Способ двойной конъюгации для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство

Изобретение относится к способу получения конъюгатов антитело–лекарственное средство и к конъюгатам антитело–лекарственное средство, где антитело содержит сконструированный остаток цистеина в положении 41 тяжелой цепи в соответствии с системой Kabat, где терапевтические группы конъюгированы с одним или более сконструированными остатками цистеина, так же как с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи, посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера. Способ позволяет регулировать DAR полученных конъюгатов антитело–лекарственное средство, получить продукт с незначительным количеством непрореагировавшего антитела. Конъюгат антитело–лекарственное средство имеет уменьшенную гидрофобность, благоприятным образом влияющую на фармакокинетические свойства конъюгата. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу конъюгации терапевтических групп, посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера, с антителами. Кроме того, оно относится к новым конъюгатам антитело-лекарственное средство.

Уровень техники

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) представляют собой развивающийся класс направленных терапевтических средств, в которых объединены специфичность антител и активность цитотоксических молекул.

Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами все больше используют для конъюгации терапевтической группы (например, лекарственного средства, токсина или хелатообразователя для радиоактивного изотопа), флуоресцентной метки или гидрофильного полимера. Введение остатка цистеина в подходящем положении антитела позволяет контроль участка конъюгации, и полученные сайт-специфические конъюгаты являются более гомогенными, чем конъюгаты, полученные посредством конъюгации дикого типа, т.е. конъюгации посредством восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи. Для сайт-специфически конъюгированных ADC, как правило, показывают по меньшей мере эквивалентную активность in vivo, улучшенную фармакокинетику (PK) и расширенное терапевтическое окно, по сравнению с конъюгатами дикого типа. Первый сайт-специфический ADC в клинических исследованиях, SGN-CD33A (Seattle Genetics), содержит расщепляемый дипептидный линкер (т.е., валин-аланин) и перекрестно сшивающий ДНК димер пирролобензодиазепина (PBD) в качестве лекарственного средства, которое связано с цистеином в положении тяжелой цепи S239C в части Fc mAb IgG1 h2H12, имея среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR) 1,9 (Sutherland et al., Blood, 2013, 122(8), 1455-1463). Эта низкая нагрузка лекарственного средства может не является подходящей для каждого связанного линкером лекарственного средства или для каждого типа злокачественной опухоли. Для менее активных токсинов или для типов злокачественных опухолей с более низкой экспрессией антигена-мишени, более высокое DAR может являться необходимым. Однако, это может становиться очевидным только на продвинутой стадии разработки, когда значительные время, усилия и ресурсы затрачены на разработку антитела с одним сконструированным остатком цистеина в тяжелой или легкой цепи. Кроме того, когда становится очевидным, что среднее DAR 1,9 является недостаточным, дополнительные остатки цистеина необходимо сконструировать в антителе, что требует разработки нового антитела, и таким образом, разработки новой линии клеток, что является длительным процессом. Кроме того, определение положения одного или более дополнительных остатков цистеина не является очень простой задачей, поскольку, например, не все положения позволяют конъюгацию, или некоторые положения могут приводить к ADC с неприемлемо высокими процентами высокомолекулярных агрегатов (HMW).

Таким образом, новые и более гибкие способы конъюгации, которые можно использовать для простой регулировки DAR полученных ADC, без необходимости предпринимать разработку полностью нового антитела, все еще являются желательными, так же как ADC, имеющие приемлемые свойства связывания антигена, фармакокинетику, эффективность in vivo, терапевтический индекс и/или стабильность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгатов антитело-лекарственное средство и к конъюгатам антитело-лекарственное средство, в которых терапевтические группы конъюгированы с одним или более сконструированными остатками цистеина, так же как с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи, посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Профиль HIC vc-секо-DUBA ADC 1d, конъюгированного посредством только восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, DAR 2,5 (верхняя панель) и vc-секо-DUBA ADC 1c, конъюгированного посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, DAR 2,6 (нижняя панель).

Фигура 2. Профили HIC vc-MMAE ADC, конъюгированных посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, с увеличивающимся DAR, полученных с использованием способа по изобретению с увеличивающимися количествами TCEP.

Фигура 3. Анализ с использованием каспазы 3/7 анти-PSMA-vc-секо-DUBA ADC 3a-3d, конъюгированных посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, с увеличивающимся DAR, полученных с использованием способа по изобретению. Ритуксимаб-vc-секо-DUBA представляет собой несвязывающий контрольный ADC.

Фигура 4. Эффективность in vivo анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC 1b (, DAR 2,2) и 1c (, DAR 2,6), конъюгированных посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, ADC 1d, конъюгированного только посредством восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи (только случайно, , DAR 2,5) для ксенотрансплантата BT474 у мышей ces1c^e KO nude.

Фигура 5. Полные PK кривые анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC 1c (DAR 2,6), конъюгированного посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, и анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC 1d (DAR 2,5) конъюгированного только посредством восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгатов антитело-лекарственное средство и к конъюгатам антитело-лекарственное средство, в которых терапевтически группы конъюгированы с одним или более сконструированными остатками цистеина, так же как с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи, посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера.

Термин «антитело», в рамках изобретения, относится к моноклональному антителу (mAb), содержащему две тяжелые цепи и две легкие цепи, или к его антигенсвязывающему фрагменту, в котором присутствует по меньшей мере одна межцепьевая дисульфидная связь, например, фрагменту Fab, Fab’ или F(ab’)₂. Антитела по изобретению могут принадлежать любому изотипу, такому как антитела IgG, IgA или IgM. Предпочтительно, антитело представляет собой антитело IgG, более предпочтительно, антитело IgG1 или IgG2. Антитела могут являться химерными, гуманизированными или человеческими. Предпочтительно, антитела являются гуманизированными. Даже более предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело IgG, наиболее предпочтительно, гуманизированное или человеческое mAb IgG1. Антитело может иметь легкие цепи κ (каппа) или λ (лямбда), предпочтительно, легкие цепи κ (каппа), т.е., представлять собой гуманизированное или человеческое антитело IgG1-κ.

В гуманизированных антителах, антигенсвязывающие определяющие комплементарность области (CDR) в вариабельных областях HC и LC происходят из антител из не относящегося к человеку вида, обычно, мыши, крысы или кролика. Эти не относящиеся к человеку CDR могут быть помещены среди человеческих каркасных остатков (FR1, FR2, FR3 и FR4) из вариабельных областей HC и LC. Выбранные аминокислоты в человеческих FR можно заменять на соответствующие исходные аминокислоты из не относящегося к человеку вида для улучшения аффинности связывания, с сохранением в то же время низкой иммуногенности. Альтернативно, выбранные аминокислоты из исходных FR не относящегося к человеку вида заменяют на соответствующие им человеческие аминокислоты для уменьшения иммуногенности, в то же время сохраняя аффинность связывания антитела. Гуманизированные таким образом вариабельные области комбинируют с человеческими константными областями.

Термины «моноклональное антитело» и «mAb», в рамках изобретения, относятся к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е., индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Антитела можно получать посредством иммунизации животных смесью пептидов, представляющих желательный антиген. B-лимфоциты выделяют и сливают с клетками миеломы, или отдельные B лимфоциты культивируют в течение нескольких суток в присутствии кондиционированной среды и фидерных клеток. Супернатанты миеломы или B-лимфоцитов, содержащие продуцированные антитела, тестируют для отбора подходящих B лимфоцитов или гибридом. Моноклональные антитела можно получать из подходящих гибридом способом гибридомы, впервые описанным в Köhler et al., Nature, 1975, 256, 495-497. Альтернативно, РНК из подходящих B-клеток или лимфомы можно лизировать, можно выделять РНК, подвергать обратной транскрипции и секвенировать. Антитела можно получать способом рекомбинантной ДНК в клетках бактерий, эукариотических животных или растений (см., например, Патент США No. 4816567). «Моноклональные антитела» можно выделять также из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в данной области, например, в Clackson et al., Nature 199, 1352, 624-628 и Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597.

Термин «сконструированное антитело с цистеиновыми заменами», в рамках изобретения, относится к антителу, в котором один или более остатков цистеина введены посредством способов генной инженерии, либо посредством замены одного или более аминокислотных остатков антитела на цистеин, или посредством вставки одного или более остатков цистеина в первичную аминокислотную последовательность.

Термин «конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC)», в рамках изобретения, относится к антителу, как определено в настоящем описании выше, с которым одна или более терапевтических групп конъюгированы посредством линкера (связанные линкером лекарственные средства). Количество связанных линкером лекарственных средств, конъюгированных с антителом, обычно обозначают как отношение лекарственного средства к антителу (DAR). Способами конъюгации, как правило, получают гетерогенную смесь различных молекул ADC, т.е. различных вариантов DAR, имеющих различные отношения лекарственного средства к антителу. Таким образом, термин «ADC» относится также к таким смесям вариантов DAR. Термин «среднее DAR» относится к среднему DAR популяции таких вариантов DAR. Как хорошо известно в данной области, распределение DAR и нагрузки лекарственного средства можно определять, например, с использованием хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) или обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC). HIC является особенно пригодной для определения среднего DAR.

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата антитело-лекарственное средство, включающему стадии:

a. избирательного восстановления сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, включающего реакцию антитела, содержащего один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из 40, 41 и 89 тяжелой цепи в соответствии с системой нумерации Kabat, 152, 153, 155 и 171 тяжелой цепи в соответствии с системой нумерации Eu, 40 и 41 легкой цепи в соответствии с системой нумерации Kabat, и 165 и 168 легкой цепи в соответствии с системой нумерации Eu, с соединением в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII)

или его солью;

b. дополнительного восстановления избирательно восстановленного антитела со стадии a. с использованием средства, восстанавливающего межцепьевые дисульфидные связи; и

c. конъюгации терапевтических групп с дополнительно восстановленным антителом со стадии b. посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкеров.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, соединение в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII) присутствует в количестве по меньшей мере один молярный эквивалент на молярное количество сконструированного цистеина. Это означает, что для избирательного восстановления антитела, имеющего один сконструированный цистеин в легкой цепи или тяжелой цепи, т.е. два сконструированных остатка цистеина присутствуют в антителе, по меньшей мере два моль соединения используют на моль антитела.

Является предпочтительным способ, в котором используют количество от 2 до 16 молярных эквивалентов соединения в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII) на молярное количество сконструированного цистеина. Если используют менее одного молярного эквивалента на молярное количество сконструированного цистеина, полного восстановления всех сконструированных остатков цистеина не достигают. Молярное отношение соединения к сконструированному цистеину влияет на скорость восстановления (снятия кэпа) сконструированных остатков цистеина, но не оказывает влияния на избирательность восстановления.

Предпочтительно, изобретение относится к способу, где антитело содержит один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из 40, 41, 152 и 153 тяжелой цепи, и 40, 41 и 165 легкой цепи. Более предпочтительно, антитело содержит один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из 41 тяжелой цепи, и 40 и 41 легкой цепи. Наиболее предпочтительно, антитело для использования в соответствии со способом по изобретению содержит сконструированный цистеин в 41 тяжелой цепи, т.е. HC41C.

В контексте настоящего изобретения, нумерацию Kabat используют для указания положений аминокислот сконструированных остатков цистеина в вариабельных областях тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), и нумерацию Eu используют для указания положений в константных областях тяжелой цепи и легкой цепи антитела. Выражение «нумерация Kabat» относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи из компиляции антител, описанной в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).

Выражение «нумерация Eu» относится к индексу Eu, как в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991).

В соответствии с настоящим изобретением, сконструированное антитело с цистеиновыми заменами можно получать с использованием общепринятых способов молекулярного клонирования, или собственно домен(ы) тяжелой цепи или легкой цепи антитела, несущие мутацию(мутации) цистеина, можно синтезировать с использованием известных оборудования и способов для синтеза (пептида или ДНК). Как правило, используют способы, сходные с описанными в WO2015/177360.

Соединение в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII) избирательно восстанавливает сконструированные остатки цистеина антитела в способе по изобретению. Соединение в соответствии с формулой (I) представляет собой 2-(дифенилфосфино)бензолсульфоновую кислоту, и соединение в соответствии с формулой (II) представляет собой 2-(дициклогексилфосфино)-бензолсульфоновую кислоту. Фосфины (I) и (II) являются коммерчески доступными в форме, например, сульфоновой кислоты или сульфоната натрия, от различных поставщиков, например, Sigma-Aldrich. Соединение в соответствии с формулой (III), (IV), (V), (VI) или (VII) можно получать способами, известными в данной области (аналогичными способам, описанным, например, в M. Bornand et al., Organometallics, 2007, 26(14), 3585-3596 и T. Schultz et al., Synthesis, 2005, 6, 1005-1011). Соединения в соответствии с формулами (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) и (VII) легко подвергаются депротонированию в водном растворе и могут формировать соответствующие соли сульфонаты с катионами, присутствующими в растворе. Типичными катионами являются, например, аммоний, тетраметиламмоний, триэтаноламмоний, имидазолий, натрий и калий, т.е. катионы, присутствующие в общепринятых буферных растворах для получения ADC.

Предпочтительным по настоящему изобретению является способ, в котором сконструированное антитело с цистеиновыми заменами подвергают реакции с соединением в соответствии с формулой (I), (II), (III), (V), (VI) или (VII), или его солью. Более предпочтительным по настоящему изобретению является способ, в котором сконструированное антитело с цистеиновыми заменами подвергают реакции с соединением в соответствии с формулой (I), (II) или (III), или его солью. Даже более предпочтительным по настоящему изобретению является способ, в котором сконструированное антитело с цистеиновыми заменами подвергают реакции с соединением в соответствии с формулой (I) или (II), или его солью. Наиболее предпочтительным по настоящему изобретению является способ, в котором сконструированное антитело с цистеиновыми заменами подвергают реакции с соединением в соответствии с формулой (I) или его солью.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, среди прочего, что с использованием соединения в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII), кэпированные сконструированные остатки цистеина в специфических положениях в полости Fab, сформированной доменами CH1, VH, VL и CL антитела, подвергаются избирательному восстановлению, в то время как межцепьевые дисульфидные связи, сформированные нативными остатками цистеина антитела, т.е. остатками цистеина из межцепьевой связи, остаются интактными.

Средство, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, для использования в соответствии со способом по изобретению может представлять собой любое средство, пригодное для восстановления межцепьевых дисульфидных связей цистеина. Пригодные средства, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, хорошо известны специалисту в данной области, см., например, R.E. Hansen et al., Analytical Biochemistry, 2009, 394, 147-158. Как правило, они являются растворимыми в воде и имеют отрицательный окислительно-восстановительный потенциал при pH 7. Восстанавливающее средство может представлять собой тиол или фосфин. Пригодные тиолы включают 1,4-(дитиобутил)-2-амин (DTBA), глутатион, цистеин, 2-меркаптоэтанол, 2-меркаптоэтиламин, дитиоэритрит (DTE) или дитиотреитол (DTT). Пригодные фосфины включают трис(3-сульфофенил)фосфин, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), трис(3-гидроксипропил)фосфин (THPP) или трис(гидроксиметил)фосфин. Предпочтительными восстанавливающими средствами являются трис(3-сульфофенил)фосфин, TCEP и DTT. Наиболее предпочтительным средством, восстанавливающим межцепьевые дисульфидные связи, является TCEP.

Средство, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, для использования в способе по изобретению, предпочтительно, присутствует в количестве более, чем 0,1 молярных эквивалентов на молярный эквивалент антитела. Более предпочтительно, средство для восстановления межцепьевой дисульфидной связи присутствует в количестве по меньшей мере 0,25 молярных эквивалентов на молярный эквивалент антитела. Даже более предпочтительно, средство, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, присутствует в количестве от 0,25 до 3 или от 0,25 до 2 молярных эквивалентов на молярный эквивалент антитела. Даже более предпочтительно, средство восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, присутствует в количестве от 0,5 до 2 молярных эквивалентов на молярный эквивалент антитела, наиболее предпочтительно, от 0,5 до 1 молярного эквивалента на молярный эквивалент антитела.

Способ по настоящему изобретению осуществляют в мягких условиях, т.е. в условиях, в которых антитело является стабильным. Как правило, способ по настоящему изобретению осуществляют в забуференном водном растворе. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, которые продуцируют в клетках-хозяевах (млекопитающих), и которые выделяют и очищают с использованием общепринятых оборудования и способов, могут нуждаться в замене буфера для получения оптимальных условий для процесса избирательного восстановления по настоящему изобретению. Пригодные забуференные растворы включают забуференные фосфатно-солевым буфером (PBS), цитратом, гистидином, ацетатом и сукцинатом водные растворы. Дополнительные соли и другие растворенные вещества (например, сахароза, трегалоза, ЭДТА) могут присутствовать в забуференном водном растворе. Для стадии избирательного восстановления забуференные растворы, предпочтительно, представляют собой растворы, забуференные ацетатом, гистидином или смесями ацетата и гистидина.

Температура реакции, как правило, лежит в диапазоне от 0°C до 40°C, pH, как правило, лежит в диапазоне от 4 до 8.

Для стадии избирательного восстановления a., pH в диапазоне от 4 до 7 является предпочтительным. Более предпочтительным для стадии избирательного восстановления является pH в диапазоне от 5 до 6.

Как правило, непрореагировавшее/избыточное соединение формулы (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII) удаляют перед дополнительным восстановлением избирательно восстановленного антитела, как правило, посредством ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF), проточной фильтрации вдоль потока (TFF) или фильтрации через активированный уголь.

Вышеописанные условия реакции для стадии избирательного восстановления a. в основном влияют на скорость и степень завершения процесса избирательного восстановления и/или на стабильность антитела.

Стадию восстановления межцепьевой дисульфидной связи b. и последующую стадию конъюгации c. по настоящему изобретению можно проводить в забуференном водном растворе, например, забуференном цитратом, гистидином или сукцинатом водном растворе, при pH и температуре, при которых антитело, терапевтические группы, подлежащие конъюгации посредством расщепляемых или нерасщепляемых линкеров (связываемые линкером лекарственные средства), и полученный конъюгат антитела являются стабильными. Как правило, pH лежит в диапазоне от 5 до 8, и температура лежит в диапазоне от 0°C до 40°C.

Для восстановления межцепьевой дисульфидной связи и последующей стадии конъюгации, pH в диапазоне от 6 до 8 является предпочтительным, более предпочтительным является pH в диапазоне от 6,5 до 7,5, pH в диапазоне от 6,8 до 7,3 является наиболее предпочтительным. Предпочтительный забуференный водный раствор, в котором осуществляют стадию восстановления межцепьевой дисульфидной связи и последующую стадию конъюгации по настоящему изобретению, содержит гистидин.

Дополнительные соли и другие растворенные вещества (например, сахароза, трегалоза, ЭДТА) могут присутствовать в забуференном водном растворе. В случае, когда группа, подлежащая конъюгации с антителом, является плохо растворимой в воде, например, в случае гидрофобного связываемого линкером лекарственного средства, группу можно растворять в органическом, смешивающимся с водой растворителе. Пригодные растворители включают диметилсульфоксид (DMSO), диметилацетамид (DMA), пропиленгликоль и этиленгликоль.

Полученные ADC можно очищать с использованием стандартных способов, известных специалисту в данной области, например, фильтрации через активированный уголь, для удаления избытка связываемого линкером лекарственного средства и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), для удаления всего непрореагировавшего антитела.

ADC, полученные способом по настоящему изобретению, можно анализировать с использованием аналитических способов, известных в данной области, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), экранированной гидрофобнофазовой HPLC (SHPC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и эксклюзионной хроматографии (SEC).

Как правило, антитело для использования по изобретению представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело, или фрагмент антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, связывающиеся с мишенью, выбранной из группы, состоящей из аннексина A1, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242, CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD56, CD70, CD74, CD79, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1, CLL-1, c MET, Cripto, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (например, EphA2 или EPhB3), рецептора эндотелина B (ETBR), FAP, FcRL5 (CD307), FGFR (например, FGFR3), FOLR1, GCC, GPNMB, HER2, HMW-MAA, интегрина α (например, αvβ3 и αvβ5), IGF1R, TM4SF1 (или антигена L6), подобного антигену Льюиса A углевода, антигена Льюиса X, антигена Льюиса Y, LIV1, мезотелина, MUC1, MUC16, NaPi2b, нектина-4, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, антигена 5T4 (или TPBG, гликопротеина трофобластов), TF (тканевого фактора), TF-Ag, Tag72, TNFR, TROP2, VEGFR и VLA.

Линкер для использования по настоящему изобретению должен содержать функциональную группу, которая может вступать в реакцию с тиольной группой некэпированного сконструированного или восстановленного межцепьевого цистеина, например, малеинимидной или галоацетильной группой. Линкер может являться расщепляемым, например, содержащим расщепляемый дипептид), или нерасщепляемым. Пригодные расщепляемые и нерасщепляемые линкеры известны в данной области. Например, расщепляемые линкеры могут содержать, например, группу валин-цитруллин (vc) или валин-аланин (va), и сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) представляет собой пример нерасщепляемого линкера. Предпочтительно, используемый линкер представляет собой расщепляемый линкер.

Терапевтическая группа может представлять собой лекарственное средство, токсин или хелатообразователь для радиоактивного изотопа.

Предпочтительным по настоящему изобретению является способ получения ADC, где терапевтическая группа представляет собой лекарственное средство или токсин.

Пригодная терапевтическая группа включает ингибитор тубулина (например, производное майтанзиноида, ауристатина или тубулизина), инактивирующий рибосому белок (например, производное сапорина), связывающее малую бороздку ДНК средство (например, димер или производное дуокармицина или пирролобензодиазепина (PBD)), разрушающее ДНК средство (например, производное PBD), алкилирующее ДНК средство (например, производное дуокармицина), интеркалирующее в ДНК средство (например, производное калихеамицина), перекрестно сшивающее ДНК средство (например, производное димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1H-бензо[e]индола (CBI)), ингибитор РНК-полимеразы (например, производное аманитина), расщепляющее ДНК средство (например, производное калихеамицина) или средство, нарушающее синтез белка или функцию необходимых клеточных белков (например, ингибитор топоизомеразы I или II (например, производное камптотецина), ингибитор протеасомы, ингибитор деацетилазы гистонов, ингибитор ядерного экспорта, ингибитор киназы или ингибитор белка теплового шока 90).

Предпочтительно, терапевтическая группа представляет собой дуокармицин, димер CBI, калихеамицин, PBD, димер PBD, майтанзиноид, тубулизин, камптотецин, аманитин или производное ауристатина. Наиболее предпочтительно, терапевтическая группа представляет собой производное дуокармицина.

Примеры пригодных терапевтических групп включают дуокармицин секо-DUBA, калихеамицин диметилгидразид N-ацетил-гамма-калихеамицина (CalichDMH), димер PBD SGD-1882, майтанзиноиды DM1 и DM4, и ауристатины монометилауристатин E (MMAE) и монометилауристатин F (MMAF).

Примеры комбинаций линкера и терапевтических групп (связанных линкером лекарственных средств) для использования в способе по изобретению включают vc-секо-DUBA (SYD980), мертанзин, эмтанзин, равтанзин, mc-vc-PAB-MMAE (также сокращенно обозначенный как mc-vc-MMAE или vc-MMAE), mc-MMAF и mc-vc-MMAF. Эти сокращенные наименования хорошо известны специалисту в данной области (см. также WO2015/177360). Связанное линкером лекарственное средство vc-секо-DUBA описано в WO2011/133039 как соединение 18b на стр. 210, ll. 21-27. В конкретном варианте осуществления, способ по изобретению, включает стадию (стадию c.) конъюгации vc-секо-DUBA с дополнительно восстановленным антителом со стадии b., как определено в настоящем описании выше, в этом способе, предпочтительно, средство, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, на стадии b. присутствует в количестве от 0,5 до 1 молярного эквивалента на молярный эквивалент антитела.

Преимущественным образом, способом по изобретению получают продукт реакции, т.е. ADC, с незначительным количеством непрореагировавшего антитела (DAR0). А также, количество высокомолекулярных (HMW) молекул является низким по сравнению с конъюгированными только посредством цистеина из межцепьевой связи ADC, таким образом, среднее DAR можно легко регулировать посредством изменения количества средства, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи. Незначительное количество DAR0 облегчает процесс очистки. Кроме того, отсутствуют потери антитела, которое является наиболее дорогостоящей частью ADC. Способ по изобретению, таким образом, является более эффективным, чем способы конъюгации предшествующего уровня техники.

Изобретение также относится к ADC, который можно получать способом, описанным в настоящем описании выше.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, где антитело содержит один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из 40, 41 и 89 тяжелой цепи в соответствии с системой нумерации Kabat, 152, 153, 155 и 171 тяжелой цепи в соответствии с системой нумерации Eu, 40 и 41 легкой цепи в соответствии с системой нумерации Kabat, и 165 и 168 легкой цепи в соответствии с системой нумерации Eu; где терапевтические группы являются конъюгированными посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера с одним или более сконструированными остатками цистеина, так же как с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи антитела; и где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет среднее DAR по меньшей мере 2,0.

Предпочтительно, изобретение относится к ADC, как описано в настоящем описании выше, где антитело содержит один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из 40, 41, 89, 152 и 153 тяжелой цепи; и 40, 41 и 165 легкой цепи. Более предпочтительно, изобретение относится к ADC, как описано в настоящем описании выше, где антитело содержит один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из тяжелая цепь 40 и 41, и 40 и 41 легкой цепи. Даже более предпочтительно, изобретение относится к ADC, как описано в настоящем описании выше, где антитело содержит один или более сконструированных остатков цистеина в положениях, выбранных из 41 тяжелой цепи, и 40 и 41 легкой цепи. Наиболее предпочтительно, изобретение относится к ADC, как описано в настоящем описании выше, где антитело содержит сконструированный цистеин в положении HC41.

Предпочтительно, изобретение относится к ADC, как описано в настоящем описании выше, где терапевтические группы, конъюгированные посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера с одним или более сконструированных остатков цистеина, так же как с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи антитела, выбраны из группы, состоящей из ингибиторов тубулина (например, производных майтанзиноида, ауристатина или тубулизина), инактивирующих рибосому белков (например, производных сапорина), связывающих малую бороздку ДНК средств (например, димеров или производных дуокармицина или пирролобензодиазепина (PBD)), разрушающих ДНК средств (например, производных PBD), алкилирующих ДНК средств (например, производных дуокармицина), интеркалирующих в ДНК средств (например, производных калихеамицина), перекрестно сшивающих ДНК средств (например, производных димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1H-бензо[e]индола (CBI)), ингибиторов РНК-полимеразы (например, производных аманитина), расщепляющих ДНК средств (например, производных калихеамицина) или средств, нарушающих синтез белка или функцию необходимых клеточных белков (например, ингибиторов топоизомеразы I или II (например, производных камптотецина), ингибиторов протеасомы, ингибиторов деацетилазы гистонов, ингибиторов ядерного экспорта, ингибиторов киназы или ингибиторов белка теплового шока 90).

Более предпочтительным является ADC по изобретению, где терапевтические группы выбраны из группы, состоящей из дуокармицина, димера CBI, калихеамицина, PBD, димера PBD, майтанзиноида, тубулизина, камптотецина, аманитина и производных ауристатина. Наиболее предпочтительно, терапевтические группы выбраны из группы, состоящей из производных дуокармицина или производных ауристатина, таких как MMAE и MMAF.

Даже более предпочтительно, изобретение относится к ADC, где антитело содержит сконструированный цистеин в положении HC41, и где группы vc-секо-DUBA или группы vc-MMAE конъюгированы со сконструированными остатками цистеина и с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи, и где ADC имеет среднее DAR по меньшей мере 2,0.

Оптимальное среднее DAR ADC зависит, среди прочего, от типа ассоциированного с опухолью антигена, типа антитела, типа терапевтической группы, типа линкера, и зависит от типа злокачественной опухоли. Свойства антигена, например, уровень экспрессии ассоциированного с опухолью антигена на поверхности клеток злокачественных опухолей, распределение ассоциированного с опухолью антигена в здоровой ткани по сравнению с пораженной заболеванием тканью, и скорость его интернализации, все влияют на оптимальное DAR ADC. Как правило, ADC по изобретению, содержащие гидрофобные терапевтические группы, имеют более низкое оптимальное DAR, чем ADC по изобретению, содержащие менее гидрофобные терапевтические группы, поскольку они формируют HMW молекулы более просто, чем ADC, содержащие менее гидрофобные терапевтические группы. ADC, содержащие менее активные терапевтические группы, могут требовать более высокого DAR, чтобы иметь желательную эффективность.

Специалист в данной области способен определять оптимальное DAR любого ADC для использования в лечении любого типа злокачественной опухоли с использованием общепринятых аналитических способов, таких как SEC и HIC, в сочетании с доклиническими тестами in vitro (например, по цитотоксичности против линий клеток злокачественных опухолей, с использованием анализов цитолиза или подтекания мембраны) и экспериментов in vivo (например, по эффективности в моделях ксенотрансплантатов на животных).

В одном предпочтительном варианте осуществления, ADC по изобретению имеет среднее DAR меньшей мере 2,2. Во втором предпочтительном варианте осуществления, ADC по изобретению имеет среднее DAR от 2,0 до 6,0, более предпочтительно, от 2,2 до 6,0.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к ADC, где антитело содержит сконструированный цистеин в положении 41 тяжелой цепи, и где группы vc-секо-DUBA конъюгированы со сконструированными остатками цистеина и с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи, и где ADC имеет среднее DAR от 2,2 до 2,6.

Во втором варианте осуществления, изобретение относится к ADC, где антитело содержит сконструированный цистеин в положении 41 тяжелой цепи, и где группы vc-MMAE конъюгированы со сконструированными остатками цистеина и с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи, и где ADC имеет среднее DAR от 2,9 до 5,8.

Преимущественно, ADC по изобретению являются менее гидрофобными, чем аналоги с таким же DAR, конъюгированные только посредством остатков цистеина из межцепьевой связи. Эта уменьшенная гидрофобность влияет на фармакокинетические свойства ADC благоприятным образом, т.е. меньшую деконъюгацию и увеличенную эффективность наблюдали in vivo.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтической композиции, содержащей ADC, как описано в настоящем описании выше, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Типичные фармацевтические составы терапевтических белков, таких как антитела, имеют форму лиофилизированных таблеток (лиофилизированных порошков), требующих растворения (в воде) (т.е., разведения) перед внутривенной инфузией, или замороженных (водных) растворов, требующих размораживания перед использованием.

Как правило, фармацевтическую композицию предоставляют в форме лиофилизированной таблетки. Пригодные фармацевтически приемлемые эксципиенты для включения в фармацевтическую композицию (перед сублимационной сушкой) по настоящему изобретению включают буферные растворы (например, содержащие соли цитрата, гистидина или сукцината в воде), лиопротекторы (например, сахарозу, трегалозу), модификаторы тоничности (например, хлорид натрия), поверхностно-активные вещества (например, полисорбат), и придающие объем средства (например, маннит, глицин). Эксципиенты, используемые для лиофилизированных составов белка, выбирают по их способности предотвращать денатурацию белка во время процесса сублимационной сушки, а также во время хранения.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к ADC или фармацевтической композиции, как описано в настоящем описании выше, для использования в качестве лекарственного средства, в частности, для использования в лечении или предотвращении злокачественной опухоли, более конкретно для использования в лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных образований.

Примеры

Материалы и способы

Антитело анти-5T4 HC41C, содержащее аминокислотную последовательность HCVR из SEQ ID NO:1, так же как аминокислотную последовательность LCVR из SEQ ID NO:2, получали с использованием способов, аналогичных способам, описанным в WO2015/177360, с использованием лидерных последовательностей HC и LC, в соответствии с SEQ ID NO:3 и 4.

Сконструированное антитело анти-PSMA с цистеиновой заменой HC41C получали с использованием метериалов и способов, описанных в WO2015/177360. Реагенты и буферы закупали у коммерческих поставщиков. Соединения в соответствии с формулой (I) (т.е., 2-(дифенилфосфино)бензолсульфоновую кислоту) и (II) (т.е., 2-(дициклогексилфосфино)бензолсульфоновую кислоту), 3-(дифенилфосфино)бензолсульфоновую кислоту, 4-(дифенилфосфино)бензолсульфоновую кислоту и трифенилфосфин-3,3',3’’-трисульфоновую кислоту закупали из Sigma-Aldrich. Соединения в соответствии с формулой (III), (IV), (V), (VI) и (VII) получали посредством литирования бензолсульфоновой кислоты, с последующей реакцией литированной бензолсульфоновой кислоты с подходящим диалкил-, диарил- или алкил/арил- (хлор-) фосфином с использованием способов, аналогичных способам, описанным в литературе, например, в M. Bornand et al., Organometallics, 2007, 26(14), 3585-3596 и T. Schultz et al., Synthesis, 2005, 6, 1005-1011. Связываемое линкером лекарственное средство vc-секо-DUBA (SYD980) синтезировали в соответствии со способами, как описано в WO2011/133039.

Способ двойного восстановления и конъюгации

К раствору антитела со сконструированным HC41C (10 мг/мл, 100 мМ гистидин, pH 5) добавляли 2-(дифенилфосфино)бензолсульфоновую кислоту (DPPBS, формула (I)) (32 молярных эквивалента на молярный эквивалент сконструированного антитела, 10 мМ в воде (MilliQ®)), и полученному раствору позволяли стоять в течение ночи при комнатной температуре. Раствор избирательно восстановленного антитела повторно забуферивали 4,2 мМ гистидином, 50 мМ трегалозой, pH 6 (~10 мг/мл) и обрабатывали ЭДТА (4% об./об., 25 мМ в воде (MilliQ®)), ТРИС (1% об./об., 1 M в воде (MilliQ®), pH 8) и TCEP (0,5-2 молярных эквивалентов (в зависимости от антитела и желательного DAR) на молярный эквивалент антитела, 3 мМ в воде (MilliQ®)). Полученный раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 3,5 часов, после чего добавляли N, N-диметилацетамид (DMA) (конечная концентрация DMA 10% об./об.) и добавляли связываемое линкером лекарственное средство (SYD980 или vcMMAE, ~8 молярных эквивалентов на молярный эквивалент антитела, 10 мМ в DMA). Полученную смесь перемешивали на вращающейся мешалке в течение 1 часа в отсутствие света, затем смеси позволяли стоять при комнатной температуре в течение ночи. Избыток связываемого линкером лекарственного средства удаляли посредством фильтрации через активированный уголь, и полученный прозрачный раствор повторно забуферивали 4,2 мМ гистидином, 50 мМ трегалозой, pH 6, с использованием фильтрации центрифугированием. Полученные ADC анализировали с использованием HIC/SEC.

Способ конъюгации связываемого линкером лекарственного средства только с цистеином из межцепьевой связи с использованием антитела со сконструированным 41C тяжелой цепи (с использованием кэпирования N-этилмалеинимидом сконструированных остатков цистеина (контроль с кэпированным NEM 41C тяжелой цепи))

Контрольные антитела HC41C с конъюгацией дикого типа синтезировали посредством добавления DPPBS (32 молярных эквивалента на молярный эквивалент антитела, 10 мМ в воде (MilliQ®)) к раствору антитела со сконструированным HC41C (10 мг/мл, 100 мМ гистидин, pH 5). Полученному раствору позволяли стоять в течение ночи при комнатной температуре. Раствор избирательно восстановленного антитела повторно забуферивали 4,2 мМ гистидином, 50 мМ трегалозой, pH 6 (~10 мг/мл) и обрабатывали ЭДТА (4% об./об., 25 мМ в воде (MilliQ®)), ТРИС (1% об./об., 1 M в воде (MilliQ®), pH 8), после чего DMA (конечная концентрация DMA составляла ~10%) и N-этилмалеинимид (NEM, 10 мМ в DMA, ~3,5 молярных эквивалентов на молярный эквивалент антитела) добавляли для кэпирования цистеина на HC41. Полученный раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего смесь повторно забуферивали 4,2 мМ гистидином, 50 мМ трегалозой, pH 6.

Антитело с кэпированным NEM сконструированным HC41C обрабатывали ЭДТА (4% об./об., 25 мМ в воде (MilliQ®)), ТРИС (1% об./об., 1M в воде (MilliQ®), pH 8), после чего добавляли трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP, 2 мМ в воде (MilliQ®), 1,33 эквивалента). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего добавляли DMA (конечная концентрация DMA составляла ~10%) и связываемое линкером лекарственное средство (SYD980 или vcMMAE) (10 мМ в DMA, ~7 молярных эквивалентов). Через 3 часа добавляли активированный уголь для удаления избытка связываемого линкером лекарственного средства и раствор фильтровали и повторно забуферивали 4,2 мМ гистидином, 50 мМ трегалозой, pH 6. Полученные ADC анализировали с использованием HIC/SEC.

HIC

Для аналитической HIC, 5-10 мкл образца (1 мг/мл) инъецировали в колонку TSKgel Butyl-NPR (4,6 мм ID x 3,5 см L, Tosoh Bioscience, кат. no. 14947). Способ элюции состоял из линейного градиента от 100% буфера A (25 мМ фосфат натрия, 1,5 M аммоний сульфат, pH 6,95) до 100% буфера B (25 мМ фосфат натрия, pH 6,95, 20% изопропанол) при 0,4 мл/мин в течение 20 минут. Температуру колонки поддерживали при 25°C. Использовали систему Waters Acquity H-Class UPLC, оборудованную детектором PDA, и программное обеспечение Empower. Оптическую плотность измеряли при 214 нм для количественного определения среднего DAR и % DAR0.

SEC

Способ A

5 мкл образца (1 мг/мл) инъецировали в колонку TSKgel G3000SWXL (5 мкм, 7,8 мм ID x 30 см L, Tosoh Bioscience, кат. no. 08541), оборудованную колонкой TSKgel SWXL Guard (7 мкм, 6,0 мм ID x 4,0 см L, Tosoh Bioscience, кат. no. 08543). Способ элюции состоял из элюции с использованием 100% 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, pH 7,5 при 0,6 мл/мин в течение 30 минут. Температуру колонки поддерживали при 25°C. Использовали систему Waters Acquity H-Class UPLC, оборудованную детектором PDA, и программное обеспечение Empower. Оптическую плотность измеряли при 214 нм для определения количества HMW молекул.

Способ B

2,5 мкл образца (1 мг/мл) инъецировали в колонку Acquity UPLC Protein BEH SEC (200Å, 1,7 мкм, 4,6 мм ID x 15 см L, Waters, кат. no. 186005225). Способ элюции состоял из элюции с использованием смеси 1:1 200 мМ фосфата натрия, pH 7,5, и 20% изопропанола в MilliQ® при 0,3 мл/мин в течение 10 минут. Температуру колонки поддерживали при 40°C. Использовали систему Waters Acquity H-Class UPLC, оборудованную детектором PDA, и программное обеспечение Empower. Оптическую плотность измеряли при 214 нм для определения количества HMW молекул.

Результаты

С различными антителами связываемые линкером лекарственные средства конъюгировали с использованием способа двойной конъюгации. Аналитические результаты обобщены в таблице 1. ADC, конъюгированные посредством как сконструированных остатков цистеина на HC41, так и остатков цистеина из межцепьевой связи, содержали незначительные количества молекул с DAR0, и для них показано меньше HMW молекул, чем для ADC, конъюгированных только посредством остатков цистеина из межцепьевой связи. Также, время удержания для пиков всех DAR уменьшилось, что является показателем менее гидрофобных вариантов DAR. На фигуре 1 показаны различия профиля HIC анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC, конъюгированного только посредством остатков цистеина из межцепьевой связи (верхняя панель), по сравнению с анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC, конъюгированным посредством как сконструированных остатков цистеина на HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи (нижняя панель). На нижней панели показана более гомогенная смесь ADC. На фигуре 2 показаны профили HIC анти-5T4-vc-MMAE ADC, конъюгированных посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи. Профили HIC показывают, что DAR ADC можно легко регулировать посредством изменения количества TCEP на стадии восстановления межцепьевой дисульфидной связи.

Таблица 1

ADC	экв. TCEP	Среднее DAR	%HMW	%DAR0	RT DAR4
анти-5T4 (HC41C)-vc-секо-DUBA
1a	0	1,9	1,3a	0,4	NA
1b	0,25	2,2	2,6a	0,5	11,4
1c	0,5	2,6	4,9a	0,3	11,4
1d* контроль	1,33	2,5	12,1a	22,4	12,5
анти-5T4 (HC41C)-vc-MMAE
2a	0,5	2,9	0,9b	0,2	10,1
2b	1,0	3,8	0,8b	0,1	10,1
2c	2,0	5,8	0,6b	c	10,1
2d* контроль	1,16	1,7	0,6b	32,3	12,0
анти-PSMA (HC41C)-vc-секо-DUBA
3a	0,25	2,0	2,7b	1,9	11,3
3b	0,5	2,3	3,1b	2,3	11,3
3c	0,75	2,8	3,2b	1,5	11,3
3d	1,0	3,2	3,2b	0,6	11,3
3e контрольd	1,24	1,8	4,8b	38,7	12,2

NA=неприменимо

* контроль с кэпированным NEM HC41C

^a SEC Способ A

^b SEC Способ B

^c количество ниже предела детекции

^d wt-анти-PSMA-vc-секо-DUBA

Анализ апоптоза

Эксперимент

Клетки LNCaP-C4,2 (15000 клеток/лунку) в полной среде для роста (среде RPMI 1640 (Lonza; Walkersville, MD, USA), дополненной 10% об./масс. FBS, соответствующей квалификации (Gibco-Life Technologies)), рассевали в 96-луночные планшеты (90 мкл/лунку). После 4 часов инкубации при 37°C, 5% CO₂, добавляли 10 мкл каждого анти-PSMA-vc-секо-DUBA ADC (3a, 3b, 3c и 3d). Серийные разведения каждого ADC получали в полной среде для роста. Апоптоз оценивали через 72 часа с использованием люминогенного субстрата каспазы-3/7 из набора для триплексного анализа ApoTox-Glo™ от Promega Corporation (Madison, WI, USA), в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

На фигуре 3 показано, что с увеличением DAR анти-PSMA-vc-секо-DUBA ADC, для ADC показывают увеличивающуюся активность каспазы-3/7. Более высокая активность каспазы-3/7 является показателем увеличения апоптоза. Апоптоз, таким образом, больше стимулируют анти-PSMA-vc-секо-DUBA ADC, имеющие более высокое DAR, как показано по более высокому сигналу люминесценцию.

Эффективность против опухолей in vivo

Опухоли индуцировали посредством подкожной инъекции двадцати миллионов (2×10⁷) клеток BT-474 в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей матригель (50:50, об.:об., ref: 356237, BD Biosciences, France) в правый бок самок мышей ces1c^e KO nude. Имплантацию клеток опухолей BT-474 проводили через 24-72 часа после облучения всего организма с использованием источника γ-лучей (2 Гр, 60Co, BioMep, Dijon, France).

Мышей случайным образом распределяли на группы обработки, когда опухоли достигали среднего объема 200-300 мм³, пока не достигали размера группы 7 животных. Статистический тест (дисперсионный анализ) проводили, чтобы удостовериться в гомогенности между группами. Затем мышам вводили однократную внутривенную (в хвостовую вену) дозу любого из носителя, 1 мг/кг анти-5T4 (HC41C)-vc-секо-DUBA (1b, DAR 2,2), 1 мг/кг анти-5T4 (HC41C)-vc-секо-DUBA (1c, DAR 2,6), 1 мг/кг анти-5T4 (HC41C)-vc-секо-DUBA (1d, конъюгация только посредством цистеина из межцепьевой связи, DAR 2,5). Пилотные исследования показали, что в этой модели доза 1 мг/кг анти-5T4 ADC не может приводить к полной ремиссии опухоли, позволяя оценку эффекта регулировки формата ADC. Сутки рандомизации и начала обработки обозначены как сутки 0 (D0).

Длину и ширину опухолей измеряли дважды в неделю с использованием штангенциркуля, и объем опухолей оценивали по формуле: объем опухоли=(ширина² x длина)/2.

На фигуре 4 показана эффективность in vivo анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC 1b (, DAR 2,2) и 1c (, DAR 2,6), оба конъюгированы посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, и ADC 1d, конъюгированного только посредством восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи (только случайно, , DAR 2,5), в положительном по 5T4 ксенотрансплантате BT474 у мышей ces1c^e KO. Непосредственно после дозирования для всех ADC показано замедление роста опухоли, и через десять суток объемы опухолей для анти-5T4-vc-секо-DUBA ADC 1b и 1c уменьшались (ремиссия). В отличие от этого, рост опухоли у мышей, обработанных только ADC 1d, замедлялся, но объемы опухолей не уменьшались (остановка развития опухоли). Через 30 суток, наблюдали повторный рост опухолей. Для ADC 1b и 1c явно показана улучшенная эффективность по сравнению с ADC 1d.

Исследования PK

Группы обработки в этом исследовании PK состояли из 9 самцов и 9 самок мышей ces1c^e KO nude. Мышам вводили ADC 1c или 1d в форме однократной внутривенной дозы 3 мг/кг. Образцы крови отбирали во множестве временных точек через несколько часов после дозирования, охлаждали в ледяной воде и перерабатывали в плазму настолько быстро, насколько возможно. Образцы быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до анализа. Уровни ADC (конъюгированных Ab) и общие уровни антител (общее количество Ab) в плазме оценивали количественно с использованием способа на основе ELISA, как описано в Dokter et al., Mol. Cancer Ther., 2014, 13, 2618-2629.

На фигуре 5 показаны полные PK кривые для ADC 1c (DAR 2,6), конъюгированного посредством как сконструированных остатков цистеина в положении HC41, так и восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи, и для ADC 1d (DAR 2,5), конъюгированного посредством только его восстановленных остатков цистеина из межцепьевой связи. Для ADC 1c, уровни конъюгированного Ab и общее количество Ab постепенно уменьшается через 96 час, что является показателем стабильного ADC и небольшой деконъюгации. Однако, для ADC 1d уровень конъюгированного Ab уменьшается более скачкообразно, чем общий уровень Ab. Этот феномен является показателем деконъюгации. ADC 1c, таким образом, является менее чувствительным к деконъюгации, чем ADC 1d.

SEQ ID NO:1 (HCVR антитела анти-5T4 HC41C)

1 EVQLVESGGD LAQPGGSLRL SCAVSGIDLS SYGMGWVRQA CGKGLEWVSI

51 ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTVYL QMTSLRAEDT ALYFCARRAT

101 YSGALGYFDI WGQGTLVTVS S

SEQ ID NO:2 (LCVR антитела анти-5T4)

1 EIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASENIY STLAWYQQKP GKAPKLLIYD

51 AFDLASGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYSGTNVDNA

101 FGQGTKLEIK

SEQ ID NO:3 (лидерная последовательность HC кролика)

1 MGWTLVFLFL LSVTAGVHS

SEQ ID NO:4 (лидерная последовательность LC кролика)

1 MVSSAQFLGL LLLCFQGTRC

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Synthon Biopharmaceuticals B.V.

COUMANS Rudy Gerardus Elisabeth

<120> СПОСОБ ДВОЙНОЙ КОНЪЮГАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ

АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

<130> P1716PC00

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR антитела анти-5T4 41C

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Cys Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ile Ile Ser Arg Asn Ser Val Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Ala Thr Tyr Ser Gly Ala Leu Gly Tyr Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR антитела анти-5T4

<400> 2

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Thr Asn

85 90 95

Val Asp Asn Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> лидерная последовательность HC кролика

<400> 3

Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 4

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> лидерная последовательность LC кролика

<400> 4

Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys

20

<---

1. Способ получения конъюгата антитело–лекарственное средство, включающий стадии:

a. избирательного восстановления сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, включающего реакцию антитела, содержащего сконструированный остаток цистеина в положении 41 тяжелой цепи в соответствии с системой нумерации Kabat, с соединением в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII)

или его солью;

b. дополнительного восстановления избирательно восстановленного антитела со стадии a. с использованием средства, восстанавливающего межцепьевые дисульфидные связи; и

c. конъюгации терапевтических групп с дополнительно восстановленным антителом со стадии b. посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкеров:

где указанные терапевтические группы конъюгированы посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера с одним или более сконструированных цистеинов и с одним или более восстановленных межцепьевых цистеинов указанного антитела.

2. Способ по п. 1, где соединение в соответствии с формулой (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) или (VII) присутствует в количестве по меньшей мере один молярный эквивалент на молярное количество сконструированного цистеина.

3. Способ по п. 1 или 2, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами подвергают реакции с соединением в соответствии с формулой (I), (II) или (III), или его солью.

4. Способ по п. 1 или 2, где средство, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, представляет собой трис(3–сульфофенил)фосфин, трис(2–карбоксиэтил)фосфин или дитиотреитол.

5. Способ по п. 1 или 2, где средство, восстанавливающее межцепьевые дисульфидные связи, присутствует в количестве более чем 0,1 молярного эквивалента на молярный эквивалент антитела.

6. Способ по п. 1 или 2, где антитело представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело или фрагмент антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, связывающиеся с мишенью, выбранной из группы, состоящей из аннексина A1, B7H4, CA6, CA9, CA15–3, CA19–9, CA27–29, CA125, CA242, CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD56, CD70, CD74, CD79, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA–1, CLL–1, c–MET, Cripto, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (например, EphA2 или EPhB3), рецептора эндотелина B (ETBR), FAP, FcRL5 (CD307), FGFR (например, FGFR3), FOLR1, GCC, GPNMB, HER2, HMW–MAA, интегрина α (например, αvβ3 и αvβ5), IGF1R, TM4SF1 (или антигена L6), подобного антигену Льюиса A углевода, антигена Льюиса X, антигена Льюиса Y, LIV1, мезотелина, MUC1, MUC16, NaPi2b, нектина–4, PD–1, PD–L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP–1, антигена 5T4 (или TPBG, гликопротеина трофобластов), TF (тканевого фактора), TF–Ag, Tag72, TNFR, TROP2, VEGFR и VLA.

7. Конъюгат антитело–лекарственное средство, где антитело содержит сконструированный остаток цистеина в положении 41 тяжелой цепи в соответствии с системой нумерации Kabat;

где терапевтические группы конъюгированы посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера с одним или более сконструированными остатками цистеина и с одним или более восстановленными остатками цистеина из межцепьевой связи антитела; и

где конъюгат антитело–лекарственное средство имеет среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR) по меньшей мере 2,0.

8. Конъюгат антитело–лекарственное средство по п. 7, имеющий среднее DAR по меньшей мере 2,2.

9. Конъюгат антитело–лекарственное средство по п. 7, имеющий среднее DAR от 2,0 до 6,0.

10. Конъюгат антитело–лекарственное средство по п. 7 для применения в качестве лекарственного средства.

11. Фармацевтическая композиция для применения в лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных образований, содержащая конъюгат антитело–лекарственное средство по любому из пп. 7-9 и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.