Гуманизированная модель нарушений со стороны почек и печени

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу оценивания in vivo терапевтической эффективности средства для применения в лечении связанной с комплементом нефропатии. Способ предусматривает введение средства грызуну, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу С3 грызуна последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена С3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена С3 человека, с образованием модифицированного гена С3. Также раскрыт способ идентификации средства, которое подавляет симптом связанной с комплементом нефропатии у грызуна, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу С3 грызуна последовательности гена грызуна, кодирующей экзон гена С3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена С3 человека, с образованием модифицированного гена С3. Изобретение эффективно для скрининга кандидатных терапевтических средств или соединений для лечения связанных с комплементом нефропатий и фиброза печени. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 31 ил., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/464262, поданной 27 февраля 2017 г., предварительной заявки на патент США №62/529916, поданной 7 июля 2017 г., и предварительной заявки на патент США №62/583780, поданной 9 ноября 2017 г., полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0002] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII размером 6Кб под названием 35469_10207US01_SequenceListing.txt, созданный 12 февраля 2018 г. и поданный в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] В данном документе, среди прочего, предусмотрены способы применения генетически модифицированных отличных от человека животных, содержащих ген C3, который является полностью или частично человеческим, для скрининга кандидатных терапевтических средств или соединений для лечения связанных с комплементом нефропатий и фиброза печени, а также способы лечения индивидуумов, у которых диагностированы или предположительно имеются связанные с комплементом нефропатии.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Белок C3 системы комплемента является терапевтической мишенью для лечения ряда заболеваний, нарушений и состояний у человека. Протеолитическое расщепление C3 специфическими в отношении C3 конвертазами играет основную роль в активации пути комплемента. C3-конвертазы приводят к образованию форм C3b, которые, в свою очередь, являются потенциальными компонентами новых молекул C3-конвертазы со стимуляцией и амплификацией тем самым каскада комплемента.

[0005] Нежелательная активация альтернативного пути комплемента была предложена в качестве возможной причины нефропатий, таких как атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS) и C3-гломерулопатия (C3G), форма мембранопролиферативного гломерулонефрита, которая охватывает болезнь плотного осадка (DDD) и C3-гломерулонефрит (C3GN). По мере их прогрессирования эти заболевания вредят и ухудшают функцию почек. Поскольку в мембране клубочка отсутствуют эндогенные регуляторные мембранные белки комплемента, которые в противном случае могли бы подавлять активацию пути комплемента, у индивидуумов со связанными с комплементом нефропатиями происходит непрерывное и нерегулируемое расщепление C3 в этом участке, что приводит к отложению продуктов активации комплемента, опосредованному C3-конвертазой повреждению гломерулярных базальных мембран, повреждению эпителиальных канальцев и эндотелиальных клеток, утолщению мембран вследствие отложения внеклеточного матрикса, отложению компонентов системы комплемента (например, продуктов расщепления С3) и, в конечном счете, дефектной фильтрации (протеинурия) и почечной недостаточности.

[0006] Оценку фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) кандидатных терапевтических молекул, которые специфически нацеливаются на белки C3 человека для лечения связанных с комплементом нефропатий, обычно проводят на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах. Однако PD таких терапевтических молекул невозможно определить надлежащим образом на определенных отличных от человека животных, поскольку эти терапевтические молекулы не воздействуют целенаправленно на эндогенные белки или гены C3.

[0007] Соответственно, существует потребность в отличных от человека животных, например, грызунах, например, животных подсемейства мышиные, например, мышах или крысах, у которых гены C3 отличного от человека животного являются полностью или частично гуманизированными или заменены (например, по эндогенным отличным от человеческих локусам) генами C3 человека, содержащими последовательности, кодирующие человеческие или гуманизированные белки C3. Такие животные потенциально могли бы служить идеальными моделями для оценки эффективности кандидатных терапевтических средств для лечения связанных с комплементом нефропатий, таких как нефропатии, ассоциированные с избыточной активацией альтернативного пути комплемента из-за патологических уровней отложения C3 в почке, в частности, если у созданных способом генной инженерии отличных от человека животных проявляются симптомы этих состояний, соответствующие симптомам, наблюдаемым при заболевании у человека.

[0008] По всему настоящему описанию упоминаются различные патенты, патентные заявки и другие типы публикаций (например, журнальные статьи, записи электронных баз данных и т.п.). Раскрытие всех патентов, патентных заявок и других публикаций, цитируемых в данном документе, тем самым включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] В данном документе, среди прочего, предусмотрены способы применения генетически модифицированных отличных от человека животных, содержащих ген C3, который является полностью или частично человеческим, и у которых проявляются один или более симптомов, соответствующих симптомам, наблюдаемым у людей со связанной с комплементом нефропатией и/или фиброзом печени, для скрининга или идентификации кандидатных терапевтических соединений или средств для лечения связанных с комплементом нефропатий и/или фиброза печени. Также в данном документе предусмотрены способы улучшения функции почек у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия.

[0011] Соответственно, в некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы оценивания in vivo терапевтической эффективности средства для применения в лечении связанной с комплементом нефропатии, при этом способ предусматривает: (a) введение средства грызуну, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу C3 грызуна последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена C3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена C3 человека, с образованием модифицированного гена C3, при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе C3 грызуна; и (b) оценивание того, подавляет ли средство (например, предупреждает, облегчает или снижает интенсивность) один или более симптомов нефропатии по сравнению с контрольными грызунами, которым средство не вводили. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают спонтанную смерть. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают сниженный вес, сниженную плотность кости, сниженное содержание жира в организме или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии выбраны из одного или более из группы, состоящей из гломерулонефрита, базофильных канальцев, склеротических клубочков, расширенных канальцев с белковыми цилиндрами, расширения мезангиального матрикса, гипертрофии клубочков и мононуклеарного воспаления интерстиция. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают отложение белка С3 в почке. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают образование мембраноатакующих комплексов C5b-9 в почке. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают один или более из повышенного уровня азота мочевины крови (BUN), липазы в сыворотке крови, цистатина C в сыворотке крови или липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов С3-гломерулопатии включают повышенное содержание альбумина в моче или C5a в моче. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания, т.е. генов, которые дифференциально экспрессируются у грызунов со связанной с комплементом нефропатией по сравнению с грызунами дикого типа без связанной с комплементом нефропатии.

[0012] В другом аспекте в данном документе также предусмотрены способы оценивания in vivo терапевтической эффективности средства для применения в лечении фиброза печени, при этом способ предусматривает: (a) введение средства грызуну, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу C3 грызуна последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена C3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена C3 человека, с образованием модифицированного гена C3, при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе C3 грызуна; и (b) оценивание того, подавляет ли средство (например, предупреждает, облегчает или снижает интенсивность) один или более симптомов фиброза печени по сравнению с контрольными грызунами, которым средство не вводили. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени включают один или более из повышенного уровня аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) или щелочной фосфатазы (ALP). В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания, т.е. генов, которые дифференциально экспрессируются у грызунов с фиброзом печени по сравнению с грызунами дикого типа без фиброза печени.

[0013] В дополнительных аспектах в данном документе предусмотрен способ идентификации средства, которое подавляет симптом связанной с комплементом нефропатии у грызуна, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу грызуна C3 последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена C3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена C3 человека, с образованием модифицированного гена C3, при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна по эндогенному локусу C3 грызуна, при этом способ предусматривает: (a) введение средства грызуну и (b) идентификацию средства в качестве средства, которое подавляет симптом связанной с комплементом нефропатии, если средство подавляет один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии у грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают спонтанную смерть. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают сниженный вес, сниженную плотность кости, сниженное содержание жира в организме или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии выбраны из одного или более из группы, состоящей из гломерулонефрита, базофильных канальцев, склеротических клубочков, расширенных канальцев с белковыми цилиндрами, расширения мезангиального матрикса, гипертрофии клубочков и мононуклеарного воспаления интерстиция. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают отложение белка С3 в почке. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают образование мембраноатакующих комплексов C5b-9 в почке. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают один или более из повышенного уровня азота мочевины крови (BUN), липазы в сыворотке крови, цистатина C в сыворотке крови или липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов С3-гломерулопатии включают повышенное содержание альбумина в моче или C5a в моче. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания.

[0014] В еще одних аспектах в данном документе также предусмотрена модель связанной с комплементом нефропатии у человека на грызуне, где в геноме грызуна содержится модифицированный ген C3 в эндогенном локусе С3, где модифицированный ген C3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один экзон гена C3 человека, и при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе C3 грызуна. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором эндогенного С3 грызуна в локусе С3 грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления у грызуна проявляются один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии человека, выбранных из группы, состоящей из спонтанной смерти, сниженного веса, сниженной плотности кости, сниженного содержания жира в организме, гломерулонефрита, базофильных канальцев, склеротических клубочков, расширенных канальцев с белковыми цилиндрами, расширения мезангиального матрикса, гипертрофии клубочков, мононуклеарного воспаления интерстиция, отложения белка C3 в почке, образования мембраноатакующих комплексов C5b-9 в почке, повышенного уровня азота мочевины крови (BUN), повышенного уровня липазы в сыворотке крови, повышенного уровня цистатина C в сыворотке крови, повышенного уровня липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке крови, повышенного уровня альбумина в моче, повышенного уровня C5a в моче и генной сигнатуры заболевания.

[0015] В другом аспекте в данном документе предусмотрена модель на грызуне для оценивания терапевтической эффективности кандидатного терапевтического средства для подавления симптома связанной с комплементом нефропатии, включающая (a) грызуна, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу C3 грызуна последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена C3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена C3 человека, с образованием модифицированного гена C3, при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна по эндогенному локусу C3 грызуна, где у грызуна проявляются один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии; и (b) одно или более кандидатных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают спонтанную смерть. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают сниженный вес, сниженную плотность кости, сниженное содержание жира в организме или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии выбраны из одного или более из группы, состоящей из гломерулонефрита, базофильных канальцев, склеротических клубочков, расширенных канальцев с белковыми цилиндрами, расширения мезангиального матрикса, гипертрофии клубочков и мононуклеарного воспаления интерстиция. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают отложение белка С3 в почке. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают образование мембраноатакующих комплексов C5b-9 в почке. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов нефропатии включают один или более из повышенного уровня азота мочевины крови (BUN), липазы в сыворотке крови, цистатина C в сыворотке крови или липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов С3-гломерулопатии представляют собой повышенное содержание альбумина в моче или C5a в моче. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания.

[0016] В дополнительных аспектах в данном документе предусмотрен способ идентификации средства, которое подавляет фиброз печени у грызуна, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу грызуна C3 последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена C3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена C3 человека, с образованием модифицированного гена C3, при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна по эндогенному локусу C3 грызуна, при этом способ предусматривает: (a) введение средства грызуну и (b) идентификацию средства в качестве средства, которое подавляет фиброз печени, если средство подавляет один или более симптомов фиброза печени у грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления ген C3 человека, кодирующий белок С3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в данном документе, грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени представляют собой один или более из повышенного уровня аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) или щелочной фосфатазы (ALP). В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания.

[0017] В другом аспекте в данном документе предусмотрена модель фиброза печени у человека на грызуне, где в геноме грызуна содержится модифицированный ген C3 в эндогенном локусе С3, где модифицированный ген C3 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один экзон гена C3 человека, и при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе C3 грызуна. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором эндогенного С3 мыши в локусе С3 грызуна. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором эндогенного С3 грызуна в локусе С3 грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления у грызуна проявляются один или более симптомов фиброза печени, выбранных из группы, состоящей из повышенного уровня аланинаминотрансферазы (ALT), повышенного уровня аспартатаминотрансферазы (AST) и повышенного уровня щелочной фосфатазы (ALP). В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания.

[0018] В дополнительных аспектах в данном документе предусмотрена модель на грызуне для оценивания терапевтической эффективности кандидатного терапевтического средства для подавления симптома фиброза печени, включающая (a) грызуна, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу C3 грызуна последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена C3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена C3 человека, с образованием модифицированного гена C3, при этом экспрессия модифицированного гена C3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе C3 грызуна, где у грызуна проявляются один или более симптомов фиброза печени; и (b) одно или более кандидатных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена C3 человека, кодирующего белок С3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена C3 человека. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок C3 мыши. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок C5 мыши, кодируемый эндогенным геном C5 мыши. В некоторых вариантах осуществления средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима. В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени включают один или более из повышенного уровня аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) или щелочной фосфатазы (ALP). В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов фиброза печени оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов заболевания.

[0019] В дополнительных аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения индивидуума, у которого диагностированы или предположительно имеются связанная с комплементом нефропатия или фиброз печени, предусматривающие введение клинически эффективного количества терапевтического средства индивидууму. Терапевтическое средство, вводимое индивидууму, включает, например, средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, средство, которое подавляет экспрессию или активность C3, и средство, которое подавляет активность продуктов протеолитического расщепления C3 (C3a или C3b). Введение обеспечивает улучшение функции почек или печени и облегчение одного или более симптомов связанной с комплементом нефропатии или фиброза печени.

[0020] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены способы улучшения функции почек у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, предусматривающие введение клинически эффективного количества терапевтического средства, при этом введение обеспечивает улучшение функции почек по сравнению с индивидуумами, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления улучшенная функция почек предусматривает одно или более из сниженной концентрации азота мочевины крови (BUN), сниженной концентрации цистатина С в сыворотке крови и/или сниженной концентрации C5a в моче. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и BUN снижается у индивидуума на приблизительно 10-50%. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и концентрация цистатина С в сыворотке крови снижается у индивидуума на приблизительно 10-60%. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и концентрация C5a в моче снижается у индивидуума на приблизительно 40-85%.

[0021] В других вариантах осуществления в данном документе предусмотрены способы уменьшения образования мембраноатакующего комплекса (MAC) в клубочках у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, предусматривающие введение клинически эффективного количества терапевтического средства, при этом введение обеспечивает уменьшение образования MAC в клубочках по сравнению с индивидуумами, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и образование MAC у индивидуума уменьшается на приблизительно 5-20%. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в данном документе, образование MAC определяют по отложению С9 в клубочковых пучках индивидуума.

[0022] В еще одном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы уменьшения инфильтрации клубочка или интерстиция почки иммунными клетками у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, предусматривающие введение клинически эффективного количества терапевтического средства, при этом введение обеспечивает уменьшение инфильтрации почек иммунными клетками у индивидуума по сравнению с индивидуумами, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой нейтрофил, который инфильтрирует клубочек. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и инфильтрация клубочка нейтрофилами уменьшается на приблизительно 50-100%. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой макрофаг, который инфильтрирует интерстиций. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и инфильтрация интерстиция макрофагами уменьшается на приблизительно 30-70%.

[0023] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены способы уменьшения размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса в почке у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, предусматривающие введение клинически эффективного количества терапевтического средства, где введение обеспечивает уменьшение размера клубочков и/или расширения мезангиального матрикса в почках у индивидуума по сравнению с индивидуумами, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления вводят терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, и размер клубочка и/или расширение мезангиального матрикса уменьшается на приблизительно 15-30%.

[0024] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в данном документе, связанная с комплементом нефропатия представляет собой атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS) или С3-гломерулопатию (C3G). В некоторых вариантах осуществления C3G предусматривает болезнь плотного осадка (DDD) или C3-гломерулонефрит (C3GN).

[0025] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в данном документе, терапевтическое средство (например, средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, средство, которое подавляет экспрессию или активность C3, или средство, которое подавляет активность C3a или C3b) представляет собой одно или более из антитела, ингибиторной нуклеиновой кислоты, отличного от антитела связывающего полипептида или низкомолекулярного химического соединения. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из антисмыслового олигонуклеотида, siRNA, microRNA (miR) или рибозима. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из человеческих антител, гуманизированных антител, антител, модифицированных последовательностями верблюжьих, химерных антител, CDR-привитых антител, одноцепочечных Fv (scFv), связанных дисульфидной связью Fv (sdFv), Fab-фрагментов и F(ab')-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят приблизительно 50 мг/кг антитела (например, антитела к C5 или антитела к C3b). В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят антитело три раза в неделю. В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят антитело (например, антитело к C5 или антитело к C3b) в течение приблизительно 9 недель.

[0026] В дополнительном аспекте, раскрытом в данном документе, предусмотрено терапевтическое средство для применения в лечении связанной с комплементом нефропатии или фиброза печени. Терапевтическое средство включает, например, средство, которое подавляет экспрессию или активность C5, средство, которое подавляет экспрессию или активность C3, и средство, которое подавляет активность продуктов протеолитического расщепления C3 (C3a или C3b). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело к C5. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело к C3b. В некоторых вариантах осуществления применение терапевтического средства в лечении обеспечивает улучшение функции почек (например, о чем свидетельствует пониженная концентрация азота мочевины крови (BUN), пониженная концентрация цистатина С в сыворотке крови и/или пониженная концентрация C5a в моче или их комбинация) по сравнению с лечением без применения терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления применение терапевтического средства в лечении обеспечивает уменьшение образования MAC в клубочках по сравнению с лечением без применения терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления применение терапевтического средства в лечении обеспечивает уменьшение инфильтрации иммунными клетками в почках по сравнению с лечением без применения терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления применение терапевтического средства в лечении обеспечивает уменьшение размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса в почках по сравнению с лечением без применения терапевтического средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0027] Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации заявки на патент с цветным(-и) графическим(-и) материалом(-и) будут предоставлены Ведомством после запроса и уплаты необходимой пошлины.

[0028] На фиг. 1A представлена иллюстрация, без соблюдения масштаба, мышиного (mC3) и гуманизированного (hC3) геномных локусов C3. Ген C3 мыши, охватывающий 5' регуляторные элементы и кодирующую область от экзона 1 до экзона 41, подвергают делеции и замене на 5' регуляторные элементы и кодирующую область от экзона 1 до экзона 41 гена C3 человека и сайт loxP, как соответственно указано жирной линией и стрелкой. На фиг. 1B представлена иллюстрация, без соблюдения масштаба, мышиного (mC3) и гуманизированного (hC3) геномных локусов C3. Ген C3 мыши, охватывающий часть интрона 1 и кодирующую область от экзона 2 до экзона 41, подвергают делеции и замене на часть интрона 1 и кодирующую область от экзона 2 до экзона 41 гена C3 человека и сайт loxP, как соответственно указано жирной линией и стрелкой.

[0029] Фиг. 2A и фиг. 2B представляют собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA сыворотки и плазмы крови, полученной от гомозиготных мышей MAID 6156 и MAID 6149, проведенного в отношении C3 мыши (фиг. 2A) или C3a мыши (фиг. 2B). Кружочками обозначены контроли 6149 или 6156 дикого типа (WT); квадратами обозначены гомозиготные (HO) мыши MAID 6156 и MAID 6149, ромбами обозначены нокаутные по C3 (нуль) животные; и треугольниками обозначена нормальная плазма крови человека (NHP) или нормальная сыворотка крови человека (NHS). ND = не выявляли.

[0030] Фиг. 3A и фиг. 3B представляют собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA сыворотки и плазмы крови, полученной от гомозиготных мышей MAID 6156 и MAID 6149, проведенного в отношении C3 человека (фиг. 3A) или C3a человека (фиг. 3B). Кружочками обозначены контроли 6149 или 6156 дикого типа (WT); квадратами обозначены гомозиготные (HO) мыши MAID 6156 и MAID 6149, ромбами обозначены нокаутные по C3 животные; и треугольниками обозначена нормальная плазма крови человека (NHP) или нормальная сыворотка крови человека (NHS). ND = не выявляли.

[0031] Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий результаты анализа ELISA сыворотки и плазмы крови, полученной от гомозиготных мышей MAID 6156 и MAID 6149, проведенного в отношении сывороточного белка амилоида A мыши (mSAA). Кружочками обозначены контроли 6149 или 6156 дикого типа (WT); квадратами обозначены гомозиготные (HO) мыши MAID 6156 и MAID 6149, ромбами обозначена плазма крови от нокаутных по С3 животных.

[0032] На фиг. 5 показаны вестерн-блоты, выполненные с использованием сыворотки крови, полученной от гомозиготных мышей MAID 6149 (фиг. 5A) и MAID 6156 (фиг. 5B). Антитело к С3 человека, применяемое в данном исследовании, является перекрестно реактивным с C3 мыши.

[0033] На фиг. 6 показаны кривые выживаемости для поколений F2, F3 и F4 гомозиготных мышей MAID 6149 (слева) и MAID 6156 (справа) с течением времени.

[0034] На фиг. 7 показан график, демонстрирующий потерю/увеличение веса с течением времени у гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 (слева) и MAID 6156 (справа) и мышей дикого типа (WT).

[0035] На фиг. 8A и фиг. 8B показаны графики, демонстрирующие результаты анализа содержания жира в организме, проведенного с участием мышей дикого типа (WT) и гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 (фиг. 8A) и MAID 6156 (фиг. 8B).

[0036] На фиг. 9A и фиг. 9B показаны графики, демонстрирующие результаты анализа плотности кости и содержания минеральных веществ в кости, проведенного c мышами дикого типа (WT) и гомозиготными (HO) мышами MAID 6149 (фиг. 9A) и MAID 6156 (фиг. 9B).

[0037] На фиг. 10A показано поперечное сечение окрашенной гематоксилином и эозином (H&E) ткани почки, полученной от нормальных мышей. На фиг. 10B показана окрашенная H&E ткань почки, полученная от гомозиготных (HO) мышей MAID 6156.

[0038] На фиг. 11A показано поперечное сечение окрашенной Шифф-йодной кислотой (PAS) ткани почки, полученной от мышей дикого типа (WT) и гомозиготных гуманизированных по мышиному C3 (huC3) мышей MAID 6149. Изображения представляют среднюю патологию срезов. Стрелки указывают на примеры склеротических клубочков. На фиг. 11B показаны графики, демонстрирующие количественную оценку расширения мезангиального матрикса в почках у гуманизированных по мышиному C3 (huC3) мышейпо сравнению с мышами дикого типа (C3wt). Увеличенная площадь клубочкового пучка указывала на гипертрофию клубочка. Увеличения окрашенной PAS площади в клубочке указывало на расширение мезангиального матрикса.

[0039] На фиг. 12 показаны графики, демонстрирующие результаты развернутых биохимических анализов сыворотки крови в отношении уровней натрия, калия, хлорида, кальция, глюкозы, общего белка, креатинина, креатинкиназы, альбумина, амилазы, общего билирубина, магния, неорганического фосфата, мочевой кислоты, фосфора, неэтерифицированной жирной кислоты, общего холестерина, триглицерида, липопротеинов высокой плотности (HDL) и липопротеина низкой плотности (LDL) у мышей дикого типа (WT) и гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 и MAID 6156.

[0040] На фиг. 13A показаны графики, демонстрирующие результаты развернутых биохимических анализов сыворотки крови в отношении уровней азота мочевины крови, липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, (отличн. HDL) и липазы у мышей дикого типа (WT) и гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 и MAID 6156. На фиг. 13B показаны графики, демонстрирующие результаты анализов ферментов печени в отношении уровней аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), отношения ALT/AST и щелочной фосфатазы (ALP) у мышей дикого типа (WT) и гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 и MAID 6156.

[0041] На фиг. 14A показаны графики, демонстрирующие результаты развернутого анализа мочи в отношении уровня альбумина у мышей дикого типа (WT) и гуманизированных по C3 (huC3) мышей MAID 6149. На фиг. 14B показан анализ BUN и цистатина C в сыворотке крови у мышей дикого типа (WT) и гуманизированных по C3 (huC3) мышей.

[0042] На фиг. 15A показана иммунофлуоресцентная микрофотография, демонстрирующая поперечные сечения почечной ткани, полученной от мышей дикого типа (WT) и гомозиготных (HO) гуманизированных по C3 мышей MAID 6149, окрашенной для выявления белка C3 человека. На фиг. 15B показана иммунофлуоресцентная микрофотография, демонстрирующая поперечные сечения почечной ткани, полученной от мышей дикого типа (WT) и гуманизированных по C3 (huC3) мышей, окрашенной для выявления мембраноатакующего комплекса C5b-9 (красный цвет). ДНК окрашивалась в синий цвет с помощью DAPI. На фиг. 15C показаны уровни C5a в моче, полученные от мышей дикого типа (WT) и гуманизированных по C3 (huC3) мышей MAID 6149.

[0043] На фиг. 16 показаны столбчатый график, демонстрирующий орган-специфические общие изменения в экспрессии РНК у гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 и MAID 6156.

[0044] На фиг. 17 показана карта генной сигнатуры и таблица, демонстрирующие перекрывание сигнатур РНК в печени гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 и MAID 6156 по сравнению с аналогами дикого типа (WT).

[0045] На фиг. 18 показана таблица, демонстрирующая важнейшие обогащенные пути генной экспрессии в печени гомозиготных мышей MAID 6149 и MAID 6156.

[0046] На фиг. 19 показана таблица, демонстрирующая генные сигнатуры фиброза, экспрессия которых повышена (выделены желтым цветом) или понижена (выделены синим цветом) в печени гомозиготных мышей MAID 6156. Изменения, которые не достигли уровня статистической значимости, были идентифицированы как «-».

[0047] На фиг. 20 показана карта генной сигнатуры и таблица, демонстрирующие перекрывание сигнатур РНК в почках гомозиготных (HO) мышей MAID 6149 и MAID 6156 по сравнению с аналогами дикого типа (WT).

[0048] На фиг. 21A представлен столбчатый график, демонстрирующий изменения экспрессии специфических для почек генов у гуманизированных по C3 (huC3) мышей MAID 6149 по сравнению с мышами дикого типа (WT). На фиг. 21B показаны изменения экспрессии генов при нефротоксичности у гуманизированных по C3 (huC3) мышей по сравнению с мышами дикого типа (WT). На фиг. 21C показаны изменения экспрессии генов внеклеточного матрикса у гуманизированных по C3 (huC3) мышей по сравнению с мышами дикого типа (WT). На фиг. 21D показаны изменения экспрессии генов цитокинов у гуманизированных по C3 (huC3) мышей по сравнению с мышами дикого типа (WT). На фиг. 21E показаны изменения экспрессии генов хемокинов у гуманизированных по C3 (huC3) мышей по сравнению с мышами дикого типа (WT). На фиг. 21B-21E числа, выделенные желтым цветом, обозначают активированную экспрессию; числа, выделенные синим цветом, обозначают подавленную экспрессию; и оставленные пустыми ячейки обозначают изменения, которые не достигли уровня статистической значимости.

[0049] На фиг. 22 показана кривая выживаемости мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N).

[0050] На фиг. 23 показан график показателей веса тела у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N).

[0051] На фиг. 24A и фиг. 24B показаны уровни маркеров функции почек у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N). На фиг. 24A показана концентрация азота мочевины крови (BUN), а на фиг. 24B показана концентрация цистатина С в сыворотке крови.

[0052] На фиг. 25 показаны графики, демонстрирующие уровни C5a в моче (слева) и нормализованные уровни C5a (справа) у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N).

[0053] На фиг. 26 показан график, дающий количественную оценку содержания мембраноатакующего комплекса (MAC) в клубочках (C5b-9) по результатам иммунофлуоресцентного окрашивания у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N).

[0054] На фиг. 27A показан график (сверху), демонстрирующий инфильтрацию клубочков Gr-1⁺ нейтрофилами у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N), а также иммуногистохимическое окрашивание (внизу) в отношении Gr-1⁺ нейтрофилов в почечной ткани, полученной от мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N). На фиг. 27B показан график (сверху), демонстрирующий инфильтрацию интерстиция F4/80⁺ макрофагами у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N), а также иммуногистохимическое окрашивание (внизу) в отношении F4/80⁺ макрофагов в почечной ткани, полученной от мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N).

[0055] На фиг. 28 показаны графики, дающие количественную оценку размера клубочка (слева) и расширения мезангиального матрикса (справа; оцениваемого с помощью PAS) у мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем (WT + Ctl Ab), и гуманизированных по С3 мышей MAID 6149, обработанных изотипическим контролем (HumIn C3 + Ctl Ab) или антителом к C5 M1M17628N (HumIn C3 + M1M17628N).

[0056] На фиг. 29A, 29B и 29C показано, что обработка антителом к С5 ведет к значительному «освобождению» генной сигнатуры заболевания у гуманизированных по C3 мышей (MAID 6149). На фиг. 29A показано, что обработка антителом к C5 обеспечивала обращение сигнатурных генов заболевания у гуманизированных по C3 мышей. На фиг. 29B показано, что «освобожденная» сигнатура заболевания включала гены, связанные с иммунной системой, внеклеточным матриксом, цитокином, комплементом и метаболизмом. На фиг. 29C показано, что типичные маркеры иммунных клеток, экспрессия которых была повышена у гуманизированных по C3 мышей, как было показано, впоследствии ослабляется путем обработки антителом к C5.

[0057] На фиг. 30 показано, что непрерывное блокирование C5 продлевало выживаемость гуманизированных по C3 мышей MAID 6149.

[0058] На фиг. 31A-31C показано, что блокирование C3b также обеспечивает защиту у гуманизированных по C3 мышей MAID 6149. На фиг. 31A показано, что блокирующее антитело к C3b улучшало выживаемость гуманизированных по C3 мышей. На фиг. 31B-31C показано, что блокирующее антитело к C3b также улучшало вес тела у гуманизированных по C3 мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0059] Система комплемента является важным компонентом врожденной иммунной системы и играет важную роль в качестве защитного механизма от вторгающихся патогенов, стимулирует адаптивные иммунные ответы и способствует удалению иммунных комплексов и апоптотических клеток. Хотя система комплемента играет важную роль во многих защитных иммунных функциях, активация комплемента является существенным медиатором повреждения тканей при широком спектре процессов аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в том числе при связанных с комплементом нефропатиях.

[0060] В настоящем изобретении предусмотрены, среди прочего, отличные от человека животные, в сыворотке крови которых экспрессируются человеческие или гуманизированные белки С3. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что грызуны, гомозиготные по человеческому или гуманизированному гену C3, склонны иметь высокие показатели частоты спонтанной смерти и, кроме того, проявляют физиологические, морфологические и гистологические симптомы, которые весьма схожи с симптомами, наблюдаемыми при связанных с комплементом нефропатиях, характеризующихся патологическим накоплением белка C3 в почке, таких как, например, С3-гломерулопатия. Таким образом, считается, что отличные от человека животные, описанные в данном документе, представляют собой первый модельный организм, способный воспроизводить симптомы связанных с комплементом нефропатий, наблюдаемых у людей, и могут применяться для оценки терапевтической эффективности кандидатных соединений или средств для лечения данных нарушений. Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что у этих грызунов проявляются симптомы, согласующиеся с фиброзом печени. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены способы применения отличных от человека животных, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие человеческий или гуманизированный белок C3, для оценки in vivo терапевтической эффективности средств для применения в лечении связанной с комплементом нефропатии и/или фиброза печени.

I. Определения

[0061] Термин «связанная с комплементом нефропатия» или «связанный с комплементом нефроз», используемый в данном документе относится к повреждению, или заболеванию, или нарушению почки, в том числе к заболеваниям/нарушениям, ассоциированным с нежелательными активацией альтернативного пути комплемента и/или отложением продуктов активации комплемента, таких как без ограничения C3 и/или мембраноатакующий комплекс C5b-9, в почечной ткани, в частности, в нефроне и более конкретно в клубочке. В некоторых вариантах осуществления связанная с комплементом нефропатия включает одно или более состояний, известных как атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS) и/или С3-гломерулопатия (C3G), форма мембранопролиферативного гломерулонефрита, который включает болезнь плотного осадка (DDD) и C3-гломерулонефрит (C3GN).

[0062] Используемый в данном документе термин «грызун» относится к любому представителю таксономического отряда Rodentia. Примеры грызунов включают без ограничения мышей, крыс, белок, луговых собачек, дикобразов, бобров, морских свинок и хомяков. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу. В другом варианте осуществления грызун представляет собой мышь.

[0063] «Индивидуумом» или «субъектом» может быть позвоночное, млекопитающее или человек. Млекопитающие включают без ограничения сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных, приматов, мышей и крыс. Индивидуумы также включают животных-компаньонов, в том числе без ограничения собак и кошек. В одном аспекте индивидуумом является человек.

[0064] Термин «эффективное количество» относится к количеству терапевтического соединения, такого как терапевтическое средство против связанной с комплементом нефропатии, вводимому индивидууму либо в виде однократной дозы, либо в виде части серии доз, которое является эффективным для получения требуемого терапевтического или профилактического результата.

[0065] «Терапевтически эффективное количество» или «клинически эффективное количество» представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию, необходимую для демонстрации поддающегося измерению улучшения конкретного нарушения. Терапевтически эффективное количество, описанное в данном документе, может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес пациента, а также способность терапевтического средства вызывать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также может быть таким, при котором любые токсические или вредные эффекты терапевтического средства перевешиваются терапевтически полезными эффектами. В случае связанной с комплементом нефропатии терапевтически эффективное количество может усиливать или улучшать общее функционирование почек, предотвращать гибель клеток почек или улучшать или предотвращать повреждение клеток почек, клубочков или связанных с ними компонентов.

II. Связанные с комплементом нефропатии

A. C3 и система комплемента

[0066] Комплемент, важный компонент иммунной системы, состоит из более чем 30 циркулирующих и клеточных белков, которые вовлечены в три связанные биохимические каскады: классический, лектиновый и альтернативный пути. Функции комплемента заключаются в содействии иммунной системе разрушать вторгающиеся микроорганизмы, а также в поддержании гомеостаза тканей. Дефицит C3 у людей ассоциирован с повышенной восприимчивостью к бактериальным инфекциям. Однако избыточная или нерегулируемая активация комплемента способствует повреждению ткани и ассоциирована с рядом болезней, нарушений и состояний у человека, характеризующихся аномальной активацией комплемента.

[0067] Ген C3 кодирует сывороточный белок комплемента C3, который играет центральную роль в активации классического, лектинового и альтернативного путей активации комплемента. Ген C3 человека локализован на хромосоме 19 в участке 19p13.3-p13.2. Ген C3 человека содержит 41 экзон и кодирует полипептид-предшественник из 1663 аминокислот, включающих 22 аминокислоты сигнального пептида, 645 аминокислот β-цепи и 992 аминокислоты α-цепи. Во время активации комплемента α-цепь расщепляется с образованием тем самым 9 разных пептидов, в том числе белка C3a из 77 аминокислот, который является сильным провоспалительным анафилотоксином.

[0068] Ген C3 является консервативным у некоторых видов, в том числе приматов, например, шимпанзе, макаков-резус, других млекопитающих, например, собаки, коровы, грызуна, например, мыши, курицы, данио и лягушки. Ген C3 мыши локализован на хромосоме 17 в участке 17 29.72 сМ19. Ген C3 мыши содержит 41 экзон и кодирует полипептид-предшественник из 1663 аминокислот, включающих 24 аминокислоты сигнального пептида, 642 аминокислот β-цепи и 993 аминокислоты α-цепи. Аналогично человеку, активация комплемента у мыши приводит к расщеплению α-цепи с образованием тем самым 9 разных пептидов, в том числе C3a из 78 аминокислот, который является сильным провоспалительным анафилотоксином. Нокаутные по С3 мыши были получены согласно стандартным процедурам, известным из уровня техники (см., например, Drouin et al. (2001) Cutting edge: the absence of 3 demonstrates a role for complement in Th2 effector functions in a murine model of pulmonary allergy, J Immunology 167:4141-4144).

B. Специфические для почки C3-опосредованные связанные с комплементом заболевания

[0069] Некоторые связанные с комплементом нефропатии, как известно, предусматривают аномально высокие уровни отложения С3 в почке, в частности, в клубочке нефрона.

1. Атипичный HUS

[0070] Гемолитический уремический синдром (или гемолитико-уремический синдром), сокращенно HUS, представляет собой заболевание, характеризующееся гемолитической анемией (анемией, вызванной разрушением красных кровяных клеток), острой почечной недостаточностью (уремией) и низким количеством тромбоцитов (тромбоцитопенией). Преимущественно, но не исключительно, он поражает детей. Большинству случаев предшествует эпизод инфекционной, иногда кровавой, диареи, приобретенной как заболевание, обусловленное пищей или загрязненной водопроводной водой, вызванное E. coli O157:H7, другими не являющимися o157:H7 серотипами E. coli, Shigella и Campylobacter.

[0071] Несмотря на применение поддерживающей терапии, по оценкам 33-40% пациентов умрут или будут иметь заболевание почек последней стадии (ESRD) с первым клиническим проявлением aHUS, а 65% пациентов умрут, потребуют диализа или будут иметь постоянное почечное повреждение в течение первого года после постановки диагноза, несмотря на терапию плазмообмена или инфузии плазмы крови (PE/PI). Пациенты, которые выживают с имеющимися признаками и симптомами aHUS, переносят хроническое тромботическое и воспалительное состояние, что подвергает их повышенному риску внезапного свертывания крови, почечной недостаточности и других серьезных осложнений, включая преждевременную смерть, на протяжении всей жизни.

2. DDD, C3-гломерулонефрит и С3-гломерулопатия

[0072] Болезнь плотного осадка (DDD) является редким нарушение, характеризующимся накоплением больших количеств C3 в почечных клубочках. Данное состояние было названо вследствие наличия очень плотных отложений в клубочковой базальной мембране (GBM), наблюдаемых с помощью просвечивающей электронной микроскопии. В 2013 году в результате согласительного совещания ученые рекомендовали дать подгруппе DDD новое название: «С3-гломерулопатия» (C3G; Pickering et al., Kidney Intl., 2013, 84:1079-89). Появление данного нового термина было обусловлено признанием того, что существует иная группа пациентов, у которых наблюдается гломерулярное заболевание с биопсией почек, напоминающей DDD. У этих индивидуумов отложения С3 имеют более светлый цвет и более широкое распространение при наблюдении с помощью электронного микроскопа. Однако после иммунофлуоресцентной оценки, как и у пациентов с DDD, в почечных клубочках присутствует большое количество C3. Следовательно, этим пациентам в настоящее время ставят диагноз «C3-гломерулонефрит» или «C3GN». Признавая их симптоматическое сходство, как DDD, так и C3GN в настоящее время классифицируются как подтипы C3G.

III. Создание гуманизированных по C3 отличных от человека животных

[0073] Гуманизированных по C3 животных, используемых в способах, раскрытых в данном документе, можно получить с применением известных из уровня техники методик (см., в основном, «Gene Targeting: A Practical Approach», Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). В одном варианте осуществления получение мышей может необязательно предусматривать разрушение гена C3 мыши и введение гена, кодирующего человеческий или гуманизированный C3, в геном мыши. В одном варианте осуществления введение гена, кодирующего человеческий или гуманизированный C3, осуществляют в то же местоположение, где находится эндогенный ген C3 мыши.

[0074] Генетически модифицированные отличные от человека животные (гуманизированные по C3 животные), используемые в способах, раскрытых в данном документе, могут быть получены путем введения трансгенов в зародышевую линию животного. Эмбриональные целевые клетки на различных стадиях развития могут быть использованы для введения трансгенов. В зависимости от стадии развития эмбриональной целевой клетки используют различные способы. Конкретную(-е) линию(-и) любого животного, используемого в способах в соответствии с настоящим изобретением, отбирают по общему состоянию здоровья, хорошим показателям выхода эмбрионов, хорошей видимости пронуклеусов в эмбрионе и хорошему половому соответствию. При получении генетически модифицированных мышей часто используют такие линии, как C57BL/6 или C57BL/6×DBA/2 F1 или линии FVB (полученные коммерческим путем в компании Charles River Labs, Boston, Mass., The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me. или Taconic Labs.).

[0075] Введение трансгена в эмбрион может быть осуществлено любыми способами, известными из уровня техники, такими как, например, микроинъекция, электропорация или липофекция. Например, трансген(-ы) может(могут) быть введен(-ы) млекопитающему посредством микроинъекции конструкции в пронуклеусы оплодотворенной(-ых) половой клетки(-ок) млекопитающего с обеспечением сохранения одной или более копий конструкции в клетках развивающегося млекопитающего(-их). После введения трансгенной конструкции в оплодотворенную яйцеклетку ее можно инкубировать in vitro в течение различных периодов времени или повторно имплантировать суррогатному хозяину или осуществлять и то, и другое. Инкубация in vitro до созревания входит в объем настоящего изобретения. Один общепринятый способ заключается в инкубировании эмбрионов in vitro в течение приблизительно 1-7 дней в зависимости от вида с последующей их повторной имплантацией суррогатному хозяину.

[0076] Повторную имплантацию осуществляют с применением стандартных способов. Обычно суррогатного хозяина анестезируют и вводят эмбрионы в яйцевод. Количество эмбрионов, имплантированных конкретному хозяину, будет варьировать в зависимости от вида, но обычно будет сопоставимо с количеством потомства, которое виды дают в естественных условиях.

[0077] Инфицирование ретровирусом также можно использовать для введения трансгена в отличное от человека животное. Развивающийся отличный от человеческого эмбрион можно культивировать in vitro до стадии бластулы. В течение этого времени бластомеры могут быть мишенями для инфицирования ретровирусом (Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). Эффективное инфицирование бластомеров достигается путем ферментативной обработки с удалением прозрачной оболочки (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). Система на основе вирусного вектора, применяемая для введения трансгена, обычно представляет собой дефектный по репликации ретровирус, несущий трансген (Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152).

[0078] Третий тип клетки-мишени для введения трансгена представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку. Трансгены могут быть эффективно введены в ES-клетки путем трансфекции ДНК или путем опосредованной ретровирусом трансдукции. Такие трансформированные ES-клетки могут быть затем объединены с бластоцистами отличного от человека животного. После этого ES-клетки колонизируют эмбрион и способствуют образованию зародышевой линии получаемого в результате химерного животного.

[0079] Генетически модифицированные животные, содержащие гуманизированный С3, могут быть скрещены с другими животными. Способ получения заключается в создании серии млекопитающих, каждое из которых содержит одну из требуемых конструкций или один из требуемых трансгенов. Таких млекопитающих разводят вместе посредством осуществления серии скрещиваний, обратных скрещиваний и отборов, с получением в конечном итоге одного млекопитающего, содержащего все требуемые конструкции и/или трансгены, при этом млекопитающее в остальном является конгенным (генетически идентичным) дикому типу за исключением присутствия требуемых конструкций и/или трансгена(-ов). В одном варианте осуществления мышь, содержащую человеческий или гуманизированный ген C3, получают таким способом.

[0080] Как правило, скрещивание и обратное скрещивание осуществляется путем спаривания сиблингов или родительской линии с потомством в зависимости от цели каждой конкретной стадии в процессе размножения. В определенных случаях может потребоваться создание большого количества потомков для создания одного потомка, который содержит каждую из нокаутных конструкций и/или трансгенов в соответствующем хромосомном местоположении. Кроме того, может потребоваться осуществление скрещивания или обратного скрещивания на протяжении нескольких поколений для того, чтобы в конечном итоге получить требуемый генотип.

[0081] В одном аспекте предусмотрены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3, где грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок C3, содержит нормальную систему комплемента, т.e. уровни белков комплемента в крови, плазме или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок C3, подобны уровням белков комплемента в крови, плазме или сыворотке крови грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок C3. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0082] В одном аспекте предусмотрена плюрипотентная или тотипотентная клетка отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, содержащая генетическую модификацию, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку мыши. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку мыши.

[0083] В одном аспекте предусмотрена яйцеклетка отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, где яйцеклетка отличного от человека животного содержит эктопическую хромосому отличного от человека животного, где эктопическая хромосома отличного от человека животного содержит генетическую модификацию, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0084] В одном аспекте эмбрион, яйцеклетка или клетка мыши, которые генетически модифицируют с тем, чтобы они содержали ген C3 человека, получены от мыши, которая принадлежит линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BU6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В другом варианте осуществления мышь принадлежит линии 129, выбранной из группы, состоящей из линии, которая представляет собой 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, также см. Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь является гибридом вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь является гибридом вышеуказанных линий 129 или гибридом вышеуказанных линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 в гибриде представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии BALB, например, линии BALB/c. В еще одном варианте осуществления мышь представляет собой гибрид линии BALB и другой вышеуказанной линии. В одном варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии Swiss или Swiss Webster.

[0085] Дополнительную информацию, касающуюся гуманизированных по C3 грызунов и способов их получения, можно найти в публикации заявки на патент США №20150313194, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.

[0086] Таким образом, в данном документе предусмотрены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют белок C3, кодируемый гуманизированным геном C3, при этом человеческий или гуманизированный белок C3 у грызуна экспрессируется в его сыворотке крови. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу. Сыворотка крови грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок C3, может характеризоваться примерно таким же уровнем белка C3, как и у грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок C3, например, мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок C3 (hC3) в сыворотке крови в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от уровня белка C3, присутствующего в сыворотке крови мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок C3, но не характеризующейся заменой эндогенного гена C3 по эндогенному локусу C3 мыши геном C3 человека или его фрагментом.

[0087] В одном варианте осуществления грызун экспрессирует белок С3 человека в сыворотке крови в концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 5%, от приблизительно 3% до приблизительно 7%, от приблизительно 5% до приблизительно 15%, от приблизительно 10% до приблизительно 20%, от приблизительно 10% до приблизительно 200%, от приблизительно 20% до приблизительно 150% или от приблизительно 30% до приблизительно 100% от уровня белка C3 мыши, присутствующего в сыворотке крови мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок C3, но не характеризующейся заменой эндогенного гена C3 по эндогенному локусу C3 мыши геном C3 человека или его фрагментом.

[0088] В одном варианте осуществления грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок C3 в сыворотке крови в концентрации, составляющей от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 15 мкг/мл, от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 20 мкг/мл, от приблизительно 15 мкг/мл до приблизительно 30 мкг/мл, от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 40 мкг/мл, от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл, от приблизительно 50 мкг/мл до приблизительно 100 мкг/мл, от приблизительно 75 мкг/мл до приблизительно 125 мкг/мл, от приблизительно 100 мкг/мл до приблизительно 1500 мкг/мл, от приблизительно 100 мкг/мл до приблизительно 1500 мкг/мл, от приблизительно 200 мкг/мл до приблизительно 1250 мкг/мл или от приблизительно 300 мкг/мл до приблизительно 1000 мкг/мл. В другом варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок C3 в сыворотке крови в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл, 6 мкг/мл, 7 мкг/мл, 8 мкг/мл, 9 мкг/мл, 10 мкг/мл, 11 мкг/мл, 12 мкг/мл, 13 мкг/мл, 14 мкг/мл, 15 мкг/мл, 16 мкг/мл, 17 мкг/мл, 18 мкг/мл, 19 мкг/мл, 20 мкг/мл, 30 мкг/мл, 40 мкг/мл, 50 мкг/мл, 60 мкг/мл, 70 мкг/мл, 80 мкг/мл, 90 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл, 300 мкг/мл, 400 мкг/мл, 500 мкг/мл, 600 мкг/мл, 700 мкг/мл, 800 мкг/мл, 900 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 1250 мкг/мл или 1500 мкг/мл, включая значения и диапазоны, лежащие в пределах этих концентраций.

IV. Применение гуманизированных по C3 отличных от человека животных для идентификации или оценивания in vivo терапевтической эффективности средств, способных обеспечивать лечение связанных с комплементом нефропатий

A. Идентификация средств, которые облегчают связанную с комплементом нефропатию или фиброз печени

[0089] В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы 1) идентификации кандидатного средства (т.e. соединения или терапевтической молекулы) или 2) оценивания in vivo терапевтической эффективности кандидатного средства для применения в лечении связанной с комплементом нефропатии, такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия. В способе используют любые из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (например, мыши или крысы), раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления кандидатные соединения вводят непосредственно отличным от человека животным, у которых проявляются симптомы связанной с комплементом нефропатии, с определением того, может ли средство или соединение уменьшать один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии и/или фиброза печени. В других вариантах осуществления кандидатные соединения приводят в контакт с сывороткой крови, полученной от этих отличных от человека животных, и оценивают активность комплемента с применением любой общепринятой методики оценивания in vitro (такой как без ограничения анализы CH50).

[0090] В некоторых вариантах осуществления кандидатное соединение или средство может модулировать активацию комплемента путем снижения, уменьшения или подавления активации комплемента (такой как без ограничения активация альтернативного пути комплемента и/или активация опосредованного C3 пути комплемента) или расщепления и/или отложения белка С3 в почках или печени гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как грызуны, например, мыши или крысы), описанных в данном документе. Соединение или средство может снижать активацию комплемента или расщепление и/или отложение белка С3 у любого из отличных от человека животных, раскрытых в данном документе, на любую величину из приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством.

[0091] В другом варианте осуществления кандидатное соединение может снижать, уменьшать или подавлять активацию комплемента (такую как без ограничения активация альтернативного пути комплемента или активация опосредованного C3 пути комплемента) или расщепление и/или отложение белка С3 в почках или печени у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как грызуны, например, мыши или крысы), описанных в данном документе, в течение не более чем 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часов, 30 часов, 36 часов, 42 часов, 48 часов, 54 часов, 60 часов, 66 часов, 72 часов, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней или трех недель (включая любые периоды времени, лежащие в пределах этих значений).

[0092] Кандидатное соединение может дополнительно модулировать активацию комплемента в других вариантах осуществления путем увеличения, усиления или активации активности комплемента (такой как без ограничения активность альтернативного пути комплемента или активность опосредованного C3 пути комплемента) в почках или печени у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как грызуны, например, мыши или крысы), описанных в данном документе. Соединение может увеличивать активность комплемента у любого из грызунов, раскрытых в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством.

[0093] В другом варианте осуществления кандидатное соединение может увеличивать, усиливать или активировать активность комплемента (такую как без ограничения активность альтернативного пути комплемента или активность опосредованного C3 пути комплемента) в почках или печени у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как грызуны, например, мыши или крысы), описанных в данном документе, в течение не более чем 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часов, 30 часов, 36 часов, 42 часов, 48 часов, 54 часов, 60 часов, 66 часов, 72 часов, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней или трех недель (включая любые периоды времени, лежащие в пределах этих значений).

[0094] В других вариантах осуществления кандидатное средство или соединение обеспечивает облегчение или лечение одного или более симптомов связанной с комплементом нефропатии или фиброза печени у отличного от человека животного (такого как грызун, например, мышь или крыса) по сравнению с контрольным отличным от человека животным, которому не вводили кандидатное средство или соединение. Термины «облегчать» или «лечить», используемые в данном документе, если не указано иное, означают устранение, замедление проявления или снижение распространенности, частоты или тяжести одного или более симптомов, ассоциированных со связанной с комплементом нефропатией (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия) или фиброзом печени.

[0095] Одним или более симптомами связанной с комплементом нефропатии (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия) в некоторых вариантах осуществления может быть спонтанная смерть. Таким образом, кандидатное соединение или средство может снижать частоту возникновения спонтанной смерти у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как грызуны, например, мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством.

[0096] Как показано в примере 2 ниже, гомозиготные гуманизированные по C3 грызуны, описанные в данном документе, характеризуются сниженным весом (т.e. не способны нормально набирать вес), сниженными плотностью кости и/или содержанием минеральных веществ и/или сниженным содержанием жира в организме по сравнению с однопометниками дикого типа или грызунами, которые не экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одним или более симптомами связанной с комплементом нефропатии (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия), облегчаемыми с помощью кандидатного средства или соединения, являются один или более из сниженного веса, сниженной плотности кости или сниженного содержания жира в организме. Таким образом, кандидатное соединение или средство могут облегчать одно или более из низкого веса тела, сниженных плотности кости или содержания минеральных веществ и/или сниженного содержания жира в организме у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством. Определение потери или увеличения веса, плотности кости или содержания минеральных веществ и содержания жира в организме является рутинным и может быть осуществлено согласно способам, хорошо известным из уровня техники.

[0097] Кроме того, как описано в примере 4 ниже, гомозиготные гуманизированные по C3 грызуны, описанные в данном документе, характеризуются высокими уровнями отложения белка C3 в почке, в частности, в нефроне (например, в клубочке), по сравнению с однопометниками дикого типа или грызунами, которые не экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одним или более симптомами связанной с комплементом нефропатии (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия), облегчаемыми с помощью кандидатного средства или соединения, являются отложение белка С3 в почке. Таким образом, кандидатное соединение или средство может облегчать отложение белка С3 в почке у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством. Для определения отложения белка С3 в почке можно проводить анализ с помощью любого ряда способов, известных из уровня техники, в том числе без ограничения иммуногистохимического анализа, иммунофлуоресцентного анализа и электронной микроскопии (в том числе иммуноэлектронной микроскопии).

[0098] В примере 4 также показано повышенное отложение мембраноатакующего комплекса C5b-9 в клубочке почки у гуманизированных по C3 грызунов по сравнению с однопометниками дикого типа или грызунами, которые не экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3, что указывает на активированный путь комплемента. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одним или более симптомами связанной с комплементом нефропатии (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия), облегчаемыми с помощью кандидатного средства или соединения, являются повышенное образование мембраноатакующего комплекса C5b-9. Таким образом, кандидатное соединение или средство может облегчать образование мембраноатакующего комплекса C5b-9 у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством. Образование мембраноатакующего комплекса C5b-9 может быть определено с помощью любого ряда способов, известных из уровня техники, в том числе без ограничения иммуногистохимического анализа, иммунофлуоресцентного анализа (такого как с применением иммунофлуоресцентно меченного антитела к C9) и электронной микроскопии (в том числе иммуноэлектронной микроскопии).

[0099] Как показано в примере 3, гомозиготные гуманизированные по C3 грызуны, описанные в данном документе, характеризуются повышенными уровнями азота мочевины крови (BUN), липазы, цистатина и липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке и/или плазме крови по сравнению с однопометниками дикого типа или грызунами, которые не экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одним или более симптомами связанной с комплементом нефропатии (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия), облегчаемыми с помощью кандидатного средства или соединения, являются повышенные уровни BUN, липазы, цистатина и липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке и/или плазме крови. Таким образом, кандидатное соединение или средство может облегчать повышенные уровни BUN, липазы, цистатина и липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке и/или плазме крови у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством. Оценивание уровней BUN, липазы, цистатина и липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке и/или плазме крови можно осуществлять с применением любого ряда способов, хорошо известных из уровня техники.

[0100] В примере 3 дополнительно показано, что гомозиготные гуманизированные по C3 грызуны, описанные в данном документе, характеризуются повышенными концентрациями альбумина в моче по сравнению с однопометниками дикого типа или грызунами, которые не экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3. В примере 4 показано, что гомозиготные гуманизированные по C3 грызуны, описанные в данном документе, характеризуются повышенными уровнями C5a в моче по сравнению с однопометниками дикого типа или грызунами, которые не экспрессируют человеческий или гуманизированный белок C3. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одним или более симптомами связанной с комплементом нефропатии (такой как без ограничения aHUS, DDD, C3-гломерулонефрит и/или С3-гломерулопатия), облегчаемыми с помощью кандидатного средства или соединения, являются повышенные уровни альбумина и/или C5a в моче. Таким образом, кандидатное соединение или средство может облегчать повышенные уровни альбумина и/или C5a в моче у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством. Оценивание уровней альбумина в моче можно осуществлять с применением любого ряда способов, хорошо известных из уровня техники.

[0101] У гомозиготных гуманизированных по C3 грызунов, описанных в данном документе, дополнительно проявляются симптомы, соответствующие поражению печени или фиброзу. Фиброз представляет собой образование избыточной волокнистой соединительной ткани в органе или ткани в процессе репарации или реакции. Физиологически фиброз действует с отложением соединительной ткани, которая может ухудшать структуру и функцию соответствующего органа или ткани. Определяемый патологическим накоплением белков внеклеточного матрикса (ECM), фиброз приводит к образованию рубцов и утолщению пораженной ткани, по сути, он представляет собой патологически усиленную реакцию заживления ран, которая нарушает нормальную функцию органов. Фиброз печени часто называется циррозом и может быть вызван рядом состояний, таких как алкогольное заболевание печени (ALD), неалкогольный стеатогепатит (NASH), хронический гепатит C, хронический гепатит B, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, наследственный гемохроматоз, болезнь Вильсона, дефицит альфа-1-антитрипсина, галактоземия, болезнь накопления гликогена типа IV, кистозный фиброз или воздействие гепатотоксических лекарственных средств или токсинов, среди многих других.

[0102] В примере 3 дополнительно показано, что гомозиготные гуманизированные по C3 грызуны, описанные в данном документе, характеризуются повышенными уровнями ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) или щелочной фосфатазы (ALP). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одним или более симптомами фиброза печени, облегчаемыми с помощью кандидатного средства или соединения, являются повышенные уровни ALT, AST или ALP. Таким образом, кандидатное соединение или средство может облегчать повышенные уровни ALT, AST и/или ALP у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством. Оценивание уровней ферментов печени ALT, AST или ALP можно осуществлять с применением любого ряда способов, хорошо известных из уровня техники.

[0103] В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии или фиброза печени отражаются генной сигнатурой заболевания, т.е. генной сигнатурой, характерной для заболевания, т.е. связанной с комплементом нефропатии или фиброза печени. Генная сигнатура заболевания включает набор генов, которые дифференциально экспрессируются у субъекта (например, грызуна), имеющего заболевание, по сравнению с контрольными субъектами дикого типа без заболевания. Под выражением «дифференциально экспрессируется» подразумевается, что экспрессия сигнатурного гена является повышенной или пониженной по сравнению с экспрессией сигнатурного гена у контроля дикого типа без заболевания на по меньшей мере 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или больше. В некоторых вариантах осуществления генная сигнатура для связанного с комплементом фиброза печени включает один или более из генов, перечисленных на фиг. 17, или один или более из дифференциально экспрессируемых генов, перечисленных на фиг. 19. В некоторых вариантах осуществления генная сигнатура для связанной с комплементом нефропатии включает один или более из генов нефротоксичности, перечисленных на фиг. 21B, один или более из генов внеклеточного матрикса (ECM), перечисленных на фиг. 21C, один или более из генов цитокинов, перечисленных на фиг. 21D, один или более из генов хемокинов, перечисленных на фиг. 21E, или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления генная сигнатура для связанной с комплементом нефропатии и для фиброза печени включает один или более из генов, перечисленных на фиг. 29C, например, один или более из генов ECM, выбранных из группы, состоящей из Timp1, Spp1, Col13a1, Mmp14, Tgfbi, Mmp2, Col1a1 и Tnc; один или более из генов цитокинов и рецепторов, выбранных из группы, состоящей из Ccl22, Ccr1, Tnfsf8, Il1f6, Ccl5, Il1rn, Tlr1, Itgb2, Ccr2, C3ar1 и Fos; одну или более из молекул передачи иммунного сигнала, выбранных из группы, состоящей из Btla, Cd86, Cd3e, Icos, H2-Ab1, Cd14, Cd28, H2-Eb1, Tyrobp, Tlr8, Cd200r1, Itgam, Cd2, Cd84, Klrk1, C1qc, H2-Oa и H2-Aa; один или более из ассоциированных с T-клеткой генов, выбранных из группы, состоящей из Cd4, Cd3g, Lcp2, H2-Oa, H2-Aa, Cd247, Ptprc и Lck; один или более из генов комплемента и системы коагуляции, выбранных из группы, состоящей из C5ar1, Cfi, C3ar1, C6, C1qc, C7, C1qa, C1qb, серпина-1, F13a1 и Cfh; один или более из генов липидного метаболизма, выбранных из группы, состоящей из Cyp7b1, Akr1c188, Agps и Lpl. В некоторых вариантах осуществления генная сигнатура для связанной с комплементом нефропатии и для фиброза печени включает один или более типичных маркеров иммунных клеток, перечисленных на фиг. 29B, например, маркеров, выбранных из группы, состоящей из Ms4a1, Cd79a, Cd79b, Cd19, Cd3d, Cd3e, Cd3g, Cd8a, Cd8b1, Cd4, Foxp3, Prf1, Gzma, Kird1, Kirk1, Ncr1, Ccl22, Clec9a, Cd207, Adam23, Marco, Msr1, C1qb, Ms4a7, Cxcr2, Csf3r, Robo4, Tek, Tie1, Cdh5, Kdr, Esam, Tagln, Acta2, Fap и Tnc.

[0104] В некоторых вариантах осуществления один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии или фиброза печени оценивают с помощью определения экспрессии одного или более, например, множества или совокупности, сигнатурных генов заболевания. Кандидатное соединение можно оценивать по его способности облегчать, т.е. обращать полностью или частично, повышенную или сниженную экспрессию сигнатурных генов заболевания, как проиллюстрировано в примере 7. Например, кандидатное соединение или средство может облегчать повышенные или пониженные уровни экспрессии одного или более генов из совокупности, представляющей собой генную сигнатуру заболевания, у любого из гуманизированных по C3 отличных от человека животных (таких как мыши или крысы), описанных в данном документе, на любую величину из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с контрольными отличными от человека животными, которых не обрабатывали кандидатным соединением или средством.

B. Кандидатные средства или соединения

[0105] Кандидатные терапевтические средства или соединения могут представлять собой без ограничения низкомолекулярные химические соединения, антитела, белки, ингибиторные нуклеиновые кислоты или любую их комбинацию.

1. Антитела

[0106] В некоторых аспектах кандидатное средство или соединение связывается (например, предпочтительно связывается) с белком комплемента (таким как без ограничения C5, C3 или продукты их протеолитического расщепления (например, C3a или C3b)) и представляет собой антитело. Термины «антитело» и «антитела» относятся к полностью человеческим антителам, гуманизированным антителам, антителам, модифицированным последовательностями верблюжьих, химерным антителам, CDR-привитым антителам, одноцепочечным Fv (scFv), связанным дисульфидной связью Fv (sdFv), Fab-фрагментам, F(ab')-фрагментам и антигенсвязывающим фрагментам любого из вышеупомянутых. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулина и антигенсвязывающие активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт. Такие фрагменты могут быть или могут не быть слитыми с другим доменом иммуноглобулина, в том числе без ограничения с Fc-областью или ее фрагментом. Специалисту в данной области будет понятно, что можно получить другие продукты слияния, в том числе без ограничения продукты слияния scFv-Fc, продукты слияния вариабельной области (например, VL и VH)-Fc и продукты слияния scFv-scFv-Fc. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа, в том числе IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY, и любого класса, в том числе IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂), или любого подкласса. В некоторых вариантах осуществления антитела являются антагонистами C5 и/или C3 и могут снижать активацию комплемента (такую как активация альтернативного пути комплемента, например, в почке или печени). В других вариантах осуществления антитела являются агонистами C5 и/или C3 и могут увеличивать активацию комплемента.

[0107] Варианты антител также могут быть получены на основании информации, известной из уровня техники, без существенного влияния на активность антитела. Например, варианты антитела могут характеризоваться заменой по меньшей мере одного аминокислотного остатка в молекуле антитела другим остатком. У антител сайты, представляющие наибольший интерес для мутагенеза, предусматривающего замену, как правило, включают гипервариабельные области, но также предполагаются изменения каркасной области (FR).

[0108] Один тип замещенного варианта антител предусматривает замену одного или более остатков в гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(-ые) вариант(-ы), отобранный(-ые) для дальнейшей разработки, будет(будут) обладать улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, из которого он(они) получены. Удобный способ получения таких замещенных вариантов предусматривает созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов в гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации с образованием всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом антитела представляются на частицах нитчатого фага в виде продуктов слияния с генным продуктом М13, упакованных внутри каждой частицы. Представленные на фагах варианты затем подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, аффинности связывания), как раскрыто в данном документе. Для идентификации кандидатных для модификации сайтов в гипервариабельной области можно выполнять аланин-сканирующий мутагенез с идентификацией остатков в гипервариабельной области, вносящих значительный вклад в связывание антигена.

[0109] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела с вариантной аминокислотной последовательностью, можно получить с помощью ряда способов, известных из уровня техники. Эти способы включают без ограничения выделение из природного источника (в случае вариантов со встречающейся в природе аминокислотной последовательностью) или получение с помощью олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или невариантной версии антитела.

[0110] Может быть желательным введение одной или более аминокислотных модификаций в Fc-область полипептидов иммуноглобулина с получением тем самым варианта Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность Fc-области человека (например, Fc-области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более аминокислотных положениях, в том числе в положении, соответствующему цистеину в шарнирной области.

[0111] Варианты Fc-области с измененными (улучшенными или ослабленными) связыванием Clq и/или комплементзависимой цитотоксичностью (CDC) описаны в публикации международной заявки на патент №WO99/51642 (включенной в данный документ посредством ссылки). Такие варианты могут содержать аминокислотную замену в одном или более аминокислотных положениях Fc-области. См. также, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821 и публикацию международной заявки на патент №WO94/29351, касающиеся вариантов Fc-области, раскрытие каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.

2. Отличные от антитела связывающие полипептиды

[0112] В некоторых аспектах кандидатное соединение связывается (например, предпочтительно связывается) с белком комплемента (таким как C5, C3 или продукты их протеолитического расщепления (например, C3a или C3b)) и представляет собой отличный от антитела связывающий полипептид. В некоторых вариантах осуществления отличный от антитела связывающий полипептид является антагонистом C5 и/или C3 и может снижать активацию комплемента (такую как активация альтернативного пути комплемента, например, в почке или печени). В других вариантах осуществления отличный от антитела связывающий полипептид является агонистом C5 и/или C3 и может увеличивать активацию комплемента.

[0113] Связывающие полипептиды могут быть синтезированы химическим путем с использованием известной методики синтеза полипептидов или могут быть получены и очищены с использованием рекомбинантной технологии. Длина связывающих полипептидов обычно составляет по меньшей мере приблизительно 5 аминокислот, в качестве альтернативы длина составляет по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или больше, при этом такие связывающие полипептиды способны связываться с мишенью, такой как любой из белков комплемента (например, C5, C3, C3a или C3b), обсуждаемых в данном документе.

[0114] Связывающие полипептиды можно идентифицировать без лишних экспериментов с использованием хорошо известных методик. В этом отношении следует отметить, что методики для скрининга библиотек полипептидов в отношении связывающих полипептидов, которые способны связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны из уровня техники (см., например, патенты США №№5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публикации заявок согласно PCT №№WO 84/03506 и WO84/03564; Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., J. Immunol. Meth, 102:259-274 (1987); Clackson, T. et al., (1991) Nature, 352: 624; Kang, A. S. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, и Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668, раскрытие каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки).

[0115] Способы получения библиотек пептидов и скрининга в этих библиотеках также раскрыты в патентах США №№5723286, 5432018, 5580717, 5427908, 5498530, 5770434, 5734018, 5698426, 5763192 и 5723323, раскрытие каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

[0116] Связывающие полипептиды можно модифицировать с усилением их ингибиторного и/или терапевтического эффекта (в том числе, например, усиленная аффинность, улучшенные фармакокинетические свойства, такие как период полужизни, стабильность и скорость выведения, пониженная токсичность и т.д.). Такие модификации включают без ограничения гликозилирование, пегилирование, замену не встречающейся в природе, но функционально эквивалентной аминокислотой, связывающие группы и т.д

3. Низкомолекулярные химические соединения

[0117] В некоторых аспектах кандидатное соединение связывается (например, предпочтительно связывается) с белком комплемента (таким как C5, C3 или продукты их протеолитического расщепления (например, C3a или C3b)) и представляет собой малую молекулу. В некоторых вариантах осуществления малая молекула представляет собой C5 и/или C3 и может снижать активацию комплемента (такую как активация альтернативного пути комплемента, например, в почке или печени). В других вариантах осуществления малая молекула является агонистом C5 и/или C3 и может увеличивать активацию комплемента.

[0118] Малые молекулы предпочтительно представляют собой органические молекулы, отличные от связывающих полипептидов или антител, определенных в данном документе. Органические малые молекулы можно идентифицировать и синтезировать химическим путем с использованием известной методики (см., например, публикации заявок согласно РСТ №№WO 00/00823 и WO 00/39585). Размер органических малых молекул обычно составляет менее приблизительно 2000 дальтон, в качестве альтернативы размер составляет менее приблизительно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон, при этом такие органические малые молекулы, которые способны связываться с полипептидом, описанным в данном документе, можно идентифицировать без лишних экспериментов с использованием хорошо известных методик. В этом отношении следует отметить, что методики для скрининга библиотек органических малых молекул в отношении молекул, которые способны связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны из уровня техники (см., например, публикации заявок согласно РСТ №№WO 00/00823 и WO 00/39585).

[0119] Органические малые молекулы могут представлять собой, например, альдегиды, кетоны, оксимы, гидразоны, семикарбазоны, карбазиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, N-замещенные гидразины, гидразиды, спирты, простые эфиры, тиолы, тиоэфиры, дисульфиды, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, мочевины, карбаматы, карбонаты, кетали, тиокетали, ацетали, тиоацетали, арилгалогениды, арилсульфонаты, алкилгалогениды, алкилсульфонаты, ароматические соединения, гетероциклические соединения, анилины, алкены, алкины, диолы, аминоспирты, оксазолидины, оксазолины, тиазолидины, тиазолины, енамины, сульфонамиды, эпоксиды, азиридины, изоцианаты, сульфонилхлориды, диазосоединения, хлорангидриды или т.п.

[0120] В некоторых аспектах низкомолекулярное химическое соединение является компонентом комбинаторной химической библиотеки. Комбинаторные химические библиотеки представляют собой коллекцию множества видов химических соединений, состоящих из меньших субъединиц или мономеров. Комбинаторные библиотеки бывают разных размеров, варьирующих от нескольких сотен до множества сотен тысяч различных видов химических соединений. Существует также ряд типов библиотек, в том числе библиотек олигомеров и полимеров, состоящих из таких соединений, как углеводы, олигонуклеотиды и малые органические молекулы и т.д. Такие библиотеки имеют различные пути применения, такие как иммобилизация и хроматографическое разделение химических соединений, а также пути применения для идентификации и определения характеристик лигандов, способных связывать целевую молекулу (например, C5, C3, C3a или C3b) или опосредовать представляющую интерес биологическую активность (такую как без ограничения подавление или активация активности комплемента).

[0121] Из уровня техники известны различные методики синтеза библиотек соединений на твердофазных подложках. Твердофазные подложки, как правило, представляют собой полимерные объекты с поверхностями, которые функционализированы для связывания с субъединицами или мономерами с образованием соединений библиотеки. Синтез одной библиотеки, как правило, предусматривает обеспечение большого количества твердофазных подложек. Для получения комбинаторной библиотеки твердофазные подложки вводят в реакцию с одной или более субъединицами соединений и с использованием одного или большего количества реагентов с помощью предварительно определенной последовательности химических реакций с тщательным контролем. Другими словами, субъединицы библиотеки «выращивают» на твердофазных подложках. Чем больше библиотека, тем требуется большее количество реакций, что усложняет задачу отслеживания химического состава множества видов соединений, составляющих библиотеку. В некоторых вариантах осуществления размер малых молекул составляет менее приблизительно 2000 дальтон, в качестве альтернативы размер составляет менее приблизительно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон.

[0122] Низкомолекулярные средства, описанные в любом из аспектов данного документа, могут быть получены с помощью любого типа химической реакции, которая может быть проведена на твердой подложке. Такие химические реакции включают без ограничения реакции 2+2 циклоприсоединения, включающие захват бутадиена; реакции [2+3] циклоприсоединения, включающие синтез изоксазолинов, фуранов и модифицированных пептидов; образование ацеталя, включающее иммобилизацию диолов, альдегидов и кетонов; альдольную конденсацию, включающую дериватизацию альдегидов, синтез пропандиолов; бензоиновую конденсацию, включающую дериватизацию альдегидов; реакции циклоконденсации, включающие бензодиазепины и гидантоины, тиазолидины, миметики превращения, порфирины, фталоцианины; циклизацию Дикмана, включающую циклизицию сложных диэфиров; реакцию Дильса-Альдера, включающую дериватизацию акриловой кислоты; электрофильное присоединение, включающее присоединение спиртов к алкенам; реакцию Гриньяра, включающую дериватизацию альдегидов; реакцию Гека, включающую синтез дизамещенных алкенов; реакцию Генри, включающую синтез нитрилоксидов in situ (см. 2+3 циклоприсоединение); каталитическое гидрирование, включающее синтез феромонов и пептидов (гидрирование алкенов); реакцию Михаэля, включающую синтез сульфанилкетонов, бицикло[2.2.2]октанов; реакцию Мицунобу, включающую синтез арильных эфиров, пептидилфосфонатов и тиоэфиров; реакции нуклеофильного ароматического замещения, включающие синтез хинолонов; окисление, включающее синтез альдегидов и кетонов; циклоприсоединение Паузена-Ханда, включающее циклизацию норборнадиена с пентинолом; фотохимическую циклизацию, включающую синтез гелиценов; реакции с металлоорганическими соединениями, включающие дериватизацию альдегидов и ацилхлоридов; восстановление сложными гидридами и соединениями олова, включающее восстановление карбонильных групп, групп карбоновых кислот, сложноэфирных и нитрогрупп; реакцию Соаи, включающую восстановление карбоксильных групп; реакции Стилла, включающие синтез производных бифенила; реакцию Сторка, включающую синтез замещенных циклогексанонов; восстановительное аминирование, включающее синтез хинолонов; реакцию Сузуки, включающую синтез производных фенилуксусной кислоты; и реакции Виттига-Хорнера, включающие реакции альдегидов, феромонов и сульфанилкетонов.

[0123] Литературные источники, раскрывающие синтез химических библиотек, а также деконволюцию отдельных соединений из этих библиотек на отдельных твердофазных подложках, можно найти в заявке на патент США №2009/0032592; Needels et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-10704; и публикации заявки согласно PCT №WO97/15390, раскрытие которых включено в данный документ посредством ссылки.

4. Ингибиторные нуклеиновые кислоты

[0124] В одном аспекте настоящего изобретения кандидатное модулирующее комплемент соединение представляет собой один или более олигонуклеотидов, нацеленных на компонент (такой как мРНК) системы комплемента. Ингибиторная нуклеиновая кислота может представлять собой без ограничения любое из антисмыслового олигонуклеотида, малой ингибиторной РНК (siRNA) или рибозима.

[0125] Олигонуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой мРНК, кодирующую белковый компонент системы комплемента. Олигонуклеотиды будут связываться с мРНК и нарушать их функции, либо за счет опосредования их разрушения, либо за счет предотвращения их трансляции в белки. Абсолютная комплементарность не требуется, хотя и является предпочтительной. Олигонуклеотидная последовательность, «комплементарная» части РНК, как указано в данном документе, означает последовательность, характеризующуюся достаточной комплементарностью для обеспечения возможности гибридизации с РНК с образованием стабильного дуплекса. Способность гибридизации будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины олигонуклеотида. Как правило, чем длиннее гибридизирующаяся нуклеиновая кислота, тем больше оснований, не соответствующих РНК, она может содержать, и при этом образовывать стабильный дуплекс. Специалисты в данной области могут установить допустимую степень несоответствия, используя стандартные процедуры для определения точки плавления образованного посредством гибридизации комплекса.

[0126] В целом, комплементарные олигонуклеотиды, полученные для гибридизации с мРНК, кодирующими белки системы комплемента, нацелены на любую область мРНК, в том числе на 5'-нетранслируемую область мРНК, на область, комплементарную стартовому кодону AUG или на 3'-нетранслируемую область.

[0127] Олигонуклеотиды могут иметь чередующиеся межнуклеозидные связи, такие как без ограничения фосфотиоат (Mag at al., Nucleic Acids Res. 19:1437-1441, 1991; и патент США №5644048), пептидо-нуклеиновую кислоту или PNA (Egholm, Nature, 3685:566-568, 1993; и патент США №6656687), фосфорамид (Beaucage, Methods Mol. Biol. 20:33-61, 1993), фосфодитиоат (Capaldi et al., Nucleic Acids Res., 28:E40, 2000). Другие олигонуклеотидные аналоги включают такие как без ограничения морфолино (Summerton, Biochim. Biophys. Acta., 1489:141-158, 1999), «запертые» олигонуклеотиды (Wahlestedt wt al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:5633-5638, 2000), пептидо-нуклеиновые кислоты или PNA (Nielsen et al., 1993; Hyrup and Nielsen, 1996) или олигонуклеотиды, модифицированные на 5'- и 3'-конце 2-o-(2-метоксил)этилом (McKay et al., J. Biol. Chem., 274:1715-1722, 1999). Все из данных литературных источников явным образом включены в данный документ посредством ссылки. Нуклеиновые кислоты могут содержать любую комбинацию дезоксирибо- и рибонуклеотидов, а также любую комбинацию оснований, в том числе урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин, изогуанин и т.д.

[0128] Комплементарные олигонуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением могут содержать по меньшей мере один фрагмент, представляющий собой модифицированное основание, которое выбрано из группы, включающей без ограничения 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеуозин, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-N2-карбоксипропил)урацил, (acp3)w и 2,6-диаминопурин.

[0129] Комплементарные олигонуклеотиды также могут содержать по меньшей мере один фрагмент, представляющий собой модифицированный сахар, выбранный из группы, включающей без ограничения арабинозу, 2-фторарабинозу, ксилулозу и гексозу.

[0130] Длина комплементарных олигонуклеотидов должна составлять по меньшей мере десять нуклеотидов и может варьировать от 10 до приблизительно 50 нуклеотидов, например, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов.

V. Лечение связанных с комплементом нефропатий

[0131] В данном документе дополнительно предусмотрены способы лечения одной или более связанных с комплементом нефропатий (таких как без ограничения атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS) или С3-гломерулопатия (C3G; такая как болезнь плотного осадка (DDD) или C3-гломерулонефрит (C3GN)). Как проиллюстрировано в примерах 6-7, обработка гуманизированных по C3 мышей, у которых проявляются один или более симптомов связанных с комплементом нефропатий, клинически эффективным количеством терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, может приводить к улучшению выживаемости и функции почек, снижению гистологических признаков повреждения почки и клубочков, ассоциированного со связанными с комплементом нефропатиями, и полному или частичному обращению экспрессии сигнатурных генов заболевания. Кроме того, как проиллюстрировано в примере 9, обработка гуманизированных по C3 мышей, у которых проявляются один или более симптомов связанных с комплементом нефропатий, клинически эффективным количеством терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C3 или активность продуктов его протеолитического расщепления (C3a или C3b), также может приводить к улучшению выживаемости.

[0132] Как используется в данном документе, «терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5» относится к любому средству, способному подавлять биологическую функцию или активность фактора 5 комплемента (C5). Оно включает средства, вещества или соединения, которые препятствуют функционированию белка C5, как это обычно происходит в пути комплемента, предотвращают экспрессию гена C5, предотвращают процессирование пре-РНК C5 в зрелую мРНК, предотвращают трансляцию мРНК C5 в полипептид C5, предотвращают посттрансляционную модификацию или процессирование полипептида C5, необходимые для его нормального физиологического функционирования, и/или блокируют активность белка C5 или препятствуют ей.

[0133] Как используется в данном документе, «терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C3» относится к любому средству, способному подавлять биологическую функцию или активность фактора 3 комплемента (C3). Оно включает средства, вещества или соединения, которые препятствуют функционированию белка C3, как это обычно происходит в пути комплемента, предотвращают экспрессию гена C3, предотвращают процессирование пре-РНК C3 в зрелую мРНК, предотвращают трансляцию мРНК C3 в полипептид C3, предотвращают посттрансляционную модификацию или процессирование полипептида C3, необходимые для его нормального физиологического функционирования, и/или блокируют активность белка C3 или препятствуют ей.

[0134] «Терапевтическое средство, которое подавляет активность C3a или C3b» относится к любому средству, способному подавлять биологическую функцию или активность C3a или C3b.

[0135] В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой одно или более из ингибиторной нуклеиновой кислоты, отличного от антитела связывающего полипептида или низкомолекулярного химического соединения, такого как любое из антител, ингибиторных нуклеиновых кислот (таких как без ограничения антисмысловой олигонуклеотид, siRNA, microRNA (miR) или рибозим) или отличных от антитела связывающих полипептидов, обсуждаемых в данном документе.

[0136] В других вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело или его функциональный фрагмент (такие как без ограничения моноклональное антитело поликлональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, антитело, модифицированное последовательностями верблюжьих, химерное антитело, CDR-привитое антитело, одноцепочечный Fv (scFv), связанный дисульфидной связью Fv (sdFv), Fab-фрагмент или F(ab')-фрагмент). Антитело можно вводить индивидууму ежедневно, через день, каждые три дня, каждые четыре дня, каждые пять дней, каждые шесть дней, один раз в неделю или один раз в две недели. В некоторых случаях индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, можно вводить от приблизительно 40мг/кг до приблизительно 60 мг/кг антитела (например, любое количество из приблизительно 40 мг/кг, 41 мг/кг, 42 мг/кг, 43 мг/кг, 44 мг/кг, 45 мг/кг, 46 мг/кг, 47 мг/кг, 48 мг/кг, 49 мг/кг, 50 мг/кг, 51 мг/кг, 52 мг/кг, 53 мг/кг, 54 мг/кг, 55 мг/кг, 56 мг/кг, 57 мг/кг, 58 мг/кг, 59 мг/кг, 60 мг/кг или больше). Введение антитела можно осуществлять посредством любых способов, известных из уровня техники, в том числе без ограничения посредством инъекции, артериальной доставки, инсуфляции, приема внутрь или суппозитория. Терапия с применением антитела к C5 может продолжаться в течение 8-56 недель (например, в течение любого периода из приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 56 недель), 1-5 лет или в течение неопределенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления антитела к C5, подходящие для применения в любых терапевтических способах, раскрытых в данном документе, могут быть получены с применением известных способов, например, описанных в заявке на патент США №15/621689, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления антитела к C3, антитела к C3a или антитела к C3b, подходящие для применения в любых терапевтических способах, раскрытых в данном документе, могут быть получены с применением известных способов.

[0137] В данном документе предусмотрены способы улучшения функции почек у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия. Способ предусматривает введение клинически эффективного количества терапевтического средства, такого как любое из терапевтических средств, описанных выше. Введение терапевтического средства приводит к улучшенной функции почек по сравнению с индивидуумами, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления улучшенная функция почек может быть показана в виде сниженных уровней азота мочевины крови (BUN). Конкретно, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к снижению уровней BUN на приблизительно 10-50% (например, снижению уровней BUN на любую величину из приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50%) по сравнению с уровнями BUN у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. Измерение BUN является рутинным в данной области техники и может быть выполнено любыми известными способами.

[0138] В других вариантах осуществления улучшенная функция почек может быть показана в виде пониженной концентрации цистатина С в сыворотке крови. Например, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к снижению концентрации цистатина С в сыворотке крови на приблизительно 10-60% (например, снижению концентрации цистатина С в сыворотке крови на любую величину из приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или 60%) по сравнению с концентрацией цистатина С в сыворотке крови у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. Измерение концентрации цистатина С в сыворотке крови является рутинным в данной области техники и может быть выполнено любыми известными способами.

[0139] В дополнительных вариантах осуществления улучшенная функция почек может быть показана в виде пониженной концентрации C5a в моче. Конкретно, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к снижению концентрации C5α в моче на приблизительно 40-85% (например, снижению концентрации C5a в моче на любую величину из приблизительно 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 56%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% или 85%) по сравнению с концентрацией C5a в моче у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. Измерение концентрации C5a в моче является рутинным в данной области техники и может быть выполнено любыми известными способами.

[0140] Также в данном документе предусмотрены способы уменьшения образования мембраноатакующего комплекса (MAC) в клубочках у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия. Способ предусматривает введение клинически эффективного количества терапевтического средства, такого как любое из терапевтических средств, описанных выше. Введение терапевтического средства приводит к уменьшенному образованию MAC в клубочках по сравнению с образованием MAC в клубочках у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. Например, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к уменьшению образования MAC на приблизительно 5-20% (например, уменьшению образования MAC на любую величину из приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%) по сравнению с образованием MAC у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. Измерение образования MAC является рутинным в данной области техники и может быть выполнено любыми известными способами (такими как без ограничения иммуногистохимическое окрашивание компонента C9 в MAC в клубочковых пучках в почечной ткани от индивидуума).

[0141] В данном документе дополнительно предусмотрены способы уменьшения инфильтрации клубочка или интерстиция почки иммунными клетками у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия. Способ предусматривает необходимость введения клинически эффективного количества терапевтического средства, такого как любое из терапевтических средств, описанных выше. Введение терапевтического средства приводит к уменьшенной инфильтрации почек иммунными клетками у индивидуума по сравнению с инфильтрацией почек иммунными клетками у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой нейтрофил, который инфильтрирует клубочек. Иммунная клетка также может представлять собой макрофаг, который инфильтрирует интерстиций. Например, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к уменьшению инфильтрации клубочка нейтрофилами на приблизительно 50-100% (например, уменьшению инфильтрации клубочка нейтрофилами на любую величину из приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 56%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) по сравнению с инфильтрацией клубочка нейтрофилами в почках у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. В качестве другого примера, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к уменьшению инфильтрации интерстиция макрофагами на приблизительно 30-70% (например, уменьшению инфильтрации интерстиция макрофагами на любую величину из приблизительно 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 56%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%) по сравнению с инфильтрацией интерстиция макрофагами в почках у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. Измерение инфильтрации иммунными клетками является общеизвестным из уровня техники и может быть выполнено любыми известными способами (такими как без ограничения иммуногистохимическое окрашивание в отношении Gr-1 на поверхности нейтрофилов или окрашивание в отношении F4/80 на поверхности макрофагов).

[0142] В данном документе дополнительно предусмотрены способы уменьшения размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса в почке у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия. Способ предусматривает введение клинически эффективного количества терапевтического средства, такого как любое из терапевтических средств, описанных выше. Введение терапевтического средства приводит к уменьшению размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса по сравнению с размером клубочка и/или расширения мезангиального матрикса в почках у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. Конкретно, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к уменьшению размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса на приблизительно 15-30% (например, уменьшению размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса на любую величину из приблизительно 15%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% или 30%) по сравнению с размером клубочка и/или расширения мезангиального матрикса у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5. Измерение размера клубочка и/или расширения мезангиального матрикса является рутинным в данной области техники и может быть выполнено любыми известными способами (такими как окрашивание и световая микроскопия ткани почки, полученной от индивидуума).

[0143] Также в данном документе предусмотрены способы увеличения продолжительности жизни индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия. Способ предусматривает введение клинически эффективного количества терапевтического средства, такого как любое из терапевтических средств, описанных выше. Введение терапевтического средства приводит к увеличению продолжительности жизни по сравнению с продолжительности жизни у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. Конкретно, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к увеличению продолжительности жизни на приблизительно 10-70% (например, к увеличению продолжительности жизни на любую величину из приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 56%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%) по сравнению с продолжительностью жизни у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5.

[0144] В данном документе дополнительно предусмотрены способы уменьшения потери веса у индивидуума, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия. Способ предусматривает введение клинически эффективного количества терапевтического средства, такого как любое из терапевтических средств, описанных выше. Введение терапевтического средства приводит к уменьшению потери веса по сравнению с потерей веса у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство. Конкретно, введение клинически эффективного количества терапевтического средства, которое подавляет экспрессию или активность C5, индивидууму, у которого диагностирована или предположительно имеется связанная с комплементом нефропатия, может приводить к уменьшению потери веса на приблизительно 10-70% (например, уменьшению потери веса на любую величину из приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 56%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%) по сравнению с потерей веса у индивидуумов, у которых диагностирована связанная с комплементом нефропатия, которым не вводили терапевтическое средство, которое подавляет экспрессию или активность C5.

[0145] Дополнительное понимание способов, раскрытых в данном документе, может быть обеспечено со ссылкой на следующие примеры, которые представлены с целью иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Замена эндогенного гена C3 мыши геном C3 человека

(I) Создание мышей MAID 6149 HO и MAID 6156 HO

[0146] Мыши MAID 6149 - замена промотором и кодирующими экзонами 1-41 C3 человека. Геном C3 человека, содержащим 5'-регуляторные элементы и все из кодирующих экзонов 1-41 гена C3 человека, заменяли локус гена C3 мыши, охватывающий 5'-регуляторные элементы и все из кодирующих экзонов 1-41 (фиг. 1A).

[0147] Предварительно в ES-клетках мыши осуществляли целенаправленную делецию мышиного гена C3 размером 25 т.о. путем замены кодирующих экзонов 2-41 и включения 900 п.о. 3'-участка относительно сайта полиаденилирования с помощью фланкированной loxP кассеты с геном устойчивости к неомицину. Полученные в результате ES-клетки мыши, ES-клетки 12132, являются гетерозиготными по нокауту С3. Клетки 12132 использовали для получения нокаутных по С3 мышей в соответствии с процедурами, известными из уровня техники.

[0148] Создавали конструкцию для целенаправленного воздействия, содержащую гомологичные плечи, соответствующие участкам, расположенным в 5'-направлении и в 3'-направлении от C3 мыши, которыми фланкирована последовательность C3 человека, охватывающая 5'-регуляторные элементы, расположенные в 5'-направлении от кодирующего экзона 1 - кодирующего экзона 41, и 3'-нетранслируемую область, и фланкированная loxP кассета с селектируемым геном устойчивости к гигромицину, и электропорировали в ES-клетки 12132. Подвергшиеся корректному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 6148) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым геном устойчивости к лекарственному средству. Клоны подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток без кассеты устойчивости к лекарственному средству (MAID 6149) вводили в эмбрион мыши на стадии 8 клеток. Мышей F0, полностью произошедших от донорной ES-клетки, несущих гуманизированный ген C3, идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения аллеля человека с использованием модифицированного анализа аллелей (см. Valenzuela et al. (2003)). Мыши MAID 6149 содержат приблизительно 53,4 т.о. последовательности человека, включающей в себя приблизительно 9 т.о. в 5'-направлении от экзона 1 C3 человека, целый ген C3 человека из приблизительно 42,8 т.о. и приблизительно 1,5 т.о. последовательности человека в 3'-направлении от сигнала polyA; и этой последовательностью человека из 53,4 т.о. заменяли приблизительно 30,6 т.о. последовательности мыши, включающей в себя приблизительно 6,5 т.о. последовательности мыши в 5'-направлении от экзона 1 C3 мыши и ген C3 мыши из приблизительно 24,1 т.о. от начала экзона 1 до стоп-кодона.

[0149] Для подтверждения того, что фланкированная loxP кассета с геном устойчивости к неомицину заменила делетированную последовательность гена C3 мыши в нокаутных по С3 ES-клетках 12132, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): 12132TU, интрон 1 C3 мыши: прямой праймер, GGCCTGATTA CATGGACCTG TC (SEQ ID NO:1); обратный праймер, CCCAGGCTTG GCTGGAATG (SEQ ID NO:2); зонд, FAM-TGTCCACTCT GGAAGCCCAG GC-BHQ (SEQ ID NO:3); 12132TD, 3'-участок от экзона 41 C3 мыши: прямой праймер, GCCAGGAGAG GAAGCTGGAG (SEQ ID NO:4); обратный праймер, TGGCTCAGCA GTAAAGAACA C (SEQ ID NO:5); зонд, FAM-ACAGATTGCT GTGAGCTGCC CAAA-BHQ (SEQ ID NO:6); кассета с геном устойчивости к неомицину: прямой праймер, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (SEQ ID NO:7); обратный праймер, GAACACGGCG GCATCAG (SEQ ID NO:8); зонд, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (SEQ ID NO:9).

[0150] Для подтверждения того, что последовательность гена C3 человека заменила делетированную последовательность гена C3 мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): mC3-1, промотор C3 мыши: прямой праймер, GCCAGCCTAG CCTACTTCA (SEQ ID NO:10); обратный праймер, GCCACCCATC CCAGTTCT (SEQ ID NO:11); зонд, FAM-CAGCCCAGGC CCTTTAGATT GCA-BHQ (SEQ ID NO:12); mC3-2, 3'-нетранслируемая область C3 мыши, прямой праймер, TACGGTGTTA GGTTCACTAT TGGT (SEQ ID NO:13); обратный праймер, GTCGCCAGCA GTCTCATACA G (SEQ ID NO:14); зонд, CAL оранжевый-AGTGGGCATC CCTTGCCAGG C-BHQ (SEQ ID NO:26); кассета с геном устойчивости к гигромицину: прямой праймер, TGCGGCCGAT CTTAGCC (SEQ ID NO:15); обратный праймер, TTGACCGATT CCTTGCGG (SEQ ID NO:16); зонд, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (SEQ ID NO:27); hC3-1, промотор C3 человека: прямой праймер, GGGCCTCCTA AGTTTGTTGA GTATC (SEQ ID NO:17); обратный праймер, CAGGGCTGGT TCCCTAGAAA TC (SEQ ID NO:18); зонд, FAM-TACAATAGCA GGCACAGCAC CCA-BHQ (SEQ ID NO:19); hC3-2, интрон 1 C3 человека: прямой праймер, GGCTGAGAGT GGGAGTCATG (SEQ ID NO:20); обратный праймер, GCACTTGCCA ATGCCATTAT C (SEQ ID NO:21); зонд, FAM-CTGCTGTCCT GCCCATGTGG TTG-BHQ (SEQ ID NO:22); hC3-3, экзон 41 C3 человека: прямой праймер, CGAATGCCAA GACGAAGAGA AC (SEQ ID NO:23); обратный праймер, GGGCACCCAA AGACAACCAT (SEQ ID NO:24); зонд, CAL оранжевый-CAGAAACAAT GCCAGGACCT CGGC-BHQ (SEQ ID NO:25).

[0151] Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, очищенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по C3 и подтверждения того, что гуманизированный аллель C3 передался в зародышевой линии. Два гетерозиготных по замене потомка скрещивали с получением мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена C3 мыши геном C3 человека. Гомозиготных по замене потомков использовали для фенотипирования.

[0152] Последовательности участка соединения локуса C3 мыши и последовательности, содержащей ген C3 человека, участка соединения последовательности, содержащей ген C3 человека, и фланкированной loxP кассеты с селектируемым геном устойчивости к гигромицину, и участка соединения последовательности фланкированной loxP кассеты с селектируемым геном устойчивости к гигромицину и локуса C3 мыши определяли, как описано выше в публикации заявки на патент США №20150313194, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.

[0153] Мыши MAID 6156 - замена кодирующими экзонами 2-41 С3 человека. Геном C3 человека, содержащим кодирующие экзоны 2-41 гена C3 человека, заменяли локус гена C3 мыши, охватывающий кодирующие экзоны 2-41. Способы, описанные выше, в основном использовали для осуществления замены последовательностей гена C3 мыши последовательностями гена C3 человека (фиг. 1B).

[0154] Предварительно в ES-клетках мыши осуществляли целенаправленную делецию мышиного гена C3 размером 25 т.о. путем замены кодирующих экзонов 2-41 и включения 900 п.о. 3'-участка относительно сайта полиаденилирования с помощью фланкированной loxP кассеты с геном устойчивости к неомицину. Полученные в результате ES-клетки мыши, ES-клетки 12132, являются гетерозиготными по нокауту С3.

[0155] Создавали конструкцию для целенаправленного воздействия, содержащую гомологичные плечи, соответствующие участкам, расположенным в 5'-направлении и в 3'-направлении от C3 мыши, которыми фланкирована последовательность C3 человека, охватывающая участок, расположенный в 5'-направлении от кодирующего экзона 2 - кодирующего экзона 41, и 3'-нетранслируемую область, и фланкированная loxP кассета с селектируемым геном устойчивости к гигромицину, и электропорировали в ES-клетки 12132. Подвергшиеся корректному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 6155) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым геном устойчивости к лекарственному средству. Клоны подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток без кассеты устойчивости к лекарственному средству (MAID 6156) вводили в эмбрион мыши на стадии 8 клеток. Мышей F0, полностью произошедших от донорной ES-клетки, несущих гуманизированный ген C3, идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения аллеля человека, как описано выше.

[0156] Для подтверждения того, что фланкированная loxP кассета с геном устойчивости к неомицину заменила делетированную последовательность гена C3 мыши в нокаутных по С3 ES-клетках 12132, и что последовательность гена C3 человека заменила делетированную последовательность гена C3 мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали те же наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца), описанные выше для мышей MAID 6149.

[0157] Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, очищенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по C3 и подтверждения того, что гуманизированный аллель C3 передался в зародышевой линии. Два гетерозиготных по замене потомка скрещивали с получением мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена C3 мыши геном C3 человека. Гомозиготных по замене потомков использовали для фенотипирования.

[0158] Последовательности участка соединения локуса C3 мыши и последовательности, содержащей ген C3 человека, участка соединения последовательности, содержащей ген C3 человека, и фланкированной loxP кассеты с селектируемым геном устойчивости к гигромицину, и участка соединения последовательности фланкированной loxP кассеты с селектируемым геном устойчивости к гигромицину и локуса C3 мыши определяли, как описано выше.

(II) Анализы концентрации C3 в сыворотке крови

[0159] Концентрации C3 в сыворотке крови анализировали у мышей MAID 6149 и мышей MAID 6156 с помощью ELISA и вестерн-блоттинга. Вкратце, анализ посредством вестерн-блоттинга выполняли следующим образом: мышиную сыворотку крови или нормальную сыворотку крови человека (NHS) разбавляли в PBS. Очищенный белок C3b человека (Calbiochem) использовали в качестве положительного контроля. Не содержащую C3 сыворотку крови мыши использовали в качестве отрицательного контроля. Сыворотку крови или очищенный белок hC3 добавляли в буфер для загрузки образцов для электрофореза, содержащий меркаптоэтанол и SDS, и прогоняли на полиакриламидном геле в условиях восстановления/денатурирования, затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Блоты блокировали, затем зондировали поликлональным первичным козьим антителом к С3 мыши (Abnova) или поликлональной козьей антисывороткой к С3 человека (Quidel) с последующим выявлением с помощью ослиного антитела к IgG козы, конъюгированного с HRP (Santa Cruz). Для проявления блота использовали хемилюминесцентный субстрат ThermoScientific Super Signal West Pico. Для визуализации использовали GE Image Quant LAS4000. Концентрации С3 в сыворотке крови определяли с помощью набора для ELISA C3 комплемента человека и набора для ELISA C3 комплемента мыши (Abcam) в соответствии с указаниями производителя. Уровни белка анализировали с помощью ELISA следующим образом. C3 мыши и человека измеряли соответственно с помощью набора для ELISA C3 комплемента мыши (Abcam) и набора для ELISA C3 комплемента человека (Abcam) в соответствии с указаниями производителя. C3a человека измеряли с помощью набора для ELISA C3a человека BD OptEIA™ (BD Biosciences). C3a мыши измеряли с использованием следующих реагентов от BD Biosciences: очищенное антитело крысы к C3a мыши, конъюгированное с биотином антитело крысы к C3a мыши и очищенный белок C3a мыши (нативный) в соответствии с указаниями производителя.

[0160] Как показано на фиг. 2, анализы ELISA показали, что как C3 мыши (фиг. 2A), так и C3a мыши (фиг. 2B) не выявлялись в сыворотке крови, а также плазме крови, полученных от гомозиготных мышей 6156 и гомозиготных мышей 6149 в возрасте шести и 10 недель по сравнению с контролями дикого типа. В отличие от этого, на фиг. 3 показано, что C3 человека (фиг. 3A), а также C3a человека (фиг. 3B) выявлялись в плазме крови и сыворотке крови, полученных от гомозиготных мышей 6156 и гомозиготных мышей 6149, хотя и в более низких концентрациях, чем наблюдаемые для этих белков в нормальной плазме крови или сыворотке крови человека. В контрольном эксперименте, в котором анализировали присутствие в сыворотке крови мыши белка амилоида А (mSAA), были обнаружены сопоставимые уровни экспрессии у гуманизированных по С3 гомозиготных мышей по сравнению с их аналогами дикого типа. Анализы посредством вестерн-блоттинга, проведенные с использованием сыворотки крови, полученной от обоих гомозиготных животных MAID 6149 и MAID 6156, продемонстрировали, что они экспрессируют белки C3 человека, а не мыши. Антитело к hC3, используемое в этих экспериментах, перекрестно реагировало с белками C3 мыши (фиг. 5A и фиг. 5B).

[0161] Таким образом, в данном примере продемонстрировано создание гуманизированных по C3 мышей. Как гомозиготные мыши MAID 6156, так и гомозиготные мыши MAID 6149 экспрессируют белок C3 человека и не экспрессируют какой-либо белок C3 мыши.

Пример 2. Продолжительность жизни и макроскопические морфологические характеристики гуманизированных по С3 мышей

(I) Средний возраст на момент смерти и вес гуманизированных по С3 мышей по сравнению с диким типом

[0162] Для этих экспериментов данные о смертности и возрасте на момент смерти получали из записей вивария. Кроме того, в когорте мышей контролировали показатели веса у гомозиготных мышей MAID 6156 и гомозиготных мышей MAID 6149. Наконец, объем мышечной ткани, объем жира во всем организме и объем жира в % определяли следующим образом. Мышей подвергали сканированию с применением системы Quantum μCT in vivo (PerkinElmer). В источнике рентгеновского излучения устанавливали значения тока - 160 мкА, пикового напряжения - 90 кВ. Мышей анестезировали изофлураном и все тело, за исключением головы, сканировали с полем зрения 60 мм × 120 мм. Сканирование занимало 34 секунды, при этом размер вокселя составлял 240 мкм. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Analyze (Mayo Clinic). Костную, жировую и мышечную ткани сегментировали по насыщенности серого цвета и рассчитывали значения объема тканей, объемное содержание жира, минеральную плотность кости (BMD) и содержание минеральных веществ в кости.

[0163] Как гомозиготные мыши MAID 6156, так и гомозиготные мыши MAID 6149 характеризовались высокими показателями спонтанной смерти, особенно в поколении F2. Однако наблюдали увеличение выживаемости в последующих поколениях (F3 и F4; фиг. 6).

[0164] Кроме того, у обеих линий мышей наблюдали сниженный вес по сравнению с сопоставимыми по возрасту мышами дикого типа (фиг. 7). В частности, мыши MAID 6149 начинали терять вес в возрасте примерно 20 недель. Аналогично, обе линии мышей характеризовались уменьшением объема мышечной ткани, объема жира во всем организме и процентного содержания жира в организме по сравнению с аналогами дикого типа (фиг. 8A и фиг. 8B). Как показано на фиг. 9, как гомозиготные мыши MAID 6149 (фиг. 9A), так и гомозиготные мыши MAID 6156 (фиг. 9B) характеризовались как сниженной плотностью кости, так и сниженным содержанием минеральных веществ в кости по сравнению с аналогами дикого типа.

[0165] Таким образом, в данном примере продемонстрировано, что гуманизированные по С3 мыши характеризуются высокими показателями спонтанной смерти, сниженными показателями веса, сниженными процентным содержанием жира в организме, плотностью кости и содержанием минеральных веществ в кости по сравнению с аналогами дикого типа.

(II) Макроскопические морфологические характеристики гуманизированных по С3 мышей по сравнению с диким типом

[0166] Макроскопические морфологические характеристики у гомозиготных гуманизированных по С3 мышей MAID 6156 после спонтанной смерти оценивал квалифицированный ветеринар. Посмертное обследование показало, что у гомозиготных мышей обнаружены хрупкие кости (ребра, череп и все остальные кости) и заметное отсутствие подкожного жира по сравнению с аналогами дикого типа.

Пример 3. Определение поражения почки и печени у гуманизированных по С3 мышей

(I) Гистопатологическое исследование почки

[0167] Вкратце, окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) предусматривает окрашивание гематоксилином, дифференцирование кислотным спиртом с последующим окрашиванием эозином. Окрашивание Шифф-йодной кислотой (PAS) срезов почки выполняли с использованием услуг коммерческой организации (Histoserv Inc.). Вкратце, тонкие срезы размером 5 микрон получали из фиксированных формалином залитых парафином тканей почки мыши вдоль сагиттальной плоскости с охватом всех анатомических областей почки. Срезы депарафинизировали и окрашивали с помощью PAS для выявления гликопротеинов, гликолипидов и муцинов в ткани. Количественное определение расширения мезангиального матрикса в окрашенных с помощью PAS срезах выполняли следующим образом. Вкратце, срезы, окрашенные с помощью PAS, визуализировали с помощью слайд-сканера Aperio AT2 с объективом 40X. Для измерений расширения матрикса мезангиальных клеток в по меньшей мере 25 клубочках на срез измеряли PAS-положительную площадь. Пороговое значение на основе оптической плотности применяли к каждому клубочковому пучку с использованием модификации алгоритма количественного определения площади Indica Labs, отделяющего окрашивание ядер (темно-синий) и фон (светло-розовый) от Шифф-положительной матрицы (ярко-фиолетовый). Матрикс и общую площадь пучка измеряли и представляли вместе с матриксом мезангиальных клеток в процентах от площади пучка.

[0168] Гистологическое сравнение почек от нормальных (фиг. 10A) и гомозиготных мышей MAID 6156 (фиг. 10B) выявило признаки гломерулонефрита, которые включали базофильные канальцы, склеротические клубочки и расширенные канальцы с белковыми цилиндрами, которые ассоциированы с мононуклеарным воспалением интерстиция. Спонтанное заболевание почек присутствовало у 6/7 наблюдаемых мышей. У трех из этих мышей был значительный гломерулонефрит, который, учитывая молодой возраст мышей, считали ранним проявлением этого состояния. Кроме того, гомозиготные мыши характеризовались признаками иммуносупрессии, при этом сниженное количество лимфоцитов наблюдали в селезенке и пейеровых бляшках. Кроме того, как показано на фиг. 11A и как количественно определено на фиг. 11B, окрашенные Шифф-йодной кислотой (PAS) почки от гуманизированных по C3 мышей характеризовались расширением мезангиального матрикса по сравнению с мышами дикого типа. Что касается количественного определения, показанного на фиг. 11B, увеличенная площадь клубочкового пучка указывала на гипертрофию клубочка. Увеличения окрашенной PAS площади в клубочке указывало на расширение мезангиального матрикса.

(II) Биохимический анализ сыворотки крови, печени и мочи

[0169] Уровни натрия, калия, хлорида, кальция, глюкозы, BUN, липазы, общего белка, креатинина, креатинкиназы, альбумина, амилазы, билирубина, магния, фосфата, мочевой кислоты, фосфора, свободных жирных кислот, холестерина, триглицеридов, HDL, отличн. HDL и LDL в сыворотке крови определяли следующим образом. Вкратце, сыворотку крови исследовали с использованием системы для биохимического анализа ADVIA в соответствии с указаниями производителя. Аналогично, уровни ферментов в сыворотке крови также исследовали с использованием системы для биохимического анализа ADVIA в соответствии с указаниями производителя.

[0170] Альбумин в моче, креатинин в моче (Exocell Inc.), BUN (BioAssay Systems) и цистатин C в сыворотке крови (BioVendor) измеряли в соответствии с инструкциями производителя.

[0171] В развернутом анализе сыворотки крови в отношении уровней натрия, калия, хлорида, кальция, глюкозы, общего белка, креатинина, креатинкиназы, альбумина, амилазы, общего билирубина, магния, неорганического фосфата, мочевой кислоты, фосфора, неэтерифицированных жирных кислот, общего холестерина, триглицерида, HDL и LDL не наблюдали различий между мышами дикого типа и гуманизированными по C3 мышами (фиг. 12). Однако наблюдали повышенный уровень азота мочевины крови (BUN), а также повышенные уровни липазы и отличн. HDL в сыворотке крови, полученной от гуманизированных по C3 мышей по сравнению с аналогами дикого типа (фиг. 13A). Эти результаты свидетельствуют о дисфункции почек, а также ассоциированы с сердечно-сосудистыми состояниями, такими как застойная сердечная недостаточность или недавний инфаркт миокарда. Кроме того, результаты развернутого анализа в отношении ферментов печени показали повышенные уровни аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы, что указывает на повреждение печени (фиг. 13B). Анализ мочи показал, что уровень альбумина был повышен у гуманизированных по С3 мышей по сравнению с аналогами дикого типа, что свидетельствует о дисфункции почек (фиг. 14A). Дальнейший анализ сыворотки крови в динамике показал, что уровни BUN и цистатина C в сыворотке крови повышались у гуманизированных по C3 мышей, что указывает на почечную недостаточность (фиг. 14B).

[0172] В заключение, результаты анализа сыворотки крови, печеночных ферментов и мочи гуманизированных по С3 мышей указывают на почечную дисфункцию и/или недостаточность, а также на дефекты печени, соответствующие фиброзу.

Пример 4. Аномальное отложение комплемента в почке у гуманизированных по С3 мышей

[0173] Поперечные срезы ткани почки от гомозиготных мышей MAID 6149 и мышей дикого типа оценивали по иммунофлуоресценции на наличие отложения C3 и мембраноатакующего комплекса C5b-9 в соответствии со следующим протоколом. Вкратце, сагиттальные срезы получали из замороженных залитых OCT образцов почек и окрашивали либо моноклональным антителом крысы к C3 мыши (Abcam), либо поликлональным антителом кролика к C5b-9 (Abcam). Для визуализации окрашивания использовали соответственно вторичное антитело осла Cy3 к антителу крысы (Jackson ImmunoResearch) или вторичное антитело осла Cy3 к антителу кролика (Jackson ImmunoResearch). Флуоресцентные изображения получали с использованием микроскопа Leica DM5500 или DM6000 соответственно.

[0174] Флуоресцентное окрашивание выявило большие очаги отложения С3 в почках гуманизированных по C3 мышей (фиг. 15A). Дополнительное окрашивание показало увеличенное отложение мембраноатакующего комплекса C3b-9 в клубочке почки мышей huC3, что указывает на активированный путь комплемента (фиг. 15B). Аномальная регуляция альтернативного пути комплемента, которая подтверждается этими данными, а также данными отложения фрагмента С3 в клубочке, а также увеличения мезангиального матрикса и плотных отложений согласно электронной микроскопии, которые обсуждались ранее, коррелирует с нефропатиями, такими как С3-гломерулопатия. Уровни C5a в моче измеряли у мышей huC3 с использованием набора DuoSet для анализа компонента комплемента C5a мыши (R&D systems) в соответствии с протоколом производителя. Уровни C5a в моче были сильно повышены у мышей huC3 по сравнению с мышами WT (фиг. 15C).

[0175] Увеличенная интенсивность окрашивания C5b-9 в почке в дополнение к повышенным уровням C5a в моче свидетельствуют о локальной активации путей комплемента в почках мышей huC3.

Пример 5. Сигнатуры последовательностей РНК гуманизированных по С3 мышей

[0176] Определение экспрессированных сигнатур последовательностей РНК при сравнении гомозиготных мышей MAID 6149 и MAID 6156 друг с другом, а также с аналогами дикого типа, выполняли следующим образом.

[0177] Получение данных секвенирования транскриптома и картирование прочтений. Общую РНК экстрагировали из образцов ткани мыши с применением набора MagMAX (Life tech, Карлсбад, Калифорния). мРНК очищали из 4 мкг общей РНК с применением набора для очистки мРНК Dynabeads® (Invitrogen, , Уолтем, Массачусетс). Получали библиотеки специфичных в отношении нити последовательностей для секвенирования РНК с применением набора для получения библиотеки mRNA-Seq ScriptSeq™ (Epicentre) с последующими двенадцатью циклами ПЦР-амплификации. Секвенирование выполняли на Illumina HiSeq^®2000 (Illumina) путем мультиплексного прогона с однократным считыванием с 33 циклами. Секвенированные считывания в файлах визуализации с помощью Illumina Hiseq2000 (файлах BCL) преобразовывали в формат FASTQ с помощью Illumina Casava 1.8.2. Считывания декодировали на основании их штрих-кодов и объединяли для каждых отдельных образцов. Общее качество считывания на образец оценивали с помощью FastQC с сохранением только образцов с достаточным качеством. Затем считывания картировали на геном мыши (сборка mm10) с использованием коммерческого программного обеспечения CLCBio с одним допустимым ошибочным спариванием.

[0178] Статистический анализ дифференциально экспрессируемых генов. Для каждого гена идентифицировали и подсчитывали считывания, картированные на экзоны смысловой нити гена. Выявляемые гены отмечали на основании их общего количества считываний экзонов смысловой нити, суммированных на уровне гена. Применяли эмпирически рассчитанное минимальное количество считываний экзонов, составляющее 10, для определения отсутствия и присутствия генов в каждом образце. Для сравнения двух групп образцов гены удаляли, если они не были отмечены как присутствующие во всех образцах в группе с более высокой экспрессией. Затем рассчитывали кратность изменения и p-значения, связанные со сравнением, с использованием пакета DESeq [Genome Biology 2010, 11:R106]. Гены с кратностью изменения (т.е. соотношением) ≥ 1,5 в обоих направлениях и с p-значением < 0,01 отбирали как генные сигнатуры с существенным нарушением.

[0179] Как показано на фиг. 16, органоспецифичный анализ экспрессии РНК показывает, что по сравнению с аналогами дикого типа у гуманизированных по С3 мышей было больше всего изменений генной экспрессии в печени и в меньшей степени в почках. Анализ также показал, что мыши MAID 6149 характеризовались большим количеством изменений генной экспрессии в сердце по сравнению с таковой, наблюдаемой у мышей MAID 6156.

[0180] Сравнение сигнатур генной экспрессии в печени между мышами MAID 6149 и MAID 6156 показало значительное совпадение в количестве генов, экспрессия которых повышена или снижена, между двумя линиями мышей (фиг. 17). Пути генной экспрессии, нарушенные в наибольшей степени у двух линий, включали пути, которые связаны с выработкой внеклеточного матрикса, реакцией на ранение и трансмембранным транспортом малых молекул (фиг. 18). В частности, было показано, что паттерны генной экспрессии, относящиеся к фиброзу печени, были особенно повышены у гомозиготных мышей MAID 6156 (фиг. 19).

[0181] Подобное сравнение, выполненное в отношении почки, показало ограниченное совпадение генных сигнатур, но в целом мыши MAID 6149 и MAID 6156 имели общую согласованность в тенденции/паттерне нарушения экспрессии РНК (фиг. 20). В частности, гены, связанные с повреждением почек, были обогащены у обеих гуманизированных по C3 линий.

[0182] В целом, анализ экспрессии РНК указывает на то, что гены печени в наибольшей степени нарушены в обеих линиях гомозиготных мышей MAID 6149 и MAID 6156. Что касается линии MAID 6156, гены, связанные с клеточным циклом и фиброзом, а также с воспалением, имели наиболее значимые сигнатуры. Генные сигнатуры воспаления и метаболизма стероидов были обогащены у гомозиготной мыши MAID 6149. В частности, экспрессия гена Tnfsf14 была сильно повышена в печени у обеих линий гуманизированных по C3 мышей. Ген Tnfsf14 кодирует белок LIGHT, также известный как представитель 14 суперсемейства факторов некроза опухоли (TNFSF14), который является секретируемым белком суперсемейства TNF. Однако, поскольку этот ген расположен по соседству в 3'-направлении с C3 в геноме мыши, его сверхэкспрессия может быть артефактом. Prok1, который представляет собой ген, кодирующий белок, связанный с ангиогенезом и развитием, был главным геном, экспрессия которого была снижена, в линиях гомозиготных мышей.

[0183] Дополнительное определение характеристик генной экспрессии в почках мышей huC3 с прогрессирующим заболеванием почек (уровни BUN у этих мышей составляют 60-120 мг/дл по сравнению с 20-35 мг/дл у мышей WT) выполняли с помощью RNASeq. Мыши huC3 характеризовались несколькими изменениями в отношении повышенной или сниженной генной экспрессии (фиг. 21A). С помощью дополнительного анализа данных выявили повышенную экспрессию нескольких генов нефротоксичности (фиг. 21B), генов ECM (фиг. 21C), цитокинов (фиг. 21D) и хемокинов (фиг. 21E).

[0184] В целом, данные генной экспрессии в почках мышей huC3 с прогрессирующим заболеванием почек указывают на продолжающееся поражение и воспаление.

Пример 6. Эффективность антител к C5 в лечении связанной с комплементом нефропатии

[0185] Как описано выше, было обнаружено, что мыши, гуманизированные по C3, характеризуются спонтанной смертностью, гемолитической активностью от нормальной до низкой, низким уровнем циркулирующего C3 (приблизительно 40 мкг/мл в отличие от 1000 мкг/мл, наблюдаемым у нормальных мышей) и патологией многих органов, в том числе воспалением почек и наличием отложений С3 в почке.

[0186] В данном примере 8-недельных гуманизированных по С3 мышей обрабатывали подкожно с использованием 50 мг/кг антитела к C5 M1M17628N или изотипического контроля три раза в неделю в течение 9 недель. Смертность, уровни азота мочевины крови, цистатина С в сыворотке крови, альбумина и С5а в моче исследовали, как описано выше. Уровни C3 и C5b-9 исследовали с помощью гистопатологического окрашивания, как описано выше.

[0187] Обработка антителом к C5 значимо улучшала выживаемость у гуманизированных по С3 мышей, при этом у мышей, обработанных антителом к С5, смертность составляла только 20% по сравнению с 81% смертностью у мышей, обработанных изотипическим контролем (фиг. 22). Обработка антителом к C5 обеспечивала улучшение в отношении веса тела у гуманизированных по C3 мышей (фиг. 23) и улучшение в отношении уровней маркеров функции почек, таких как BUN (фиг. 24A) и цистатин C в сыворотке крови (фиг. 24B). Влияния на уровень альбумина в моче не наблюдали (данные не показаны); однако уровни С5а в моче снижались при обработке антителом к С5 (фиг. 25).

[0188] Гистопатологическое окрашивание показало повышенное содержание мембраноатакующего комплекса (MAC) в клубочках (C5b-9) у гуманизированных по С3 мышей, обработанных изотипическим контролем, по сравнению с гуманизированными по С3 мышами, обработанными антителом к C5, и мышами дикого типа, обработанными изотипическим контролем (фиг. 26). Обработка антителом к C5 значимо уменьшала инфильтрацию клубочка нейтрофилами (фиг. 27A) и инфильтрацию интерстиция макрофагами (фиг. 27B) в почках гуманизированных по C3 животных. Более того, гуманизированные по С3 мыши, обработанные изотипическим контролем, в отличие от гуманизированных по С3 мышей, обработанных антителом к C5, и мышей дикого типа, обработанных изотипическим контролем, характеризовались увеличенным размером клубочка, а также расширением мезангиального матрикса (фиг. 28).

[0189] В заключение, результаты указывают на то, что терапия антителом к С5 может обеспечивать значимое улучшение в отношении смертности и функции почек, а также уменьшение гистологических признаков повреждения в почках грызунов, у которых проявляются симптомы связанных с комплементом нефропатий.

Пример 7. Обработка антителом к С5 приводит к значительному «спасению» генной сигнатуры заболевания у гуманизированных по C3 мышей (MAID 6149)

[0190] Гуманизированных по C3 мышей (MAID 6149) обрабатывали мышиным антителом к C5 мыши либо антителом изотипического контроля (n = 16), начиная с 8-недельного возраста. Мышей дикого типа обрабатывали изотипическим контролем (n = 5). Антитела вводили подкожно в количестве 50 мг/кг три раза/неделя. Обработку продолжали до 17-недельного возраста. Экспрессию генов исследовали с помощью секвенирования нового поколения (NGS) в почках мышей, выживших на момент завершения исследования.

[0191] Как показано на фиг. 29A, обработка антителом к C5 обеспечивала обращение сигнатурных генов заболевания у гуманизированных по C3 мышей MAID 6149. «Спасенная» сигнатура заболевания включала связанные с иммунной системой, внеклеточным матриксом, цитокином, комплементом и метаболизмом гены (фиг. 29B). Типичные маркеры иммунных клеток, экспрессия которых была повышена у гуманизированных по C3 мышей, как было показано, впоследствии ослаблялась посредством обработки антителом к C5 (фиг. 29C).

Пример 8. Непрерывное блокирование С5 может быть необходимым для продления выживаемости гуманизированных по C3 мышей (MAID 6149)

[0192] Гуманизированных по C3 мышей обрабатывали мышиным антителом к C5 мыши либо антителом изотипического контроля (n = 15), начиная с 8-недельного возраста. Антитела вводили подкожно в количестве 50 мг/кг три раза/неделя. Обработку прекращали в возрасте 24 недель.

[0193] Только 2 из 15 мышей, обрабатываемых антителом к C5, погибли на протяжении 16-недельного периода обработки (в возрасте 8-24 недель). В это же время в группе обработки изотипическим контролем погибли 13 из 16 (фиг. 30). На протяжении четырех недель после прекращения обработки погибло несколько мышей, получавших обработку антителом к C5 (12 из оставшихся 13). Эти данные подтверждают, что непрерывное блокирование С5 может быть необходимым для продления выживаемости гуманизированных по C3 мышей MAID 6149.

Пример 9. Блокирование C3b также обеспечивало защиту у гуманизированных по C3 мышей

[0194] Гуманизированных по C3 мышей (MAID 6149)обрабатывали связывающим/блокирующим антителом к C3b (n = 14) либо антителом изотипического контроля (n = 14), начиная с 8-недельного возраста. Антитела вводили подкожно в количестве 50 мг/кг три раза/неделя. Обработку продолжали до 18-недельного возраста (период обработки общей сложностью 10 недель).

[0195] Одиннадцать из 14 мышей, обработанных изотипическим контролем, погибло в течение 10-недельного периода исследования (фиг. 31A). В течение того же периода времени погибла только 1 из 14 мышей, обработанных антителом к 3b, что свидетельствует о том, что блокирование C3b обеспечивает значимое преимущество в отношении выживаемости у гуманизированных по C3 мышей MAID 6149. Блокирующее антитело к C3b также обеспечивало улучшение в отношении веса тела у гуманизированных по C3 мышей, что свидетельствует об улучшении состояния здоровья (фиг. 31B и фиг. 31C). В целом, эти данные указывают на то, что блокирование C3b, стоящего выше C5, также обеспечивает защиту у гуманизированных по C3 мышей.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Регенерон Фармасьютикалз, Инк.

<120> Гуманизированная модель нарушений со стороны почек и печени

<130> 35469 (10207WO01)

<150> 62/583780

<151> 2017-11-09

<150> 62/529,916

<151> 2017-07-07

<150> 62/464,262

<151> 2017-02-27

<160> 27

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 1

ggcctgatta catggacctg tc 22

<210> 2

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 2

cccaggcttg gctggaatg 19

<210> 3

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 3

tgtccactct ggaagcccag gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 4

gccaggagag gaagctggag 20

<210> 5

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 5

tggctcagca gtaaagaaca c 21

<210> 6

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 6

acagattgct gtgagctgcc caaa 24

<210> 7

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 7

ggtggagagg ctattcggc 19

<210> 8

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 8

gaacacggcg gcatcag 17

<210> 9

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 9

tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

<210> 10

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 10

gccagcctag cctacttca 19

<210> 11

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 11

gccacccatc ccagttct 18

<210> 12

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 12

cagcccaggc cctttagatt gca 23

<210> 13

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 13

tacggtgtta ggttcactat tggt 24

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 14

gtcgccagca gtctcataca g 21

<210> 15

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 15

tgcggccgat cttagcc 17

<210> 16

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 16

ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 17

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 17

gggcctccta agtttgttga gtatc 25

<210> 18

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 18

cagggctggt tccctagaaa tc 22

<210> 19

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 19

tacaatagca ggcacagcac cca 23

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 20

ggctgagagt gggagtcatg 20

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 21

gcacttgcca atgccattat c 21

<210> 22

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 22

ctgctgtcct gcccatgtgg ttg 23

<210> 23

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 23

cgaatgccaa gacgaagaga ac 22

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 24

gggcacccaa agacaaccat 20

<210> 25

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 25

cagaaacaat gccaggacct cggc 24

<210> 26

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 26

agtgggcatc ccttgccagg c 21

<210> 27

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 27

acgagcgggt tcggcccatt c 21

<---

1. Способ оценивания in vivo терапевтической эффективности средства для применения в лечении связанной с комплементом нефропатии, при этом способ предусматривает:

(a) введение средства грызуну, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу С3 грызуна последовательности гена грызуна, содержащей экзон гена С3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена С3 человека, с образованием модифицированного гена С3, при этом

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена С3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена С3 человека, и экспрессия модифицированного гена С3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе С3 грызуна; или

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена С3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена С3 человека; и

где грызун представляет собой мышь или крысу, и грызун проявляет один или более симптомов нефропатии; и

(b) оценивание того, подавляет ли средство один или более симптомов нефропатии по сравнению с контрольными грызунами, которым не вводили средство.

2. Способ по п. 1, где грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок С3 мыши.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок С5 мыши, кодируемый эндогенным геном С5 мыши.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярных химических соединений, пептидов и антител.

5. Способ по п. 4, где средство представляет собой антитело.

6. Способ по п. 5, где средство представляет собой моноклональное антитело или его функциональный связывающий фрагмент.

7. Способ по п. 4, где средство представляет собой ингибиторную нуклеиновую кислоту.

8. Способ по п. 7, где ингибиторная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, shRNA, аптамера, антисмыслового олигонуклеотида, образующего триплекс олигонуклеотида и рибозима.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии предусматривают спонтанную смерть.

10. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии предусматривают сниженный вес, сниженную плотность кости, сниженное содержание жира в организме или их комбинацию.

11. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии выбраны из одного или более из группы, состоящей из гломерулонефрита, базофильных канальцев, склеротических клубочков, расширенных канальцев с белковыми цилиндрами, расширения мезангиального матрикса, гипертрофии клубочков и мононуклеарного воспаления интерстиция.

12. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии предусматривают отложение белка С3 в почке.

13. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии предусматривают отложение мембраноатакующих комплексов C5b-9 в почке.

14. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии предусматривают один или более из повышенного уровня азота мочевины крови (BUN), липазы в сыворотке крови, цистатина С в сыворотке крови или липопротеинов, отличных от липопротеинов высокой плотности, в сыворотке крови.

15. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии предусматривают повышенный уровень альбумина или С5а в моче.

16. Способ по любому из пп. 1-8, где один или более симптомов нефропатии оценивают с помощью определения экспрессии одного или более сигнатурных генов нефропатии.

17. Способ идентификации средства, которое подавляет симптом связанной с комплементом нефропатии у грызуна, в геноме которого содержится замена по эндогенному локусу С3 грызуна последовательности гена грызуна, кодирующей экзон гена С3, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон гена С3 человека, с образованием модифицированного гена С3, при этом (i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена С3 человека, содержит экзон 2 - экзон 41 гена С3 человека, и экспрессия модифицированного гена С3 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе СЗ грызуна, или (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один экзон гена С3 человека, содержит экзон 1 - экзон 41 гена С3 человека; и где грызун представляет собой мышь или крысу и проявляет один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии; и при этом способ предусматривает: (а) введение средства грызуну и (b) идентификацию средства в качестве средства, которое подавляет симптом связанной с комплементом нефропатии, если средство подавляет один или более симптомов связанной с комплементом нефропатии у грызуна.