Тест-система для выявления sars-cov-2 линии омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для выявления SARS-CoV линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Указанная тест-система включает олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:

прямой праймер Ins214EPESARS-CoV-2 –

обратный праймер Ins214EPESARS-CoV-2 –

флоуресцентный зонд Ins214EPESARS-CoV-2

Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного и точного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности, к диагностике инфекционных заболеваний, а именно к тест-системе для выявления SARS-CoV-2линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

26 ноября 2021 Всемирная организация здравоохранения обозначила новую линию вируса SARS-CoV-2 – Омикрон (Классификация варианта «омикрон» (B.1.1.529) как варианта вируса SARS-CoV-2, вызывающего обеспокоенность. Сайт Всемирной организации здравоохранения, URL: https://www.who.int/ru/news/item/26-11-2021-classification-of-omicron-(b.1.1.529)-sars-cov-2-variant-of-concern, дата обращения – 28.12.2021 г.). Данный вариант нового коронавируса имеет большое количество мутаций, что объясняет повышенное внимание и беспокойство в отношении новой линии. По уже полученным данным отличиями новой линии Омикрон можно назвать высокий риск повторного заражения и относительно низкую эффективность существующих вакцин. Обеспечение возможности высокопроизводительного скрининга SARS-CoV-2 линии Омикрон является крайне важной и актуальной задачей, стоящей перед разработчиками тест-систем на сегодняшний день.

Известна тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 (Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: патент RU2756474, Российская Федерация, заявка RU2021114811, заявл. 24.05.2021, опубл. 30.09.2021), включающая ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена N вируса SARS-CoV-2: прямой GGACCCCAAAATCAGCGAAA, обратный CTGGTTACTGCCAGTTGAATC, флуоресцентный зонд ROXCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC. Причем осуществляют реакцию ПЦР в режиме реального времени, состоящую из следующих этапов: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 с, 55°С - 15 с; 72°С - 20 с - 40 циклов, образец считается положительным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию, при этом, если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SAPvS-CoV-2 считается отрицательным.

Также известен набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени (Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени: патент RU2744198, Российская Федерация, заявка RU2020118246, заявл. 25.05.2020, опубл. 03.03.2021), включающий в себя олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие фрагмент гена РНК зависимой РНК полимеразы, и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:

CoV2-f tca caa ttc aga agt agg acc tg;
CoV2-r agc ctc caa agg caa tag tgc
CoV2-pr R6G - tct tgc cga ata cca taa tga atc caa – BHQ1

Наиболее близким к заявляемому изобретению является тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A и Influenza virus B (Тест-системадлявыявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: патент RU2761481, РоссийскаяФедерация, заявка 2021126293, заявл. 07.09.2021, опубл. 08.12.2021), включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды со следующей структурой: прямой праймер вируса гриппа В ATTCTTCAATgAAgAAggAAC; обратный праймер вируса гриппа В CTCCCAACACggTAgATA; флуоресцентный зонд вируса гриппа В (R6G)-TCCCATCATCATyCCAgg-(BHQ-1); прямой праймер вируса гриппа А CACCAAAyCATgArggAATA; обратный праймер вируса гриппа А gCTCATgTTgATTCCCAC; флуоресцентный зонд вируса гриппа А (ROX)-TgCAggTCCTrTAgAATCTrTCCACTC-(BHQ-2); прямой праймер SARS-CoV-2 AgAgCTATgAATTgCAgAC; обратный праймер SARS-CoV-2 gggAAATACAAAATTTggACA; флуоресцентный зонд SARS-CoV-2 (FAM)-AATTggCAAAgAAATTTgACACCTTCA-(BHQ-1).

На сегодняшний день неизвестны тест-системы, пригодные для эффективного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон.

Технической проблемой является необходимость разработки эффективной и точной тест-системы для выявления SARS-CoV-2 Линии Омикрон – Ins214EPE.

Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного и точного выявления SARS-CoV-2 Линии Омикрон.

Технический результат достигается тем, что тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:

прямой праймер Ins214EPESARS-CoV-2 – ATATTCTAAGCACACGCCTATT (SEQNO:1);

обратный праймер Ins214EPESARS-CoV-2 – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA (SEQNO:2);

флоуресцентный зонд Ins214EPESARS-CoV-2 –

ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ-2 (SEQ NO:3).

Для решения задачи детекции варианта Омикрон были обработаны геномы всех вариантов SARS-CoV-2 в базе данных GISAID (https://www.gisaid.org) с целью поиска уникальных инделов, которые бы встречались бы в большинстве геномов варианта Омикрон и не встречались бы никогда у других вариантов SARS-CoV-2. Заявляемая тест-система была получена путем конструирования диагностических праймеров и зонда для детекции линии Омикрон SARS-CoV-2 с помощью подбора флюоресцентно-меченного гидролизующегося зонда высокоспецифичного к уникальной последовательности инсерции Ins214EPE. Данная инсерция не встречается более ни у одного варианта SARS-CoV-2, но присутствует в большинстве геномов линии B.1.1.529 BA.1.

Для оптимизации работы тест-системы была проведена серия экспериментов по подбору рабочей концентрации праймеров и поставлен эксперимент с градиентом температуры отжига праймеров для подбора оптимального значения в условиях мультиплексной реакции. По результатам экспериментов оптимальная концентрация праймеров и зондов составила 400 нМ, оптимальная температура отжига 61°С.

Анализ результатов был произведён с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную сигмовидную форму и пересекала пороговую линию.

Заявляемое изобретение поясняется примером

Проверка эффективности тест-системы.

Тест был валидирован на РНК варианта Omicron, любезно предоставленной Лабораторией изменчивости патогенных микроорганизмов (д-р Владимир Гущин, Институт Гамалеи, Москва, Россия), и РНК из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева.

Таблица 1 – образцы вируса, используемые при валидации теста

№ п/п Наименование вируса Номер в глобальном европейском вирусном архиве (GISAIDIsolateID)
1 hCoV-19/Russia/MOW-Moscow_PMVL-O11/2021 EPI_ISL_7263932
2 hCoV-19/Russia/MOW-Moscow_PMVL-O16/2021 EPI_ISL_7263933
3 hCoV-19/Russia/SPE-RII-MH44356S/2021 EPI_ISL_7717296

В результате образцы 1, 2 и 3 были положительными в анализе, как и ожидалось. Отрицательные контрольные образцы (не отражены в таблице 1) были признаны отрицательными. Для оценки эффективности амплификации анализа ins214EPE использовали 10-кратные серийные разведения РНК Omicron. Эффективность составила 98,9% (R2 = 0,99). Данныеоб эффективности амплификации представлены на фиг.1, а кривая амплификации представлена на фиг. 2.

Разработаннаятест-система демонстрирует высокую специфичность. Он был протестирован на 26 клинических образцах (РНК, выделенных из мазков из ротоглотки) с ранее охарактеризованными вирусами, принадлежащими 8 различным линиям SARS-CoV-2 (включая DeltaB.1.617.2 + AY. *). Специфический сигнал был обнаружен только в образцах с SARS-CoV-2 РНК линии Omicron (подтверждено полногеномным секвенированием). Специфичность была дополнительно проверена на клинических образцах, положительных на другие респираторные вирусы из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева - гриппа, парагриппа, сезонных коронавирусов человека (OC43, NL63, 229E, HKU1), hRSV, риновирусов, бокавирусов, метапневмовирусов (всего 33) – без ложноположительных результатов. Аналитическая специфичность теста была проверена на 26 образцах 8 различных линий SARS-CoV-2 (таблица 2).

Таблица 2 – результаты проверки аналитической специфичности теста

№ п/п Образцы Анализ рекомбинантного белка,
значение Ct
Анализ гена HKU SARS-CoV-2 N, значение Ct Анализ гена ins214EPE, значение Ct
1 hRV 32,85
2 hRV 33,76
3 hRV 27,75
4 hRSV B 31,49
5 hRSV B 30,98
6 hRSV B 32,33
7 hRSV A 28,76
8 hRSV A 30,56
9 hRSV A 27,7
10 hPIV4 23,9
11 hPIV3 27,01
12 hPIV2 24,72
13 hPIV1 28,63
14 hCoV OC43 30,34
15 hCoV OC43 30,69
16 hCoV OC43 28,64
17 hCoV NL63 32,2
18 hCoV NL63 30,42
19 hCoV NL63 24,95
20 hMPV 30,12
21 hCoV HKU1 30,06
22 hCoV HKU1 28,3
23 hCoV HKU1 30,73
24 Human influenza A (H3N2) 28,16 39,06
25 Human influenza A (H3N2) 29,13
26 Human influenza A (H3N2) 28,45
27 SARS-CoV-2 B.1.1.529 34,15 26,61 28,44
28 hBoV 32,26
29 hBoV 30,75
30 hBoV 27,25
31 hAdV 29,47
32 hCoV 229E 29,11
33 hCoV 229E 32,52
34 hCoV 229E 29,37

--->

Перечень последовательностей

<110> ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

"НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА ИМЕНИ А.А.

СМОРОДИНЦЕВА" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

<120>Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом

одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

<130>Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом

одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>21

<212> DNA

<213>SARS-CoV-2

<400> 1

atattctaagcacacgcctatt 22

<210> 2

<211>22

<212> DNA

<213>SARS-CoV-2

<400> 2

ggcaaatctaccaatggttc ta 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>SARS-CoV-2

<400>3

tgcgtgagccagaagatctccct 23

<---

1. Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:

прямой праймер Ins214EPE SARS-CoV-2 – ATATTCTAAGCACACGCCTATT,

обратный праймер Ins214EPE SARS-CoV-2 – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA,

флоуресцентный зонд Ins214EPE SARS-CoV-2 –

ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ-2.

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная концентрация праймеров и зонда составляет 400 нМ.

3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная температура отжига праймеров и зонда составляет 61°С.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии и кардиологии, и предназначено для диагностики степени тяжести хронической сердечной недостаточности. Исследуют генотипы полиморфизма rs1799998 гена CYP11B2 при хронической сердечной недостаточности с нарушениями диастолической функции левого желудочка.

Изобретение относится к области вирусологии. Описан набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающий две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности: пару специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса: ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1, ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2; пару специфических праймеров для сегмента гена N вируса: N-F: как показано в SEQ ID NO: 3, N-R: как показано в SEQ ID NO: 4.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана система для обнаружения целевого агента, содержащая: аналитический картридж, включающий тестовую ячейку, содержащую возбуждающий электрод и сенсорный электрод, причем тестовая ячейка выполнена с возможностью вмещать образец, содержащий целевой агент, подвергающийся процессу амплификации, причем указанный целевой агент содержит нуклеиновую кислоту; и считывающее устройство, включающее: область, выполненную с возможностью принимать аналитический картридж, нагреватель, располагающийся таким образом, чтобы нагревать используемый аналитический картридж внутри полости, память, хранящую по меньшей мере машиночитаемые инструкции по хранению, и процессор, конфигурируемый указанными инструкциями таким образом, чтобы по меньшей мере: приводить к нагреванию аналитического картриджа нагревателем до заданной температуры для выполнения процесса амплификации внутри тестовой ячейки; подавать ток возбуждения на возбуждающий электрод на протяжении по меньшей мере части времени протекания процесса амплификации, принимать сигнал от сенсорного электрода, соответствующий току возбуждения после его затухания вследствие взаимодействия по меньшей мере с образцом внутри тестовой ячейки, раскладывать указанный сигнал на составляющую активного сопротивления и составляющую реактивного сопротивления, анализировать составляющую реактивного сопротивления для определения наличия перепада сигнала относительно времени и на определенной частоте указанного сигнала, указывающего на положительный образец, содержащий целевой агент, на протяжении по меньшей мере части времени протекания процесса амплификации, и в ответ на определение возникновения перепада сигнала выводить положительный результат теста; или в ответ на определение отсутствия перепада сигнала выводить отрицательный результат теста.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу in vitro определения деградации внеклеточного матрикса (ЕСМ) у субъекта, причем способ предусматривает определение в выделенном образце от субъекта уровня продукта экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из цепи альфа-1 коллагена типа V (COL5A1), трансформирующего фактора роста бета-1 (TGFB1), субъединицы альфа-4 интегрина (ITGA4), субъединицы бета-1 интегрина (ITGB1), матриксной металлопептидазы 2 (ММР2), матриксной металлопептидазы 9 (ММР9) и костного морфогенетического белка 1 (ВМР1), причем по меньшей мере один ген определяется необязательно в комбинации с одним или обоими из цепи альфа-1 коллагена типа XI (COL11A1) и цепи альфа-2 коллагена типа V (COL5A2), причем, когда уровень продукта(ов) экспрессии выше эталонного значения, это свидетельствует о деградированном ЕСМ.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к системе и способам усиления доступа к ядерным информационным молекулам, таким как ДНК, РНК и белки, с помощью аналитических биомолекул, таких как транспосомные комплексы, посредством обработки ядер усилителем ядерной проницаемости, а также к способам использования ядерной мембраны, клеточной мембраны и подходов внешней компартментализации в качестве сохраняющих близость элементов.

Настоящее изобретение относится к осуществляемому in vitro способу раннего выявления вспышки некротического энтерита в популяции птиц, при этом способ включает a) сбор материала образца фекалий, полученного от популяции птиц, в последовательные моменты времени и b) определение количественного соотношения маркерных генов netB и cpa, содержащихся в материале образца, полученном на стадии a); где реверсия количественного соотношения netB и cpa с течением времени является ранним признаком вспышки некротического энтерита.

Данное изобретение относится к биотехнологии, в частности к везикулам, происходящим из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, и к их применению. Везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, можно с успехом использовать для разработки способа диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, композиции для предотвращения, ослабления или лечения этих заболеваний и получения носителя для доставки лекарственного вещества в головной мозг.

Изобретение относится к биотехнологии. Предоставлен способ диагностики и/или мониторинга травматического повреждения головного мозга (TBI) у индивидуума.

Группа изобретений относится к BI-1-дефицитному штамму Brucella suis и способу его конструирования. Предложен BI-1-дефицитный штамм B.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана тест-система для выполнения анализов исследования мутации c.1934dupG в гене ASXL1, которая состоит из поликарбонатного планшета для ПЦР, где в лунках содержится смесь для реакции под слоем парафина, где в контрольных лунках содержится отрицательный и положительный образцы для внутреннего контроля исследования.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты способа получения библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты, происходящие из множества отдельных ядер или клеток. Изобретение обеспечивает возможность оценки транскрипционной динамики сложных биологических систем. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 42 ил., 1 табл., 4 пр.
Наверх