Аутологичная композиция и способ лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии

Группа изобретений относится к фтизиатрии, а именно к аутологичной композиции для лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии и способу лечения. Аутологичная композиция для лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии содержит смесь выделенных из моноцитов периферической крови больного зрелых дендритных клеток и Т-лимфоцитов, активированных специфическими антигенами ESAT-6 и SFP-10, при определенном соотношении. Способ лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии включает введение больному аутологичную композицию в дозе 1 мл десятикратно один раз в неделю внутрикожно в подлопаточную область на фоне противотуберкулезной терапии. Использование аутологичной композиции в способе лечения позволяет получить положительный эффект с прекращением бактериовыделения и положительной рентгенологической динамикой, и дальнейшим прекращением лечения. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано в комплексном лечении больных туберкулезом с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта терапии противотуберкулезными препаратами

Туберкулез (ТБ) остается сложной медико-экономической и медико-биологической проблемой во всех странах мира, в том числе и в России (Global report WHO, 2019). Согласно документам ВОЗ, ТБ - одно из десяти заболеваний с высоким уровнем смертности. По оценкам ВОЗ, в 2018 году во всем мире было выявлено полмиллиона новых случаев резистентности к рифампицину, из которых 78% - с множественной лекарственной устойчивостью микобактерий (МЛУ-ТБ) (WHO consolidated guidelines on drug-resistant tuberculosis treatment. 2019. 99р.). Высокий процент глобального бремени туберкулеза с МЛУ-ТБ приходится на Индию (27%), Китай (14%), Российскую Федерацию (9%), а также на страны бывшего СССР (>50% ранее леченных случаев туберкулеза) (Global report WHO, 2019). За последние годы в Российской Федерации, заболеваемость туберкулезом со множественной лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ-ТБ) остается стабильной с 2015 года и существенно не изменилась к 2019 году (5,2 и 5,4 на 100 тыс. населения соответственно), несмотря на некоторое снижение распространенности (2015 - 25,5 против 2019 - 21,4). При этом в 56,5% случаев у больных сохраняется бактериовыделение, что связано с низкой эффективностью лечения. Применение новых противотуберкулезных препаратов привело к некоторому повышению эффективности лечения больных с МЛУ-ТБ с 2015 года (24,5%) и составила в 2019 году 35,7%, однако по данным ВОЗ необходимо достигнуть показателя 78% (Нечаева О.Б. Эпидемическая ситуация и ресурсы по туберкулезу (справки) за 2018 год [Электронный ресурс]). Низкая эффективность лечения связана с распространенностью туберкулеза с широкой и тотальной лекарственной устойчивостью, развитием большого числа нежелательных явлений на фоне терапии туберкулеза, которые требуют отмены препаратов.

Остается актуальным поиск альтернативных методов лечения больных туберкулезом. Специфическая инфекция практически всегда сопровождается изменениями иммунной системы организма, что рассматривается как вторичная иммунная недостаточность, а динамика туберкулезного процесса коррелирует с выраженностью тех или иных иммунологических сдвигов (Б.Е. Кноринг, 2013; Новицкий В.В., 2012). Проведение иммунотерапии может повысить эффективность лечения больных туберкулезом с лекарственной устойчивостью возбудителя. В России для лечения туберкулеза проводились разработки аутологичных вакцин, созданных на основе антиген-активированных дендритных клеток (патент RU 2372 936 Способ создания аутологичной вакцины для лечения туберкулеза (2009); WO/2014/007667 Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения (2014). Наряду с трудоемкими методиками получения клеток и дальнейшего их выращивания, для активации дендритных клеток применялся туберкулин. В настоящее время проведение многочисленных исследований (Киселев В.А., 2009, 2010; Слогоцкая Л.В., 2011; Довгалюк И.Ф., 2013) показали, что туберкулин обладает низкой специфичностью и чувствительностью по сравнению с применением аллергена туберкулезного рекомбинантного с наличием специфических антигенов ESAT-6 и SFP-10. Применение туберкулина может влиять не только на иммуногенность вакцины, представляя собой смесь фильтратов убитых нагреванием культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, осажденных трихлоруксусной кислотой, обработанных этиловым спиртом и эфиром для наркоза, растворенных в фосфатно-буферном растворе с твином-80 в качестве стабилизатора и фенолом в качестве консерванта, но и на развитие побочных реакций после ее введения.

Известно исследование по созданию вакцины на основе дендритных клеток и использованию ее в лечении больных большей частью с впервые выявленным туберкулезом с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (Гончаров А.Е., Титов Л.П., Скрягин А.Е., Шпаковская Н.С., Солодовникова В.В., Романова И.В., Антонова Н.П., Коваленко Д.Г., Метелица Л.П., Ветушко Д.А., Скрягина Е.М. Адьювантная терапия туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью вакциной на основе дендритных клеток // Медицинские новости. - 2014. - №12. - С. 67-72). Дендридные клетки выделяли из моноклональных клеток крови и костного мозга центрифугированием, адгезией и культивированием в питательной среде. Выделение гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из мононуклеарных клеток костного мозга осуществляли с использованием наборов для прямой иммуномагнитной сепарации. С целью экспансии ГСК растили на среде AIM-V с интерликином 4 (1L-4) и фактором некроза опухоли . Полученную биомассу клеток порционно замораживали в среде для криоконсервации. Для праймирования ДК культивировали в течение 6 часов в питательной среде с 100 мкг/мл короткоцепочечного пептида протеина CFP-1076-85. Далее ДК отмывали двукратно от пептида и культивировали при температуре 37 градусов С в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ в течение двух суток в среде, содержащей ГМ-КСФ в качестве индуктора созревания. Культуры ДК были суспендированы в 0,9% растворе хлорида натрия, после чего взвесь клеток вводилась внутрикожно в область медиальной поверхности предплечья 0,1 мл на расстоянии не менее 3 см от каждого введения. Всего взвесь вводилась трехкратно с интервалом от 2 до 4-х недель.

Используемая вакцина характеризуется невысокой специфичностью в связи с применением только одного специфичного для туберкулезной инфекции антигена (протеина CFP-1076-85), травматичностью для пациентов процедуры получения клеток костного мозга, длительностью и сложностью приготовления вакцины.

Задачей заявляемого способа является разработка эффективной аутологичной композиции на основе активированных специфическими туберкулезными антигенами зрелых дендритных клеток и ее использование в лечении больных туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии.

Задача реализуется за счет того, что созданная композиция состоит из зрелых дендритных клеток, дифференцированных из моноцитов периферической крови и активированных специфическими туберкулезными пептидами ESAT-6 и SFP-103 и Т-лимфоцитов, активированных специфическими пептидами ESAT-6 и SFP-10, и что клеточную композицию вводят на фоне комплексного лечения больному туберкулезом с ЛУ десятикратно один раз в неделю внутрикожно в подлопаточную область в объеме 1 мл.

Изобретение поясняется чертежом, где на Фиг. 1 - Динамика снижения специфических иммуноглобулинов после проведения иммунотерапии, на Фиг. 2 - Динамика рентгенологического обследования у пациента с фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, а - представлена рентгенограмма до проведения иммунотерапии; б - рентгенограмма через 120 дней после иммунотерапии.

Способ реализуется следующим образом.

I этап.

Пациентам с сохраняющимся бактериовыделением и/или прогрессированием специфического процесса по данным рентгенологического обследования проводится забор 60 мл периферической крови в вакутейнеры с цитратом. Кровь обрабатывается в течение 36 часов после забора и выделяются мононуклеары, которые культивируют при 37°C в среде RPMI1640 с добавлением 10% человеческой сыворотки, полученной от доноров с IV группой крови.

Из периферийной крови выделяют моноциты, для получения дендритных клеток, и лимфоциты, для создания суспендированной композиции для иммунотерапии, путем центрифугирования на ступенчатом градиенте фикол-урографина (плотность раствора 1,077 г на мл) с последующим прикреплением моноцитов к поверхности культуральных флаконов. Обычно, в зависимости от пациента, получается 0,5-1×10⁷ моноцитов.

Для индукции образования дендритных клеток во флаконы с питательной средой, в которой культивируются полученные моноциты, добавляют ростовые факторы: 1) гранулоцит-макрофаг колоний-стимулирующий фактор (GM-CSF) в концентрации 3000 ед/мл и интерлейкин 15 (IL15).

На 4-5 день в среду к полученным дендритным клеткам добавляют (в конечной концентрации 3 микрограмма на мл) специфические пептиды ESAT-6 и SFP-10.

Принудительное введение в клетки антигенов ESAT-6 и SFP-10 осуществляют с помощью прибора для электропорации фирмы "Eppendorf или другой аналогичной техники. Для реализации электропорации в стандартную кювету, имеющую расстояние между плоскими электродами 0,5 см наливают 0,4 мл суспензии клеток в физиологическом растворе с добавлением белка NS3 (10 микрограмм в мл). Электропорация осуществляется при напряжении 300 вольт и времени импульса 250 микросекунд.

Для индукции полного созревания дендритных клеток после введения специфических пептидов ESAT-6 и SFP-10 их культивируют в течение 1 суток в питательной среде с добавлением смеси цитокинов TNFa и IL1b по 500 Ед/мл каждого.

Подтверждением получения истинных дендритных клеток служат следующие критерии (определяемые с помощью флуоресцентного микроскопа или техники проточной цитометрии):

а) рост в неприкрепленном к субстрату состоянии (в отличие от макрофагов, которые плотно прикрепляются к субстрату);

б) наличие характерной морфологии дендритных клеток, несущих множественные отростки;

в) появление значительного количества поверхностных маркеров свойственных дендритным клеткам (HLA-DR, HLA-ABC, CD80, CD83).

Одновременно с подготовкой дендритных клеток из взятой порции крови получают активированные Т-лимфоциты, для чего из 20 мл крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности по стандартной методике (Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. - М.: Медицина, 2000. - 432 с.) выделяют мононуклеарные лейкоциты и с помощью фитогемагглютинина (20 микрограмм/мл) активируют к пролиферации содержащиеся в этой клеточной смеси Т-лимфоциты в соответствии с известной процедурой.

Активирование Т-лимфоцитов осуществляют путем их обработки фитогемагглютинином и добавлением специфических антигенов (ESAT-6 и SFP-10) в концентрации 1 мкг на мл. Для преимущественной стимуляции Th1-клеточного пути иммунного ответа к клеткам добавляется бактериальный липополисахарид (0,2 мкг на мл). Полученные активированные лимфоциты (3-5×10⁷ клеток) и дендритные клетки (0,5-1×10⁷ клеток), несущие специфические антигены (ESAT-6 и SFP-10) смешиваются для получения композиции для инъекций.

II этап.

Полученная композиция на основе аутологичных активированных специфическими туберкулезными пептидами зрелых дендритных клеток вводится больному путем внутрикожного введения в подлопаточную область в объеме 1 мл десятикратно один раз в неделю больному туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью возбудителя на фоне стандартной противотуберкулезной терапии с включением комбинаций из шести-восьми препаратов, которые применяются в лечении туберкулеза легких с широкой лекарственной устойчивостью микобактерий: инъекционные аминогликозиды канамицин (Km) и амикацин (Am) и полипептид (капреомицин - Cm), фторхинолоны III поколения - левофлоксацин (Lfx), спарфлоксацин (Sfx), IV поколения - моксифлоксацин (Mfx)), протионамид (Pto), этионамид (Eto), циклосерин (С8)/теризидон (Trd), аминосалициловая кислота (PAS), линезолид (Lzd), амоксициллин(а-убрать) + клавулановая кислота (Amx/Clv), кларитромицин (С1)/азитромицин (Az), имипенем (Imp)/циластатин (On), меропенем (Мрт). Препараты назначаются согласно переносимости пациентами и их массе тела

После каждого введения осуществляется контроль состояния больного с проведением:

1) определения частоты сердечных сокращений (ЧСС);

2) определения частоты дыхания (ЧД);

3) термометрии;

4) клинического анализа крови (КАК);

5) биохимического анализа крови (БАК);

6) общего анализа мочи (ОАМ).

III этап.

После проведения десятикратного курса иммунотерапии проводится оценка результатов лечения в динамике на 30-е, 60-е, 120-е и 240-е сутки.

Проводится оценка:

- выраженности симптомов интоксикации и респираторной симптоматики;

- динамика бактериовыделения с помощью: микроскопического исследования мокроты для выявления КУМ методом люминесцентной микроскопии; культурального исследования мокроты (посев материала на плотные и жидкие питательные среды в системе BACTECMGIT 960);

- рентгенологическая динамика с помощью рентгенографии и СКТ грудной клетки.

Положительный результат лечения характеризуется прекращением бактериовыделения и/или получением положительной рентгенологической динамике в виде рассасывания очаговых и/или инфильтративных изменений, а также сокращением полостей распада легочной ткани.

Исследование по созданию аутологичной композиции на основе активированных специфическими туберкулезными пептидами ESAT-6 и SFP-10 зрелых дендритных клеток и лечения на фоне комплексной терапии больных туберкулезом легких с ЛУ возбудителя и отсутствием эффекта одобрено ЛЭК ФГБУ «СПб НИИФ» МЗ РФ, выписка из Протокола №27.5 (исходящий №58 от 19.02.16).

Проводилось обследование, забор биологического материала и лечение 25 пациентов (19 мужчин (76,0%) и 6 женщин (24,0%) на базе отделения терапии туберкулеза легких и хирургии туберкулеза ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России, отделения для лечения больных туберкулезом с множественной и широкой лекарственной устойчивостью СПб ГБУЗ «Городская туберкулезная больница №2» и отделения терапии туберкулеза с лекарственной устойчивостью СПб ГБУЗ «Пушкинский противотуберкулезный диспансер» с мая 2016 года по февраль 2018 года.

Средний возраст больных составил 38,3±10,5 года, средний срок предшествующей непрерывной противотуберкулезной химиотерапии составил 16,2±6,8 лет. На фоне лечения противотуберкулезными препаратами у пациентов сохранялось бактериовыделение и отрицательная рентгенологическая динамика. В 18,6% случаев было проведено хирургическое лечение.

Все больные имели распространенный двухсторонний деструктивный туберкулез легких без возможности проведения радикального хирургического лечения. В 88,0% (22) случаев имел место фиброзно-кавернозный туберкулез легких, в 8,0%) (2) - диссеминированный туберкулез легких, у одного пациента - цирротический туберкулез легких. У 2 больных (4,4%) отмечалась тотальная лекарственная устойчивость возбудителя.

В исследование не включались больные с отсутствием бактериовыделения, туберкулемой (-ми) легких, очаговым туберкулезом легких, злокачественными процессами, ВИЧ-инфекцией, генерализованными формами туберкулеза, микобактериозом органов дыхания, онкологическими заболеваниями, с обострением хронических заболеваний, пациенты, получающие лучевую, цитостатическую, длительную системную глюкокортикостероидную терапию.

Пациентам проводилась иммунотерапия с введением аутологичной композиции с активированными специфическими пептидами ESAT-6 и SFP-10 дендритными клетками на фоне противотуберкулезной терапии.

Все пациенты получали противотуберкулезную терапию с учетом данных о чувствительности возбудителя по результатам бактериологического исследования и включением комбинаций из шести-восьми препаратов второго и третьего ряда согласно существующим рекомендациям (инъекционные аминогликозиды канамицин (Km) и амикацин (Am) и полипептид (капреомицин - Cm), фторхинолоны III поколения - левофлоксацин (Lfx), спарфлоксацин (Sfx), IV поколения - моксифлоксацин (Mfx)), протионамид (Pto), этионамид (Eto), циклосерин (Cs)/теризидон (Trd), аминосалициловая кислота (PAS), линезолид (Lzd), амоксициллин(а-убрать) + клавулановая кислота (Amx/Clv), кларитромицин (Cl)/азитромицин (Az), имипенем (Imp)/циластатин (On), меропенем (Mpm). Препараты назначаются согласно переносимости пациентами и их массе тела.

Оценка эффективности лечения проводилась в динамике на 30-е, 60-е, 120-е и 240-е сутки по выраженности симптомов интоксикации и респираторной симптоматики; прекращению бактериовыделения с помощью: микроскопического исследования мокроты для выявления КУМ методом люминесцентной микроскопии; культурального исследования мокроты (посев материала на плотные и жидкие питательные среды в системе BACTECMGIT 960) и рентгенологической динамике с помощью рентгенографии и компьютерной томографии органов грудной клетки.

На этапе подписания информированного согласия пять пациентов отказались от проведения иммунотерапии или имели критерии невключения.

Пациентам проводился забор 60 мл периферической крови в вакутейнеры с цитратом и ее обработка не позднее 36 часов после забора. Полученные дендритные клетки и Т-лимфоциты активировались специфическими пептидами ESAT-6 и SFP-10, далее после получения суспендированной аутологичной композиции на основе зрелых дендритных клеток в лабораторных условиях проводилось ее введение внутрикожно в дозе 1 мл еженедельно десятикратно.

В динамике после курса терапии у больных определялись изотипы активированных специфическими пептидами ESAT-6/SFP-10 иммуноглобулинов (ИК (иммунные комплексы), IgG1, IgG3, IgE, IgG1+IgG3) методом динамического светорассеяния, вклад которых должен снижаться на фоне терапии, что в свою очередь говорит о снижении активности туберкулезной инфекции (Патент RU 2707571 Способ прогнозирования развития туберкулеза у здоровых лиц / Старшинова А.А., Зинченко Ю.С., Истомина Е.В., Филатов М.В., Денисова Н.В., Павлова М.В., Сапожникова Н.В., Яблонский П.К., Бурдаков B.C., Чурилов Л.П.). Измерения проводятся на лазерном корреляционном спектрометре (сертификат RU. С.39.003. А №5381) ЛКС-03 (ИНТОКС-МЕД, Россия).

В 70,0% случаев (n=14) не отмечено побочных реакций на введение композиции. У одного больного (7,2%) отмечалась общая побочная реакция в виде тремора, озноба на первое введение. У 5 (38,7%) - на 8 и 9 введение отмечалась кожная реакция в местах введения в виде папулы, с регрессией к 4-8 неделе.

Отдаленные результаты лечения были проанализированы у четырнадцати больных после 240 дней терапии и через год после проведения курса иммунотерапии.

По результатам комплексного обследования симптомы интоксикации снизились через 60 дней в 65,0% (13/20) случаев и к 120 дням отмечались только в 15,0% (3/20) случаев, которые далее диагностировались к 240 дням после иммунотерапии.

Прекращение бактериовыделения отмечалось через 60 дней в 25,0% (5 из 20) случаев, через 120 дней после иммунотерапии в 30,0% (6 из 20) случаев. К 240 дню после терапии и через год после проведенного лечения положительная динамика сохранялась в 66,7% (10 из 14) случаев.

По данным рентгенологического обследования имела место рентгенологическая динамика в виде рассасывания очаговых и инфильтративных изменений в легких в 20,0% (4 из 20) через 60 дней, через 120 дней - в 30% (6 из 20) и к 240 дням - в 42,8%) (6 из 14) данная динамика сохранялась, что значимо с учетом отсутствия положительного результата на фоне противотуберкулезных препаратов.

По отдаленным результатам лечения через 12 месяцев после проведения иммунотерапии в 42,8% (6 из 14) терапия была прекращена с учетом отсутствия бактериовыделения и положительной динамики по данным рентгенологического обследования. Три пациента скончались из-за прогрессирования туберкулезного процесса (20,0%) и один больной скончался в связи с развитием сердечной недостаточности. Два пациента прекратили прием терапии самостоятельно и у двоих (15,3%) отмечалось прогрессирование туберкулезного процесса.

Результаты иммунологического исследования изотипов

иммуноглобулинов, активированных специфическими пептидами, показывают снижение уровня иммуноглобулинов после проведения иммунотерапии (Фиг. 1).

Согласно полученным данным, благодаря проведению иммунотерапии удалось в 42,8% случаев получить высокую эффективность лечения у больных туберкулезом легких, у которых на фоне проведения полихимиотерапии положительной динамики не отмечалось.

Клинический пример №1.

Пациент С.А.В. (58 л.) поступил в стационар с диагнозом «Фиброзно-кавернозный туберкулез легких с бактериовыделением (МБТ (+) и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя (ШЛУ МБТ) (S, Н, R, Е, Z, Pt, Am, Km, Cap, Cs, Ofx)». Сопутствующие заболевания: папилломатоз желчного пузыря, гипертоническая болезнь (II ст.), двухсторонняя сенсоневральная тугоухость, поверхностный гастрит, хронический простатит, энцефалопатия II ст., смешанного генеза, хронический холецистит (ремиссия).

Анамнез болезни: туберкулезом легких болеет с 2008 года, изначально деструктивный туберкулез легких, МБТ (+), лечение в стационаре с положительной динамикой в течение 7 месяцев, был выписан, а в 2013 году снят с учета. Рецидив в 2015 году, двухсторонний деструктивный туберкулез легких. МБТ (+), впервые установлена МЛУ МБТ, в стационаре больному была выполнена клапанная бронхоблокация, там же больной лечился с 21.07.2015 по 26.04.2016 по 4 режиму с отрицательной динамикой, хирургическое лечение показано не было с учетом распространенности процесса и выраженной сердечно-сосудистой патологией, расширен спектр лекарственной устойчивости до ШЛУ МБТ (данные об устойчивости так же к капреомицину) 26.04.2016 был переведен для продолжения лечения в противотуберкулезный диспансер. Инвалид 2 группы. Проведенное обследование: микобактерии туберкулеза определены как методом бактериоскопии так и посевом, при рентгеновском исследовании были выявлены двухсторонние каверны в легких на фоне инфильтративно-очаговых изменений с обеих сторон.

Проведен курс иммунотерапии суспендированной композицией на основе дендритных клеток (10 введений еженедельно, на фоне противотуберкулезной терапии).

Через 60 дней после проведения иммунотерапии у пациента отмечалась прибавка в весе 3 кг, симптомы интоксикации не определялись. Получен первый отрицательный результат по данным микроскопии. Далее через 120 дней получены отрицательные результаты посевов по данным бактериологического обследования. Полученная динамика сохранялась далее к 240 дням терапии и далее через год после иммунотерапии.

На контрольных рентгенограммах 30-е, 60-е, 120-е и 240-е сутки отмечалась умеренная положительная динамика процесса с уменьшением инфильтративных и очаговых изменений и полостей распада (Фиг. 2). Вклад изотипов специфических иммуноглобулинов (IgG1, IgG3, IgE, IgG1+IgG3) снизился через 120 дней в два раза.

Пациент выписан из стационара с рекомендацией дальнейшего наблюдения в условиях диспансера по месту жительства. Через год после окончания проведения иммунотерапии получение положительной динамики и стабилизация процесса позволили завершить курс лечения и назначить противорецидивное лечение.

1. Аутологичная композиция для лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии, отличающаяся тем, что она содержит смесь выделенных из моноцитов периферической крови больного зрелых дендритных клеток в количестве 0,5-1×10⁷ и Т-лимфоцитов в количестве 3-5×10⁷, активированных специфическими антигенами ESAT-6 и SFP-10.

2. Способ лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии, отличающийся тем, что больному вводят аутологичную композицию по п. 1 в дозе 1 мл десятикратно один раз в неделю внутрикожно в подлопаточную область на фоне противотуберкулезной терапии.