Способ определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии для определения циркулирующих опухолевых клеток у больных с целью определения чувствительности циркулирующих опухолевых клеток к химиотерапии и прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при раке молочной железы. Определяют экспрессию на ядросодержащих клетках общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 (ЕрСАМ) и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3 и маркера эритроцитов CD235a (гликофорина А), для этого образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берут, далее проводят обогащение популяции циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с помощью метода негативной селекции, к образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности с р равным 1.077 при соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца, далее образцы центрифугируют при 1200g в течение 20 минут, затем удаляют 2/3 верхней фракции и собирают содержимое кольца на границе раздела фаз градиент-плазма, далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, центрифугированием при 300g в течение 10 минут и дважды при 110g по 10 минут, супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера, далее образец делят на две части: неокрашенную контрольную пробу в объеме 50 мкл и окрашенную пробу в объеме 100 мкл, в обе пробы добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера PerFix-nc Buffer 1, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 минут при 18-25°С, затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера PerFix-nc Buffer 2, перемешивают на вортексе, в пробы немедленно добавляют антитела анти-CD45-АРС-Су7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD235а(гликофорин А)-РегСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток, инкубируют в темноте в течение 20-30 минут при 18-25°С, далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 минут, супернатант удаляют, затем к пробам добавляют по 100 мкл буфера, после чего весь полученный объем образца анализируют на проточном цитометре, одновременно детектируют сигналы флуоресцентных меток: AF488, РегСР-Су5.5, AF647, АРС-Су7 и рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле. Применение изобретения обеспечивает повышение информативности и чувствительности способа. 2 пр., 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии для определения циркулирующих опухолевых клеток у больных с целью определения чувствительности циркулирующих опухолевых клеток к химиотерапии и прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при раке молочной железы.

В настоящее время существуют трудности в наиболее точном определении циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) чувствительных к химиотерапии для прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при раке молочной железы. Известные методы определения ЦОК основаны на выявлении ЕрСАМ-позитивных клеток и не учитывают многообразную субпопуляцию ЕрСАМ-негативных циркулирующих опухолевых клеток в связи с чем не обладают достаточной специфичностью и не позволяют более точно идентифицировать пациентов, у которых действительно отсутствуют циркулирующие опухолевые клетки, что создаются трудности в персонифицированном подходе к лечению пациентов. Также, существует проблема доступности методов диагностики обусловленная необходимостью приобретения дополнительного дорогостоящего оборудования, что обуславливает выполнение исследований только на базе исследовательских и крупных лечебных учреждений.

Известно достаточно много методов выделения и исследования циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических больных.

В патенте US 8445225 В2 опубл. 21.05.2013 г. содержится информация о методе проведения анализа одной или нескольких циркулирующих опухолевых клеток, включая характеристику морфологии одной или нескольких циркулирующих опухолевых клеток посредством анализа изображений, при этом учитываются клетки только с мембранными эпителиальными маркерами.

В патентной заявке WO 2017060784 А1 опубл. 13.04.2017 г. описан способ детекции циркулирующих опухолевых клеток с помощью системы, включающей механизм изоляции клеток по их размеру в диапазоне 12-40 мкм и подсчет клеток на основе электрического импеданса, при этом не учитывается их фенотип и в анализ не попадают циркулирующие опухолевые клетки меньшего и большего размера.

В описаниях изобретений по патентным заявкам US 6365362 B1 опубл. 02.04.2002, US 6623982 В1 опубл. 23.09.2003 г., US 7282350 В2 опубл. 16.10.2007 г., US 5993665 А опубл. 30.11.1999 г., US 6790366 В2 опубл. 14.09.2004 г. и US 6645731 В2 опубл. 11.11.2003 г. указаны способы использования CellSearch® System. В патентах US 5985153 А опубл. 16.11.1999 г., US 6660159 В1 опубл. 09.12.2003 г., US 6890426 В2 опубл. 10.05.2005 г., US 6136182 А опубл. 24.10.2004 г. имеется описание устройства, которое можно использовать для реализации системы CellSearch. Система CellSearch Circulating Tumor Cell system (Veridex LLC) основана на использовании комбинации иммуномагнитной маркировки ЕрСАМ и автоматизированной цифровой микроскопии для идентификации и подсчета количества редких циркулирующих опухолевых клеток с фенотипом DAPI+CK+CD45- в образце крови. Это система наряду с другими методами используется для оценки прогноза онкологического заболевания и позволяет предсказать выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость у пациентов с метастатическим раком молочной железы, колоректальным раком и раком простаты.

Известные аналоги имеют ряд существенных недостатков. Так, принцип выявления циркулирующих опухолевых клеток с помощью существующих методов основан на обнаружении клеток, экспрессирующих только мембранный домен CD326 (ЕрСАМ). Однако, известно, что молекула ЕрСАМ состоит из мембранного (ЕрЕХ) и внутриклеточного (EpICD) доменов. При наличии активационных сигналов происходит расщепление молекулы с шеддингом ЕрЕХ домена и высвобождением в цитоплазму EpICD домена (The Emerging Role of ЕрСАМ in Cancer and Stem Cell Signaling [Text] / Munz M., Baeuerle P.A., Gires O. // Cancer Research, Vol. 69: (14), July 15, 2009). При этом не определяются циркулирующие опухолевые клетки с внутриклеточным доменом, потерявшие мембранный ЕрЕХ домен, а также клетки негативные по экспрессии CD326 (ЕрСАМ), но экспрессирующие другие эпителиальные маркеры, например, цитокератины. При использовании имеющихся способов высока вероятность ложноотрицательных случаев, когда циркулирующие опухолевые клетки представлены только клетками, не экспрессирующими мембранный CD326 (ЕрСАМ), а также ложноположительных результатов вследствие интерференции попадающими в образец для анализа эритроцитами.

Таким образом, известные способы обладают недостаточной точностью и информативностью вследствие ограниченного инструментария для детекции клеток.

Наиболее близким к предлагаемому, является выбранный в качестве прототипа, способ определения циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы (RU 2522923 С1, опубл. 20.07.2014 г.). Способ описывает определение циркулирующих раковых клеток, чувствительных к адъювантной гормональной терапии, в крови больных раком молочной железы и включает выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител с магнитными метками, получение лизатов циркулирующих опухолевых клеток, извлечение мРНК из лизатов циркулирующих опухолевых клеток, получение кДНК, получение амплифицированной ДНК, определение экспрессии маркерных генов, при этом в случае наличия одного из маркеров GA733-2, MUC-1, HER2 делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, и при обнаружении маркеров ESR1, PGR делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии.

Недостатком данного способа является использование в качестве маркеров, по которым обогащают популяцию циркулирующих опухолевых клеток с помощью магнитных частиц, GA733-2, MUC-1, HER2. Указанные молекулы не являются обязательными для ЦОК. Известно, что при люминальном А и трижды-негативном подтипах опухолевые клетки не экспрессируют Her2neu. Независимо от молекулярного типа среди гетерогенной популяции циркулирующих опухолевых клеток может присутствовать значимая доля клеток, не экспрессирующих MUC1. Еще одним недостатком метода является отсутствие среди маркеров для выявления ЦОК цитокератинов, которые конститутивно присутствуют в эпителиальных клетках. Кроме того, поскольку в способе не проводится исключения CD45+ клеток возможно искажение результатов за счет костномозговых предшественников, которые могут экспрессировать эпителиальные маркеры (Bone Marrow-Derived Cells Contribute to the Maintenance of Thymic Stroma including Thymic Epithelial Cells [Text] / Shami Chakrabarti, Mohammed Hoque, Nawshin Zara Jamil, Varan J Singh, Neelab Meer, Mark T. Pezzano. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.29.319426v1). Ограничение на чувствительность данного метода накладывает и сама методика детекции ЦОК, поскольку для получения кДНК для проведения ПЦР требуется более одной клетки.

Новый технический результат - повышение информативности и чувствительности способа, повышение доступности диагностики.

Для достижения нового технического результата в способе определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы, включающем выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител и последующую детекцию посредством определения экспрессии на них маркера эпителиальных клеток, определяют экспрессию общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 (ЕрСАМ) и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3 и маркера эритроцитов CD235a (гликофорина А), для этого образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берут, далее проводят обогащение популяции циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), для чего к образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности с р=1.077 при соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца, далее образцы центрифугируют при 1200g в течение 20 минут, затем удаляют 2/3 верхней фракции и собирают содержимое кольца на границе раздела фаз градиент-плазма, далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки центрифугированием при 300g в течение 10 минут и дважды при 110g по 10 минут, супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки и азида натрия, далее образец делят на две части: неокрашенную контрольную пробу в объеме 50 мкл и окрашенную пробу в объеме 100 мкл, в обе пробы добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 минут при 18-25°С, затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера, перемешивают на вортексе, в пробы немедленно добавляют антитела анти-CD45-APC-Cy7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD35а(гликофорин А)-PerСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток, инкубируют в темноте в течение 20-30 минут при 18-25°С, далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 минут, супернатант удаляют, затем к пробам добавляют по 100 мкл буфера, после чего проводят детекцию путем анализа всего полученного объема образца на проточном цитометре, имеющем не менее двух лазеров и позволяющем одновременно детектировать сигналы флуоресцентных меток: AF488, PerCP-Cy5.5, AF647, АРС-Су7 и рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле:

где А - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин - циркулирующих опухолевых клеток;

В - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;

С - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ-пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;

1,5 - коэффициент для учета деления анализируемого образца на 50 мкл (неокрашенный контроль) и 100 мкл (окрашенный образец);

8 - значение соответствует объему цельной крови, использованной для процедуры обогащения циркулирующих опухолевых клеток.

Способ осуществляют следующим образом. Образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берется для исключения попадания в образец клеток кожного эпителия. Для обогащения популяции ЦОК используют метод негативной селекции. К образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре 20 мин. Затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности (р=1.077) в соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца. Далее образцы центрифугируют при 1200g 20 мин без торможения. Затем удаляется 2/3 верхней фракции (тромбоцит-содержащей плазмы) и собирается кольцо на границе раздела фаз градиент-плазма. Далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, центрифугированием при 300g в течение 10 мин без торможения и дважды при 110g по 10 мин. Супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера для окрашивания (Cell Staining Buffer).

Для дальнейшего исследования образец делят на две части: 50 мкл - неокрашенный контроль, 100 мкл - окрашенная проба. В пробу и контроль добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера PerFix-nc Buffer 1, перемешивают на вортексе и инкубируют 15 мин при 18-25°С. Затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера PerFix-nc Buffer 2, перемешивают на вортексе, в пробу немедленно добавляют антитела анти-CD45-АРС-Су7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD235а(гликофорин А)-PerСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток. Инкубируют в темноте 20-30 мин при 18-25°С. Далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 мин. Супернатант удаляют, к окрашенной пробе и неокрашенному контролю добавляют по 100 мкл буфера для окрашивания (Cell Staining Buffer), весь полученный объем образца анализируют на проточном цитометре, оснащенном как минимум 2 лазерами, позволяющем одновременно детектировать сигналы следующих флуоресцентных меток: AF488, PerСР-Су5.5, AF647, АРС-Су7. Рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле:

где А - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин - циркулирующих опухолевых клеток;

В - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;

С - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ-пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;

1,5 - коэффициент для учета деления анализируемого образца на 50 мкл (неокрашенный контроль) и 100 мкл (окрашенный образец);

8 - значение соответствует объему цельной крови, использованной для процедуры обогащения циркулирующих опухолевых клеток.

Использование клона антител 9С4 позволяет выявлять циркулирующие опухолевые клетки, экспрессирующие как мембранный домен CD326 (ЕрСАМ) - ЕрЕХ, так и внутриклеточный домен EpICD.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная Ш., 57 лет с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Стадия заболевания IIВ. Состояние менструальной функции - менопауза. Степень злокачественности - II. Размер первичного опухолевого узла составляет 2 см. С целью определения ЦОК проведено исследование согласно предлагаемому способу. Образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирали утром натощак, первый мл крови в исследовании не использовали. Популяции ЦОК обогащали согласно приведенной выше методике. Полученный образец окрашивали коктейлем антител и анализировали с помощью метода проточной цитометрии (Фигура 1). Анализ показал отсутствие CD45-CD235a-EpCAM+panCK-, CD45-CD235a-EpCAM+panCK+, CD45-CD235a-EpCAM-panCK+ популяций ЦОК. Использование методов, основанных на определении только ЕрСАМ-позитивных ЦОК также не позволило обнаружить ЦОК у данной больной.

Пример 2. Больная Ж., 65 лет с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Стадия заболевания IIВ. Состояние менструальной функции -менопауза. Степень злокачественности - II. Размер первичного опухолевого узла составляет 2,5 см. С целью определения ЦОК проведено исследование согласно предлагаемому способу (Фигура 2). Подсчет количества циркулирующих опухолевых клеток в 1 мл цельной крови рассчитывали согласно формуле, указанной выше:

Таким образом, предлагаемый метод позволил детектировать 6,19 ЦОК в 1 мл цельной крови больной Ж. Использование имеющихся методов, основанных на определении только ЕрСАМ-позитивных ЦОК позволило обнаружить у данной больной только 0,83 ЦОК в 1 мл цельной крови.

Предлагаемый способ основан на анализе данных протоколов цитометрической оценки популяционного состава ЦОК образцов периферической крови больных раком молочной железы.

Изучались образцы крови от 58 пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Средний возраст больных составил 55,1±10,8 лет. Для выявления преимуществ предлагаемого метода наличие и количество ЦОК определяли двумя способами: основанным на методе CellSearch (по детекции только CD45 и EpCam), и предлагаемым спосорбом (по детекции CD45, EpCam и цитокератина).

Частота выявления ЦОК была сопоставима (табл. 1), в то время как предлагаемым способом выявлялось в 2,5 раза больше ЦОК (табл. 2). Используя метод Блэнда-Алтмана (Altaian DG, Bland JM. Measurement in medicine: the analysis of method comparison studies. Statistician. 1983; 32: 307-17. 10.2307/2987937), позволяющего сравнить результаты измерений, выполненных двумя методами, было показано, что методы плохо согласуются. Средняя разность между измерениями равна - 66,11 (ДИ95% от -269,9 до 137,7), что говорит об наличии систематического расхождения в измерениях (р<0,05). Был рассчитан коэффициент корреляции между значениями количества ЦОК, полученными двумя разными методами (R2=0.1999 (95%ДИ 0.6238-0,1898). Таким образом, измерения, полученные обоими способами, не сопоставимы и преимущество имеет новый предлагаемый метод, который демонстрирует в 2,5 раза более высокую эффективность обнаружения ЦОК. Повышение специфичности и чувствительности анализа достигается за счет исключения из анализа эритроцитов, обломков клеток и CD45-позитивных клеток. Циркулирующие опухолевые клетки, определенные предлагаемым способом, являются наиболее репрезентативным объектом для протеомных и генетических исследований.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет обнаружить, с чувствительностью 1 клетка, циркулирующие опухолевые клетки и обеспечивает значительное увеличение вероятности обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, повышает точность измерений и чувствительность методов анализа, а также эффективность диагностики при работе с больными раком молочной железы для оценки прогноза и эффективности терапии.

Приложение

Фигура 1. Результат цитометрического исследования образца цельной крови больной Ш. после проведения обогащения популяций ЦОК

Фигура 2. Результат цитометрического исследования образца цельной крови больной Ж.

Таблица 1 - Частота обнаружения ЦОК при применении двух тактик гейтирования у больных РМЖ

Таблица 2 - Количество ЦОК при применении двух тактик гейтирования у больных РМЖ

Способ определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы, включающий выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител и последующую детекцию посредством определения экспрессии на них маркера эпителиальных клеток, отличающийся тем, что определяют экспрессию общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 (ЕрСАМ) и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3 и маркера эритроцитов CD235a (гликофорина А), для этого образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берут, далее проводят обогащение популяции циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), для этого к образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности с р=1.077 при соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца, далее образцы центрифугируют при 1200g в течение 20 минут, затем удаляют 2/3 верхней фракции и собирают содержимое кольца на границе раздела фаз градиент-плазма, далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, центрифугированием при 300g в течение 10 минут и дважды при 110g по 10 минут, супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки и азида натрия, далее образец делят на две части: неокрашенную контрольную пробу в объеме 50 мкл и окрашенную пробу в объеме 100 мкл, в обе пробы добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 минут при 18-25°С, затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера, перемешивают на вортексе, в пробы немедленно добавляют антитела анти-CD45-APC-Cy7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD235а(гликофорин А)-РегСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток, инкубируют в темноте в течение 20-30 минут при 18-25°С, далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 минут, супернатант удаляют, затем к пробам добавляют по 100 мкл буфера, после чего проводят детекцию путем анализа всего полученного объема образца на проточном цитометре, имеющем не менее двух лазеров и позволяющем одновременно детектировать сигналы флуоресцентных меток: AF488, PerCP-Cy5.5, AF647, АРС-Су7, и рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле:

где А - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин-циркулирующих опухолевых клеток;

В - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;

С - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ-пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;

1,5 - коэффициент для учета деления анализируемого образца на 50 мкл (неокрашенный контроль) и 100 мкл (окрашенный образец);

8 - значение соответствует объему цельной крови, использованной для процедуры обогащения циркулирующих опухолевых клеток.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для диагностики рака печени. Предложен способ диагностики рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции аутоантитела, иммунологически специфического для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для диагностики рака печени. Предложен способ диагностики рака печени у субъекта-млекопитающего посредством детекции аутоантитела, иммунологически специфического для маркерного белка опухоли, выбранного из группы, состоящей из MMP9, AIF1, EpCAM и CDKN1B, в тестируемом образце, содержащем физиологическую жидкость от субъекта-млекопитающего.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения стадии меланомы. Способ определения стадии меланомы по изменению профиля экспрессии микроРНК в экзосомах включает забор венозной крови в пробирку с антикоагулянтом, центрифугирование, отбор плазмы и приготовление нескольких аликвот с последующим замораживанием, выделением экзосом методом ультрацентрифугирования и выделением экзосомальных микроРНК, постановка реакции ПЦР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроРНК-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, MHKpoPHK-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а, при определенных условиях, далее проводят расчет коэффициента, диагностирующего развитие меланомы (R) по эмпирической формуле и при значении R: в диапазоне от 0 до 0,99 – здоровые пациенты, в диапазоне от 1 до 1,99 - 1-2 стадия меланомы, выше 2 - 3-4 стадия меланомы.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для диагностики ДВС-синдрома у больных гемобластозами с сопутствующей тромбоцитопенией. Для диагностики явного ДВС-синдрома, кроме наличия 5 и более баллов по шкале DIC (ISTH), оценивается уровень синдекана-1 в сыворотке крови, повышение которого более 5,5 нг/мл подтверждает диагноз и требует назначения патогенетической терапии.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антитело или его функциональный фрагмент, которое специфически связывается с ECL-2 клаудина 3, а также его применения для получения агента для детекции клаудина 3, а также для предупреждения и лечения рака и для получения средства для диагностики, визуализации, лечения рака и для доставки лекарственного средства, специфичного к раковым клеткам, где рак представляет собой рак, экспрессирующий клаудин 3, полинуклеотиды, вектора экспрессии, клетки, способ получения антитела или его функционального фрагмента, способы специфической детекции клаудина 3, композиция для детекции клаудина 3, конъюгат антитело-лекарственное средство и его применение для получения средства для предотвращения и лечения рака, композиция для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, композиция для предотвращения и лечения рака, содержащая антитело или его функциональный фрагмент, белок CAR, способы диагностики и визуализации рака, способы предупреждения и лечения рака, способ специфичной доставки лекарственного средства в раковые клетки.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии и онкологии. Для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) после лимфаденэктомии проводят иммуногистохимический анализ на срезах лимоузлов с антителами к pSTAT3 и pAKT1.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии. Предложен малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии. Предложен малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогноза эффективности иммунотерапии меланомы ниволумабом. Производят забор опухолевой ткани пациента методом кор-биопсии.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и клинической биохимии, и может быть использовано для уточняющей лабораторной диагностики почечно-клеточного рака (ПКР) для случаев наличия дополнительной ткани в почке по результатам лучевых методов диагностики. Осуществляют определение KIM-1 следующим образом: в средней порции утренней мочи обследуемых определяют соотношение KIM-1 и креатинина.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и касается способа прогнозирования в остром периоде ишемического инсульта неблагоприятного исхода. Способ прогноза неблагоприятного исхода у пациентов с ишемическим инсультом включает оценку тяжести инсульта у пациента по шкале NIHSS, взятие периферической крови у пациента в острый период инсульта, выделение из периферической крови мононуклеарных клеток, мечение мононуклеарных клеток моноклональными антителами к поверхностным антигенам, присутствующим на моноцитарных миелоидных супрессорных клетках, причем взятие периферической крови у пациента проводят в первые 24-48 часов после инсульта, определяют процентное содержание моноцитарных миелоидных супрессорных клеток среди мононуклеарных клеток, рассчитывают показатель прогностической модели неблагоприятного исхода ишемического инсульта по формуле:Y=е(-3.42+0.23×Х1-0.16×Х2)/(1+е-3.42+0.23×Х1-0.16×Х2)где Y - показатель прогностической модели неблагоприятного исхода ишемического инсульта, Х1 - тяжесть инсульта у пациента по шкале NIHSS в первые 24-48 часов, Х2 - процентное содержание моноцитарных миелоидных супрессорных клеток в периферической крови в первые 24-48 часов у пациента, и при значении Y≥0,24 прогнозируют неблагоприятный исход ишемического инсульта.
Наверх