Определение дозы для иммунотерапевтических средств

Группа изобретений относится к определению подходящих доз иммунотерапевтических средств. Раскрыто применение способа для контактирования иммунореактивного материала индивида с иммунотерапевтическим средством и измерения по меньшей мере одной иммунологической реакции для определения того, находится ли в подходящей для введения этому индивиду дозе это иммунотерапевтическое средство, причем указанная иммунологическая реакция представляет собой изменение экспрессии или количества одного или более цитокинов, продуцированных этим иммунореактивным материалом, где доза иммунотерапевтического средства, при которой иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект, отражает подходящую дозу для введения индивиду, где приемлемый терапевтический эффект включает остановку или замедление прогрессирования заболевания у индивида; ингибирование или замедление развития нового заболевания у индивида; уменьшение частоты или тяжести симптомов и/или рецидивов у индивида и/или увеличение продолжительности жизни человека. Также раскрыт способ определения подходящей дозы иммунотерапевтического средства для введения индивиду. Группа изобретений обеспечивает подбор дозы без чрезмерных неудобств или рисков для пациентов. 2 н. и 36 з.п. ф-лы, 13 ил., 5 табл., 5 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способов определения подходящих доз для иммунотерапевтических соединений, эффективность и токсичность которых может значительно варьироваться при одной и той же дозе между индивидами из-за естественных вариаций у отдельных субъектов типа вариаций реакции иммунной системы в ответ на введение таких иммунотерапевтических соединений.

Уровень техники

Обычно терапевтически эффективные дозы для терапевтических соединений легко определяются. Для определения эффективного количества терапевтического соединения типа антибиотика или анальгетика когорте испытуемых дают возрастающие количества терапевтического соединения до тех пор, пока не будет наблюдаться требуемый терапевтический эффект, ожидая, что чем больше доза, тем больше терапевтический эффект. Однако одним из факторов, ограничивающих вводимую дозу терапевтического соединения, является появление нежелательных побочных эффектов, наблюдаемых при введении более высоких, но все еще терапевтических количеств соединения. Такие количества или токсические дозы тоже легко определяются, просто путем введения все большего и большего количества соединения до тех пор, пока не будет наблюдаться побочный эффект типа жара, тошноты или более тяжелые последствия типа недостаточности органов, шока и т.д. Поскольку такие терапевтически эффективные и токсические дозы обычно определяются из расчета на килограмм веса тела или нормируются относительно какого-то другого параметра по отношению к индивиду, то дозы терапевтических соединений, которые будут одновременно эффективными и нетоксичными, легко экстраполируются для любого пациента.

Однако бывают ситуации, при которых эффективные терапевтические и/или токсические дозы и/или их экстраполяция для всех индивидов не могут быть определены стандартными методами, например, когда терапевтическое средство не соответствует ожиданиям того, что чем больше вводимое количество, то тем выше наблюдаемый терапевтический эффект. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что при введении иммунотерапевтического средства типа агониста Toll-подобного рецептора одна и та же доза при введении различным индивидам дает различные результаты, к примеру, различные уровни терапевтического эффекта и/или различные уровни побочных эффектов. Авторы настоящего изобретения также отмечали, что клетки, выделенные от разных индивидов, по-разному реагируют в плане активации клеток при измерении по экспрессии цитокинов на одно и то же количество иммунотерапевтического средства. Настоящее изобретение отчасти основывается на этих наблюдениях, которые указывают, что иммунологическая реакция на иммунотерапевтические средства подвержена естественным вариациям в иммунной системе индивидов с тем, что не существует универсального количества дозы в пересчете на единицу, например, веса, площади поверхности, для всех индивидов, которая бы гарантировала приемлемый терапевтический эффект для определенного иммунотерапевтического средства и предпочтительно обеспечивала приемлемый профиль токсичности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение касается способов определения подходящей дозы иммунотерапевтического средства, уровень которой предпочтительно является терапевтическим и нетоксичным для данного индивида. Не придерживаясь какого-то конкретного механизма, полагаем, что иммунотерапевтические средства, например, молекулы на основе РНК, для оказания терапевтического эффекта зависят от многих врожденных факторов, активность и количество которых варьируются среди индивидов, что ведет к вариабельности эффектов, как терапевтических, так и нежелательных, наблюдаемых у разных людей при введении одного и того же средства в одной и той же дозе.

В частности, настоящее изобретение касается способа определения подходящей дозы иммунотерапевтического средства для введения индивиду, включающего (а) контактирование по отдельности множественных различных доз иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида и (b) измерение по меньшей мере одной иммунологической реакции, вызванной множественными различными дозами иммунотерапевтического средства. В одном воплощении стадия (b) характеризуется качественным и/или количественным измерением по меньшей мере одной иммунологической реакции, предпочтительно количественным измерением по меньшей мере одной иммунологической реакции. Доза при использовании в способах настоящего изобретения представляет собой количество иммунотерапевтического средства, например, доза может представлять собой количество в пикограммах, нанограммах, микрограммах, миллиграммах и граммах либо их эквивалентах в других системах единиц. Доза или количество может означать абсолютное количество, то есть доза не изменяется в зависимости от возраста, пола, веса, индекса массы тела, отражающего количество жировой ткани, площади поверхности кожи и т.д. у индивида. С другой стороны, доза может учитывать различия между индивидами типа возраста, пола, веса, индекса массы тела, отражающего количество жировой ткани, площади поверхности кожи и т.д. Множественные различные дозы представляют отдельные дозы в различных количествах, предпочтительно эти различные количества определяются одинаковым образом (выражаются в одних и тех же единицах), к примеру, все множественные различные дозы выражаются в единицах мг на кг веса тела или же все в абсолютном количестве. В одном воплощении, в котором стадия контакта с множественными различными дозами имеет место in vitro, доза может выражаться в абсолютном количестве или же с учетом типа иммунореактивного материала, к примеру, если иммунореактивный материал включает иммунные клетки, то доза может учитывать количество иммунных клеток или количество подтипа иммунных клеток.

В целях настоящего изобретения для контактирования иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида или для измерения иммунологической реакции могут применяться любые методы, известные в данной области. Типичные воплощения включают такие, в которых иммунореактивный материал представляет собой клеточную композицию, содержащую иммунные клетки, выделенные из индивида, типа цельной крови или очищенной популяции иммунных клеток, выделенных из индивида. В тех воплощениях, в которых индивиду вводятся множественные различные дозы иммунотерапевтического средства, иммунореактивным материалом является сама иммунная система и измеряется иммунологическая реакция, генерируемая иммунными клетками в организме индивида. Например, после введения иммунотерапевтического средства можно выделить кровь или лимфу из индивида и протестировать на желательную иммунологическую реакцию типа экспрессии цитокина. В одном воплощении, в котором иммунотерапевтическое средство вводится индивидам, такое введение может проводиться на кожу, то есть это скарификационная кожная проба.

В одном воплощении способ выполняется in vivo либо in vitro или же по меньшей мере одна из стадий выполняется in vivo, а другие стадии выполняются in vitro, например, стадия контактирования проводится in vivo, а измерение иммунологического ответа происходит in vitro, к примеру, путем взятия крови у индивида и измерения иммунологической реакции в крови или в клетках, выделенных из крови. Предпочтительно все стадии способа выполняются in vitro.

Иммунотерапевтическим средством, используемым в способах по изобретению, служат любые средства, молекулы, соединения, композиции и т.д., которые могут вызывать изменения по меньшей мере одного компонента иммунной системы животных, предпочтительно человека. Например, иммунотерапевтическое средство может активировать определенный тип иммунных клеток или может вызвать переход определенного типа иммунных клеток в состояние покоя, причем активацию или состояние покоя можно измерить, например, по изменению экспрессии цитокина. Другие воздействия по меньшей мере на один компонент иммунной системы могут включать побуждение пролиферации или дифференцировки иммунных клеток, например, повышение или уменьшение количества иммунных клеток в крови. Кроме того, иммунотерапевтическое средство может индуцировать вырабатывание антител или же активировать иммунные клетки типа цитотоксических Т-клеток, вызывая цитотоксические эффекты. Хотя изменения экспрессии цитокинов полезны в качестве иммунологических реакций в контексте способов изобретения, как описано ниже, однако в одном воплощении цитокины, ввиду их способности вызывать изменения иммунной системы (вызывать иммунологические реакции), тоже могут быть иммунотерапевтическими средствами. Типичные иммунологические реакции, применимые в способах настоящего изобретения, приводятся ниже.

В одном воплощении иммунотерапевтическое средство представляет собой соединение, которое является агонистом Toll-подобного рецептора (TLR), например, агонистом TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9, TLR-10, TLR-11, TLR-12 или TLR-13. Предпочтительно TLR представлен таким, который располагается внутри клетки, типа TLR-3, TLR-7, TLR-8 и TLR-9. Также предпочтительно иммунотерапевтическое средство является агонистом Toll-подобного рецептора-7 (TLR-7) или Toll-подобного рецептора-8 (TLR-8). Агонисты TLR-7 известны и включают такие соединения, как одноцепочечные молекулы РНК и соединения имидазохинолина типа тиазолохинолона, противовирусные соединения имиквимод и ресиквимод. Другие соединения-агонисты TLR-7 включают N[-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1H-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)ацетамид, 1H-{4-[4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1Н-имидазо4,5-с]хинолин-1-ил]бутил}-N-(1,1-диоксотиэтан-3-ил)ацетамид, N-(4-(4-амино-2-этил-1H-имидазо [4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-1H-(1,1-диоксид отиэтан-3 -ил)ацетамид, поли(с1-тимидин), аналоги гуанозина локсорибин и бропиримин, а также другие аналоги оснований нуклеотидов. Агонисты TLR-8 тоже включают одноцепочечные молекулы РНК, а также 2-этил-1-(4-((2-метилтетрагидрофуран-3-ил)амино)бутил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин и 1-(4-(циклогексиламино)бутил)-2-этил-1 Н-имидазо[4,5-с] хинолин-4-амин. Сообщали, что частицы, содержащие протамин и РНК, могут активировать TLR-7 при поглощении их, к примеру, плазмоцитоидными дендритными клетками, или TLR-8 при поглощении их, к примеру, моноцитами (WO 2009/144230). В одном воплощении иммунотерапевтическим средством может быть вирус, например, РНК-вирус. ммунотерапевтическим средством предпочтительно могут быть молекулы нуклеиновой кислоты типа молекул одноцепочечной РНК или другие молекулы на основе РНК, причем эти молекулы нуклеиновой кислоты кодируют иммунореактивные пептиды или белки. Более предпочтительно иммунотерапевтическое средство, у которого измеряется иммунологическая реакция, представлено одноцепочечной молекулой РНК, кодирующей один или несколько пептидов, причем каждый пептид содержит эпитоп, который специфически экспрессируется в пораженных болезнью клетках или тканях типа опухолевой ткани. При экспрессии этих пептидов (иммунореактивных пептидов) из РНК они презентируются на клеточной поверхности в комплексе с молекулами МНС и в конечном итоге индуцируют иммунные ответы против больных клеток или тканей, экспрессирующих эти эпитопы. В предпочтительном воплощении молекулы РНК могут образовывать комплексы с катионными липидами, катионными полимерами и другими веществами с положительными зарядами, которые могут образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Другие типичные иммунотерапевтические средства описаны ниже.

В настоящем изобретении иммунореактивный материал, используемый в способах по изобретению, охватывает всю иммунную систему индивида или ее часть, для которой можно измерить изменение какой-то характеристики (иммунологической реакции) при контакте с иммунотерапевтическим средством. Предпочтительно иммунореактивный материал включает клетку иммунной системы, например, иммунную клетку или иммунореактивную клетку, либо композицию, содержащую иммунную клетку или иммунореактивную клетку и является, например, цельной кровью или лимфатической жидкостью. Иммунные клетки также могут быть практически очищенными, например, очищены на 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. Термин "иммунные клетки" относится к клеткам иммунной системы, участвующим в защите организма человека. Термин "иммунные клетки" охватывает конкретные типы иммунных клеток и их предшественников, включая лейкоциты, в том числе макрофаги, моноциты (предшественники макрофагов), гранулоциты типа нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, дендритные клетки, тучные клетки и такие лимфоциты, как В-клетки, Т-клетки и природные клетки-киллеры (NK). Макрофаги, моноциты (предшественники макрофагов), нейтрофилы, дендритные клетки и тучные клетки являются фагоцитарными клетками. В одном воплощении иммунореактивный материал индивида включает клетки, выделенные из крови индивида, либо иммунореактивный материал включает цельную кровь, выделенную из индивида, либо иммунореактивный материал включает лимфатическую жидкость, выделенную из индивида. В одном воплощении, в котором способ выполняется in vitro, иммунореактивный материал индивида включает или в основном состоит из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), а если иммунореактивный материал представлен цельной кровью, то цельная кровь необязательно может быть с добавлением дендритных клеток типа плазмоцитоидных дендритных клеток (pDCs) и/или происходящих из моноцитов незрелых дендритных клеток (iDCs). Дендритные клетки могут быть из гетерологического или сингенного источника или могут быть аутологичными, предпочтительно аутологичными. Поскольку иммунотерапевтическим средством могут быть иммунные клетки, то в одном воплощении изобретения иммунные клетки могут составлять и иммунореактивный материал, и иммунотерапевтическое средство.

В настоящем изобретении иммунологическая реакция в контексте способов изобретения представляет собой изменение измеримой характеристики иммунной системы или компонента иммунной системы, а предпочтительно это такая реакция, которая указывает на терапевтический эффект от введения иммунотерапевтического средства. Например, иммунологическая реакция включает изменение активности иммунных клеток, активность которых может представлять собой изменение фенотипа дифференцировки иммунных клеток или изменение пролиферативной способности иммунных клеток либо изменение экспрессии или количества одного или нескольких цитокинов, вырабатываемых иммунными клетками, на уровне нуклеиновой кислоты или белка. Иммунологическая реакция может означать изменение количества определенного типа иммунных клеток у индивида типа лимфоцитов или Т-клеток. Иммунологическая реакция также может означать изменение количества тромбоцитов или кинетики активации тромбоцитов у индивида. Иммунологическая реакция также может означать изменение воспалительного состояния индивида типа воспалительной реакции на коже, например, контактный дерматит. Иммунологическая реакция также может включать индукцию иммунного ответа против целевого антигена типа индукции цитотоксического ответа Т-клеток против антигена. Предпочтительно измеряемая иммунологическая реакция представляет собой изменение количества/концентрации одного или нескольких цитокинов, секретируемых иммунными клетками, при измерении, к примеру, путем детектирования самого цитокина или детектирования нуклеиновой кислоты, кодирующей цитокин.

Цитокины составляют широкую категорию небольших белков, которые важны для клеточной сигнализации тем, что они высвобождаются из клеток и влияют на поведение других клеток, хотя цитокины также могут участвовать в аутокринной сигнализации. Цитокины вырабатываются целым рядом клеток, включая целый ряд иммунных клеток, а также эндотелиальные клетки, фибробласты и различные стромальные клетки, причем данный цитокин может вырабатываться более чем одним типом клеток. Типичные цитокины включают монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, INF-α, INF-γ, GM-CSF. В одном воплощении цитокин участвует в регуляции лимфоидного гомеостаза, предпочтительно это цитокин, который участвует и предпочтительно индуцирует или усиливает развитие, примирование, размножение, дифференцировку и/или выживаемость Т-клеток. В одном воплощении цитокин представлен интерлейкином. В предпочтительном воплощении цитокин представлен одним или несколькими из следующего: интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-12 (IL-12), альфа-фактор некроза опухолей (TNF-α), альфа-интерферон (IFN-α) типа α-интерферона 2а (IFN-α2a), гамма-интерферон (IFN-γ), индуцируемый у-интерфероном белок (IP10), бета-интерлейкин-1 (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин 12р70 (IL-12p70).

β-Интерлейкин-1 (IL-1β) является представителем семейства цитокинов типа интерлейкина-1, который вырабатывается активированными макрофагами в виде пробелка, который подвергается протеолитической обработке в свою активную форму каспазой-1 (CASP1/ICE). Этот цитокин является важным медиатором воспалительного ответа и участвует в различных клеточных активностях, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Установлено, что индукция циклооксигеназы-2 (PTGS2/COX2) этим цитокином в центральной нервной системе (ЦНС) способствует гиперчувствительности при воспалительных болях.

Интерлейкин-2 (IL-2) - это белок, который регулирует деятельность лейкоцитов (лейкоцитов, часто лимфоцитов), отвечающих за иммунитет.IL-2 является частью естественной реакции организма на микробные инфекции, а также в отличении чужеродного ("не своего") от "своего". IL-2 играет ключевую роль в главных функциях иммунной системы, например, в толерантности и иммунитете, главным образом посредством прямого действия на Т-клетки. В тимусе, где созревают Т-клетки, он предотвращает аутоиммунные заболевания, способствуя дифференцировке некоторых незрелых Т-клеток в регуляторные Т-клетки, которые подавляют другие Т-клетки, готовые в противном случае атаковать нормальные здоровые клетки в организме. IL-2 также способствует дифференцировке Т-клеток в эффекторные Т-клетки и в Т-клетки памяти, когда исходные Т-клетки также стимулируются антигеном, что помогает организму бороться с инфекциями.

Интерлейкин-6 (IL-6) действует в качестве и провоспалительного цитокина, и противовоспалительного миокина, и секретируется Т-клетками и макрофагами для стимуляции иммунных реакций, например, во время инфекции и после травмы, особенно при ожогах или других повреждениях тканей, приводящих к воспалению. IL-6 также играет роль в борьбе с инфекциями, так как было показано, что IL-6 у мышей необходим для устойчивости против бактерии Streptococcus pneumoniae. Роль IL-6 в качестве противовоспалительного цитокина опосредуется его ингибирующим действием на TNF-α и IL-1 и активацией IL-1RA и IL-10.

Интерлейкин-12 (IL-12) обычно вырабатывается дендритными клетками, макрофагами, нейтрофилами и лимфобластоидными В-клетками человека в ответ на антигенную стимуляцию. IL-12 представляет собой гетеродимерный цитокин, который кодируется двумя отдельными генами, IL-12A (р35) и IL-12B (р40). Активный гетеродимер (который именуется "р70") и гомодимер р40 образуются после синтеза белка. IL-12 участвует в дифференцировке наивных Т-клеток в клетки Th1 и известен как фактор, стимулирующий Т-клетки, который может стимулировать рост и функцию Т-клеток. Он стимулирует выработку у-интерферона (IFN-γ) и альфа-фактора некроза опухолей (TNF-α) Т-клетками и клетками природных киллеров (NK), опосредует усиление цитотоксической активности NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+, а также обладает антиангиогенной активностью.

α-Фактор некроза опухолей (TNF-α) (кахексии или кахектин) участвует в системном воспалении и является одним из цитокинов, составляющих реакции острой фазы. Он вырабатывается главным образом активированными макрофагами, хотя и может вырабатываться многими другими типами клеток, такими как дендритные клетки, моноциты, лимфоциты CD4+, NK-клетки, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы и нейроны. Основная роль TNF-α заключается в регуляции иммунных клеток. TNF-α -эндогенный пироген, он может вызывать жар, апоптотическую гибель клеток, кахексию, воспаление, а также ингибировать онкогенез и репликацию вирусов и реагировать на сепсис через клетки, вырабатывающие IL-1 и IL-6.

Интерфероны (IFN) I типа у человека относятся к большой подгруппе белков-интерферонов, способствующих регуляции активности иммунной системы. У млекопитающих они обозначаются как IFN-α (альфа), IFN-β (бета), IFN-к (каппа), IFN-δ (дельта), IFN-ε (эпсилон), IFN-τ (тау), IFN-ω (омега) и IFN-ζ, (дзета, также известный как лимитин). В основном они участвуют во врожденных иммунных реакциях против вирусной инфекции. Гены, ответственные за их синтез, относятся к 13 подтипам, которые называются IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21. Эти гены находятся вместе в одном кластере на хромосоме 9. Белки IFN-β обладают противовирусной активностью, которая в основном участвует во врожденном иммунитете. Описаны два типа IFN-β: IFN-β1 (IFNB1) и IFN-β3 (IFNB3). IFN-α и IFN-β секретируются многими типами клеток, включая дендритные клетки, лимфоциты (NK-клетки, В-клетки и Т-клетки), макрофаги, фибробласты, эндотелиальные клетки, остеобласты и др. Они стимулируют и макрофаги, и NK-клетки на выработку противовирусных реакций, а также действуют против опухолей. Плазмацитоидные дендритные клетки были идентифицированы как наиболее сильные продуценты IFN типа I в ответ на активацию Toll-подобных рецепторов (TLR), например, TLR-7, -8 и/или -9, поэтому их называют естественными IFN-вырабатывающими клетками.

γ-Интерферон ( ) представляет собой димеризованный растворимый цитокин, который является единственным представителем класса интерферонов II типа. IFN-γ играет решающую роль во врожденном и адаптивном иммунитете против вирусных и некоторых бактериальных и протозойных инфекций. IFN-γ является важным активатором макрофагов и индуктором экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса П. Аномальная экспрессия IFN-γ связана с рядом аутовоспалительных и аутоиммунных заболеваний. Значение IFN-γ в иммунной системе отчасти связано с его способностью напрямую ингибировать репликацию вирусов и, что наиболее важно, с его иммуностимулирующим и иммуномодулирующим действием. IFN-γ вырабатывается преимущественно макрофагами, природными киллерами (NK) и природными Т-клетками-киллерами (NKT) как часть врожденного иммунитета, а также эффекторными Т-клетками - Th1 CD4+ и цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) CD8+ после появления антиген-специфичного иммунитета.

Индуцируемый γ-интерфероном белок 10 (IP-10), также известный как хемокин-10 с мотивом С-Х-С (CXCL10) или небольшой индуцируемый цитокин В10, представляет собой небольшой цитокин, принадлежащий к семейству СХС-хемокинов, который секретируется некоторыми типами клеток, например, в ответ на IFN-γ. Эти типы клеток включают макрофаги, дендритные клетки, моноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. IP-10 приписывали несколько ролей типа хемоатрактанта для моноцитов/макрофагов, Т-клеток, NK-клеток и дендритных клеток, усиления адгезии Т-клеток к эндотелиальным клеткам, противоопухолевой активности и ингибирования образования колоний из клеток костного мозга и ангиогенеза.

В одном воплощении измерение иммунологической реакции включает использование меченых лигандов, специфически связывающихся с молекулами, например, меченых зондов из нуклеиновой кислоты, гибридизующихся с нуклеиновой кислотой, и/или меченых антител либо их фрагментов/производных, специфически связывающихся с пептидами типа цитокинов.

Согласно изобретению, измерение наличия или количества нуклеиновой кислоты может проводиться известными методами обнаружения нуклеиновых кислот типа методов, включающих методы гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот. В одном воплощении транскрипты мРНК выявляются либо их количество определяется методом ОТ-ПЦР или Нозерн-блот. Такие методы обнаружения нуклеиновых кислот могут включать применение олигонуклеотидов, гибридизующихся с нуклеиновыми кислотами. Подходящие олигонуклеотиды обычно варьируются по длине от пяти до нескольких сотен нуклеотидов, более типично 20-70 нуклеотидов в длину или меньше, еще более типично 10-30 нуклеотидов в длину.

Согласно изобретению, измерение наличия или количества пептида типа цитокина может проводиться различными способами, включая, без ограничения, иммунологическое детектирование с помощью антитела, специфически связывающегося с данным пептидом. Методы с применением антител для обнаружения пептидов хорошо известны и включают методы ELISA, конкурентного связывания и др. Обычно в таких методах используются антитела либо их фрагменты, специфически связывающиеся с пептидом, которые прямо или косвенно связаны с меткой, обеспечивающей детектирование, например, с индикаторным ферментом, радиоактивной меткой, флуорофором или парамагнитными частицами.

Согласно изобретению, если иммунологическая реакция детектируется по измерению роста клеток или его отсутствия либо по изменению состояния дифференцировки клеток, такое измерение может проводиться различными способами, включая, без ограничения, подсчет количества клеток или измерение включения ³Н в клеточную ДНК для определения пролиферации клеток. Изменения в дифференцировке можно измерять путем наблюдения за изменением экспрессии клеточного белка, связанного с определенным состоянием дифференцировки, или путем наблюдения за изменением визуального фенотипа клеток, связанного с определенным состоянием дифференцировки. В данной области известны и другие методы, которые можно легко использовать в описанных здесь способах.

В одном воплощении способа измеряется по меньшей мере одна иммунологическая реакция либо 2 и более иммунологических реакций или же 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более иммунологических реакций.

В определенных воплощениях способа множественные различные дозы иммунотерапевтического средства могут составлять две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и более десяти различных доз. Кроме того, множественные различные дозы иммунотерапевтического средства могут представлять эскалацию дозы, предпочтительно линейную или логарифмическую эскалацию дозы, например, 1, 2, 3, 4, 5 и т.д., или 1, 3, 9, 27, 81, 243 и т.д., либо 0,1, 1, 10, 100, 1000 и т.д. В одном воплощении стадии (а) и (b) выполняются последовательно. Предпочтительно стадия (b) выполняется через 2-48 часов после стадии (а), предпочтительно через 4-24 часа после стадии (а).

В одном предпочтительном воплощении стадия (а) способа (раздельное контактирование множественных различных доз иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида) выполняется in vivo и характеризуется раздельным контактированием множественных различных доз иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида в виде отдельных операций введения, каждая из которых характеризуется введением индивиду одной дозы иммунотерапевтического средства. Отдельные операции введения могут выполняться впоследствии и отделяться друг от друга промежутками времени от 2 до 30 дней, как-то от 7 до 28 дней, предпочтительно в 7 дней, 14 дней, 21 день или 28 дней, более предпочтительно в 7 дней или 14 дней. Предпочтительно измерение по меньшей мере одной иммунологической реакции проводится отдельно после каждой отдельной операции введения. В одном воплощении отдельные операции введения могут проводиться практически в одно и то же время, к примеру, путем введения множественных различных доз на кожу практически в одно и то же время. В этом воплощении измеряемая иммунологическая реакция, к примеру, может представлять собой контактный дерматит, который выявляется визуально.

Пациентам вводились многие типы иммунотерапевтических средств для получения терапевтического эффекта, поэтому с учетом таких знаний известны стандартные дозы или диапазоны стандартных доз для таких типов иммунотерапевтических средств, которые дают терапевтический эффект. Если такие стандартные дозы или диапазоны доз известны, то множественные различные дозы при контактировании на стадии (а) предпочтительно должны включать дозу, которая ниже стандартной дозы или диапазона, и/или дозу, которая находится в пределах стандартного диапазона доз, и/или дозу, которая больше, чем стандартная доза или диапазон. Например, если стандартный диапазон доз молекулы РНК, вводимой индивиду в качестве противораковой вакцины, составляет от 5 до 100 мкг, то типичные множественные различные дозы при контактировании на стадии (а) могут составлять 2 мкг, 10 мкг и 150 мкг. Если для определенного типа иммунотерапевтических средств не известны стандартные дозы или диапазоны доз, то в способах по изобретению можно использовать известные дозы или диапазоны доз для аналогичного типа иммунотерапевтических средств либо определять стандартные дозы или диапазоны доз эмпирически, а затем применять их согласно изобретению для определения подходящей дозы иммунотерапевтического средства для индивида.

В одном воплощении множественные различные дозы включают по меньшей мере одну дозу, которая ниже стандартного диапазона доз для иммунотерапевтического средства. В одном воплощении множественные различные дозы включают по меньшей мере одну дозу, которая находится в пределах стандартного диапазона доз для иммунотерапевтического средства. В одном воплощении первая из отдельных операций введения характеризуется введением такой дозы иммунотерапевтического средства, которая ниже стандартной дозы для этого иммунотерапевтического средства, причем дозы, вводимые при последующих отдельных операциях введения, необязательно будут выше, чем доза, вводимая при первой отдельной операции введения.

В одном воплощении, в котором стадия контактирования имеет место in vitro, стандартная доза или диапазон доз для иммунотерапевтического средства должен быть эквивалентен стандартной дозе того же иммунотерапевтического средства in vivo. Такие эквивалентности известны в данной области или могут быть установлены методами, известными в данной области. В одном воплощении стандартная доза может быть такой же, как при введении (контактировании) in vivo, но с поправкой, к примеру, на количество иммунореактивного материала, используемого in vitro (например, количество иммунных клеток), и/или на объем иммунореактивного материала по сравнению с контактированием in vivo. В одном воплощении стандартная доза для контактирования in vitro такая же, как и количество/концентрация иммунотерапевтического средства на 1 мл крови или лимфы или на количество определенного типа иммунных клеток, которое наблюдается у индивида при введении ему известной стандартной дозы. В одном воплощении стандартная доза "in vitro" эквивалентна концентрации иммунотерапевтического средства, достигаемой в цельной крови при введении индивиду стандартной дозы "in vivo". Например, если стандартная доза в 1 мг/кг дает концентрацию иммунотерапевтического средства в цельной крови 10 мкг/мл, то стандартная доза in vitro, эквивалентная стандартной дозе в 1 мг/кг in vivo, составляет 10 мкг/мл, если иммунореактивным материалом будет цельная кровь.

Способы настоящего изобретения могут дополнительно включать стадию выявления наличия или отсутствия по меньшей мере одной нежелательной реакции типа нежелательной иммунологической реакции, например, слишком высокого или слишком низкого уровня экспрессии цитокина либо побочного эффекта, либо неблагоприятного события или реакции типа токсичности для органов, возникающей при контакте иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом, например, при введении иммунотерапевтического средства индивиду. Эта стадия может выполняться после каждого случая контакта иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом, будь то in vitro или in vivo. В одном воплощении, в котором достигаемый терапевтический эффект заключается в снижении количества клеток определенного типа, нежелательной реакцией может быть такое повышение экспрессии известного цитокина, которое снижает терапевтическое действие иммунотерапевтического средства. Побочные эффекты представляют собой подгруппу нежелательных реакций, которые могут выявляться при проведении стадии контактирования in vivo, и представляют собой такие нежелательные реакции, которые отражают некоторый уровень дискомфорта для индивида и могут варьироваться по степени тяжести. Более тяжелые побочные эффекты называются здесь неприемлемыми побочными эффектами. Типичными побочными эффектами являются, без ограничения, парестезия, усталость, головная боль, мышечная боль, давление на грудь или боль в груди, дрожь, повышенная температура или жар, шум в ушах, боль в суставах, головокружение, потливость, гипотония и/или тахикардия. Типичными неприемлемыми побочными эффектами могут быть такие эффекты, которые угрожают жизни индивида, типа синдрома системной воспалительной реакции, который в конечном итоге может привести к недостаточности органов.

В одном воплощении, в котором выявляется по меньшей мере один побочный эффект после введения одной из множественных различных доз, все последующие дозы можно вводить вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством. В одном воплощении, в котором выявляется по меньшей мере один неприемлемый побочный эффект после введения одной из множественных различных доз, все последующие дозы следует вводить вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством. Последующие дозы могут быть такими же или ниже той дозы, которая вызвала приемлемый или неприемлемый побочный эффект, который потребовал введения по меньшей мере одного антитоксического средства. Если доза вызывает приемлемые или неприемлемые побочные эффекты в отсутствие антитоксического средства, но переносится при введении в присутствии антитоксического средства, то последующие дозы могут быть и выше, но их можно вводить только в присутствии антитоксического средства. Антитоксическое средство предпочтительно представляет собой жаропонижающий препарат типа NSAID, например, ибупрофен, напроксен, кетопрофен или нимесулид; аспирин и родственные салицилаты типа салицилата холина, салицилата магния и салицилата натрия; парацетамол (ацетаминофен); метамизол; набуметон; и феназон.

В одном воплощении, в котором выявляется по меньшей мере один побочный эффект после введения одной из множественных различных доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, следующая доза иммунотерапевтического средства, которая будет вводиться впоследствии, должна быть равна или меньше дозы, введенной при предыдущем введении. Предпочтительно, если по меньшей мере одна нежелательная реакция представляет собой неприемлемый побочный эффект, то следующая доза иммунотерапевтического средства, которая будет вводиться впоследствии, должна быть меньше, чем доза, введенная при предыдущем введении. За тем введением, которое следует непосредственно за предыдущей операцией введения, далее может следовать одна или несколько дополнительных операций введения, которые необязательно представляют схему эскалации дозы шаг за шагом.

В одном воплощении, в котором выявляется по меньшей мере один побочный эффект после введения одной из множественных различных доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, следующая доза иммунотерапевтического средства, которая будет вводиться впоследствии, должна быть меньше, чем доза, введенная при предыдущем введении.

В одном воплощении, в котором не выявляется никаких побочных эффектов после введения одной из множественных различных доз, доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект, отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду. В одном воплощении, в котором в качестве подходящей дозы установлена более чем одна доза, доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция дает убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект, является той дозой иммунотерапевтического средства, которую следует вводить индивиду. Убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект будет зависеть от измеряемой иммунологической реакции. Например, самым сильным признаком может быть тот, при котором наблюдается наибольшая или наименьшая экспрессия цитокина при введении множественных различных доз. Наибольшая вводимая доза, которая обеспечивает приемлемый терапевтический эффект, не обязательно будет той дозой, при которой проявляется самый сильный признак приемлемого терапевтического эффекта.

В одном воплощении, в котором выявляется по меньшей мере один побочный эффект после введения одной из множественных различных доз, та доза при последующем введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду. В одном аспекте этого воплощения, в котором не выявляется никаких побочных эффектов после введения любой из множественных различных доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, та доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция дает убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект, является подходящей дозой для введения иммунотерапевтического средства индивиду. Этот аспект касается ситуации, когда имеется несколько различных доз в качестве подходящих доз, так как при этих дозах при введении вместе с антитоксическим средством не проявляется никаких побочных эффектов. Убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект будет зависеть от измеряемой иммунологической реакции. Например, самым сильным признаком может быть тот, при котором наблюдается наибольшая или наименьшая экспрессия цитокина при введении множественных различных доз вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством. Наибольшая доза при введении вместе с антитоксическим средством, при которой не выявляется никаких побочных эффектов, не обязательно будет той дозой, при которой проявляется убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект.В одном аспекте этого воплощения, в котором выявляется по меньшей мере один побочный эффект после введения одной из множественных различных доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, наибольшая доза, при которой не выявляются побочные эффекты либо они наименее тяжелые или же считаются приемлемыми в свете тяжести заболевания, является подходящей дозой для введения иммунотерапевтического средства индивиду. Этот аспект касается ситуации, когда некоторые из доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством приводят к побочным эффектам или когда побочные эффекты выявляются при всех дозах при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством. Таким образом, подходящей дозой является та доза, которая терапевтически эффективна и при которой не выявляется никаких побочных эффектов либо они наименее тяжелые или же считаются приемлемыми в свете тяжести заболевания.

Согласно настоящему изобретению доза, определенная как подходящая доза для определенного иммунотерапевтического средства для конкретного индивида, представляет собой дозу, при которой по меньшей мере одна известная иммунологическая реакция, которая указывает на приемлемый, предпочтительно оптимальный терапевтический эффект у индивида для этого иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду. Предпочтительно подходящая доза также вызывает минимальное количество нежелательных реакций или побочных эффектов у индивида, независимо от того, вводится она вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством или нет. В одном воплощении, в котором контактирование иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом происходит in vivo, доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект, непосредственно отражает подходящую дозу, то есть подходящая доза для введения иммунотерапевтического средства индивиду будет такой же или близкой к одной или нескольким из множественных различных доз при контакте с иммунореактивным материалом. В одном воплощении, в котором контактирование иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом происходит in vitro, множественные различные дозы, используемые в способе in vitro, не обязательно являются такими, которые при введении индивиду обеспечат приемлемый терапевтический эффект. Таким образом, доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект in vitro, может отражать подходящую дозу косвенно. Взаимосвязь между дозой при контакте in vitro и эквивалентной ей дозой in vivo либо известна, либо может быть определена методами, известными в данной области. Например, если доза иммунотерапевтического средства при контакте in vitro представляет собой количество, относящееся к числу иммунных клеток при контактировании (например, 10 нг/10⁸ клеток), то эквивалентной дозой in vivo будет доза, которая дает такое же или близкое содержание иммунотерапевтического средства в крови по отношению к такому же числу таких же иммунных клеток (10 нг/10⁸ таких же клеток).

Терапевтический эффект будет зависеть от того терапевтического эффекта, который ожидается от данного иммунотерапевтического средства. В одном воплощении приемлемый терапевтический эффект включает, без ограничения, остановку или замедление течения заболевания; торможение или замедление развития нового заболевания у индивида; уменьшение частоты или тяжести симптомов и/или рецидивов у индивида, у которого в настоящее время имеется или ранее было заболевание; и/или продление, то есть повышение продолжительности жизни индивида. В одном воплощении типичным оптимальным терапевтическим эффектом является тот, при котором заболевание устраняется так, что никакого дальнейшего лечения не требуется. В одном воплощении, в котором заболевание представляет собой рак, приемлемым терапевтическим эффектом является такой, при котором по крайней мере не увеличивается размер и/или количество опухолей, предпочтительно такой, при котором размер и/или количество опухолей уменьшается, а оптимальным терапевтическим эффектом будет полное исчезновение всевозможных опухолей и не потребуется дальнейшее введение иммунотерапевтического средства.

Если было установлено, что по меньшей мере одна иммунологическая реакция или определенное изменение по меньшей мере одной иммунологической реакции указывает на приемлемый терапевтический эффект, то доза, которая дает такую же реакцию или ее изменение, является подходящей дозой для получения приемлемого терапевтического эффекта. Кроме того, сила или слабость по меньшей мере одной иммунологической реакции или ее изменения также могут указывать на силу или слабость терапевтического эффекта при этой дозе. Для многих иммунотерапевтических средств известны корреляции между по меньшей мере одной иммунологической реакцией и терапевтическим эффектом. Более того, такие корреляции могут быть определены методами, известными в данной области. Например, может быть измерена по меньшей мере одна иммунологическая реакция у одного или нескольких индивидов, получавших иммунотерапевтическое средство в дозе, которая давала терапевтический эффект, предпочтительно приемлемый терапевтический эффект, причем по меньшей мере одна иммунологическая реакция, последовательно наблюдалась среди индивидов, указывает на терапевтический эффект, предпочтительно приемлемый терапевтический эффект для этого иммунотерапевтического средства. К примеру, если доза иммунотерапевтического средства, дающая приемлемый терапевтический эффект, последовательно коррелирует с повышением экспрессии трех разных цитокинов и дифференцировкой определенного типа иммунных клеток в более зрелые иммунные клетки, то повышение экспрессии трех разных цитокинов и дифференцировка иммунных клеток являются иммунологическими реакциями, указывающими на приемлемый терапевтический эффект. Таким образом можно определить комплект иммунологических реакций или "набор параметров", указывающих на терапевтический эффект для любого иммунотерапевтического средства. В одном воплощении изобретения, если известный набор иммунологических реакций, указывающих на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, такой же или практически такой же, как у индивида, получавшего дозу иммунотерапевтического средства, то введенная доза отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду.

Типичные воплощения изобретения включают, без ограничения, такие, в которых (i) приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства установлен по наибольшему уровню экспрессии определенного цитокина, а подходящая доза для индивида представлена дозой, дающей наибольший уровень экспрессии данного цитокина; или (ii) приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства установлен по наименьшему уровню экспрессии определенного цитокина, а подходящая доза для индивида представлена дозой, дающей наименьший уровень экспрессии данного цитокина; или (iii) приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства установлен по индукции экспрессии определенного цитокина, а подходящая доза для индивида представлена дозой, вызывающей экспрессию данного цитокина; или (iv) приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства установлен по специфическому профилю экспрессии нескольких цитокинов, а подходящая доза для индивида представлена дозой, дающей практически такой же специфический профиль экспрессии нескольких цитокинов; или (v) приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства установлен по индукции дифференцировки определенных иммунных клеток, а подходящая доза для индивида представлена дозой, вызывающей такую же или близкую дифференцировку определенных иммунных клеток; или (v) приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства установлен по индукции или усилению эффекторной функции иммунных клеток, например, Т-клеток, а подходящая доза для индивида представлена дозой, вызывающей такую же или близкую индукцию или усиление эффекторной функции иммунных клеток.

Настоящее изобретение также касается способа лечения индивидов подходящими дозами иммунотерапевтического средства, включающего введение индивиду дозы иммунотерапевтического средства, которая была установлена как подходящая в соответствии со способами изобретения. Предпочтительно иммунотерапевтическим средством служит агонист TLR. В одном воплощении способ лечения индивидов подходящими дозами иммунотерапевтического средства включает: (а) раздельное контактирование множественных различных доз иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида, (b) измерение по меньшей мере одной иммунологической реакции, вызванной множественными различными дозами иммунотерапевтического средства, причем доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения индивиду, и (с) введение иммунотерапевтического средства индивиду в подходящей дозе. В одном воплощении способ лечения индивидов подходящими дозами иммунотерапевтического средства включает введение иммунотерапевтического средства индивиду в подходящей дозе, причем подходящая доза определяется путем (а) раздельного контактирования множественных различных доз иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида и (b) измерения по меньшей мере одной иммунологической реакции, вызванной множественными различными дозами иммунотерапевтического средства, причем доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения индивиду.

В одном воплощении подходящая доза иммунотерапевтического средства вводится вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством. В этом воплощении подходящей дозой иммунотерапевтического средства является доза, при которой без введения по меньшей мере одного антитоксического средства выявляется по меньшей мере один побочный эффект.

В предпочтительном воплощении способ представляет собой способ иммунотерапии для лечения рака, а иммунотерапевтическим средством служит нуклеиновая кислота, предпочтительно одноцепочечная РНК, кодирующая один или несколько эпитопов, специфически экспрессирующихся на раковых клетках. Предпочтительно один или несколько эпитопов представлены неоэпитопами.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятными из следующего подробного описания и формулы изобретения.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, следует иметь в виду, что данное изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными методологиями, протоколами и реагентами, так как они могут варьироваться. Также следует иметь в виду, что применяемая здесь терминология предназначается только для описания конкретных воплощений и не должна ограничивать объем настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют те значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области.

Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы приводятся вместе с конкретными воплощениями, однако следует иметь в виду, что они могут комбинироваться любым образом и в любом количестве для создания дополнительных воплощений. Описанные по-разному предпочтительные воплощения не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение только описанными явно воплощениями. Следует иметь в виду, что это описание поддерживает и охватывает воплощения, в которых описанные явно воплощения комбинируются с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в настоящей заявке следует рассматривать как раскрытые при описании настоящей заявки, если контекстом не указано иначе.

Предпочтительно используемые здесь термины определяются так, как описано в "A Multilingual Glossary of Biotechnological Terms (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, В. Nagel, and H. Kolbl, Eds. (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Швейцария.

В практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иначе, стандартные методы биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методы рекомбинантной ДНК, которые описаны в литературе по данной области (например, см. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, M.R. Green, J. Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2012).

По всему описанию и в последующей формуле изобретения, если из контекста не следует иначе, слово "включать" и такие варианты, как "включает" и "включающий", подразумевают включение указанного члена, целого числа или стадии либо группы членов, целых чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого члена, целого числа или стадии либо группы членов, целых чисел или стадий, хотя в некоторых воплощениях такие другие члены, целые числа или стадии либо группы членов, целых чисел или стадий могут исключаться, т.е. сущность заключается во включении указанного члена, целого числа или стадии либо группы членов, целых чисел или стадий. Термины в единственном числе и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), следует рассматривать как охватывающие как единственное, так и множественное число, если не указано иначе или прямо не противоречит контексту. При этом указание диапазонов значений просто служит сокращенным способом индивидуального указания каждого отдельного значения, попадающего в этот диапазон. Если не указано иначе, каждое отдельное значение включается в описание, как если бы оно было указано индивидуально.

Все описанные здесь способы могут выполняться в любом подходящем порядке, если не указано иначе или прямо не противоречит контексту.

Использование всевозможных примеров или примерной лексики (например, "как-то"), представленных здесь, служит просто для лучшей иллюстрации изобретения и не накладывает ограничений на объем притязаний, заявленных в настоящем изобретении. Никакая лексика в описании не должна рассматриваться как указывающая на какой-либо не заявленный элемент, существенный для практического применения изобретения.

По всему тексту описания цитируются некоторые документы. Каждый из приведенных здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, настоящим включаются в качестве ссылки во всей полноте. Ничто в данном документе не должно быть истолковано как допущение того, что изобретение не может предшествовать такому раскрытию в силу предшествующего изобретения.

Настоящим изобретением предусмотрена иммунотерапия заболеваний введением подходящей дозы иммунотерапевтического средства, причем подходящая доза определяется описанными здесь способами. Поскольку эффективность иммунотерапевтического средства будет зависеть от естественных вариаций среди индивидов в отношении их иммунной системы, то для каждого пациента нужно определять индивидуально подходящую терапевтически эффективную и предпочтительно нетоксичную дозу. В одном предпочтительном воплощении иммунотерапевтическое средство предназначается для лечения рака. В одном предпочтительном воплощении иммунотерапия может осуществляться методами активной иммунотерапии.

Изобретение конкретно касается определения подходящей дозы иммунотерапевтического средства для индивида. Как только такая подходящая доза установлена, иммунотерапевтическое средство можно вводить индивиду в этой дозе с тем, чтобы индуцировать иммунологическую реакцию типа иммунного ответа против конкретной цели. В предпочтительном воплощении иммунный ответ индуцирует и/или активирует соответствующие эффекторные клетки типа Т-клеток, которые распознают эпитопы, экспрессированные на опухолевых клетках, через соответствующий антигеновый рецептор типа Т-клеточного рецептора или искусственного Т-клеточного рецептора, что приводит к гибели пораженных клеток, экспрессирующих эпитоп.

Иммунотерапевтические подходы, охватываемые изобретением, включают иммунизацию с помощью i) пептида или полипептида, содержащего эпитоп, ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, содержащий эпитоп, или iii) рекомбинантного вируса, кодирующего пептид или полипептид, содержащий эпитоп.

Дендритные клетки (DCs) представляют собой популяции лейкоцитов, которые презентируют антигены, захваченные в периферических тканях, к Т-клеткам через пути презентации антигенов МНС класса II и класса I. Хорошо известно, что DCs являются мощными индукторами иммунных реакций, а активация этих клеток является решающей стадией для индукции противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки для удобства подразделяют на "незрелые" и "зрелые" клетки, что можно использовать в качестве простого способа различения между двумя хорошо изученными фенотипами. Однако эту номенклатуру не следует интерпретировать как исключающую все возможные промежуточные стадии дифференциации. Незрелые дендритные клетки характеризуются как антигенпрезентирующие клетки с высокой способностью к поглощению и процессингу антигенов, что коррелирует с сильной экспрессией Fcγ-рецептора и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно характеризуется меньшей экспрессией этих маркеров, но сильной экспрессией молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, типа МНС класса I и класса II, молекул адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующих молекул (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 ВВ). Созреванием DC называется такое состояние активации DC, при котором такие антигенпрезентирующие DC вызывают прайминг Т-клеток, тогда как их презентация незрелыми DC приводит к толерантности. Созревание DC главным образом вызывают биомолекулы с микробными признаками (бактериальная ДНК, вирусная РНК, эндотоксин и др.), которые распознаются врожденными рецепторами (распознающими паттерны рецепторами), противовоспалительные цитокины (TNF, IL-1, IFNs), лигирование CD40 на поверхности DC с CD40L, и вещества, выделяющиеся из клеток, подвергающихся стрессовой гибели. DC могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга, а также клеток, полученных из лейкоцитной пленки или цельной крови, in vitro с такими цитокинами, как колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и IL-4.

Предпочтительными иммунотерапевтическими средствами являются иммунореактивные пептиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько таких пептидов, причем пептиды могут содержать эпитопы, предпочтительно неоэпитопы, возникающие при специфичных для заболевания мутациях. Термин "специфичная для заболевания мутация" в контексте настоящего изобретения относится к таким соматическим мутациям, которые присутствуют в нуклеиновой кислоте больной клетки, но отсутствуют в нуклеиновой кислоте соответствующей нормальной, не больной клетки. Заболевание может быть раковым, поэтому термин "опухолеспецифичная мутация" или "специфичная для рака мутация" относится к таким соматическим мутациям, которые присутствуют в нуклеиновой кислоте опухоли или раковой клетки, но отсутствуют в нуклеиновой кислоте соответствующей нормальной, т.е. неопухолевой или незлокачественной клетки. Термины "опухолеспецифичная мутация" и "опухолевая мутация" и термины "специфичная для рака мутация" и "раковая мутация" применяются здесь взаимозаменяемым образом.

В тех воплощениях, где иммунотерапевтическое средство представляет собой антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую данный антиген, "клеточный иммунитет", "клеточная реакция", "клеточный ответ против антигена" и подобные термины охватывают клеточные иммунологические реакции, направленные на клетки, характеризующиеся презентацией антигенов с МНС класса I или класса II. Клеточные реакции относятся к клеткам, называемым Т-клетками или Т-лимфоцитами, которые действуют либо как "хелперы", либо как "киллеры". Хелперные Т-клетки (также называются Т-клетками CD4⁺) играют центральную роль в регуляции иммунного ответа, а клетки-киллеры (также называются цитотоксическими Т-клетками, цитолитическими Т-клетками, Т-клетками CD8⁺ или CTLs) убивают больные клетки типа раковых клеток и предотвращают появление еще большего числа больных клеток. Предпочтительно противоопухолевая реакция CTLs вырабатывается против опухолевых клеток, экспрессирующих один или несколько опухолевых антигенов, и предпочтительно они презентируют такие экспрессируемые в опухолях антигены с МНС класса I.

"Антиген" по изобретению охватывает любые вещества, предпочтительно пептиды или белки, который являются мишенью и/или индуцируют иммунный ответ типа специфической реакции с антителами или Т-лимфоцитами (Т-клетками). Предпочтительно антиген содержит по меньшей мере один эпитоп типа Т-клеточного эпитопа. Предпочтительно антигеном в контексте настоящего изобретения является молекула, которая, необязательно после процессинга, индуцирует иммунную реакцию, которая предпочтительно специфична для антигена (включая клетки, экспрессирующие антиген). Антиген или его Т-клеточный эпитоп предпочтительно презентируется клетками, предпочтительно антигенпрезентирующими клетками, включая больные клетки, в частности раковые клетки, в контексте молекул МНС, что вызывает иммунный ответ против антигена (включая клетки, экспрессирующие антиген). Антигеном предпочтительно является продукт, который соответствует природному антигену или получен из него. Такие природные антигены могут включать аллергены, вирусы, бактерии, грибки, паразиты и другие возбудители инфекций и патогены или могут быть получены из них, или же антигеном может быть опухолевый антиген. Согласно настоящему изобретению, антиген может соответствовать встречающемуся в природе продукту, например, вирусному белку или его части. В предпочтительных воплощениях антиген представляет собой поверхностный полипептид, то есть это полипептид, естественным образом выставленный на поверхности клетки, патогена, бактерии, вируса, гриба, паразита, аллергена или опухоли. Антиген может вызывать иммунный ответ против клетки, патогена, бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли.

Термин "связанный с заболеванием антиген" или "специфичный для заболевания антиген" применяется в самом широком смысле для обозначения любых антигенов, связанных или специфичных для заболевания. Такие антигены представляют собой молекулы, содержащие эпитопы, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина на выработку специфичного к антигену клеточного иммунитета и/или антительного гуморального иммунитета против заболевания. Поэтому связанные с заболеваниями антигены могут применяться в терапевтических целях. Связанные с заболеваниями антигены предпочтительно связаны с инфицированием микробами, обычно это микробные антигены, или же связаны с раком, обычно с опухолями.

Термин "патоген" обозначает патогенный биологический материал, способный вызывать заболевания у организмов, предпочтительно у позвоночных организмов. Патогены включают такие микроорганизмы, как бактерии, одноклеточные эукариотические организмы (простейшие), грибы, а также вирусы.

В контексте настоящего изобретения термин "опухолевый антиген" или "связанный с опухолью антиген" относится к таким белкам, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в ограниченном числе тканей и/или органов либо на определенных стадиях развития, к примеру, опухолевый антиген в нормальных условиях может специфически экспрессироваться в ткани желудка, предпочтительно в слизистой желудка, в репродуктивных органах, например, в яичках, в трофобластической ткани, например, в плаценте или в гаметных клетках, и экспрессироваться или аномально экспрессироваться в одной или нескольких опухолевых или раковых тканях. В этом контексте "ограниченное количество" предпочтительно означает не более 3, более предпочтительно не более 2. Опухолевые антигены в контексте настоящего изобретения включают, к примеру, дифференцировочные антигены, предпочтительно антигены, специфичные для типа клеток, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в клетках определенного типа на определенной стадии дифференцировки, раковые/яичковые антигены, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в яичках и иногда в плаценте, а также специфичные гаметные антигены. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген предпочтительно связан с клеточной поверхностью раковой клетки и предпочтительно не экспрессируется или редко экспрессируется в нормальных тканях. Предпочтительно опухолевый антиген или аномальная экспрессия опухолевого антигена идентифицирует раковые клетки. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген, который экспрессируется раковыми клетками у субъекта, например, пациента, страдающего раковым заболеванием, может быть собственным белком или несобственным белком. В предпочтительных воплощениях опухолевый антиген в контексте настоящего изобретения в нормальных условиях специфически экспрессируется в раковых тканях или в тканях или органах, которые не являются незаменимыми, то есть в тканях или органах, которые при повреждении иммунной системой не вызывают смерти субъекта, либо в органах или структурах организма, которые не доступны или труднодоступны для иммунной системы или защищены по механизму толерантности, например, наличием клеток T_reg в высокой концентрации. Аминокислотная последовательность опухолевого антигена может быть идентичной между опухолевым антигеном, который экспрессируется в нормальных тканях, и опухолевым антигеном, который экспрессируется в раковых тканях, или же аминокислотные последовательности могут отличаться, например, только по одной аминокислоте или более чем по одной аминокислоте, предпочтительно более чем по 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотам. Термины "опухолевый антиген", "экспрессирующийся в опухоли антиген", "раковый антиген" и "экспрессирующийся при раке антиген" являются эквивалентами и применяются здесь взаимозаменяемым образом.

Термины "эпитоп", "антигенный пептид", "антигенный эпитоп", "иммуногенный пептид" и "МНС-связывающий пептид" применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к антигенной детерминанте в молекулах типа антигена, то есть к части или фрагменту иммунологически активного соединения, которое распознается иммунной системой, к примеру, распознается Т-клетками, в частности, при презентации в контексте молекул МНС. Эпитоп белка предпочтительно содержит непрерывную или прерывистую часть данного белка и предпочтительно длиной от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот, например, эпитоп предпочтительно может быть длиной в 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот.Согласно изобретению, эпитоп может связываться с молекулами МНС типа молекул МНС на поверхности клетки, поэтому это может быть "пептид, связывающийся с МНС" или "антигенный пептид". Термин "главный комплекс гистосовместимости" и аббревиатура "МНС" включает молекулы МНС класса I и МНС класса II и относится к комплексу генов, который присутствует у всех позвоночных. Белки или молекулы МНС важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антиген-презентирующими клетками или больными клетками при иммунных реакциях, причем белки или молекулы МНС связывают пептиды и презентируют их для распознавания Т-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые МНС, экспрессируются на поверхности клеток и презентируют и собственные антигены (фрагменты пептидов самой клетки), и несобственные антигены (например, фрагменты вторгающихся микроорганизмов) Т-клеткам. Предпочтительно такие иммуногенные части связываются с молекулами МНС класса I или класса II. При этом считается, что иммуногенная часть "связывается" с молекулой МНС класса I или класса II, если такое связывание обнаруживается любым методом, известным в данной области. Термин "МНС-связывающий пептид" относится к пептидам, которые связываются с молекулами МНС класса I и/или МНС класса II. В случае комплексов пептид/МНС класса I связывающиеся пептиды обычно имеют длину в 8-10 аминокислот, хотя и более длинные или короткие пептиды могут быть более эффективными. В случае комплексов пептид/МНС класса II связывающиеся пептиды обычно имеют длину в 10-25 аминокислот, в особенности 13-18 аминокислот, причем могут быть эффективными и более длинные, и более короткие пептиды.

В настоящем изобретении термин "неоэпитоп" означает такой эпитоп, который отсутствует у стандартных типа нормальных нераковых клеток или гаметных клеток, но встречается в пораженных клетках типа раковых клеток. Это включает, в частности, ситуации, при которых соответствующий эпитоп встречается в нормальных нераковых или гаметных клетках, однако из-за одной или нескольких мутаций в раковых клетках последовательность эпитопа изменяется так, что возникает неоэпитоп.Кроме того, неоэпитоп может быть не только специфичным для больных клеток, но также специфичным для пациента с этим заболеванием.

В одном особенно предпочтительном воплощении изобретения эпитоп или неоэпитоп представляет собой Т-клеточный эпитоп. При этом термин "Т-клеточный эпитоп" относится к пептидам, которые связываются с молекулой МНС в конфигурации, распознаваемой Т-клеточным рецептором. Как правило, Т-клеточные эпитопы представлены на поверхности антигенпрезентирующих клеток.

В настоящем изобретении термин "прогнозирование иммуногенных модификаций аминокислот" относится к прогнозированию того, будет ли пептид, содержащий такую модификацию аминокислот, иммуногенным и тем самым полезным в качестве эпитопа, в частности Т-клеточного эпитопа, при вакцинации.

Согласно изобретению, Т-клеточный эпитоп может присутствовать в вакцине как часть более крупного объекта типа вакцинной последовательность и/или полипептида, содержащего более чем один Т-клеточный эпитоп. Презентируемый пептид или Т-клеточный эпитоп образуется после соответствующего процессинга.

Т-клеточные эпитопы могут быть модифицированы по одному или нескольким остаткам, не являющимся незаменимыми для распознавания TCR или для связывания с МНС.Такие модифицированные Т-клеточные эпитопы можно считать иммунологически эквивалентными.

Предпочтительно Т-клеточный эпитоп, когда он презентирован МНС и распознан Т-клеточным рецептором, в присутствии соответствующих костимулирующих сигналов способен индуцировать клональную экспансию Т-клеток, несущих Т-клеточный рецептор, специфически распознающий комплекс пептид/МНС.

Предпочтительно Т-клеточный эпитоп содержит аминокислотную последовательность, практически соответствующую аминокислотной последовательности фрагмента антигена. Предпочтительно таким фрагментом антигена является пептид, презентируемый МНС класса I и/или класса II.

Т-клеточный эпитоп согласно изобретению предпочтительно относится к той части или фрагменту антигена, который способен стимулировать иммунный ответ, предпочтительно клеточный ответ против антигена или клеток, характеризующихся экспрессией антигена и предпочтительно презентацией антигена, типа больных клеток, в частности раковых клеток. Предпочтительно Т-клеточный эпитоп способен стимулировать клеточный ответ против клеток, характеризующихся презентацией антигена с МНС класса I, и предпочтительно способен стимулировать чувствительные к антигену цитотоксические Т-лимфоциты (CTL).

В некоторых воплощениях антиген представлен аутоантигеном, в частности, опухолевым антигеном. Опухолевые антигены и их определение известны специалистам.

Термин "иммуногенность" касается относительной эффективности в индуцировании иммунного ответа, который предпочтительно связан с терапевтическим лечением типа лечения против рака. При этом термин "иммуногенный" касается свойства обладания иммуногенностью. Например, термин "иммуногенная модификация" в применении к пептиду, полипептиду или белку касается эффективности данного пептида, полипептида или белка в индуцировании иммунного ответа, вызванного и/или направленого против данной модификации. Предпочтительно немодифицированный пептид, полипептид или белок не индуцирует иммунный ответ, индуцирует другой иммунный ответ или индуцирует другой уровень, предпочтительно более низкий уровень иммунного ответа.

Согласно изобретению, термин "иммуногенность" или "иммуногенный" предпочтительно касается относительной эффективности в индуцировании биологически значимого иммунного ответа, в частности, иммунного ответа, применимого для вакцинации. Так, аминокислотная модификация или модифицированный пептид будет иммуногенным, если он индуцирует иммунный ответ против целевой модификации у субъекта, причем этот иммунный ответ может быть полезным для терапевтических или профилактических целей.

"Процессинг антигена" или "процессинг" означает разложение полипептида или антигена на продукты процессинга, которыми являются фрагменты данного полипептида или антигена (например, разложение полипептида на пептиды), и ассоциацию одного или нескольких из этих фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами МНС для презентации клетками, предпочтительно антигенпрезентирующими клетками, специфичным Т-клеткам.

В одном воплощении иммунотерапевтическое средство может содержать антигенпрезентирующие клетки (АРС), то есть клетки, которые презентируют пептидные фрагменты белковых антигенов в ассоциации с молекулами МНС на своей клеточной поверхности. Некоторые АРС могут активировать антиген-специфичные Т-клетки. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки очень эффективно интернализируют антигены путем фагоцитоза, пиноцитоза или опосредованного рецептором эндоцитоза, а затем выставляют фрагмент антигена, связанный с молекулой МНС класса II, на своей мембране. Т-клетки распознают и взаимодействуют с комплексом антигена и молекулы МНС класса II на мембране антигенпрезентирующих клеток. Затем антигенпрезентирующие клетки вырабатывают дополнительный костимулирующий сигнал, что приводит к активации Т-клеток. Экспрессия костимулирующих молекул является определяющей характеристикой профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Основными типами профессиональных антигенпрезентирующих клеток являются дендритные клетки, которые имеют самый широкий диапазон презентации антигенов и могут считаться самыми важными антиген-презентирующими клетками, а также макрофаги, В-клетки и некоторые активированные эпителиальные клетки.

Непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки не экспрессируют конститутивно белки МНС класса II, необходимые для взаимодействия с наивными Т-клетками CD4⁺; они экспрессируются только при стимуляции непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток некоторыми цитокинами типа IFNγ.

Антигенпрезентирующие клетки могут быть нагружены такими пептидами, которые презентируются с МНС класса I и класса II, путем трансдукции клеток нуклеиновой кислотой, предпочтительно РНК, кодирующей пептид или полипептид, включающий в себя презентируемый пептид, например, нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтическое средство по изобретению, включающее средство доставки генов, нацеленное на дендритные или другие антигенпрезентирующие клетки, может вводиться пациентам, что ведет к трансфекции, происходящей in vivo. Например, трансфекция дендритных клеток in vivo, как правило, может осуществляться любыми методами, известными в данной области, типа методов, описанных в WO 97/24447, или метода с использованием генной пушки, описанного Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997.

Термин "антигенпрезентирующая клетка" также охватывает клетки-мишени.

"Клетки-мишени" означают клетки, которые являются мишенью для иммунного ответа типа клеточного иммунного ответа. Клетки-мишени включают клетки, которые презентируют антиген или эпитоп антигена, то есть пептидный фрагмент, полученный из антигена, и включают любые нежелательные клетки типа раковых клеток. В предпочтительных воплощениях клетки-мишени представляют собой клетки, экспрессирующие антиген, как описано здесь, и предпочтительно презентируют указанный антиген с МНС класса I.

Термин "часть" означает дробную часть. В отношении конкретной структуры типа аминокислотной последовательности или белка термин его/ее "часть" может означать непрерывную или прерывистую долю указанной структуры. Предпочтительно часть аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислот в указанной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, если часть является прерывистой, то данная прерывистая часть состоит из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и более частей структуры, а каждая часть является непрерывным элементом структуры. Например, прерывистая часть аминокислотной последовательности может состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и более, предпочтительно не более чем 4 частей данной аминокислотной последовательности, причем каждая часть предпочтительно содержит по меньшей мере 5 непрерывных аминокислот, по меньшей мере 10 непрерывных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 20 непрерывных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 30 непрерывных аминокислот этой аминокислотной последовательности.

Термины "часть" и "фрагмент" применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к непрерывным элементам. Например, часть структуры типа аминокислотной последовательности или белка означает непрерывный элемент данной структуры.

Доля, часть или фрагмент структуры предпочтительно включает в себя одно или несколько функциональных свойств данной структуры. Например, порция, часть или фрагмент эпитопа, пептида или белка предпочтительно иммунологически эквивалентна тому эпитопу, пептиду или белку, из которого она получена. В контексте настоящего изобретения "часть" структуры типа аминокислотной последовательности предпочтительно включает, предпочтительно составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% всей структуры или аминокислотной последовательности.

В одном воплощении иммунотерапевтическое средство может представлять собой иммунореактивные клетки. Иммунореактивные клетки относятся к иммунореактивному материалу в том смысле, что это клетки, которые выполняют эффекторные функции во время иммунной реакции. Иммунореактивные клетки предпочтительно способны связывать антиген или клетки, характеризующиеся презентацией антигена или антигенного пептида, полученного из антигена, и опосредовать иммунный ответ.Например, такие клетки секретируют цитокины и/или хемокины, секретируют антитела, распознают раковые клетки и необязательно устраняют такие клетки. Например, иммунореактивные клетки включают Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, инфильтрирующие опухоли Т-клетки), В-клетки, природные клетки-киллеры, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения "иммунореактивными клетками" являются Т-клетки, предпочтительно Т-клетки CD4⁺ и/или CD8⁺. В одном воплощении настоящего изобретения иммунореактивный материал индивида предпочтительно включает иммунореактивную клетку или композицию, содержащую иммунореактивную клетку.

"Иммунореактивная клетка" также может распознавать антигены или антигенные пептиды, полученные из антигена, с определенной степенью специфичности, в частности, если они презентированы в контексте молекул МНС типа на поверхности антигенпрезентирующих клеток или больных клеток типа раковых клеток. Предпочтительно такое распознавание способствует тому, что клетки, распознающие антиген или антигенный пептид, полученный из данного антигена, будут реагирующими или реактивными. Если клетки представляют собой хелперные Т-клетки (Т-клетки CD4⁺), несущие рецепторы, распознающие антиген или антигенный пептид, полученный из антигена, в контексте молекул МНС класса II, то такая реакция или реактивность может включать высвобождение цитокинов и/или активацию лимфоцитов CD8⁺ (CTL) и/или В-клеток. Если клетки представляют собой CTL, то такая реакция или реактивность может включать устранение клеток, презентированных в контексте молекул МНС класса I, т.е. клеток, характеризующихся презентацией антигена с МНС класса I, к примеру, путем апоптоза или опосредованного перфорином лизиса клеток. Реакция CTL может включать в себя устойчивый захват кальция, деление клеток, продукцию цитокинов типа IFN-α и TNF-α, возрастание маркеров активации типа CD44 и CD69 и специфическое цитолитическое уничтожение экспрессирующих антиген клеток-мишеней. Реакции CTL также можно определять с помощью искусственного репортера, который служит точным индикатором реакции CTL. Такие CTL, которые распознают антигены или антигенные пептиды, полученные из антигенов, и являются реагирующими или реактивными, также называются "антиген-реагирующими CTL". Если клетки представлены В-клетками, то такая реакция может включать высвобождение иммуноглобулинов.

Термины "Т-клетки" и "Т-лимфоциты" применяются здесь взаимозаменяемо и включают хелперные Т-клетки (Т-клетки CD4⁺) и цитотоксические Т-клетки (CTL, Т-клетки CD8⁺), которые включают и цитолитические Т-клетки.

Т-клетки относятся к группе лейкоцитов, известных как лимфоциты, и играют центральную роль в клеточном иммунитете. Их можно отличить от других типов лимфоцитов, таких как В-клетки и природные клетки-киллеры, по наличию специального рецептора на их клеточной поверхности, называемого Т-клеточным рецептором (TCR). Главным органом, ответственным за созревание Т-клеток, является тимус. Было обнаружено несколько различных подмножеств Т-клеток, каждое из которых имеет свою функцию.

Т-хелперы помогают другим лейкоцитам в иммунологических процессах, включая дифференцировку В-клеток в плазматические клетки и активацию цитотоксических Т-клеток и макрофагов, среди прочих функций. Эти клетки также известны как Т-клетки CD4⁺, так как они экспрессируют белок CD4 на своей поверхности. Хелперные Т-клетки становятся активированными, когда им презентирутся пептидные антигены молекулами МНС класса II, экспрессиранными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АРС) в контексте костимуляции. После активации они быстро делятся и секретируют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют или помогают при активном иммунном ответе.

Цитотоксические Т-клетки разрушают инфицированные вирусами клетки и опухолевые клетки, а также участвуют в отторжении трансплантатов. Эти клетки также известны как Т-клетки CD8⁺, так как они экспрессируют гликопротеин CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои мишени в контексте костимуляции при связывании с антигенами, связанными с МНС класса I, присутствующими на поверхности всех содержащих ядро клеток организма.

Большинство Т-клеток содержат Т-клеточный рецептор (TCR), существующий в виде комплекса из нескольких белков. Т-клеточный рецептор фактически состоит из двух отдельных пептидных цепей, которые вырабатываются из независимых альфа- и бета-генов Т-клеточного рецептора (TCRa и TCRP) и называются α- и β- цепями TCR. Т-клетки γδ (Т-клетки гамма-дельта) составляют небольшое подмножество Т-клеток, содержащих особый Т-клеточный рецептор (TCR) на своей поверхности. Однако у Т-клеток γδ TCR состоит из одной γ-цепи и одной δ-цепи. Эта группа Т-клеток встречается гораздо реже (2% от общего количества Т-клеток), чем Т-клетки αβ.

Согласно изобретению, термин "рецептор антигена" охватывает встречающиеся в природе рецепторы типа Т-клеточных рецепторов, а также сконструированные рецепторы, которые придают произвольную специфичность типа специфичности моноклональных антител иммуноэффекторным клеткам типа Т-клеток. При этом можно получить большое количество антиген-специфичных Т-клеток для адоптивного переноса клеток. Так, антигеновый рецептор по изобретению может находиться на Т-клетках, например, вместо или в дополнение к собственным Т-клеточным рецепторам Т-клетки. Такие Т-клетки необязательно требуют процессинга и презентации антигена для распознавания клетки-мишени, а скорее могут распознавать, предпочтительно специфически, любые антигены, присутствующие в клетке-мишени. Предпочтительно такой рецептор антигена экспрессируется на поверхности клеток. Для целей настоящего изобретения Т-клетки, содержащие рецептор антигена, охватываются термином "Т-клетка", который здесь применяется. В частности, согласно изобретению, термин "рецептор антигена" включает искусственные рецепторы, содержащие одну молекулу или комплекс молекул, распознающих, т.е. связывающихся с целевой структурой (например, антигеном) на клетках-мишенях типа раковых клеток (например, путем связывания антигенсвязывающего сайта или антигенсвязывающего домена с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени), и придающих специфичность иммунноэффекторным клеткам типа Т-клеток, экспрессирующих данный рецептор антигена на поверхности клетки. Предпочтительно распознавание целевой структуры рецептором антигена приводит к активации иммунноэффекторной клетки, экспрессирующей данный рецептор антигена. Рецептор антигена может содержать одну или несколько белковых единиц, причем данные белковые единицы содержат один или несколько доменов, как описано здесь. При этом "рецептор антигена" также может представлять собой "химерный рецептор антиген (CAR)", "химерный Т-клеточный рецептор" или "искусственный Т-клеточный рецептор".

Антиген может распознаваться рецептором антигена через любые домены распознавания антигена (здесь они также называются просто "доменами"), способные образовывать антигенсвязывающий сайт, как-то через антигенсвязывающие участки антител и Т-клеточных рецепторов, которые могут располагаться на одних и тех же или разных пептидных цепях. В одном воплощении два домена, образующие сайт связывания антигена, происходят из иммуноглобулина. В одном воплощении два домена, образующие антигенсвязывающий сайт, происходят из Т-клеточного рецептора. Особенно предпочтительны вариабельные домены антител типа одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), полученных из моноклональных антител, и вариабельных доменов Т-клеточных рецепторов, в частности, одиночных альфа- и бета-цепей TCR. На самом деле в качестве домена распознавания антигена можно использовать почти все, что связывается с данной мишенью с высоким сродством.

Первый сигнал в активации Т-клеток обеспечивается связыванием Т-клеточного рецептора с коротким пептидом, презентированным главным комплексом гистосовместимости (МНС) на другой клетке. Это гарантирует, что активируется только Т-клетка с TCR, специфичным для этого пептида. Партнерскими клетками обычно являются профессиональные антигенпрезентирующие клетки (АРС), обычно это дендритные клетки в случае наивных ответов, хотя В-клетки и макрофаги тоже могут быть важными АРС. Пептиды, презентируемые Т-клеткам CD8⁺ молекулами МНС класса I, обычно имеют длину в 8-10 аминокислот; а пептиды, презентируемые Т-клеткам CD4⁺молекулами МНС класса II, обычно длиннее, так как концы связывающей щели у молекул МНС класса II открыты.

В контексте настоящего изобретения молекула способна связываться с мишенью, если она обладает значительным сродством к данной определенной мишени и связывается с данной определенной целью мишенью при стандартных анализах. "Сродство" или "сродство связывания" часто измеряется по равновесной константе диссоциации (K_D). Молекула (практически) не способна связываться с мишенью, если она не обладает значительным сродством к данной мишени и не связывается в значительной степени с данной мишенью при стандартных анализах.

Цитотоксические Т-лимфоциты можно получать in vivo путем введения антигена или антигенного пептида в антигенпрезентирующие клетки in vivo. Антиген или антигенный пептид может быть представлен в виде белка, в виде ДНК (например, в составе вектора) или в виде РНК. Антиген может подвергаться процессингу с образованием пептидного партнера для молекулы МНС, а его фрагмент может презентироваться и без дальнейшего процессинга. В частности, именно так обстоит дело, если он может связываться с молекулой МНС. Как правило, возможно введение пациентам путем внутрикожной инъекции. Однако инъекция также может проводиться интранодально в лимфатический узел (Maloy et al., 2001, ProcNatl Acad Sci. USA 98: 3299-303) или внутривенно. Другие способы введения могут включать внутримышечное и подкожное введение. Полученные клетки презентируют данный комплекс и распознаются аутологичными цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые затем размножаются.

Специфическая активация Т-клеток CD4⁺ или CD8⁺ может обнаруживаться различными способами. Методы выявления специфической активации Т-клеток включают детектирование пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов (например, лимфокинов) или появления цитолитической активности. Для Т-клеток CD4⁺ предпочтительным способом выявления специфической активации Т-клеток является детектирование пролиферации Т-клеток. Для Т-клеток CD8⁺ предпочтительным способом выявления специфической активации Т-клеток является детектирование появления цитолитической активности.

Под "клеткой, характеризующейся презентацией антигена" или "клеткой, презентирующей антиген" и подобными выражениями подразумевается клетка типа больной клетки, например, раковая клетка или антигенпрезентирующая клетка, презентирующая антиген, который она экспрессируют, или фрагмент, происходящий из данного антигена, например, при процессинге антигена в контексте молекул МНС, в частности, молекул МНС класса I. Аналогичным образом термин "заболевание, характеризующееся презентацией антигена" означает заболевание с участием клеток, характеризующихся презентацией антигена, в частности, с МНС класса I. Презентация антигена клетками может осуществляться путем трансфекции клеток нуклеиновой кислотой типа РНК, кодирующей антиген.

Под "фрагментом антигена, который презентируется" или аналогичными выражениями подразумевается, что этот фрагмент может презентироваться МНС класса I или класса II, предпочтительно МНС класса I, например, при добавлении его непосредственно к антигенпрезентирующим клеткам. В одном воплощении фрагмент представлен таким фрагментом, который естественным образом презентируется клетками, экспрессирующими антиген.

Термин "иммунологически эквивалентный" означает то, что иммунологически эквивалентная молекула типа иммунологически эквивалентной аминокислотной последовательности проявляет такие же или практически такие же иммунологические свойства и/или оказывает такое же или практически такое же иммунологическое действие, например, в отношении типа иммунологического эффекта типа индуцирования гуморального и/или клеточного иммунитета, силы и/или продолжительности индуцированной иммунной реакции или специфичности индуцированной иммунной реакции. В контексте настоящего изобретения термин "иммунологически эквивалентный" может применяться в отношении иммунологических эффектов или свойств пептида, используемого для иммунизации. Например, аминокислотная последовательность иммунологически эквивалентна эталонной аминокислотной последовательности, если данная аминокислотная последовательность при воздействии на иммунную систему субъекта вызывает иммунную реакцию со специфичностью к эталонной аминокислотной последовательности.

Термин "иммуноэффекторные функции" в контексте настоящего изобретения охватывается термином "иммунологическая реакция" в том виде, в котором он здесь используется, и при этом включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, которые приводят, к примеру, к гибели опухолевых клеток или к ингибированию роста опухолей и/или ингибированию развития опухолей, включая ингибирование распространения и метастазирования опухолей. Предпочтительно иммуноэффекторные функции в контексте настоящего изобретения представляют собой опосредованные Т-клетками эффекторные функции. Такие функции в случае хелперных Т-клеток (Т-клеток CD4⁺) включают распознавание антигена или антигенного пептида, происходящего из антигена, в контексте молекул МНС класса II Т-клеточными рецепторами, высвобождение цитокинов и/или активацию лимфоцитов CD8⁺ (CTLs) и/или В-клеток, а в случае CTL - распознавание антигена или антигенного пептида, происходящего из антигена, в контексте молекул МНС класса I Т-клеточными рецепторами, элиминацию клеток, презентированных в контексте молекул МНС класса I, то есть клеток, характеризующихся презентацией антигена с МНС класса I, к примеру, посредством апоптоза или опосредованного перфоринами лизиса клеток, вырабатывание цитокинов типа IFN-γ и TNF-α и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих клеток-мишеней.

Термины "главный комплекс гистосовместимости" и сокращенно "МНС" охватывают молекулы МНС класса I и МНС класса II и относятся к комплексу генов, который встречается у всех позвоночных. Белки или молекулы МНС важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками или больными клетками при иммунных реакциях, в которых белки или молекулы МНС связывают пептиды и презентируют их для распознавания Т-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые МНС, экспрессируются на поверхности клеток и выставляют Т-клеткам как собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и несобственные антигены (например, фрагменты вторгающихся микроорганизмов).

Область МНС подразделяется на три подгруппы: класс I, класс II и класс III. Белки МНС класса I содержат α-цепь и β2-микроглобулин (не входит в состав МНС, кодируемого хромосомой 15). Они презентируют фрагменты антигена цитотоксическим Т-клеткам. У большинства клеток иммунной системы, особенно у антигенпрезентирующих клеток, белки МНС класса II содержат α- и β-цепи и презентируют фрагменты антигена Т-хелперам. Область МНС класса III кодирует другие иммунные компоненты типа компонентов комплемента, а некоторые кодируют цитокины.

МНС является полигенным (имеется несколько генов МНС класса I и МНС класса II) и полиморфным (имеются множественные аллели у каждого гена).

В настоящем изобретении термин "гаплотип" относится к аллелям HLA, находящимся на одной хромосоме, и кодируемым ими белкам. Гаплотип также может относиться к аллелям, находящимся в любом локусе в пределах МНС. Каждый класс МНС представлен несколькими локусами: например, HLA-A (лейкоцитарный антиген А человека), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-Р и HLA-V для класса I и HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA и HLA-DOB для класса П. Термины "аллель HLA" и "аллель МНС" применяются здесь взаимозаменяемым образом.

МНС проявляют крайний полиморфизм. В человеческой популяции в каждом генетическом локусе имеется множество гаплотипов, содержащих различные аллели. Различные полиморфные аллели МНС и класса I, и класса II имеют разные пептидные специфичности в том смысле, что каждый аллель кодирует белки, которые связывают пептиды, проявляющие определенные паттерны последовательности.

В контексте настоящего изобретения молекула МНС предпочтительно означает молекулу HLA.

В контексте настоящего изобретения термин "пептид, связывающийся с МНС" включает пептиды, связывающиеся с МНС класса I и/или класса II, или пептиды, которые могут быть подвергнуты процессингу с образованием пептидов, связывающихся с МНС класса I и/или класса II. В случае комплексов пептид/МНС класса I связывающиеся пептиды обычно имеют длину в 8-12, предпочтительно 8-10 аминокислот, хотя и более длинные или короткие пептиды могут быть более эффективными. В случае комплексов пептид/МНС класса II связывающиеся пептиды обычно имеют длину в 9-30, предпочтительно 10-25 аминокислот, в особенности 13-18 аминокислот, хотя могут быть эффективными и более длинные, и более короткие пептиды.

В одном воплощении иммунотерапевтическое средство, используемое в способах по изобретению, может включать антигенный пептид или нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенный пептид. "Антигенный пептид" предпочтительно относится к частям или фрагментам антигена, способным стимулировать иммунный ответ, предпочтительно клеточный ответ против антигена или клеток, характеризующихся экспрессией антигена, и, предпочтительно, презентацией антигена типа из больных клеток, в частности, раковых клеток. Предпочтительно антигенный пептид способен стимулировать клеточный ответ против клеток, характеризующихся презентацией антигена с МНС класса I, и предпочтительно способен стимулировать реагирующие на антиген цитотоксические Т-лимфоциты (CTL). Предпочтительно антигенные пептиды являются презентируемыми пептидами МНС класса I и/или класса II или могут подвергаться процессингу с образованием презентируемых пептидов МНС класса I и/или класса II. Предпочтительно антигенные пептиды имеют аминокислотную последовательность, которая в основном соответствует аминокислотной последовательности фрагмента антигена. Предпочтительно таким фрагментом антигена является презентируемым пептидом МНС класса I и/или класса II. Предпочтительно антигенный пептид имеет аминокислотную последовательность, которая в основном соответствует аминокислотной последовательности такого фрагмента, и подвергается процессингу с образованием такого фрагмента, то есть презентируемого пептида МНС класса I и/или класса II, происходящего из антигена.

Если пептид будет презентироваться непосредственно, то есть без процессинга, в частности, без расщепления, то он должен иметь длину, подходящую для связывания с молекулой МНС, в частности, с молекулой МНС класса I, предпочтительно длину в 7-20 аминокислот, более предпочтительно в 7-12 аминокислот, более предпочтительно 8-11 аминокислот, в частности, длину в 9 или 10 аминокислот.

Если пептид является частью более крупного объекта, содержащего дополнительные последовательности, например, последовательности вакцины или полипептида, и должен презентироваться после процессинга, в частности, после расщепления, то пептид, полученный при процессинге, должен иметь длину, подходящую для связывания с молекулой МНС, в частности, с молекулой МНС класса I, предпочтительно длину в 7-20 аминокислот, более предпочтительно в 7-12 аминокислот, более предпочтительно 8-11 аминокислот, в частности, длину в 9 или 10 аминокислот. Предпочтительно последовательность пептида, который должен презентироваться после процессинга, происходит из аминокислотной последовательности антигена, то есть его последовательность в основном соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена. Таким образом, связывающийся с МНС пептид имеет последовательность, которая в основном соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена.

Пептиды, у которых аминокислотные последовательности в основном соответствуют последовательности пептидов, презентирующихся МНС класса I, могут отличаться по одному или нескольким остаткам, несущественным для распознавания TCR пептида, презентированного с МНС класса I, или для связывания пептида с МНС. Такие соответствующие в основном пептиды тоже способны стимулировать реагирующие на антиген CTL и могут считаться иммунологически эквивалентными. Пептиды, у которых аминокислотные последовательности отличаются от презентирующихся пептидов по остаткам, не влияющим на распознавание TCR, но улучшающим стабильность связывания с МНС, могут улучшить иммуногенность антигенного пептида и могут упоминаться здесь как "оптимизированные пептиды". Используя имеющиеся знания о том, какие из этих остатков могут скорее повлиять на связывание с МНС либо с TCR, можно применить рациональный подход к разработке в основном соответствующих пептидов. Полученные при этом пептиды, которые будут функциональными, считаются антигенными пептидами.

Антигенный пептид, когда он презентируется МНС, должен распознаваться Т-клеточным рецептором. Предпочтительно антигенный пептид, если он распознается Т-клеточным рецептором, способен при наличии соответствующих костимулирующих сигналов индуцировать клональную экспансию Т-клеток, несущих Т-клеточный рецептор, специфически распознающий этот антигенный пептид. Предпочтительно антигенные пептиды, в частности, если они презентируются в контексте молекул МНС, способны стимулировать иммунный ответ, предпочтительно клеточный ответ против антигена, из которого они получены, или против клеток, характеризующихся экспрессией антигена и предпочтительно презентацией антигена. Предпочтительно антигенный пептид способен стимулировать клеточный ответ против клеток, характеризующихся презентацией антигена с МНС класса I, и предпочтительно способен стимулировать реагирующие на антиген CTL. Такие клетки предпочтительно являются клетками-мишенями.

Термин "геном" относится к общему количеству генетической информации в хромосомах организма или клетки.

Термин "экзом" относится к той части генома организма, которую составляют экзоны, то есть кодирующие части экспрессируемых генов. Экзом обеспечивает генетический шаблон, используемый при синтезе белков и других функциональных генных продуктов. Это наиболее функционально релевантная часть генома, поэтому она вносит наибольший вклад в фенотип организма. По оценкам, у генома человека экзом составляет 1,5% от всего генома (Ng et al., 2008, PLoS Gen., 4(8): 1-15).

Термин "транскриптом" относится к комплекту всех молекул РНК, включая мРНК, рРНК, тРНК и другие некодирующие РНК, продуцируемые в одной клетке или популяции клеток. В контексте настоящего изобретения транскриптом означает набор всех молекул РНК, вырабатываемых в одной клетке, популяции клеток, предпочтительно популяции раковых клеток, или всех клеток данного индивида в определенный момент времени.

"Нуклеиновая кислота" предпочтительно представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), более предпочтительно РНК, наиболее предпочтительно транскрибируемую in vitro РНК (IVT РНК) или синтетическую РНК. Нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК, мРНК, полученные рекомбинантно и синтезированные химически молекулы. Нуклеиновая кислота может присутствовать в виде одноцепочечной или двухцепочечной и линейной или ковалентно замкнутой кольцевой молекулы. Нуклеиновая кислота может быть выделенной. Термин "выделенная нуклеиновая кислота" означает, что нуклеиновая кислота (i) была амплифицирована in vitro, к примеру, методом полимеразной цепной реакции (ПНР), (ii) была получена рекомбинантно путем клонирования, (iii) была очищена, к примеру, путем расщепления и разделения методом гель-электрофореза, или (iv) была синтезирована, к примеру, путем химического синтеза. Нуклеиновая кислота может использоваться для введения в клетки, т.е. трансфекции, в частности, в виде РНК, которая может быть получена путем транскрипции in vitro с ДНК-матрицы. Кроме того, РНК может быть модифицирована перед применением путем стабилизации последовательностей, кэппинга и полиаденилирования.

Термин "генетический материал" относится к выделенной нуклеиновой кислоте, будь то ДНК или РНК, участкам двойной спирали, частям хромосом или полному геному организма или клетки, в частности, их экзому или транскриптому.

Термин "мутация" означает изменение или отличие в последовательности нуклеиновой кислоты (замена, добавление или делеция нуклеотидов) по сравнению с эталоном. "Соматическая мутация" может возникать в любых клетках организма, кроме половых клеток (сперматозоиды и яйцеклетки), поэтому она не передается детям. Эти изменения могут (но не всегда) вызывать рак или другие заболевания. Предпочтительно мутация является несинонимичной мутацией. Термин "несинонимичная мутация" означает такую мутацию, предпочтительно замену нуклеотидов, которая ведет к замене аминокислоты типа замены аминокислоты в продукте трансляции, которая предпочтительно приводит к образованию неоэпитопа.

Термин "мутация" включает точечные мутации, инсерционно-делеционные мутации, слияния, хромотрипсис и правки РНК.

Термин "инсерционно-делеционная мутация" описывает особый класс мутаций, определяемый как мутации, приводящие к колокализованной вставке и делеции и чистому приросту или потере в нуклеотидах. В кодирующих участках генома, если длина инсерционно-делеционной мутации не кратна 3, они вызывают мутации со сдвигом рамки. Инсерционно-делеционные мутации противоположны точечным мутациям; если инсерционно-делеционная мутация означает вставки и делеции нуклеотидов из последовательности, то точечная мутация является формой замены, при которой заменяется один из нуклеотидов.

При слиянии могут образоваться гибридные гены, составленные из двух прежде отдельных генов. Это может произойти в результате транслокации, интерстициальной делеции или хромосомной инверсии. Зачастую слитые гены являются онкогенами. Онкогенное слияние генов может приводить к получению генных продуктов с новой или отличной функцией от двух партнеров по слиянию. С другой стороны, при слиянии протоонкогена с сильным промотором онкогенная функция будет усиливаться под действием сильного промотора от вышележащего партнера по слиянию. Онкогенные слияния транскриптов также могут быть вызваны явлениями транссплайсинга или перескока при считывании.

Термин "хромотрипсис" относится к генетическому феномену, при котором определенные участки генома разрушаются, а затем сшиваются вместе при одном разрушительном событии.

Термин "правка РНК" или "редактирование РНК" относится к молекулярным процессам, при которых информационное содержание в молекуле РНК изменяется в результате химического изменения состава оснований. Редактирование РНК включает модификации нуклеозидов типа дезаминирования цитидина (С) в уридин (U) и аденозина (А) в инозин (I), а также добавления и вставки нуклеотидов без матрицы. Правка РНК в мРНК эффективно изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка так, что она отличается от предсказанной по последовательности геномной ДНК.

Термин "сигнатура раковых мутаций" относится к набору мутаций, присутствующих в раковых клетках по сравнению с нераковыми эталонными клетками.

"Эталон" в контексте настоящего изобретения может применяться для сопоставления и сравнения результатов, полученных на образцах опухолей. Как правило, "эталон" может быть получен на основе одного или нескольких нормальных образцов, в частности образцов, не подверженных раковым заболеваниям, полученных либо от пациентов, либо от одного или нескольких различных лиц, предпочтительно здоровых людей, в частности индивидов одного и того же вида. "Эталон" может быть определен эмпирически путем тестирования достаточно большого числа нормальных образцов.

Специфичные для заболевания мутации могут быть установлены любым подходящим методом секвенирования, предпочтительно методом секвенирования следующего поколения (NGS). В будущем методы секвенирования третьего поколения могут заменить технологию NGS для ускорения стадии секвенирования в методе. Для ясности: термины "секвенирование следующего поколения" или "NGS" в контексте настоящего изобретения означают все новые технологии высокопроизводительного секвенирования, которые, в отличие от "стандартной" методологии секвенирования, известной как химия Сэнгера, считывают матрицы нуклеиновых кислот случайным образом параллельно по всему геному, разбивая весь геном на мелкие кусочки. Такие технологии NGS (также известные как технологии массового параллельного секвенирования) способны поставлять информацию о последовательностях нуклеиновых кислот всего генома, экзома, транскриптома (всех транскрибируемых последовательностей генома) или метилома (всех метилированных последовательностей генома) за очень короткий период времени, например, в пределах 1-2 недель, предпочтительно в пределах 1-7 дней или наиболее предпочтительно в пределах менее 24 часов, и в принципе позволяют проводить секвенирование отдельных клеток. В контексте настоящего изобретения можно использовать многие платформы NGS, которые коммерчески доступны или приведены в литературе, например, подробно описанные в Zhang et al., 2011. The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38(3): 95-109; или в Voelkerding et al., 2009. Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical Chemistry 55:641-658.

Предпочтительно исходным материалом для NGS служат препараты ДНК и РНК. Такие нуклеиновые кислоты можно легко получить из образцов типа биологического материала, например, из свежих, быстрозамороженных или фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) опухолевых тканей либо из свежевыделенных клеток или из CTCs, присутствующих в периферической крови пациентов. Можно выделить нормальную немутантную геномную ДНК или РНК из нормальной соматической ткани, однако в контексте настоящего изобретения предпочтительными являются клетки гаметной линии. ДНК или РНК зародышевой линии выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) у пациентов с негематологическими раковыми заболеваниями. Несмотря на то, что нуклеиновые кислоты, экстрагированные из тканей FFPE или свежевыделенных отдельных клеток, сильно фрагментированы, они подходят для применения в NGS.

В литературе описано несколько прицельных методов NGS для секвенирования экзома (например, см. Teer and Mullikin, 2010, Human Mol Genet 19 (2): R145-51), которые все могут применяться в связи с настоящим изобретением. Во многих из этих методов (например, описанных как захват генома, разделение генома, обогащение генома и т.д.) применяются методы гибридизации, в том числе методы гибридизации на основе матриц (например, Hodges et al., 2007, Nat. Genet. 39: 1522-1527) и в жидкой фазе (например, Choi et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 19096-19101). Также доступны коммерческие наборы для получения образцов ДНК и последующего захвата экзома, к примеру, набор TruSeq™ для получения образцов ДНК и набор Exome TruSeq™ для обогащения экзома фирмы Illumina Inc. (San Diego, California).

Для того, чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов при выявлении специфичных для рака соматических мутаций или различий в последовательностях при сравнении, например, последовательности образца опухоли с последовательностью образца сравнения типа последовательности образца зародышевой линии, предпочтительно определять последовательность в повторных пробах от одного или обоих типов этих образцов. Так, предпочтительно последовательность эталонного образца типа последовательности образца зародышевой линии определяют дважды, трижды или больше раз. С другой стороны, и последовательность образца опухоли определяют дважды, трижды или больше раз. Также можно определять последовательность эталонного образца типа последовательности образца зародышевой линии и/или последовательность образца опухоли более одного раза, определяя по меньшей мере один раз последовательность в геномной ДНК и по меньшей мере один раз последовательность в РНК данного эталонного образца и/или данного образца опухоли. Например, при определении вариаций между репликатами эталонного образца типа образца зародышевой линии можно оценить ожидаемую долю ложноположительных (FDR) соматических мутаций в виде статистической величины. Технические повторы образца должны давать идентичные результаты, а любая обнаруженная мутация при таком сравнении "того же с тем же" будет ложноположительной. В частности, для определения частоты ложных результатов при выявлении соматических мутаций в образце опухоли по сравнению с контрольным образцом можно использовать технические повторы контрольного образца в качестве эталона для оценки количества ложноположительных результатов. Кроме того, можно объединить различные показатели, связанные с качеством (например, охват или качество SNP), в один показатель качества с помощью метода машинного обучения. Для данной соматической вариации можно просчитать все другие вариации с превышением показателя качества, что позволит ранжировать все вариации в комплекте данных.

В контексте настоящего изобретения термин "РНК" относится к молекулам, которые содержат по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток, а предпочтительно полностью или по существу состоят из рибонуклеотидных остатков. "Рибонуклеотид" означает нуклеотид с гидроксильной группой в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин "РНК" включает двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК типа частично или полностью очищенной РНК, практически чистую РНК, синтетическую РНК и полученную рекомбинантно РНК типа модифицированной РНК, которая отличается от природной РНК добавлением, делецией, заменой и/илиизменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала типа по концам РНК или внутри, к примеру, к одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК также могут содержать нестандартные нуклеотиды типа не встречающихся в природе нуклеотидов или химически синтезированных нуклеотидов или дезоксинуклеотидов. Такие измененные РНК могут упоминаться как аналоги или аналоги природной РНК.

Термин "РНК" включает и предпочтительно относится к "мРНК". Термин "мРНК" означает "матричная РНК" и относится к "транскриптам", которые образуются с использованием ДНК-матрицы и кодируют пептиды или полипептиды. Как правило, мРНК содержит 5'-UTR, область, кодирующую белок, и 3'-UTR. мРНК имеет весьма ограниченный период полураспада в клетках и in vitro. В контексте настоящего изобретения мРНК может быть получена путем транскрипции in vitro с ДНК-матрицы. Методология транскрипции in vitro известна специалистам в данной области. Например, существует много коммерчески доступных наборов для транскрипции in vitro.

Стабильность и эффективность трансляции РНК можно модифицировать по мере необходимости. К примеру, РНК можно стабилизировать и усилить ее трансляцию за счет одной или нескольких модификаций, обладающих стабилизирующим действием и/или повышающих эффективность трансляции РНК. Такие модификации описаны, к примеру, в РСТ/ЕР2006/009448, включенном сюда путем ссылки. Для того, чтобы усилить экспрессию РНК, используемой в воплощениях настоящего изобретения, ее можно модифицировать в пределах кодирующей области, то есть последовательности, кодирующей экспрессируемый пептид или белок, предпочтительно без изменения последовательности экспрессируемого пептида или белка, так, чтобы увеличилось содержание GC для повышения стабильности мРНК, и провести оптимизацию кодонов и тем самым усилить трансляцию в клетках.

Термин "модификация" в контексте РНК, используемой в настоящем изобретении, включает любые модификации РНК, которые не присутствуют естественным образом в данной РНК.

В одном воплощении изобретения РНК, используемая согласно изобретению, не содержит 5'-трифосфатов без кэпов. Удаление таких 5'-трифосфатов без кэпов может осуществляться путем обработки РНК фосфатазой.

РНК по изобретению может содержать модифицированные рибонуклеотиды для повышения ее стабильности и/или снижения цитотоксичности. Например, в одном воплощении в РНК, используемой по изобретению, 5-метилцитидин заменяют частично или полностью, предпочтительно полностью, на цитидин. С другой стороны, в одном воплощении в РНК, используемой по изобретению, псевдоуридин заменяют частично или полностью на уридин. В предпочтительном воплощении РНК по изобретению, содержащая модифицированные рибонуклеотиды, все еще обладает способностью действовать в качестве агониста Toll-подобного рецептора.

В одном воплощении термин "модификация" относится к снабжению РНК 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа. Термин "5'-кэп" относится к структуре типа кепки, находящейся на 5'-конце молекулы мРНК, которая обычно состоит из гуанозинового нуклеотида, соединенного с мРНК посредством необычной 5'-5'-трифосфатной связи. В одном воплощении этот гуанозин метилирован в положении 7. Термин "стандартный 5'-кэп" относится к встречающимся в природе 5'-кэпам РНК, предпочтительно к 7-метилгуанозиновым кэпам (m7G). В контексте настоящего изобретения термин "5'-кэп" включает аналоги 5'-кэпа, которые близки по структуре кэпам РНК и модифицированы так, чтобы они обладали способностью стабилизировать РНК и/или усиливать трансляцию РНК при присоединении к ней, предпочтительно in vivo и/или в клетке.

Обеспечение РНК 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа может осуществляться путем транскрипции ДНК-матрицы in vitro в присутствии данного 5'-кэпа или аналога 5'-кэпа, причем такой 5'-кэп включают при транскрипции в образующуюся нить РНК, или же можно получить РНК, к примеру, путем транскрипции in vitro, и присоединить 5'-кэп к РНК после транскрипции с помощью кэппирующих ферментов, к примеру, кэппирующих ферментов вируса коровьей оспы.

РНК может содержать и другие модификации. Например, другие модификации РНК, используемой в настоящем изобретении, могут представлять собой удлинение или укорочение природного хвоста поли(А) либо изменение 5'- или 3'-нетранслируемых участков (UTR) типа введения UTR, не связанных с кодирующей областью данной РНК, к примеру, замены существующего З'-UTR или вставку одной или нескольких, предпочтительно двух копий 3'-UTR, полученных из гена глобина типа альфа2-глобина, альфа 1-глобина, бета-глобина, предпочтительно бета-глобина, более предпочтительно β-глобина человека.

РНК с немаскированной последовательностью поли-А транслируется более эффективно, чем РНК с маскированной последовательностью поли-А. Термин "хвост поли(А)" или "последовательность поли-А" относится к последовательности остатков аденила (А), которая обычно располагается на 3'-конце молекулы РНК, а "немаскированная последовательность поли-А" означает, что последовательность поли-А на 3'-конце молекулы РНК заканчивается А из последовательности поли-А и за ней не следуют нуклеотиды, отличные от А, расположенные на 3'-конце, то есть после последовательности поли-А. Кроме того, длинная последовательность поли-А примерно из 120 пар оснований обеспечивает оптимальную стабильность транскрипта и эффективность трансляции РНК.

Таким образом, для повышения стабильности и/или экспрессии РНК, используемой по настоящему изобретению, ее можно модифицировать так, чтобы она находилась вместе с последовательностью поли-А, предпочтительно длиной от 10 до 500, более предпочтительно от 30 до 300, еще более предпочтительно от 65 до 200 и особенно от 100 до 150 остатков аденозина. В особенно предпочтительном воплощении последовательность поли-А имеет длину примерно в 120 остатков аденозина. Для дальнейшего повышения стабильности и/или экспрессии РНК, используемой по изобретению, последовательность поли-А может быть демаскирована.

Кроме того, включение 3'-нетранслируемого участка (UTR) в 3'-нетранслируемую область молекулы РНК может привести к повышению эффективности трансляции. Синергический эффект может достигаться при включении двух и более таких 3'-нетранслируемых участков. 3'-Нетранслируемые участки могут быть аутологичными или гетерологичными по отношению к той РНК, в которую они вводятся. В одном конкретном воплощении 3'-нетранслируемый участок происходит из гена β-глобина человека.

Комбинация вышеописанных модификаций, то есть включение последовательности поли-А, демаскирование последовательности поли-А и включение одного или нескольких 3 '-нетранслируемых участков оказывает синергическое влияние на стабильность РНК и повышает эффективность трансляции.

Термин "стабильность" РНК относится к "периоду полураспада" РНК. "Период полураспада" относится к периоду времени, необходимому для устранения половины активности, содержания или количества молекул. В контексте настоящего изобретения период полураспада РНК является показателем стабильности данной РНК. Период полураспада РНК может влиять на "продолжительность экспрессии" РНК. Можно ожидать, что РНК с длительным периодом полураспада будет экспрессироваться в течение продолжительного времени.

Конечно, если нужно уменьшить стабильность и/или эффективность трансляции РНК, то можно модифицировать РНК так, чтобы ухудшилось функционирование вышеописанных элементов, повышающих стабильность и/или эффективность трансляции РНК.

Термин "экспрессия" применяется в самом общем значении и включает в себя продукцию РНК и/или пептидов или полипептидов, например, путем транскрипции и/или трансляции. Что касается РНК, то термин "экспрессия" или "трансляция" относится, в частности, к продукции пептидов или полипептидов. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот.Кроме того, экспрессия может быть краткосрочной либо устойчивой.

Термин "экспрессия» также включает "аберрантную экспрессию" или "аномальную экспрессию". "Аберрантная экспрессия" или "аномальная экспрессия" означает то, что экспрессия изменена, предпочтительно повышена по сравнению с контролем, например, с состоянием у субъекта, не страдающего заболеванием, связанным с аберрантной или аномальной экспрессией определенного белка, например, опухолевого антигена. Повышение экспрессии означает повышение по меньшей мере на 10%, в частности, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100% или больше. В одном воплощении экспрессия обнаруживается только в больной ткани, тогда как экспрессия в здоровой ткани подавляется.

Термин "специфически экспрессируется" означает, что белок экспрессируется в основном только в определенной ткани или органе. Например, то, что опухолевый антиген специфически экспрессируется в слизистой желудка, означает, что данный белок преимущественно экспрессируется в слизистой желудка и не экспрессируется в других тканях или не экспрессируется в значительной степени в других типах тканей или органов. Так, белок, который экспрессируется исключительно в клетках слизистой желудка и в значительно меньшей степени в любой другой ткани типа яичек, специфически экспрессируется в клетках слизистой желудка. В некоторых воплощениях опухолевый антиген в нормальных условиях также может специфически экспрессироваться более чем в одном типе тканей или органов, как-то в 2 или 3 типах тканей или органов, но предпочтительно не более чем в 3 различных типах тканей или органов. В этом случае опухолевый антиген специфически экспрессируется в этих органах. Например, если в нормальных условиях опухолевый антиген экспрессируется в легких и желудке, предпочтительно примерно в равной степени, то данный опухолевый антиген специфически экспрессируется в легких и желудке.

В контексте настоящего изобретения термин "транскрипция" относится к процессу, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. После этого РНК может транслироваться в белок. В соответствии с настоящим изобретением термин "транскрипция" включает "транскрипцию in vitro", причем термин "транскрипция in vitro" касается процесса, в котором РНК, в частности, мРНК, синтезируется in vitro в бесклеточной системе, предпочтительно с использованием соответствующих клеточных экстрактов. Предпочтительно для получения транскриптов применяются клонирующие векторы. Такие клонирующие векторы обычно обозначаются как транскрипционные векторы и охватываются термином "вектор". Используемая в настоящем изобретении РНК предпочтительно представляет собой транскрибированную in vitro РНК (IVT-RNA) и может быть получена путем транскрипции in vitro соответствующей ДНК-матрицы. Промотором для контроля транскрипции может быть любой промотор для любой РНК-полимеразы. Конкретными примерами РНК-полимераз являются РНК-полимеразы Т7, Т3 и SP6. Предпочтительно транскрипция in vitro контролируется промотором Т7 или SP6. ДНК-матрица для транскрипции in vitro может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности, кДНК, и введения ее в подходящий вектор для транскрипции in vitro. кДНК может быть получена путем обратной транскрипции РНК.

Термин "трансляция" относится к процессу в рибосомах клетки, посредством которого нить матричной РНК направляет сборку последовательности аминокислот для получения пептида или полипептида.

Контролирующие экспрессию последовательности или регуляторные последовательности, которые в контексте настоящего изобретения могут быть функционально связаны с нуклеиновой кислотой, могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность и регуляторная последовательность связаны друг с другом "функционально", если они связаны между собой ковалентно так, что транскрипция или трансляция кодирующей последовательности находится под контролем или под влиянием регуляторной последовательности. Если кодирующая последовательность будет транслироваться в функциональный белок при функциональной связи регуляторной последовательности с кодирующей последовательностью, то индукция регуляторной последовательности приведет к транскрипции кодирующей последовательности, не вызывая сдвига рамки считывания в кодирующей последовательности или неспособности кодирующей последовательности транслироваться в нужный белок или пептид.

Термин "контролирующая экспрессию последовательность" или "регуляторная последовательность" в контексте изобретения включает промоторы, последовательности связывания с рибосомой и другие контрольные элементы, контролирующие транскрипцию нуклеиновой кислоты или трансляцию производной РНК. В одном воплощении регуляторные последовательности можно контролировать. Точная структура регуляторных последовательностей может варьироваться в зависимости от вида или от типа клеток, но обычно она включает 5'-нетранскрибируемые и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые участвуют в инициации транскрипции или трансляции, как-то ТАТА-блок, последовательности кэппинга, последовательность СААТ и др. В частности, 5'-нетранскрибируемые регуляторные последовательности содержат промоторный участок, который включает в себя последовательность промотора для контроля транскрипции функционально связанного гена. Регуляторные последовательности также могут содержать последовательности энхансеров или последовательности вышележащих активаторов.

Предпочтительно РНК для экспрессии в клетках вводится в данные клетки. В одном воплощении способов по изобретению РНК для введения в клетки получается путем транскрипции in vitro соответствующей ДНК-матрицы.

Термины типа "РНК, способная к экспрессии" и "РНК, кодирующая" применяются здесь взаимозаменяемо и в отношении конкретного пептида или полипептида означают, что РНК, если она присутствует в соответствующем окружении, предпочтительно внутри клетки, может экспрессироваться и вырабатывать данный пептид или полипептид. Предпочтительно РНК способна взаимодействовать с клеточным механизмом трансляции для вырабатывания того пептида или полипептида, который она способна экспрессировать.

Термины типа "перенос", "введение" или "трансфекция" применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к введению нуклеиновых кислот, в частности экзогенных или гетерологичных нуклеиновых кислот, в частности, РНК, в клетки. Согласно настоящему изобретению, клетки могут входить в состав органа, ткани и/или организма. Согласно настоящему изобретению, введение нуклеиновой кислоты осуществляется либо в виде голой нуклеиновой кислоты, либо в сочетании с реагентом для введения. Предпочтительно введение нуклеиновых кислот проводится в виде голых нуклеиновых кислот. Предпочтительно РНК вводится в сочетании со стабилизирующими веществами типа ингибиторов РНКаз. Настоящим изобретением также предусмотрено повторное введение нуклеиновых кислот в клетки для обеспечения устойчивой экспрессии в течение продолжительного времени.

Клетки можно трансфицировать с помощью любых носителей, с которыми может связываться РНК, например, путем образования комплексов с РНК или образования везикул, в которых заключена или инкапсулирована РНК, что приводит к повышению стабильности РНК по сравнению с голой РНК. Подходящие носители включают, к примеру, липидные носители типа катионных липидов, липосомы, в частности, катионные липосомы и мицеллы, и наночастицы. Катионные липиды могут образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Можно использовать любые катионные липиды.

Предпочтительно введение РНК, кодирующей пептид или полипептид, в клетки, в частности, в клетки in vivo, приводит к экспрессии данного пептида или полипептида в клетках. В определенных воплощениях предпочтительна доставка нуклеиновых кислот в определенные клетки. В таких воплощениях носитель, который применяется для введения нуклеиновой кислоты в клетки (к примеру, ретровирус или липосомы), содержит наводящую молекулу. Например, в носитель нуклеиновой кислоты может быть включена или связана с ним молекула типа антитела, специфичного для белка поверхностной мембраны на клетках мишени, или лиганда рецептора на клетках мишени. В том случае, когда нуклеиновая кислота вводится при помощи липосом, в состав липосом могут входить белки, связывающиеся с белком поверхностной мембраны, который связан с эндоцитозом, чтобы обеспечить нацеливание и/или поглощение. К таким белкам относятся капсидные белки либо их фрагменты, которые специфичны для определенного типа клеток, антитела против белков, которые интернализуются, белки, которые нацелены на внутриклеточное расположение и т.д.

Термин "клетка" или "клетка хозяина" предпочтительно означает интактные клетки, то есть клетки с неповрежденной мембраной, из которых не высвободились их нормальные внутриклеточные компоненты типа ферментов, органелл или генетического материала. Интактными клетками предпочтительно являются жизнеспособные клетки, то есть живые клетки, способные выполнять свои нормальные метаболические функции. Предпочтительно данный термин относится к любым клеткам, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной нуклеиновой кислотой. Термин "клетка" включает прокариотические клетки (например, Е. coli) или эукариотические клетки (например, дендритные клетки, В-клетки, клетки СНО, клетки COS, клетки K562, клетки HEK293, клетки HELA, дрожжевые клетки и клетки насекомых). Экзогенная нуклеиновая кислота может находиться внутри клетки (i) в свободно диспергированной, (ii) заключена в рекомбинантный вектор или (iii) встроена в геном клетки хозяина или митохондриальную ДНК. Особенно предпочтительны клетки млекопитающих типа клеток человека, мышей, хомяков, свиней, коз и приматов. Клетки могут быть получены из большого количества типов тканей и включают первичные клетки и клеточные линии. Конкретные примеры включают кератиноциты, лейкоциты периферической крови, стволовые клетки костного мозга и эмбриональные стволовые клетки. В других воплощениях клетки представляют собой антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки, моноциты или макрофаги.

Клетка, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно экспрессирует пептид или полипептид, кодируемый этой нуклеиновой кислотой.

Термин "клональная экспансия" относится к процессу, при котором конкретный объект размножается. В контексте настоящего изобретения этот термин предпочтительно применяется в контексте иммунологической реакции, при которой лимфоциты стимулируются антигеном, пролиферируют и амплифицируются определенные лимфоциты, распознающие данный антиген. Предпочтительно клональная экспансия приводит к дифференцировке лимфоцитов.

Термины типа "уменьшение" или "ингибирование" относятся к способности вызывать общее снижение уровня, предпочтительно на 5% или больше, на 10% или больше, на 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше. Термин "ингибировать" и аналогичные выражения включают полное или практически полное ингибирование, то есть снижение до нуля или почти до нуля.

Термины типа "увеличение", "повышение", "усиление" или "продление" предпочтительно относятся к увеличению, повышению, усилению или продлению по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 100%, предпочтительно по меньшей мере на 200%, в частности, по меньшей мере на 300%. Эти термины также могут относиться к увеличению, повышению, усилению или продлению с нуля или неизмеримого или необнаружимого уровня до уровня больше нуля или уровня, который можно измерить или обнаружить.

Согласно настоящему изобретению, термин "пептид" относится к веществам, содержащим два или больше, предпочтительно 3 или больше, предпочтительно 4 или больше, предпочтительно 6 или больше, предпочтительно 8 или больше, предпочтительно 10 или больше, предпочтительно 13 или больше, предпочтительно 16, предпочтительно 21 или больше и предпочтительно вплоть до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности, 100 аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями. Термин "полипептид" или "белок" относится к крупным пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но в целом термины "пептид", "полипептид" и "белок" являются синонимами и применяются здесь взаимозаменяемым образом. Согласно изобретению, термин "модификация" или "изменение последовательности" в отношении пептидов, полипептидов или белков относится к изменению последовательности у пептида, полипептида или белка по сравнению с исходной последовательностью типа последовательности пептида, полипептида или белка дикого типа. Термин включает варианты со вставкой аминокислот, варианты с добавлением аминокислот, варианты с удалением аминокислот и варианты с заменой аминокислот, предпочтительно варианты с заменой аминокислот.Все эти изменения последовательности по изобретению могут потенциально создавать новые эпитопы.

Варианты со вставкой аминокислот включают вставки одной или двух либо нескольких аминокислот в определенную аминокислотную последовательность.

Варианты с добавлением аминокислот включают слияния на N- и/или С-концах одной или нескольких аминокислот типа 1, 2, 3, 4 или 5 и более аминокислот.

Варианты с удалением аминокислот характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности типа удаления 1, 2, 3, 4 или 5 и более аминокислот.

Варианты с заменой аминокислот характеризуются тем, что по меньшей мере один остаток в последовательности удаляется, а на его место вставляется другой остаток.

Согласно изобретению, модификация или модифицированный пептид, используемый для тестирования в способах по изобретению, может происходить из белка, содержащего модификацию.

Термин "происходит" в соответствии с изобретением означает, что определенный объект, в частности, последовательность определенного пептида, присутствует в том объекте, из которого она получена. В случае аминокислотных последовательностей, особенно определенных участков последовательностей, "происходит", в частности, означает, что соответствующая аминокислотная последовательность получена из той аминокислотной последовательности, в которой она присутствует.

Иммунотерапевтические средства, если подходящая доза уже установлена описанными здесь способами, могут применяться для лечения субъектов с заболеваниями, например, заболеваниями, характеризующимися наличием больных клеток, экспрессирующих антиген и презентирующих антигенный пептид, путем введения иммунотерапевтического средства в подходящей дозе. Особенно предпочтительными являются раковые заболевания. Описанные здесь иммунотерапевтические средства также могут применяться для иммунизации или вакцинации для предотвращения описанных здесь заболеваний.

Одним из таких иммунотерапевтических средств являются вакцины типа противораковых вакцин, разработанных на основе неоэпитопов, экспрессирующихся только в раковых клетках.

Согласно изобретению, термин "вакцина" относится к фармацевтическим препаратам (фармацевтическим композициям) или продуктам, которые при введении индуцируют иммунный ответ, в частности клеточный иммунный ответ, который распознает и атакует патогенов или больные клетки типа раковых клеток. Вакцина может применяться для профилактики или лечения заболевания. Термин "персонализированная противораковая вакцина" или "индивидуализированная противораковая вакцина" относится к конкретному больному раком и означает, что противораковая вакцина адаптирована к потребностям или особым обстоятельствам конкретного больного раком.

Противораковые вакцины, предусмотренные согласно изобретению, при введении пациентам могут обеспечить один или несколько Т-клеточных эпитопов для стимуляции, примирования и/или размножения Т-клеток, специфичных к опухоли пациента. Т-клетки предпочтительно направлены против клеток, экспрессирующих те антигены, из которых происходят Т-клеточные эпитопы. Так, описанные здесь вакцины предпочтительно способны индуцировать или стимулировать клеточный ответ, предпочтительно активность цитотоксических Т-клеток, против ракового заболевания, характеризующегося презентацией одного или нескольких ассоциированных с опухолью неоантигенов с МНС класса I. Поскольку представленная здесь вакцина будет нацелена на специфичные для рака мутации, она будет специфичной к опухоли пациента.

В одном воплощении настоящего изобретения вакцина относится к таким вакцинам, которые при введении пациентам предпочтительно обеспечивают один или несколько Т-клеточных эпитопов (неоэпитопов, подходящих неоэпитопов, комбинацию из идентифицированных здесь подходящих неооэпитопов), как-то 2 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше, 25 или больше, 30 или больше и предпочтительно вплоть до 60, до 55, до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 Т-клеточных эпитопов, включающих модификации аминокислот или модифицированные пептиды, прогнозированные как подходящие эпитопы. Презентация этих эпитопов клетками пациента, в частности антигенпрезентирующими клетками, предпочтительно приводит к тому, что Т-клетки нацеливаются на эпитопы, которые связаны с МНС, и тем самым на опухоли пациента, предпочтительно первичные опухоли, а также метастазы опухолей, экспрессирующие антигены, из которых происходят Т-клеточные эпитопы, и презентирующие эти эпитопы на поверхности опухолевых клеток.

Для определения применимости идентифицированных модификаций аминокислот или модифицированных пептидов, содержащих эпитопы, для вакцинации от рака можно предпринять дальнейшие шаги. Так, дальнейшие шаги могут включать одно или несколько из следующего: (i) оценка того, находятся ли модификации в известных или предсказанных эпитопах, презентируемых с МНС, (ii) проверка in vitro и/или in silico, находятся ли модификации в эпитопах, презентируемых с МНС, например, проверка того, составляют ли модификации часть пептидных последовательностей, которые преобразуются в и/или презентируются в виде презентируемых с МНС эпитопов, и (iii) проверка in vitro того, что предполагаемые модифицированные эпитопы, в частности, когда они находятся в контексте своих природных последовательностей, например, когда они фланкированы аминокислотными последовательностями, которые также фланкируют данные эпитопы в природном белке, и когда они экспрессируются в антигенпрезентирующих клетках, будут способны стимулировать Т-клетки типа Т-клеток пациента с требуемой специфичностью. Каждая такая фланкирующая последовательность может содержать 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше и предпочтительно вплоть до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот и может фланкировать последовательность эпитопа с N-конца и/или с С-конца.

Модифицированные пептиды, определенные согласно изобретению, можно ранжировать по их применимости в качестве эпитопов для вакцинации от рака. Так, в одном аспекте можно использовать ручной или компьютерный аналитический процесс, в котором идентифицированные модифицированные пептиды подвергаются анализу и отбору по их применимости в соответствующей предусмотренной вакцине. В предпочтительном воплощении такой аналитический процесс является процессом на основе вычислительного алгоритма. Предпочтительно такой аналитический процесс включает определение и/или ранжирование эпитопов по их прогнозируемой способности быть иммуногенными.

Эпитопы, идентифицированные согласно изобретению и представленные в вакцине, предпочтительно присутствуют в виде содержащего данные эпитопы полипептида типа полиэпитопного полипептида или нуклеиновой кислоты, в частности РНК, кодирующей такой полипептид. Кроме того, эпитопы могут присутствовать в полипептиде в виде вакцинной последовательности, то есть находиться в контексте своих природных последовательностей, например, фланкированных аминокислотными последовательностями, которые также фланкируют данные эпитопы в природном белке. Каждая такая фланкирующая последовательность может содержать 5 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше и предпочтительно вплоть до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот и может фланкировать последовательность эпитопа с N-конца и/или С-конца. Так, вакцинная последовательность может содержать 20 или больше, 25 или больше, 30 или больше, 35 или больше, 40 или больше и предпочтительно вплоть до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот.В одном воплощении эпитопы и/или вакцинные последовательности выстраиваются в полипептиде "голова к хвосту".

В одном воплощении идентифицированные здесь эпитопы и/или вакцинные последовательности разделяются линкерами, в частности нейтральными линкерами. Термин "линкер" в контексте настоящего изобретения относится к пептиду, вставленному между двумя пептидными доменами типа эпитопов или вакцинных последовательностей, для соединения данных пептидных доменов. Нет никаких особых ограничений в отношении последовательности линкеров. Однако предпочтительно, чтобы последовательность линкера уменьшала стерические препятствия между двумя пептидными доменами, хорошо транслировалась и поддерживала или допускала процессинг эпитопов. Кроме того, линкер должен не содержать или почти не содержать иммуногенных элементов последовательности. Линкеры предпочтительно не должны создавать неэндогенных эпитопов, подобных тем, которые образуются на стыке между соседними эпитопами, что может вызывать нежелательные иммунные реакции. Следовательно, полиэпитопная вакцина предпочтительно должна содержать такие последовательности линкеров, которые способны уменьшить количество нежелательных стыковочных эпитопов, связывающихся с МНС. Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) и Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) показали, что богатые глицином последовательности нарушают процессинг в протеасомах, поэтому использование богатых глицином последовательностей линкеров позволяет минимизировать количество содержащихся в линкерах пептидов, которые процессируются в протеасомах. Кроме того, оказалось, что глицин ингибирует сильное связывание в положениях бороздок для связывания с МНС (Abastado et al, 1993, J. Immunol. 151 (7): 3569-75). Schlessinger et al., 2005, Proteins 61 (1): 115-26 обнаружили, что аминокислоты глицин и серии, включенные в аминокислотную последовательность, дают более гибкий белок, который более эффективно транслируется и процессируется в протеасомах, обеспечивая лучший доступ к кодируемым эпитопам. Каждый линкер может содержать 3 или больше, 6 или больше, 9 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше и предпочтительно вплоть до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот. Предпочтительно линкер обогащен аминокислотами глицином и/или серином. Предпочтительно по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% аминокислот линкера представляют собой глицин и/или серии. В одном предпочтительном воплощении линкер в основном состоит из аминокислот глицина и серина. В одном воплощении линкер содержит аминокислотную последовательность (GGS)_a(GSS)_b(GGG)_c(SSG)_d(GSG)_c, где а, b, с, d и е независимо означают числа, выбранные из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, причем a+b+c+d+e отличается от 0 и предпочтительно составляет 2 или больше, 3 или больше, 4 или больше либо 5 или больше. В одном воплощении линкер содержит последовательность, как описано здесь, включая последовательности линкеров, описанные в примерах, типа последовательности GGSGGGGSG.

В одном особенно предпочтительном воплощении полипептид, содержащий один или несколько неоэпитопов, типа полиэпитопного полипептида, является иммунотерапевтическим средством, которое можно вводить пациентам в виде нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК типа транскрибированной in vitro или синтетической РНК, которая может экспрессироваться в клетках пациента типа антигенпрезентирующих клеток для вырабатывания полипептида. Также предусматривается введение одного или нескольких мультиэпитопных полипептидов, которые в целях настоящего изобретения охватываются термином "полиэпитопный полипептид", предпочтительно в виде нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК типа транскрибированной in vitro или синтетической РНК, которая может экспрессироваться в клетках пациента типа антигенпрезентирующих клеток для вырабатывания одного или нескольких полипептидов. В случае введения более чем одного мультиэпитопного полипептида подходящие неоэпитопы, представленные различными мультиэпитопными полипептидами, могут быть разными или же частично перекрываться. Попадая в клетки пациента типа антигенпрезентирующих клеток, полипептид по изобретению подвергается процессингу с образованием подходящих неоэпитопов, идентифицированных согласно изобретению. Введение вакцины, полученной по изобретению, может обеспечить эпитопы, презентируемые с МНС класса II, которые способны вызвать реакцию хелперных Т-клеток CD4⁺ против клеток, экспрессирующих антигены, из которых происходят эпитопы, презентируемые с МНС. С другой стороны, введение вакцины, полученной согласно изобретению, может обеспечить неоэпитопы, презентируемые с МНС класса I, которые способны вызвать реакцию хелперных Т-клеток CD8⁺ против клеток, экспрессирующих антигены, из которых происходят неоэпитопы, презентируемые с МНС. Кроме того, введение вакцины, полученной по изобретению, может обеспечить один или несколько неоэпитопов (включая известные неоэпитопы и подходящие неоэпитопы, идентифицированные по изобретению), а также один или несколько эпитопов, не содержащих специфичных для рака соматических мутаций, но экспрессируемых раковыми клетками и предпочтительно вызывающих иммунный ответ против раковых клеток, предпочтительно специфичный для рака иммунный ответ.В одном воплощении введение вакцины, полученной согласно изобретению, обеспечивает неоэпитопы, которые представляют собой эпитопы, презентируемые с МНС класса II и/или способные вызвать ответ хелперных Т-клеток CD4⁺ против клеток, экспрессирующих антигены, из которых происходят презентируемые с МНС эпитопы, а также эпитопы, не содержащие специфичных для рака соматических мутаций, которые презентируются с МНС класса I и/или способны вызвать ответ Т-клеток CD8⁺ против клеток, экспрессирующих антигены, из которых происходят презентируемые с МНС эпитопы. В одном воплощении эпитопы, не содержащие специфичных для рака соматических мутаций, происходят из опухолевого антигена. В одном воплощении неоэпитопы и эпитопы, не содержащие специфичных для рака соматических мутаций, оказывают синергическое действие при лечении рака. Предпочтительно вакцина, полученная согласно изобретению, применима для полиэпитопной стимуляции ответов цитотоксических и/или хелперных Т-клеток.

Вакцина, полученная согласно изобретению, может представлять собой рекомбинантную вакцину.

Термин "рекомбинантный" в контексте настоящего изобретения означает "полученный посредством генной инженерии". Предпочтительно "рекомбинантный объект" типа рекомбинантного полипептида в контексте настоящего изобретения не встречается в природе и предпочтительно является результатом комбинирования таких объектов, как последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот, которые не сочетаются в природе. Например, рекомбинантный полипептид в контексте настоящего изобретения может содержать несколько аминокислотных последовательностей типа неоэпитопов или вакцинных последовательности, происходящих из разных белков или разных частей одного и того же белка, слитых вместе, например, пептидными связями или соответствующими линкерами.

Термин "встречающийся в природе" в настоящем изобретении означает то, что объект встречается в природе. Например, пептиды или нуклеиновые кислоты, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из источника в природе и не подвергались преднамеренной модификации человеком в лаборатории, являются природными.

Согласно изобретению, термин "заболевание" относится к любым патологическим состояниям, включая раковые заболевания, в частности те формы раковых заболеваний, которые описаны здесь.

Термин "нормальный" относится к здоровому состоянию или состояниям здорового субъекта или ткани, то есть непатологическим состояниям, причем "здоровый" предпочтительно означает нераковый.

"Заболевание с участием клеток, экспрессирующих антиген" означает, что в клетках больной ткани или органа выявляется экспрессия антигена. Экспрессия в клетках больной ткани или органа может быть повышенной по сравнению с состоянием в здоровой ткани или органе. Повышение означает увеличение по меньшей мере на 10%, в частности, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 10000% или даже больше. В одном воплощении экспрессия обнаруживается только в больной ткани, тогда как в здоровой ткани экспрессия подавляется. Согласно изобретению, заболевания с участием или связанные с клетками, экспрессирующими антиген, включают раковые заболевания.

Рак (медицинский термин: злокачественное новообразование) представляет собой класс заболеваний, при которых группа клеток проявляет неконтролируемый рост (деление за пределами нормальных пределов), инвазию (вторжение и разрушение соседних тканей) и иногда метастазирование (распространение в другие места в организме через лимфу или кровь). Эти три злокачественных свойства рака отличают его от доброкачественных опухолей, которые самоограничены и не инвазируют и не метастазируют. При большинстве раковых заболеваний образуются опухоли, но при некоторых, типа лейкемии, они не образуются.

Злокачественная опухоль по существу является синонимом рака. Злокачественное образование, злокачественное новообразование и злокачественная опухоль практически являются синонимами рака.

Согласно изобретению, термин "опухоль" или "опухолевидное заболевание" относится к аномальному росту клеток (называемых неопластическими клетками, опухолеродными клетками или опухолевыми клетками), предпочтительно образующих отек или поражение. Под "опухолевыми клетками" понимаются аномальные клетки, которые растут путем быстрой неконтролируемой пролиферации клеток и продолжают расти после прекращения стимулов, вызвавших неоплазию. Опухоли проявляют частичное или пол-ное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью и обычно образуют отдельную массу ткани, которая может быть доброкачественной, предраковой или злокачественной.

Доброкачественная опухоль - это опухоль, у которой отсутствуют все три злокачественных свойства рака. Так, по определению, доброкачественная опухоль не растет неограниченным, агрессивным образом, не проникает в окружающие ткани и не распространяется на несмежные ткани (не метастазирует).

Новообразование представляет собой аномальную массу ткани в результате неоплазии. Неоплазия (от греческого: новый рост) - аномальная пролиферация клеток. Рост клеток превышает и не согласован с ростом нормальных тканей вокруг него. Рост продолжается таким же чрезмерным образом даже после прекращения стимулов. При этом обычно образуется "шишка" или опухоль. Новообразования могут быть доброкачественными, предраковыми или злокачественными.

"Рост опухоли" или "опухолевый рост" в контексте настоящего изобретения относится к тенденции опухолей к увеличению размера и/или к тенденции опухолевых клеток к пролиферации.

Для целей настоящего изобретения термины "рак" и "раковое заболевание" применяются взаимозаменяемо с терминами "опухоль" и "опухолевидное заболевание".

Раковые заболевания классифицируют по типу клеток, составляющих опухоль, и по ткани, предположительно являющейся источником опухоли. То есть по гистологии и локализации, соответственно.

Термин "рак" согласно изобретению включает лейкозы, семиномы, меланомы, тератомы, лимфомы, нейробластомы, глиомы, рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почек, рак надпочечников, рак щитовидной железы, рак крови, рак кожи, рак головного мозга, рак шейки матки, рак кишечника, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак кишечника, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак лимфатических узлов, рак пищевода, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак уха, носа и горла (ENT), рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак яичников и рак легких и их метастазы. Примеры рака - карциномы легких, карциномы молочной железы, карциномы простаты, карциномы толстой кишки, почечно-клеточный рак, карциномы шейки матки либо метастазы типов рака или опухолей, описанных выше. Термин рак согласно изобретению также включает раковые метастазы и рецидивы рака.

Под "метастазированием" подразумевается распространение раковых клеток из исходного участка в другие части организма. Метастазирование является очень сложным процессом, который зависит от отделения злокачественных клеток из первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проникновения через базальные мембраны эндотелия с выходом в полости тела и сосуды, а затем, после переноса с кровью, инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли, то есть вторичной опухоли или метастатической опухоли на месте мишени зависит от ангиогенеза. Метастазирование опухолей зачастую происходит даже после удаления первичной опухоли, так как клетки или компоненты опухоли могут оставаться и развивать метастатический потенциал. В одном воплощении термин "метастазирование" согласно изобретению относится к "удаленному метастазированию", что означает метастазирование на удалении от первичной опухоли и системы регионарных лимфатических узлов.

Клетки вторичной или метастатической опухоли похожи на клетки исходной опухоли. Это значит, к примеру, что если рак яичников метастазирует в печень, то вторичная опухоль состоит из аномальных клеток яичника, а не аномальных клеток печени. При этом опухоль в печени называется метастатическим раком яичников, а не раком печени.

Термин "циркулирующие опухолевые клетки" или "CTCs" относится к клеткам, которые отделены от первичной опухоли или метастазов опухоли и циркулируют в кровотоке. СТС могут представлять собой затравки для последующего роста дополнительных опухолей (метастазирования) в разных тканях. Циркулирующие опухолевые клетки встречаются с частотой порядка 1-10 СТС на 1 мл цельной крови у пациентов с метастатическими заболеваниями. Разработаны исследовательские методы выделения СТС. Было описано несколько исследовательских методов выделения СТС, например, методы, в которых используется то, что эпителиальные клетки обычно экспрессируют белок клеточной адгезии ЕрСАМ, который отсутствует в нормальных клетках крови. Иммуномагнитный захват на основе шариков включает обработку образцов крови антителом к ЕрСАМ, конъюгированным с магнитными частицами, а затем выделение меченых клеток в магнитном поле. Затем выделенные клетки окрашивают с помощью антител к другому эпителиальному маркеру, цитокератину, а также общему лейкоцитарному маркеру CD45 с тем, чтобы отличить редкие СТС от примесных лейкоцитов. Этот надежный и полуавтоматический подход позволяет идентифицировать СТС со средним выходом примерно 1 СТС/мл и чистотой 0,1% (Allard et al., 2004, Clin Cancer Res 10: 6897-6904). Во втором методе выделения СТС применяется микрожидкостное устройство для захвата СТС, которое включает пропускание цельной крови через камеру, в которую встроено 80 000 микростолбиков, функционализированных путем покрытия антителами к ЕрСАМ. Затем СТС окрашивают с помощью вторичных антител против цитокератина или таких тканеспецифичных маркеров, как PSA при раке предстательной железы или HER2 при раке молочной железы, и визуализируют путем автоматического сканирования микростолбиков в нескольких плоскостях по трехмерным координатам. СТС-чипы способны идентифицировать положительные по цитокератину циркулирующие опухолевые клетки у пациентов со средним выходом в 50 клеток/мл и чистотой в диапазоне от 1 до 80% (Nagrath et al., 2007, Nature 450: 1235-1239). Другая возможность выделения СТС - набор для выявления циркулирующих опухолевых клеток (СТС) CellSearch™ фирмы Veridex, LLC (Raritan, NJ), который собирает, идентифицирует и подсчитывает СТС в пробирке с кровью. Система CellSearch™ одобрена Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для подсчета СТС в цельной крови, которая основана на сочетании иммуномагнитной маркировки и автоматической цифровой микроскопии. В литературе описаны и другие способы выделения СТС, каждый из которых можно использовать в сочетании с настоящим изобретением.

Рецидив или возврат возникает, когда человека опять поражает то заболевание, которое поражало его в прошлом. Например, если пациент страдал опухолевым заболеванием, прошел успешное лечение данного заболевания и у него опять возникло данное заболевание, то такое вновь возникшее заболевание может рассматриваться как рецидив или возврат.Однако согласно изобретению рецидив или возврат опухолевого заболевания не обязательно может происходить на месте первоначального опухолевого заболевания. Так, например, если пациент страдал опухолью яичников и прошел успешное лечение, то рецидив или возврат может означать появление опухоли яичников или возникновение опухоли в месте, отличном от яичников. Рецидив или возврат опухоли также включает ситуации, когда опухоль возникает в месте, отличном от места исходной опухоли, а также на месте исходной опухоли. Предпочтительно исходная опухоль, от которой пациент проходил лечение, представляет собой первичную опухоль, а опухоль в месте, отличном от места исходной опухоли, представляет собой вторичную или метастатическую опухоль.

Термин "иммунотерапия" относится к лечению заболеваний путем индуцирования, усиления или подавления иммунных ответов. Иммунотерапия, предназначенная для выработки или усиления иммунных ответов, классифицируется как активационная иммунотерапия, тогда как иммунотерапия, которая уменьшает или подавляет иммунитет, классифицируется как супрессивная иммунотерапия. Термин "иммунотерапия" включает иммунизацию антигеном или вакцинацию антигеном либо иммунизацию против опухоли или вакцинацию от опухоли. Термин "иммунотерапия" также касается манипулирования иммунитетом таким образом, чтобы неадекватные иммунные реакции модулировались в более подходящие в контексте таких аутоиммунных заболеваний, как ревматический артрит, аллергия, диабет или рассеянный склероз.

Термины "иммунизация" или "вакцинация" описывают процесс введения антигена индивидам с целью индуцирования иммунного ответа, к примеру, по терапевтическим или профилактическим причинам.

Под "лечением" подразумевается введение иммунотерапевтического средства или композиции, содержащей иммунотерапевтическое средство, как описано здесь, субъекту для предотвращения или устранения заболевания, включая уменьшение размера опухолей или количества опухолей у субъекта; остановку или замедление заболевания у субъекта; торможение или замедление течения нового заболевания у субъекта; уменьшение частоты или тяжести симптомов и/или рецидивов у субъекта, который в настоящее время имеет или у которого ранее было заболевание; и/или продление, то есть увеличение продолжительности жизни у субъекта. В частности, термин "лечение заболевания" включает излечение, сокращение продолжительности, улучшение, предотвращение, замедление или торможение прогрессирования или ухудшения либо предотвращение или задержку возникновения заболевания или его симптомов.

Под "риском" подразумевается то, что субъект, то есть пациент, идентифицирован как имеющий большие, чем обычно, шансы возникновения заболевания, в частности рака, по сравнению с населением в целом. Кроме того, субъект, у которого было или в настоящее время имеется заболевание, в частности раковое, является субъектом с повышенным риском возникновения заболевания, поскольку у такого субъекта может снова возникнуть заболевание. Субъекты, у которых в настоящее время имеется или ранее был рак, также имеют повышенный риск появления раковых метастазов.

Профилактическое проведение иммунотерапии, к примеру, профилактическое введение иммунотерапевтического средства или композиции, содержащей иммунотерапевтическое средство, предпочтительно защищает реципиента от возникновения заболевания. Терапевтическое проведение иммунотерапии, к примеру, терапевтическое введение иммунотерапевтического средства, может привести к торможению прогрессирования/усиления заболевания. Это включает замедление прогрессирования/усиления заболевания, в частности, нарушение прогрессирования заболевания, которое предпочтительно ведет к устранению заболевания.

Иммунотерапия может проводиться по любой из множества методик, в которых представленные здесь средства функционируют, удаляя больные клетки у пациента. Такое удаление может происходить в результате усиления или индукции иммунного ответа у пациента, специфичного для антигена или клеток, экспрессирующих антиген.

Иммунотерапевтические средства и композиции могут применяться по отдельности или в сочетании со стандартными режимами лечения типа хирургии, облучения, химиотерапии и/или пересадки костного мозга (аутологичного, сингенного, аллогенного или неродственного).

Термин "in vivo" относится к ситуации у субъекта.

Термины "субъект", "индивид", "организм" или "пациент" относятся к позвоночным, в особенности к млекопитающим, и применяются здесь взаимозаменяемым образом. Например, млекопитающими в контексте настоящего изобретения являются люди, другие приматы, домашние млекопитающие, как-то собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и др., лабораторные животные, как-то мыши, крысы, кролики, морские свинки и др., а также животные в неволе типа животных в зоопарках. Термины также относятся к позвоночным, не относящимся к млекопитающим, как-то к птицам (в частности, одомашненным птицам типа кур, уток, гусей, индеек) и к рыбам (в особенности культивируемым рыбам, например, лососям или сомам). Термин "животное" в настоящем изобретении также включает людей.

Термин "аутологичный" применяется для описания того, что происходит от одного и того же субъекта. Например, "аутологичная трансплантация" означает трансплантацию ткани или органов, полученных от одного и того же субъекта. Такие процедуры выгодны, так как они преодолевают иммунологический барьер, который в противном случае приводит к отторжению.

Термин "гетерологичный" применяется для описания того, что состоит из множества различных элементов. К примеру, пересадка костного мозга от одного индивида другому составляет гетерологичную трансплантацию. Гетерологичный ген - это ген, полученный из другого источника, чем субъект.

В качестве части композиции для иммунизации или вакцинации предпочтительно одно или несколько иммунотерапевтических средств вводят вместе с одним или несколькими адъювантами для индукции иммунного ответа или для усиления иммунного ответа. Термин "адъювант" относится к соединениям, которые продлевают или усиливают или ускоряют иммунный ответ. Композиции настоящего изобретения предпочтительно оказывают свое действие без добавления адъювантов. Тем не менее, композиции по настоящей заявке могут содержать какой-нибудь известный адъювант. Адъюванты составляют гетерогенную группу соединений типа масляных эмульсий (например, адъюванты Фрейнда), минеральных соединений (типа квасцов), бактериальных продуктов (типа токсина Bordetella pertussis), липосом и иммуностимулирующих комплексов. Примерами адъювантов являются монофосфорил-липид-А (MPL, SmithKline Beecham), такие сапонины, как QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 и QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, витамин Е, монтанид, квасцы, олигонуклеотиды CpG (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) и различные эмульсии типа вода-в-масле, которые получают из биологически разлагаемых масел типа сквалена и/или токоферола.

Можно вводить и другие вещества, которые стимулируют иммунные ответы у пациентов. Например, при вакцинации можно использовать цитокины благодаря их регуляторным свойствам на лимфоцитах. К таким цитокинам относятся, к примеру, интерлейкин-12 (IL-12), который, как было показано, усиливает защитное действие вакцин (см. Hall, 1995, IL-12 at the crossroads, Science 268:1432-1434), GM-CSF и IL-18.

Существует ряд соединений, которые усиливают иммунный ответ и поэтому могут использоваться при вакцинации. К таким соединениям относятся костимулирующие молекулы, представленные в виде белков или нуклеиновых кислот, как-то В7-1 и В7-2 (CD80 и CD86, соответственно).

Согласно изобретению, "опухолевый образец" представляет собой образец типа образца из организма, содержащий опухолевые или раковые клетки типа циркулирующих опухолевых клеток (СТС), в частности образец ткани, включая жидкие фазы организма, и/или клеточный образец. Согласно изобретению, "неопухолевый образец" представляет собой образец типа образца из организма, не содержащий опухолевых или раковых клеток типа циркулирующих опухолевых клеток (СТС), в частности образец ткани, включая жидкие фазы организма, и/или клеточный образец. Такие образцы из организма могут быть получены стандартным способом типа тканевой биопсии, включая пункционную биопсию, и путем взятия крови, бронхиального аспирата, мокроты, мочи, кала или других жидких фаз организма. Согласно изобретению, термин "образец" также включает обработанные образцы, как-то фракции или выделенные препараты (изоляты) из биологических образцов, например, выделенные нуклеиновые кислоты или клетки.

Описанные здесь иммунотерапевтические средства и их композиции можно вводить любым стандартным способом, включая инъекции или инфузии. Введение может проводиться, к примеру, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или трансдермально. В одном воплощении введение проводят интранодально типа инъекции в лимфатический узел. Другие формы введения предусматривают трансфекцию in vitro антигенпрезентирующих клеток типа дендритных клеток описанными здесь нуклеиновыми кислотами с последующим введением этих антигенпрезентирующих клеток.

Термин "фармацевтически приемлемый" относится к нетоксичности материала, который не мешает действию активного компонента фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать соли, буферы, консерванты, носители и необязательно другие терапевтические средства. Предпочтительно фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или эксципиентов.

Термин "эксципиент" служит для обозначения всех веществ в фармацевтической композиции, которые не являются активными ингредиентами, как-то связующих веществ, смазывающих веществ, загустителей, поверхностно-активных веществ, консервантов, эмульгаторов, буферов, ароматизаторов или красителей.

Термин "разбавитель" относится к разбавителям и/или разжижителям. Кроме того, термин "разбавитель" включает одно или несколько из текучих, жидких или твердых суспензий и/или смесительных сред.

Термин "носитель" относится к таким совместимым твердым или жидким наполнителям или разбавителям, которые подходят для введения человеку. Термин "носитель" относится к природным или синтетическим органическим или неорганическим компонентам, которые объединяют с активным компонентом, чтобы облегчить нанесение активного компонента. Предпочтительно компонентами носителя являются стерильные жидкости типа воды или масла, включая полученные из минерального масла, животных или растений, как-то арахисовое масло, соевое масло, кунжутное масло, подсолнечное масло и др. Также в качестве водных соединений-носителей можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина.

Фармацевтически приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, к примеру, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, edit. 1985). Примеры подходящих носителей включают, к примеру, карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, легкоплавкий воск, масло какао и т.п. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.

Фармацевтические носители, наполнители или разбавители можно выбирать с учетом предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать в качестве или в дополнение к носителям, эксципиентам или разбавителям любые подходящие связующие, смазывающие вещества, суспендирующие средства, покрывающие средства и/или солюбилизирующие средства. Примеры подходящих связующих включают крахмал, желатин, натуральные сахара типа глюкозы, безводной лактозы, сыпучей лактозы, бета-лактозы, кукурузные подсластители, натуральные и синтетические смолы типа гуммиарабика, трагаканта или альгината натрия, карбоксиметилцеллюлозу и полиэтиленгликоль. Примеры подходящих смазывающих веществ включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. В фармацевтические композиции могут входить консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизаторы. Примеры консервантов включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Также можно использовать антиоксиданты и суспендирующие средства.

В одном воплощении композиции представляют собой водные композиции. Водная композиция необязательно может содержать растворенные вещества, например, соли. В одном воплощении композиция имеет вид лиофилизованной композиции. Лиофилизованные композиции получают путем лиофилизации соответствующей водной композиции.

Настоящее изобретение подробно описано и иллюстрируется на фигурах и примерах, которые приводятся только в целях иллюстрации и не должны быть ограничительными. Благодаря описанию и примерам, специалистам доступны и другие воплощения, которые также включены в изобретение.

Краткое описание фигур

На фиг. 1a-1f представлены гистограммы системного уровня лимфоцитов (фиг. 1а), системного уровня тромбоцитов (фиг. 1b) и системного уровня цитокинов в сыворотке (IFN-α, IL-6, IFN-γ, IP-10) (фиг. 1c-1f, соответственно) до (pre) и после (через 2, 6, 24 и 48 часов) введения различных доз тетравалентной вакцины против РНК_(LIP) у 15 отдельных пациентов. Представлены средние значения из двух повторов. V =посещение, а V2 означает 1-е введение, V3 - 2-е введение, V4 - 3-е введение, V5 - 4-е введение, V6 - 5-е введение, V7 - 6-е введение, V8 - 7-е введение и V9 - 8-е введение, соответственно. Пациенты I группы получали только 6 введений (V2-V7). Забор крови и анализ проводили по стандартным методикам.

На фиг. 2a-2h представлены гистограммы уровня экспрессии цитокинов после инкубации выделенных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с составом РНК-липосомы в течение 6 часов (темные точки) и после инкубации в течение 24 часов (светлые точки). Отдельные точки данных представляют средние значения из трех экспериментов.

На фиг. 3a-3h представлены гистограммы уровня экспрессии цитокинов после инкубации цельной крови с составом РНК-липосомы в течение 6 часов (темные точки) и после инкубации в течение 24 часов (светлые точки). Отдельные точки данных представляют средние значения из трех экспериментов.

На фиг. 4а-4с представлены гистограммы уровня экспрессии цитокинов после инкубации состава РНК-липосомы в течение 6 часов в цельной крови (темные кружочки), в цельной крови, обогащенной pDC (темные квадратики) и iDC (темные треугольники). Отдельные точки данных представляют средние значения из трех экспериментов.

На фиг. 5а-5с представлены гистограммы уровня экспрессии цитокинов после инкубации состава РНК-липосомы в течение 24 часов в цельной крови (темные кружочки), в цельной крови, обогащенной pDCs (темные квадратики) и iDCs (темные треугольники). Отдельные точки данных представляют средние значения из трех экспериментов.

На фиг. 6a-6j представлены гистограммы уровня экспрессии цитокинов после инкубации PBMCs с низкомолекулярными агонистами TLR-7 через 24 часа, темные кружочки - N-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил))имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидропиран-2Н-пиран-4-ил)ацетамид (SMI), светлые кружочки - N-{4-[4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-1-ил]бутил}-N-(1,1-диоксотиэтан-3-ил)ацетамид (SM2).

На фиг. 7а-7j представлены гистограммы уровня экспрессии цитокинов после инкубации цельной крови с низкомолекулярными агонистами TLR-7 через 24 часа, темные кружочки - N-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил))имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидропиран-2Н-пиран-4-ил)ацетамид (SM1), светлые кружочки - N-{4-[4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил] бутил}N-(1,1-диоксотиэтан-3-ил)ацетамид (SM2).

На фиг. 8а-8е представлены гистограммы уровня активации определенных иммунных клеток при измерении по относительной экспрессии CD69 после инкубации РВМС с низкомолекулярными агонистами TLR-7 через 24 часа, темные кружочки - N-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил))имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидропиран-2Н-пиран-4-ил)ацетамид (SM1), светлые кружочки - N-{4-[4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1H-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил]бутил}-N-(1,1 -диоксотиэтан-3-ил)ацетамид (SM2).

На фиг. 9а-9е представлены гистограммы уровня активации определенных иммунных клеток при измерении по относительной экспрессии CD69 после инкубации цельной крови с низкомолекулярными агонистами TLR-7 через 24 часа, темные кружочки - N-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил))имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидропиран-2Н-пиран-4-ил)ацетамид (SM1), светлые кружочки -N-{4-[4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-1-ил]бутил}-N-(1,1-диоксотиэтан-3-ил)ацетамид (SM2).

На фиг. 10a-10kk представлены графики уровня секреции цитокинов в крови самцов или самок макаки-крабоеда по времени после внутривенного введения низкомолекулярного агониста TLR-7 -N-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил))имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидропиран-2Н-пиран-4-ил)ацетамида (SM1).

На фиг. 11a-11m представлены графики уровня секреции цитокинов в крови самцов макаки-крабоеда по времени после внутривенного введения низкомолекулярного агониста TLR-7 - N-(4-(4-амино-2-этил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(1,1-диоксидотиэтан-3 -ил)ацетамида (SM3).

На фиг. 12a-12f представлены графики уровня экспрессии цитокинов после 24-часовой инкубации РВМС, выделенных от различных индивидов, с низкомолекулярным агонистом TLR-8 - 2-этил-1-(4-((2-метилтетрагидрофуран-3-ил)амино)бутил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амином (SM4).

На фиг. 13а-13h представлены графики уровня экспрессии цитокинов после 24-часовой инкубации РВМС, выделенных от различных индивидов, с низкомолекулярным агонистом TLR-8 - 1-(4-(циклогексиламино)бутил)-2-этил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амином (SM5).

ПРИМЕРЫ

Пример 1

В рамках утвержденного интервенционального клинического испытания фазы I (NCT02410733) 15 пациентов со злокачественной меланомой получали внутривенно в дни 1 (V2), 8 (V3), 15 (V4), 22 (V5), 29 (V6), 36 (V7), 50 (V8) и 64 (V9) (пациенты 1, 2 и 3 только в дни 1, 8, 15, 22, 29, 43) возрастающие количества иммунотерапевтических препаратов на основе РНК в составе липосом в виде наночастиц. Иммунотерапевтические средства содержали 4 отдельных препарата типа РНК-липоплекс (PHK_(LIP)), каждый из которых кодирует один связанный с меланомой антиген, который после внутривенного введения вызывает эффективную индуцированную TLR7 ведомую интерфероном I типа иммуноактивацию и стимуляцию Т-клеток. Пациенты получали возрастающие уровни дозы, начиная с 7,2 мкг общей РНК для первого цикла вакцинации, 14,4 мкг общей РНК для второго цикла вакцинации и до 29, 50, 75 или 100 мкг общей РНК, соответственно, для оставшихся циклов вакцинации.

До и после каждого цикла вакцинации оценивали и отмечали основные показатели состояния организма и отрицательные эффекты или серьезные отрицательные эффекты (побочные эффекты). Брали пробы крови для гематологического анализа и измерения системных цитокинов при отдельных циклах вакцинации (через 0 (до вакцинации), 2, 6, 24 и 48 часов (ч) после введения РНК_(LIP)). Для каждого пациента определяли число лимфоцитов (фиг. 1а), число тромбоцитов (фиг 1b) и уровни экспрессии цитокинов в сыворотке (фиг. 1c-1f).

Первый пациент (женщина, 1982 г.р.) испытывал симптомы, обычно связанные с активацией иммунной системы, такие как головная боль, усталость, дрожь и жар, в пределах нескольких часов после введения иммунотерапевтического средства. Эти симптомы были дозозависимыми и наблюдались при дозе 14,4 мкг (2-й цикл вакцинации). После введения 29 мкг РНК (3-й цикл вакцинации) дополнительно наблюдалась умеренная связанная с жаром тахикардия и гипотензия. Наблюдаемые симптомы легко устранялись при введении парацетамола, но тем не менее потребовали снижения дозы до 14,4 мкг общей РНК при оставшихся циклах вакцинации для этого пациента. Наблюдаемые гематологические изменения включали обратимое дозозависимое снижение системных лимфоцитов и тромбоцитов, а также незначительное кратковременное повышение системных IFN-α, IL-6, IFN-γ и сильную секрецию IP-10. Эти наблюдения согласуются с предполагаемым механизмом действия для иммунотерапии РНК_(LIP) и подтверждают результаты, полученные при обширных доклинических исследованиях.

Второй пациент (женщина, 1947 г.р.) очень хорошо переносил иммунотерапевтическое средство (вакцинацию) при всех трех уровнях дозы без каких-либо нежелательных явлений, связанных с иммунотерапевтическим средством. Кроме того, отмечались лишь незначительные гематологические изменения наряду с небольшим кратковременным повышением IFN-γ и IL-6, а также существенная дозозависимая секреция IP-10. Однако общее количество секретируемых цитокинов было значительно меньше по сравнению с первым пациентом, как видно из фиг. lc-1f.

Третий пациент (мужчина, 1950 г.р.) очень хорошо переносил введение иммунотерапевтического средства при всех трех уровнях дозы, а также одновременный прием парацетамола до и после введения по усмотрению исследователя. Для этого пациента единственным клиническим симптомом была умеренная температура после 3-го цикла вакцинации (29 мкг), которая прошла в пределах 24 часов. Как и у первого пациента, наблюдалось дозозависимое кратковременное снижение системных лимфоцитов, хотя и в меньшей степени, и дозозависимое кратковременное повышение IFN-α, IFN-γ и IP-10, тогда как уровень системного IL-6 были значительно выше, чем у первого и второго пациентов, но тоже полностью вернулся к норме в пределах 24 часов.

Четвертый пациент (женщина, 1971 г.р.) испытывал симптомы, обычно связанные с активацией иммунной системы, такие как головная боль, усталость и озноб в пределах нескольких часов после введения 7,2 мкг или 14,4 мкг общей РНК, соответственно. При обеих дозировках отмечалось небольшое кратковременное снижение циркулирующих лимфоцитов и умеренная кратковременная дозозависимая индукция цитокинов IFN-γ, IP-10 и IFN-α, сравнимая с первым пациентом, тогда как повышение IL-6 после введения 14,4 мкг было немного больше и скорее сопоставимо с уровнем цитокинов у третьего пациента.

Пятый пациент (мужчина, 1950 г.р.) очень хорошо переносил введение иммунотерапевтического средства с небольшим повышением температуры тела после 2-го цикла вакцинации (14,4 мкг) и легкой болью в суставах после 3-го цикла вакцинации (14,4 мкг). Хотя число тромбоцитов существенно не менялось, но наблюдалась умеренная, хотя и полностью преходящая лимфоцитопения после 2-го цикла вакцинации с 14,4 мкг. Почти не наблюдалось повышения системных цитокинов, за исключением незначительного и полностью обратимого повышения секреции IP-10 после 2-го цикла вакцинации, которое было самым меньшим по сравнению с другими пятью пациентами.

Шестой пациент (женщина, 1974 г.р.) очень хорошо переносил введение иммунотерапевтического средства. У этого пациента единственными клинически наблюдаемыми нежелательными явлениями были озноб, головная боль и боль в конечностях (все легкие), которые отмечались после введения 14,4 мкг (2-й цикл вакцинации). Кроме того, наблюдалось полностью обратимое небольшое дозозависимое снижение тромбоцитов и лимфоцитов. Также отмечалось незначительное дозозависимое повышение системного IFN-α и IFN-γ после 2-го цикла вакцинации (14,4 мкг), причем последний был сравним с первым и четвертым пациентом по интенсивности.

При этом наблюдалась индивидуальная чувствительность к введению PHK_(LIP) у пациентов 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 и 16 (возрастной диапазон 27-75 лет). Это отражается в различной интенсивности гематологических изменений и в различной кратковременной индукции уровней системных цитокинов, особенно при дозах >29 мкг общей РНК, и в отличающихся профилях нежелательных явлений, связанных с повторяющимся дозированием РНК_(LIP). Хотя большинство пациентов очень хорошо переносили неоднократное введение РНК(_LIP) даже в дозах вплоть до 75 и 100 мкг общей РНК, у отдельных пациентов отмечалась сильная лихорадка после введения 100 мкг РНК(_LIP) (пациент 16) или ухудшение гипертензии после введения 7,2 мкг (пациент 11), 14,4 мкг (пациент 10) и 75 или 100 мкг общей РНК_(LIP) (пациент 16).

Исходя не только из отличия между наблюдаемыми нежелательными явлениями, возникающими при каждой дозе среди 15 пациентов, но также из индивидуальных различий в гематологических изменениях и уровнях экспрессии цитокинов в сыворотке в различные моменты времени после введения иммунотерапевтического средства, данные четко указывают на то, что различные индивиды различаются по интенсивности индуцированных иммунологических реакций при введении одного и того же иммунотерапевтического средства при одной и той же дозе.

Пример 2

Целью следующего исследования было получение информации об активации in vitro выделенных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или клеток в цельной крови по измерению экспрессии некоторых цитокинов после того, как клетки контактировали с молекулами РНК в комплексе с липосомами (PHK_LIP), причем молекулы РНК кодируют определенные опухолевые антигены. Кодируемые антигены: NY-ES01 - раковый антиген, экспрессирующийся в самых разных опухолях (RBL001.1), тирозиназа (RBL002.2), MAGE-А3-связанный с меланомой антиген (RBL003.1) и ТРТЕ - тирозиновая протеинфосфатаза (RBL004.1).

В первой части этого исследования образцы гепаринизованной цельной крови человека и РВМС (выделенных из гепаринизованной цельной крови), полученные от здоровых доноров, контактировали со смесью из равных частей липосомных составов RBL001.1, RBL002.2, RBL003.1 и RBL004.1. Для получения информации о роли дендритных клеток (DC) в отношении секреции цитокинов в цельной крови, во второй части исследования проводили обогащение гепаринизованной цельной крови плазмоцитоидными DCs (pDC) или происходящими из моноцитов незрелыми DCs (iDC), а затем инкубировали с молекулами РНК в составе липосом (PHK-LIP).

В качестве первичного показателя в обеих частях этого исследования определяли активацию этих клеток через 6 ч и 24 ч после контактирования путем анализа экспрессии цитокинов в супернатантах культур. В первой части исследования анализировали следующие цитокины: IP-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12 и IFN-α2. Во второй части исследования анализировали только IP-10, IL-6 и IFN-α2.

В культурах РВМС при контактировании с четырьмя различными композициями РНК-LIP наблюдалась дозозависимая индукция всех детектируемых цитокинов (фиг. 2а-2h). Как видно из фиг. 3a-3h, в цельной крови, где детектировалась экспрессия, не было изменений в уровнях цитокинов IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2 и IL-12. Кроме того, IFN-α2 не повышался значительно при любой дозе в цельной крови по сравнению с контролем на разбавитель. Однако наблюдалась дозозависимая повышающая регуляция хемокина IP-10 (CXCL10) в цельной крови. Усиление индукции IL-6 в цельной крови наблюдалось только в клетках, полученных от одного из четырех доноров и лишь на низком уровне.

В исследовании с обогащенной дендритными клетками цельной кровью тоже наблюдалась дозозависимая индукция IP-10, IFN-α2 и IL-6.

Результаты, полученные на выделенных РВМС, показали некоторые отличия по сравнению с цельной кровью, свидетельствуя о большей чувствительности тест-системы с выделенными РВМС. С выделенными РВМС наблюдалось повышение уровня цитокинов для всех тестируемых цитокинов, тогда как с РВМС в цельной крови обнаружение цитокинов ограничивалось IFN-α2, IP-10 и IL-6. Во второй части исследования секреция цитокинов в цельной крови повышалась при обогащении различными типами DC, свидетельствуя о том, что именно DC являются основным типом клеток для поглощения комплексов РНК-липосомы. Исходя из этих данных, можно предположить, что pDC являются основным типом клеток для захвата РНК в составе липосом в цельной крови, так как обогащение свежими pDC приводит к повышению секреции IFN-α2.

Более того, эти результаты четко показывают значительные индивидуальные отличия в различных иммунологических реакциях в ответ на контактирование иммунотерапевтического средства (РНК-LIP) с иммунореактивным материалом индивидов (РВМС, цельная кровь и цельная кровь, обогащенная DC) при одной и той же дозе.

Материалы

В исследованиях использовали следующие материалы и их источники: заказной 7-plex (кат. №L5002JFHHC), одинарный IFN-α2 Plex (кат. №171-В6010М), одинарный IP-10 Plex (кат. №171- В5020М), одинарный IL-6 Plex (кат. №171-В5006М), стандарты цитокинов группы II (кат. №171-D60001), стандарты цитокинов группы I (кат. №171-D50001), набор реагентов Bio-Plex Pro (кат. №171-304070М), все от фирмы Bio-Rad Laboratories GmbH; пируват натрия (кат. №11360-039), заменимые аминокислоты (кат. №11140-035), пенициллин-стрептомицин (кат. №15140-122), HEPES (кат. №15360-056), RPMI-1640+Glutamax™ (кат .№61870-010), все от фирмы Invitrogen, GIBCO®; человеческая сыворотка типа АВ фирмы LONZA; IL-4 (кат. №130-093-924), шарики CD14 (кат. №130-050-201), шарики CD304 (кат. №130-090-532), все от фирмы Miltenyi Biotech GmbH; Leucomax, Molgramostim (rHuman GM-CSF) фирмы Novartis; и Ficoll-Paque PLUS (кат. №17-1440-03) фирмы GE Healthcare.

Методы

Цельную кровь получали от здоровых добровольцев в стерильных шприцах. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Гепаринизованную цельную кровь использовали для получения РВМС путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque. iDC выделяли из свежеполученных РВМС, выделенных из цельной крови, а выделение моноцитов CD14⁺ проводили методом разделения на магнитных шариках. pDC выделяли из свежеполученных РВМС, выделенных из цельной крови, а выделение pDC проводили методом разделения на магнитных шариках.

Для первой части этого исследования получали гепаринизованную цельную кровь от здоровых доноров (n=4). Одну часть цельной крови использовали для получения РВМС. Затем РВМС ресуспендировали в среде и высеивали в 96-луночный планшет.Вкратце, на каждую дозовую группу высеивали 5 × 10⁵ РВМС по 180 мкл на лунку. Затем добавляли 20 мкл растворов, содержащих РНК в комплексе с липосомами (смесь РНК-липосомы), до конечного объема 200 мкл (разведение 1:10 каждого раствора) и конечной плотности клеток 2,5×10⁶ РВМС/мл. Для всех исследуемых доз получали данные из трех повторов. Оставшуюся цельную кровь, полученную от тех же доноров, раскапывали прямо в лунки 96-луночного планшета. Вкратце, высеивали 180 мкл цельной крови в трех повторах для всех дозовых групп и добавляли по 20 мкл растворов, содержащих РНК в комплексе с липосомами, до конечного объема 200 мкл и разведения добавляемых растворов 1:10. Ниже в табл. 1 и 2 приведены сводки по индивидуальным образцам для исследования.

Для второй части исследования дважды получали гепаринизованную цельную кровь от одних и тех же доноров (n=2). Первый раз гепаринизованную цельную кровь использовали для получения РВМС, а затем для выделения моноцитов CD14⁺. Выделенные моноциты культивировали в течение 5 дней для получения iDC. В культуральную среду добавляли цитокины IL-4 и GM-CSF (по 1000 ед./мл), чтобы стимулировать образование iDC. Через три дня клетки получали свежую среду, содержащую цитокины. Затем получали гепаринизованную цельную кровь от тех же доноров во второй раз. Одну часть этой крови использовали для получения РВМС, а затем для выделения pDC. После этого оставшуюся цельную кровь высеивали в лунки, как описано выше: 180 мкл на лунку в 96-луночном планшете. Для группы с самой высокой дозой раскапывали по 100 мкл цельной крови. Добавление аутологичных pDC или iDC проводили следующим образом: в образцы цельной крови добавляли 10000 DC, как указано в табл. 3. После добавления DC добавляли 20 мкл растворов, содержащих РНК с составе липосом, до конечного объема 200 мкл и разведения растворов 1:10.

Расписание экспериментов Первая часть исследования

День 1. Получение гепаринизованной цельной крови (n=4)

Получение РВМС от каждого донора

Посев РВМС и цельной крови

Добавление растворов РНК-LIP и инкубация

Получение супернатантов/плазмы в точке 6 ч и замораживание при -65°С - -85°С

День 2. Получение супернатантов/плазмы в точке 24 ч и замораживание при -65°С - -85°С

Проведение анализа замороженных супернатантов в любой следующий день

Вторая часть исследования

День 1. Получение цельной крови (n=2)

Получение РВМС от каждого донора

Выделение моноцитов CD14⁺ из РВМС

Культивирование выделенных моноцитов CD14⁺ для получения iDC

День 4. Подпитка iDC

День 6. Сбор iDC

Получение цельной крови (n=2; те же доноры)

Получение РВМС от каждого донора

Выделение pDC из РВМС

Посев цельной крови

Добавление iDC или pDC, соответственно

Добавление растворов, содержащих PHK-LIP

Получение супернатантов/плазмы в точке 6 ч и замораживание при -65°С - -85°С

День 7. Получение супернатантов/плазмы в точке 24 ч и замораживание при -65°С - -85°С

Проведение анализа супернатантов/плазмы в любой следующий день

Результаты

После инкубации РВМС со смесью РНК-LIP в течение 24 часов отмечалась дозозависимая секреция всех цитокинов. Однако наблюдались сильные колебания уровней концентрации цитокинов (20-60000 пг/мл). В реакции цитокинов доминировали пять из восьми отобранных цитокинов, а именно IP-10, IFN-γ, TNF-α, IL-1β и IL-6 (см. табл. 4). Кроме того, наблюдались и различия во времени секреции: IL-1, IL-6 и TNF-α выявлялись уже после 6 ч инкубации (при высоких концентрациях РНК), а их уровни не повышались заметно через 24 ч, свидетельствуя о вариациях в способности клеток от разных доноров реагировать на добавление композиции PHK-LIP.

В дополнение к исследованиям с выделенными РВМС проводили аналогичные эксперименты на цельной крови. В этих опытах не отмечалось повышения секреции цитокинов до заметной концентрации после инкубации с композицией РНК-LIP у следующих цитокинов: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2 и IL-12 (см. табл. 5 и фиг. 3a-3h). Отметим, что в некоторых точках повышение уровня, которое наблюдалось только в 1 из 3 повторов, считались выбросами. В отношении IFN-α2 отмечался низкий уровень базовой секреции в некоторых образцах от трех из четырех доноров, включая контроль на разбавитель. У всех доноров отмечалось повышение секреции IP-10 через 24 часа при самой высокой из исследованных доз. У двух из четырех доноров все-таки отмечалось повышение уровня при дозе #3 (0,37 мкг/мл). IL-6 возрастал, хотя и на очень низком уровне, после добавления РНК-LIP у двух из четырех доноров через 24 часа при самой высокой из исследованных доз.

Для проверки роли DC в активации и секреции цитокинов на цельной крови, проводили вторую часть исследования. При этом гепаринизованную цельную кровь, обогащенную аутологичными iDC или pDC, инкубировали с композицией РНК-LIP в диапазоне доз от 0,016 до 50 мкг/мл. Результаты, представленные на фиг. 4а-4с и фиг. 5а-5с, показывают четкую дозозависимую индукцию IFN-α2, IP-10 и IL-6. В отношении IFN-α2 повышение секреции после 24-часовой инкубации с композицией РНК-LIP в цельной крови отмечалось только при двух самых высоких из исследованных доз (10 и 50 мкг/мл). При дозе 3 (2 мкг/мл) не отмечалось повышения секреции. Однако добавление pDC к гепаринизованной цельной крови повышало секрецию IFN-α2 при дозе 2 мкг/мл. Напротив, добавление iDC не вело к повышению секреции этого цитокина по сравнению с самой цельной кровью. Примечательно, что повышение уровня IP-10 отмечалось после 24-часовой инкубации с РНК-LIP при 0,4-50 мкг/мл (немного и при 0,08 мкг/мл), что подтверждает результаты первой части исследования. Добавление DC любого типа приводило к еще большей секреции определяемых цитокинов по сравнению с отсутствием добавления, хотя самые высокие уровни отмечались в цельной крови, обогащенной iDC. В отношении IL-6 подтвердились результаты из первой части исследования, например, повышение уровня экспрессии отмечалось при дозах выше 2 мкг/мл. При этом добавление iDC к цельной крови также приводило к повышению уровня экспрессии по сравнению с самой цельной кровью.

Обсуждение и заключение

В отношении первой части исследования, в обеих тест-системах - изолированных РВМС человека и цельной крови, после инкубации с композицией PHK-LIP секретировались некоторые цитокины. Однако различия между тест-системами свидетельствуют, что РВМС обладают большей чувствительностью в качестве тест-системы. С одной стороны, отмечалось повышение уровня цитокинов в выделенных РВМС по всем 8 исследованным цитокинам. При использовании цельной крови в качестве тест-системы отмеченные цитокины ограничивались IFN-α2, IP-10 и IL-6. Разные результаты могут быть вызваны различными условиями культивирования, так как выделенные РВМС культивировали в культуральной среде с добавлением сыворотки (FCS) и антибиотиков, тогда как культивирование в цельной крови означает, что РВМС культивировали с плазмой и эритроцитами человека.

Во второй части исследования было показано, что секреция IFN-α2 в цельной крови может повышаться при добавлении pDC. Известно, что pDC секретируют IFN-α при активации TLR-7 (Kwissa et al., 2012. Distinct TLR adjuvants differentially stimulate systemic and local innate immune responses in nonhuman primates. Blood 119:2044-2055; Schiller et al, 2006. Immune response modifiers-mode of action. Exp.Dermatol. 15:331-341, Hornung et al, 2005. Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat. Med. ll(3):263-270). Поскольку TLR-7 активируется РНК внутри эндосом, это значит, что pDC являются главным типом клеток для поглощения РНК.

Результаты этих экспериментов также показывают, что один и тот же иммунореактивный материал, выделенный от разных индивидов, при контактировании с одним и тем же иммунотерапевтическим средством при одной и той же концентрации (той же дозе) дает значительно отличающиеся иммунологические реакции, тем самым дополнительно подтверждая вывод о том, что иммунотерапевтические средства при одной и той же дозе оказывают различное действие на разных индивидов, поэтому нет единой дозы, которая была бы терапевтически эффективной и/или переносимой у всех индивидов.

Пример 3

Целью следующего исследования было получение информации об активации in vitro выделенных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или клеток в свежей цельной крови путем измерения секреции определенных цитокинов и индукции общего маркера активации (CD69) после того, как клетки инкубировали при различных концентрациях небольших соединений-агонистов TLR-7, а именно N--(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)ацетамида (обозначается здесь как SM1) и N-{4-[4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1H-имидазо [4,5-с]хинолин-1-ил]бутил}-N-(1,1-диоксотиэтан-3-ил)ацетамида (обозначается здесь какБМ2). Как обсуждается более подробно ниже, гепаринизованную цельную кровь человека и РВМС (выделенные из лейкоцитарной пленки), полученные от здоровых доноров, инкубировали в течение 24 часов с эквимолярными количествами соединений-агонистов SM1 или SM2.

РВМС для эксперимента выделяли из лейкоцитарной пленки путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque. Затем РВМС ресуспендировали в среде для культивирования клеток и высеивали в 96-луночный планшет. Вкратце, на каждую дозовую группу высеивали 5 × 10⁵ РВМС по 190 мкл на лунку. Затем добавляли 10 мкл агонистов в указанных концентрациях до конечного объема 200 мкл (разведение каждого раствора 1:20) и конечной плотности клеток 2,5×10⁶ РВМС/мл. Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 часов. После этого собирали супернатанты и сразу же анализировали либо замораживали и хранили при -80°С до анализа. Для всех доз исследуемых агонистов получали данные от 10 человек (для обеих частей исследования), все в биологических повторах.

Цельную кровь получали от здоровых добровольцев в стерильных шприцах. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Свежую гепаринизованную цельную кровь раскапывали прямо в 96-луночный планшет. Вкратце, 190 мкл цельной крови от разных индивидов (n=10 доноров для СВА; n=8 для проточной цитометрии) высеивали в двух повторах для всех дозовых групп и добавляли 10 мкл растворов тестируемых элементов до конечного объема 200 мкл и разбавления добавляемых растворов 1:20. Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 часов. После этого собирали супернатанты и сразу же анализировали либо замораживали и хранили при -80°С до анализа.

Для измерения клеточной активации по экспрессии CD69 собирали клеточные осадки и сразу же проводили окрашивание для проточной цитометрии и измерения.

Готовили серийные разведения каждого агониста с разбавителем DMSO (диметилсульфоксид): 5-кратно за 8 раз. Концентрации соединений-агонистов при инкубации с РВМС или цельной кровью составляли 10 мкМ, 2 мкМ, 0,4 мкМ, 0,08 мкМ, 0,016 мкМ, 0,0032 мкМ, 0,0006 мкМ и 0,0001 мкМ.

В качестве первичного показателя в первой части исследования определяли активацию клеток путем анализа индукции секреции цитокинов в супернатантах клеточных культур (РВМС) и плазме (цельная кровь) методом цитометрического анализа на шариках (СВА). Анализировали следующие цитокины/хемокины (IFN-α, IP-10, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 и IL-2). Для второй части исследования определяли активацию клеток путем анализа экспрессии общего маркера активации CD69 в нескольких типах иммунных клеток методом проточной цитометрии. Исследовали следующие типы иммунных клеток: плазмоцитоидные дендритные клетки (pDC), миелоидные дендритные клетки (mDC), моноциты, В-клетки и NK-клетки.

В частности, для определения концентрации цитокинов использовали метод цитометрического анализа на шариках (мультиплексный набор ProcartaPlex; eBioscience), который охватывал все десять цитокинов/хемокинов (IFN-α, IP-10, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 и IL-2). Анализ проводили на установке Luminex®.

Для проточной цитометрии клеточные осадки окрашивали с помощью смеси антител, комбинируя поверхностные маркеры CD3, CD16, CD19, CD14, BDCA2 и BDCA3 и маркер активации CD69. С этим набором можно было анализировать активацию В-клеток, NK-клеток, моноцитов, плазмоцитоидных дендритных клеток (pDC) и миелоидных дендритных клеток (mDC). Измерения проводили на BD FACS Canto II™.

В культивируемых РВМС при инкубации с агонистами TLR7 наблюдалась последовательная и дозозависимая индукция 8 из 10 измеряемых цитокинов (фиг. 6a-6h). Только IL-12p70 и IL-2 не индуцировались последовательно, а в нескольких случаях они экспрессировались только на низком уровне в РВМС от некоторых доноров (фиг. 6i-6j). Сравнение уровней цитокинов у разных доноров при различных концентрациях агонистов показывает сильную вариабельность для обоих соединений-агонистов, что объясняется очень индивидуальной реакцией иммунной системы на внешние раздражители, о чем свидетельствует инкубация типичных агонистов TLR7 с иммунными клетками в условиях in vitro.

После инкубации цельной крови с каждым соединением-агонистом (фиг. 7а-7j) кривые зависимости доза-эффект для выявляемых цитокинов в основном сопоставимы с наблюдениями, проведенными на РВМС. Однако, в отличие от РВМС, также наблюдается последовательная и дозозависимая индукция секреции IL-12p70 после инкубации с каждым соединением-агонистом (фиг. 7j). Как отмечалось у РВМС, кривые зависимости доза-эффект для секреции цитокинов очень индивидуальны и зависят от соответствующей реакции иммунной системы донора крови.

Клеточную активацию после инкубации РВМС и цельной крови с агонистами TLR7 также анализировали методом проточной цитометрии (по экспрессии CD69). Аналогично наблюдениям, сделанным по секреции цитокинов, отмечается последовательная дозозависимая активация всех анализируемых популяций иммунных клеток (pDC, mDC, моноцитов, В-клеток и NK-клеток) для обоих соединений-агонистов, для РВМС (фиг. 8а-8е) и для цельной крови (рис. 9а-9е). Кроме того, как отмечалось и по цитокинам, интенсивность активации иммунных клеток также сильно варьирует между образцами крови от различных доноров.

Вышеописанные результаты четко показывают, что разные индивиды значительно различаются по интенсивности индуцированных клеточных иммунологических реакций в ответ на иммунотерапевтические средства, в данном случае агонисты TLR7.

Пример 4

Целью следующего исследования было изучение эффекта введения in vivo различных количеств низкомолекулярных агонистов TLR7 - N-(4-(4-амино-2-(2-метоксиэтил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)ацетамида (SM1) и N-(4-(4-амино-2-этил-1H-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил)бутил)-N-(1,1-диоксидотиэтан-3-ил)ацетамида (SM3) на экспрессию различных цитокинов в крови на модели у макаки-крабоеда. Различные цитокины, экспрессию которых определяли, включают интерферон-альфа, антагонист рецептора интерлейкина-1, интерлейкины 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, хемоаттрактантный белок моноцитов 1, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, воспалительный белок-1β макрофагов, альфа-фактор некроза опухолей и фактор роста сосудистого эндотелия.

Макакам крабоедам внутривенно вводили определенную однократную дозу одного из соединений-агонистов в виде 30-минутной инфузии. Через некоторые промежутки времени после начала введения у обезьян брали пробы крови (0,5 мл примерно для 0,25 мл плазмы) из кровеносного сосуда vena cephalica antebrachii или vena saphena в пробирки с K₃EDTA. Образцы крови хранили на измельченном льду до центрифугирования. Плазму получали центрифугированием при 1800g при 4°С в течение 10 мин, вносили порциями в маркированные микропробирки и хранили замороженными при -70°С или ниже. Перед определением цитокинов образцы замороженной плазмы оттаивали и разбавляли.

Уровни цитокинов определяли с помощью набора ELISA для альфа-интерферона (например, набора VeriKine™ Cynomolgus/Rhesus IFNa ELISA) и набора Luminex® для цитокинов/хемокинов у приматов (например, Milliplex Non-Human Primate Cytokine/Chemokine Magnetic Premixed 23 Plex Panel) в соответствии с инструкциями производителя. Сначала обезьянам вводили низкую дозу соединения-агониста (30 [только животным, получающим SM1], 100 [только животным, получающим SM1] или 300 мкг/кг). Позже, через 14 дней, тем же обезьянам вводили вторую, более высокую дозу того же соединения-агониста (1, 3 или 10 мг/кг). Результаты представлены на фиг. 10а-10kk (SMI) и на фиг. 11a-11m (SM3) и показывают, что введение in vivo агонистов TLR-7 приводит к продукции различных цитокинов очень индивидуальным образом.

Фиг. 10 (SM1)

Соединение-агонист SM1 вводили путем внутривенной инфузии макакам крабоедам, обозначаемым как особи Р0101 (самец), Р0102 (самец), Р0501 (самка), Р0502 (самка), Р0201 (самец), Р0202 (самец), Р0601 (самка), Р0602 (самка), Р0301 (самка), Р0202 (самка), Р0701 (самка), Р0702 (самка), в дозах 30 мкг/кг, 100 мг/кг, 300 мкг/кг и 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг, как описано ниже. В различные моменты времени измеряли секрецию цитокинов в кровь вплоть до 168 часов после введения. На фигурах представлены концентрации в плазме различных цитокинов вплоть до 12 или 24 часов после начала инфузии.

Каждой обезьяне вводили один и тот же агонист дважды. Первое введение было при одной из низких доз: 30 мкг/кг, 100 мкг/кг или 300 мкг/кг, а второе введение было при одной из более высоких доз: 1 мг/кг, 3 мг/кг или 10 мг/кг. Обезьянам, получавшим 30 мкг/кг в качестве первой дозы, вводили вторую дозу в 1 мг/кг. Обезьянам, получавшим 100 мкг/кг в качестве первой дозы, вводили вторую дозу в 3 мг/кг.О безьянам, получавшим 300 мкг/кг в качестве первой дозы, вводили вторую дозу в 10 мг/кг.

Фиг. 10а. Секреция а-интерферона при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10b. Секреция α-интерферона при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг.10с. Секреция а-интерферона при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10d. Секреция агониста рецептора интерлейкина-1 при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10е. Секреция агониста рецептора интерлейкина-1 при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 1 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10f. Секреция агониста рецептора интерлейкина-1 при дозе в 3 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 10 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10g. Секреция интерлейкина-8 при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10h. Секреция интерлейкина-8 при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10i. Секреция интерлейкина-8 при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10j. Секреция интерлейкина-10 при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10k. Секреция интерлейкина-10 при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10l. Секреция интерлейкина-10 при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10m.Секреция хемоаттрактантного белка-1 моноцитов при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10n.Секреция хемоаттрактантного белка-1 моноцитов при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10о. Секреция хемоаттрактантного белка-1 моноцитов при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, РОЗ02, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10р. Секреция колониестимулирующего фактора гранулоцитов при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг.10q. Секреция колониестимулирующего фактора гранулоцитов при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10r.Секреция колониестимулирующего фактора гранулоцитов при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10s. Секреция интерлейкина-4 при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10t. Секреция интерлейкина-4 при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301,Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10u. Секреция интерлейкина-4 при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10v. Секреция интерлейкина-6 при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10w. Секреция интерлейкина-6 при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10х. Секреция интерлейкина-6 при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10у. Секреция интерлейкина-18 при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10z. Секреция интерлейкина-18 при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10аа. Секреция интерлейкина-18 при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10bb. Секреция воспалительного белка-ip макрофагов при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10cc. Секреция воспалительного белка-ip макрофагов при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10dd. Секреция воспалительного белка-1β макрофагов при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10ее. Секреция α-фактора некроза опухолей при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10ff. Секреция α-фактора некроза опухолей при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10gg. Секреция α-фактора некроза опухолей при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10hh. Секреция фактора роста сосудистого эндотелия при дозе в 30 мкг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i) и 100 мкг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii).

Фиг. 10Н. Секреция фактора роста сосудистого эндотелия при дозе в 300 мкг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (i) и 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (ii).

Фиг. 10jj. Секреция фактора роста сосудистого эндотелия при дозе в 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (i) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (ii).

Фиг. 10kk. Секреция интерлейкина-12 при дозе в 1 мг/кг у животных Р0101, Р0102, Р0501, Р0502 (i), 3 мг/кг у животных Р0201, Р0202, Р0601, Р0602 (ii) и 10 мг/кг у животных Р0301, Р0302, Р0701, Р0702 (iii).

Фиг. 11 (SM3)

Соединение-агонист SM3 вводили путем внутривенной инфузии самцам макаки-крабоеда, обозначаемым как особи 16962, 17477, 17479, 17607, 16988, 30018, 16669, 17613, 14030, 16216, в дозах 300 мкг/кг, 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг. В различные моменты времени измеряли секрецию цитокинов в кровь вплоть до 168 часов после введения. На фигурах представлены концентрации в плазме различных цитокинов вплоть до 12 или 24 часов после начала инфузии.

Фиг. 11а. Секреция а-интерферона при дозе в 300 мкг/кг у животных 16962, 17477, 17479, 17607 (i) и 1 мг/кг у животных 16962, 16988, 17479, 30018 (ii).

Фиг. 11b. Секреция а-интерферона при дозе в 3 мг/кг у животных 16669, 17607, 17613 (i) и 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477 (ii).

Фиг. 11с. Секреция колониестимулирующего фактора гранулоцитов при дозе в 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477.

Фиг. 11d. Секреция интерлейкина-10 при дозе в 1 мг/кг у животных 16962, 16988, 17479, 30018 (i) и 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477 (ii).

Фиг. 11е. Секреция интерлейкина-15 при дозе в 300 мкг/кг у животных 16962, 17477, 17479, 17607 (i) и 1 мг/кг у животных 16962, 16988, 17479, 30018 (ii).

Фиг. 11f. Секреция интерлейкина-15 при дозе в 3 мг/кг у животных 16669, 17607, 17613 (i) и 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477 (ii).

Фиг. 11g. Секреция агониста рецептора интерлейкина-1 при дозе в 300 мкг/кг у животных 16962, 17477, 17479, 17607 (i) и 1 мг/кг у животных 16962, 16988, 17479, 30018 (ii).

Фиг. 11h. Секреция агониста рецептора интерлейкина-1 при дозе в 3 мг/кг у животных 16669, 17607, 17613 (i) и 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477 (ii).

Фиг. 11i. Секреция интерлейкина-10 при дозе в 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477.

Фиг. 11j. Секреция хемоаттрактантного белка-1 моноцитов при дозе в 300 мкг/кг у животных 16962, 17477, 17479, 17607 (i) и 1 мг/кг у животных 16962, 16988, 17479, 30018 (ii).

Фиг. 11k. Секреция хемоаттрактантного белка-1 моноцитов при дозе в 3 мг/кг у животных 16669, 17607, 17613 (i) и 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477 (ii).

Фиг. 11l. Секреция α-фактора некроза опухолей при дозе в 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477.

Фиг. 11m. Секреция воспалительного белка-ip макрофагов при дозе в 10 мг/кг у животных 14030, 16216, 17477.

Пример 5

Целью следующего исследования было изучение эффекта введения in vivo двух низкомолекулярных агонистов TLR8 - 2-этил-1-(4-((2-метилтетрагидрофуран-3-ил)амино)бутил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амина (SM4) и 1-(4-(циклогексиламино)бутил)-2-этил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амина (SM5) на секрецию цитокинов клетками РВМС человека in vitro. Различные цитокины, экспрессию которых определяли, включают альфа-фактор некроза опухолей, интерлейкин-1β, интерлейкины 6, 8, 10 и 12р70, гамма-интерферон, интерлейкин 10 и индуцируемый γ-интерфероном белок 10.

РВМС выделяли из свежих образцов крови, взятых у 4 добровольных доноров крови человека. РВМС выделяли по стандартной методике, ресуспендировали в среде для культивирования клеток, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, при плотности 2×10⁶ клеток/мл, высеивали в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку, а затем инкубировали 6 часов при 37°С. Подходящие исходные растворы каждого соединения-агониста получали путем растворения соединения-агониста в DMSO и последующего разбавления DMSO за один или несколько раз до концентрации, превышающей в 1000 раз конечную концентрацию при тестировании. Готовили соответствующие разведения агониста с помощью среды; на первом этапе агонист разбавляли 1:100, а на втором этапе к 100 мкл клеток в лунках добавляли 25 мкл предыдущего разведения и 125 мкл среды.

Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°С, а затем собирали супернатанты и анализировали методом анализа на шариках Luminex® или методом ELISA, специфичным для определенных цитокинов человека, в соответствии с инструкциями производителей.

Результаты, представленные на фиг. 12 и 13, показывают, что воздействие на РВМС человека агонистами TLR8 приводило к секреции измеряемых цитокинов очень индивидуальным образом.

Фиг. 12 (SM4)

Соединение-агонист SM4 добавляли при анализе in vitro к свежеприготовленным РВМС человека от четырех доноров крови, обозначенных как индивиды 130325, 100621, 110126, 110125, в различных концентрациях, т.е. 0,1 мкМ, 0,3 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ и 30 мкМ. Через 24 часа после добавления соединения-агониста измеряли секрецию цитокинов в супернатантах, как описано выше. Представлены концентрации различных цитокинов в супернатантах после 24-часовой инкубации с различными количествами агониста.

Фиг. 12а. Секреция а-фактора некроза опухолей из РВМС от индивидов 130325, 100621, 110126, 110125 через 24 часа.

Фиг. 12b. Секреция интерлейкина-1 Р из РВМС от индивидов 130325, 100621, 110126, 110125 через 24 часа.

Фиг. 12с. Секреция интерлейкина-6 из РВМС от индивидов 130325, 100621, 110126, 110125 через 24 часа.

Фиг. 12d. Секреция гамма-интерферона из РВМС от индивидов 130325, 100621, 110126, 110125 через 24 часа.

Фиг. 12е. Секреция интерлейкина-10 из РВМС от индивидов 130325, 100621, 110126, 110125 через 24 часа.

Фиг. 12f. Секреция индуцируемого у-интерфероном белка 10 из РВМС от индивидов 130325, 100621, 110126, 110125 через 24 часа.

Фиг. 13 (SM5)

Соединение-агонист SM5 добавляли при анализе in vitro к свежеприготовленным РВМС человека от четырех доноров крови, обозначенных как индивиды 131105, 130618, 130325, 131120, в различных концентрациях: 0,1 мкМ, 0,3 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ и 30 мкМ. Через 24 часа после добавления соединения-агониста измеряли секрецию цитокинов в супернатантах, как описано выше. Представлены концентрации различных цитокинов в супернатантах после 24-часовой инкубации с различными количествами агониста.

Фиг. 13а. Секреция α-фактора некроза опухолей из РВМС от индивидов 131105, 130618, 130325, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13b. Секреция интерлейкина-1β из РВМС от индивидов 131105, 130618, 130325, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13с. Секреция интерлейкина-6 из РВМС от индивидов 131105, 130618, 130325, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13d. Секреция интерлейкина-8 из РВМС от индивидов 131105, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13е. Секреция гамма-интерферона из РВМС от индивидов 131105, 130618, 130325, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13f. Секреция интерлейкина-10 из РВМС от индивидов 131105, 130618, 130325, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13g. Секреция индуцируемого γ-интерфероном белка 10 из РВМС от индивидов 131105, 130618, 130325, 131120 через 24 часа.

Фиг. 13h. Секреция интерлейкина 12р70 из РВМС от индивидов 131105, 131120 через 24 часа.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH

<120> DOSE DETERMINATION FOR IMMUNOTHERAPEUTIC AGENTS

<130> 674-171 PCT2

<140>

<141>

<150> PCT/EP2016/075647

<151> 2016-10-25

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence

<220>

<221> REPEAT

<222> (1)..(3)

<223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently

a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(15)

<223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or

more, 3 or more, 4 or more or 5 or more

<220>

<221> REPEAT

<222> (4)..(6)

<223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently

a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20

<220>

<221> REPEAT

<222> (7)..(9)

<223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently

a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20

<220>

<221> REPEAT

<222> (10)..(12)

<223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently

a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20

<220>

<221> REPEAT

<222> (13)..(15)

<223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently

a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20

<400> 1

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker sequence

<400> 2

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<---

1. Применение способа для контактирования иммунореактивного материала индивида с иммунотерапевтическим средством и измерения по меньшей мере одной иммунологической реакции для определения того, находится ли в подходящей для введения этому индивиду дозе это иммунотерапевтическое средство, причем указанная иммунологическая реакция представляет собой изменение экспрессии или количества одного или более цитокинов, продуцированных этим иммунореактивным материалом, где доза иммунотерапевтического средства, при которой указанная по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения индивиду, где приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства включает остановку или замедление прогрессирования заболевания у индивида; ингибирование или замедление развития нового заболевания у индивида; уменьшение частоты или тяжести симптомов и/или рецидивов у индивида, у которого в настоящее время или у которого ранее было заболевание; и/или увеличение продолжительности жизни человека.

2. Способ определения подходящей дозы иммунотерапевтического средства для введения индивиду, включающий определение дозы, подходящей для индивида, с использованием стандартного диапазона доз для иммунотерапевтического средства, которые, как известно, оказывают терапевтическое действие, причем данный способ отличается тем, что указанное определение включает применение по п. 1, в котором способ контактирования иммунореактивного материала индивида с иммунотерапевтическим средством и измерения по меньшей мере одной иммунологической реакции используется в отношении указанного иммунотерапевтического средства, предоставленного в множестве различных доз, представляющих эскалацию дозы, при этом множество различных доз включает по меньшей мере одну дозу, которая находится ниже стандартного диапазона доз для иммунотерапевтического средства, или где множество различных доз включает по меньшей мере одну дозу, которая находится в пределах стандартного диапазона доз для иммунотерапевтического средства, и по меньшей мере одна доза из указанного множества различных доз определяется как подходящая доза, при этом известна корреляция между по меньшей мере одной иммунологической реакцией и терапевтическим эффектом, при этом доза, при которой по меньшей мере одна иммунологическая реакция указывает на приемлемый терапевтический эффект иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения индивиду, где приемлемый терапевтический эффект для конкретного иммунотерапевтического средства включает остановку или замедление прогрессирования заболевания у индивида; ингибирование или замедление развития нового заболевания у индивида; уменьшение частоты или тяжести симптомов и/или рецидивов у индивида, который в настоящее время имеет или ранее имел заболевание; и/или увеличение продолжительности жизни человека.

3. Применение по п. 1 или способ по п. 2, при этом измерение по меньшей мере одной иммунологической реакции характеризуется качественным и/или количественным измерением экспрессии или количества одного или более цитокинов.

4. Способ по п. 2 или 3, при этом множественные различные дозы иммунотерапевтического средства составляют две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и более десяти различных доз.

5. Способ по любому из пп. 2-4, при этом множество различных доз иммунотерапевтического средства представляют эскалацию дозы, которая является линейной или логарифмической эскалацией дозы.

6. Применение по п. 1 или 3 или способ по любому из пп. 2-5, где иммунотерапевтическое средство является агонистом Toll-подобного рецептора (TLR), предпочтительно агонистом TLR-7 или TLR-8.

7. Применение по любому из пп. 1, 3 или 6 или способ по любому из пп. 2-6, где иммунотерапевтическое средство включает по меньшей мере иммунореактивный пептид или белок либо нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере иммунореактивный пептид или белок.

8. Применение или способ по п. 7, где указанная нуклеиновая кислота включает РНК.

9. Применение способа по п. 8, где иммунотерапевтическое средство включает РНК и по меньшей мере один липид.

10. Применение способа по п. 9, где иммунотерапевтическое средство включает РНК в составе липоплекса.

11. Применение по любому из пп. 1, 3, 6-10 или способ по любому из пп. 2-10, где измерение по меньшей мере одной иммунологической реакции выполняют через 2-48 часов после контактирования иммунореактивного материала индивида с иммунотерапевтическим средством, предпочтительно через 4-24 часа.

12. Применение по любому из пп. 1, 3, 6-11 или способ по любому из пп. 2-11, где по меньшей мере один цитокин выбран из группы, состоящей из интерлейкина-6 (IL-6), α-фактора некроза опухолей (TNF-α), α-интерферона (IFN-α), γ-интерферона (IFN-γ), индуцируемого γ-интерфероном белка 10 (IP-10), интерлейкина-1β (IL-1β), интерлейкина-2 (IL-2) и интерлейкина-12p70 (IL-12p70).

13. Применение или способ по п. 12, при этом по меньшей мере один цитокин представлен α-интерфероном (IFN-α).

14. Применение по любому из пп. 1, 3, 6-13 или способ по любому из пп. 2-13, где способ для контактирования иммунореактивного материала индивида с иммунотерапевтическим средством и измерение по меньшей мере одной иммунологической реакции осуществляется способом in vitro.

15. Применение или способ по п. 14, при этом иммунореактивный материал индивида включает клетки крови, выделенные из индивида.

16. Применение или способ по п. 15, при этом иммунореактивный материал включает цельную кровь, выделенную из индивида.

17. Применение или способ по п. 16, при этом цельная кровь обогащена аутологичными дендритными клетками от индивида, предпочтительно плазмоцитоидными дендритными клетками (pDC) и/или происходящими из моноцитов незрелыми дендритными клетками (iDC).

18. Применение или способ по п. 17, при этом иммунореактивный материал индивида в основном состоит из или включает мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

19. Применение или способ по любому из пп. 14-18, при этом доза, при которой меняется экспрессия или количество одного или более цитокинов указывает на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду, где о приемлемом терапевтическом эффекте для определенного иммунотерапевтического средства предпочтительно свидетельствует:

(i) наивысший уровень экспрессии определенного цитокина, или

(ii) наименьший уровень экспрессии определенного цитокина, или

(iii) индукция экспрессии определенного цитокина, или

(iv) специфический профиль экспрессии множества цитокинов, или

(v) индукция дифференцировки определенной иммунной клетки, или

(vi) индукция или усиление эффекторной функции иммунной клетки, предпочтительно Т-клетки.

20. Способ по любому из пп. 2-13, где контактирование иммунореактивного материала индивида с иммунотерапевтическим средством выполняют in vivo, и она отличается раздельным контактированием множества различных доз иммунотерапевтического средства с иммунореактивным материалом индивида в виде отдельных операций введения, каждая из которых характеризуется введением индивиду одной дозы иммунотерапевтического средства.

21. Способ по п. 20, при этом отдельные операции введения выполняют последовательно с промежутками времени от 2 до 30 дней, например от 7 до 28 дней, предпочтительно в 7 дней, 14 дней, 21 день или 28 дней, более предпочтительно в 7 дней или 14 дней между ними.

22. Способ по п. 20 или 21, при этом измерение изменения экспрессии или количества одного или более цитокинов проводится отдельно после каждой отдельной операции введения.

23. Способ по любому из пп. 20-22, при этом первая из отдельных операций введения характеризуется введением такой дозы иммунотерапевтического средства, которая ниже стандартного диапазона доз для этого иммунотерапевтического средства, а дозы, вводимые при последующих отдельных операциях введения, необязательно будут выше, чем доза, вводимая первой из отдельных операций введения, причем указанный стандартный диапазон доз для указанного иммунотерапевтического средства предпочтительно является таким, который известен как обеспечивающий терапевтический эффект.

24. Способ по любому из пп. 20-23, дополнительно включающий (c) выявление наличия или отсутствия по меньшей мере одного побочного эффекта.

25. Способ по п. 24, при этом по меньшей мере один побочный эффект представляет собой неприемлемый побочный эффект, при этом, в частности, неприемлемый побочный эффект представляет собой более серьезный побочный эффект, в частности, неприемлемый побочный эффект представляет собой побочный эффект, который угрожает жизни индивида.

26. Способ по п. 24 или 25, при этом определение присутствия или отсутствия по меньшей мере одного побочного эффекта выполняют после каждой отдельной операции введения.

27. Способ по любому из пп. 24-26, при этом, если после введения одной из множественных различных доз выявляется по меньшей мере один побочный эффект, то все последующие дозы вводятся вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством.

28. Способ по п. 27, при этом, если после введения одной из множественных различных доз при введении не вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством выявляется по меньшей мере один побочный эффект, то следующая доза иммунотерапевтического средства, подлежащая последующему введению, должна быть равна или меньше дозы, введенной при предыдущей операции введения.

29. Способ по п. 28, при этом за той операцией введения, которая следует непосредственно за предыдущей операцией введения, дополнительно следует одна или несколько дополнительных операций введения, которые необязательно представляют схему эскалации дозы шаг за шагом.

30. Способ по любому из пп. 27-29, при этом, если после введения одной из множества различных доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством выявляется по меньшей мере один побочный эффект, то следующая доза иммунотерапевтического средства, подлежащая последующему введению, должна быть меньше дозы, введенной при предыдущей операции введения.

31. Способ по любому из пп. 27-30, при этом антитоксическое средство включает жаропонижающий препарат, предпочтительно парацетамол (ацетаминофен).

32. Способ по любому из пп. 24-31, при этом побочный эффект представляет собой одно или несколько из числа парестезии, усталости, головной боли, мышечной боли, давления на грудь или боли в груди, озноба, повышенной температуры или жара, шума в ушах, боли в суставах, головокружения, потливости, гипотонии и тахикардии.

33. Способ по любому из пп. 20-32, при этом, если после введения одной из множественных различных доз не выявляется никаких побочных эффектов, то доза, при которой меняется экспрессия или количество одного или более цитокинов указывает на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду, где о приемлемом терапевтическом эффекте для определенного иммунотерапевтического средства предпочтительно свидетельствует:

(i) наивысший уровень экспрессии определенного цитокина, или

(ii) наименьший уровень экспрессии определенного цитокина, или

(iii) индукция экспрессии определенного цитокина, или

(iv) специфический профиль экспрессии множества цитокинов, или

(v) индукция дифференцировки определенной иммунной клетки, или

(vi) индукция или усиление эффекторной функции иммунной клетки, предпочтительно Т-клетки.

34. Способ по любому из пп. 20-32, при этом, если после введения одной из множественных различных доз выявляется по меньшей мере один побочный эффект, то доза при последующем введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, при которой меняется экспрессия или количество одного или более цитокинов указывает на приемлемый терапевтический эффект для иммунотерапевтического средства, отражает подходящую дозу для введения иммунотерапевтического средства индивиду, где о приемлемом терапевтическом эффекте для определенного иммунотерапевтического средства предпочтительно свидетельствует:

(i) наивысший уровень экспрессии определенного цитокина, или

(ii) наименьший уровень экспрессии определенного цитокина, или

(iii) индукция экспрессии определенного цитокина, или

(iv) специфический профиль экспрессии множества цитокинов, или

(v) индукция дифференцировки определенной иммунной клетки, или

(vi) индукция или усиление эффекторной функции иммунной клетки, предпочтительно Т-клетки.

35. Способ по п. 34, где подходящая доза для введения иммунотерапевтического средства индивиду является таковой, если (a) после введения не выявляется никаких побочных эффектов и (b) изменение в экспрессии или количестве одного или более цитокинов после введения любой из множества различных доз с по меньшей мере одним антитоксическим средством обеспечивает наиболее убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект, где это наиболее убедительное указание на приемлемый терапевтический эффект предпочтительно зависит от уровня экспрессии определенного измеряемого цитокина.

36. Способ по п. 35, где

(a) если выявляется по меньшей мере один побочный эффект после введения одной из множества различных доз при введении вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством, то наибольшая доза, при которой не выявляются побочные эффекты, является подходящей дозой для введения иммунотерапевтического средства индивиду,

или

(b) если побочный эффект обнаруживается после введения во всех различных дозах, вводимых по крайней мере с одним антитоксическим агентом, самая высокая доза, при которой побочный эффект является наименее тяжелым или иным образом считается приемлемым в свете тяжести заболевания, является подходящей дозой для введения иммунотерапевтического средства индивиду.

37. Способ по п. 35 или 36, при этом подходящая доза предназначается для введения вместе с по меньшей мере одним антитоксическим средством.

38. Применение по любому из пп. 1, 3, 6-19 или способ по любому из пп. 2-37, где индивидом является человек.