелудочной железе, соответствующих легкой и тяжелой стадии развития НАЖБ ПЖ.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание технологически простого, экономически необремененного способа позволяющего создавать модели неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы крыс, в стадиях - стеатоза, стеатопанкреонекроза и стеатопанкреонекроза с фиброзом.

Технический результат изобретения обеспечивается тем, что экспериментальным животным ежесуточно с кормом вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела в течение 24 недель, последовательно одновременно определяют уровни весоростовых показателей животных, исследуют биохимические показатели сыворотки крови и гистологические изменения ткани поджелудочной железы; по истечении 4 недель от начала вскармливания выявляют сформировавшуюся модель стеатоза поджелудочной железы, характеризующегося жировой инфильтрацией клеток, на 12 неделе от начала вскармливания выявляют сформировавшуюся модель стеатопанкреонекроза, проявляющегося очагами некроза и воспалительно-клеточной инфильтрацией, на 24 неделе от начала вскармливания выявляют сформировавшуюся модель стеатопанкреонекроза с фиброзом поджелудочной железы. Использование изобретения позволит своевременно диагностировать и назначать адекватное лечение с учетом стадии заболевания поджелудочной железы.

Заявляемый способ моделирования НАЖБ ПЖ соответствует критерию изобретения «новизна», поскольку совокупность заявляемых признаков не известна из уровня техники.

Способ соответствует критерию «изобретательский уровень», так как для специалиста заявляемое техническое решение явным образом не следует из уровня техники; технических решений с существенными признаками заявляемого способа не выявлено.

Изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», может быть использовано в медицине для отработки медицинских технологий и фармацевтических препаратов в доклинических испытаниях лечения заболеваний поджелудочной железы.

Таким образом, по мнению авторов заявляемое техническое решение в полной мере соответствует требованиям к изобретению.

Для решения поставленной задачи, согласно заявляемому способу, был разработан метод моделирования неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы у крыс, путем кормления экспериментальных животных кормом с высоким содержанием жиров в течение 24 недель. Прототипом для эксперимента послужила работа J. Fan по формированию алиментарной гиперлипидемии и стеатоза печени путем воздействия в течение 12 недель гиперхолестериновым рационом, содержащим 10% свиного сала и 2 % холестерина от общего состава пищи [Fan J.G., Zhong L., Xu Z.J., Tia L.Y., Ding X.D., Li M.S., Wang G.L. Effect of low-calorie diet on steatohepatitis in rats with obesity and hyperlipidemia // World J. оf Gastroenterology. 2003. N 9(9). P. 2045-2049]. В нашем способе была подобрана доза, оказывающая наибольший патогенетический эффект. Было установлено, что для формирования стойких структурных изменений в поджелудочной железе к стандартному виварному рациону должны быть добавлены дополнительные 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела животного. Нагрузка топленным говяжьим салом (20% от общего состава рациона) являлась базовым патогенетическим фактором, увеличивающим общий калораж рациона диеты. В диету также был включен холестерин (10% от общего состава рациона), как один из факторов, активизирующих липидные нарушения, процессы жировой инфильтрации паренхиматозных органов пищеварительной системы. То есть, в модели НАЖБ ПЖ инициируются механизмы, характеризующиеся ожирением, дислипидемией, жировым повреждением органов.

На промежуточных этапах эксперимента, было выявлено, что на 4 неделе у животных диагностируется сформировавшийся стеатоз поджелудочной железы, по истечении 12 недель определяется явно выраженный стеатопанкреонекроз, а по истечении 24 недели от начала эксперимента формируется стеатопанкреонекроз с фиброзной трансформацией. Таким образом, моделирование НАЖБ ПЖ в течение 24 недель на экспериментальном рационе, позволяет получить различные морфологические изменения, соответствующие различным стадиям заболевания у людей.

Таким образом, предложенное решение не является простой модификацией известных способов, оно дает неожиданно высокий результат и 100% воспроизводимость у подопытных животных. Предлагаемый способ постадийного моделирования неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы несложен в техническом воспроизведении и создает условия для проведения совершенно оригинальных и имеющих огромное практическое значение для медицины и биологии работ по выяснению патогенетических механизмов формирования НАЖБ ПЖ.

Для создания модели неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы использовались белые крысы самцы линии Wistar в возрасте 6 месяцев, выведенные в филиале «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (г. Чехов, Московская обл.). Крысы линии Wistar являются генетически контролируемой закрытой колонией нелинейных крыс и широко используются для изучения проблем питания и моделирования заболеваний висцеральных систем. Средняя масса животных составляла 180,4±5.4 г. При разработке модели отрабатывалось воспроизведение нескольких аналогичных экспериментальных состояний, все варианты модификаций воспроизводимых моделей анализировались на основании гистологических исследований ткани поджелудочной железы. Отобраны были те модели, при воспроизведении которых достигались стойкие структурные нарушения поджелудочной железы при отсутствии смертности экспериментальных животных.

Описание моделирования НАЖБ ПЖ. Формируются группы животных: 3 опытных и 3 контрольных.

Опытная 1 - крысы, находящиеся на экспериментальном рационе в течение 4 недель.

Опытная 2 - крысы, находящиеся на экспериментальном рационе в течение 12 недель.

Опытная 3 - крысы, находящиеся на экспериментальном рационе в течение 24 недель.

Также формировались группы контроля - крысы, содержавшиеся на стандартном рационе вивария.

Состав экспериментального и стандартного рациона представлен в таблице 1.

Таблица 1 Суточный рацион крыс (г/100г массы животного)
Ингредиенты	Экспериментальный рацион	Стандартный рацион
Говяжье сало	4,25	0,5
Холестерин	0,43	-
Подсолнечное масло	0,5	0,5
Смесь зерновая	5	5
Хлеб пшеничный (сухари)	2	20
Крупа овсяная	1,3	1,3
Мясо говяжье второй категории	2	2
Творог обезжиренный	0,8	0,8
Морковь	3,3	3,3
Зелень	3,3	3,3
Дрожжи пивные	0,05	0,05
Соль поваренная	0,1	0,1

В экспериментальный рацион включен холестерин (10% от общего состава рациона), как один из факторов, активизирующих липидные нарушения, процессы жировой инфильтрации и структурную дезинтеграцию поджелудочной железы. Базовым патогенетическим фактором являлась жировая нагрузка топленым говяжьим салом (20% от общего состава рациона), увеличивающая общую калорийность и патогенность рациона экспериментальной диеты. То есть, в модели НАЖБ ПЖ инициируются механизмы, характеризующиеся ожирением, дислипидемией, стеатозом поджелудочной железы.

Ежедневно проводился осмотр животных, учитывалась поедаемость корма. Все животные сохраняли активность, заболеваний и смертности не наблюдалось. Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 ЕЕС. Оценивались биометрические показатели каждого животного: вес крысы, индекс Кетле, относительная и абсолютная масса поджелудочной железы, висцерального жира.

Для изучения динамики процессов использовали известные общепринятые методы.

Интенсивность метаболических процессов в организме крыс, находящихся на высокожировой нагрузке оценивали по активности ферментов в сыворотке крови - трансфераз и дегидрогеназ (аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ)), холинэстеразы, гамма-глютамилтрансферазы (ГГТ). Структурно-функциональное состояние поджелудочной железы также оценивали по классическому критерию - активности липазы в сыворотке крови. Метаболизм углеводов характеризовали по концентрации глюкозы и лактата в сыворотке крови.

Интенсивность липидного обмена оценивали по показателям липидов и липопротеидов в сыворотке крови: определяли уровень общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП), результаты выражали в ммоль/л. Холестерин липопротеидов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) определяли расчетным методом по формулам Фридвальда. Индекс атерогенности (ИА) рассчитывали по формуле ОХС-ХС ЛПВП/ХС ЛПВП.

Средние весоростовые параметры крыс опытных и контрольных групп представлены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние экспериментального рациона на массу тела, висцерального жира и поджелудочной железы крыс, M±m
Показатели	Контрольная группа, n=30	Сроки воздействия экспериментальным рационом
4 недели (опытная 1), n=10	12 недель (опытная 2), n=10	24 недели (опытная 3), n=10
Масса тела крысы до эксперимента, г	180.4±5.4	184.2±3.6	191.5±8.5	186.9±10.6
Масса тела крысы после эксперимента, г	235.2±5.8	***324.5±8.7	***371.4±12.2*	***480.0±50.1**
Прибавка массы тела, г	43.9±3.3	***151±11	***182±6**	***295.4±65.2**
Масса висцерального жира	6.0±0.8	***16.81±0.96	***18.34±0.2*	***19.54±3.40
Масса поджелудочной железы, г	3,5±0,1	***5,7±0,3	***7,0±0,3**	***11,2±0,2**

Примечание: (*) слева - статистическая значимость различий относительно контрольной группы, справа - относительно опытной группы 1 и 2.

* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

У всех крыс опытных групп по сравнению с контрольной группой выявлено увеличение массы тела, индекса Кетле, существенное повышение массы висцеральной жировой ткани и поджелудочной железы. Полученные результаты указывают на развитие ожирения тела и органов у крыс, подвергавшиеся воздействию патогенным высокожировым питанием.

Динамика метаболических процессов в организме крыс, содержавшихся на экспериментальном рационе в течение 24 недель характеризовалась стабильным ростом ферментативной активности (табл. 3). Резкий скачок активности АЛТ, АСТ, ЛДГ (р<0,001) в крови крыс наблюдался на 4 неделе высокожировой нагрузки. Отмечалось повышение активности фермента поджелудочной железы - липазы (р<0,05). Ферментативная активность гепатобилиарной системы и пищеварительно-транспортного конвейера на 12 и 24 недели характеризовалась значительным увеличением активности трансфераз и лактатдегидрогеназы, гамма-глютамилтрансферазы, холинэстеразы (только для опытной группы 3) и липазы. Наблюдалось снижение соотношения АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса). Выявленные изменения активности изучаемых ферментов являются диагностическим критерием структурно-функционального повреждения желез пищеварительной системы.

Таблица 3 Динамика биохимических показателей крови крыс под влиянием экспериментального рациона, M±m
Показатели	Контрольная группа, n=30	Сроки воздействия экспериментальным рационом
4 недели (опытная 1), n=10	12 недель (опытная 2), n=10	24 недели (опытная 3), n=10
Показатели липидов крови
Общий холестерин, ммоль/л	1,49±0,04	***3,68±0,04	1,64±0,08**	***2,72±0,17**
Триглицериды, ммоль/л	1,19±0,04	***1,90±0,06	**0,51±0,05***	***0,48±0,08
ХС ЛПНП, ммоль/л	0,29±0,02	***2,34±0,11	***0,90±0,12**	***1,74±0,17*
ХС ЛПОНП, ммоль/л	0,54±0,02	***0,85±0,03	**0,23±0,01***	***0,22±0,02
ХС ЛПВП, ммоль/л	0,67±0,04	***0,28±0,02	*0,50±0,08**	0,75±0,15
ИА, у.е.	1,36±0,15	***11,87±1,55	**2,9±0,35***	**2,44±0,8
Показатели активности ферментов
АЛТ	55,3±2,5	***108,9±3,5	**133,5±6,5***	***173,7±6,7***
АСТ	147,1±9,6	***243,1±9,1	225,3±8,3***	***196,3±18,2**
ЛДГ	883±21	**1799,1±176,8	1678±38***	***1269±96***
АСТ/АЛТ, у.е.	2,69±0,17	2,23±0,09	*1,65±0,05*	*1,12±0,08***
Гамма-глютамил трансфераза, ммоль/л	12,6±1,7	*14,5±0,2	***26,7±1,0***	**29,5±1,7***
Холинэстераза, МЕ/л	746±14	725,2±10,6	**517,9±13,0**	***890,6±15,5***
Липаза, МЕ/л	13,4±0,5	*17,1±0,5	**23,1±1,2***	***46,2±3,6***
Показатели углеводного обмена
Глюкоза, ммоль/л	6,5±0,4	***8,9±0,2	*7,2±0,2*	***12,0±0,3**
Лактат, ммоль/л	1,34±0,07	*1,81±0,04	*1,99±0,06	*1,97±0,05

Примечание: (*) слева - статистическая значимость различий относительно контрольной группы, справа - относительно опытной группы 1 и 2. * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

Изучение показателей липидного обмена показало, что у крыс под влиянием жирового рациона на 4 неделе формировалась алиментарная дислипидемия, проявляющаяся повышением уровня ОХС, ТГ, ХС ЛПОНП в сыворотке крови. При этом ХС ЛПВП снижался более чем в 2 раза, а индекс атерогенности увеличился на порядок (р<0,001). Через 12 недель жировой нагрузки концентрация ОХС в крови выровнялась с таковым показателем у контрольных крыс, уровни ТГ и ХС ЛПОНП достоверно снизились более чем в 2 раза. Воздействие гиперкалорийного рациона в течение 24 недель вызывало прогрессирование гиперлипидемии. По сравнению с показателями контрольной группы отмечено достоверное повышение ОХС в крови и индекса атерогенности. Полученные результаты характеризуют динамику нарушений липидного обмена на всех этапах эксперимента. Формирование НАЖБ ПЖ сопровождалось развитием гипергликемии, доказательством чего явилось повышение уровня глюкозы в крови во всех опытных группах крыс.

Для проведения гистологического исследования кусочки ткани средней части поджелудочной железы фиксировались в 10%-ным растворе нейтрального формалина, приготовленного на 0,07М фосфатном буфере (рН=6,98). Обезвоживание тканей проводили в этиловом спирте возрастающей концентрации и заливали в парапласт. Далее с помощью микротома (МЗП-01 «ТЕХНОМ») готовили срезы исследуемого органа толщиной 7 мкм. Для гистологических исследований срезы тканей поджелудочной железы окрашивали гематоксилин-эозином по Романовскому [Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во иностр. литературы, 1962. 967 с.]. Препараты анализировали при помощи микроскопа фирмы «Carl Zeiss» (Германия) (ув. об. х10, х40 и х100). Данные, полученные в результате исследований приведены ниже.

Доказательством развития модели неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы у животных служило исследование морфологии тканей органа на гистологических срезах. В контрольных группах морфология органов у животных соответствовала норме. Хорошо прослеживалась дольчатость строения (Фиг. 1а). Ацинусы были представлены железистыми клетками с ярко выраженной дифференциацией базальной части, содержащей ядро и апикальной части, содержащей секретируемые вакуоли. Между ацинусами располагались островки Лангерганса (Фиг. 1б). Островки имели округлую форму и состояли из инсулоцитов, между которыми располагались капилляры с перикапиллярным пространством.

На 4 неделе экспериментального моделирования НАЖБ ПЖ у животных отмечалось изменения структуры поджелудочной железы. Дольчатость строения прослеживалась хорошо, но отмечалась некоторая отечность стромы ткани. Наблюдалась вакуолизация цитоплазмы и увеличение размеров клеток ацинусов, что, скорее всего, было вызвано жировой инфильтрацией органа. Картина структурных изменений характеризовала формирование стеатоза (Фиг. 2).

Гистоструктура поджелудочной железы у крыс, содержащихся на жировом рационе в течении 12 недель, имела слабовыраженную волокниструю строму, дольчатость строения прослеживалась слабо. В междольковых прослойках соединительной ткани выявлялись кровеносные сосуды, с повышенным кровенаполнением. В междольковых прослойках соединительной ткани выявлялись кровеносные сосуды, нервные волокна и выводные протоки, а кроме того, в отдельных участках наблюдались скопления липоцитов (Фиг. 3.а). Обнаруживались очаги паренхимы ткани с клетками с жировой инфильтрацией. Клетки не формировали ацинарного строения ткани, некоторые клетки были заполнены крупными вакуолями (Фиг. 3б). Наблюдались и очаги некроза с воспалительной инфильтрацией (Фиг. 3в). Данная картина демонстрирует развитие стеатопанкреонекроза.

Исследование морфологии тканей поджелудочной железы крыс через 24 недели эксперимента выявило крупные очаги некроза с воспалительно-клеточной инфильтрацией и нарушение дольчатого строения тканей (Фиг. 4а). Архитектоника органа нарушалась, отмечалось разрастание соединителей ткани в паренхиме органа (Фиг. 4б). На данном этапе установлено формирование стеатопанкреонекроза с фиброзной трансформацией поджелудочной железы.

Пример 1. Моделирование стадии стеатоза поджелудочной железы у крыс. Cамец крысы линии Wistar в возрасте 6 месяцев весом 181,4 г содержался в стандартных условиях вивария и получал экспериментальную диету согласно протоколу исследования. На 4 недели животное изымалось из эксперимента. Вес животного составлял 331,2 г, прибавка массы тела составила 149,8 г, что в 3,5 раза больше прибавки у крыс контрольной группы. Увеличение веса животного указывает на развитие ожирения. Под легким эфирным наркозом проводилась эвтаназия животного и сбор биологического материала (поджелудочная железа, кровь, сыворотка). Вес поджелудочной железы составлял 5,43 г. Один кусочек центральной части поджелудочной железы фиксировался в формалине и подвергался дальнейшей гистологической обработке. Показатели активности ферментов в крови животного были следующие: АЛТ - 110,6 нмоль/(с*л), АСТ - 239,9 нмоль/(с*л) и ЛДГ - 1834,8 нмоль/л, гамма-глютамил трансфераза - 14,7 ммоль/л, холинэстераза - 732,3 МЕ/л, липаза - 17,4 МЕ/л, показатели углеводного обмена глюкоза - 9,1 ммоль/л, лактат - 1,79 ммоль/л. Данные показатели у крысы были достоверно выше, чем у крыс контрольной группы, что свидетельствовало о патологических процессах в паренхиматозных органах пищеварительной системы. Исследование показателей липидного обмена выявило увеличение общего холестерина (3,74 ммоль/л), триглицеридов (1,98 ммоль/л), ХС ЛПНП (2,29 ммоль/л), ХС ЛПОНП (0,87 ммоль/л), при этом уровень ХС ЛПВП снижался (0,28 ммоль/л). Индекс атерогенности увеличивался более чем в 10 раз (12,72 у.е.). Данные изменения характеризовали развитие дислипидемии у крысы. На срезах ткани поджелудочной железы определялись участки клеток со стеатозом - клетки были увеличены в размерах и содержали заполненную вакуолями цитоплазму. Полученные результаты указывают на формирование у данного животного ожирения, гиперферментемиии, дислипидемии, стеатоза поджелудочной железы.

Пример 2. Моделирование стадии стеатопанкреонекроза поджелудочной железы у крыс. Самец крысы линии Wistar в возрасте 6 месяцев имел массу до начала эксперимента 187,4 г. В течение 12 недель животное содержалось на экспериментальной диете с высоким содержанием жира и холестерина. В конце эксперимента у животного развивалось ожирение. Вес животного составлял 385,6 г, прибавка в весе была в 4,1 раза больше в сравнении с контрольной группой. Вес поджелудочной железы был в два раза больше, чем у крыс в контрольной группе и составлял 7,18 г. В крови показатели активности ферментов были следующие: АЛТ - 139,7 нмоль/(с*л), АСТ - 228,4 нмоль/(с*л) и ЛДГ - 1751,5 нмоль/л, гамма-глютамил трансфераза - 26,1 ммоль/л, холинэстераза - 521,6 МЕ/л, липаза - 22,7 МЕ/л, показатели углеводного обмена глюкоза - 7,4 ммоль/л, лактат - 2,1 ммоль/л. Увеличение активности данных ферментов в сравнении с контрольной группой и экспериментальной группой 1 говорит о более активной фазе патологического процесса в органах пищеварительной системы крысы. Показатели липидного обмена были следующие: общий холестерин - 1,69 ммоль/л, триглицериды - 0,50 ммоль/л, ХС ЛПНП - 0,92 ммоль/л, ХС ЛПОНП - 0,22 ммоль/л, ХС ЛПВП - 0,56 ммоль/л. Индекс атерогенности был увеличен в 2 раза (3,04 у.е.). Наблюдалась дислипидемия, но не такая существенная в сравнении с крысами из экспериментальной группы 1, содержавшихся на высокожировом рационе в течение 4 недель. На срезах ткани поджелудочной железы определялись участки клеток в состоянии некроза и с лейкоцитарной инфильтрацией. Ацинарные клетки были с жировой дистрофией. Полученные результаты указывают на формирование у данного животного ожирения, дислипидемии, стеатопанкреонекроза поджелудочной железы.

Пример 3. Моделирование стадии стеатопанкреонекроза с фиброзом поджелудочной железы. Самец крысы линии Wistar в возрасте 6 месяцев содержалась на экспериментальном рационе в течение 24 недель. До начала эксперимента вес животного составлял 194,4 г, через 24-и недели высокожировой нагрузки вес увеличился в 6,5 раз в сравнении с прибавкой в весе у контрольных животных. Наблюдалась сильная степень ожирения. Поджелудочная железа животного была гипертрофирована, ее масса превышала в 3,5 раза массу поджелудочной железы у крыс из группы контроля. Показатели ферментативной активности были следующие: АЛТ - 176,1 нмоль/(с*л), АСТ - 198,4 нмоль/(с*л) и ЛДГ - 1321,6 нмоль/л, гамма-глютамил трансфераза - 30,1 ммоль/л, холинэстераза - 908,9 МЕ/л, липаза - 46,7 МЕ/л, показатели углеводного обмена глюкоза - 7,4 ммоль/л, лактат - 2,1 ммоль/л. Высокие показатели активности ферментов и уровня метаболитов углеводного обмена у крысы на 24 неделе эксперимента говорят об обширной клеточной гибели и прогрессировании патологического процесса в органах пищеварительной системы. Показатели липидного обмена были следующие: общий холестерин - 2,72 ммоль/л, триглицериды - 0,43 ммоль/л, ХС ЛПНП - 1,82 ммоль/л, ХС ЛПОНП - 0,24 ммоль/л, ХС ЛПВП - 0,76 ммоль/л. Индекс атерогенности был увеличен в 1,5 раза (2,47 у.е.). Выявлялось нарушение липидного обмена с ярко выраженной гиперлипидемией. Морфологическое исследование тканей поджелудочной желез крысы выявила нарушение архитектоники органа. В поджелудочной железе определялись многочисленные участки некроза, заполненные клеточным воспалительным инфильтратом. Было отчётливо видно разрастание соединительно тканных структур в паренхиме органа. Полученные результаты указывают на формирование у данного животного ожирения, гиперлипидемии, в поджелудочной железе состояние стеатопанкреонекроза с фиброзной трансформацией.

Таким образом, приведенные примеры подтверждают, что авторам с высокой степенью достоверности, удалось получить модель неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы, характеризующуюся ожирением, нарушением структурной организации, некрозом ткани, формированием фиброза поджелудочной железы.

Разработанная модель НАЖБ ПЖ позволяет изучать стадийность развития жирового поражения поджелудочной железы, характеризующейся формированием 3 стадий - стеатоза, стеатопанкреонекроза и стеатопанкреонекроза с фиброзом. Развитие модели НАЖБ ПЖ учитывает большинство клинически значимых факторов повреждения поджелудочной железы, наиболее часто встречающиеся в патогенезе заболеваний у людей. Результаты исследования свидетельствуют о несомненной экономической привлекательности использования данной модели. Модель легка в исполнении, не требует высокотехнических и затратных средств. Не требует специальных навыков у персонала в осуществлении экспериментального моделирования.

В фундаментальной науке экспериментальное моделирование помогает более глубоко исследовать патогенетические механизмы заболеваний поджелудочной железы, ассоциированных с ожирением, определить роль поджелудочной железы в метаболических нарушениях, установить критерии оценки степени изменений состояния поджелудочной железы в динамике развития НАЖБ ПЖ. В медицинской практике, на экспериментальной модели возможна отработка новых лечебных технологий и фармакологических препаратов.

Способ постадийного моделирования неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы (НАЖБ ПЖ) у крыс путем скармливания экспериментальным животным патогенного корма, отличающийся тем, что в течение 24 недель ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела, по истечении 4 недель от начала кормления проводят гистологическое исследование и при обнаружении жировой инфильтрации панкреатических клеток судят о формировании модели НАЖБ ПЖ в стадии стеатоза; по истечении 12 недель от начала кормления при обнаружении на гистологических срезах жировых перерождений ткани и некроза клеток с воспалительной инфильтрацией судят о формировании модели НАЖБ ПЖ в стадии стеатопанкреонекроза; по истечении 24 недель от начала кормления при обнаружении на гистологических срезах областей некроза клеток с замещением паренхимы соединительнотканными структурами судят о формировании модели НАЖБ ПЖ в стадии стеатопанкреонекроза с фиброзом поджелудочной железы.