Способ предупреждения и подавления интенсификации липопероксидации антиоксидантом глутатионом для улучшения критериев качества эмбрионов и перепелят в условиях промышленного производства

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ предупреждения и подавления интенсификации липопероксидации антиоксидантом глутатионом для улучшения критериев качества эмбрионов и перепелят в условиях промышленного производства основан на том, что проводят двукратную обработку перепелиных яиц водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом. Изобретение позволяет снизить количества основных цитотоксичных продуктов липопероксидации, положительно воздействует на антиоксидантную защиту организма, повышение критериев качества суточного молодняка. 7 табл., 5 пр.

 

Данное изобретение относится к сельскому хозяйству, и в частности, к птицеводству (аэрозольное применение водного раствора восстановленного глутатиона перед инкубацией и перед переводом яиц в выводную тару).

Перепеловодство является сравнительно новой отраслью птицеводства в России. Это обусловлено короткими сроками выращивания перепелов с быстрым получением продукции и окупаемостью затрат [6].

У перепелов множество преимуществ: они обладают небольшими размерами, высокой яичной продуктивностью и коротким периодом инкубации. Мясо перепелов можно относить к диетическим продуктам, т.к. оно содержит множество витаминов и микроэлементов, также в нем много полноценных протеинов, но мало жира (3%) [5]. Кроме того, из-за высокой интенсивности обменных процессов, температура тела перепелов выше на 2°С, чем у других видов сельскохозяйственных птиц. Вследствие чего, они более устойчивы к различным инфекционным заболеваниям [7]. Но, не смотря на все вышеперечисленное, до сих пор в условиях производства, невозможно добиться 100% вывода перепелов (по РФ в среднем 75%) [4]. К тому же, как известно, развитие зародышей птиц осуществляется вне организма матери, из-за чего они особенно подвержены отрицательному воздействию факторов внешней среды, которое провоцирует масштабное развитие широкого спектра свободнорадикальных патологий [4]. При этом факторы стресса даже небольшой силы, выполняющие тренировочную функцию для взрослых организмов, зачастую могут перейти в разряд экстремальных для зародышей.

Стрессовыми воздействиями в промышленной инкубации могут быть: неравномерный прогрев партий яиц в различных зонах инкубатора и в сетке, длительный перенос в выводные шкафы, отсутствие аэроионизации, биоакустатики, задержка в инкубаторе и др.

Эмбрион, который формируется в неблагоприятных условиях, становится особенно уязвимым к действию свободных радикалов, синтез которых возрастает в разы преимущественно из-за нарушения реакций митохондриальной дыхательной цепи [2].

Для коррекции негативных последствий стрессовых воздействий в птицеводстве все чаще используют естественные метаболиты - антиоксиданты, позволяющие нивелировать в организме зародыша возникающие аномалии, обусловленные свободно-радикальной прогрессией и развитием перекисного окисления липидов (ПОЛ).

В данном эксперименте использовали глутатион (GSH) - трипептид γ-глутамилцистеинилглицин - тиол, антиоксидант, который содержится почти во всех эукариотических клетках и у некоторых прокариотов [9]. У млекопитающих он способен синтезироваться в печени, обеспечивающей при физиологических условиях до 90% всего циркулирующего глутатиона (GSH) [13]. Уровень GSH варьирует в зависимости от органов [15, 18]. Самый высокий фиксируют в печени (5-10 мм), затем в почках, селезенке, тонкой кишке, мозге, поджелудочной железе, легких, сердце и мышцах.

Глутатион - главный буфер редокса тиола, который служит для поддержания внутриклеточного гомеостаза. В условиях окислительного стресса глутатион может привести к обратимому образованию смешанных дисульфидов между тиольными группами белка (S-глутатионилирование) для предотвращения необратимого окисления белка [12].

Его главной функцией является инактивация свободных радикалов. Восстановленная форма глутатиона - центральный компонент антиоксидантной системы защиты эритроцитов. Заявленный трипептид обладает защитным действием в отношении репликативной системы клетки [16], выполняет коферментные функции. Известно также, что заявленный биостимулятор может стабилизировать мембранную структуру, перемещение ацилпероксидов, образующихся путем перекисного окисления липидов [11].

Активность связывания ДНК транскрипционных факторов, таких как c-Jun, NF-kB и Fos, модулируется изменением соотношения GSH/GSSG [14]; пониженное соотношение индуцирует S-глутатионилирование остатка цистеина в доменах связывания ДНК, приводящее к ингибированию связывания ДНК. Снижение синтеза GSH останавливает клеточный цикл в фазах S и G2 [17], в то время как пролиферирующие клетки в фазах S и G2 клеточного цикла показали повышенные уровни GSH в ядре. Эти результаты доказывают, что GSH необходим в соответствующий период для пролиферации клеток [14].

Окислительно-восстановительное состояние клеточного тиола также регулирует запрограммированную гибель клеток [14]. Уменьшенное внутриклеточное отношение GSH/GSSG индуцирует потерю антиапоптотического белка Вс1-2, высвобождение цитохрома из митохондрий и активацию каспазы, индуцирующей апоптоз, тогда как увеличенное внутриклеточное отношение GSH / GSSG предотвращает запрограммированную гибель клеток [18].

Все это указывает на высокую значимость заявленного вещества в системе становления биологически полноценного зародыша.

На данный момент нет сведений о двухкратной обработке перепилиных яиц растворами восстановленного глутатиона.

С целью выявления эффективности двукратной обработки восстановленного глутатиона, была осуществлена дополнительная обработка перепелиных яиц водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом в диапазоне концентраций от 0,1 до 10% перед переводом в выводную тару. В ряде экспериментов установили, что обработка перепелиных яиц водными растворами восстановленного глутатиона аэрозольным методом - перед инкубацией 2,5% и перед переводом яиц в выводную тару-5%, по ряду критериев превосходит результат однократной обработки яиц. Отдельно следует отметить, что при использовании двукратной схемы применения данного метаболита для экспериментов брали только химически чистый глутатион без дополнительных формообразующих веществ.

В качестве прототипа данного метода взят опыт применения восстановленного глутатиона на инкубационных яйцах перепелов. При использовании оптимальной концентрации (2,5%) раствора глутатиона вывод перепелят опытной партии (79,2%) был выше на 7,6%, чем в контроле (71,6%)[3]. Также в качестве прототипа был выбран опыт по использованию препарата «Полиоксидоний» (антиоксидант, иммуномодулятор, детоксикант) для предынкубационной обработки куриных яиц. При использовании оптимального раствора вывод цыплят опытной партии (82,1%) превосходил контроль (80,1%) на 2% [1].

Задача изобретения - улучшение качества эмбрионов и перепелов в условиях промышленного производства при использовании антиоксиданта глутатиона, путем предупреждения и нивелирования интенсификации процессов липопероксидации.

Технический результат заключается в том, что двукратная обработка инкубационных яиц водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом способствовала снижению основных цитотоксичных продуктов липопероксидации - малонового диальдегида (МДА) на 26,2% и оснований Шиффа (ОШ) на 18,6%, при повышении содержания глутатиона в 1,6 раза и антиокислительной активности (АОА) в 1,5 раза. Указанное обусловило повышение качества суточного молодняка, что выразилось в превосходстве опытной группы с двукратной обработкой по критериям «Пасгар» и «Оптистарт» на 0,5 и 0,6 балла соответственно по сравнению с контролем. На пятые сутки этот результат был по 0,5 балла, а на десятые 0,5 и 0,4 балла выше, соответственно, по сравнению с контролем.

Способ осуществляется следующим образом. На поверхность скорлупы за 3-4 часа до начала инкубации яйцо обрабатывают водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом в концентрации 2,5%, а при переводе яиц в выводную тару - 5%. Предварительно восстановленный глутатион растворяют и смешивают в дистиллированной воде при 18-22°С.

Пример 1. Эксперимент проводили на трех партиях яиц, одна из которых контрольная и две опытные. При этом первую из них однократно обрабатывали водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом концентрацией 2,5%, а вторую - водными растворами восстановленного глутатиона аэрозольным методом в концентрациях: 2,5% перед инкубацией и 5% при переводе яиц в выводную тару. Яйца перепелов японской породы получали от одного родительского стада, сортировали по 250 штук в каждую партию при соблюдении аналогичности массы, время снесения и сроков хранения.

Двукратная обработка водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом в оптимальных концентрациях корректирует негативные последствия оксидативного стресса, о чем свидетельствует снижение основных токсичных продуктов липопероксидации - малонового диальдегида (МДА) на 26,2% и оснований Шиффа (ОШ) на 18,6% соответственно, тогда как при однократной обработке эти показатели имели меньшую разницу с контролем: 13,9% и 10,9% соответственно. Заявленный трипептид, проникая в яйцо, оказывает стимулирующие воздействие на антиоксидантную защиту организма, что выразилось в увеличении глутатиона в 1,6 раза и антиоксидантной активности (АОА) в 1,5 раза, соответственно, тогда как при однократной обработке разница также была меньше: 1,3 и 1,2 раза соответственно.

По данным Сурая П. и Фисинина В.И. (2012), интенсивность липопероксидации имеет обратную зависимость с качеством становления органов и тканей молодняка, использованием питательных и минеральных веществ их организмом, терморегуляцией [11]. Таким образом, тенденция, наблюдаемая в таблице 1, очевидно обуславливает условия для получения высоко жизнеспособных и биологически полноценных особей, обладающих спектром преимуществ относительно контрольных особей. Заявленное нашло многократное подтверждение в последующих таблицах.

Пример 2. Данные таблицы 2 указывают на выраженное стимулирующее воздействие глутатиона на эмбриональную жизнеспособность. Заявленное выразилось в том, что вывод перепелят и выводимость яиц достоверно повысились в опытной группе на 9,60% (р<0,05) и 9,25% (р<0,01), соответственно. При этом наибольшее снижение количества отходов инкубации отмечали при двукратной обработке яиц по таким отходам инкубации, как: «кровяные кольца» в 1,5 раза, «замершие» - в 2,2 раза, «задохлики» - в 2 раза, «слабые» - в 1,7 раза относительно контроля. Необходимо отметить, что однократная обработка яиц имела меньший эффект по аналогичным категориям отходов инкубации.

Пример 3. Снижение эндогенной интоксикации продуктами ПОЛ обусловило сохранение целостности и функциональности мембранных структур клеток [10], определяя условия для повышения качества получаемого молодняка суточного возраста. Анализ данных таблицы 3 свидетельствовал о том, что перепелята по критериям «Пасгар» и «Оптистарт» в опытной группе с двукратной обработкой превосходили контроль на 0,5 и 0,6 балла соответственно, тогда как в группе с однократной разница была менее значительной и составила 0,3 и 0,4 балла, соответственно.

При дальнейшем выращивании перепелят было установлено, что по критериям качества опытная группа с двукратной обработкой сохраняла тенденцию к увеличению (таблицы 4, 5), по сравнению с контролем и группой с однократной, что также свидетельствует о более выраженном положительном влиянии первой на качество и интенсивность развития птицы. Так, разница с контролем на пятые сутки составляла по 0,5 балла, а на десятые 0,5 и 0,4 соответственно, тогда как при однократной она была в те же сутки 0,3 и 0,2 и по 0,2 балла соответственно.

Также стоит отметить, что только вылупившиеся перепелята опытной группы с двукратной обработкой яиц лучше реагировали на звук (постукивание). Так, в течение 30 секунд 9 из 10 особей направились к источнику звука, тогда как в контроле этот результат составил -7 из 10.

Пример 4. Известно, что температура тела является показателем качества и здоровья молодняка суточного возраста, при ее снижении прогноз на дальнейшую сохранность не благоприятный. Повышение температуры под крылом на 0,4°С у представителей опытной группы при двукратной обработке инкубационных яиц (против 0,1°С при однократной) также подтверждает улучшение качества перепелов (таблица 6).

Пример 5. По данным Орлова М.В. (1987) скорлупа является главным источником минеральных веществ, необходимых для построения костяка. Во время эмбриогенеза кальций и другие микроэлементы из нее поступают к зародышу, что обуславливает условия, облегчающие проклев и сокращение сроков вывода [8]. Так, в опытной группе с двукратной обработкой толщина скорлупы была меньше на 7,7%, нежели в контроле (против 6,0%) при однократной). Кроме того, при биохимическом исследовании сыворотки крови было выявлено, что содержание общего кальция в организме цыплят суточного возраста опытной группы возросло на 3,1%, магния - на 10,6%, при достоверном увеличении неорганического фосфора- на 9,3% (р<0,05), что также свидетельствует о более эффективном усвоении заявленных элементов из скорлупы яйца [4].

Вывод: Двукратная обработка водным раствором восстановленного глутатиона в оптимальных концентрациях по предложенной схеме определила снижение интенсивности липопероксидации, повлекшее повышение жизнеспособности особей, а также позитивные изменения объективно-субъективных критериев их качества, при повышении температуры тела и лучшем использовании минеральных веществ скорлупы организмом эмбриона, как важнейших характеристик биологической полноценности молодняка.

Литература:

1. Аганичева А.А., Алексеева С.А., Кузнецов О.Ю. Способ повышения эмбриональной и постэмбриональной жизнеспособности цыплят.// Патент РФ №2540533, 2013.-МПК A01K 45/00.

2. Азарнова, Т.О. Научно-практические аспекты профилактики оксидативного стресса, как способа оптимизации условий инкубации и акселерации эмбрионов кур: дис. … доктора биол. наук. / Т.О. Азарнова; МГАВМиБ - М., 2013. - 309 с.

3. Азарнова Т.О. Эффективность реализации антиоксидантного и обменостимулирующего действий глутатиона в промышленном перепеловодстве / Т.О. Азарнова, В.А. Попова, М.С. Найденский, И.С. Луговая, В.А. Комар // Ветеринарный фармакологический вестник. 2020. №3 (12). С. 70-80.

4. Бессарабов Б.Ф. Инкубация яиц сельскохозяйственной птицы / Б.Ф. Бессарабов, А.A. Крыканов, А.Л. Киселев. - Санкт-Петербург [и др.]: Лань, 2015. - 160 с.: ил. (+ вклейка, 16 с.). - (Учебник для вузов. Специальная литература).

5. Бессарабов Б.Ф. Технология производства яиц и мяса птицы на промышленной основе: учебное пособие / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Крыканов, Н.П. Могильда. // Санкт-Петербург: Лань, 2012. - 336 с.: ил. - (Учебники для вузов. Специальная литература).

6. Голубов И.И. Развивать отечественное перепеловодство! [Текст] / И.И. Голубов, Г.В. Красноярцев // Птица и птицепродукты. - 2012. - №5. - С. 27-29.

7. Орда М.С. Перепеловодство - перспективная отрасль животноводства. Проблемы патологии / М.С. Орда, Ю.О. Ляднович // Ветеринарный журнал Беларуси. - 2017. - №2. - С. 81-84.

8. Орлов М.В. Биологический контроль в инкубации / М.В. Орлов. - М.: Россельхозиздат, 1987. - 224 с.

9. Смирнов Л.П. Роль глутатиона в функционировании систем антиоксидантной защиты и биотрансформации (обзор) / Л.П. Смирнов, И.В. Суховская // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. - 2014 - №6- 34 с.

10. Сурай П. Современные методы борьбы со стрессами в птицеводстве: от антиоксидантов к витагенам / П. Сурай, В.И. Фисинин // Сельскохозяйственная биология. 2012. Т. 47. №4. С. 3-13.

11. Толпыгина О.А. Роль глутатиона в системе антиоксидантной защиты(обзор) / О.А. Толпыгина// ACTA BIOMEDICA SCIENTIFICA / - 2012- №2-2 - 178 с.

12. Ballatori, N., Krance, S.М., Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and pathophysiology//Mol Aspects Med 30, 2009 -13-28.

13. Deneke S.M., Fanburg B.Y., Regulation of cellular glutathione/Deneke S.M., Fanburg B. Y. // Amer. J. Physiol.- 1989. - Vol. 257. - P. L163-L173.

14. Johnson, W.M., Dysregulation of glutathione homeostasis in neurodegenerative diseases/ Johnson W.M., Wilson-Delfosse A.L., Mieyal J.J.//Nutrients, 2012 Oct 9; 4(10) - 1399-1440.

15. Koji Aoyama, Impaired Glutathione Synthesis in Neurodegeneration/ Koji Aoyama, Toshio Nakaki. -2013: Journal of Molecular Sciences, 14(10), 2013. - 1378-1395 c.

16. Mandal, P.K., Brain oxidative stress: detection and mapping of antioxidant marker 'Glutathione' in different brain regions of healthy male/female, MCI and Alzheimer patients using non-invasive magnetic resonance spectroscopy. / Mandal P.K., Tripathi M., Sugunan S. -: Biochem Biophys Res Commun, 2012. - 43-48.

17. Neal M., Time to get Personal: A Framework for Personalized Targeting of Oxidative Stress in Neurotoxicity and Neurodegenerative Disease/ Neal M., Richardson J.R. // Curr Opin Toxicol. 2018 Feb; 7: 127-132.

18. Niedzielska E., Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases/ Niedzielska E, Smaga I, Gawlik M, Moniczewski A, Stankowicz P, Pera J, Filip M. // Mol Neurobiol. 53(6), 2016 - 4094-4125.

Способ предупреждения и подавления интенсификации липопероксидации антиоксидантом глутатионом для улучшения критериев качества эмбрионов и перепелят в условиях промышленного производства, отличающийся тем, что проводят двукратную обработку перепелиных яиц водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом: за 3-4 часа перед закладкой в инкубатор яйца обрабатывают 2,5% раствором восстановленного глутатиона, а при переводе яиц на вывод используют 5% раствор восстановленного глутатиона, при этом предварительно восстановленный глутатион растворяют и смешивают в дистиллированной воде при температуре 18-22°С.