Опухолевый маркер, реагент для выявления метилирования, набор и их применение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым опухолевым маркерам, и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает новый реагент для выявления метилирования промоторного участка гена COL4A1 в образце, полученном от пациента. Изобретение также относится к способу идентификации наличия патологии у пациента, страдающего от рака, в частности от колоректального рака, с использованием указанного реагента. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл., 5 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области техники, связанной с биологией, в частности к опухолевому маркеру, реагенту для выявления метилирования, набору и их применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Колоректальный рак, также известный как рак толстой кишки, является распространенной злокачественной опухолью желудочно-кишечного тракта. В Китае заболеваемость колоректальным раком возрастает с каждым годом. В некоторых прибрежных зонах Китая, таких как Шанхай и Гуанчжоу, заболеваемость раком толстой кишки поднялась до второго места, уступая лишь раку легких. В настоящее время полагают, что развитие рака кишечника является следствием накопления генетических и эпигенетических дефектов. Ранние стадии колоректального рака обычно не характеризуются проявлением каких-либо признаков или симптомов, а такие симптомы, как кровь в фекалиях, боль в животе и диарея, могут проявляться на поздней стадии. При проявлении симптомов зачастую это происходит на поздней стадии, на которой пациенты испытывают сильную боль и нуждаются дорогостоящем лечении. Поэтому раннее выявление, ранняя диагностика и раннее лечение являются важными мерами по снижению заболеваемости колоректальным раком и обусловленной им смертности.

Для раннего выявления рака кишечника и предраковых очагов, а также удаления этих очагов можно применять скрининговые тесты, тем самым предупреждая возникновение рака кишечника. В настоящее время скрининговые тесты в отношении колоректального рака в основном включают тест на скрытую кровь в кале, недостатком которого является то, что на него легко влияет пища или низкий уровень выявления аденомы, и энтероскопию, которая является золотым стандартом диагностики рака кишечника, но характеризуется низкой комплаентностью, чтобы выступать в качестве скринингового теста. Поэтому существует острая потребность в способе скрининга рака кишечника, характеризующемся высокой точностью и комплаентностью.

В качестве нового скринингового теста в отношении рака кишечника все больше и больше внимания уделяют тесту на ДНК в фекалиях. Данный способ (Cologuard®) в 2016 году был включен в Руководство по скринингу колоректального рака в США. Данный способ характеризуется удобством, неинвазивностью, высоким уровнем выявления рака и предраковых аденом кишечника и т.п. Для создания набора для высокоэффективного тестирования ДНК фекалий с целью выявления рака кишечника необходимо преодолеть два основных препятствия, включающих экстракцию ДНК из фекалий и выбор маркеров. С одной стороны, состав фекалий является сложным, в них содержится множество ингибиторов последующих реакций, а также в них содержится большое количество бактериальной ДНК. Для экстракции целевых генов человека из такой смеси необходимо наличие группы высокочувствительных способов экстракции и очистки генов; с другой стороны, существует множество маркеров, связанных с колоректальным раком, особенно маркеров метилирования ДНК, поскольку исследования показали, что метилирование ДНК является ранним событием, имеющим место в ходе образования опухоли. Тем не менее, многие маркеры метилирования являются высокоэффективными на клеточном и тканевом уровнях, а в случае нахождения в фекалиях, крови и других подвергаемых скринингу средах их чувствительность и специфичность в отношении рака кишечника значительно снижаются, например, ген виментина характеризуется 83% чувствительностью в тканях, но чувствительность его обнаружения снижается до 46% в образцах фекалий. Аналогичная ситуация имеет место для таких генов, как SFRP1 и SFRP2. Такие маркеры не могут удовлетворять требованиям клинического выявления колоректального рака. Следовательно, ключевым моментом для выявления связанных с раком кишечника генов в фекалиях является выбор присутствующих в фекалиях маркеров с высокой чувствительностью выявления и специфичностью в отношении рака кишечника, и, как ожидается, такие маркеры действительно будут использоваться при клиническом выявлении рака кишечника.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В свете вышесказанного настоящим изобретением предусмотрены опухолевый маркер, последовательность для захвата, пара праймеров, зонд, реагент для выявления метилирования, набор и их применение. Чувствительность такого опухолевого маркера к раку кишечника в фекалиях близка к чувствительности в тканях и даже превышает таковую в тканях.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение маркера, последовательности для захвата, пары праймеров, зонда, реагента для выявления метилирования, набора и способа неинвазивного выявления опухолей.

Для достижения данных целей настоящим изобретением предусмотрены представленные далее технические протоколы.

Настоящим изобретением предусмотрено применение гена COL4A1 в получении опухолевых маркеров.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность гена COL4A1 характеризуется по меньшей мере 97,8% идентичностью с последовательностью, приведенной под номером доступа в Genbank NC_000013.11.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность гена COL4A1 характеризуется по меньшей мере 98,9% идентичностью с последовательностью, приведенной под номером доступа в Genbank NC_000013.11.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность гена COL4A1 характеризуется по меньшей мере 99,9% идентичностью с последовательностью, приведенной под номером доступа в Genbank NC_000013.11.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность гена COL4A1 характеризуется 100% идентичностью с последовательностью, приведенной под номером доступа в Genbank NC_000013.11.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль представляет собой колоректальный рак или колоректальную аденому.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения подлежащий тестированию образец представляет собой ткань, жидкость организма или экскрет.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения ткань представляет собой ткань кишечника.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения к жидкости организма относятся без ограничения кровь, сыворотка крови, плазма крови, внеклеточная жидкость, тканевая жидкость, лимфатическая жидкость, спинномозговая жидкость или водянистая влага.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения экскрет представляет собой мокроту, слюну, мочу или фекалии.

Настоящим изобретением также предусмотрено применение реагента для выявления метилирования гена COL4A1 в получении реагента или набора для выявления наличия опухоли.

Реагент для выявления метилирования гена COL4A1 может представлять собой реагент для выявления метилирования из предшествующего уровня техники; при этом в предшествующем уровне техники представлены различные способы выявления метилирования целевого гена, такие как специфичная к метилированию ПЦР (MSP), специфичная к метилированию количественная ПЦР (qMSP), ПЦР, количественная ПЦР и ДНК-чипы, основанные на использовании специфичных к метилированной ДНК связывающих белков, чувствительные к метилированию рестрикционные эндонуклеазы, бисульфитное секвенирование или пиросеквенирование и т.д. Каждый способ выявления предусматривает использование своих соответствующих реагентов, и все эти реагенты можно применять в настоящем изобретении для выявления метилирования гена COL4A1.

Настоящим изобретением также предусмотрена последовательность для захвата, характеризующаяся любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

I) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1;

II) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1;

III) последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1; и

IV) последовательностей, комплементарных последовательностям, представленным в I, II или III.

Настоящим изобретением также предусмотрена пара праймеров, где прямой праймер характеризуется любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

V) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2;

VI) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2;

VII) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 2, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2; и

VIII) последовательностей, комплементарных последовательностям, представленным в V, VI или VII;

при этом обратный праймер характеризуется любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

IX) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 3;

X) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 3;

XI) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 3, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 3; и

XII) последовательностей, комплементарных последовательностям, представленным в IX, X или XI.

Настоящим изобретением также предусмотрен зонд, характеризующийся любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

XIII) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 4;

XIV) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 4;

XV) последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 4, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 4; и

XVI) последовательностей, комплементарных представленным в XIII, XIV или XV.

Настоящим изобретением также предусмотрен реагент для выявления метилирования гена COL4A1, который содержит последовательность для захвата, праймер и/или зонд для выявления метилирования гена COL4A1.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены последовательность для захвата, праймер и/или зонд, полученные из CpG-островков гена COL4A1.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения праймер и/или зонд обеспечивают выявление метилирования гена COL4A1 с помощью специфичной к метилированию количественной ПЦР (qMSP).

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения реагент для выявления метилирования, предусмотренный настоящим изобретением, обеспечивает выявление уровней метилирования в геносоме, межгенном участке или промоторном участке и участке, расположенном вблизи промоторного участка, гена COL4A1.

Метилирование, которое имеется в опухолевых тканях, считается выраженной модификацией ДНК с потенциальной клинической ценностью. Все из геносомы, межгенного участка, промоторного участка или участка, расположенного вблизи промоторного участка, подвергаются метилированию, что может быть связано с опухолями. К настоящему моменту было продемонстрировано на ряде различных опухолей, что аномальное метилирование CpG-островков в промоторе гена-супрессора опухоли или вблизи него приводит к инактивации транскрипции.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения реагент для выявления метилирования, предусмотренный настоящим изобретением, предусматривает последовательность для захвата, праймер и/или зонд, полученные из CpG-островков в промоторном участке гена COL4A1 или вблизи него.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность для захвата в реагенте для выявления метилирования, предусмотренном настоящим изобретением, характеризуется любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

I) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1;

II) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1;

III) последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1; и

IV) последовательностей, комплементарных последовательностям, представленным в I, II или III.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения прямой праймер, относящийся к праймерам в реагенте для выявления метилирования, предоставленном в настоящем документе, характеризуется любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

V) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2;

VI) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2;

VII) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 2, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2; и

VIII) последовательностей, комплементарных последовательности, представленной в V, VI или VII.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения обратный праймер, относящийся к праймерам в реагенте для выявления метилирования, предоставленном в настоящем документе, характеризуется любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

IX) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 3;

X) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 3;

XI) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 3, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 3; и

XII) последовательностей, комплементарных последовательностям, представленным в IX, X или XI.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения зонд в реагенте для выявления метилирования, предоставленном в настоящем документе, характеризуется любой из представленных ниже нуклеотидных последовательностей:

XIII) нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 4;

XIV) нуклеотидной последовательности, полученной путем выполнения модификации, замены, удаления или добавления одного или более оснований по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 4;

XV) последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 4, или функционально аналогичной нуклеотидной последовательности, полученной из CpG-островков нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 4; и

XVI) последовательностей, комплементарных представленным в XIII, XIV или XV.

Настоящим изобретением также предусмотрен набор для выявления опухолей, который содержит последовательность для захвата, пару праймеров, зонд или реагент для выявления метилирования.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотренный в данном документе набор содержит один или более разделенных контейнеров для заполнения реагентами.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотренный в данном документе набор содержит первый контейнер, содержащий последовательность для захвата; второй контейнер, содержащий пару праймеров для амплификации; и третий контейнер, содержащий зонд.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотренный в данном документе набор дополнительно содержит реагенты, обычно применяемые в наборах, например реагенты для преобразования, обычно применяемые в qMSP, предназначенные для преобразования неметилированных цитозиновых оснований в урацил, тогда как метилированные цитозиновые основания остаются без изменений. К средствам для преобразования относятся без ограничения гидросульфитные, бисульфитные или гидразиновые соли и тому подобное; а также, например, ДНК-полимеразы, dNTP, ионы Mg²⁺ и буферы, обычно применяемые при амплификации гена COL4A1.

Настоящим изобретением также предусмотрено применение последовательности для захвата, пары праймеров, зонда, реагента для выявления метилирования и набора для выявления опухолей.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ выявления наличия опухоли, который применяют для установления отличий между нормальным образцом и опухолевым образцом путем определения уровня метилирования гена COL4A1.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает следующие стадии:

(1) выявление уровня метилирования гена COL4A1 у субъекта;

(2) сравнение уровня метилирования гена COL4A1 у субъекта с уровнем метилирования в нормальном контрольном образце;

(3) указание того, что у субъекта имеется опухоль или существует риск ее развития, при условии, что установлены отличия между нормальным образцом и опухолевым образцом по увеличению уровня метилирования гена COL4A1 у субъекта по сравнению с уровнем метилирования в нормальном контрольном образце.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение обеспечивает выявление уровней метилирования в геносоме, межгенном участке или промоторном участке и участке, расположенном вблизи промоторного участка, гена COL4A1.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение обеспечивает установление отличий между нормальным образцом и опухолевым образцом путем выявления уровней метилирования в промоторном участке и участке, расположенном вблизи промоторного участка, гена COL4A1.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения уровень метилирования выявляют с помощью специфичной к метилированию ПЦР, или специфичной к метилированию количественной ПЦР (qMSP), или ПЦР, количественной ПЦР и ДНК-чипов, основанных на использовании специфичных к метилированной ДНК связывающих белков, или чувствительных к метилированию рестрикционных эндонуклеаз, или бисульфитного секвенирования, или пиросеквенирования.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения уровень метилирования выявляют с помощью специфичной к метилированию количественной ПЦР (qMSP).

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения уровень метилирования выявляют с применением указанных последовательности для захвата, пары праймеров, зонда, реагента для выявления метилирования или указанного набора.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения осуществляемое на стадии (1) выявление уровня метилирования гена COL4A1 у субъекта включает стадии:

а) экстрагирования ДНК из подлежащего выявлению образца с применением способа захвата магнитными микроносителями;

b) преобразования ДНК из подлежащего выявлению образца с помощью гидросульфитной, бисульфитной или гидразиновой соли;

c) проведения выявления с помощью специфичной к метилированию количественной ПЦР (qMSP).

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения осуществляемое на стадии а) экстрагирование ДНК из подлежащего выявлению образца с применением способа захвата магнитными микроносителями включает следующие стадии:

смешивание и измельчение подлежащего выявлению образца в защитной жидкости с последующим центрифугированием и сбором супернатанта;

центрифугирование супернатанта, сбор супернатанта, добавление в супернатант для инкубации лизирующего раствора и магнитных микроносителей со специфичными комплементарными олигонуклеотидными последовательностями для захвата;

удаление части супернатанта, отмывание магнитных микроносителей и перенос в чистую центрифужную пробирку, добавление промывочной жидкости, проведение инкубации при 100–2000 об/мин при комнатной температуре в течение 0,5–5 мин, размещение на магнитной стойке, и пипетирование супернатанта, и при этом процедуру повторяют 3 раза;

и элюирование ДНК целевого гена с помощью буфера.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения критерии выявления заключаются в том, что опухолевый образец и нормальный образец интерпретируют в соответствии с пороговым значением, где пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, для образца фекалий составляет 32-42, предпочтительно пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, для образца фекалий составляет 35,2, причем если значение Ct для образца фекалий меньше порогового значения, предусмотренного для значения Ct, то его интерпретируют как опухолевый образец, а если значение Ct для образца фекалий превышает пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, или равняется ему, то его интерпретируют как нормальный образец; при этом пороговое значение, предусмотренное для значения уровня метилирования, для образца ткани составляет 1-10, предпочтительно пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, для образца фекалий составляет 3,9, причем если значение уровня метилирования для образца ткани превышает пороговое значение, предусмотренное для значения уровня метилирования, то его интерпретируют как опухолевый образец; если значение уровня метилирования меньше порогового значения, предусмотренного для значения уровня метилирования, или равняется ему, то его интерпретируют как нормальный образец. Величину порога можно корректировать в соответствии с реальной ситуацией.

Настоящим изобретением также предусмотрена система для выявления наличия опухоли, которая содержит следующие компоненты:

(1) компонент для выявления метилирования гена COL4A1;

(2) компонент для обработки данных;

(3) элемент для вывода результатов.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения компонент для выявления метилирования предусматривает один или более из прибора для проведения флуоресцентной количественной ПЦР, прибора для проведения ПЦР и секвенатора.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения компонент для выявления метилирования дополнительно предусматривает последовательность для захвата, пару праймеров, зонд, реагент для выявления метилирования или набор.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения компонент для обработки данных выполнен с возможностью а) приема данных относительно тестирования подлежащего тестированию образца и нормального контрольного образца; b) хранения данных относительно тестирования подлежащего тестированию образца и нормального контрольного образца; c) сравнения данных относительно тестирования подлежащего тестированию образца того же типа и нормального контрольного образца и d) выдачи ответа относительно вероятности или возможности того, что у субъекта имеется опухоль, в соответствии с результатами сравнения.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения компонент для вывода результатов применяют для вывода вероятности или возможности того, что у субъекта имеется опухоль.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения критерии оценки, которыми руководствуется компонент для обработки данных, предусматривают следующее: интерпретацию опухолевого образца и нормального образца в соответствии с пороговым значением;

где пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, для образца фекалий составляет 32–42, предпочтительно пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, для образца фекалий составляет 35,2, причем если значение Ct для образца фекалий меньше порогового значения, предусмотренного для значения Ct, то его интерпретируют как опухолевый образец, а если значение Ct для образца фекалий превышает пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, или равняется ему, то его интерпретируют как нормальный образец; при этом пороговое значение, предусмотренное для значения уровня метилирования, для образца ткани составляет 1-10, предпочтительно пороговое значение, предусмотренное для значения Ct, для образца фекалий составляет 3,9, причем если значение уровня метилирования для образца ткани превышает пороговое значение, предусмотренное для значения уровня метилирования, то его интерпретируют как опухолевый образец; если значение уровня метилирования меньше порогового значения, предусмотренного для значения уровня метилирования, или равняется ему, то его интерпретируют как нормальный образец. Величину порога можно корректировать в соответствии с реальной ситуацией.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль по настоящему изобретению представляет собой колоректальную опухоль.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль по настоящему изобретению представляет собой колоректальный рак или колоректальную аденому.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения подлежащий тестированию образец или тип образца, предусмотренный настоящим изобретением, представляет собой ткань, жидкость организма или экскрет.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения ткань представляет собой ткань кишечника.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения жидкость организма предусматривает кровь, сыворотку крови, плазму крови, внеклеточную жидкость, тканевую жидкость, лимфатическую жидкость, спинномозговую жидкость или водянистую влагу.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения экскрет представляет собой мокроту, мочу, слюну или фекалии.

В ходе исследования, проводимого согласно настоящему изобретению, было обнаружено, что путем выявления уровня метилирования промоторного участка гена COL4A1 образцы, соответствующие колоректальному раку, можно отличить от нормальных образцов фекалий человека. Согласно настоящему изобретению реагент для выявления метилирования гена применяют для выявления колоректального рака с высокой чувствительностью выявления и специфичностью в отношении рака кишечника.

По сравнению с существующим маркером для выявления рака кишечника маркер и технический протокол, предусмотренные настоящим изобретением, позволяют выявлять колоректальный рак с высокой чувствительностью и специфичностью, а уровень выявления колоректального рака в фекалиях является более высоким, чем в образце ткани.

1. Согласно вышеприведенному техническому протоколу реагент для выявления метилирования гена COL4A1 обеспечивает выявление колоректального рака в образце фекалий в 83,8% случаев со специфичностью, составляющей 95,2%, при этом неожиданным является то, что уровень выявления колоректального рака в образце фекалий является более высоким, чем в образце ткани, причем фекалии можно легко применять в качестве образца для выявления, и можно проводить надежную диагностику колоректального рака. Получение образца фекалий характеризуется легкостью выполнения, процедура сбора образцов характеризуется неинвазивностью и простотой, и при этом она не будет причинять боль и неудобства для пациента.

2. Согласно вышеприведенному техническому протоколу реагент для выявления метилирования гена COL4A1 обеспечивает выявление колоректального рака в 81,9% случаев в образце ткани со специфичностью 95,2%.

3. Согласно техническому протоколу реагент для выявления метилирования и способ выявления продуктов экстракции в случае гена COL4A1 позволяют удобно и точно определять страдающих колоректальным раком и здоровых людей, а реагент для выявления метилирования гена, согласно ожиданиям, будет применяться в наборе для генного выявления в образцах фекалий и служить для клинического выявления рака кишечника.

4. Согласно представленным в техническом протоколе реагенту/набору рак выявляют и диагностируют по уровню метилирования, причем все больше и больше исследований доказывают, что изменение метилирования является ранним событием в ходе онкогенеза, а ранние очаги легко обнаружить путем выявления аномалий в отношении метилирования.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Для более четкой иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения или предшествующего уровня техники теперь будет представлено краткое описание сопроводительных графических материалов, которые необходимы для описания вариантов осуществления или предшествующего уровня техники.

На фиг. 1 показана ROC-кривая для гена COL4A1 для выявления колоректального рака, полученная в ходе тестирования образцов фекалий в примере 1;

на фиг. 2 показана амплификационная карта со стандартной кривой для гена COL4A1, полученная в ходе тестирования образцов фекалий в примере 1;

на фиг. 3 показана ROC-кривая для гена COL4A1 для выявления колоректального рака, полученная в ходе тестирования образцов ткани в примере 2;

на фиг. 4 показана ROC-кривая для гена SFRP1 для выявления колоректального рака в ходе тестирования 19 пар образцов ткани в сравнительном примере 2;

на фиг. 5 показана ROC-кривая для гена SFRP1 для выявления колоректального рака в ходе тестирования 36 образцов фекалий в сравнительном примере 2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении раскрыт опухолевый маркер, реагент для выявления метилирования, набор и их применение, а специалисты в данной области техники из содержания настоящей публикации смогут узнать и соответствующим образом улучшить технологические параметры. В частности, отмечается, что все аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются включенными в настоящее изобретение. Несмотря на то, что способы и варианты применения настоящего изобретения были описаны в рамках предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидно, что методики по настоящему изобретению могут быть применены на практике с модификацией или соответствующим изменением и в виде комбинации способов и вариантов применения, описанных в данном документе, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения.

Сырье, вспомогательные материалы и реагенты, используемые для опухолевого маркера, реагента для выявления метилирования, набора и их применения, предусмотренные настоящим изобретением, можно приобрести на рынке или синтезировать. При условии наличия CpG-сайтов, которые позволяют выявлять дифференциальное метилирование, в настоящем изобретении можно применять любой фрагмент нуклеиновой кислоты гена COL4A1. CpG-островок представляет собой богатый CpG участок в последовательности нуклеиновой кислоты. CpG-островки начинают обнаруживаться выше промотора и простираются ниже до транскрипционного участка. Метилирование CpG-островков в промоторе обычно подавляет экспрессию генов. CpG-островки в промоторе являются частью метилирования, а «открытое море» CpG в геносоме содержит консервативную мишень метилирования ДНК. Недавние исследования выявили синергетические эффекты метилирования непромоторных участков (например, геносомы и UTR) в отношении экспрессии генов, а метилирование геносомы может являться потенциальными терапевтическими мишенями при лечении рака.

В целом, CpG-островки относятся к участкам, богатым динуклеотидами CpG, обычно расположенным в промоторе или вблизи него. В настоящем изобретении CpG-островки относятся не только к богатым динуклеотидами CpG участкам в промоторе или вблизи него, но также и к гибридным метилированным CpG-сайтам или выделенным CpG-сайтам.

Как правило, CpG-содержащая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Тем не менее, настоящее изобретение применимо, например, к образцам, содержащим ДНК или ДНК и РНК, предусматривающую мРНК, при этом ДНК или РНК могут быть однонитевыми или двухнитевыми, или в образцах также могут содержаться гибридные нити ДНК-РНК.

«Праймер» или «зонд» в настоящем изобретении относится к олигонуклеотиду, содержащему участок, комплементарный последовательности из по меньшей мере 6 последовательных нуклеотидов целевой молекулы нуклеиновой кислоты (например, целевого гена). В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд содержит участок, комплементарный последовательности, представленной в виде блока из по меньшей мере 9, из по меньшей мере 10, из по меньшей мере 11, из по меньшей мере 12, из по меньшей мере 13, из по меньшей мере 14, из по меньшей мере 15, из по меньшей мере 16, из по меньшей мере 17, из по меньшей мере 18, из по меньшей мере 19 или из по меньшей мере 20 последовательных или непоследовательных нуклеотидов целевой молекулы. Если праймер или зонд содержит участок, комплементарный по меньшей мере x последовательным нуклеотидам целевой молекулы, праймер или зонд на по меньшей мере 95% комплементарен по меньшей мере x последовательным нуклеотидам целевой молекулы. В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98%, на по меньшей мере 99% или на 100% комплементарен целевой молекуле.

«Выявление» в настоящем изобретении имеет такое же значение, что и диагностика, а также включает диагностику колоректальных опухолей на средней и поздней стадиях, а также в дополнение к ранней диагностике колоректальных опухолей включает скрининг в отношении колоректальных опухолей, оценку риска, прогноз, идентификацию заболевания, диагностику стадий заболевания и выбор терапевтических мишеней.

Применение маркера колоректальных опухолей COL4A1 делает возможной раннюю диагностику колоректальных опухолей. В случае подтверждения того, что метилированный в раковой клетке ген является метилированным в клинически или морфологически нормальных клетках, это указывает на то, что кажущиеся нормальными клетки прогрессируют в направлении раковых. Таким образом, можно проводить раннюю диагностику колоректального рака по метилированию специфичного для колоректальной опухоли гена COL4A1 в кажущихся нормальными клетках.

При этом ранняя диагностика относится к возможности выявления рака до метастазирования, предпочтительно до того момента, когда можно будет наблюдать морфологические изменения в тканях или клетках.

В дополнение к ранней диагностике колоректальных опухолей использование реагентов/наборов по настоящему изобретению также желательно для скрининга в отношении колоректальных опухолей, оценки риска, прогностической диагностики, идентификации заболевания, диагностики стадий заболевания и выбора терапевтических мишеней.

В качестве альтернативного варианта осуществления применительно к стадиям заболевания при прогрессировании колоректальных опухолей до различных стадий или за различные периоды диагноз можно ставить путем измерения степени метилирования COL4A1, полученного из образцов. Конкретную стадию колоректальной опухоли в образцах можно выявлять путем сравнения степени метилирования гена COL4A1 для нуклеиновых кислот, выделенных из образцов на каждой стадии колоректального рака, со степенью метилирования гена COL4A1 для одной или более нуклеиновых кислот, выделенных из образцов ткани кишечника без пролиферативных нарушений клеток.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Выбирали 163 экземпляра образцов фекалий (80 экземпляров с колоректальным раком, 83 экземпляра, соответствующих норме, при этом все подтвержденные посредством энтероскопии или результатов патологического исследования) и подвергали их измельчению центрифугированием, добавляли 100 мкл магнитных микроносителей для захвата (содержащих последовательность для захвата гена COL4A1), и смесь подвергали обработке в соответствии с приведенным далее техническим протоколом.

Технический протокол предусматривал следующее:

1) собирали образцы фекалий здорового человека и пациентов с наличием колоректальной опухоли согласно результатам энтероскопии, смешивали 1 г фекалий и 4 мл защитного раствора, и смесь измельчали, а затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут, после чего супернатант отбирали, а осадок удаляли;

2) повторно отбирали 10 мл супернатанта для центрифугирования, отбирали 3,2 мл супернатанта, добавляли 2 мл лизирующего раствора и 100 мкл магнитных микроносителей M1 для захвата с последующим инкубированием при 92°C в течение 10 мин, а затем выдерживанием в течение 1 ч при комнатной температуре;

3) смесь помещали на магнитную стойку, часть супернатанта удаляли, проводили отмывание магнитных микроносителей, смесь переносили в центрифужную пробирку на 2 мл, добавляли 800 мкл промывочного раствора W1 с последующим инкубированием при 1300 об/мин в течение 1 мин при комнатной температуре, размещением на магнитной стойке, пипетированием супернатанта и повторением процедуры 3 раза;

4) добавляли 55 мкл элюента с последующим инкубированием при 92°C при 1300 об/мин в течение 10 мин, размещением на магнитной стойке и переносом 50 мкл элюента в новую EP-пробирку за 3 мин;

5) фрагмент ДНК с предыдущей стадии метилировали с использованием набора для метилирования ДНК EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research), и 15 мкл конечного элюата использовали для выявления с помощью qMSP.

В итоге получали 15 мкл подвергнутой бисульфитной конверсии ДНК. Затем проводили qMSP для выявления уровня метилирования COL4A2.

Система для проведения qMSP-реакции: 25 мкл (8,2 мкл воды без нуклеаз, 5 мкл 5× бесцветного буфера GoTaq Flexi, 5 мкл MgCl₂ (25 мМ), 1 мкл dNTP (10 мМ), 0,5 мкл полимеразы для горячего старта GoTaq, 0,125 мкл прямого праймера (100 мМ), 0,125 мкл обратного праймера (100 мкМ), 0,05 мкл зонда (100 мкМ) и 5 мкл ДНК). Процедура проведения реакции: 4 мин при 95°C (20 с при 95°C, 30 с при 56°C, 30 с при 72°C) × 45 циклов, 30 с при 37°C.

И, наконец, по стандартной кривой рассчитывали количество копий гена в образце.

Сайты метилирования гена COL4A1 относительно постоянны и в основном расположены в CpG-островках в промоторном участке или вблизи него. Для этих участков был разработан один набор из последовательности для захвата, праймера и зонда, и его использовали в реагенте для выявления метилирования гена COL4A1.

Далее приведены последовательность для захвата, праймер и зонд, содержащиеся в реагенте.

Последовательность для захвата COL4A1 (SEQ ID NO: 1): 5’-CTGCCCGGCGTGCGGGGGCCGCGGCGGACAGCTAGCTCTC-3’

Пара праймеров для qMSP и зонд для COL4A1:

прямой праймер (SEQ ID NO: 2): 5’-CGTTTGGAGTCGTCGTATTC-3’;

обратный праймер (SEQ ID NO: 3): 5’-CGACGAACAACTAACTCTCG-3’;

зонд (SEQ ID NO: 4): 5’-CGTAGCGTTGGAAGTTCGGTTTTT-3’.

Полученная в ходе тестирования образцов фекалий ROC-кривая для гена COL4A1 для выявления колоректального рака показана на фиг. 1.

В случае колоректального рака чувствительность выявления гена COL4A1 составляет 83,8% (67/80), специфичность составляет 95,2% (79/83), а площадь под ROC-кривой составляет 0,965 (95% CI: 0,941–0,989, p<0,0001).

Полученная в ходе тестирования образцов фекалий амплификационная кривая стандартной кривой для гена COL4A1 показана на фиг. 2:

амплификационная эффективность согласно стандартной кривой составляет 103%, линейность R² = 0,993.

Таблица 1

Примечание к таблице 1: «без амплификации» означает отсутствие амплификационной кривой, отсутствие данных относительно Ct и попадание в диапазон, превышающий пороговое значение.

Пример 2

Выбирали 105 пар образцов тканей, пораженных колоректальным раком, и нормальных паракарциномных тканей (подтвержденных энтероскопией или результатами патологического исследования). Согласно протоколу ДНК из ткани экстрагировали с помощью набора QIAamp DNA Kit (QIAGEN), а затем ДНК преобразовывали с помощью набора для метилирования ДНК EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research).

Затем проводили qMSP для выявления уровня метилирования COL4A1.

Система для проведения qMSP-реакции и процедуры проведения реакции были такими же, как при тестировании образцов фекалий в примере 1. И, наконец, по стандартной кривой рассчитывали величину метилирования гена в образцах: (мишень/ACTB) * 100. Использовали такие же праймер и зонд для qMSP, что и в примере 1.

Полученная в ходе тестирования образцов ткани ROC-кривая для гена COL4A1 для выявления колоректального рака показана на фиг. 3.

В случае колоректального рака чувствительность выявления гена COL4A1 составляет 81,9% (86/105), специфичность составляет 95,2% (100/105), а площадь под ROC-кривой составляет 0,884 (95% CI: 0,829–0,939, p<0,001).

Таблица 2

Сравнительный пример 1

В ходе проведения некоторых исследований ДНК из образцов фекалий экстрагировали с помощью набора QIAamp DNA Feces Mini Kit (QIAGEN), а затем осуществляли качественное или количественное выявление уровня маркеров в образцах с использованием специфичной к метилированию ПЦР (MSP) или специфичной к метилированию количественной ПЦР (qMSP). Если для выявления колоректального рака с помощью MSP необходим электрофорез, это является менее удобным для работы, и существует риск загрязнения продуктов; причем содержащаяся в фекалиях ДНК, экстрагированная с помощью набора QIAamp DNA Feces Mini Kit, представляла собой общую ДНК человека и бактерий с небольшим количеством ДНК, действительно происходящей из опухоли человека, что не способствовало проведению последующего ПЦР-выявления.

Сравнительный пример 2

Из результатов исследований было видно, что метилирование гена SFRP1 ассоциировано с раком кишечника, а колоректальный рак можно выявлять путем выявления уровня метилирования этого гена в фекалиях. При тестировании 53 экземпляров образцов фекалий (29 экземпляров с раком кишечника, 7 экземпляров с аденомой, 17 экземпляров, соответствующих норме) было выявлено 89% случаев колоректальных опухолей со специфичностью 86%. (Zhang W, Bauer M, Croner RS, Pelz JO, Lodygin D, Hermeking H, Sturzl M, Hohenberger W, Matzel KE. DNA feces test for colorectal cancer: Hypermethylation of the secreted frizzled-related protein-1 gene. DISEASES OF THE COLON & RECTUM 2007; 50(10): 1618-26; discussion 1626-7.)

Уровень метилирования гена SFRP1 также выявляли в 19 парах образцов тканей и 36 экземпляров образцов фекалий, а способ экстракции в случае целевого гена был таким же, как и в примерах 1 и 2. Полученная в ходе тестирования 19 пар образцов тканей ROC-кривая для гена SFRP1 для выявления колоректального рака показана на фиг. 4.

В случае образцов тканей, пораженных колоректальным раком, чувствительность выявления гена SFRP1 составляла 89%, специфичность составляла 95%, а площадь под ROC-кривой составляла 0,972 (95% CI: 0,929-1, p<0,001).

Полученная в ходе тестирования 36 экземпляров образцов фекалий ROC-кривая для гена SFRP1 для выявления колоректального рака показана на фиг. 5.

В случае колоректального рака чувствительность выявления гена SFRP1 составляла 67%, специфичность составляла 94%, а площадь под ROC-кривой составляла 0,892 (95% CI: 0,790-0,994, p<0,0001).

Следовательно, ген SFRP1 характеризуется высокой чувствительностью выявления и специфичностью в отношении тканей, пораженных колоректальным раком, однако в образцах фекалий чувствительность для гена SFRP1 значительно снижена.

Вышеизложенное является лишь предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, и для специалистов в данной области техники следует отметить, что могут быть выполнены различные модификации и изменения без отступления от сущности настоящего изобретения, и эти модификации и изменения также следует рассматривать в качестве включенных в объем правовой охраны настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> КРИЭЙТИВ БАЙОСАЙЕНСИЗ (ГУАНЧЖОУ) КО., ЛТД.

<120> ОПУХОЛЕВЫЙ МАРКЕР, РЕАГЕНТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ, НАБОР

И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<150> 201810494478.2

<151> 2018-05-22

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing версии 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность для захвата COL4A1

<400> 1

ctgcccggcg tgcgggggcc gcggcggaca gctagctctc 40

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 2

cgtttggagt cgtcgtattc 20

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 3

cgacgaacaa ctaactctcg 20

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 4

cgtagcgttg gaagttcggt tttt 24

<---

1. Реагент для выявления метилирования гена COL4A1, содержащий группу, состоящую из:

последовательности для захвата, представленной под SEQ ID NO: 1;

первого праймера, представленного под SEQ ID NO: 2;

второго праймера, представленного под SEQ ID NO: 3; и

зонда, представленного под SEQ ID NO: 4.

2. Реагент по п. 1, где указанная последовательность для захвата, указанный первый праймер, указанный второй праймер и/или указанный зонд получены из CpG-островков гена COL4A1.

3. Реагент по любому из пп. 1, 2, где указанная последовательность для захвата, указанный первый праймер, указанный второй праймер и/или указанный зонд получены из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из CpG-островков геносомы, межгенного участка, промоторного участка и участка, расположенного вблизи промоторного участка, гена COL4A1.

4. Реагент по любому из пп. 1-3, предназначенный для выявления наличия опухоли.

5. Реагент по п. 4, где опухоль представляет собой колоректальную опухоль.

6. Реагент по п. 4 или 5, где опухоль представляет собой колоректальный рак или аденому.

7. Способ для выявления наличия опухоли у субъекта-человека, предусматривающий:

получение образца от субъекта-человека;

экстрагирование ДНК из указанного образца;

преобразование экстрагированной ДНК;

амплификацию преобразованной ДНК и определение уровня метилирования гена COL4A1 в образце посредством реагента для выявления метилирования по любому из пп. 1-6; и

выявление наличия опухоли у субъекта-человека, если уровень метилирования гена COL4A1 в образце является более высоким по сравнению с уровнем метилирования гена COL4A1 в контрольном образце от субъектов-людей, у которых не имеется указанной опухоли.

8. Способ по п. 7, где уровень метилирования гена COL4A1 представляет собой уровень метилирования в по меньшей мере одном, выбранном из группы, состоящей из геносомы, межгенного участка, промоторного участка и участка, расположенного вблизи промоторного участка, гена COL4A1.

9. Способ по п. 7 или 8, где

указанные амплификация преобразованной ДНК и определение уровня продукта амплификации предусматривают по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из специфичной к метилированию ПЦР, специфичной к метилированию количественной ПЦР, ПЦР, предусматривающей ПЦР, количественную ПЦР и ДНК-чипы, основанные на использовании специфичных к метилированной ДНК связывающих белков, чувствительных к метилированию рестрикционных эндонуклеаз, бисульфитного секвенирования и пиросеквенирования; и/или

экстрагирование ДНК из указанного образца предусматривает осуществление способа захвата магнитными микроносителями; и/или

указанное преобразование экстрагированной ДНК предусматривает применение гидросульфитной, бисульфитной или гидразиновой соли; и/или

указанные амплификация преобразованной ДНК и определение уровня продукта амплификации предусматривают проведение выявления с помощью специфичной к метилированию количественной ПЦР.

10. Способ по любому из пп. 7-9, где образец представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из ткани, жидкости организма или экскрета.

11. Способ по любому из пп. 7-10, где образец представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из мокроты, мочи, слюны или фекалий.

12. Способ по любому из пп. 7-11, где образец представляет собой фекалии.