Тест-система для выявления sars-cov-2 линии омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
Владельцы патента RU 2772362:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для выявления SARS-CoV линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Указанная тест-система включает олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямой праймер Ins214EPESARS-CoV-2 –
обратный праймер Ins214EPESARS-CoV-2 –
флоуресцентный зонд Ins214EPESARS-CoV-2
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного и точного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности, к диагностике инфекционных заболеваний, а именно к тест-системе для выявления SARS-CoV-2линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
26 ноября 2021 Всемирная организация здравоохранения обозначила новую линию вируса SARS-CoV-2 – Омикрон (Классификация варианта «омикрон» (B.1.1.529) как варианта вируса SARS-CoV-2, вызывающего обеспокоенность. Сайт Всемирной организации здравоохранения, URL: https://www.who.int/ru/news/item/26-11-2021-classification-of-omicron-(b.1.1.529)-sars-cov-2-variant-of-concern, дата обращения – 28.12.2021 г.). Данный вариант нового коронавируса имеет большое количество мутаций, что объясняет повышенное внимание и беспокойство в отношении новой линии. По уже полученным данным отличиями новой линии Омикрон можно назвать высокий риск повторного заражения и относительно низкую эффективность существующих вакцин. Обеспечение возможности высокопроизводительного скрининга SARS-CoV-2 линии Омикрон является крайне важной и актуальной задачей, стоящей перед разработчиками тест-систем на сегодняшний день.
Известна тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 (Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: патент RU2756474, Российская Федерация, заявка RU2021114811, заявл. 24.05.2021, опубл. 30.09.2021), включающая ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена N вируса SARS-CoV-2: прямой GGACCCCAAAATCAGCGAAA, обратный CTGGTTACTGCCAGTTGAATC, флуоресцентный зонд ROXCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC. Причем осуществляют реакцию ПЦР в режиме реального времени, состоящую из следующих этапов: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 с, 55°С - 15 с; 72°С - 20 с - 40 циклов, образец считается положительным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию, при этом, если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SAPvS-CoV-2 считается отрицательным.
Также известен набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени (Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени: патент RU2744198, Российская Федерация, заявка RU2020118246, заявл. 25.05.2020, опубл. 03.03.2021), включающий в себя олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие фрагмент гена РНК зависимой РНК полимеразы, и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:
CoV2-f | tca caa ttc aga agt agg acc tg; |
CoV2-r | agc ctc caa agg caa tag tgc |
CoV2-pr | R6G - tct tgc cga ata cca taa tga atc caa – BHQ1 |
Наиболее близким к заявляемому изобретению является тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A и Influenza virus B (Тест-системадлявыявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: патент RU2761481, РоссийскаяФедерация, заявка 2021126293, заявл. 07.09.2021, опубл. 08.12.2021), включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды со следующей структурой: прямой праймер вируса гриппа В ATTCTTCAATgAAgAAggAAC; обратный праймер вируса гриппа В CTCCCAACACggTAgATA; флуоресцентный зонд вируса гриппа В (R6G)-TCCCATCATCATyCCAgg-(BHQ-1); прямой праймер вируса гриппа А CACCAAAyCATgArggAATA; обратный праймер вируса гриппа А gCTCATgTTgATTCCCAC; флуоресцентный зонд вируса гриппа А (ROX)-TgCAggTCCTrTAgAATCTrTCCACTC-(BHQ-2); прямой праймер SARS-CoV-2 AgAgCTATgAATTgCAgAC; обратный праймер SARS-CoV-2 gggAAATACAAAATTTggACA; флуоресцентный зонд SARS-CoV-2 (FAM)-AATTggCAAAgAAATTTgACACCTTCA-(BHQ-1).
На сегодняшний день неизвестны тест-системы, пригодные для эффективного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон.
Технической проблемой является необходимость разработки эффективной и точной тест-системы для выявления SARS-CoV-2 Линии Омикрон – Ins214EPE.
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного и точного выявления SARS-CoV-2 Линии Омикрон.
Технический результат достигается тем, что тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямой праймер Ins214EPESARS-CoV-2 – ATATTCTAAGCACACGCCTATT (SEQNO:1);
обратный праймер Ins214EPESARS-CoV-2 – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA (SEQNO:2);
флоуресцентный зонд Ins214EPESARS-CoV-2 –
ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ-2 (SEQ NO:3).
Для решения задачи детекции варианта Омикрон были обработаны геномы всех вариантов SARS-CoV-2 в базе данных GISAID (https://www.gisaid.org) с целью поиска уникальных инделов, которые бы встречались бы в большинстве геномов варианта Омикрон и не встречались бы никогда у других вариантов SARS-CoV-2. Заявляемая тест-система была получена путем конструирования диагностических праймеров и зонда для детекции линии Омикрон SARS-CoV-2 с помощью подбора флюоресцентно-меченного гидролизующегося зонда высокоспецифичного к уникальной последовательности инсерции Ins214EPE. Данная инсерция не встречается более ни у одного варианта SARS-CoV-2, но присутствует в большинстве геномов линии B.1.1.529 BA.1.
Для оптимизации работы тест-системы была проведена серия экспериментов по подбору рабочей концентрации праймеров и поставлен эксперимент с градиентом температуры отжига праймеров для подбора оптимального значения в условиях мультиплексной реакции. По результатам экспериментов оптимальная концентрация праймеров и зондов составила 400 нМ, оптимальная температура отжига 61°С.
Анализ результатов был произведён с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную сигмовидную форму и пересекала пороговую линию.
Заявляемое изобретение поясняется примером
Проверка эффективности тест-системы.
Тест был валидирован на РНК варианта Omicron, любезно предоставленной Лабораторией изменчивости патогенных микроорганизмов (д-р Владимир Гущин, Институт Гамалеи, Москва, Россия), и РНК из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева.
Таблица 1 – образцы вируса, используемые при валидации теста
№ п/п | Наименование вируса | Номер в глобальном европейском вирусном архиве (GISAIDIsolateID) |
1 | hCoV-19/Russia/MOW-Moscow_PMVL-O11/2021 | EPI_ISL_7263932 |
2 | hCoV-19/Russia/MOW-Moscow_PMVL-O16/2021 | EPI_ISL_7263933 |
3 | hCoV-19/Russia/SPE-RII-MH44356S/2021 | EPI_ISL_7717296 |
В результате образцы 1, 2 и 3 были положительными в анализе, как и ожидалось. Отрицательные контрольные образцы (не отражены в таблице 1) были признаны отрицательными. Для оценки эффективности амплификации анализа ins214EPE использовали 10-кратные серийные разведения РНК Omicron. Эффективность составила 98,9% (R2 = 0,99). Данныеоб эффективности амплификации представлены на фиг.1, а кривая амплификации представлена на фиг. 2.
Разработаннаятест-система демонстрирует высокую специфичность. Он был протестирован на 26 клинических образцах (РНК, выделенных из мазков из ротоглотки) с ранее охарактеризованными вирусами, принадлежащими 8 различным линиям SARS-CoV-2 (включая DeltaB.1.617.2 + AY. *). Специфический сигнал был обнаружен только в образцах с SARS-CoV-2 РНК линии Omicron (подтверждено полногеномным секвенированием). Специфичность была дополнительно проверена на клинических образцах, положительных на другие респираторные вирусы из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева - гриппа, парагриппа, сезонных коронавирусов человека (OC43, NL63, 229E, HKU1), hRSV, риновирусов, бокавирусов, метапневмовирусов (всего 33) – без ложноположительных результатов. Аналитическая специфичность теста была проверена на 26 образцах 8 различных линий SARS-CoV-2 (таблица 2).
Таблица 2 – результаты проверки аналитической специфичности теста
№ п/п | Образцы | Анализ рекомбинантного белка, значение Ct |
Анализ гена HKU SARS-CoV-2 N, значение Ct | Анализ гена ins214EPE, значение Ct |
1 | hRV | 32,85 | ||
2 | hRV | 33,76 | ||
3 | hRV | 27,75 | ||
4 | hRSV B | 31,49 | ||
5 | hRSV B | 30,98 | ||
6 | hRSV B | 32,33 | ||
7 | hRSV A | 28,76 | ||
8 | hRSV A | 30,56 | ||
9 | hRSV A | 27,7 | ||
10 | hPIV4 | 23,9 | ||
11 | hPIV3 | 27,01 | ||
12 | hPIV2 | 24,72 | ||
13 | hPIV1 | 28,63 | ||
14 | hCoV OC43 | 30,34 | ||
15 | hCoV OC43 | 30,69 | ||
16 | hCoV OC43 | 28,64 | ||
17 | hCoV NL63 | 32,2 | ||
18 | hCoV NL63 | 30,42 | ||
19 | hCoV NL63 | 24,95 | ||
20 | hMPV | 30,12 | ||
21 | hCoV HKU1 | 30,06 | ||
22 | hCoV HKU1 | 28,3 | ||
23 | hCoV HKU1 | 30,73 | ||
24 | Human influenza A (H3N2) | 28,16 | 39,06 | |
25 | Human influenza A (H3N2) | 29,13 | ||
26 | Human influenza A (H3N2) | 28,45 | ||
27 | SARS-CoV-2 B.1.1.529 | 34,15 | 26,61 | 28,44 |
28 | hBoV | 32,26 | ||
29 | hBoV | 30,75 | ||
30 | hBoV | 27,25 | ||
31 | hAdV | 29,47 | ||
32 | hCoV 229E | 29,11 | ||
33 | hCoV 229E | 32,52 | ||
34 | hCoV 229E | 29,37 |
--->
Перечень последовательностей
<110> ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
"НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА ИМЕНИ А.А.
СМОРОДИНЦЕВА" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
<120>Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом
одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
<130>Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом
одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>21
<212> DNA
<213>SARS-CoV-2
<400> 1
atattctaagcacacgcctatt 22
<210> 2
<211>22
<212> DNA
<213>SARS-CoV-2
<400> 2
ggcaaatctaccaatggttc ta 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213>SARS-CoV-2
<400>3
tgcgtgagccagaagatctccct 23
<---
1. Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямой праймер Ins214EPE SARS-CoV-2 – ATATTCTAAGCACACGCCTATT,
обратный праймер Ins214EPE SARS-CoV-2 – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA,
флоуресцентный зонд Ins214EPE SARS-CoV-2 –
ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ-2.
2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная концентрация праймеров и зонда составляет 400 нМ.
3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная температура отжига праймеров и зонда составляет 61°С.