Холодоадаптированная живая аттенуированная вакцина с удаленным фактором вирулентности, подходящая для доставки через слизистые оболочки
Изобретение относится к биотехнологии. Предложены композиции и способы получения живой аттенуированной вакцины против гриппа, подходящей для назального введения. В данной вакцине применяется холодоадаптированный вирус гриппа, не содержащий фактора вирулентности, содержащий мутации, обеспечивающие способность к репликации, достаточную для производства вакцины. Вакцины, полученные указанным способом, обеспечивают существенную перекрестную защиту от штаммов, не использованных для вакцинации. Указанная вакцина безопасна для детей в возрасте до 2 лет и взрослых людей в возрасте более 49 лет. Кроме того, указанный холодоадаптированный вирус с делетированным фактором вирулентности можно адаптировать с целью получения иммунитета от возбудителей других заболеваний, кроме гриппа. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 12 ил.
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №62/324134, поданной 18 апреля 2016 г. Указанные и все другие внешние материалы полностью включены в настоящий документ посредством ссылок. Если определение или использование термина в источнике, включенном посредством ссылки, не соответствует или противоречит определению указанного термина в настоящем документе, следует употреблять определение указанного термина, представленное в настоящем документе.
Область изобретения
[0002] Область настоящего изобретения представляет собой вакцины, конкретно - вакцины, обеспечивающие безопасность от вирусных заболеваний.
Уровень техники
[0003] Следующее описание включает информацию, которая может быть полезна для понимания настоящего изобретения. Это утверждение не является признанием, что какая-либо информация, представленная в настоящем документе, представляет собой предшествующий уровень техники или имеет отношение к настоящему изобретению, или что какая-либо явным или косвенным образом цитируемая публикация представляет собой предшествующий уровень техники.
[0004] Ежегодные эпидемии и пандемии гриппа представляют собой значительную нагрузку на здравоохранение с учетом значительной смертности из-за осложнений. По расчетным данным, ежегодно 5-10% взрослых и 20-30% детей заражаются сезонными вирусами гриппа. У 2-5 миллионов человек среди этих зараженных развивается тяжелое заболевание, причем каждый год имеет место 500000 смертельных случаев. Это представляет собой глобальную значительную нагрузку на здравоохранение.
[0005] Вакцинация с применением вакцины от гриппа считается наиболее эффективным способом ослабления нагрузки от заболевания и смертности, вызванной сезонным гриппом, а также профилактики дальнейших/будущих пандемий у человека. В настоящее время на рынке существует два типа вакцин от гриппа - субъединичные (т.е. не содержащие жизнеспособный вирус) вакцины (доступные от нескольких производителей) и холодоадаптированные аттенуированные (т.е. содержащие живой вирус) вакцины (например, Flumist® производства Medimmune®). Давно известно, что у обоих подходов к получению вакцины существуют недостатки.
[0006] Современные субъединичные вакцины от гриппа невозможно изготовить за короткое время, и поэтому их применимость ограничена при реагировании на быстро распространяющиеся штаммы. Например, во время пандемии 2009 г. для доставки первой партии вакцины для человека потребовалось около 9-12 месяцев. Кроме того, хорошо известно, что субъединичные вакцины характеризуются плохой иммуногенностью. Это в особенности верно для пожилых людей и маленьких детей. Кроме того, субъединичные вакцины обычно ограничены конкретными подтипами. Они обычно характеризуются неудовлетворительной или полной неэффективностью по отношению к защите от подтипов вируса в пределах генотипа или между генотипами. В результате существует срочная потребность в более иммуногенных вакцинах, которые могут формировать повышенный титр нейтрализующих антител против распространенных эпитопов вируса и обеспечивать защиту как против вирусов того же генотипа, так и подтипов.
[0007] В противоположность этому, современные холодоадаптированные живые аттенуированные вакцины (LAIV) обладают улучшенной иммуногенностью по сравнению с субъединичными вакцинами. В то же время такие живые аттенуированные вакцины на данный момент утверждены для применения только у людей в возрасте от 2 до 49 лет из-за потенциального увеличения вирусной нагрузки у лиц младше 2 лет или старше 49 лет). К сожалению, такая вакцина имеет наибольшее значение именно для очень маленьких и пожилых людей. Кроме того, следует принимать во внимание, что на основании предварительных данных CDC с 2013 по 2016 гг. составы LAIV демонстрировали относительно недостаточную или пониженную эффективность. Это ограничивает преимущества вакцин против гриппа для наиболее нуждающихся в них групп населения. Быстрое производство дешевых, массовых и эффективных вакцин (способных индуцировать надежный иммунный ответ) важно для лечения и профилактики гриппа, в частности, сезонного гриппа у маленьких детей и пожилых людей.
[0008] С момента первого документального подтверждения инфекции вируса гриппа птиц H5N1 у человека в Гонконге в 1997 г. сообщалось об инфекции других подтипов вируса гриппа птиц, в том числе H9N2, H7N7, H6N1, H7N9, H5N6 и H10N8 у людей в странах, где эти подтипы вируса гриппа птиц циркулируют среди домашней птицы. Среди этих распространяющихся вирусов гриппа с 2003 г. выявлено 858 случаев инфекции вируса H5N1 у человека в 16 странах, причем 453 из них привели к смертельному исходу (http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/2017_03_16_table H5N1.pdf?ua=1). Все публикации включены в настоящий документ посредством ссылок в той же степени, как если бы было явным образом указано, что каждая отдельная публикация или заявка на патент включена в настоящий документ посредством ссылки. Если определение или использование термина во включенном источнике не соответствует или противоречит определению указанного термина в настоящем документе, употребляют определение указанного термина, представленное в настоящем документе, а определение указанного термина в источнике не употребляют.
[0009] Хотя вирус H5N1 и его производные (H5N6 и H5N2) продолжают распространяться и вызывать инфекции у человека, распространение вируса H7N9 в Китае в 2013 г. также привело к более чем тысяче случаев заболевания у человека, приблизительно 30% которых привели к смертельному исходу (http://www.wpro.who.int/outbreaks_emergencies/H7N9/en/). Спорадические случаи инфекции H7N9 продолжают появляться в Китае, и есть опасения, что этот подтип может представлять собой большую угрозу потенциальной пандемии, чем вирус H5N1. Кроме того, в Китае сообщалось об инфекции других распространяющихся подтипов вируса гриппа птиц, например, H10N8 и H6N1, у человека. Существуют опасения, что некоторые из этих подтипов могут подвергаться дальнейшей адаптации к человеку или стать реассортантами с вирусом сезонного гриппа и вызвать новую пандемию.
[0010] Опыт пандемии H1N1 2009 г. показал, что получение вакцины для вакцинации людей иногда занимает более 6 месяцев с появления вируса до доступности вакцины для населения. Разработка современных вакцин против гриппа не соответствует требованиям с точки зрения природы быстрого распространения пандемического гриппа. Несомненно, в будущем произойдут новые пандемии, хотя предсказать их временные сроки и подтип вируса невозможно.
[0011] Живые аттенуированные вакцины против гриппа с улучшенной иммуногенностью могут соответствовать требованиям к сезонным и пандемическим вакцинам. У живых аттенуированных вакцин против гриппа есть несколько преимуществ перед субъединичными или инактивированными вакцинами. Прежде всего, живые аттенуированные вакцины могут индуцировать у реципиентов улучшенный иммунный ответ. Во-вторых, для иммунизации может потребоваться меньшее количество живой аттенуированной вакцины. Наконец, аттенуированные живые вакцины против гриппа можно легко применять посредством назального введения. Однако современные аттенуированные вакцины против гриппа не могут обеспечить полной защиты и не утверждены для применения в группах очень маленьких и пожилых людей, которые наиболее нуждаются в них.
[0012] Кроме того, описаны попытки применения в вакцинах вирусов гриппа, холодоадаптированных посредством пересева при пониженных температурах. Например, в патенте США 7758867, выданном Seong, описано применение в вакцинах холодоадаптированного штамма вируса, несущего шесть копий генома вируса гриппа H1N1. Все публикации, указанные в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылок в той же степени, как если бы было явным образом указано, что каждая отдельная публикация или заявка на патент включена в настоящий документ посредством ссылки. Если определение или использование термина во включенном источнике не соответствует или противоречит определению указанного термина в настоящем документе, употребляют определение указанного термина, представленное в настоящем документе, а определение указанного термина в источнике не употребляют. Аналогичным образом, в патенте США №8282937, выданном Maassab и Herlocher, описано применение холодоадаптированных вирусов гриппа H1N1, несущих некоторые указанные мутации, в качестве инструмента для получения вакцин против эндемичных вирусов гриппа. В то же время неясно, обеспечивают ли такие холодоадаптированные вирусы долговременную защиту от штаммов вируса гриппа, не принадлежащих к исходному серотипу.
[0013] В патенте США №8591914, выданном Yang и Kemble, описаны поливалентные вакцины, полученные с использованием реассортантных вирусов гриппа, в качестве потенциального подхода к иммунизации против нескольких серотипов гриппа, и отмечено, что такие реассортантные штаммы могут быть холодоадаптированными. В то же время неясно, может ли такой подход обеспечить надлежащую безопасность для групп очень маленьких и пожилых людей.
[0014] Таким образом, сохраняется потребность в безопасной и эффективной аттенуированной вакцине, подходящей для применения при профилактике инфекций у человека, особенно инфекций вируса гриппа.
Сущность изобретения
[0015] Сущность изобретения заключается в аппаратуре, системах и способах получения аттенуированного и холодоадаптированного вируса гриппа, не содержащего фактора вирулентности, но эффективно размножающегося при производстве вакцины. Такой вирус можно применять для производства вакцины, подходящей для вакцинации путем назального применения. Указанная вакцина безопасна для лиц в возрасте менее 2 лет и старше 49 лет и обеспечивает значительную перекрестную защиту. Аттенуированный и холодоадаптированный вирус также можно адаптировать посредством генетических модификаций с целью получения защиты от возбудителей других заболеваний, кроме гриппа.
[0016] Один вариант реализации концепции настоящего изобретения представляет собой мутированный вирус гриппа для получения вакцины. Указанный вирус содержит геном вируса гриппа H1N1, включающий делецию активности фактора вирулентности, первый набор из одной или более мутаций, придающих способность к репликации при 37°С в отсутствие активности фактора вирулентности, и второй набор из одной или более мутаций, придающих способность к репликации вируса при температуре ниже 35°С. Делеция активности фактора вирулентности может включать делецию по меньшей мере части гена фактора вирулентности. Такая делеция может представлять собой делецию по меньшей мере части гена NS1, распространяющуюся за пределы нуклеотидов 57-528 сегмента NS1 мутированного вируса. Первый набор из одной или более мутаций может включать одну или более из точечных мутаций, которые могут придавать способность к репликации и лежать за пределами области М мутированного вируса гриппа H1N1 (например, мутацию G346A в геноме вируса гриппа H1N1). Второй набор из одной или более мутаций может включать одну или более из точечных мутаций, например, мутацию Т261G или A310G в геноме вируса гриппа H1N1.
[0017] Такой мутированный вирус гриппа также может включать третий набор из одной или более мутаций, придающих способность к репликации при температуре ниже 35°С. Эти мутации могут включать одну или более из точечных мутаций, отличающихся от указанного второго набора мутаций, например, мутации T261G или A310G в геноме вируса гриппа H1N1. Мутированный вирус гриппа может демонстрировать пониженную способность к репликации при температуре 37° или выше по сравнению с температурой 35°С или ниже.
[0018] В некоторых вариантах реализации мутированный вирус гриппа включает инсерцию гена, кодирующего экзогенный антиген. Такой экзогенный антиген может происходить от организма, патогенного для человека, например, вируса (например, вируса гриппа, вируса ТОРС, вируса MERS, вируса Зика, вируса гепатита, папилломавируса и вируса Эбола), бактерии, гриба и/или паразита. В других вариантах реализации мутированный вирус гриппа включает инсерцию гена, кодирующего эндогенный антиген, ассоциированный с болезненным состоянием, например, антиген высокого канцерогенного риска и тау-белок, ассоциированный с болезнью Альцгеймера.
[0019] Еще один вариант реализации концепции настоящего изобретения представляет собой мутированный вирус гриппа, описанный выше, причем указанный мутированный вирус гриппа подходит для применения в составе живой аттенуированной вакцины. Такая живая аттенуированная вакцина подходит для вакцинации посредством воздействия живой аттенуированной вакцины на слизистую оболочку.
[0020] Еще один вариант реализации концепции настоящего изобретения представляет собой живую аттенуированную вакцину, содержащую геном вируса гриппа модифицирован H1N1, включающий делецию фактора вирулентности, первый набор из одной или более мутаций, придающих способность к репликации в отсутствие активности фактора вирулентности, и второй набор из одной или более мутаций, придающих способность к репликации вируса при температуре ниже 35°С. Модифицированный вирус гриппа H1N1 присутствует в вакцине в достаточных количествах для получения протективного эффекта после иммунизации. Вакцина содержит среду-носитель и составлена с учетом поддержки вакцинации посредством контакта слизистой оболочки с живой аттенуированной вакциной. В некоторых вариантах реализации делеция активности фактора вирулентности включает делецию по меньшей мере части гена фактора вирулентности, например, делецию по меньшей мере части гена NS1, распространяющуюся за пределы нуклеотидов 57-528 сегмента NS1 мутированного вируса. В некоторых вариантах реализации первый набор из одной или более мутаций включает первый набор из одной или более из точечных мутаций, которые обеспечивают способность к репликации; указанные мутации могут лежать за пределами области М модифицированного вируса гриппа H1N1 (например, мутация G346A в геноме вируса гриппа H1N1). В некоторых вариантах реализации второй набор из одной или более мутаций включает второй набор из одной или более из точечных мутаций, например, мутации T261G и/или A310G в геноме вируса гриппа H1N1. Модифицированный вирус, используемый в живой аттенуированной вакцине согласно концепции настоящего изобретения, может включать третий набор из одной или более мутаций, обеспечивающих репликацию при температуре ниже 35°С, например, мутации T261G и/или A310G в геноме вируса гриппа H1N1. Такой мутированный вирус гриппа демонстрирует пониженную способность к репликации при температуре 37° или выше по сравнению с температурой 35°С или ниже.
[0021] В некоторых вариантах реализации аттенуированная вакцина содержит мутированный вирус гриппа, содержащий инсерцию гена, кодирующего экзогенный антиген, например, организма, патогенного для человека. Примеры подходящих организмов, патогенных для человека, включают вирус (например, вирус гриппа, вирус ТОРС, вирус MERS, вирус Зика, вирус гепатита, папилломавирус и вирус Эбола), бактерию, гриб и/или паразит. В других вариантах реализации аттенуированная вакцина содержит мутированный вирус гриппа, включающий инсерцию гена, кодирующего эндогенный антиген, ассоциированный с болезненным состоянием, например, антиген высокого канцерогенного риска и/или тау-белок.
[0022] Как отмечено выше, вакцина в соответствии с концепцией настоящего изобретения может содержать среду-носитель. В некоторых вариантах реализации указанная среда-носитель содержит адъювант и/или усилитель иммунного ответа. Примеры подходящих усилителей иммунного ответа включают агонисты TLR-7, например, имиквимод.
[0023] Вследствие по меньшей мере частичной потери фактора вирулентности и адаптации к пониженным температурам живая аттенуированная вакцина безопасна для людей в возрасте младше двух лет и/или старше 49 лет. Живая аттенуированная вакцина эффективно обеспечивает по меньшей мере 20% выживаемость на животной модели после введения высокой летальной дозы патогенного организма, по отношению к которому указанная живая аттенуированная вакцина обеспечивает защиту, причем такое введение имеет место по меньшей мере через две недели после интраназальной вакцинации животной модели живой аттенуированной вакциной.
[0024] Еще один вариант реализации концепции настоящего изобретения представляет собой способ получения модифицированного вируса гриппа, подходящего для применения в составе живой аттенуированной вакцины. Такой способ включает делецию активности фактора вирулентности в вирусе гриппа H1N1 с целью получения первого мутированного вируса; размножение указанного первого мутированного вируса в линии клеток млекопитающего при температуре 37° или выше с получением способного к репликации второго мутированного вируса, включающего первый набор из одной или более мутаций, и размножение второго мутированного вируса в системе на основе яйца птицы при температуре менее 35°С с получением холодоадаптированного третьего мутированного вируса, содержащего второй набор из одной или более мутаций. В некоторых вариантах реализации делеция активности фактора вирулентности включает делецию по меньшей мере части гена фактора NS1, причем указанная делеция распространяется за пределы нуклеотидов 57-528 сегмента NS1. В некоторых вариантах реализации первый набор из одной или более мутаций представляет собой первый набор из одной или более из точечных мутаций, которые придают способность к репликации и могут лежать за пределами области М мутированного вируса гриппа H1N1 (например, мутация G346A в геноме вируса гриппа H1N1). Второй набор из одной или более мутаций представляет собой второй набор из одной или более из точечных мутаций, например, мутации T261G и/или A310G в геноме вируса гриппа H1N1. В некоторых вариантах реализации третий мутированный вирус включает третий набор из одной или более мутаций, отличающийся от второго набора из одной или более мутаций и придающий способность к репликации при температуре ниже 35°С, например, мутации T261G и/или A310G в геноме вируса гриппа H1N1. Третий мутантный вирус может демонстрировать пониженную способность к репликации при температуре 37° или выше по сравнению с температурой 35°С или ниже.
[0025] Некоторые варианты реализации включают этап инсерции в вирус гриппа H1N1 гена, кодирующего экзогенный антиген. В таких вариантах реализации указанный экзогенный антиген может происходить от организма, патогенного для человека, например, вируса (например, вируса гриппа, вируса ТОРС, вируса MERS, вируса Зика, вируса гепатита, папилломавируса и вируса Эбола), бактерии, гриба и/или паразита. В других вариантах реализации выполняют инсерцию гена, кодирующего эндогенный антиген, ассоциированный с болезненным состоянием, например, антиген высокого канцерогенного риска и/или тау-белок.
[0026] Различные цели, признаки, аспекты и преимущества предмета настоящего изобретения станут более очевидными из подробного описания предпочтительных вариантов реализации, приведенного ниже вместе с сопроводительными фигурами, на которых аналогичные цифры обозначают аналогичные компоненты.
Краткое описание чертежей
[0027] На фиг. 1 схематически изображен типичный процесс получения способного к репликации холодоадаптированного вируса гриппа DelNS1 (холодоадаптированного CA04-DelNS1).
[0028] На фиг. 2 изображены данные секвенирования, демонстрирующие мутацию в NP в положении G346A (D101N), которая, как обнаружено, поддерживает репликацию вируса DelNS1 в клетках MDCK и оплодотворенных яйцах курицы, несмотря на делецию фактора вирулентности.
[0029] На фиг. 3 изображены данные секвенирования, демонстрирующие мутации в NEP в положениях T261G (L79V) и A310G (E95G), которые, как обнаружено, поддерживают репликацию холодоадаптированного вируса DelNS1.
[0030] На фиг. 4 графически отображены ростовые свойства холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 при 33°С и 39°С.
[0031] На фиг. 5 показаны фотографии, демонстрирующие размер бляшек холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1, культивированного при различных температурах.
[0032] На фиг. 6 показаны данные, имеющие отношение к защите посредством вакцины в соответствии с концепцией настоящего изобретения при летальной стимуляции вирусом PR8 (H1N1), адаптированного к мыши.
[0033] На фиг. 7 показаны данные, имеющие отношение к защите посредством вакцины в соответствии с концепцией настоящего изобретения при летальной стимуляции вируса A/Vietnam/1194/04 (H5N1).
[0034] На фиг. 8 показаны данные, имеющие отношение к защите посредством вакцины в соответствии с концепцией настоящего изобретения при высоколетальной стимуляции вирусом A/Vietnam/1194/04 (H5N1).
[0035] На фиг. 9 показаны данные, имеющие отношение к защите посредством вакцины в соответствии с концепцией настоящего изобретения при высоколетальной стимуляции вирусом A/Zhejiang/1/RG/2013 (H7N9) после однократной иммунизации с помощью назальных капель.
[0036] На фиг. 10 показаны данные, имеющие отношение к защите посредством вакцины в соответствии с концепцией настоящего изобретения при высоколетальной стимуляции вирусом A/Zhejiang/1/RG/2013 (H7N9) после двукратной иммунизации с помощью назальных капель.
[0037] На фиг. 11 показаны данные, имеющие отношение к защите против MERS посредством иммунизации холодоадаптированным вирусом гриппа DelNS1, несущим ген, кодирующий антиген MERS, согласно концепции настоящего изобретения.
[0038] На фиг. 12 показаны фотографии гистологии легкого мышей, обработанных Adv-РР4, получивших холодоадаптированный вирус гриппа DelNS1, несущий ген антигена MERS, в качестве вакцины, или PBS в качестве вакцины, после инфекции коронавируса MERS.
Подробное описание изобретения
[0039] Следующее описание включает информацию, которая может быть полезна для понимания настоящего изобретения. Это утверждение не является признанием, что какая-либо информация, представленная в настоящем документе, представляет собой предшествующий уровень техники или имеет отношение к настоящему изобретению, или что какая-либо явным или косвенным образом цитируемая публикация представляет собой предшествующий уровень техники. В следующем обсуждении предложено большое количество типичных вариантов реализации предмета настоящего изобретения. Хотя каждый вариант реализации представляет собой одну комбинацию элементов настоящего изобретения, считается, что предмет настоящего изобретения включает все возможные комбинации описанных элементов. Так, если один вариант реализации включает элементы А, В и С, а второй вариант реализации включает элементы В и D, то считается, что предмет настоящего изобретения также включает остальные комбинации А, В, С или D, даже если они не описаны явным образом.
[0040] Предмет настоящего изобретения описывает разработку мутаций, имеющих важное значение для эффективной репликации вируса DelNS1, а также мутации, обеспечивающей холодовую адаптацию вируса DelNS1. NS1 представляет собой ген вирулентности вирусов гриппа, причем белок NS1 играет важную роль в противодействии противовирусному ответу хозяина и поддержке репликации вируса. Эффективная репликация, обеспечиваемая этими специфическими мутациями, имеет важное значение для высокого уровня продукции вируса, что является важным элементом для разработки вакцины против гриппа. Холодовая адаптация вируса, используемого для иммунизации, обеспечиваемая этими специфическими мутациями, облегчает применение в качестве аттенуированной живой вакцины, например, вакцины, которую удобно и безопасно вводить через дыхательные пути (например, назально или путем ингаляции).
[0041] В настоящем изобретении также описана разработка вакцины на основе вновь открытого и разработанного вируса. В настоящем изобретении также описана улучшенная безопасность, а также, как ни странно, высокая эффективность указанной вновь разработанной вакцины. Авторы настоящего изобретения предполагают, что вакцину на основе вируса DelNS1, несущего указанные специфические мутации, также можно безопасно применять у людей в возрасте младше двух лет и старше 50 лет.
[0042] Следует принимать во внимание, что описанные методики обеспечивают большое количество выгодных технических эффектов, в том числе улучшенную защиту против различных штаммов гриппа и улучшенный профиль безопасности для популяций очень маленьких детей и пожилых лиц.
[0043]
[0044] Кроме того, следует принимать во внимание, что удобство интраназального введения или нанесения на слизистые (при обеспечении защиты без дискомфорта, ассоциированного с инъекциями) сопряжено с описанной улучшенной безопасностью и эффективностью/защитой от различных штаммов вируса гриппа, в частности, при дополнительном применении усилителя иммунного ответа. Подходящие усилители иммунного ответа включают агонисты TLR-7. В предпочтительном варианте реализации усилитель иммунного ответа представляет собой имиквимод (который, как продемонстрировано, дополнительно усиливает иммунный ответ на вакцины против гриппа). Применение такого интраназального введения или нанесения на слизистые дополнительно повышает общую полезность и защиту населения в целом, включая популяции очень маленьких детей (т.е. младше 2 лет) и пожилых лиц (т.е. старше 49 лет).
[0045] В некоторых вариантах реализации цифры, отражающие количественные характеристики ингредиентов, свойств, например, концентрации, условий реакции и т.д., используют для описания и утверждения того, что следует понимать, что определенные варианты реализации настоящего изобретения в некоторых случаях подвергаются модификации посредством использования термина «приблизительно». Соответственно, в некоторых вариантах реализации численные параметры, заданные в письменном описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут меняться в зависимости от желательных свойств, которые должны быть получены в конкретном варианте реализации. В некоторых вариантах реализации численные параметры следует рассматривать с учетом количества приведенных значимых знаков и применения обычных способов округления. Хотя численные диапазоны и параметры, задающие широкие рамки некоторых вариантов реализации настоящего изобретения, представляют собой приближенные значения, численные значения, заданные в конкретных примерах, приведены как можно точнее. Численные значения, представленные в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, могут одержать определенные ошибки, неизбежно возникающие с учетом стандартного отклонения, найденного при соответствующих измерениях в ходе тестирования.
[0046] В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают упоминание множественного числа, если контекст не указывает на иное явным образом. Кроме того, в настоящем описании значение слова «в» включает значения «в» и «на», если иное не следует из контекста явным образом.
[0047] Указание диапазонов значений в настоящем документе предназначено исключительно для использования в качестве способа сокращенной записи каждого отдельного значения, входящего в указанный диапазон. Если в настоящем документе не указано иное, каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно приведено в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, можно выполнять в любом порядке, если иное не указано в настоящем документе или не следует из контекста явным образом. Использование всевозможных примеров или типичных выражений (например, выражения «такой, как») осуществляется по отношению к определенным вариантам реализации исключительно для лучшего освещения настоящего изобретения и не вводит ограничений сущности настоящего изобретения, если не указано иное. Ни одно выражение в описании не следует рассматривать в качестве обозначения элемента, не предусмотренного формулой изобретения и необходимого для осуществления изобретения.
[0048] Группировка альтернативных элементов или вариантов реализации изобретения, описанных в настоящем документе, не должна истолковываться в качестве ограничений. Каждый член группы может упоминаться и указываться по отдельности или в любой комбинации с другими членами группы или другими элементами, присутствующими в настоящем документе. Один или более из членов группы можно включить в группу или убрать из нее в целях удобства и/или патентоспособности. При таком включении или удалении считается, что описание в настоящем документе содержит указанную модифицированную группу и за счет этого соответствует письменному описанию всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
[0049] В некоторых вариантах реализации концепции настоящего изобретения экспрессия фактора вирулентности штаммом вируса, используемым для иммунизации, может быть понижена и/или устранена. В предпочтительном варианте реализации это сопровождается полной или частичной делецией гена фактора вирулентности (например, гена, кодирующего белок NS1). Примером штамма вируса гриппа с удаленным фактором вирулентности является DellNSl, из которого вырезан интрон, кодирующий белок NS1. Такая делеция неизбежно оказывает вредоносный эффект на способность полученного вируса к репликации и размножению. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что пересев на линию клеток млекопитающего при 37°С приводит к размножению таких вирусов гриппа с удаленным фактором вирулентности за счет дополнительных мутаций, придающих способность к эффективной репликации в отсутствие фактора вирулентности. Такие мутации могут уникальным образом поддерживать репликацию в отсутствие гена фактора вирулентности.
[0050] Хотя отсутствие вирулентности со способностью к репликации является полезной особенностью вируса гриппа, предназначенного к применению в качестве вакцины, могут быть полезны дополнительные особенности, способные снизить вероятность системной инфекции после введения вируса. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что последующий пересев вируса, несущего такую мутацию - делецию фактора вирулентности, при пониженных температурах (например, в оплодотворенных яйцах курицы при 30°) позволяет выделить холодоадаптированный вирус DelNS1. Репликация таких холодоадаптированных штаммов гриппа ингибируется при нормальных температурах организма (например, 37°С), что эффективно изолирует реплицирующиеся популяции в областях организма с относительно низкой температурой (например, полости носа).
[0051] Обнаружено, что такие холодоадаптированные вирусы DelNS1 являются авирулентными и способны обеспечивать более эффективную защиту от летального введения вирусов других подтипов, чем предшествующая (т.е. доступная для приобретения) холодоадаптированная живая аттенуированная вакцина против гриппа. Поскольку элемент вирулентности удален из генома такого холодоадаптированного вируса DelNS1 и указанный вирус дополнительно адаптирован к репликации при более низкой температуре, чем штамм вируса, содержащийся в предшествующей аттенуированной вакцине против гриппа, вакцина, полученная с использованием вирусов согласно концепции настоящего изобретения, является более безопасной и может применяться в наиболее уязвимых популяциях - пожилых лиц и маленьких детей.
[0052] Конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что пересев вируса гриппа, сконструированного путем делеции гена вирулентности (например, NS1), на линию клеток млекопитающего (например, клетки MDCK) при обычных температурах (например, 37°С) может привести к появлению мутаций, поддерживающих эффективную репликацию вируса, несмотря на отсутствие фактора вирулентности. Авторы настоящего изобретения дополнительно обнаружили, что пересев такого мутированного вируса на клетки хозяина (например, клетки оплодотворенных яиц) при пониженных температурах (т.е. менее 37°С) может привести к появлению дополнительных мутаций, обуславливающих холодовую адаптацию. Такие пониженные температуры могут составлять приблизительно 35°С, приблизительно 33°С, приблизительно 30°С, приблизительно 27°С или менее 27°С.
[0053] В настоящем изобретении предложена аппаратура, системы и способы, за счет которых получают вакцинный штамм, который может преодолеть ограничения современных вакцин против гриппа и будет соответствовать требованиям популяции, нуждающейся в защите от сезонного гриппа, и готовности к пандемиям. Такие вакцины можно разработать с использованием живого аттенуированного вируса, несущего мутации, которые: (1) удаляют фактор вирулентности, (2) обеспечивают эффективную репликацию в отсутствие фактора вирулентности и (3) обеспечивают холодовую адаптацию. Концепция настоящего изобретения включает три компонента. Во-первых, был разработан аттенуированный вирус гриппа DelNS1 (например, вирус гриппа с удаленным неструктурным геном 1), который неожиданно включал новую мутацию в сегменте генома М, обеспечивавшую воспроизведение вируса в отсутствие фактора вирулентности. Такое эффективное воспроизведение имеет важное значение для практического производства вакцины против гриппа. Во-вторых, неожиданно обнаружили, что такой мутантный вирус можно дополнительно адаптировать к пониженным температурам. Это позволило разработать серию новых мутаций, обеспечивших холодовую адаптацию вируса гриппа с удаленным фактором вирулентности. Такая холодовая адаптация могла обеспечить возможность эффективной доставки вакцинного препарата вируса через дыхательные пути или слизистую оболочку. Еще более неожиданной оказалась способность штамма вируса, разработанного за счет такого продолжительного процесса модификации (т.е. делеции NS1 и холодовой адаптации за счет вновь открытых мутаций), по-прежнему продуцировать высокий титр вируса; эта особенность крайне полезна для получения вакцины. Наконец, за счет такой двойной модификации и холодовой адаптации, обеспечивших возможность применения вакцины, полученной с использованием такого сильно модифицированного вируса, посредством интраназальной доставки, авторы изобретения обнаружили, что вакцина, полученная указанным образом, демонстрировала превосходный профиль безопасности в исследованиях на животных, неожиданно улучшенную перекрестную реакционную способность против других (т.е. не использованных для иммунизации) штаммов гриппа, и повышенную эффективность по сравнению с предшествующим золотым стандартом интраназальной вакцины (в том числе единственной интраназальной вакциной против гриппа, доступной для людей).
[0054] Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что иммуногенность такой вакцины против гриппа по отношению как к тому же штамму, так и к другим разновидностям можно усилить за счет сопутствующего применения имиквимода. Применение имиквимода и аналогичных соединений для усиления иммуногенности различных вакцинных композиций описано в предварительной заявке на патент США №62/194136, поданной 17 июля 2015 г.
[0055] В одном варианте реализации концепции настоящего изобретения вирус гриппа, модифицированный путем делеции фактора вирулентности с последующей разработкой по меньшей мере одной мутации, обеспечивающей эффективную репликацию в отсутствие фактора вирулентности, и по меньшей мере одной дополнительной мутации, обеспечивающей холодовую адаптацию, служит носителем или «основой» для инсерции одного или более генов, происходящих от патогенного организма, не являющегося вирусом гриппа. Такой модифицированный вирус может служить основой живой аттенуированной вакцины, обеспечивающей клинически эффективную защиту от и/или лечение инфекции патогенного организма, не являющегося вирусом гриппа. В предпочтительном варианте реализации такую вакцину можно эффективно вводить через слизистую оболочку. Примеры подходящих патогенных организмов, не являющихся вирусом гриппа, включают ТОРС, MERS, вирус Зика, вирус гепатита, папилломавирус, вирус Эбола и др. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что инсерцию домена RBD MERS в такую модифицированную основу вируса гриппа можно применять для получения вакцины, вводимой назальным путем и обеспечивающей защиту от инфекции MERS у ОРР4-трансдуцированных мышей. Таких ОРР4-трансдуцированных мышей широко используют в качестве модели мыши для разработки вакцин против MERS. Авторы настоящего изобретения также успешно внедрили домен RBD вируса Зика в такую модифицированную основу вируса гриппа. Хотя выше отмечено применение вирусных антигенов, в такую модифицированную основу вируса гриппа в целях применения в вакцинных препаратах также можно внедрять гены, кодирующие антигены бактерий, простейших, грибов и/или паразитических организмов. Кроме того, предполагается, что в такой вектор можно внедрять и экспрессировать другие мишени иммунной системы, в том числе эндогенные антигены (т.е. антигены человека), ассоциированные с болезненными состояниями (например, антиген высокого канцерогенного риска и/или тау-белок). В таком качестве указанную платформу можно применять в качестве вакцины против рака (терапевтически и/или профилактически) при первичной профилактике и/или предотвращении рецидива рака, или, в качестве альтернативы, для лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний, ассоциированных с бляшками тау-белка.
[0056] С помощью методологии согласно настоящему изобретению можно разработать различные мутации. Например, мутации A14U и G917A, расположенные в сегменте М генома вируса гриппа, могут поддерживать репликацию вируса DelNS1 A/WSN/33 (H1N1) и DelNS1 H7N9, соответственно, несмотря на делецию части гена фактора вирулентности NS1. В то же время следует принимать во внимание, что можно применять мутации в других частях вирусного генома, кроме сегмента М. Например, в некоторых вариантах реализации концепции настоящего изобретения мутация в сегменте NP генома вируса гриппа может поддерживать репликацию вируса гриппа с вырезанным интроном, кодирующим фактор вирулентности NS1. Такие вирусы DelNS1 авирулентны для мышей и могут обеспечивать перекрестную защиту от различных подтипов вируса гриппа. Мутации, придающие аналогичные свойства, можно разработать на основе текущих сезонных циркулирующих штаммов вируса гриппа (например, штамма вируса 2009 H1N1, ставшего одним из вирусов сезонного гриппа, циркулирующих у людей, с пандемии 2009 г.).
[0057] В одном варианте реализации концепции настоящего изобретения из такого штамма 2009 H1N1 A/California/04/09 разработан штамм DelNS1, в котором удалена значительная часть или весь интрон, кодирующий NS1 (например, распространяющаяся за пределы сегмента, охватываемого нуклеотидами 57-528). С использованием способов согласно концепции настоящего изобретения разработали штамм такого вируса гриппа DelNS1 с мутацией G345A в области NP, обеспечивающей эффективную репликацию вируса DelNS1 в культуре клеток и в яйцах. Как ни странно, эта новая адаптивная мутация отличалась от мутаций в области М вирусов DelNS1 A/WSN/33 и H7N9 и ранее не регистрировалась в качестве мутации в вирусах гриппа DelNS1.
[0058] С использованием вируса DelNS1 2009 H1N1, способного к репликации и происходящего от штамма A/California/04/09, способы согласно концепции настоящего изобретения позволили успешно получить холодоадаптированные вакцинные штаммы DelNS1 H1N1, например, холодоадаптированный CA4-DelNS1. Неожиданно оказалось, что эта двойная модификация может позволить получить вирус гриппа, продуцирующий высокий титр вируса, например, титр вируса в диапазоне, который можно адаптировать для получения вакцины. Следует принимать во внимание, что предыдущая (т.е. коммерциализированная) живая аттенуированная вакцина против гриппа (например, Flumist®) основана на свойствах холодовой адаптации "основы", происходящей от штамма вируса H2N2 (A/Ann Arbor/6/60). Холодоадаптированные живые аттенуированные вакцины, происходящие от этой основы, утверждены FDA только для применения в возрастной группе от 2 до 49 лет. В ограничительных целях FDA ссылается на опасения по поводу применения в этих возрастных группах и в группах с некоторыми основными заболеваниями, поскольку единственным аттенуирующим фактором является только наличие у данного вакцинного штамма мутаций, ограничивающих репликацию при повышенных температурах в нижних дыхательных путях. К сожалению, указанные возрастные группы характеризуются относительно высокой смертностью при инфекции гриппа. Следует принимать во внимание, что для субъектов, получающих вакцины, разработанные в соответствии с концепцией настоящего изобретения, предложен двойной механизм защиты, поскольку мутация DelNS1 в новом вакцинном штамме в комбинации с мутациями, обуславливающими холодовую адаптацию, обеспечивает повышенный уровень безопасности без ущерба для эффективности.
[0059] Как отмечено выше, пересев штаммов вируса гриппа DelNS1 с мутацией, обеспечивающей репликацию, в оплодотворенных яйцах при низких температурах (т.е. менее 37°С) позволяет разработать мутации, обуславливающие холодовую адаптацию. Существуют различные мутации, которые можно применять в таком качестве. Например, новые мутации в NEP - T261G и A310G ассоциированы с функцией холодовой адаптации вакцинного штамма DelNS1 H1N1. Следует отметить, что эти мутации отличаются от мутаций, присутствующих в штамме А/Ann Arbor/6/60, используемом в качестве основы для предыдущей коммерциализированной живой аттенуированной вакцины. Неожиданно оказалось, что такой холодоадаптированный вирус DelNS1 H1N1 (например, вирус Са4- DelNS1) способен к эффективной репликации, и можно разработать протокол, обеспечивающий стабильную репликацию вакцинного штамма такого вируса в оплодотворенных яйцах. Неожиданно оказалось, что можно достичь уровня репликации, аналогичного уровню репликации вируса дикого типа в яйцах.
[0060] Оказалось, что такие мутации холодовой адаптации обуславливают выгодные ростовые ограничения холодоадаптированного вируса гриппа DelNS1 при повышенных (например, физиологических) температурах. Например, обнаружено, что такой вирус реплицируется при 30-33°С, но его рост ограничен при 37-39°С, что указывает на возможность ограничения репликации холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 при повышенных температурах, например, 37-39°С. Такие ростовые ограничения указывают, что холодоадаптированные вирусы гриппа Del1NSl согласно концепции настоящего изобретения подходят для применения живой аттенуированной вакцины, в частности, в качестве живых аттенуированных вакцинных штаммов, которые можно эффективно вводить путем нанесения на ткань слизистой оболочки. Обнаружено, что вакцинные составы, полученные с применением холодоадаптированного DelNS1 согласно концепции настоящего изобретения, не оказывают видимого патогенного действия на мышей.
[0061] Как показано ниже, вакцины, полученные с использованием холодоадаптированного вируса гриппа DelNS1 согласно концепции настоящего изобретения, обеспечивают перекрестную защиту у мышей, которым вводили летальную дозу штаммов вирусов высокопатогенного гриппа. В ряде случаев стимуляции холодоадаптированный вакцинный штамм DelNS1 обеспечивал значительно улучшенную защиту по сравнению с предыдущей холодоадаптированной вакциной H1N1 Flumist®. Например, мыши, иммунизированные холодоадаптированным вирусом CA4-DelNS1, демонстрировали меньшую потерю массы тела и повышенную выживаемость по сравнению с мышами, иммунизированными холодоадаптированным вакцинным штаммом Flumist® СА7. Этот эффект еще более очевиден при стимуляции мышей высоколетальными дозами вируса H5N1 или H7N9.
Примеры
[0062] Штамм California(CA)/04/09 использовали для конструирования вируса СА4-DelNS1 посредством реверсивно-генетических процедур, приведших к делеции интрона в положении 56-529. Полученный вирус пересевали до стабилизации вируса DelNS1 путем репликации в клетках MDCK при 37°С. После подтверждения мутаций секвенированием СА (холодоадаптированный) вирус 4-DelNS1 дополнительно адаптировали к репликации при пониженных температурах путем пересева при 30°С в оплодотворенных яйцах курицы до стабилизации титра вируса. Схематическое изображение процесса показано на фиг. 1.
[0063] Анализ последовательности CA4-DelNS1 выполняли после пересева в клетки MDCK. Подтвердили наличие одной адаптивной замены G на А в положении G346A (D101N в последовательности белка) сегмента NP. Обнаружено, что эта замена обеспечивала поддержку репликации вируса CA4-DelNS1 в клетках MDCK и яйцах. Результаты анализа последовательности немутированного (Р1) и мутированного штаммов вируса CA4-DelNS1 показаны на фиг. 2.
[0064] Анализ последовательности вируса CA4-DelNS1 выполняли после холодовой адаптации путем пересева и стабилизации репликации в оплодотворенных яйцах курицы при 30°С. Выявили и подтвердили наличие двух адаптивных замен T261G(L79V) и A310G (E95G) в кодирующей области NEP сегмента NS. Результаты анализа последовательности немутированного (Р1) и мутированного штаммов вируса CA4-DelNS1 показаны на фиг. 3.
[0065] Кинетику роста холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 проверяли в клетках MDCK после многократной репликации при низкой температуре (33°С) и высокой температуре (39°С), соответственно. Результаты показаны на фиг. 4.
Фиг. 4. Ростовые свойства холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 при 33°С и 39°С
[0066] Бляшкообразующие свойства холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 при 33°С, 37°С и 39°С оценивали с использованием клеток MDCK на чашках с мягким агаром. Результаты показаны на фиг. 5.
[0067] Группы из 6 мышей иммунизировали однократной дозой холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 и вакцины Flumist® H1N1 посредством закапывания в нос. Через две недели после иммунизации мышам вводили летальную дозу (10 MLD50) вируса PR8 (H1N1). Изменение массы тела и выживаемость регистрировали в течение двух недель после введения вируса; они показаны на фиг. 6. Протективный эффект иммунизации с помощью закапывания холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 в нос был очевиден и обеспечивал приблизительно 80% выживаемость.
[0068] Группы из 6 мышей иммунизировали однократной дозой холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 и вакцины Flumist® H1N1 посредством закапывания в нос. Через две недели после иммунизации мышам вводили летальную дозу (100 MLD50) вируса A/Vietnam/1194/04 (H5N1). Изменение массы тела и выживаемость регистрировали в течение двух недель после введения вируса. Результаты показаны на фиг. 7. Протективный эффект иммунизации с помощью закапывания холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 в нос был очевиден и обеспечивал приблизительно 80% выживаемость без значительной потери массы тела.
[0069] Группы из 6 мышей иммунизировали двукратной дозой холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 и вакцины Flumist® H1N1 с интервалом две недели посредством закапывания в нос. Через две недели после введения второй дозы мышам вводили высоколетальную дозу (1000 MLD50) вируса A/Vietnam/1194/04 (H5N1). Изменение массы тела и выживаемость регистрировали в течение двух недель после введения вируса. Результаты показаны на фиг. 8. Протективный эффект иммунизации с помощью закапывания холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 в нос был очевиден и обеспечивал приблизительно 80% выживаемость.
[0070] Группы из 6 мышей иммунизировали однократной дозой холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 и вакцины Flumist® H1N1 посредством закапывания в нос. Через две недели после иммунизации мышам вводили высоколетальную дозу (6 MLD50) вируса A/Zhejiang/1/RG/2013 (H7N9). Изменение массы тела и выживаемость регистрировали в течение двух недель после введения вируса. Результаты показаны на фиг. 9.
Протективный эффект иммунизации с помощью закапывания холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 в нос был очевиден; мыши, иммунизированные таким образом, демонстрировали лишь незначительную начальную потерю массы тела с последующим быстрым и полным выздоровлением.
[0071] Группы из 6 мышей иммунизировали двукратной дозой холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 и вакцины Flumist® H1N1 с интервалом две недели посредством закапывания в нос. Через две недели после введения второй дозы мышам вводили высоколетальную дозу (15 MLD50) вируса A/Zhejiang/1/RG/2013 (H7N9). Изменение массы тела и выживаемость регистрировали в течение двух недель после введения вируса. Результаты показаны на фиг. 10. Протективный эффект иммунизации с помощью закапывания холодоадаптированного вируса CA4-DelNS1 в нос был очевиден; мыши, иммунизированные таким образом, демонстрировали почти 20% выживаемость.
[0072] Как отмечено выше, холодоадаптированный способный к репликации вирус гриппа DelNS1 согласно концепции настоящего изобретения можно применять в качестве носителя или основы для разработки штаммов вируса для иммунизации от других заболеваний, кроме гриппа. Например, в геном холодоадаптированного вируса DelNS1 согласно концепции настоящего изобретения можно внедрить гены, кодирующие экзогенные антигены, ассоциированные с организмами, патогенными для человека (например, бактериями, грибами и/или паразитами), или эндогенные антигены (т.е. антигены человека), ассоциированные с заболеванием человека (например, раком, аутоиммунным заболеванием и нейродегенеративным заболеванием, например, болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона). Результаты исследований вакцины, полученной с использованием холодоадаптированного вируса гриппа DelNS1, несущего экзогенный ген, кодирующий антиген коронавируса MERS, показаны на фиг. 11 и 12. Как показано на фиг. 11, инокуляция мышей, обработанных Adv-DPP4 с целью придания восприимчивости к MERS CoV, обеспечивала защиту от последующей инфекции MERS-CoV, что подтверждалось пониженной потерей массы тела и ускоренным выздоровлением по сравнению с обработанными аналогичным образом невакцинированными мышами. Дальнейшее подтверждение защиты показано в гистологических исследованиях ткани легких на фиг. 12. Продемонстрировано, что мыши, получившие имитацию вакцинации с использованием PBS, характеризовались признаками тяжелой пневмонии после инфекции MERS, в то время как у мышей, получивших вакцину, содержавшую холодоадаптированный вирус гриппа DelNS1, несущий ген, кодирующий антиген MERS, развивалась лишь умеренная пневмония.
Протоколы
[0073] Адаптация вируса DelNS1
1. Конструирование плазмиды с делецией NS1:
2009 H1N1 A/California/04/09 (СА4) использовали в качестве основы для конструирования вакцинного штамма DelNS1. Плазмиду без экспрессии NS1 конструировали посредством инвертированной ПЦР со следующими праймерами:
2. Получение вируса CA04-DelNS 1:
Девять плазмид: pHW2000-CA04-PB2, pHW2000-CA04-PB1, pHW2000-CA04-PA, pHW2000-CA04-NP, pHW2000-CA04-HA, pHW2000-CA04-NA, pHW2000-CA04-M, pHW2000-CA04-DelNS1 и pCX-CA04-NSl смешивали друг с другом в одной пробирке. Каждая плазмида была представлена в количестве 1 мкг. Выполнили трансфекцию смеси плазмид в клетки 293Т, высеянные в 6-луночный планшет при 80% конфлюентности. При трансфекции старую среду заменяли 1 мл Opti-MEM без пенициллина и стрептомицина. Через шестнадцать часов надосадочную жидкость выбрасывали и добавляли 2 мл MEM, содержащей 1 мкг/мл трипсина. Через семьдесят часов после трансфекции собирали надосадочную жидкость после удаления остатков клеток.
3. Пересев вируса DelNS1:
Двести микролитров полученного вируса DelNS1 вводили в 9-10-дневные оплодотворенные яйца и помещали в инкубатор при 37°С на 48 часов. Собирали аллантоисную жидкость из яиц и измеряли титр НА. Клетки крови и другие остатки удаляли центрифугированием при 1500 g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость переносили в ультрафильтр Millipore 100K и центрифугировали со скоростью 3000 g в течение 10 минут. В фильтр добавляли PBS до объема 10 мл для отмывки концентрированного вируса; суспензию повторно центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут. Двести микролитров полученного препарата вируса использовали для инокуляции 9-10-дневных оплодотворенных яиц; процедуру повторяли до резкого увеличения титра НА вируса.
4. Анализ последовательности вируса DelNS 1:
После стабилизации титра НА вируса выделяли вирусную РНК и выполняли полногеномное секвенирование для проверки сайта мутации.
5. Внедрение мутации(й), обнаруженных в адаптированном вирусе, в плазмиды, используемые в качестве основы:
Выявленную адаптивную мутацию внедрили в вирус СА4 дикого типа для подтверждения роли указанной замены в поддержке репликации вируса с использованием стандартного протокола сайт-специфического мутагенеза.
6. Вирус DelNS1 повторно получили с использованием мутированных плазмид.
[0074] Кинетика роста в клетках и яйцах
Для клеток MDCK:
Клетки MDCK, высеянные в 24-луночный планшет при 100% конфлюентности, инфицировали вирусами DelNS1 при MOI, равной 0,05 при температуре 37°С. Через час после абсорбции надосадочную жидкость удаляли и клетки однократно промывали 500 мкл PBS на лунку. На клетки наслаивали MEM с добавлением 1 мкг/мл трипсина; затем клетки инкубировали при 37°С или 33°С. Надосадочную жидкость собирали в соответствующие моменты времени, центрифугировали для удаления клеток и хранили при -80°С для анализа бляшек.
Для яиц:
9-10-дневные яйца инокулировали 1000 БОЕ вирусов DelNS1. Яйца инкубировали при 37°С или 33°С. Аллантоисную жидкость собирали в соответствующие моменты времени.
[0075] Анализ бляшек
Десятикратно разбавленный вирус DelNS1 использовали для инфицирования клеток MDCK, высеянных в шестилуночные планшеты при 100% конфлюентности, и инкубировали кдетки при 37°С.Через час после абсорбции надосадочную жидкость выбрасывали и клетки однократно промывали 1 мл PBS. На клетки наслаивали 1% агарозную MEM с добавлением 1 мкг/мл трипсина; затем планшет помещали в перевернутом виде в инкубатор при 33°С. Через сорок восемь часов клетки фиксировали 10% формалином в течение по меньшей мере 1 часа, а затем выбрасывали формалин и агарозный гель. Клетки окрашивали 1% кристалл-виолетом для визуализации бляшек.
[0076] Исследования на мышах
[0077] Шести-восьминедельных самок мышей BALB/C анестезировали и интраназально вводили им 25 мкл PBS, содержащего 1,35×105 БОЕ вируса DelNS1. Массу тела мышей и другие параметры регистрировали ежедневно в течение двух недель после введения. Для определения титра в легких после инфицирования мышей умерщвляли через 3 дня после инфицирования. Через две недели после иммунизации мышам вводили соответствующие вирусы в летальной дозе. Массу тела мышей регистрировали ежедневно в течение двух недель. После введения вирусов мышей умерщвляли при потере более 25% массы тела.
Протоколы вакцины против MERS
[0078] Конструирование плазмиды pHW2000-MERS-RBD-NEP
Для получения рекомбинантного вируса гриппа с делецией NS1, экспрессирующего рецептор-связывающий домен (RBD) MERS сконструировали плазмиду pHW2000-MERS-RBD-NEP. Она содержала открытую рамку считывания, составленную из N-конца NS1 СА04, RBD-домена MERS, сайта расщепления PTV1-2A, NEP СА04 с мутированной N-концевой последовательностью NS1. Последовательность MERS-RBD-PTV1-2A амплифицировали с помощью ПЦP с плазмиды pcDNA-MERS-SPIKE. Затем продукт ПЦР вставляли в pHW2000-CA04-DelNS1, содержавшую только открытую рамку считывания NEP СА04, посредством клонирования, независимого от лигирования, с использованием экзонуклеазы III. После трансформации плазмиды выделяли из соответствующих клонов, а затем секвенировали для подтверждения последовательности.
[0079] Получение вируса CA04-delNS1-RBD
Девять плазмид: pHW2000-CA04-PB2, pHW2000-CA04-PBl, pHW2000-CA04-PA, pHW2000-CA04-NP, pHW2000-CA04-HA, pHW2000-CA04-NA, pHW2000-CA04-M, pHW2000-MERS-RBD-NEP и pCX-CA04-NS1 в количестве по 1 мкг смешивали и использовали для трансфекции клеток 293Т, высеянных в 6-луночный планшет при 80% конфлюентности. При трансфекции старую среду заменяли 1 мл Opti-MEM без антибиотиков. Через шестнадцать часов надосадочную жидкость выбрасывали и добавляли 2 мл MEM, содержащей 1 мкг/мл трипсина. Через семьдесят часов после трансфекции собирали надосадочную жидкость после удаления остатков клеток. Надосадочную жидкость вводили в 9-10-дневные оплодотворенные яйца и инкубировали при 37°С в течение 48 часов. Аллантоисную жидкость из яиц собирали и осветляли центрифугированием. Затем вирус секвенировали и титровали посредством анализа бляшек в клетках MDCK. Максимальный титр вируса CA04-delNSl-RBD составил 2×107 БОЕ/мл.
[0080] Исследования на животных
[0081] Две группы (по шесть особей) шести-восьминедельных самок мышей BALB/C анестезировали и дважды интраназально вводили им 25 мкл PBS, содержащего 5×105 ЦПД50 вируса MERS-RBD-DelNS1, с интервалом две недели. За пять дней до введения коронавируса MERS мышам вводили 2,5×108 БОЕ Adv-DPP4 в 50 мкл PBS. На 5 день после инфекции Adv-DPP4 мышам вводили 5×105 ЦПД50 коронавируса MERS. В одной группе мышей ежедневно регистрировали массу тела в течение двух недель. Еще одну группу мышей умерщвляли на 3 день после введения коронавируса MERS и получали ткани легких для гистопатологического обследования и анализа титра вируса.
[0082] Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что без отхода от концепций изобретения, изложенных в настоящем документе, возможно осуществить многие другие модификации изобретения, помимо уже описанных. Таким образом, не подразумевается ограничение предмета изобретения, за исключением рамок прилагаемой формулы изобретения. Более того, при интерпретации как описания, так и формулы изобретения все термины следует интерпретировать в наиболее широком смысле в соответствии с контекстом. В частности, термины «включает» и «включающий» следует интерпретировать как неисключительным образом относящиеся к элементам, компонентам или этапам, указывая, что упомянутые элементы, компоненты или этапы могут присутствовать, или использоваться, или применяться в сочетании с другими элементами, компонентами или этапами, не упомянутыми явным образом. Если формула изобретения относится по меньшей мере к чему-либо одному, выбранному из группы, состоящей из А, В, С… и N, текст следует интерпретировать таким образом, что требуется только один элемент из группы, а не А плюс N, или В плюс N и т.д.
1. Мутированный вирус гриппа для производства вакцины для лечения или предупреждения вируса гриппа, содержащий: модифицированный геном вируса гриппа H1N1, содержащий делецию активности фактора вирулентности NS1, причем делеция активности фактора вирулентности NS1 включает делецию по меньшей мере части NS1 гена фактора вирулентности;
первый набор из одной или более мутаций в сегменте NP модифицированного вируса гриппа H1N1, где первый набор из одной или нескольких мутаций включает первый набор из одной или нескольких точечных мутаций, придающих способность к репликации, где первый набор из одной или нескольких точечных мутаций включает мутацию G346A в геноме вируса гриппа H1N1; и
второй набор из одной или более мутаций в кодирующем сегменте NEP модифицированного вируса гриппа H1N1, где второй набор из одной или нескольких мутаций включает второй набор из одной или нескольких точечных мутаций, выбранных из группы, состоящей из мутаций T261G и A310G в геноме вируса гриппа H1N1.
2. Мутированный вирус гриппа по п. 1, отличающийся тем, что указанная делеция активности фактора вирулентности NS1 включает делецию по меньшей мере части гена NS1 фактора вирулентности, распространяющуюся за пределы нуклеотидов 57-528 сегмента NS1 мутированного вируса.
3. Мутированный вирус гриппа по п. 1, дополнительно содержащий инсерцию гена, кодирующего экзогенный антиген.
4. Мутированный вирус гриппа по п. 3, отличающийся тем, что указанный экзогенный антиген происходит от организма, патогенного для человека.
5. Мутированный вирус гриппа по п. 4, отличающийся тем, что указанный организм, патогенный для человека, представляет собой вирус.
6. Мутированный вирус гриппа по п. 5, отличающийся тем, что вирус представляет собой ТОРС коронавирус или MERS коронавирус.
7. Живая аттенуированная вакцина для лечения или предупреждения вируса гриппа, содержащая:
модифицированный вирус гриппа H1N1 по любому из пп. 1-6, причем указанный модифицированный вирус гриппа H1N1 присутствует в достаточных количествах для получения протективного эффекта после иммунизации; и
среду-носитель;
причем указанная живая аттенуированная вакцина приготовлена для обеспечения вакцинации посредством контакта слизистой оболочки с живой аттенуированной вакциной.
8. Живая аттенуированная вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что среда-носитель представляет собой агонист TLR-7.
9. Живая аттенуированная вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что указанная живая аттенуированная вакцина безопасна для применения у человека в возрасте до двух лет.
