Иммунокомпетентная клетка и экспрессирующий вектор, экспрессирующие регуляторные факторы иммунной функции

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены Т-клетки для лечения рака, экспрессирующий вектор для генерирования Т-клетки для лечения рака. Кроме того, рассмотрены наборы векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака. Также рассмотрены противоопухолевое средство, способы получения Т-клетки для лечения рака. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии опухолевых заболеваний. 14 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.

 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к иммунокомпетентной клетке, экспрессирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19, противоопухолевому средству, содержащему иммунокомпетентную клетку, и экспрессирующему вектору для генерирования иммунокомпетентной клетки.

Предшествующий уровень техники

[0002] Рак - это болезнь, поражающая многих людей во всем мире. В большинстве случаев, широко применяется химиотерапия, лучевая терапия или хирургическое лечение. Однако, возникают различные проблемы, в частности, появление побочных реакций, потеря некоторых функций, трудности в лечении метастазов.

[0003] Таким образом, в последние годы развивается иммунотерапия, нацеленная на повышение качества жизни пациентов. В данной иммунотерапии иммуно-клеточная терапия представляет собой терапию, которая включает в себя сбор иммунокомпетентных клеток у пациентов, обработку и амплификацию иммунокомпетентных клеток с целью усиления их иммунной функции и передачу иммунокомпетентных клеток пациентам. В частности, известна терапия, которая включает в себя сбор Т-клеток у пациентов, введение гена, кодирующего CAR в Т-клетки, амплификацию Т-клеток и передачу Т-клеток снова пациентам (см. 2

непатентный документ 1). Данная терапия в настоящее время проходит клиническое испытание по всему миру и показывает эффективность, например, против злокачественного новообразования кроветворного органа, например, лейкемии или лимфомы.

[0004] По меньшей мере, несколько сотен различных типов факторов, таких как цитокины, хемокины и сигнальные регуляторные белки, известны как регуляторные факторы иммунной функции иммунокомпетентных клеток, таких как Т-клетки. Среди них интерлейкин 7 (IL-7), представляющий собой цитокин, необходимый для выживания Т-клеток, и, как известно, продуцируемый негемопоэтическими клетками, такими как стромальные клетки костного мозга, тимуса и лимфатических органов или тканей. Т-клетка, экспрессирующая химерные рецепторы к цитокину, содержащему IL-7 и IL-7R alpha, гибридизированные друг с другом (см. патентный документ 1), описывается как Т-клетка, использующая функцию данного IL-7. Однако химерный рецептор к цитокину в Т-клетке экспрессируется как один гибридный белок способом, ограниченным поверхностью мембраны Т-клетки, введенной к нему, и просто преобразует сигнал цитокина, такого как IL-7R, лиганд-независимым образом, только в аутологичную клетку. Таким образом, химерный рецептор к цитокину не может усилить функцию Т-клетки, не введенной с рецептором.

[0005] Выявлено, что: сниженная экспрессия CCL19, CCL21 и IL-7 обусловливает недостаток в поддержании зоны Т-клеток в селезенке мыши с мутацией сигнального регуляторного белка SIRP alpha (см. непатентный документ 2); и CCL19, CCL21 и IL-7 поддерживают гомеостаз Т-клеток во вторичных лимфоидных тканях (ткани селезенки или лимфатические узлы) (см. непатентный документ 3). Однако в непатентных документах 2 и 3, описанных выше, показано влияние на неактивированные Т-клетки, постоянно присутствующие в зонах Т-клеток вторичных лимфоидных тканей, и не показана прямая связь с 3

противоопухолевым иммунным ответом. Кроме того, CCL19-, CCL21- или IL-7-экспрессирующие клетки, описанные в непатентных документах 2 и 3, не являлись Т-клетками, а являлись ретикулоэндотелиальными клетками, присутствующими во вторичных лимфоидных тканях.

[0006] Между тем, Т-клеточный рецептор (далее также называемый «TCR») представляет собой молекулу антигенного рецептора, экспрессируемого на клеточные мембраны Т-клеток. TCR присутствует в виде гетеродимера, состоящего из альфа-цепи и бета-цепи, или гамма-цепи и дельта-цепи, и, как известно, активирующего Т-клетки путем распознавания молекулы антигена, связанной с молекулой главного комплекса гистосовместимости (ГКГС).

[0007] Иммунотерапия, которая включает введение гена TCR, способного распознавать опухолевый антиген, экспрессируемый на раковых клетках, к Т-клеткам, полученным от пациентов, больных раком, амплификацию Т-клетки и последующий перенос Т-клетки снова пациентам, находится в стадии разработки посредством применения функции данного TCR. В частности, описывается лекарственный препарат для лечения менингиом, содержащий TCR, экспрессирующий клетку, направленно распознающий WT1-экспрессирующую клетку (см. патентный документ 2).

[0008] Хотя некоторые из описанных выше методов демонстрируют противоопухолевое действие на злокачественное новообразование в кроветворном органе, ни один из предыдущих случаев по-прежнему не оказывает заметного воздействия на солидный рак. Считается, что это связано с проблемами низкой эффективности выживания переносимых иммунокомпетентных клеток in vivo или недостаточной активацией эндогенных иммунокомпетентных клеток, индуцированных переносимыми иммунокомпетентными клетками, или их недостаточным локальным накоплением в опухоли. Таким образом, необходима разработка методики решения этих задач. 4

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

[0009] Патентный документ 1: Международная публикация № WO 2013/123061

Патентный документ 2: Японская не прошедшая экспертизу опубликованная патентная заявка № 2013-116891

Непатентные документы

[0010]

Непатентный документ 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013)

Непатентный документ 2: SATO-HASHIMOTO M. с соавт., J. Immunol., 2011, том 187, №. 1, 291-7

Непатентный документ 3: SIEGERT S. с соавт., Front. Immunol., 2012, том 3, статья 285

Сущность изобретения

Задача изобретения

[0011] Иммунокомпетентные клетки, предназначенные для использования в традиционной иммунотерапии, в недостаточной степени усиливают эффект стимулирования иммунитета, присущий эндогенным иммунокомпетентным клеткам, а также пролиферативный потенциал, выживаемость или способность иммунокомпетентных клеток накапливать Т-клетку. Соответственно, задачей настоящего изобретения является создание иммунокомпетентной клетки, которая экспрессирует регуляторные факторы иммунной функции иммунокомпетентной клетки и обладает всем пролиферативным потенциалом, выживаемостью и способностью накапливать Т-клетку, а также экспрессирующего вектора регуляторных факторов иммунной функции, для генерации иммунокомпетентной клетки. 5

Средство решения задачи

[0012] Авторы изобретения попытались улучшить клетки, экспрессирующие регуляторные факторы иммунной функции, с целью достижения гораздо лучшего эффекта стимулирования иммунитета или противоопухолевой активности при иммунотерапии рака с использованием иммунокомпетентных клеток. В ходе работы авторы изобретения сосредоточились на цитокинах, хемокинах и сигнальных регуляторных белках, которые являются факторами, регулирующими иммунную функцию иммунокомпетентных клеток, и сконструировали вектор для экспрессии факторов, регулирующих иммунную функцию иммунокомпетентных клеток. В результате введения данного экспрессирующего вектора в иммунокомпетентные клетки авторы изобретения обнаружили, что иммунокомпетентные клетки, превосходящие обычные иммунокомпетентные клетки по эффекту стимулирования иммунитета, пролиферативному потенциалу, выживаемости и способности накапливать Т-клетку, могут быть получены и, таким образом, выполнили настоящее изобретение.

[0013] В частности, настоящее изобретение описано в следующих пунктах (1) - (9):

(1) Иммунокомпетентная клетка, экспрессирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19.

(2) Иммунокомпетентная клетка по п. (1), в которой молекула клеточной поверхности, направленно распознающая раковый антиген, представляет собой Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген.

(3) Иммунокомпетентная клетка по п. (1) или (2), в которых иммунокомпетентная клетка представляет собой Т-клетку.

(4) Иммунокомпетентная клетка по п. (1) - (3), в которых раковым антигеном является WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, 6

MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Сурвивин, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, GD2 или GM2.

(5) Экспрессирующий вектор для генерирования иммунокомпетентной клетки в соответствии с любой из формул изобретения (1) - (4), при этом экспрессирующий вектор представляет собой любой из следующих экспрессирующих векторов (а) - (е):

а) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(b) следующие два экспрессирующих вектора (b-1) и (b-2):

(b-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген; а также

(b-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(c) следующие два экспрессирующих вектора (c-1) и (c-2):

(c-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(c-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(d) следующие два экспрессирующих вектора (d-1) и (d-2):

(d-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(d-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно 7

распознающую раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; а также

(e) следующие три экспрессирующих вектора (e-1), (e-2) и (e-3):

(e-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген;

(e-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(e-3) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

(6) Экспрессирующий вектор по п. (5), в котором молекула клеточной поверхности, направленно распознающая раковый антиген, представляет собой Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген.

(7) Экспрессирующий вектор по п. (5) или (6), в которых

нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, в экспрессирующем векторе (a)

нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7 и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19 в экспрессирующем векторе (b-2)

нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7 в экспрессирующем векторе (c-1), или

нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19 в экспрессирующем векторе (d-2)

связаны посредством последовательности, кодирующей саморасщепляющийся пептид. 8

(8) Экспрессирующий вектор по п. (5) - (7), в которых экспрессирующий вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую «суицидальный» ген.

(9) Противоопухолевое средство, содержащее иммунокомпетентную клетку по п. (1) - (4) и фармацевтически приемлемую добавку.

Результат изобретения

[0014] Иммунокомпетентная клетка, экспрессирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген IL-7 и CCL19 (далее также называемая «IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка») в соответствии с настоящим изобретением имеет противоопухолевую активность, и использование данной иммунокомпетентной клетки позволяет затормозить снижение выживаемости, вызванное опухолью, образованной раковой клеткой, имеющей антиген, направленно распознаваемый молекулой клеточной поверхности. Кроме того, использование экспрессирующего вектора настоящего изобретения позволяет генерировать иммунокомпетентную клетку, обладающую всем пролиферативным потенциалом, выживаемостью и способностью накапливать Т-клетку.

Краткое описание чертежей

[0015] [Фиг. 1] Фиг. 1 представляет собой диаграмму, показывающую карту экспрессирующего вектора IL-7 × CCL19.

[Фиг. 2А] Фиг. 2А представляет собой диаграмму, показывающую результаты исследования количества клеток IL-7/CCL19-экспрессирующей Т-клетки.

[Фиг. 2B] Фиг. 2B представляет собой диаграмму, показывающую результаты исследования выживаемости IL-7/CCL19-экспрессирующей Т-клетки. 9

[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет собой диаграмму, показывающую результаты теста миграции Т-клеток с использованием IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток.

[Фиг. 4] Фиг. 4 представляет собой диаграмму, показывающую карту экспрессирующего вектора IL-7 × CCL19 × HSV-TK.

[Фиг. 5] Фиг. 5 представляет собой диаграмму, показывающую карту экспрессирующего вектора TCR × IL-7 × CCL19.

[Фиг. 6] Фиг. 6 представляет собой диаграмму, показывающую карту экспрессирующего вектора IL-7 × CCL19 × eGFP.

[Фиг. 7] Фиг. 7 представляет собой диаграмму, демонстрирующую показатели выживаемости интактной мыши, мыши, получившей P1A-специфичную TCR/eGFP-экспрессирующую Т-клетку, и мыши, получившей TCR/IL-7/CCL19/eGFP экспрессирующую Т-клетку.

[Фиг. 8] Фиг. 8 представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты исследования объемов опухоли интактной мыши, мыши, получившей P1A-специфичную TCR/eGFP-экспрессирующую Т-клетку, и мыши, получившей TCR/IL-7/CCL19/eGFP экспрессирующую Т-клетку.

Способ осуществления изобретения

[0016] IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка настоящего изобретения не имеет конкретного ограничения, поскольку иммунокомпетентная клетка экспрессирует молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19. IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению может дополнительно экспрессировать другие регуляторные факторы иммунной функции, такие как IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL- 17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, интерферон гамма, макрофагальный белок воспаления альфа, ГМ-КСФ, макрофагальный колониестимулирующий фактор, трансформирующий ростовой фактор бета и ФНО-альфа. 10

[0017] Раковый антиген означает вещество, такое как белок или гликолипид, который более экспрессирован в раковой клетке, чем в нормальной клетке, или направленно экспрессируется в раковой клетке. Примеры такого ракового антигена могут включать в себя опухолеассоциированный антиген, раково-тестикулярный антиген, ангиогенез-ассоциированный антиген и эпитопный пептид неоантигена рака, приписываемый генной мутации, и могут направленно включать, помимо прочего, белок, такой как WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Сурвивин, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, МЕЗОТЕЛИН, NKG2D и P1A, а также гликолипид, например, GD2 и GM2.

[0018] Примеры молекулы клеточной поверхности, направленно распознающей раковый антиген, могут включать в себя рецептор клеточной поверхности, искусственный рецептор, фактор адгезии, направленно распознающий раковый антиген и могут предпочтительно включать в себя молекулу, которая дает возможность направленно маркировать рак посредством его экспрессии на клеточной поверхности, как например Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген и конститутивный андростановый рецептор (CAR), направленно распознающий раковый антиген, более предпочтительно TCR. TCR может быть гетеродимером, состоящим из альфа-цепи и бета-цепи (альфа-бета TCR) или может быть гетеродимером, состоящим из гамма-цепи и дельта-цепи (гамма-дельта TCR) до тех пор, пока TCR направленно распознает раковый антиген. Молекула клеточной поверхности, направленно распознающая раковый антиген, может опосредованно распознавать раковый антиген до тех пор, пока распознавание является направленным. Например, молекула (напр., антитело), направленно распознающая раковый антиген, вводится 11

субъекту комбинированно или одновременно с иммунокомпетентной клеткой согласно настоящему изобретению, и иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению способна избирательным путем, направленно распознавать раковый антиген, путем распознавания молекулы (напр., антитела) или распознавания метки, маркирующей молекулу (напр., антитело). В случае распознавания антитела примеры молекулы клеточной поверхности включают в себя CD16. Примеры метки, маркирующей молекулу (напр., антитело), включают в себя FITC.

[0019] Тип иммунокомпетентной клетки для IL-7 × CCL19-экспрессирующей иммунокомпетентной клетки согласно настоящему изобретению может быть любой клеткой, участвующей в иммунном ответе. Примеры этого могут включать в себя: лимфоидную клетку, такую как Т-клетку, естественную клетку-киллера (NK-клетку), и В-клетку; антигенпредставляющую клетку, такую как моноцит, макрофаг и дендритную клетку; и гранулоцит, такой как нейтрофил, эозинофил, базофил, и тучную клетку и может предпочтительно включать в себя выделенную T-клетку млекопитающего (напр., человека, собаки, кошки, свиньи или мыши), более предпочтительно выделенную T-клетку человека. В альтернативном варианте, Т-клетку можно получить путем изоляции и очистки из жидкости организма, такой как кровь или костный мозг, ткань селезенки, тимус, лимфатические узлы или подобное, или иммуноцита, проникающего в раковую ткань первичной опухоли, метастатической опухоли, ракового асцита или подобного. Можно использовать Т-клетку, полученную из ES-клетки или iPS-клетки. Примеры такой Т-клетки могут включать альфа-бета Т-клетку, гамма-дельта Т-клетку, CD8 + Т-клетку, CD4 + Т-клетку, Т-клетку-инфильтрирующую опухоль, Т-клетку памяти, наивную Т-клетку и естественную киллерную Т-клетку.

[0020] Примеры способа для генерирования IL-7 × CCL19-экспрессирующей иммунокомпетентной клетки согласно настоящему изобретению могут включать способ генерации, который включает 12

введение экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению, упомянутого ниже, в иммунокомпетентную клетку. В альтернативном варианте, примеры этого могут включать в себя способ генерации, который включает введение экспрессирующего вектора молекулы клеточной поверхности, направленно распознающей раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и/или CCL19 в оплодотворенную яйцеклетку, ES-клетку или iPS-клетку, и затем индуцирование экспрессии, и способ генерации, который включает в себя дальнейшее введение, если необходимо, экспрессирующего вектора молекулы клеточной поверхности, направленно распознающей раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и/или CCL19 в иммунокомпетентную клетку, полученную путем отделения от трансгенного млекопитающего, экспрессирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, с помощью генной трансфекции.

[0021] Примеры способа генерации, который включает введение экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению, упомянутого ниже, в иммунокомпетентную клетку, могут включать, но без конкретного ограничения, способ введения с помощью способа, известного в данной области техники, такого как способа вирусной инфекции, кальций-фосфатного способа, липофекции, микроинъекции и электропорации, и, предпочтительно, могут включать способ введения с помощью способа вирусной инфекции.

[0022] Примеры способа вирусной инфекции могут включать в себя способ, который включает трансфекцию упаковывающей клетки, такой как GP2-293 клетки (производится Takara Bio Inc.), Plat-GP клетки (производится Cosmo Bio Co., Ltd.), PG13 клетки (ATCC CRL-10686) или PA317 клетки (ATCC CRL-9078) с экспрессирующим вектором согласно настоящему изобретению и упаковывающего плазмида для получения рекомбинантного вируса и заражения иммунокомпетентной клетки рекомбинантным вирусом. Способ вирусной инфекции может быть 13

выполнен с использованием коммерчески доступного набора, такого как Retrovirus packaging Kit Eco (производится Takara Bio Inc.).

[0023] Иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению может быть получена путем интегрирования полинуклеотида, содержащего нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, IL-7 и CCL19 в геном клетки с использованием способа генной инженерии, известного в данной области техники, такой стимулятор может быть экспрессирован под контролем соответствующего стимулятора. Примеры способа генной инженерии, известного в данной области техники, включают в себя способ использования эндонуклеазы, такой как нуклеазы с цинковыми пальцами, TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции), системы CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)-Cas. В случае, когда иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению может экспрессировать дополнительный чужеродный белок, полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую дополнительный чужеродный белок, может быть аналогичным образом интегрирован в геном клетки с помощью метода генной инженерии так, что стимулятор может быть экспрессирован под контролем соответствующего стимулятора. Примеры способа интеграции полинуклеотида в геном клетки, так что стимулятор может быть экспрессирован под контролем соответствующего стимулятора, включают способ, который включает в себя интеграцию полинуклеотида, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую рак антиген, IL-7 и CCL19 (или дополнительный белок) функционально связаны после соответствующего стимулятора (то есть полинуклеотида, в котором кодирующие последовательности связаны так, что факторы (или дополнительный белок) могут быть выражены под контролем 14

стимулятора) в некодирующую область или подобную генома клетки; и способ, который включает в себя интеграцию полинуклеотида, содержащего нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, IL-7 и CCL19 (или дополнительный белок) после эндогенного стимулятора клеточного генома. Примеры эндогенного стимулятора включают стимуляторы TCRα и TCRβ.

[0024] IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению также может экспрессировать тимидин киназу вируса простого герпеса (HSV-TK) или индуцибельную каспазу 9, упомянутую ниже.

[0025] IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению экспрессирует молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, IL-7 и CCL19. Следовательно, IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению обладает высоким пролиферативным потенциалом, выживаемостью или способностью накапливать внутреннюю Т-клетку и применима к адоптивной иммунотерапии с использованием различных иммунокомпетентных клеток. Примеры адаптивной иммунотерапии включают, помимо прочего, терапию дендритной клеткой, терапию NK-клеткой, терапию гамма-дельта Т-клеткой, терапию альфа-бета Т-клеткой, терапию цитотоксическим Т-лимфоцитом и терапию инфильтрирующим опухоли лимфоцитом. Например, способ может включать введение экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению, упомянутого ниже, в иммунокомпетентную клетку, собранную у пациента, амплификацию иммунокомпетентной клетки и введение иммунокомпетентной клетки пациенту. Далее будут даны конкретные примеры, хотя настоящее изобретение не ограничено этим. Терапия дендритной клеткой содержит этап поглощения хирургически извлеченной 15

раковой ткани или ее лизата дендритной клеткой, дифференцированной из моноцита, собранного у пациента, и введение дендритной клетки в тело пациента, и может содержать этап введения экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению в дендритную клетку. В этом контексте эпитопный пептид молекулы ракового антигена также может быть искусственно синтезирован и использован вместо раковой ткани или лизата. Терапия NK-клеткой содержит этап обработки лимфоцитов, собранных у пациента, с множеством стимулирующих веществ, таких как IL-2, для активации и амплификации NK-клетки, которая затем вводится пациенту, и может содержать этап введения вектора согласно настоящему изобретению в NK-клетку. Можно ожидать, что совместное применение лекарственного средства антитела против рака с активированной NK-клеткой даст эффект эффективного воздействия на раковую клетку. Терапия гамма-дельта Т-клеткой содержит этап культивирования и стимуляции лимфоцитов, собранных у пациента с использованием IL-2 или золедроновой кислоты для амплификации гамма-дельта Т-клетки, которая затем вводится пациенту, и может содержать этап введения экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению в гамма-дельта Т-клетку. Терапия альфа-бета Т-клеткой содержит этап культивирования лимфоцитов, собранных у пациента с анти-CD3-антителом или IL-2 и введения активированной альфа-бета Т-клетки пациенту, и может содержать этап введения экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению в альфа-бета Т-клетку. Терапия цитотоксическим Т-лимфоцитом содержит этап стимуляции лимфоцитов, собранных у пациента с раковой клеткой, собранной у пациента, культивирование лимфоцитов путем добавления анти-CD3-антитела или IL-2 для амплификации цитотоксического Т-лимфоцита, направленно для раковой клетки, который затем вводится пациенту, и может содержать этап введения экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению в цитотоксический Т-лимфоцит. Антигенпредставляющая 16

клетка, которая представляет пептид эпитопа ракового антигена может также использоваться вместо раковой клетки. Терапия инфильтрирующим опухоли лимфоцитом содержит этап сбора лимфоцитов из раковой ткани, собранно у пациента, стимуляции и культивирования лимфоцитов с IL-2 или подобным и введения лимфоцитов пациенту, и может содержать этап введения экспрессирующего вектора согласно настоящему изобретению в лимфоцит.

[0026] Экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению представляет собой любой из следующих экспрессирующих векторов с (a) до (e) для генерирования IL-7 × CCL19-экспрессирующей иммунокомпетентной клетки согласно настоящему изобретению:

а) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(b) следующие два экспрессирующих вектора (b-1) и (b-2):

(b-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген; а также

(b-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(c) следующие два экспрессирующих вектора (c-1) и (c-2):

(c-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(c-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(d) следующие два экспрессирующих вектора (d-1) и (d-2): 17

(d-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(d-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; а также

(e) следующие три экспрессирующих вектора (e-1), (e-2) и (e-3):

(e-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген;

(e-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(e-3) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

[0027] Экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие другие регуляторные факторы иммунной функции, такие как IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, интерферон гамма, макрофагальный белок воспаления альфа, ГМ-КСФ, макрофагальный колониестимулирующий фактор, трансформирующий ростовой фактор бета, ФНО-альфа.

[0028] Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин 7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, могут включать в себя соответствующие нуклеиновые кислоты млекопитающих, а также могут предпочтительно включать в себя нуклеиновые кислоты человека. Соответствующие нуклеиновые кислоты могут быть надлежащим образом выбраны в зависимости от типа клетки, к которой вводится экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению. Данные о последовательности в этих 18

соответствующих нуклеиновых кислотах могут быть надлежащим образом получены путем поиска документа, известного в данной области техники, или базы данных, например, базы данных Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

[0029] Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, могут предпочтительно включать в себя нуклеиновую кислоту человека. Примеры такой нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, могут включать в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую Т-клеточный рецептор (TCR), или нуклеиновую кислоту, кодирующую конститутивный андростановый рецептор (CAR). Данная нуклеиновая кислота может быть нуклеиновой кислотой, полученной естественным способом, или искусственно синтезированной нуклеиновой кислотой и может быть надлежащим образом выбрана в зависимости от типа клетки, к которой вводится экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению. Данные о последовательности в данной нуклеиновой кислоте могут быть надлежащим образом получены путем поиска документа, известного в данной области техники, или базы данных, например, базы данных Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

[0030] Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, могут быть образованы способом, известным в данной области техники, таким как способ химического синтеза или способ ПЦР амплификации, исходя из данных о нуклеотидной последовательности в каждой кодирующей нуклеиновой кислоте. Выбранные кодоны для кодирующих аминокислот могут быть изменены в целях оптимизации экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. 19

[0031] TCR для нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR, может быть гетеродимером, состоящим из альфа-цепи и бета-цепи (альфа-бета TCR), или может быть гетеродимером, состоящим из гамма-цепи и дельта-цепи (гамма-дельта TCR). Нуклеиновая кислота, кодирующая альфа-бета TCR, содержит и нуклеиновую кислоту, кодирующую альфа-цепь TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую бета-цепь TCR. Нуклеиновая кислота, кодирующая гамма-дельта TCR, включает в себя и нуклеиновую кислоту, кодирующую гамма-цепь TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую дельта-цепь TCR.

[0032] Данные о последовательности в нуклеиновой кислоте, кодирующей TCR, могут быть выделены из нуклеиновых кислот альфа-цепи и бета-цепи как субъединиц TCR цитотоксических Т-лимфоцитов, индуцированных определенным антигенным пептидом с помощью способа, известного в данной области техники (международная публикация WO 2007/032255; Morgan с соавт., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Например, ПЦР предпочтительна для анализа TCR. Праймерами ПЦР для анализа TCR могут быть, например, праймер 5'-R (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3': последовательность №: 3) как праймер 5', праймер 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3': последовательность №: 4) специально для сегмента С альфа-цепи TCR, праймер 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3': последовательность №: 5) специально для сегмента С1 бета-цепи TCR, или праймер 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3': последовательность №: 6) специально для сегмента C2 бета-цепи TCR как праймер 3', при этом данный список праймеров не является исчерпывающим. Дериват TCR, демонстрируя высокую связывающую активность, может связываться с выбранной клеткой, представляющей антигенный пептид, и может произвольно медиировать in vivo и in vitro эффективное уничтожение выбранной клетки, представляющей антигенный пептид.

[0033] Нуклеиновая кислота, кодирующая TCR, является, например, нуклеиновой кислотой, кодирующей TCR, такой как TCR, специфичный 20

для MART1 (Cancer Res. 54, 5265-5268 (1994)), TCR, специфичный для MAGE-A3 (Anticancer Res., 20, 1793-1799 (2000)), TCR, специфичный для gp100 (J. Immunol. 170, 2186-2194 (2003)), TCR, специфичный для NY-ESO-1 (J. Immunol., 174, 4415-4423 (2005)), TCR, специфичный для WT1 (Blood, 106, 470-476 (2005)), TCR, специальный для MAGE-A1 (Int. Immunol., 8, 1463-1466 (1996)), или TCR, специфичный для P1A (Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. Cytotoxic T lymphocytes to an unmutated tumor antigen P1A: normal development but restrained effector function. J. Exp. Med. 189: 811) и может быть нуклеотидной последовательностью, которая на 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, наиболее предпочтительно 98% или более идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из TCR, описанных в документах, поскольку TCR может распознавать молекулу антигена, связанную с молекулой ГКГС, и может активировать Т-клетку. В нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из TCR, описанных в документах, устанавливается последовательность, кодирующая область, определяющую комплементарность, и может использоваться нуклеотидная последовательность, сохраняющая последовательность, кодирующую область, определяющую комплементарность, и имеющая последовательность, отличную от последовательности, кодирующей область, определяющую комплементарность, которая на 60% или более, предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 80% или более, еще более предпочтительно 90% или более, наиболее предпочтительно 95% или более идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей любой TCR, описанных в документах.

[0034] Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, могут включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность под № 1. Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, 21

может быть нуклеотидной последовательностью, которая на 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, наиболее предпочтительно 98% или более идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность под № 1, поскольку IL-7 повышает скорость производства клеток или показатель выживания клеток. Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, могут включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность под № 2. Может использоваться нуклеиновая кислота, которая на 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, наиболее предпочтительно 98% или более идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность под № 2, поскольку CCL19 оказывает на клетку хемоаттрактивное действие.

[0035] Экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую «суицидальный» ген. «Суицидальный» ген – это ген, выполняющий функцию прямого или второстепенного индуцирования вещества, являющегося цитотоксическим, и убивающий клетки, экспрессирующей этот «суицидальный» ген. Экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую «суицидальный» ген, регулирующую иммунокомпетентную клетку in vivo путем применения лекарственного средства, активирующего функцию суицидального гена в рамках курса онкотерапии, например, после исчезновения опухоли. В отличие от других цитокинов, IL-7 или CCL19 с меньшей долей вероятности вызывают синдром выброса цитокинов или опухолевую трансформацию трансгенной клетки в качестве побочной реакции. Тем не менее, вследствие усиления 22

функции иммунокомпетентной клетки, представленной с экспрессирующим вектором в настоящем изобретении, цитокин или его аналог, выброс которых производится при атаке на выбранную раковую ткань, могут неожиданно оказать воздействие на окружающие ткани. В этом случае экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую «суицидальный» ген, может эффективно снизить риск наступления синдрома выброса цитокинов.

[0036] Примеры «суицидального» гена могут включать в себя гены, кодирующие тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK) и индуцибельную каспазу 9, описанную в документах ниже. Примеры лекарственных средств, активирующих функцию этих генов, могут включать в себя ганцикловир для первого гена и соединение для CID (химической индукции димеризации) AP1903 для второго гена (Cooper LJ., с соавт., Cytotherapy. 2006; 8 (2): 105-17; Jensen M. C. с соавт., Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep; 16 (9): 1245-56; Jones BS. Front Pharmacol. 2014 Nov 27; 5: 254; Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8; 8 (2): 230-49; Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25; 6: 174).

[0037] В экспрессирующем векторе (а), который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, как в векторе согласно настоящему изобретению любая из нуклеиновых кислот может располагаться до или после других нуклеиновых кислот. В частности, в качестве примера берется случай содержания нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR, в качестве нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген. Экспрессирующий вектор может иметь нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, может иметь нуклеиновую 23

кислоту, кодирующую TCR, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, может иметь нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, может иметь нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, может иметь нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, или же может иметь нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, идущие сверху вниз.

[0038] В экспрессирующем векторе (b-2), который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, как в векторе согласно настоящему изобретению расположение нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, никак конкретно не ограничено, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, может располагаться как до, так и после нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7.

[0039] В экспрессирующем векторе (с-1), который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, как в векторе согласно настоящему изобретению расположение нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, никак конкретно не ограничено, и нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, может располагаться до или после нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген.

[0040] В экспрессирующем векторе (d-2), который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно 24

распознающую раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, как в векторе согласно настоящему изобретению расположение нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, никак конкретно не ограничено, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, может располагаться до или после нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген.

[0041] Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, могут соответственно транскрибироваться разными стимуляторами или могут транскрибироваться одним стимулятором с помощью внутреннего участка посадки рибозима (IRES) или саморасщепляющегося пептида 2А.

[0042] Экспрессирующий вектор согласно настоящему изобретению может содержать произвольную нуклеиновую кислоту между нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, в случае транскрипции данных нуклеиновых кислот одним стимулятором с помощью внутреннего участка посадки рибозима (IRES) или саморасщепляющегося пептида 2А, между нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, в случае содержания нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, между нуклеиновой кислотой, кодирующей альфа-цепь, и нуклеиновой кислотой, кодирующей бета-цепь, в случае содержания нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа-бета TCR, или между нуклеиновой кислотой, кодирующей гамма-цепь, и нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-цепь, в случае содержания нуклеиновой кислоты, кодирующей гамма-дельта TCR, поскольку 25

возможна экспрессия каждой нуклеиновой кислоты. Данные нуклеиновые кислоты предпочтительно связаны последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид (пептид 2А) или IRES, предпочтительной является последовательность, кодирующая пептид 2А. Связь с помощью этой последовательности обеспечивает эффективную экспрессию каждой нуклеиновой кислоты.

[0043] В случае содержания нуклеиновой кислоты, кодирующей «суицидальный» ген, положение «суицидального» гена никак конкретно не ограничено, и «суицидальный» ген может располагаться, например, посредством последовательности, кодирующей пептид 2А или IRES, после стимулятора для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, или нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, а также до или после каждой из этих нуклеиновых кислот, или может располагаться после другого стимулятора.

[0044] Пептид 2А – это полученный из вируса саморасщепляющийся пептид, характеризующийся тем, что G-P (расположение 1 остатка от С-конца) в аминокислотной последовательности под № 7 расщепляется в эндоплазматическом ретикулуме (Szymczak с соавт., Expert Opin. Biol. Ther. 5 (5): 627-638 (2005)). Поэтому нуклеиновые кислоты, соединенные для фланкирования пептида 2А, экспрессируются внутриклеточно независимо друг от друга.

[0045] Пептид 2А предпочтительно является пептидом 2А, полученным из пикорнавируса, ротавируса, вируса насекомых, Афтовируса или вируса Трипаносомы, наиболее предпочтительным является пептид 2А, полученный из пикорнавируса (F2A) и показанный в последовательности № 8.

[0046] Вектор экспрессирующего вектора, описанного в настоящем изобретении, может быть линейным или круговым, также это может быть невирусный вектор, например, плазмидный, вирусный или вектор на 26

основе транспозон. Такой вектор может содержать контрольные последовательности, такие как стимулятор и терминатор, и последовательность специфичного маркера, например, гена лекарственной устойчивости или гена-репортера. Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, функционально располагаются ниже последовательности стимулятора, поэтому каждая нуклеиновая кислота может быть успешно транскрибирована.

[0047] Примеры стимуляторов могут включать: стимуляторы на основе вирусов, такие как ретровирусный ДКП стимулятор, ранний стимулятор вируса SV40, цитомегаловирусный стимулятор, стимулятор тимидинкиназы вируса простого герпеса, а также стимуляторы генов млекопитающих, такие как стимулятор фосфоглицераткиназы (ФГК), стимулятор Xist, стимулятор β-актина и стимулятор РНК-полимеразы II. В качестве альтернативы могут использоваться тетрациклин-чувствительный стимулятор, индуцируемый тетрациклином, стимулятор Mx1, индуцируемый интерфероном, и т.п. Использование стимулятора, индуцированного определенным элементом в экспрессирующем векторе, описанном в настоящем изобретении, позволяет регулировать индукцию экспрессии IL-7 и CCL19 в ответ на курс онкотерапии.

[0048] В качестве примера вирусных векторов можно назвать ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы и векторы на основе адено-ассоциированного вируса, наиболее оптимальным может являться ретровирусный вектор, точнее вектор pMSGV (Tamada k с соавт., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) и вектор pMSCV (производится Takara Bio Inc.). Посредством ретровирусного вектора трансген интегрируется в геном клетки-хозяина и может стабильно экспрессироваться в течение длительного времени.

[0049] Для того, чтобы подтвердить ограничение экспрессирующего вектора, описанного в настоящем изобретении, в иммунокомпетентной клетке, например, экспрессия TCR может быть исследована методом 27

проточной цитометрии, нозерн-блоттинга, саузерн-блоттинга, ПЦР, например, ПЦР с обратной транскрипцией, ИФА или вестрн-блоттинга, когда экспрессирующий вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и экспрессия маркерного гена, включенного в экспрессирующий вектор, описанный в настоящем изобретении, может быть исследована, когда экспрессирующий вектор содержит маркерный ген.

[0050] Когда экспрессирующий вектор, содержащийся в IL-7 × CCL19-экспрессирующей иммунокомпетентной клетке, описанной в настоящем изобретении, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, вариабельный участок TCR, который должен быть экспрессирован, располагается вне клетки. Иммунокомпетентная клетка, экспрессирующая TCR, имеющая такой вариабельный участок TCR, способна распознать молекулу антигена, связанную с молекулой ГКГС.

[0051] Противоопухолевое средств, описанное в настоящем изобретении, не имеет конкретного ограничения, поскольку противоопухолевое средство содержит IL-7 × CCL19-экспрессирующую иммунокомпетентную клетку, и фармацевтически приемлемую добавку. В качестве примеров добавки можно указать физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, среду для культивирования клеток, декстрозу, воду для инъекций, глицерин, этиловый спирт и их комбинацию, стабилизатор, растворитель и поверхностно-активное вещество, буферное вещество, антисептик, регулятор тоничности, наполнитель и смазывающее вещество.

[0052] Противоопухолевое средство, описанное в настоящем изобретении, может вводиться объекту исследования, нуждающемуся в онкотерапии, способом, известным специалистам в данной области. Примеры способов введения: внутривенно, внутриопухолево, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, интраперитонеально, внутриартериально, интрамедуллярно, интракардиально, внутрисуставно, интрасиновиально, 28

интракраниально, интратекально, субарахноидально (спинномозговая жидкость).

[0053] Количество IL-7 × CCL19-экспрессирующих иммунокомпетентных клеток, описанных в настоящем изобретении, содержащееся во вводимом противоопухолевом средстве, может соответствующим образом регулироваться с учетом типа, места поражения и степени тяжести ракового заболевания, возраста, веса и состояния объекта исследования, получающего лечение, и т.п. Образцы могут включать преимущественно от 1 × 104 до 1 × 1010 клеток, более оптимальное количество — от 1 × 105 до 1 × 109 клеток, еще более оптимальное — от 5 × 106 до 5 × 108 клеток в однократной дозе.

[0054] Например, противоопухолевое средство для введения может вводиться отдельно 4, 3, 2 или 1 раз в сутки, с интервалом в 1, 2, 3, 4 или 5 суток, один раз в неделю, с интервалом в 7, 8 или 9 суток, два раза в неделю, один раз в месяц или два раза в месяц.

[0055] Формы рака, для лечения которых может применяться противоопухолевое средство, описанное в настоящем изобретении, либо указанный ниже способ онкотерапии, — солидный рак или рак крови. Примеры: раковые заболевания, такие как аденокарцинома, плоскоклеточный рак, железисто-плоскоклеточный рак, недифференцированный рак, крупноклеточный рак, мелкоклеточный рак, рак кожи, рак молочной железы, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак влагалища, рак шеи, рак матки, рак печени, рак почек, рак поджелудочной железы, рак селезенки, рак легких, рак трахеи, рак бронхов, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, рак желудка, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак яичка, рак яичника; рак костной ткани, хрящевой ткани, жировой ткани, мышечной ткани, сосудистой ткани, кроветворной ткани; саркомы, такие как хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная гемангиоэндотелиома, злокачественная невринома, остеосаркома и саркома мягких тканей; бластомы, такие как гепатобластома, 29

медуллобластома, нефробластома, нейробластома, панкреатобластома, плевролегочная бластома и ретинобластома; эмбриональная опухоль; лимфома; и лейкемия.

[0056] Противоопухолевое средство, описанное в настоящем изобретении, может применяться в сочетании с дополнительным противоопухолевым средством. Примеры дополнительного противоопухолевого средства: алкириующие препараты, такие как циклофосфамид, бендамустин, ифосфамид и дакарбазин; антиметаболиты, такие как пентостатин, флударабин, кладрибин, метотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин и эноцитабин; препараты молекулярно-таргетного действия, такие как ритуксимаб, цетуксимаб и трастузумаб; ингибиторы киназы, такие как иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дасатиниб, сунитиниб и траметиниб; ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб; ингибиторы кальциневрина, такие как циклоспорин и такролимус; противоопузолевые антибиотики, такие как идарубицин, доксорубицин и митомицин С; алкалоиды растительного происхождения, такие как иринотекан и этопозид; платиносодержащие препараты, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; гормональные препараты, такие как тамоксифен и бикалутамид; а также иммунорегуляторы, такие как интерферон, ниволумаб и пембролизумаб, при этом наиболее оптимальными могут быть алклириующий препарат и антиметаболит.

[0057] Примеры способа «применения противоопухолевого средства, описанного в настоящем изобретении, в сочетании с дополнительным противоопухолевым средством» могут включать способ, при котором дополнительное противоопухолевое средство применяется в лечении после использования противоопухолевого средства, описанного в настоящем изобретении, способ, при котором противоопухолевое средство, описанное в настоящем изобретении, применяется параллельно с дополнительным противоопухолевым средством, а также способ, при котором лечение противоопухолевым средством, описанным в настоящем 30

изобретении, осуществляется после применения дополнительного противоопухолевого средства, при этом наиболее оптимальным может быть способ, предусматривающий использование дополнительного противоопухолевого средства после противоопухолевого средства, описанного в настоящем изобретении. Совместное применение противоопухолевого средства, описанного в настоящем изобретении, и дополнительного противоопухолевого средства усилит терапевтическое действие на опухоль и позволит также уменьшить побочное действие каждого из противоопухолевых средств за счет снижения частоты введения или дозы противоопухолевого средства. Кроме того, дополнительное противоопухолевое средство может входить в состав противоопухолевого средства, описанного в настоящем изобретении.

[0058] Примеры альтернативного объекта 1 настоящего изобретения могут включать: 1) способ лечения рака, предусматривающий введение пациентам, нуждающимся в онкотерапии, иммунокомпетентной клетки, экспрессирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19, 2) иммунокомпетентную клетку, экспрессирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19 для использования в качестве противоопухолевого средства и 3) использование иммунокомпетентной клетки, экспрессирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19 для получения противоопухолевого средства.

[0059] Примеры альтернативного объекта 2 настоящего изобретения могут включать в себя набор для генерации иммунокомпетентной клетки, экспрессирующей молекулу клеточной поверхности, направленно распознающей раковый антиген интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19, включающий в себя экспрессирующий вектор, описанный в настоящем изобретении. Набор не имеет конкретного ограничения, поскольку он 31

содержит экспрессирующий вектор, описанный в настоящем изобретении. В набор может входить инструкция по генерации IL-7 × CCL19-экспрессирующей иммунокомпетентной клетки, описанной в настоящем изобретении, и реагент, используемый при введении экспрессирующего вектора, описанного в настоящем изобретении, в иммунокомпетентную клетку.

Пример 1

[0060] (Выбор регуляторных факторов иммунной функции)

По меньшей мере, несколько сотен различных типов молекул, способных регулировать функцию Т-клеток, существуют in vivo. Опираясь на ранее осуществленные открытия или опыты, авторы изобретения первыми выбрали из огромного числа комбинаций IL-7 и CCL19 в качестве регуляторных молекул для усиления иммунорегулирующего действия иммунокомпетентных клеток, а также выбрали комбинацию этих двух молекул, т.е. комбинацию IL-7 и CCL19, а не отдельные молекулы. Авторы изобретения генерировали вектор для экспрессии данных регуляторных факторов иммунной функции иммунокомпетентной клетки.

[0061] (Генерирование экспрессирующего вектора для экспрессии IL-7 и CCL19 - 1)

Фрагмент ДНК CAR с FITC-антителом (последовательность № 9), кодирующий CAR с FITC-антителом, состоящий из антитела FITC scFv, трансмембранной области CD8 мыши и внутриклеточных сигнальных мотивов CD28-4-1BB-CD3ζ мыши, фрагмент ДНК F2A-MCS (последовательность № 10), кодирующий пептид 2А (F2A), показанный в последовательности № 8, и сайт множественного клонирования (MCS), следующий за пептидом, и фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 (последовательность № 11), кодирующий мышиный IL-7 (без стоп-кодона) и F2A и мышиный CCL19, следующий за мышиным IL-7, были синтезированы искусственно (Life Technologies Corp.). 32

[0062] В целях генерирования вектора для экспрессии IL-7 и CCL19 фрагмент ДНК CAR с FITC-антителом и фрагмент ДНК F2A-MCS были соединены для получения структуры CAR с FITC-антителом – F2A-MCS. Затем полученная структура была клонирована в ретровирусный экспрессирующий вектор pMSGV (Tamada k с соавт., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) для создания вектора pMSGV, содержащего структуру CAR с FITC-антителом – F2A-MCS. Фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 был включен в MCS вектора pMSGV путем обработки и лигирования рестрикционным ферментом (NsiI и SalI) для получения вектора pMSGV, содержащего структуру CAR с FITC-антителом –F2A-IL-7-F2A-CCL19 (IL-7 × CCL19-экспрессирующий вектор (1)). Карта полученного вектора представлена на Фиг. 1. Кроме того, фрагмент ДНК CAR с FITC-антителом был клонирован в ретровирусный экспрессирующий вектор pMSGV для создания вектора pMSGV, не содержащего IL-7 и CCL19, используемого в качестве контрольного (контрольный вектор (1)).

[0063] (Генерирование ретровируса, индуцированного IL-7 × CCL19-экспрессирующим вектором)

Для трансдукции мышиных Т-клеток был генерирован ретровирус. Пакующая клеточная линия GP2-293 (производится Takara Bio Inc.) была трансфицирована вышеуказанным IL-7 × CCL19-экспрессирующим вектором (1) или контрольным вектором (1) и плазмидом pCL-Eco (производится Imgenex Corp.) с использованием Липофектамина 2000 или 3000 (производится Life Technologies Corp.) для генерирования ретровируса, индуцированного с IL-7 × CCL19-экспрессирующим вектором (1) или контрольным вектором (1).

[0064] В качестве среды для культивирования клеток GP2-293 использовалась среда DMEM, дополненная 10% ФТС, 100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. В качестве среды для культивирования Т-клеток в нижеприведенных Примерах использовался раствор RPMI-1640, дополненный 10% ФТС, 100 ед./мл пенициллина, 100 33

мг/мл стрептомицина, 50 ммоль/л 2-меркаптоэтанола и 2 ммоль/л L-глутамина.

[0065] (Трансдукция мышиных Т-клеток)

Для трансдукции мышиных Т-клеток 3 × 106 очищенных мышиных Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов были активированы на 48 часов посредством иммобилизованного антитела CD3 mAb (3 мкг/мл) и IL-2 (100 МЕД/мл). После этого супернатант, содержащий полученный таким образом ретровирус, индуцированный IL-7 × CCL19-экспрессирующим вектором (1) или контрольным вектором (1), был смешан с вышеуказанными активированными мышиными Т-клетками (1 × 106 клеток/мл) в чашке, покрытой реагентом RetroNectin(R) с концентрацией 25 мкг/мл (производится Takara Bio Inc.). После центрифугирования на скорости 1500 об./мин. в течение 2 часов клетки выращивались в течение 6 часов в присутствии IL-2 (100 МЕД/мл). Для удаления ретровируса из культуральной среды мышиные Т-клетки были выделены, перенесены в свежую питательную среду (RPMI), содержащую IL-2 (100 МЕД/мл), и выращивание продолжалось в течение 42 часов до получения мышиных Т-клеток, индуцированных IL-7 × CCL19-экспрессирующим вектором (1) (IL-7/CCL19-экспрессирующие Т-клетки (1)), или мышиных Т-клеток, индуцированных контрольным вектором (1) (контрольные Т-клетки (1)).

[0066] (Генерирование экспрессирующего вектора для экспрессии IL-7 и CCL19 - 2)

Вектор pMSGV, содержащий последовательность CAR с человеческим антителом CD20-F2A-IL-7-F2A-CCL19 (IL-7 × CCL19-экспрессирующий вектор (2)) был генерирован в порядке, изложенном в предыдущем разделе «Генерирование экспрессирующего вектора для экспрессии IL-7 и CCL19 - 1», с тем лишь отличием, что при генерировании IL-7 × CCL19-экспрессирующего вектора (1), описанного выше, последовательность области scFv антитела FITC, входящая в последовательность № 9, была заменена последовательностью scFv 34

человеческого антитела CD20 (последовательность № 12), синтезированной Life Technologies Corp. на основе последовательности ритуксимаба. Аналогичным образом, вектор pMSGV, не содержащий IL-7 и CCL19 (контрольный вектор (2)), был генерирован в порядке, изложенном в предыдущем разделе «Генерирование экспрессирующего вектора для экспрессии IL-7 и CCL19 - 1», с тем лишь отличием, что при генерировании контрольного вектора (1), описанного выше, последовательность области scFv антитела FITC, входящая в последовательность № 9, была заменена последовательностью scFv человеческого антитела CD20 (последовательность № 12). IL-7 × CCL19-экспрессирующий вектор (2) или контрольный вектор (2) были перенесены в мышиные Т-клетки посредством ретровируса таким же образом, как при генерации IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток (2) или контрольных Т-клеток (2).

Пример 2

[0067] (Количество клеток и жизнеспособность IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток)

Исследование проводилось для определения того, будут ли IL-7 или CCL19, продуцированные IL-7/CCL19-экспрессирующими T-клетками, выполнять биологическую функцию и демонстрировать эффект стимулирования иммунитета. Образец, содержащий сгенерированные IL-7/CCL19-экспрессирующие T-клетки (2) (4 × 105 клеток) или контрольные T-клетки, культивировался 5 дней. Культивирование проводилось без антигенной стимуляции при помощи CD20, чтобы исключить воздействие CD20 CAR человека на экспрессию IL-7 и CCL19. Затем количество клеток и жизнеспособность проверялись при помощи трипанового синего. Результаты показаны на Фиг. 2A и 2B. На Фиг. 2A показано количество клеток, а на Фиг. 2B показана жизнеспособность. В темной колонке 35

показаны результаты для IL-7/CCL19-экспрессирующих T-клеток, а в светлой колонке показаны результаты для контрольных T-клеток.

[0068] (Результаты)

Как показано на Фиг. 2A и 2B, количество клеток и жизнеспособность IL-7/CCL19-экспрессирующих T-клеток (2) были приблизительно в 5 раз и приблизительно в 2 раза, соответственно, выше количества клеток и жизнеспособности контрольных T-клеток (2). Данные результаты продемонстрировали, что при применении IL-7/CCL19-экспрессирующих T-клеток, подготовленных путем введения экспрессирующего вектора, описанного в настоящем изобретении, в T-клетки, IL-7 или CCL19 выполняет биологическую функцию и демонстрирует эффект стимулирования иммунитета.

Пример 3

[0069] [Тест миграции Т-клеток]

(Тест миграции Т-клеток с использованием IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток)

Хемоаттрактивное действие CCL19 исследовалось при помощи теста миграции клеток с использованием Transwell. Миграционные свойства иммуноотвечающих T-клеток оценивались при помощи миграции через поликарбонатный фильтр с размером пор, равным 5 мкм, с использованием 96-луночных камер Transwell(R) (Costar, производство Corning, Inc.). А именно, IL-7/CCL19-экспрессирующие Т-клетки (1) или контрольные Т-клетки (1) культивировались в нижней камере. Культивирование проводилось без антигенной стимуляции при помощи FITC, чтобы исключить воздействие FITC CAR на экспрессию IL-7 и CCL19. Иммуноотвечающие T-клетки были подготовлены из селезенки или лимфатических узлов посредством негативного отбора при помощи MACS (производство Miltenyi Biotec GmbH). Иммуноотвечающие T-клетки были промаркированы синим CytoTell (производство AAT Bioquest, 36

Inc.) и культивированы в течение 3 часов в верхней камере. Миграция из верхней камеры в нижнюю камеру была исследована методом проточной цитометрии (EC800; производство Sony Corp.), и для анализа данных было использовано программное обеспечение FlowJo (производство Tree Star, Inc.). Результаты показаны на Фиг. 3. На Фиг. 3 в темной колонке показаны результаты для IL-7/CCL19-экспрессирующих T-клеток (1), а в светлой колонке показаны результаты для контрольных T-клеток (1), ордината показывает абсолютное количество иммуноотвечающих T-клеток, которые мигрировали в нижнюю камеру. Статистически значимая разница исследовалась при помощи критерия Стьюдента.

[0070] (Результаты)

Как показано на Фиг. 3, IL-7/CCL19-экспрессирующие T-клетки (1) позволяли T-клеткам мигрировать в нижнюю камеру приблизительно в 1,8 раза чаще по сравнению с контрольными T-клетками (1). При лечении переносом лимфоцитов (т.е. T-клеток), урон, наносимый раковым клеткам введенными T-клетками важен в соответствии с установленной процедурой, и кроме того, важно активировать эндогенные T-клетки (= иммуноциты хозяина), изначально присутствующие у пациента, больного раком, и тем самым использовать эти клетки как клетки, атакующие раковые клетки. Поэтому предпочтительно не только переносить лимфоциты, отличающиеся антиопухолевой активностью, извне, но также способствовать активному взаимодействию между перенесенными T-клетками и эндогенными T-клетками при помощи определенно подхода, чтобы эндогенные T-клетки аккумулировались ближе к раковым клеткам с точки зрения усиления иммунотерапевтического эффекта. Как видно из результатов на Фиг. 3, IL-7/CCL19-экспрессирующие T-клетки (1) были способны накапливать внутренние T-клетки, демонстрируя таким образом, что активное взаимодействие между перенесенными T-клетками и эндогенными T-клетками можно индуцировать. 37

[0071] Результаты, отображенные на Фиг. 2A, 2B, и 3, демонстрируют, что T-клетки, экспрессирующие IL-7 и CCL19, обладают важными эффектами, незаменимыми для стимулирования иммунитета, эффективной пролиферации с помощью IL-7, обладания высокой жизнеспособностью и аккумулирования T-клеток с помощью CCL19, а также обладают отличным иммуностимулирующим эффектом. Иными словами, было показано, что экспрессия двух регуляторных молекул, т.е. "IL-7" и "CCL19", в иммунокомпетентных клетках позволяет улучшить пролиферативный потенциал, жизнеспособность и иммуностимулирующий эффект иммунокомпетентных клеток. Более того, как указано выше, T-клетки, экспрессирующие L-7 и CCL19, обладают всем пролиферативным потенциалом, выживаемостью и способностью накапливать T-клетки, предполагающими возможность того, что эти T-клетки обладают эффектом инфильтрации в пораженные раком ткани на T-клетках или дендритных клетках, а также эффектом замедления роста опухоли.

Пример 4

[0072] [Генерирование экспрессирующего вектора IL-7 × CCL19 × HSV-TK]

Нуклеотидная последовательность, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие ген IL-7, ген CCL19 и «суицидальный» ген HSV-TK, расположены последовательно с тем, чтобы фланкировать нуклеотидную последовательность, кодирующую саморасщепляющийся пептид, пептид 2A, может клонироваться в сайт множественного клонирования вектора pMSGV1 для генерирования вектора для экспрессии IL-7, CCL19 и HSV-TK. Карта этого вектора показана на Фиг. 4.

[0073] Иммунокомпетентные клетки, вводимые со сгенерированным таким образом экспрессирующим вектором IL-7 × CCL19 × HSV-TK, способны регулировать иммунокомпетентные клетки в объекте 38

исследования путем применения ганцикловира к объекту исследования, которому ввели иммунокомпетентные клетки.

Пример 5

[0074] [Генерирование экспрессирующего вектора TCR × IL-7 × CCL19]

Нуклеотидная последовательность, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие ген TCR, ген IL-7 и ген CCL19, расположены последовательно с тем, чтобы фланкировать нуклеотидную последовательность, кодирующую саморасщепляющийся пептид, пептид 2A, может клонироваться в сайт множественного клонирования вектора pMSGV1 для генерирования вектора для экспрессии TCR, IL-7 и CCL19. Карта этого вектора показана на Фиг. 5.

[0075] Иммунокомпетентные клетки, вводимые со сгенерированным таким образом экспрессирующим вектором TCR × IL-7 × CCL19, могут, в особенности, связываться не только с раковым антигеном, расположенным на поверхности раковой клетки, но и с комплексом пептида, полученным из ракового антигена, представленным ГКГС в раковых клетках, и могут индуцировать Т-клетки специально для более широкого спектра опухолеассоциированных молекул-мишеней.

Пример 6

[0076] [Генерирование экспрессирующего вектора для экспрессии IL-7, CCL19 и eGFP]

Фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19, кодирующий мышиный IL-7 (без стоп-кодона) и F2A и мышиный CCL19, следующий за мышиным IL-7, был синтезирован искусственно (Life Technologies Corp.).

[0077] В целях генерирования вектора для экспрессии IL-7, CCL19 и eGFP синтезированный таким образом фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 был включен в MCS ретровирусного экспрессирующего вектора pMSGV с последовательностью F2A-eGFP (Tamada k с соавт., Clin Cancer Res 18: 39

6436-6445 (2002)) путем обработки и лигирования рестрикционным ферментом (NcoI и EcoRI) для получения вектора pMSGV, содержащего фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP (последовательность №: 13) (экспрессирующий вектор IL-7 × CCL19 (3)). Карта полученного вектора представлена на Фиг. 6. Кроме того, в качестве контрольного вектора был сгенерирован вектор pMSGV, содержащий pMSGV и не содержащий ни IL-7, ни CCL19 (контрольный вектор (3)). В последовательности № 13 положения нуклеотидов 1-462 представляют собой нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 (положения нуклеотидов 1-75 представляют собой сигнальную последовательность IL-7), положения нуклеотидов 463-537 представляют собой нуклеиновую кислоту, кодирующую F2A, положения нуклеотидов 538-861 представляют собой нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19 (положения нуклеотидов 538-612 представляют собой сигнальную последовательность CCL19), положения нуклеотидов 868-942 представляют собой нуклеиновую кислоту, кодирующую F2A, положения нуклеотидов 946-1662 представляют собой нуклеиновую кислоту, кодирующую eGFP, и положения нуклеотидов 1663-1665 представляют собой стоп-кодон. Аминокислотная последовательность, соответствующая нуклеотидной последовательности № 13, показана в последовательности № 14. Чтобы использовать рестрикционный фермент NcoI, тимин (t) в положении 4 нуклеотида в последовательности № 13 был заменен гуанином (g) (фенилаланин (F) в положении 2 аминокислоты в последовательности № 14 был заменен валином (V)).

[0078] [Генерирование Т-клеток, экспрессирующих P815 опухолевый антиген P1A-специфичный TCR, IL-7, CCL19 и eGFP]

Клетки селезенки были собраны из трансгенной мыши, экспрессирующей H-2Ld-рестриктированный TCR, специфичный для P815 опухолевого антигена P1A (Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189: 811) полученные от Y. Liu. Мышиные T-клетки, экспрессирующие P815 опухолевые антигены P1A-специфичные 40

TCR, полученные из клеток селезенки (P1A-специфичная TCR T-клетка) были получены. Затем ретровирус, введенный с экспрессирующим вектором IL-7 × CCL19 (3) или контрольным вектором (3), был сгенерирован так же, как в Примере 1. Клетки, активированные P1A-пептидом в течение 48 часов, были трансдуцированы с клетками селезенки (3 × 106 клеток/лунку) включая P1A-специфичную TCR T-клетку для получения P1A-специфичных TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующих Т-клетки или P1A-специфичных TCR/eGFP-экспрессирующих Т-клетки. Трансдукция с каждым экспрессирующим вектором была подтверждена анализом проточной цитометрии для обнаружения eGFP в качестве суррогатного маркера. Соответствующие уровни экспрессии eGFP полученных Т-клеток составляли от 70 до 80% во всех опытах.

[0079] На день 0, 5 × 105 клеток мастоцитомы P815, суспендированных в 0,1 мл HBSS, были подкожно инокулированы в боковую область живота каждому 6-10 недельному самцу мыши DBA/2 (n = 30). На день 6, мыши были облучены сублетальной доза (3-5 Гр) для предварительной обработки. На день 7, мыши были разделены на 3 группы (n = 10). P1A-специфичные TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующие Т-клетки или P1A-специфичные TCR/eGFP-экспрессирующие Т-клетки (оба типа клеток были от 70 до 80% eGFP-положительными) были введены внутривенно по 1 × 106 клеток для каждой мыши. Затем была проанализирована выживаемость каждой мыши, при этом объемы опухоли мертвых мышей были измерены. Результаты анализа выживаемости каждой мыши показаны на фиг. 7, а результаты измерения объемов опухоли мертвых мышей показаны на фиг. 8.

[0080] На Фиг. 7 ▲ означает результаты по интактным мышам, ■ означает результаты по мышам, получившим P1A-специфичные TCR/eGFP-экспрессирующие Т-клетки, ● означает результаты по мышам, получившим P1A-специфичные TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующие Т-клетки, абсцисса представляет собой количество дней (день) после 41

подкожной инокуляции мастоцитомы P815, а ордината показывает процент выживаемости (%). 80% мышей, получивших P1A-специфичные TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующие Т-клетки, выжили даже на день 60, 50% мышей выжили даже через 100 дней. Таким образом, было показано, что использование иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих P1A-специфические TCR, IL-7 и CCL19, оказывает противоопухолевое действие и подавляет снижение выживаемости, вызванное опухолью.

[0081] На Фиг. 8 абсцисса представляет собой количество дней (день) после подкожной инокуляции мастоцитомы P815, а ордината показывает объем опухоли (мм3). Как видно из Фиг. 8, увеличение объема опухоли было заметно подавлено у мышей, получивших P1A-специфичные TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующие Т-клетки, что свидетельствует о том, что P1A-специфичные TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующие Т-клетки обладают превосходной противоопухолевой активностью и оказывают терапевтический эффект на твердый рак.

Промышленная применимость

[0082] IL-7 × CCL19-экспрессирующая иммунокомпетентная клетка согласно настоящему изобретению обладает всем пролиферативным потенциалом, степенью выживаемости и способностью накапливать лимфоцит и в связи с этим применима в области иммунотерапии.

1. Т-клетка для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, экспрессирующая Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19.

2. Т-клетка для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, по п. 1, в которой Т-клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, введенную внутрь клетки извне, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, введенную внутрь клетки извне.

3. Т-клетка для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, по п. 1 или 2, где раковым антигеном является WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Сурвивин, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, GD2 или GM2.

4. Т-клетка для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, экспрессирующая химерный антиген рецептор (CAR), направленно распознающий раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19, где раковым антигеном является WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Сурвивин, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, GD2 или GM2.

5. Экспрессирующий вектор для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с любым из пп. 1-3, представляющий собой следующий вектор (а):

а) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, направленно распознающую раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

6. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с любым из пп. 1-3, представляющий собой следующие векторы (b-1) и (b-2):

(b-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген;

(b-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

7. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с любым из пп. 1-3, представляющий собой следующие векторы (c-1) и (c-2):

(c-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7;

(c-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

8. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с любым из пп. 1-3, представляющий собой следующие векторы (d-1) и (d-2):

(d-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7;

(d-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

9. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с любым из пп. 1-3, представляющий собой следующие векторы (e-1), (e-2) и (e-3):

(e-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген;

(e-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(e-3) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

10. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с п. 4, представляющий собой следующие векторы (b'-1) и (b-2):

(b'-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антиген рецептор (CAR), направленно распознающий раковый антиген;

(b-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

11. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с п. 4, представляющий собой следующие векторы (c'-1) и (c-2):

(c'-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, направленно распознающий раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7;

(c-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

12. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с п. 4, представляющий собой следующие векторы (d-1) и (d'-2):

(d-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(d'-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, направленно распознающий раковый антиген, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

13. Набор векторов для генерирования Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, в соответствии с п. 4, представляющий собой следующие векторы (e'-1), (e-2) и (e-3):

(e'-1) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, направленно распознающий раковый антиген;

(e-2) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; а также

(e-3) экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

14. Экспрессирующий вектор или экспрессирующие векторы по любому из пп. 5-13, где по меньшей мере один вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую «суицидальный» ген.

15. Противоопухолевое средство, содержащее Т-клетку для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, по пп. 1-4 и фармацевтически приемлемую добавку.

16. Способ получения Т-клетки для лечения рака, ассоциированного с раковым антигеном, экспрессирующей Т-клеточный рецептор, направленно распознающий раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19, при этом способ включает введение экспрессирующего вектора или экспрессирующих векторов по пп. 5-9 в Т-клетку.

17. Способ получения Т-клетки для лечения рака, экспрессирующей химерный антиген рецептор (CAR), направленно распознающий раковый антиген, интерлейкин 7 (IL-7) и CCL19, при этом способ включает введение экспрессирующего вектора или экспрессирующих векторов по пп. 10-13 в Т-клетку.